b'\n_START_ARTICLE_\nCitometr\xc3\xada de flujo\n_START_PARAGRAPH_\nLa citometr\xc3\xada de flujo es una tecnolog\xc3\xada biof\xc3\xadsica basada en la utilizaci\xc3\xb3n de luz l\xc3\xa1ser, empleada en el recuento y clasificaci\xc3\xb3n de c\xc3\xa9lulas seg\xc3\xban sus caracter\xc3\xadsticas morfol\xc3\xb3gicas, presencia de biomarcadores, y en la ingenier\xc3\xada de prote\xc3\xadnas. En los cit\xc3\xb3metros de flujo, las c\xc3\xa9lulas suspendidas en un fluido atraviesan un fin\xc3\xadsimo tubo transparente sobre el que incide un delgado rayo de luz l\xc3\xa1ser, la luz transmitida y dispersada por el pasaje de las c\xc3\xa9lulas a trav\xc3\xa9s del tubo se recoge por medio de unos dispositivos de detecci\xc3\xb3n, permitiendo hacer inferencias en cuanto a tama\xc3\xb1o y complejidad de las c\xc3\xa9lulas. Tambi\xc3\xa9n permite el an\xc3\xa1lisis multiparam\xc3\xa9trico simult\xc3\xa1neo de otras caracter\xc3\xadsticas f\xc3\xadsicas y qu\xc3\xadmicas, evaluando en promedio m\xc3\xa1s de dos mil part\xc3\xadculas por segundo._NEWLINE_La citometr\xc3\xada de flujo es una t\xc3\xa9cnica utilizada en forma rutinaria en muchos centros de salud para el diagn\xc3\xb3stico y seguimiento de muchas enfermedades tales como las leucemias, granulomatosis cr\xc3\xb3nica, y SIDA; sin embargo tiene much\xc3\xadsimas otras aplicaciones en investigaci\xc3\xb3n b\xc3\xa1sica, pr\xc3\xa1ctica y ensayos cl\xc3\xadnicos. Una variante com\xc3\xban de esta t\xc3\xa9cnica es la separaci\xc3\xb3n f\xc3\xadsica de part\xc3\xadculas seg\xc3\xban sus propiedades, emple\xc3\xa1ndose por ejemplo para purificar poblaciones de inter\xc3\xa9s.\n_START_SECTION_\nHistoria\n_START_PARAGRAPH_\nEl primer cit\xc3\xb3metro de flujo basado en la medici\xc3\xb3n de impedancia, es decir utilizando el principio Coulter, fue descrito en la patente de Estados Unidos N\xc2\xba 2.656.508, expedida en 1953 a nombre de Wallace H. Coulter. Mack Fulwyler fue el inventor del precursor de los cit\xc3\xb3metros de flujo actuales, en particular del tipo separador de c\xc3\xa9lulas.\xe2\x80\x8b El primer dispositivo de citometr\xc3\xada de flujo basado en fluorescencia (ICP 11) fue desarrollado en 1968 por Wolfgang G\xc3\xb6hde de la Universidad de M\xc3\xbcnster, y declarado en la patente de Alemania N\xc2\xba 1815352 el 18 de diciembre de 1968.\xe2\x80\x8b Y comercializado por primera vez en los a\xc3\xb1os 1968 y 1969 por la empresa alemana Partec encargada del desarrollo y producci\xc3\xb3n a trav\xc3\xa9s de Phywe AG en Gotinga. En aquel tiempo los m\xc3\xa9todos de absorci\xc3\xb3n electromagn\xc3\xa9tica ten\xc3\xadan el favor de la comunidad cient\xc3\xadfica sobre los m\xc3\xa9todos fluorescentes.\xe2\x80\x8b Poco tiempo despu\xc3\xa9s comenz\xc3\xb3 el desarrollo comercial de los cit\xc3\xb3metros de flujo, incluyendo el citofluor\xc3\xb3grafo (1971) de la empresa Bio/Physics Systems Inc. (m\xc3\xa1s tarde Ortho Diagnostics), el PAS 8000 (1973) de la empresa Partec, y el primer dispositivo FACS de Becton Dickinson (1974), el ICP 22 (1975) de Partec/Phywe y el Epics de la Coulter Corporation en 1977/78.\n_START_SECTION_\nOrigen del nombre de la t\xc3\xa9cnica\n_START_PARAGRAPH_\nEl nombre original de la citometr\xc3\xada de flujo era "citofotometr\xc3\xada de pulso" (en Alem\xc3\xa1n: Impulszytophotometrie), que fue el nombre publicado en la primera patente de aplicaci\xc3\xb3n pr\xc3\xa1ctica de la citometr\xc3\xada de flujo fluorescente. Reci\xc3\xa9n en la 5.\xc2\xaa Conferencia sobre Citometr\xc3\xada Automatizada de la American Engineering Foundation realizada en Pensacola, Florida en 1976 -ocho a\xc3\xb1os despu\xc3\xa9s de la presentaci\xc3\xb3n del primer cit\xc3\xb3metro de flujo fluorescente (1968)- se acord\xc3\xb3 utilizar el nombre de citometr\xc3\xada de flujo, un t\xc3\xa9rmino que r\xc3\xa1pidamente gan\xc3\xb3 popularidad.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nPrincipio\n_START_PARAGRAPH_\nUn rayo de luz monocrom\xc3\xa1tico, usualmente de luz l\xc3\xa1ser, es dirigido hacia un fin\xc3\xadsimo chorro de l\xc3\xadquido hidrodin\xc3\xa1micamente enfocado. Se coloca una serie de detectores en el punto en el que el chorro de l\xc3\xadquido atraviesa el rayo de luz. Uno se coloca en l\xc3\xadnea con el rayo de luz (a este detector se lo conoce como FSC, por Forward Scatter o detector de Dispersi\xc3\xb3n Frontal), y varios angularmente a la trayectoria del rayo (a estos se los conoce como SSC, por Side Scatter, o detectores de Dispersi\xc3\xb3n Lateral); adem\xc3\xa1s de uno o m\xc3\xa1s detectores de fluorescencia. Cada una de las part\xc3\xadculas suspendidas con un tama\xc3\xb1o de entre 0,15 a 0,20 micr\xc3\xb3metros que atraviesan el rayo de luz lo dispersan, y las sustancias qu\xc3\xadmicas fluorescentes que se encuentran dentro o adheridas a la part\xc3\xadculas son excitadas hasta emitir luz a una longitud de onda mayor que la de la fuente de luz. Esta combinaci\xc3\xb3n de luz dispersada y fluorescencia es recogida por los detectores, y por medio de un an\xc3\xa1lisis en la fluctuaci\xc3\xb3n de la intensidad luminosa recogida por cada detector, es posible derivar varios tipos de informaci\xc3\xb3n acerca de la estructura f\xc3\xadsica y qu\xc3\xadmica de cada part\xc3\xadcula individual._NEWLINE_El detector frontal o FSC brinda informaci\xc3\xb3n acerca del volumen de la part\xc3\xadcula, mientras que los detectores laterales o SSC brindan informaci\xc3\xb3n acerca de la complejidad interna de la misma (por ejemplo la forma del n\xc3\xbacleo celular, la cantidad y tipo de gr\xc3\xa1nulos citoplasm\xc3\xa1ticos o la rugosidad de la membrana plasm\xc3\xa1tica). Esto es debido a que los componentes internos de las c\xc3\xa9lulas dispersan la luz. Algunos de los cit\xc3\xb3metros de flujo presentes en el mercado han eliminado la necesidad de un detector de fluorescencia y utilizan tan s\xc3\xb3lo la informaci\xc3\xb3n de luz dispersada para las mediciones. Otros cit\xc3\xb3metros de flujo son capaces de generar gr\xc3\xa1ficos de los datos obtenidos de la fluorescencia de las c\xc3\xa9lulas, luz dispersada y luz transmitida.\n_START_SECTION_\nGating\n_START_PARAGRAPH_\nLos datos generados por los cit\xc3\xb3metros de flujo pueden ser dibujados en relaci\xc3\xb3n a una variable, en forma de histograma, o en gr\xc3\xa1ficos de puntos (dot-plot) de dos dimensiones y dos o m\xc3\xa1s variables, o incluso en gr\xc3\xa1ficos tridimensionales. Las regiones delimitadas en estos gr\xc3\xa1ficos pueden ser separadas secuencialmente, de acuerdo con la intensidad de la fluorescencia, para crear una serie de subgrupos llamados "gates" (portales). Existen protocolos espec\xc3\xadficos para hacer la separaci\xc3\xb3n en gates, proceso conocido como gating, tanto para prop\xc3\xb3sitos cl\xc3\xadnicos como diagn\xc3\xb3sticos._NEWLINE_Los gr\xc3\xa1ficos de citometr\xc3\xada con frecuencia se hacen en funci\xc3\xb3n de escalas logar\xc3\xadtmicas. Ya que los diferentes compuestos fluorescentes utilizados para hacer el marcado poseen espectros de emisi\xc3\xb3n que con frecuencia se solapan,\xe2\x80\x8b las se\xc3\xb1ales recogidas por los detectores deben ser compensadas tanto electr\xc3\xb3nica como computacionalmente. Los datos acumulados por los cit\xc3\xb3metros pueden ser analizados utilizando diferentes softwares, tales como por ejemplo WinMDI\xe2\x80\x8b (el \xc3\xbanico que es freeware), Flowjo, FCS Express, VenturiOne, CellQuest Pro, o Cytospec.\xe2\x80\x8b Una vez que se han recogido los datos, no se hace necesario que la computadora siga conectada al cit\xc3\xb3metro, raz\xc3\xb3n por la cual la mayor parte de las veces el an\xc3\xa1lisis de datos se hace en otro ordenador. Esto se hace especialmente necesario en instalaciones centrales donde la utilizaci\xc3\xb3n de estas m\xc3\xa1quinas se encuentra bajo alta demanda.\n_START_SECTION_\nAn\xc3\xa1lisis computacional\n_START_PARAGRAPH_\nLos progresos recientes en la identificaci\xc3\xb3n autom\xc3\xa1tica de poblaciones utilizando m\xc3\xa9todos computacionales ha ofrecido una alternativa a las estrategias tradicionales del gating. Los sistemas automatizados de identificaci\xc3\xb3n podr\xc3\xadan, potencialmente, ayudar a encontrar poblaciones extremadamente peque\xc3\xb1as, raras, y ocultas. Los m\xc3\xa9todos automatizados m\xc3\xa1s representativos incluyen al FLOCK\xe2\x80\x8b en Immunology Database and Analysis Portal (ImmPort),\xe2\x80\x8b FLAME\xe2\x80\x8b GenePattern y flowClust,\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b en Bioconductor. Los esfuerzos colaborativos han desembocado en un proyecto abierto llamado FlowCap (Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods,\xe2\x80\x8b) de manera de proveer una v\xc3\xada alternativa para comparar y evaluar los datos obtenidos por los m\xc3\xa9todos de agrupamiento en citometr\xc3\xada de flujo, adem\xc3\xa1s de servir para establecer una gu\xc3\xada para el uso y aplicaci\xc3\xb3n m\xc3\xa1s apropiados para estos m\xc3\xa9todos.\n_START_SECTION_\nClasificaci\xc3\xb3n de c\xc3\xa9lulas activadas por fluorescencia\n_START_PARAGRAPH_\nLa t\xc3\xa9cnica de clasificaci\xc3\xb3n de c\xc3\xa9lulas activadas por fluorescencia FACS por sus siglas en ingl\xc3\xa9s (Fluorescence-Activated Cell Sorting) es un tipo especializado de citometr\xc3\xada de flujo. Esta t\xc3\xa9cnica provee un m\xc3\xa9todo para la clasificaci\xc3\xb3n y selecci\xc3\xb3n de c\xc3\xa9lulas provenientes de una mezcla de varias poblaciones en dos o m\xc3\xa1s contenedores de a una c\xc3\xa9lula por vez, seg\xc3\xban las caracter\xc3\xadsticas particulares de dispersi\xc3\xb3n y fluorescencia de cada c\xc3\xa9lula. Es un instrumento cient\xc3\xadfico de gran utilidad ya que provee un m\xc3\xa9todo de grabaci\xc3\xb3n de datos provenientes de las se\xc3\xb1ales de fluorescencia de cada c\xc3\xa9lula que es a la vez r\xc3\xa1pido, objetivo y cuantitativo; adem\xc3\xa1s permite la separaci\xc3\xb3n f\xc3\xadsica de aquellas c\xc3\xa9lulas pertenecientes a una poblaci\xc3\xb3n de inter\xc3\xa9s. El acr\xc3\xb3nimo FACS es una marca registrada perteneciente a Becton, Dickinson and Company.\xe2\x80\x8b Entre la gran mayor\xc3\xada de los investigadores que utilizan esta tecnolog\xc3\xada ya sea para la clasificaci\xc3\xb3n o el an\xc3\xa1lisis, este t\xc3\xa9rmino ha pasado a ser gen\xc3\xa9rico en el uso com\xc3\xban, al igual que xerox o kleenex. El clasificador de c\xc3\xa9lulas fue inventado por Mack Fulwyler en 1965, utilizando originalmente el principio Coulter como m\xc3\xa9todo de recolecci\xc3\xb3n de datos, una t\xc3\xa9cnica relativamente dif\xc3\xadcil y que ya casi no se utiliza en los instrumentos modernos. La t\xc3\xa9cnica fue ampliada luego por Len Herzenberg, quien fue el responsable de acu\xc3\xb1ar el t\xc3\xa9rmino FACS.\xe2\x80\x8b Herzenberg gan\xc3\xb3 el Premio Kioto en 2006 por su trabajo pionero en citometr\xc3\xada de flujo._NEWLINE_La suspensi\xc3\xb3n de c\xc3\xa9lulas es arrastrada hacia el centro de una corriente de l\xc3\xadquido estrecha, que fluye r\xc3\xa1pidamente. El flujo est\xc3\xa1 dispuesto de manera que existe una gran separaci\xc3\xb3n entre c\xc3\xa9lulas en relaci\xc3\xb3n con su di\xc3\xa1metro. Un mecanismo de vibraci\xc3\xb3n ultras\xc3\xb3nico provoca que la corriente de l\xc3\xadquido conteniendo las c\xc3\xa9lulas se rompa en peque\xc3\xb1as gotitas. El sistema se ajusta de modo que haya una baja probabilidad de que m\xc3\xa1s de una c\xc3\xa9lula quede contenida en cada gota. Justo antes de que la corriente se rompa en gotitas, el flujo pasa a trav\xc3\xa9s de una estaci\xc3\xb3n de medici\xc3\xb3n de fluorescencia, donde se mide el car\xc3\xa1cter fluorescente de inter\xc3\xa9s de cada c\xc3\xa9lula. Un anillo capaz de adquirir una carga el\xc3\xa9ctrica se coloca justo en el punto donde la corriente se rompe en gotitas. Seg\xc3\xban la medici\xc3\xb3n de la intensidad de fluorescencia recogida para cada c\xc3\xa9lula, el sistema entrega una determinada carga el\xc3\xa9ctrica al anillo, como consecuencia las gotitas se cargan el\xc3\xa9ctricamente con un signo contrario al del anillo mientras se desprenden de la corriente de l\xc3\xadquido. Las gotitas cargadas luego caen a trav\xc3\xa9s de un sistema de deflexi\xc3\xb3n electrost\xc3\xa1tica que desv\xc3\xada las gotas en los contenedores dependiendo de su carga. En algunos sistemas, la carga se aplica directamente a la corriente de l\xc3\xadquido, y como resultado la gotita que se desprende retiene carga del mismo signo que la aplicada. Luego de que la gotita se desprende, el anillo recupera una carga neutra.\n_START_SECTION_\nMarcadores fluorescentes\n_START_PARAGRAPH_\nSe pueden utilizar un amplio rango de fluor\xc3\xb3foros como etiquetas para el marcado fluorescente en citometr\xc3\xada de flujo. Los fluor\xc3\xb3foros se encuentran por lo general qu\xc3\xadmicamente unidos a anticuerpos espec\xc3\xadficos capaces de reconocer una determinada mol\xc3\xa9cula diana en la superficie o en el interior de la c\xc3\xa9lula. Estas etiquetas fluorescentes tambi\xc3\xa9n pueden adosarse qu\xc3\xadmicamente a casi cualquier compuesto qu\xc3\xadmico que presente una cierta afinidad por la membrana o alguna otra estructura celular. Cada fluor\xc3\xb3foro posee un pico de excitaci\xc3\xb3n caracter\xc3\xadstico, y una longitud de onda de emisi\xc3\xb3n tambi\xc3\xa9n caracter\xc3\xadstica. Sin embargo los espectros de emisi\xc3\xb3n de diferentes etiquetas con frecuencia se superponen, por consiguiente, la combinaci\xc3\xb3n de marcadores que pueden ser usados depende de la longitud de onda de la l\xc3\xa1mpara(s) o del l\xc3\xa1ser(es) usados para excitar los fluorocromos y en los tipos de detectores que se encuentren disponibles.\xe2\x80\x8b El n\xc3\xbamero m\xc3\xa1ximo de marcadores fluorescentes distinguibles se cree que se encuentra entre 17 o 18, y este nivel de complejidad requiere un laborioso proceso de optimizaci\xc3\xb3n para limitar los artefactos, as\xc3\xad como complejos algoritmos de deconvoluci\xc3\xb3n para separar los espectros solapados.\xe2\x80\x8b _NEWLINE_Marcadores fluorescentes de uni\xc3\xb3n covalente: Isoticianato de fluoresce\xc3\xadna, picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Marcadores fluorescentes de uni\xc3\xb3n no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de acridina, yoduro de propidio, rh12. Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente.\n_START_SECTION_\nPuntos cu\xc3\xa1nticos\n_START_PARAGRAPH_\nA veces se utilizan puntos cu\xc3\xa1nticos en lugar de los tradicionales fluor\xc3\xb3foros debido a que poseen un pico de emisi\xc3\xb3n mucho m\xc3\xa1s estrecho.\n_START_SECTION_\nMarcado isot\xc3\xb3pico\n_START_PARAGRAPH_\nUno de los enfoques utilizados para soslayar el l\xc3\xadmite de marcas fluorescentes utilizables, es utilizar en su lugar is\xc3\xb3topos de lant\xc3\xa1nidos adosados a los anticuerpos. Este m\xc3\xa9todo podr\xc3\xada en teor\xc3\xada, permitir el uso de entre 40 y 60 marcadores perfectamente distinguibles, y ha sido demostrado hasta para 30 etiquetas distintas.\xe2\x80\x8b Las c\xc3\xa9lulas son ionizadas por medio de un chorro de plasma permitiendo de esta manera identificar los is\xc3\xb3topos asociados por medio de espectrometr\xc3\xada de masas de tiempo de vuelo. Aunque este m\xc3\xa9todo permite el uso de un mayor n\xc3\xbamero de etiquetas, de hecho posee un menor rendimiento que la citometr\xc3\xada de flujo tradicional. Y adem\xc3\xa1s destruye las c\xc3\xa9lulas analizadas, impidiendo de esta forma su recuperaci\xc3\xb3n para un proceso de selecci\xc3\xb3n.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nAplicaciones\n_START_PARAGRAPH_\nLa tecnolog\xc3\xada de la citometr\xc3\xada de flujo tiene aplicaciones en numerosos campos, incluyendo la biolog\xc3\xada molecular, inmunolog\xc3\xada, biolog\xc3\xada vegetal y marina. Tiene una amplia aplicaci\xc3\xb3n en medicina, (especialmente en trasplantes, hematolog\xc3\xada, inmunolog\xc3\xada tumoral, y quimioterapia, diagn\xc3\xb3stico prenatal, gen\xc3\xa9tica y selecci\xc3\xb3n de esperma para una preselecci\xc3\xb3n de sexo). En biolog\xc3\xada marina se ha explotado las propiedades autofluorescentes del plancton fotosint\xc3\xa9tico para caracterizar abundancia y estructura comunitaria. En ingenier\xc3\xada de prote\xc3\xadnas, se utiliza la citometr\xc3\xada de flujo en conjunci\xc3\xb3n con t\xc3\xa9cnicas de expresi\xc3\xb3n en levaduras y expresi\xc3\xb3n en bacterias, para identificar aquellas prote\xc3\xadnas expresadas en la superficie celular que posean las caracter\xc3\xadsticas deseadas.'