Hortic. Bras. vol.27 no.4 Brasília out./dez. 2009
http://dx.doi.org/10.1590/S0102-05362009000400013
Serology detection of Melon yellowing-associated virus (MYaV) in melon producing areas of the Brazilian Northeast
Mirtes F LimaI; Tatsuya NagataII; Filipe M NevesIII; Alice K Inoue-NagataI; Antônio W MoitaI; Carla SousaIV; Marília Della VecchiaIV; Maurício G RangelIV; Rita de CS DiasV; Luiza S DutraVI; Antônio C de ÁvilaI
IEmbrapa Hortaliças, C. Postal 218, 70359-970 Brasília-DF; mflima@cnph.embrapa.br
IIUnB-Depto Biologia Celular, C. Postal 153081, 70910-900 Brasília-DF
IIIPós-graduando Universidade Católica de Brasília
IVSyngenta Seeds Ltda, C. Postal 71, 62800-000 Aracati-CE
VEmbrapa Semi-Árido, C. Postal 23, 56302-970 Petrolina-PE
VIGraduando Universidade Católica de Brasília, 70790-160 Brasília-DF
Palavras-chave: detecção, sorologia, DAS-Elisa, amarelão, levantamento.
Keywords: Cucumis melo, serology, DAS-ELISA, yellowing of melon plants, survey.
Em 2007, a produção de melão (Cucumis melo L.) no Brasil foi de cerca de 500.000 t em mais de 22.000 ha plantados (IBGE, 2008).
No País, a Região Nordeste é a principal produtora de melão, contribuindo com mais de 90% da produção nacional (Vilela, 2009). As condições climáticas desta região, caracterizadas por elevadas temperaturas e níveis de luz solar, têm propiciado a obtenção de alta produtividade e frutos de qualidade superior, elevando o status da cultura em nível de produto de exportação.
Os estados do RN e CE, representados principalmente pelos pólos agrícolas de Mossoró-Assu e Baixo Jaguaribe, respectivamente, são os maiores produtores da fruta na região, seguidos pelo Submédio do Vale do São Francisco, o qual abrange parte dos estados da BA e PE.
Entre as doenças que afetam plantas da família Cucurbitaceae, aquelas causadas por vírus podem ser bastante destrutivas. No Brasil, as viroses estão entre os principais problemas fitossanitários que afetam espécies desta família, causando redução na qualidade dos frutos e perda significativa na produção. A incidência e a severidade destas doenças podem variar segundo a interação patógeno, hospedeiro, vetor e meio ambiente (Provvidenti, 1996).
Além destes fatores, a ocorrência de infecção mista, com a presença de diferentes espécies de vírus infectando a mesma planta, pode tornar a sintomatologia mais complexa e aumentar significativamente as perdas na produção. Os vírus podem infectar as cucurbitáceas em quaisquer estádios de desenvolvimento. Entretanto, os prejuízos são maiores quando a infecção ocorre na fase de mudas.
Mais de dez vírus infectando cucurbitáceas já foram relatados no País (Moura et al., 2001). Entretanto, aqueles detectados com maior freqüência nestas culturas são Papaya ringspot virus - type watermelon (PRSV-w), Watermelon mosaic virus (WMV), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), Squash mosaic virus (SqMV) e Cucumber mosaic virus (CMV).
Nas duas últimas décadas, dois novos vírus foram detectados em espécies desta família, o Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV), transmitido por tripes, relatado em 1997 afetando a cultura da abobrinha (Pozzer et al., 1996; Rezende et al., 1997) e, no final da década de 90, o Melon yellowing-associated virus (MYaV) associado à doença "amarelão do meloeiro", transmitido pela mosca branca Bemisia tabacci (Genn.) biótipo B (Nagata et al., 2003, 2005).
A doença foi assim denominada pelos produtores devido ao amarelecimento generalizado das folhas, principalmente das folhas baixeiras. Os sintomas da virose são percebidos a partir de 35-37 dias do plantio observando-se, inicialmente, o amarelecimento das folhas basais e que, com o progresso da infecção torna-se mais acentuado (Silva et al., 2002).
Resultados de pesquisas revelaram que o agente causal do amarelão pode ser transmitido para plantas sadias por mosca-branca (Santos et al., 2002; Nagata et al., 2003) e por enxertia (Lima et al., 2002; Nagata et al., 2003, 2005). Entretanto, a transmissão por inoculação mecânica ainda não foi comprovada.
Em meloeiros exibindo sintomas típicos da doença, observou-se de forma consistente, a presença de partículas flexuosas e inclusões similares àquelas induzidas por espécies de vírus do gênero Carlavirus da família Flexiviridae (Nagata et al., 2003, 2005).
Até o momento, apenas um fragmento de 1.612 nucleotídeos do genoma do MYaV foi sequenciado (Nagata et al., 2003). Apesar da análise desta sequência ter indicado alguma similaridade com vírus do gênero Carlavirus, a posição taxonômica do MYaV ainda não está completamente elucidada, considerando-se que o sequenciamento completo do genoma do vírus ainda não foi concluído.
A sua conclusão propiciará também o desenvolvimento de métodos acurados de diagnose baseados na detecção do ácido nucléico. A correta identificação do agente causal da doença do amarelão e o conhecimento da forma de disseminação são de primordial importância para o estabelecimento de medidas eficientes de controle.
A diagnose do MYaV, até o presente, pode ser feita por meio de enxertia ou de transmissão por mosca-branca, seguida de teste sorológico com anti-soro específico para o MYaV (Ávila et al., 2008).
Este estudo teve como objetivo realizar um levantamento da ocorrência do MYaV nos principais pólos de produção de melão dos estados do RN, CE, PE e BA, utilizando como ferramenta de detecção anticorpos policlonais e o teste DAS-Elisa (Ávila et al., 2008).
Durante o mês de novembro de 2007, plantios comerciais de meloeiro foram inspecionados nos principais estados produtores do País, para avaliação da ocorrência da doença amarelão do meloeiro. Um total de 374 plantas, a maioria exibindo sintomas sugestivos do amarelão (MYaV), foram coletadas em áreas produtoras da Região Nordeste.
No estado do RN, 54 amostras foram coletadas em plantios de meloeiro dos municípios de Mossoró, Baraúna, Assu e Panguassu, enquanto que no estado do CE, 37 amostras foram oriundas dos municípios de Itaiçaba, Russas, Icapuí e Aracati.
As coletas realizadas nos estados do RN e CE estiveram a cargo da Embrapa Hortaliças, Universidade de Brasília e Syngenta. No Submédio do Vale do São Francisco coletaram-se 283 amostras, abrangendo os Estados da BA (221 amostras) e PE (62 amostras). Essas coletas foram feitas sob a responsabilidade da Embrapa Hortaliças, Embrapa Semi-Árido e Universidade Católica de Brasília.
Na BA, as coletas ocorreram nos projetos irrigados de Mandacaru, Salitre e Tourão, situados no município de Juazeiro, enquanto que em PE, os meloeiros foram coletados em áreas do Projeto Caraíbas, no município de Santa Maria da Boa Vista e do Projeto Bebedouro, no município de Petrolina.
As plantas amostradas foram acondicionadas em sacos de plástico, identificadas e depositadas em caixas de isopor contendo gelo e, uma vez no laboratório, as amostras foram imediatamente, processadas. A análise do material foi realizada no Laboratório de Virologia da Embrapa Hortaliças com a colaboração da Universidade Católica de Brasília.
O teste sorológico selecionado para detecção do MYaV foi o DAS-Elisa (Double antibody sandwich/Enzyme-linked immunosorbent assay) (Clark & Adams, 1977) empregando anti-soro produzido por Ávila et al. (2008).
O IgG e o conjugado foram utilizados na concentração de 1 mg/ml, de acordo Ávila et al. (2008). Como antígeno, foram empregados extratos preparados a partir de folhas e de hastes de meloeiros coletados usando-se tampão de extração (1,4 M NaCl; 0,02 M KH2PO4; 0,08 M Na2HPO4.12H2O; 0,02M KCl; pH 7,4), na proporção de 1:10 (g/ml). Amostras de plantas de maxixe (Cucumis anguria L.) infectadas com o MYaV e sadias foram utilizadas como controles positivo e negativo, respectivamente, nos testes de detecção.
A amostra foi considerada positiva no teste DAS-Elisa quando o valor da leitura da absorbância foi pelo menos duas vezes superior ao valor médio da absorbância registrada para o extrato de planta sadia utilizada como controle negativo.
Os testes iniciais, em DAS-Elisa, foram realizados com amostras foliares, entretanto, com resultados inconsistentes. Optou-se, então, pela inclusão de hastes, conforme ensaios conduzidos por Ávila et al. (2008) que consideraram o vírus como presente no sistema vascular da planta. Adicionalmente, supôs-se que as partículas virais poderiam estar distribuídas de modo irregular na planta, como ocorre para outros vírus (Li et al., 1998; EPPO Bulletin, 2004; Díaz-Pendón et al., 2005). Para testar esta hipótese da provável distribuição irregular do MYaV na planta, a rama de cada meloeiro coletado foi dividida em três partes: o primeiro terço foi denominado de porção basal, o segundo de parte intermediária e o terço da extremidade da rama foi denominado de ápice.
Posteriormente, foram amostradas folhas e porções de haste de cada terço da rama da planta. Visando ainda aumentar a sensibilidade do teste na identificação do MYaV, em amostras com baixa concentração viral, aumentou-se o período de incubação de cerca de 2-3 horas para cerca de 24 horas, para as seguintes etapas do DAS-Elisa: adição do IgG, adição do antígeno e adição do conjugado (Ávila et al., 2008).
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado. Na investigação da distribuição do MYaV na planta definiram-se os tratamentos que consistiram dos valores de absorbância obtidos de folhas e das secções de haste de todas as plantas coletadas.
As lavouras de meloeiro visitadas apresentaram elevada incidência de plantas com sintomas suspeitos da doença amarelão, caracterizados pela presença de mosaico verde-amarelo e amarelecimento do limbo foliar, frequentemente atingindo até 100% das plantas da área cultivada, principalmente em plantios no estado do RN.
Os resultados do teste sorológico indicaram que 58,0% do total de plantas coletadas estavam infectadas com MYaV (Tabela 1).
A presença do vírus, confirmada pelo teste DAS-Elisa foi detectada em plantas de 25 dos 26 plantios visitados, com incidência de 4,8% em uma área do estado da BA a 100% em áreas dos estados do RN (5 áreas), CE (2), BA (2) e PE (1). Estes resultados indicam a ampla disseminação do MYaV em meloeiros dos principais estados produtores da Região Nordeste. Também indicam que os anticorpos desenvolvidos contra o MYaV foram eficientes na detecção deste vírus de forma específica e consistente nas amostras analisadas.
Acredita-se que as amostras que apresentaram resultados negativos para os anticorpos do MYaV poderiam: (i) não estar infectadas com o vírus e os sintomas observados ter sido causados por fatores abióticos como, por exemplo, deficiência nutricional; (ii) estar com a concentração do MYaV abaixo do limiar de detecção da técnica ou, ainda, (iii) estar infectadas com outros vírus diferentes do MYaV. Os controles reagiram como esperado.
Os resultados da análise estatística indicaram diferenças significativas entre as concentrações do MYaV, representadas pelos valores de absorbância, em folhas e hastes de meloeiros (p<0,05). Verificou-se maior número de amostras positivas para extratos preparados a partir de haste do que de folhas, confirmando os resultados obtidos por Ávila et al. (2008) que recomendam a detecção do MYaV, preferencialmente, em hastes.
Os valores médios de absorbância para hastes e folhas de meloeiros, por estado, considerando a posição de coleta das amostras na rama da planta são apresentados na Tabela 2. A porcentagem de amostras positivas para o MYaV para base da rama (53,65±8% a 71,42±5%), posição intermediária (56,09±8% a 68,75±7%) e ápice (48,78±8% a 70±15%), indicam que a amostragem da haste pode ser feita de qualquer uma das três posições da rama.
Os valores médios de absorbância para haste ficaram compreendidos entre 0,2303±0,0175 e 0,9056±0,2082 para amostras coletadas da base da rama, 0,1922±0,0143 e 0,2899±0,0339 para a porção mediana, e 0,2620±0,0336 e 0,3975±0,0498 para o ápice. Para o controle negativo verificou-se absorbância de 0,0530. No caso de folhas, como esperado, estes valores foram menores (Tabela 2).
Os testes sorológicos revelaram alta porcentagem de plantas infectadas em campos do RN (96,3%) e CE (75,7%) e no Submédio do Vale do São Francisco (PE e BA; 48,4%) (Tabela 1). Em áreas do município de Mossoró-RN, estas porcentagens ficaram compreendidas no intervalo de 84,6% a 100% (Tabela 1), confirmando que as inúmeras plantas coletadas com sintomas de amarelecimento estavam, de fato, infectadas com o MYaV. As observações realizadas em campo já haviam sugerido resultados similares.
No estado do CE, a incidência de plantas infectadas variou de 54,5%, em plantios do município de Icapuí, a 100% em áreas dos municípios de Itaiçaba e Russas (Tabela 1).
O plantio de meloeiro nesses dois estados é realizado em extensas áreas e, em sua maioria, por grandes empresas. Apesar da alta tecnificação do plantio, a doença amarelão do meloeiro está amplamente distribuída nestas regiões produtoras, causando apreensão entre os produtores. Por outro lado, no Submédio do Vale do São Francisco, a amplitude do intervalo da quantidade de plantas infectadas foi bem maior, variando de 0% em plantio do Projeto Mandacaru a 100%, em áreas do Projeto Tourão, em Juazeiro-BA, e Projeto Bebedouro, em Petrolina-PE.
A disseminação generalizada desta doença nas principais regiões produtoras da Região Nordeste tem sido favorecida pela presença de elevadas populações de mosca-branca virulíferas (Santos et al., 2004), ausência de cultivares de melão com resistência ao MYaV, assim como pela adoção de medidas de controle pouco efetivas. Entretanto, considerando a complexidade da doença e o conhecimento da dificuldade de controle do vetor em áreas produtoras, é possível afirmar que os prejuízos causados pelo MYaV nas áreas produtoras poderiam ser minimizados pela adoção de um manejo integrado de pragas (MIP) com aplicação de medidas de controle bem definidas. Uma delas seria a eliminação dos restos de cultura logo após a colheita (sanitização), a qual reduziria, significativamente, as fontes de inóculo do vírus e do vetor em campo, reduzindo a população de moscas-brancas virulíferas e, consequentemente, a incidência do MYaV em plantios novos.
Os produtores dos estados do RN e CE dispõem de alto nível tecnológico para o cultivo do melão considerando sua importância como cultura de exportação (Sales Júnior et al., 2006).
Dentre as técnicas utilizadas no manejo da doença em campo, nestes dois estados, merece destaque a proteção das plantas com tecido não tecido (TNT) que tem propiciado o retardamento da ocorrência da infecção das plantas.
A cobertura das mudas por um período de cerca de 35 dias pós-plantio tem evitado o contato das moscas-brancas virulíferas com as plantas de melão e, consequentemente, reduzido também a transmissão do MYaV para plântulas nos estádios iniciais de desenvolvimento da cultura. A infecção precoce resulta em prejuízos mais severos à cultura. Entretanto, tem-se observado que, cerca de duas semanas após a remoção do TNT do novo plantio, elevado número de meloeiros começam a exibir sintomas típicos da doença. Ainda que insatisfatória, esta tem sido a estratégia mais utilizada para reduzir as perdas causadas pela virose na produção.
Constatou-se que, apesar da utilização desta medida, a incidência da doença em plantas em campo tem sido elevada. No RN, um fator que tem contribuído, significativamente, para a manutenção deste panorama e para o aumento dos prejuízos causados pelo amarelão é a permanência de plantios de meloeiros doentes abandonados e infestados com moscas-brancas em áreas adjacentes a plantios novos ainda sob a proteção do TNT. Como conseqüência, logo após a remoção do TNT, as moscas-brancas virulíferas tendem a migrar das áreas abandonadas para as plantas dos cultivos novos, infestando e se estabelecendo nessas novas áreas e contribuindo assim para a perpetuação do vírus e do vetor em campo.
Apesar de o amarelão ser também um problema sério da cultura no Submédio do Vale do São Francisco, a infecção por MYaV foi inferior (48,4%) àquela observada nos estados do RN e CE. Esta diferença na porcentagem de plantas infectadas do universo amostrado não representa a real incidência do vírus nas lavouras, visto que a amostragem não foi realizada de modo aleatório, mas considerando plantas exibindo sintomas de amarelecimento.
A baixa porcentagem de plantas infectadas em PE e BA pode, simplesmente, ser o reflexo da existência de outros problemas fitossanitários e/ou nutricionais que provocam sintomas que podem ser confundidos com os do amarelão e que não estão visivelmente presentes nos estados do RN e CE. O cultivo de meloeiros em PE e BA é realizado por pequenos produtores que muitas vezes utilizam sementes de híbridos F2 e adotam sistema de cultivo com baixo nível tecnológico de produção. A não utilização de TNT para proteção das mudas, provavelmente, deve-se ao fato de o amarelão ainda não ser o principal problema fitossanitário, como ocorre nos estados do RN e CE.
A partir dos resultados obtidos neste levantamento, fica evidenciado que o MYaV está presente nas principais zonas produtoras de melão do Nordeste brasileiro. O conhecimento básico do MYaV avançou significativamente nos últimos anos com a elucidação parcial do seu genoma (Nagata et al., 2003). A finalização do sequenciamento completo do genoma desse vírus propiciará o desenvolvimento de métodos moleculares de diagnose, baseados na detecção de ácidos nucléicos.
As informações geradas com os estudos biológicos, sorológicos e moleculares do agente causal do amarelão do meloeiro visam contribuir para o entendimento da sua etiologia e, consequentemente, da doença e, dessa maneira, dar suporte aos programas de melhoramento genético de meloeiro que buscam identificar fontes de resistência ao MYaV. Neste contexto, a Embrapa Hortaliças, Brasília-DF, assim como também a Embrapa Agroindústria Tropical, Fortaleza-CE e Embrapa Semi-Árido, Petrolina-PE, entre outras instituições, vêm desenvolvendo projetos visando a obtenção de cultivares com resistência ao MYaV.
Os autores agradecem ao CNPq pelo suporte financeiro ao Projeto "Caracterização e desenvolvimento de sistema de detecção de flexivírus isolado de meloeiro com sintoma da doença amarelão" e ao técnico Lúcio Flávio Barbosa pelo auxílio na condução dos testes em laboratório.
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