Os 26 animais colostomizados foram randomizados em dois grupos experimentais composto de 13 animais, segundo o sacrifício ter sido realizado duas ou quatro semanas após a derivação do trânsito fecal. Cada grupo foi dividido por sua vez em dois subgrupos de acordo com a solução de intervenção aplicada no reto. No primeiro subgrupo, aplicaram-se clisteres retais, em dias alternados, contendo 20 mL de SF à 37ºC (grupo controle; n=4). No segundo subgrupo, os clisteres continham butirato de sódio (B5887- Sigma-Aldrich Corporation, St Louis, MO, USA) na dose de 100 mL/Kg na concentração de 80 mmol/L (grupo experimental; n=9).
Duas ou quatro semanas após a intervenção com as substâncias propostas os animais foram anestesiados com a mesma técnica descrita anteriormente, a cavidade abdominal foi reaberta, removendo-se dois fragmentos com quatro centímetros cada, obtidos do cólon submetido ou não a irrigação com as soluções de intervenção propostas. Os espécimes retirados foram abertos longitudinalmente pela borda antimesentérica, lavados com SF e divididos em dois fragmentos, com dois centímetros de comprimento, destinados aos estudos histológicos e avaliação dos níveis de peroxidação lipídica pela quantificação tecidual do malondialdeído (MDA).
Os fragmentos destinados a análise histológica foram imediatamente imersos em paraformaldeído a 4% em PBS, por 24 h e, logo após, desidratados em concentrações crescentes de etanol. Terminada esta fase, foram inclusos em blocos de parafina e, a partir destes, realizou-se cortes histológicos com 5 μm de espessura, que posteriormente foram montados sobre uma lâmina. Depois de montados, os cortes foram corados com hematoxilina-eosina (HE) para o diagnóstico de colite. As lâminas foram analisadas por patologista experiente no diagnóstico de doenças inflamatórias colorretais, que desconhecia a origem do material e os objetivos do estudo. Para o diagnóstico da colite considerou-se dois parâmetros principais: a infiltração de polimorfonucleares na mucosa cólica e a presença de erosões ou úlceras epiteliais.
A medida dos níveis de peroxidação lipídica foi avaliada pela dosagem das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), tais como o MDA, segundo metodologia proposta anteriormente23. O MDA é um dos produtos secundários da lipoperoxidação, sendo considerado candidato potencial como um biomarcador geral de estresse oxidativo tecidual. Para a quantificação dos níveis tissulares de MDA, resumidamente, 1 g de cada fragmento cólico foi colocada em 5 mL de tampão fosfato e homogeneizada em vórtex e ultrassonicador por 30 s, repetindo-se o processo três vezes, alternadamente. A seguir, 250 µL do sobrenadante, obtido no processo de homogeneização, foram transferidos para tubo plástico contendo 25 µL de hidroxi-tolueno butilado (BHT) a 4% metanólico e, novamente, homogeneizados no vórtex. A seguir adicionou-se 1 mL de ácido tricloroacético a 12%, 1 mL de ácido tiobarbitúrico a 0,73% e 750 µL de tampão tris/HCl incubando-se em banho-maria, a 100ºC, por 60 min. Concluída essa etapa, os tubos foram imediatamente acondicionados em recipiente contendo gelo para bloquear a reação. A seguir acrescentou-se 1,5 mL de n-butanol homogeneizando-se, no vórtex, por mais 30 s. Posteriormente, os tubos foram centrifugados por 10 min a 5.000 rpm e, o sobrenadante, removido para a leitura da coloração em espectrofotômetro Lambda 45UV/VIS (Perkin-Elmer Inc., Massachussetts, USA), sempre em absorbância de 532 nm.
Os valores teciduais de MDA, nos segmentos irrigados e não irrigados com as soluções de intervenção, foram expressos pelo valor médio com o respectivo desvio-padrão. Os resultados encontrados nos segmentos expostos e não expostos a SF e ao butirato foram comparados pelo teste de Mann-Whitney. A variação nos níveis teciduais de MDA, nos diferentes tempos de irrigação, foi avaliada pelo teste de Kruskal-Wallis. Na análise estatística dos resultados encontrados, adotou-se nível de significância de 5% (p<0,05), utilizando-se o programa SPSS® (SPSS Inc., Chicago, USA) versão 13.0 para Windows.