Fernando de Sá Del Fio
Doutor em Farmacologia pela Universidade Estadual de Campinas (Unicamp - SP). Professor de Farmacologia da Faculdade de Ciências Odontológicas e professor de Farmacologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de Marília (Unimar - SP).
Professor titular de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica da Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp - SP).
Doutor em Farmacologia. Professor adjunto de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica da Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual de Campinas - (Unicamp - SP).
Trabalho realizado na Faculdade de Odontologia de
Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp-SP).
Unitermos: resistência bacteriana, resistência a antimicrobianos
Unterms: bacterial resistance, antimicrobial resistance.:
O primeiro antibiótico, a penicilina, foi descoberto por Alexander Fleming, em 1929, em um hospital londrino. Ele observou a inibição do crescimento em placa de uma cultura de estafilococos contaminada por um fungo, mais tarde identificado como Penicillium notatum. Anos mais tarde, com o advento da Segunda Guerra Mundial, foi imperativo que se estudasse e que se pesquisasse mais a quimioterapia moderna, pois com a guerra eram inevitáveis os ferimentos e, com eles, as infecções. A penicilina foi então extensamente utilizada contra estafilococos e estreptococos, grandes causadores de pneumonias, infecções aéreas superiores, septicemias etc. A nova droga tinha grande capacidade em dizimar essas infecções e, ainda, atuava de acordo com os princípios da quimioterapia moderna, ou seja, com toxicidade seletiva(1).
A resistência à nova droga foi descrita quase que imediatamente, bactérias produtoras de penicilinase, hoje chamadas b-lactamases, sobreviviam à terapêutica clínica e só altas doses efetivamente atingiam sucesso, concentrações inatingíveis sem efeitos de toxicidade. O desenvolvimento de resistência à penicilina pelo Staphylococcus aureus, através da produção de b-lactamase, diminuiu significativamente o uso dessa droga em infecções estafilocócicas, principalmente em pacientes hospitalizados nos quais as cepas resistentes são encontradas antes de sua disseminação à comunidade(2).
Com a evolução da antibioticoterapia as cepas de S. aureus foram tornando-se cada vez mais resistentes devido à produção de b-lactamases. Em 1946, apenas 5% das cepas de S.aureus eram produtoras de b-lactamase, atualmente, relatos de 1990 mostram que 90% das cepas produzem a enzima(3).
Inicialmente o fenômeno da resistência bacteriana não parecia ser um problema tão grande. Foi temporariamente resolvido com a introdução de novos agentes antibacterianos, tais como os aminoglicosídeos, macrolídeos, glicopeptídeos e ainda alterações estruturais nos compostos já existentes que refletiam em alteração de sua atividade e espectro antimicrobiano(4). Hoje se conhecem microrganismos multirresistentes, não sensíveis a quaisquer dos antibióticos disponíveis clinicamente, levando rapidamente à morte pacientes hospitalizados. Esses casos são cada vez mais frequentes, inclusive no Brasil(5).
O maior determinante de resistência intrínseca é a presença ou ausência do alvo para a ação da droga. Assim, antibióticos poliênicos, como a anfotericina B, atuam contra fungos devido à sua capacidade de ligação a esteróis componentes de sua membrana. Alteram sua permeabilidade, levando-o à morte. Como bactérias não possuem esteróis em sua membrana, sendo essa uma característica natural, são portanto insensíveis a essas drogas. Outro clássico exemplo é a relação entre inibidores da síntese da parede celular, tal como as penicilinas e micoplasmas. Esses microrganismos não apresentam essa estrutura celular, logo penicilinas não encontram alvo para sua ação nesses microrganismos(6). Essa característica fenotípica é transmitida verticalmente de geração à geração sem perda da característica. A resistência intrínseca ou natural não apresenta qualquer risco à terapêutica, pois é previsível, bastando-se conhecer o agente etiológico da infecção e os mecanismos de ação dos fármacos disponíveis clinicamente.
A resistência ainda pode ser não natural ou adquirida. Ocorre quando há o aparecimento de resistência em uma espécie bacteriana anteriormente sensível à droga em questão. É uma "nova" característica manifestada na espécie bacteriana, característica essa ausente nas células genitoras. Essa nova propriedade é resultado de alterações estruturais e/ou bioquímicas da célula bacteriana, determinada por alterações genéticas cromossômicas ou extra-cromossômicas (plasmídios). Uma simples alteração genética pode levar ao aparecimento de um exemplar muito resistente, que normalmente não perde viabilidade e patogenicidade(4).
A aquisição de resistência tem diminuído muito a atividade de importantes antibióticos, servindo como objetivo maior de pesquisadores para a busca de novas drogas, associações ou esquemas terapêuticos.
O uso indiscriminado, irresponsável e ignorante de antibióticos, terapeutica ou profilaticamente, humano ou veterinário, passando ainda pelo uso no crescimento animal e propósitos agrícolas, tem favorecido a essa pressão seletiva, mostrando como resultado a seleção e predominância de espécies cada vez mais resistentes(7,8).
Em um artigo publicado na Inglaterra, em 1998, o autor mostra dados relativos ao uso de antibióticos no mundo. Mostra que de todas as drogas utilizadas, 50% se destinam a uso humano e 50% ao agroveterinário. Da fração de drogas usada em humanos, 20% são em hospitais e 80% comunitátria. Desse montante, calcula-se que de 20% a 50% não haja necessidade de uso. Para o uso veterinário, os dados são mais alarmantes, 20% são usados terapeuticamente e até 80% para uso profilático e promoção de crescimento. Estima-se que até 80% do uso agroveterinário é altamente questionável(9).
Alguns autores(18) ainda condenam o uso indiscriminado e sem controle de antibióticos contra acne, o uso exagerado em hospitais, o uso em pacientes com presença de H. pylori sem lesão ulcerosa e, ainda, defendem um maior controle do uso em odontologia, pois genes de resistência do Streptococcus pneumoniae parecem ter se originado de estreptococos da cavidade oral(19). Esses mesmos autores ainda implicam o ensino médico como responsável por grande parte do uso indiscriminado de drogas, ressaltando a importância da conscientização do estudante para esse grave problema(18).
O uso indiscriminado não se relaciona diretamente com a pobreza ou falta de recursos de um país. Na França, nos anos de 1991/92, foi realizado um levantamento sobre o uso de antibióticos em crianças, chegando-se a valores absurdos para o uso de antibióticos em infecções de etiologia viral. Em torno de 25% das crianças da comunidade em estudo tomaram antibióticos contra infecções virais (Figura 1) (20).
Em um estudo publicado no ano de 1987 os autores mostraram a quantidade de antibióticos consumida terapêutica, profilaticamente e na conservação de alimentos no ano de 1980. Chegaram ao espantoso valor de 17 mil toneladas de penicilina, o que naquele ano seria igual ao consumo de 3,84 g da droga para cada habitante da terra(33).
Para uma melhor compreensão do fenômeno global de resistência bacteriana é preciso entender como microrganismos adquirem resistência, como passam a expressar essa nova característica, de onde vem essa informação.
A mutação é um fenômeno espontâneo, resultado de um erro na replicação do DNA, ocorre um mutante a cada 104 a 1010 divisões celulares. Normalmente envolve deleção, substituição ou adição de um ou mais pares de bases, levando a alterações na composição de aminoácidos de determinados peptídeos. Essa mutação ocorre na ausência ou presença de antibióticos, o único papel que pode caber à droga é selecionar os mutantes, favorecendo seu crescimento por sua atuação nas células normais sensíveis. Esse problema tem se mostrado mais alarmante com drogas destinadas a tratamentos prolongados, como as utilizadas contra a tuberculose e hanseníase(11). A mutação leva muitas vezes à alteração de permeabilidade da célula ou ainda à alteração de seu receptor. As células mutantes não têm qualquer vantagem biológica sobre as normais, ao contrário são defectivas, morrendo à qualquer alteração, seja de pH, temperatura, osmolaridade etc.(10).
As mutações podem ser classificadas em: Single large-step quando uma única mutação, normalmente associada à estrutura do receptor leva a um aumento súbito da CMI para a bactéria e, ainda, Multi-step quando sucessivas mutações, levam a diminuições graduais da efetividade de antibióticos frente ao microrganismo, caso típico da Neisseria gonorrhoeae e da penicilina G, muito utilizada no passado para esse fim que agora carece de efetividade e potência.
Resistência transferível
A resistência transferível ocorre quando um dado microrganismo recebe material genético de outro microrganismo, passando a expressar a característica contida no gene recentemente adquirido. Esse material genético que contém a informação que expressa a resistência pode ser transferido de algumas formas: transformação, transdução, conjugação e ainda transposição.
A transformação é um processo no qual há lise de determinado microrganismo com liberação de seu material genético para o meio, dessa forma, outra bactéria é capaz de captar esse DNA incorporando-o ao seu genoma(12). Esse DNA pode ser originário de cromossomos, plasmídios ou ainda bacteriófagos e para que o processo ocorra a bactéria receptora tem de estar apta a receber esse material, no estado dito de competência, quando sintetiza proteínas de superfície capaz de ligação ao DNA. Parece de pouca importância clínica, pois só ocorre em condições extremamente favoráveis(11,12,13).
A transdução envolve a incorporação acidental de DNA bacteriano cromossômico ou plasmidial por um bacteriófago durante seu processo de infecção celular. Após a lise celular, esse bacteriófago atua então como um vetor e ao infectar nova célula pode introduzir o DNA contendo o gene de resistência, tornando-a resistente à determinada droga. Ocorre somente entre bactérias de uma mesma espécie e exerce papel importante na transferência de plasmídios R (resistência) entre S. aureus e Streptococcus pyogenes(14,15).
A conjugação é um processo que requer contato físico, bactéria-bactéria, em que uma das células, a doadora, transfere através de fímbria ou pilus sexual o material genético a outra, chamada receptora. A habilidade de uma bactéria em conjugar normalmente é codificada em plasmídios, chamados plasmídios F, de fertilidade ou conjugativos. Esses plasmídios são segmentos de DNA de fita dupla auto-replicantes que legam à bactéria que os possuem a propriedade de estabelecer, através desse canal protéico (fímbria), contato com outras bactérias para a transferência de genes plasmidiais. Ao receber o material genético sob a forma de plasmídios que pode conter genes determinantes de resistência (plasmídios R), a bactéria receptora a partir desse momento pode expressar uma nova característica, tornando-se resistente. Pode ainda conjugar com outra bactéria, atuando agora como doadora, pois junto com genes de resistência, ela recebe genes conjugativos (plasmídios F), permitindo então repetir o processo agora em progressão geométrica.
No fenômeno da transposição há a dependência da presença na bactéria de segmentos curtos de DNA denominados transpossons. Transpossons podem conter genes de resistência para um ou mais antibióticos. Por não terem capacidade de auto-replicação, unem-se a replicons, ou seja, "saltam" dentro da célula entre plasmídios, cromossomos e bacteriófagos, caracterizando uma promiscuidade gênica celular. Esses "genes saltadores", ao se unirem a segmentos de DNA para sua replicação, podem incorporar genes de resistência nesse DNA(11,21).
A partir desses mecanismos, bactérias podem adquirir e/ou transferir resistência a outras bactérias, passando a elas a propriedade de defesa contra determinada droga. É importante salientar que não há necessidade de patogenicidade do microrganismo para que carregue genes de resistência, ao contrário, bactérias de microbiota normal são as que carregam maior quantidade de genes de resistência a uma ou mais drogas.
Através desses mecanismos, as bactérias garantem genes que detêm informações que as tornam resistentes às mais diversas classes de drogas, mas como? De que forma essa proteção se manifesta, como as bactérias se defendem? Como é útil essa informação? Há inúmeros mecanismos através dos quais esses microrganismos se tornam resistentes às drogas, manifestando a resistência.
1. Produção de enzimas inativadoras
Bactérias podem conter genes que codificam a produção de enzimas com propriedades de clivar, de quebrar ou ainda de promover alterações estruturais na molécula da droga tornando-a inativa contra aquele microrganismo. Como exemplo de enzimas que quebram a estrutura da droga, temos as b-lactamases, atuam promovendo a hidrólise dos derivados b-lactâmicos deixando aberta a estrutura do anel, fazendo com que com essa configuração molecular a droga seja incapaz de se ligar ao seu sítio receptor, as PBPs (penicillin binding proteins), ficando impossibilitada para inibir a síntese da parede celular bacteriana. Dessa forma a bactéria continua seu ciclo reprodutivo normalmente, tornando-se então resistente aos antibióticos b-lactâmicos. Existem dezenas de tipos de b-lactamases, variando de substrato e microrganismo produtor. A informação para sua produção em microrganismos pode estar presente no cromossomo bacteriano, em plasmídios ou em transposson e, como visto anteriormente, pode ser transferida a outras bactérias tanto vertical como horizontalmente. Essas enzimas são, sem sombra de dúvida, a grande causa de insucesso terapêutico de penicilinas e análogos diante de inúmeros microrganismos; E. coli, P. aeruginosa, N. gonorrhoeae, N. meningitidis etc.(22).
Existem ainda enzimas bacterianas que em vez de quebrar a estrutura molecular da droga, apenas alteram sua conformação, promovendo adenilação, acetilação e fosforilação de aminoglicosídeos, reduzindo sua afinidade pelo receptor ribossômico, impedindo assim a inibição da síntese protéica bacteriana, permitindo a bactéria sua reprodução normal. De modo estratégico, essas enzimas se fixam à membrana bacteriana, pois é onde há grande quantidade de ATP e acetil coenzima A, fonte de radicais fosfato, adenil e acetil que usa para modificar estruturalmente o antibiótico logo no processo de entrada de droga na célula. Essas enzimas são encontradas em grande quantidade em gram-negativos patogênicos, alvo principal dessas drogas(23). O cloranfenicol também sofre esse tipo de modificação estrutural, perdendo sua afinidade pelo receptor e, portanto, sua atividade. É transformado em monoacetato ou diacetato de cloranfenicol por uma acetiltransferase no interior de alguns microrganismos gram-positivos e gram negativos(10). Recentemente foi relatado que a tetraciclina também pode sofrer modificação enzimática estrutural em microrganismos(24).
Outro mecanismo através do qual bactérias diminuem a concentração citoplasmática de drogas é o bombeamento ativo de drogas para o meio extracelular. Esse mecanismo chamou a atenção da comunidade científica em torno de 1980, quando pesquisadores demonstraram esse mecanismo codificado em plasmídios em cepas de E. coli(27). A bactéria passa a produzir proteínas de membrana que funcionam como uma verdadeira bomba para tetraciclinas, bombeiam ativamente a tetraciclina para fora da bactéria. Parecem existir ainda dois subtipos de sistemas de bombeamento; aquele dito "multi-drug-pump", ou seja, bombeia inespecificamente várias drogas e um sistema específico para transporte de tetraciclina, muito comum em cepas de P. aeruginosa(24). A droga não atinge concentrações intracelulares suficientes para promover inibição de síntese protéica ribossomal, pois quase instantaneamente é bombeada para fora da bactéria(28).
3. Alteração do receptor para a ação da droga
Para que uma droga exerça sua atividade farmacológica ante a um microrganismo é imperativo que haja a ligação ou a interação fármaco-receptor. Muitas vezes, por mutação cromossômica, há a alteração bioquímica desse receptor, impedindo uma perfeita ligação entre a droga e seu receptor na bactéria. Esse mecanismo de manifestação de resistência ocorre em inúmeras bactérias para grande quantidade de antibióticos; macrolídios, b-lactâmicos, cloranfenicol, quinolonas, rifampicina e mais recentemente glicopeptídeos(10).
As PBPs (Penicillin Binding Proteins) são enzimas envolvidas na síntese da parede celular bacteriana e servem como alvo para ação de drogas b-lactâmicas. Sua inibição por essas drogas determina a formação de uma parede celular frágil que não suporta a diferença osmótica, levando à lise celular bacteriana(30). S. pneumoniae, S. aureus resistente à meticilina (MRSA), N. gonorrhoeae, Haemophilus influenzae são alguns exemplos de microrganismos que se tornam insensíveis à ação de b-lactâmicos através de alterações nas PBPs, diminuindo a afinidade da droga pelas enzimas. A origem desses genes de resistência parece ser a captação de DNA bacteriano do meio. Os genes que codificam essa alteração no S. pneumoniae são chamados de genes mosaico, pois são constituídos de genes próprios misturados a segmentos de DNA de microrganismos mais resistentes à penicilina, tais como os S. viridans(29).
Alterações no ribossomo bacteriano também são responsáveis por resistência a grande número de drogas, ocorrendo com aminoglicosídeos, cloranfenicol e principalmente macrolídios. Para essas drogas, no S. aureus ocorre uma metilação em um resíduo de adenina no RNA ribossômico 23S, diminuindo a afinidade da droga pelo receptor, impedindo a droga de inibir a síntese protéica bacteriana(31). Existe ainda uma outra maneira de impedir o contato droga-receptor promovido pela bactéria; é o caso da produção de uma proteína citoplasmática que protege fisicamente o ribossomo da inibição promovida pela tetraciclina(28). Podem ocorrer ainda alterações na DNA-girase ou topoisomerase, levando a resistência das quinolonas e também alteração da RNA polimerase para as rifamicinas. Essa resistência tem particular importância clínica, pois pode aparecer durante o longo curso de tratamento da tuberculose. Para prevenção está recomendada a associação de duas ou mais drogas(6).
As sulfonamidas atuam inibindo a diidropteroato sintetase, enzima responsável pela ligação entre o ácido p-aminobenzóido e a pteridina na síntese de ácido fólico bacteriano. Alguns bacilos gram-negativos sintetizam via plasmídio ou transposson, uma diidropteroato sintetase alterada, sem afinidade pelas sulfas, mas que mantém sua atividade bioquímica na produção do folato. Sem a inibição pelas sulfas, a bactéria cresce normalmente, tornando-se resistente à droga. Mecanismo similar acomete o trimetoprim, na fase seguinte à síntese do ácido fólico, na redução à tetraidrofolato pela diidrofolato redutase(32).
Todos esses mecanismos de expressão de resistência são cada vez mais frequentes em inúmeros microrganismos, alguns deles expressando muitas formas de resistência. O que se pergunta é: de onde vem a informação para que o microrganismo saiba exatamente como se defender de cada droga? Qual a origem dos genes que codificam esses mecanismos de resistência?
A resposta ainda não é consenso entre a comunidade científica, mas existem fortes evidências de que esses genes sempre estiveram presentes na natureza, principalmente em microrganismos produtores de antibióticos, pois se produzem uma droga devem ter capacidade de se defender dela. Através de transmissões verticais (replicação) e horizontais (conjugação), potencializadas ainda pela pressão seletiva com o uso crescente dessas drogas, esses genes foram disseminando-se, adaptando-se a novas espécies e hoje alguns deles, por exemplo os que codificam a produção de b-lactamases, encontram-se disseminados por quase todos os microrganismos de importância médica. A informação para a defesa sempre existiu, ela só estava restrita a certas espécies de microrganismos. Com o uso crescente e indiscriminado de antibióticos, através de pressão seletiva, permaneceram vivos apenas os microrganismos capazes de se defender da ação da droga.
1. Modificação química-estrutural de agentes antibacterianos preexistentes
Através de alterações químicas na estrutura de agentes consagrados se conseguem novas drogas. Mantém-se o grupo farmacofórico (o que detém a atividade da droga), alterando-se radicais ligados a ele, modificando assim a farmacocinética e espectro de atividade da droga criando-se um novo composto. Como exemplo temos a modificação estrutural de fluoroquinolonas, originando o trovafloxacin, com uma atividade anaeróbica muito maior que os compostos originais. Esse composto estará disponível clinicamente na Inglaterra dentro de alguns anos(35).
2. Novos alvos (mecanismos) para a ação de drogas
Novas abordagens farmacológicas são necessárias para se "desviar" dos mecanismos de resistência preexistentes. A mupirocina tem como alvo a t-RNA sintetase, essencial para a síntese protéica bacteriana, atua de modo distinto dos clássicos inibidores de síntese protéica, tais como aminoglicosídeos, tetraciclinas, macrolídios etc. Alguns peptídeos de cadeia curta com ação em membranas bacterianas têm sido testados a alguns anos. São retirados das mais diversas fontes, pele de sapo, insetos e porcos. Infelizmente ainda é grande o número de efeitos colaterais nas células mamíferas, porém são drogas com ação completamente diversa daquelas disponíveis em clínica(35).
Outra abordagem ainda mais interessante e promissora é a de se utilizar como alvo genes bacterianos que se expressam somente em indivíduos infectados. Se houver sucesso com esse tipo de abordagem, aparecerão novas drogas com ação exclusivamente em bactérias patogênicas, sem ação na microbiota normal(36).
Algumas vacinas têm sido testadas e usadas com sucesso em doenças de etiologia bacteriana, principalmente naquelas em que o agente é multirresistente, caso dos pneumococos.
4. Introdução de associações de drogas
1. Russell, A.D. and Chopra, I. In Understanding antibacterial action and resistance, 1st ed. Ellis Horwood, London, 1990.
2. Hawkey, P.M. The origins and molecular basis of antibiotic resistance. BMJ. 317: 657-660,1988.
12. Smith, H.O.; Danner, D.B.; Deich, R.A. Genetic Transformation. Ann Rev Biochem. 50: 41-68, 1981.
13. Spratt, B.G. Hybrid penicillin-binding in penicillin resistant strains of Neisseria gonorrhoeae. Nature. 332: 137-6, 1988.
18. Smith, A. J., et al. Contributors to antibiotic resistance. BMJ. 318: 669-73, 1999.
19. Coffey, T.J. et al. Horizontal spread of an altered penicillin binding protein 2B gene between Streptococcus pneumoniaea and Streptococcus oralis. FEMS Microbiol Lett. 110:335-40, 1993.
20. Guillemont, D. et al. Trends in Antimicrobial drug use in the community - France, 1981-1992. J Infect Dis. 177:492-7, 1998.
28. Speer, B. S.; Shoemaker, N.B.; Salyers, A.A. Bacterial Resistance to Tetracycline: Mechanisms, Transfer and Clinical Significance. Clin Microbiol Rev. 5(4): 387-99, 1992.
29. Spratt, B.G. Resistance to Antibiotics Mediated by Target Alterations. Science. 264: 388- 393, 1994.
37. Miyamura,S.; Koizuma, K.; Nakagawa, Y. An inhibitor of chloranfenicol acetyltransferase produced by Streptomyces. J. Antibiot. 4: 1217-1218, 1979.