ESTABELECIMENTO DO DELIVERY DO COMPLEXO RIBONUCLEOPROTEICO CAS9 EM BACTERIAS
SaCas9; sgRNA; eGFP; delivery; complexo RNP.
Diversos estudos comprovam as vantagens do delivery do complexo ribonucleoproteico Cas9 (RNP-Cas9), pré-formado in vitro, em células eucarióticas, com redução de efeitos off-targets e aumento da eficiência da edição. Contudo, nenhuma descrição, até o presente momento, demonstrou a aplicação do delivery deste complexo em bactérias.
O presente estudo teve como finalidade estabelecer o delivery do complexo ribonucleoproteico Cas9 em bactérias.
O método estabelecido foi dedutivo e o tipo do trabalho experimental-laboratorial.
Para a avaliação da atividade do RNP-SaCas9, estabelecemos um ensaio de clivagem in vitro com dois amplicons: eGFP e T7/eGFP.
Para as análises in vivo, transformamos o vetor pDEST17-eGFP em uma cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS e realizamos o delivery do complexo RNP-SaCas9 por eletroporação. Induzimos a expressão do eGFP e avaliamos os resultados por eletroforese em gel de poliacrilamida 13% (PAGE).
Na análise do ensaio de clivagem in vitro em gel de agarose 1,5%, nos controles negativos de ambos os substratos houve presença de uma única banda com tamanho coerente ao esperado de 741 e 877 bp para as reações com eGFP e T7/eGFP, respectivamente.
Referente aos grupos experimentais, a presença de bandas com tamanho inferior ao dos substratos se fizeram presente: 593 bp corresponde ao fragmento maior da clivagem do substrato eGFP pelo RNP-SaCas9; e 582 bp e 284 bp, geradas pela clivagem do substrato T7/eGFP pelo RNP-SaCas9.
A proteína eGFP apresenta tamanho ~29 KDa. Nos controles de indução, foram observadas bandas com tamanhos ~29 KDa com fraca intensidade, como esperado. Nos controles negativos, houveram a presença de bandas com tamanhos próximos a 29 KDa, mas de maior intensidade, devido à expressão do eGFP. No grupo experimental houveram bandas com tamanhos ~29 KDa e com intensidade similar aos controles de indução, sugerindo que não houve a expressão do eGFP devido ao nocaute do gene eGFP pelo complexo RNP-SaCas9.
Comprovamos a integridade da molécula do sgRNA (RNA-guia) desenhada para o gene eGFP e evidenciamos que a atividade nucleásica da SaCas9 foi capaz de clivar os substratos no ensaio de clivagem in vitro.
A análise em PAGE 13% dos extratos proteicos dos grupos experimentais forneceu dados sugestivos da ocorrência de nocaute do gene eGFP. No entanto, confirmações adicionais por citometria de fluxo e sequenciamento devem ser realizadas para confirmação dos resultados
HANIEL SIQUEIRA MORTAGUA WALFLOR, ROSANGELA STADNICK LAUTH DE ALMEIDA TORRES, LIA CAROLINACAROLINA SOARES DE MEDEIROS KUCZERA