Luiz Henrique de Vieira Pais
1 Aula de Bioquímica I Tema: Purificação de Proteínas Prof. Dr. Júlio César Borges Depto. de Química e Física Molecular DQFM Instituto de Química de São Carlos IQSC Universidade de São Paulo USP
2 Proteínas: Isolamento e Purificação Estudos e aplicações biotecnológicas de proteínas Amostras Puras Proteínas Diferentes propriedades = Diferentes formas de isolamento Considerações Gerais: Qual é o uso da Proteína? Qual é o material de partida? O que deve ser removido da solução? Quais as condições iniciais da solução? Qual é a estabilidade da proteína? Qual é a escala de purificação? Qual é o custo econômico para a purificação? Etc...
3 Proteínas: Isolamento e Purificação A purificação de proteínas pode ser feita por uma série de etapas e técnicas cromatográficas diferentes que devem obedecer uma sequência lógica. Preparação, Captura, Transferência, Acondicionamento, etc Múltiplas etapas ocasiona perdas inerentes de amostras: Rendimento Uma purificação eficiente deve ser feita com o mínimo de passos possíveis considerando o uso da proteína e o custo.
4 Proteínas: Isolamento e Purificação Fatores a considerar: 1) Objetivo para pureza 2) Quantidade e Rendimento 3) Manutenção da estrutura 4) Atividade biológica 5) Custo para o processo 6) Tempo Obter o máximo de informações sobre as propriedades da proteína alvo e dos contaminantes. Atividade; Massa Molecular; Constituição de Aminoácidos pi teórico; Coeficiente de absortividade molar Estabilidade; Estado oligomérico; Etc. Purificação: Combinação de técnicas que exploram as diferentes propriedades da proteína-alvo para isolá-la das demais. Estrutura Primária (cdna tradução) ProtParam Toll Sednterp
5 Proteínas: Isolamento e Purificação ANTES DE COMEÇAR!!! 1) Definir objetivos Pureza versus uso da proteína alvo Pureza versus custo Pureza versus tempo Qualidade final da amostra versus custo/tempo Over-purification versus under-purification
6 Proteínas: Isolamento e Purificação 2) Definir propriedades do alvo e dos contaminantes Tais informações guiarão a estratégia a ser montada para atingir os objetivos definidos. Contaminantes chave : eliminá-los primeiro!!!
7 Proteínas: Isolamento e Purificação 3) Testes de avaliação e/ou acompanhamento do processo Dependem dos objetivos estabelecidos 1) Testes de atividade biológica - Teste enzimático, interação com ligantes, etc 2) Testes para avaliar a pureza - Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS 3) Testes de quantificação - Depende da origem da proteína 4) Testes para os contaminantes chave - Idem anteriores 5) Testes estruturais - Dicroísmo circular, fluorescência, etc.
8 Proteínas: Isolamento e Purificação Estratégia de 3 fazes de purificação. Definir objetivos para cada fase!! DEPENDE DAS PROPRIEDADES DO MATERIAL!!! Captura: isolar, concentrar e estabilizar a proteína alvo Purificação intermediária: retirar a maior parte das impurezas Polimento: remover traços de contaminantes Alta Pureza! Rapidez! Baixo Custo! OBS: Minimizar ao máximo o manuseio da amostra entre as fazes!!!!
9 Proteínas: Isolamento e Purificação Captura Objetivo: Isolar, concentrar e manter atividade - Principais técnicas cromatográficas: Troca Iônica e Afinidade - Resinas de alta Capacidade - Separar de contaminantes críticos: DNA, proteases, etc Purificação intermediária Objetivo: retirar a maior parte das impurezas Separar contaminantes de propriedades similares Usar técnicas complementares: Troca iônica, afinidade ou interação hidrofóbica Polimento Objetivo: aumentar a pureza e preparar para armazenamento Obs: sacrifica e dilui a amostra Principal técnica: Filtração em Gel CEM
10 Proteínas: Isolamento e Purificação INÍCIO PREPARAÇÃO - EXTRAÇÃO - CLARIFICAÇÃO Isolamento inicial da amostra protéica do material de origem; Lise das células/tecido de origem: - Lise por Sonicação - Lise por pressão - Trituração do tecido Preparação da amostra para as etapas cromatográficas: 1) Adição de aditivos (Detergentes); 2) Ajuste do ph da amostra; 3) Adição de Sais; 4) Centrifugações; 5) Filtrações; 6) Diálises; 7) Etc...
11 Proteínas: Metodologias de Isolamento CLARIFICAÇÃO Centrifugação, Filtração, ultrafiltração e Gel filtração Ultracentrifugação Precipitação em sulfato de amônio Salting out estrutura da água Diálise Separação pela M Preparação da amostra para etapas subsequentes Somente se necessário
12 Proteínas: Isolamento e purificação Métodos Cromatográficos Separação por características: Tamanho, solubilidade, carga e afinidade.
13 Proteínas: Metodologias de Purificação Cromatografia de exclusão molecular Separação pela Massa Molecular Proteínas maiores eluem primeiro Menor caminho a percorrer Importante técnica para avaliar a Massa molecular de proteínas e interações proteínaproteína Detector de UV M
14 Proteínas: Metodologias de Purificação Cromatografia por troca iônica Alia resolução e capacidade Interação reversível entre proteínas com cargas opostas à da resina Importante técnica de caracterização e quantificação de proteínas e peptídeos Depende do pi da proteína alvo e do ph da solução Troca aniônica Resina Catiônica Troca catiônica Resina Aniônica Separação por aumento da [Sal] ou por mudanças no ph
15 Proteínas: Metodologias de Purificação Cromatografia por troca iônica = Condições iniciais 2 = Adsorção 3 = Início da Eluição 4 = Término da Eluição 5 = Regeneração [Proteína] [NaCl] Cromatograma [NaCl]
16 Proteínas: Metodologias de Purificação Cromatografia por interação hidrofóbica Alia resolução e capacidade Interação reversível entre proteínas hidrofóbicas com a resina hidrofóbica [Proteína] [NaCl] Separação por diminuição da [Sal] ou por mudanças no ph, temperatura [NaCl]
17 Proteínas: Metodologias de Purificação Cromatografia por Fase Reversa Alia resolução e capacidade Interação reversível entre proteínas hidrofóbicas com a resina hidrofóbica
18 Proteínas: Metodologias de Purificação Cromatografia por Fase Reversa Eluição por solvente orgânico Pode desnaturar a proteína - Comprometimento da Estrutura 3D [Proteína] [Solvente Orgânico]
19 Proteínas: Metodologias de Purificação Cromatografia de afinidade Importante técnica em Tecnologia de DNA Recombinante - Isolamento de mrnas - Isolamento de proteínas recombinantes Perfil de eluição similar à Troca Iônica
20 Proteínas: Isolamento e Purificação Técnicas de purificação oferecem um balanço entre: As técnicas Capacidade Velocidade Recuperação Resolução escolhidas devem suprir os objetivos definidos e as propriedades da proteína alvo A Ordem dos fatores influencia Captura Capacidade, Velocidade e Recuperação Purificação intermediária Capacidade e Resolução Polimento Resolução e Recuperação o resultado
21 Proteínas: Metodologias de Purificação Comparativo das técnicas cromatográficas versus Etapa Técnica Principais Vantagens Captura Pur. Intermediária Polimento Início Condição da Amostra Final Troca Iônica Capacidade Velocidade Resolução Baixa [Sal]; Sem limite de volume Alta [Sal] ou mudança de ph; Amostra concentrada HIC Resolução, Capacidade Velocidade Alta [Sal]; Sem limite de volume Baixa [sal]; Amostra Concentrada Afinidade Capacidade Velocidade Resolução Condições específicas para a ligação; Sem limite de volume Condições específicas presença de competidor Amostra Concentrada CEM Resolução Fluxo e Volume inicial limitado (< 5% VC) Amostra diluída Fase Reversa Resolução Requer Solvente Orgânico Presença de solvente orgânico Atividade biológica comprometida Amostra Concentrada
22 Proteínas: Isolamento e caracterização A Eletroforese em gel de poli-acrilamida na presença de dodecil-sulfato de sódio (SDS- PAGE) é o principal método de acompanhamento do processo de Purificação e avaliação do grau de pureza. Pode requerer concentração da amostra para avaliar o grau de pureza
23 Proteínas: Isolamento e caracterização SDS-PAGE Separação por Massa Molecular Influência da Z/M e forma da partícula
24 Proteínas: Isolamento e Purificação 1) Defina claramente os objetivos; 2) Avalie as propriedades da proteína alvo e contaminantes; 3) Desenvolva métodos de avaliação da atividade ou da estrutura; 4) Minimize o manuseio da amostra; 5) Minimize o uso de aditivos; 6) Remova agentes de degradação; 7) Usar diferentes técnicas em cada etapa; 8) Minimize o número de etapas; 9) Robustez e Reprodutibilidade; 10) Use uma combinação lógica de etapas. MANTENHA A SIMPLICIDADE!!!
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