SciELO - Brazil - Avaliação do efeito do Risedronato Sódico na consolidação de fraturas: estudo experimental em ratos Avaliação do efeito do Risedronato Sódico na consolidação de fraturas: estudo experimental em ratos
Artigos Originais • Acta ortop. bras. 12 (2) • Jun 2004 • https://doi.org/10.1590/S1413-78522004000200002 copiar
Luiz Antonio Alcântara de Oliveira
Consuelo Junqueira Rodrigues
Paulo José de Santana
Desnutrição protéica; Risedronato; Consolidação de fraturas; Ratos
Protein malnutrition; Risedronate; Fracture healing; Rats
IProfessor Adjunto Doutor da FMUEL
IIProfessor Livre-Docente da FMUSP
IIIProfessor Assistente da FMUEL
Descritores: Desnutrição protéica; Risedronato; Consolidação de fraturas; Ratos.
A consolidação das fraturas é uma resposta especializada do organismo em que a regeneração do osso leva à restauração da integridade do esqueleto. Embora a maioria das fraturas consolide sem problemas, fatores como a desnutrição protéica, presente em nosso meio, podem interferir negativamente na consolidação de fraturas(9).
Não há no arsenal farmacêutico um medicamento que acelere a consolidação das fraturas, apesar dos estudos que vêm sendo realizados no sentido de se buscar esse resultado(3,12). Diante disso, empregou-se o risedronato sódico, um bisfosfonato formador de massa óssea, com o intuito de se observar a sua eficácia na consolidação das fraturas, através de um estudo experimental em ratos nutridos e desnutridos.
Analisou-se, através de análise estatística, o comportamento bioquímico do cálcio, fósforo e fosfatase alcalina, além das proteínas totais e albumina, e do marcador bioquímico da formação óssea, a osteocalcina. Foram também analisados estatisticamente os dados obtidos através de avaliações ponderal, radiográfica, densitométrica, histológica e histomorfométrica.
O objetivo deste trabalho é avaliar a influência do risedronato sódico, experimentalmente, no processo de consolidação de fraturas em ratos machos adultos, nutridos e subnutridos, nos quais foram provocadas fraturas nas tíbias direitas.
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de Londrina, Pr, em Parecer BIO 033/00 e pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo sob o protocolo nº 669/00.
Foram utilizados 40 ratos de laboratório de linhagem Lewis, machos, adultos, isogênicos, com peso inicial variando entre 250 e 342 gramas.
Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos com dez animais em cada grupo, assim distribuídos: grupo I, com dieta protéica, sem o risedronato (grupo controle); grupo II, com dieta protéica, com risedronato; grupo III, com dieta aprotéica, sem risedronato; grupo IV, com dieta aprotéica, com risedronato, sendo mantidos em gaiolas, contendo cinco animais em cada uma, feitas de polietileno opaco, e fechadas com tampa de aço inoxidável em forma de grade, forradas com sepilho, e higienizadas três vezes por semana. No recinto onde os animais permaneciam, o período de luz foi de 12 horas, com temperatura, umidade e nível de ruído mantidos estáveis.
A dieta aprotéica, fornecida aos animais dos grupos III e IV, é padronizada e utilizada para desnutrição experimental em animais de laboratório.
Para a análise bioquímica, foram realizadas coletas de sangue através de punção cardíaca nos dias 1º, 15º e 43º do experimento.
No 15º dia, os ratos foram submetidos a fratura fechada do terço médio das tíbias direitas, realizadas manualmente por flexão forçada, procurando-se obter similaridade quanto ao traço, localização e mobilização do periósteo, estando os animais sob anestesia, através de injeção intraperitoneal de solução composta de cetamina na dose de 40 mg/kg e de xilazina na dose de 5 mg/kg(7,14) de peso corporal diluídos em 1 ml de solução salina. Após a realização das fraturas, os animais dos grupos II e IV passaram a receber dose diária de 1 mg/kg/dia de risedronato sódico, através de gavagem com cateter de polietileno especialmente adaptado, medindo 5 cm de comprimento e 1 mm de diâmetro, sendo a solução preparada imediatamente antes de cada administração oral. A contenção do animal foi feita por técnico habilitado, e, afastando-se a mandíbula com espátula, administrou-se o medicamento aos grupos II e IV, sem necessidade de anestesia. A administração da solução de risedronato sódico foi efetuada em dose única diária, após a fratura, durante 28 dias.
A eutanásia dos animais ocorreu 28 dias após a realização das fraturas, no 43º dia do experimento, atendendo-se a um protocolo de administração de dose letal obtida com anestesia injetável intraperitoneal de barbitúrico após a indução anestésica com halotano, finalizando com dose letal de cloreto de potássio. Após esse procedimento, realizou-se a pesagem e a desarticulação coxo-femoral direita dos animais para estudo do calo ósseo.
A avaliação do material de estudo foi feita de acordo com a evolução ponderal dos animais e das dosagens séricas do cálcio, fósforo, fosfatase alcalina, proteínas totais, albumina e osteocalcina no 1º, 15º e 43º dias, e do estudo radiográfico, planimetria, densitometria, histologia e histomorfometria do calo ósseo no final do estudo.
Para o estudo estatístico, utilizou-se a técnica de análise de variância para o delineamento inteiramente casualizado, e mascaramento do tipo duplo-cego, em esquema fatorial de tratamento, com desdobramento dos graus de liberdade do efeito da interação entre a dieta e a medicação. Os dados obtidos foram analisados em nível de significância de 5%, ou seja, os testes foram considerados significativos quando p<0,05.
A seguir, as tabelas com as médias e os desvios-padrões das variáveis mensuradas e sua respectiva análise de variância.
A avaliação clínica comparativa e sistemática da formação do calo ósseo em fraturas apresenta muitas dificuldades, pois há inúmeras diferenças individuais no que diz respeito à natureza e ao local da fratura, curso e duração da consolidação. Porém, particularmente difícil é estudar os métodos terapêuticos capazes de influenciar a formação do calo ósseo. Assim, é natural que se aborde esse problema experimentalmente, para podermos comparar de maneira homogênea o material, isto é, as mesmas condições quanto ao sexo, idade, peso, dieta, natureza e localização da fratura. Além disso, em países em desenvolvimento como o Brasil, deve-se considerar o estado nutricional como fator influente na consolidação de fraturas, pois dele depende a restauração à integridade do esqueleto.
Neste experimento, o animal utilizado foi o rato, por ser o modelo mais prático e comum. As fraturas são de rápida consolidação, dispensando imobilização externa ou interna, e sem complicações importantes. O modelo também possibilita a coleta de sangue para a o estudo bioquímico. As alterações ósseas relacionadas à evolução do calo ósseo podem ser facilmente verificadas nesse modelo animal(10). O modelo também permite a avaliação da formação do calo ósseo em situações como a desnutrição(9), ou da ação de substâncias como a calcitonina(8), alendronato sódico(12), fluoreto de sódio(2), complexo osseína-hidroxiapatita(3).
As fraturas foram obtidas por osteoclasia manual(13), e mostraram similaridade satisfatória, com pequenas diferenças de localização, porém sem necessidade de se criar um dispositivo mecânico para a sua realização. A comparação de consolidação de fraturas experimentais exige similaridade, o que se procurou obter neste experimento. Os animais não foram imobilizados, tendo sido deixados livres para a deambulação, porque a imobilização, além de ser desnecessária, poderia criar possibilidade de interferência pela presença de material de síntese(8).
A via peritoneal, para a realização da anestesia, é a mais usada para roedores. Não houve complicações durante o ato anestésico, o que nos permite assegurar a eficácia desta conduta.
A dieta aprotéica para desnutrição experimental(11) levou à desnutrição protéica, verificada na análise dos valores das proteínas totais (p<0,0001) e da albumina (p=0,0153). A desnutrição protéica assim obtida teve interferência direta na consolidação das fraturas, o que concorda com observações obtidas em outros estudos(8,9).
O medicamento utilizado neste experimento com o fim de se analisar sua possível influência como adjuvante na consolidação das fraturas, o risedronato sódico, é um piridinil bisfosfonato de terceira geração que, como outros bisfosfonatos, inibe a reabsorção óssea mediada pelos osteoclastos(5).
A formação de uma ponte entre os fragmentos de um osso fraturado constitui o passo mais importante na sua consolidação; a quantidade de calo ósseo é a porção visível nas radiografias(1). As fraturas experimentais nas tíbias de ratos atingem a fase de ossificação em torno da quarta semana de evolução, quando já demonstram evidências radiográficas de consolidação. Com base nesses dados, foi determinada a eutanásia dos animais 28 dias após a realização das fraturas, para a avaliação radiográfica, densitométrica e histológica do calo ósseo.
A desnutrição dos animais dos grupos III e IV foi evidenciada pela significante perda de peso (p<0,0001), o que foi observado já no 15º dia do experimento, ocasião em que foram realizadas as fraturas, persistindo a perda de peso até o final do experimento.
Para a avaliação planimétrica, foram feitas radiografias (Figuras 1 e 2) depois da desarticulação do joelho. Na avaliação radiográfica, a diferença entre os resultados médios dos calos ósseos foi estatisticamente significante (p<0,0001), havendo menor área de calo ósseo nos grupos que consumiram a dieta desprovida de proteínas, o que concorda com os achados de outros estudos(9) que demonstraram haver calo mais abundante nas fraturas em ratos nutridos quando comparados aos subnutridos.
A análise densitométrica mostrou diferença estatisticamente significante quando houve a administração do risedronato. Os bisfosfonatos se aderem aos minerais do osso, agindo sobre os osteoclastos, têm alta seletividade de localização e retenção nos ossos, e podem aumentar a massa óssea(5). Este fato vem também confirmar o mecanismo de ação do risedronato como inibidor da reabsorção óssea mediada pelos osteoclastos.
Comparando os grupos com dieta aprotéica com e sem risedronato, os estudos histológicos não apresentaram diferença significante quanto à quantidade de osso formado, porém observou-se que no grupo com dieta aprotéica com risedronato, havia mais tecido ósseo maduro, evidenciando calcificação ao exame anátomo-patológico, quando comparado ao grupo com dieta aprotéica sem o medicamento. Assim, qualitativamente, o risedronato contribuiu para a formação de tecido ósseo maduro, de melhor qualidade e morfologia, embora quantitativamente não tenha oferecido diferença significativa, ao exame histológico, nas amostras dos grupos submetidos às dietas protéica e aprotéica (Figuras 3-6). Essa diferença na qualidade do tecido ósseo foi também observada nos grupos com dieta protéica, comparando-se os grupos com e sem risedronato, o que constata que o risedronato melhora a arquitetura trabecular(6,12).
Na avaliação dos componentes teciduais das diferentes amostras, ao se avaliar a porcentagem de tecido fibroso, e de osso neoformado, verificou-se que não houve significância estatística nos grupos de diferentes dietas, com ou sem a administração do risedronato. Porém, quando avaliado o percentual de tecido cartilagíneo, verificou-se diferença estatisticamente significante (p<0,05), com aumento do mesmo, quando o risedronato foi administrado ao grupo de dieta aprotéica. Isso é significativo por ser provável que a cartilagem evolua para ossificação endocondral. Contudo, não há garantia disso, visto que é possível a evolução para retardo de consolidação ou mesmo para pseudartrose.
Na avaliação laboratorial dos níveis de cálcio, observou-se diferença significativa nos níveis séricos do cálcio (p<0,05) nos grupos que receberam o risedronato tanto de dieta aprotéica como o de dieta protéica, confirmando o efeito hipocalcemiante dos bisfosfonatos(5).
A análise dos níveis séricos da fosfatase alcalina revelou diferença estatisticamente significante nos grupos com dietas diferentes, sendo diminuída nos grupos com dieta aprotéica, o que pode ser explicado pela desnutrição; porém, a adição do risedronato não causou diferença estatisticamente significante nos diferentes grupos.
A análise das variações dos níveis séricos das proteínas totais, possibilitou verificar que houve diferença estatisticamente significante quando analisada a dieta (p<0,001), confirmando a desnutrição protéica. A adição do risedronato não causou diferença significativa nos grupos que receberam o medicamento.
Em relação à análise dos níveis séricos da albumina, houve diferença estatisticamente significante na análise das diferentes dietas. A presença do risedronato na dieta protéica foi estatisticamente significante, o que pode sugerir que esse medicamento talvez interfira no metabolismo dessa proteína, abrindo espaço para mais estudos desse assunto.
A osteocalcina, uma proteína de baixo peso molecular, sintetizada pelos osteoblastos, e específica para o tecido ósseo, tem seus níveis séricos aumentados na formação óssea(4). Neste experimento, os níveis séricos desta proteína estiveram aumentados no grupo em que o risedronato foi administrado aos animais que consumiam a dieta aprotéica, apresentando diferença estatisticamente significante (p=0,0024) aos 43 dias. Apresentou, também, diferença estatisticamente significante (p=0,0498) no grupo que recebeu dieta protéica. A osteocalcina é produzida e liberada pelos osteoblastos durante a formação óssea, e o aumento sérico deste marcador do metabolismo ósseo neste experimento, principalmente quando da administração do risedronato, demonstra uma elevação da atividade osteoblástica que traduz produção óssea, isto é, anabolismo.
O risedronato exerceu influência significativa em diversas variáveis, como na quantidade relativa de cartilagem, que é o sítio para a ossificação endocondral, presente no calo ósseo; na densitometria óssea; no marcador da formação óssea, a osteocalcina; sendo sua ação principalmente nos animais desnutridos. Isso pode ter uma aplicação clínica importante, principalmente em se tratando de pacientes que vierem a sofrer fraturas estando em situação de carência nutricional, como pacientes acamados por longo período, idosos, ou em outra situação de desvantagem, o que certamente nos desafia a novas pesquisas nessa área.
O risedronato sódico administrado por via oral na dose de 1 mg/kg de peso corporal exerceu influência positiva no processo de consolidação de fraturas em ratos nutridos ou desnutridos.
O risedronato sódico apresentou significância estatística na avaliação da densidade mineral óssea nos ratos nutridos e desnutridos.
Na avaliação bioquímica, a osteocalcina demonstrou que o risedronato contribuiu positivamente para a formação óssea nos animais.
Trabalho recebido em 14/04/03
Aprovado em 06/04/04
Trabalho realizado no Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da universidade de São Paulo (FMUSP) e na Faculdade de Medicina da Universidade Estadual de Londrina (FMUEL)
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