ReP USP - Detalhe do registro: Variabilidade do domínio KH-2 da proteína do retardo mental do X frágil (FMRP)
Autor USP: VELLOSO, FERNANDO JANCZUR - IB
Subjects: RETARDO MENTAL; MUTAÇÃO GENÉTICA; DOENÇAS GENÉTICAS; CROMOSSOMO X FRÁGIL
Keywords: Alternative splicing KH-2 protein; Domínio KH-Z; FMR1; FMR1; FMRP; FMRP; Frágil X syndrome; Síndrome do X Frágil; Splicing alternativo
Abstract: A proteína do retardo mental do X frágil (FMRP), codificada pelo gene do Retardo Mental do X Frágil (do inglês, Fragile Mental Retardation 1, FMR1) tem expressão significativa no encéfalo, gônadas e células proliferativas. A FMRP é uma proteína ligante de RNA, repressora traducional, que transita entre o núcleo celular, grânulos citoplasmáticos e polissomos. Sua associação a RNA pode se dar pelos domínios Tudor N-terminais, dois domínios centrais, com homologia à heteronucleoproteína K (KH) ou motivos RGG, ricos em arginina (R) e glicina (G), C-terminais. A abolição da expressão da FMRP por mutações no gene FMR1 é a causa mais frequente de deficiência intelectual hereditária entre homens. Transcritos desse gene sofrem splicing alternativo de quatro éxons, podendo gerar até 20 isoformas não redundantes da FMRP. A tradução de RNAm do FMR1 contendo o éxon 12 causa uma extensão em fase, em 21 aminoácidos na alça variável do segundo domínio KH (KH-2) da FMRP, cujos padrão de expressão e função ainda são desconhecidos. Embora a FMRP tenha alta similaridade com duas proteínas parálogas, proteínas relacionadas à FMRP, FRX1P e FXR2P, ela apresenta algumas características de expressão e função que lhes são próprias. A longa alça variável do domínio KH-2, por exemplo, não é observada nas parálogas e é característica somente de ortólogas da FMRP em mamíferos. Assim, é possível que o estudo deste segmento da proteína traga informações funcionais específicas para o encéfalo de mamífero.Demonstramos anteriormente, por qRT-PCR, que, em transcritos do Fmr1 de rato, a expressão da sequência do éxon 12 é regulada ao longo do desenvolvimento pós-natal precoce, de forma diferencialmente positiva no córtex cerebral frontal e cerebelo, em relação ao hipocampo. No presente trabalho, aprofundamos esses estudos, tendo como objetivo a análise cuidadosa da expressão desse éxon em isoformas da FMRP (FMRP+12ISO), pelo uso de um anticorpo dirigido ao segmento codificado por ele, em encéfalos do décimo segundo dia pós-natal (P12, controle positivo) ou embrionários. Para tal, foram realizadas análises por imunoistoquímica e, em P12, ensaios de cromatografia de exclusão molecular de partículas ribonucleoproteicas. Análises de níveis de RNAm e proteicos em fase embrionária (E12 a E20) do encéfalo do rato foram também conduzidas in vivo e in vitro, em cultivo primário de neuroesferas em suspensão, a partir da dissociação de vesículas telencefálicas de ratos em E14. Os dados de imunoistoquímica de encéfalo de ratos em P12 indicaram que (i) as camadas granular externa e a camada piramidal externa do córtex cerebral e as células de Purkinje no cerebelo são mais ricas em FMRP+12ISO; (ii) o giro denteado e CA3 foram fontes de FMRP+12ISO no hipocampo, porém em mais baixa intensidade; e (iii) o conjunto das isoformas da FMRP, incluindo as FMRP+12ISO, foram expressas em região periventricular dos ventrículos laterais em período pós-natal, sugestivo de células-tronco neurais do adultoou recém diferenciadas. No córtex cerebral, as FMRP+12ISO foram expressas em áreas motora (segmento rostrodorsal), sensorial (segmentos dorsolaterais a laterais), auditiva (segmentos dorsolaterais), olfatória (córtex piriforme) e visual (segmentos ventrolaterais), além da área do cingulado (segmentos mediais) de ambos os hemisférios cerebrais. Os dados também confirmaram que, em P12, as FMRP+12ISO têm expressão mais pronunciada no córtex cerebral e cerebelo do que no hipocampo. À cromatografia, as FMRP+12ISO tiveram o mesmo padrão de distribuição que o conjunto das isoformas da FMRP, fracionando em complexos ribonucleoproteicos maiores que 600 kDa. De modo geral, a expressão das FMRP+12ISO foi baixa em E12 e E14. Houve concordância entre as análises por qRT-PCR, Western blotting e imunoistoquímica, corroborando a baixa expressão do éxon 12 do FMR1 na vesículas telencefálicas em E14. Observamos por imunoistoquímica poucas células sugestivas de progenitoras, na base do neuroepitélio, que expressassem FMRP+12ISO ou outras isoformas da FMRP. O córtex cerebral em E20 foi raramente positivo para FMRP+12ISO ou o conjunto das isoformas da FMRP. Por outro lado, células da camada mais superficial da placa cortical, indicativa de ser a camada I, mostraram expressão de isoformas da FMRP sem o segmento codificado pelo éxon 12 do Fmr1, em E18 e da FMRP, incluindo as FMRP+12ISO, em E20, de forma contínua em várias regiões corticais. Em neuroesferas em suspensão, a expressão das FMRP+12ISOfoi muito baixa enquanto isoformas da FMRP, supostamente com a alça variável de KH- 2 em sua conformação curta, tiveram alta expressão nessas células. Desde as primeiras 24 horas sob condições de diferenciação neuronal in vitro, células de neuroesferas aumentaram a expressão das FMRP+12ISO, que se mantiveram alta no período analisado (12 dias in vitro), colocalizando-se com outras isoformas da FMRP. Ensaios preliminares in vitro pela interferência do RNA, em células imortalizadas C6, indicaram um RNA em fita dupla, entre dois testados, com capacidade de inibição de mensagens do Fmr1 que especificamente contenham o éxon 12. A expressão do éxon 12 do FMR1 no córtex cerebral frontal, humano, em envelhecimento foi baixa pela análise de RNAm, enquanto o total de transcritos deste gene apresentou-se em níveis significativos. Nossos dados sugerem que a expressão do éxon 12 do Fmr1 é mais significativa para FMRP+12ISO em células neuronais, durante um período crítico de sinaptogênese, no primeiro mês pós-natal do rato. O tecido telencefálico, embrionário não se mostrou uma fonte rica dessas isoformas, principalmente em células indiferenciadas, que foram francamente negativas