L-glutamic acid in the prevention of the calcification of bovine pericardial fixed in glutaraldehyde: study in rats
http://dx.doi.org/10.1590/S0102-76382007000300006
Andrea Dumsch de Aragon FerreiraI; Francisco Diniz Affonso da CostaII; Eduardo Antonio Andrade dos SantosIII; Evandro Antonio SardetoIV; Carlos Henrique Gori GomesV; Claudinei CollatussoV; Sérgio Augusto Veiga LopesIV; Ângela PerruzzoVI; Iseu de Santo Elias Affonso da CostaVII
IMestre; Cirurgiã Cardíaca do Serviço de Cirurgia Cardíaca da Santa Casa de Curitiba
IILivre Docente; Chefe do Serviço de Cirurgia Cardíaca da Santa Casa de Curitiba
IIIMédico Especialista em Radiologia da Santa Casa de Curitiba
IVMestre; Cirurgião Cardíaco da Santa Casa de Curitiba
VEspecializando (Médico Residente em Cirurgia Cardíaca da Santa Casa de Curitiba
VIBioquímica Responsável da Cardioprótese
VIILivre Docente; Médico Cirurgião Cardíaco da Santa Casa de Curitiba
OBJETIVO: Avaliar a eficácia do ácido L-glutâmico na prevenção da calcificação do pericárdio bovino implantado no subcutâneo de ratos.
MÉTODO: Utilizaram-se 54 ratos Wistar, distribuídos em seis grupos, de acordo com o segmento de pericárdio bovino implantado. Inicialmente, todos os pericárdios foram fixados com glutaraldeído 0,5% por 72h. No grupo I, após a fixação, o pericárdio foi preservado em glutaraldeído 0,2% até o implante. O grupo II foi estocado em solução de Paraben. No grupo III e IV, após a fixação inicial, os pericárdios foram tratados com ácido L-glutâmico 8% com pH 7,4 e 3,5, respectivamente, sendo em seguida estocados em Paraben. Os grupos V e VI foram semelhantes aos grupos III e IV, exceto pela concentração do ácido L-glutâmico que foi de 0,8%. Os explantes foram feitos com 15, 30 e 60 dias, e as amostras submetidas à análise histológica com hematoxilina-eosina e Von Kossa, além da mensuração de cálcio por espectofotometria de absorção atômica.
RESULTADOS: A mensuração por espectofotometria de absorção atômica demonstrou aumento progressivo da calcificação nos grupos I, II e III, aos 15, 30 e 60 dias. Nos grupos IV, V e VI, os níveis de cálcio permaneceram sem alteração nos períodos estudados. A análise microscópica demonstrou calcificação progressiva nos grupos I, II e III. Nos grupos IV, V e VI, a calcificação, quando observada, foi focal e de grau leve.
CONCLUSÃO: O uso do ácido L-glutâmico em segmentos de pericárdio bovino, fixados pelo glutaraldeído, foi efetivo na prevenção da calcificação, quando implantados no subcutâneo de ratos por até 60 dias.
Descritores: Ácido glutâmico. Glutaral. Pericárdio. Calcinosis.
A fixação de próteses valvares com glutaraldeído (GDA) tem sido amplamente utilizada nas últimas três décadas [1]. Seu emprego contribui para a estabilização do colágeno e para a redução da rejeição [2]. Apesar disso, a calcificação das cúspides valvares tratadas com o GDA ainda representa a principal causa de falência destes implantes [3,4].
Alguns autores têm suposto que a fixação do tecido biológico pelo GDA, por si só, pode ser agente facilitador da calcificação, pois a liberação gradual do glutaraldeído monomérico pós-implante, a partir das rupturas de ligações de glutaraldeído polimérico, resulta em efeito citotóxico, inibindo o processo de proliferação endotelial, expondo resíduos celulares ricos em fosfolipídios que comprovadamente funcionam como sítios primários do processo de calcificação, devido à grande polaridade da molécula de GDA monomérica [3-9].
Em vista disto, diversos tratamentos químicos alternativos, visando a diminuir ou retardar o processo de calcificação, têm sido propostos.
Estudos experimentais demonstraram que o tratamento do pericárdio bovino com o ácido L-glutâmico, previamente fixado em GDA, melhorou sua biocompatibilidade, por neutralizar os efeitos tóxicos do glutaraldeído, reduzindo de forma significativa a calcificação. Além disto, o pH ácido favorece a despolimerização do glutaraldeído polimérico, facilitando a saída do tecido de moléculas monoméricas não ligadas [4,8].
A aplicação de um método eficiente na produção de biopróteses é desejável, pois poderia levar ao aumento da durabilidade e, conseqüentemente, diminuir a necessidade de reoperações, particularmente em países em desenvolvimento, nos quais o emprego de próteses biológicas é mais freqüente.
O objetivo deste trabalho foi analisar a eficácia do ácido L-glutâmico nas concentrações 0,8% e 8%, e com variação de pH entre pH 3,5 (ácido) e pH 7,4 (fisiológico), na prevenção da calcificação de segmentos de pericárdio bovino fixados em GDA e implantados na tela subcutânea de ratos jovens.
Este trabalho foi realizado nos Laboratórios de Cirurgia Experimental da Disciplina de Técnica Operatória da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR), no Laboratório da Cardioprótese Ltda, no Laboratório de Patologia Clínica da Santa Casa de Misericórdia de Curitiba e no Instituto de Tecnologia para o Desenvolvimento (LACTEC).
O Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da PUC-PR aprovou este experimento, sob o registro na CEPA/PUCPR número 62.
Foram utilizados 54 ratos machos (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia), da linhagem Wistar, com idade média de 33,0 + 3 dias e peso médio de 90,0 + 4g.
Os animais foram divididos em 6 grupos (I, II, III, IV,V e VI), com nove animais cada, conforme o tratamento químico do pericárdio bovino implantado (Tabela 1).
Cada grupo foi subdividido em 3 subgrupos, de acordo com o tempo de evolução pós-operatória por ocasião da eutanásia dos animais para o explante dos segmentos do pericárdio bovino, com 15, 30 e 60 dias (Tabela 2).
Obtenção do pericárdio bovino
Os pericárdios bovinos foram obtidos em frigorífico de animais em idade de abate comercial, logo após o seu sacrifício. Estes foram dissecados e liberados da gordura mediastínica e pleural, lavados e transportados em solução gelada de Ringer Lactato a 4ºC até o laboratório, onde foram processados.
Em todos os grupos, os segmentos de pericárdio foram previamente fixados em GDA a 0,5% em solução tampão fosfato, com pH = 7,4, por 72 horas, em temperatura ambiente (fixação padrão). Após esta fase, foi realizado o tratamento dos segmentos de pericárdio de forma diferente entre os grupos (Tabela 1).
O grupo I ou grupo controle recebeu o tratamento convencional empregado em biopróteses comercialmente disponíveis, isto é, após a fixação inicial com GDA a 0,5%, foi estocado em solução tamponada com GDA a 0,2%. Os pericárdios do grupo II foram fixados de forma igual ao grupo I, diferindo deste apenas na sua estocagem, que foi feita em solução com Paraben. No grupo III, após serem fixados em GDA 0,5%, os segmentos pericárdicos foram tratados com solução tamponada contendo ácido Lglutâmico 0,8% com pH = 7,4, por 48 horas, sendo posteriormente armazenados em SSI com Paraben. No grupo IV, após a mesma fixação, os segmentos pericárdicos foram tratados com solução de ácido L-glutâmico a 0,8% com pH=3,5 por 48 horas, sendo posteriormente armazenados em SSI com Paraben.
Os grupos V e VI foram tratados de forma semelhante, após fixação, os segmentos pericárdicos foram mantidos em solução de ácido L-glutâmico a 8%, diferindo apenas no pH (grupo V pH=7,4 e grupo VI pH=3,5).
Foi praticada incisão de aproximadamente 2cm na região dorsal e confeccionada loja subcutânea para o implante do pericárdio bovino sob a pele do animal.
Os ratos foram marcados com canetas demográficas e colocados em gaiolas apropriadas. Em cada gaiola ficaram cinco animais. Os ratos foram mantidos no biotério, sendo submetidos à eutanásia com 15, 30 e 60 dias, com dose letal de tiopental sódico, 400 mg/kg, por via intraperitoneal. Posteriormente, foi realizada incisão longitudinal na região dorsal e remoção dos implantes para análise microscópica e mensuração do cálcio por espectroscopia de absorção atômica com atomização em chama.
Os explantes foram fixados em solução de formalina a 10% e encaminhados para análise microscópica. O exame histológico foi realizado por um mesmo observador, sem conhecimento do grupo ao qual pertencia o espécime.
A avaliação da calcificação distrófica foi então realizada por meio de microscópico tetraocular (American Optical x8), com a coloração de HE (hematoxilina-eosina) e classificada em quatro níveis, de acordo com o porcentual da peça comprometido por calcificação (Tabela 3).
A determinação quantitativa do cálcio foi realizada por espectroscopia de absorção atômica, com espectrômetro Perkin Elmer®, 4100.
A quantidade total de cálcio foi expressa em miligramas por amostra e extrapolada para µg/mg de tecido préimplantado. Deste modo, foi possível estimar a quantidade de cálcio incorporada por miligrama de tecido seco implantado e não do tecido seco explantado, cujo peso reflete não só na quantidade de cálcio incorporada, como também a infiltração das células do hospedeiro.
As variáveis, tanto a quantificação de cálcio por espectroscopia de absorção atômica, quanto a análise da calcificação distrófica, foram inicialmente submetidas à avaliação de sua distribuição por meio de testes de normalidade, coeficiente de variação e análise de histogramas.
Para avaliar as possíveis diferenças existentes entre os seis grupos nos índices de calcificação distrófica foi aplicado o modelo de Análise da Variância (ANOVA) de Kruskal-Wallis e de Friedman, considerando a distribuição assimétrica das variáveis e ausência de homocedasticidade entre os grupos.
Para todos foram utilizados os testes bicaudais, considerando que as diferenças poderiam estar distribuídas para ambos os lados da curva, com nível de significância mínimo de 5%. O tamanho da amostra foi estimado considerando um erro de tipo I de 5% (alfa) e erro do tipo II de 10%.
Análise da calcificação nos grupos de estudo por espectroscopia de absorção atômica
Grupo I ou controle - O grupo controle apresentou calcificação progressiva conforme o dia de sacrifício dos animais (Tabela 4).
Grupo II -No grupo II, também se pode observar calcificação progressiva ao longo do tempo, não havendo diferença estatisticamente significativa (p = 0,11) em relação ao grupo I (Tabela 4, Figura 1).
Grupo III -Os pericárdios do grupo III também apresentaram calcificação progressiva (Tabela 4).
Grupo IV -No grupo IV, observou-se significativa redução da calcificação do pericárdio, mesmo após 60 dias de permanência na tela subcutânea dos animais, com diferença estatisticamente significativa em relação aos grupos I (p = 0,001), grupo II (p = 0,01) e grupo III (p = 0,008) - Tabela 4.
Grupo V -No grupo V, observaram-se níveis de calcificação significativamente diferentes dos grupos I (p = 0,04), II (p = 0,001) e III (p = 0,03) e em menor proporção em relação ao grupo IV (p = 0,09) - Tabela 4.
Grupo VI -No grupo VI, os resultados foram tão satisfatórios quanto o grupo IV, não havendo tendência de calcificação aos 60 dias (Tabela 4).
Análise microscópica (histológica) da calcificação distrófica nos grupos de estudo
Com 15 dias de sacrifício dos animais
A análise microscópica confirmou os dados obtidos pela espectroscopia de absorção atômica. Após 15 dias, os pericárdios dos grupos I, II e III já evidenciavam calcificação distrófica, mais acentuadamente na porção central do tecido. Já nos grupos IV,V e VI, a calcificação esteve ausente ou era de intensidade mínima e de caráter focal.
Com 30 dias de sacrifício dos animais
Com 30 dias, verificou-se que, de forma semelhante ao que se observou aos 15 dias, a calcificação compreendendo maiores taxas percentuais de tecido ocorreu com maior freqüência nos grupos I, II e III, enquanto que, nos grupos IV, V e VI, a calcificação ocorreu no seu grau mais leve (010% da peça).
Com 60 dias de sacrifício dos animais
Com 60 dias, verificou-se que, de forma semelhante do que se observou aos 15 e 30 dias, a calcificação compreendendo maiores taxas percentuais de tecido ocorreu com maior freqüência nos grupos I, II e III, enquanto que, nos grupos IV, V e VI, a calcificação ocorreu no seu grau mais leve (0-10% da peça) - Figura 2.
O conjunto de gráficos da Figura 3 ilustra a evolução em cada grupo, segundo o tempo da eutanásia dos animais, evidenciando a redução progressiva da extensão da calcificação distrófica do segmento pericárdico, de acordo com o tratamento aplicado (Figura 3).
Leukauf et al. [10] analisaram os efeitos do tratamento com ácido L-glutâmico em pericárdios bovinos previamente fixados pelo GDA. Observaram que a semeadura "in vitro" de células endoteliais sobre tecidos não tratados resultava em morte dessas células em menos de 48 horas, enquanto que nos tecidos tratados com ácido glutâmico houve adequada proliferação celular, porém com baixa aderência ao tecido subjacente. No mesmo estudo, os autores fizeram o implante de enxertos tubulares de pericárdio bovino em artérias carótidas de carneiros. Verificaram que, nos tratados somente com GDA, a superfície interna estava recoberta por camada de fibrina, com trombos contendo plaquetas e macrófagos, e apenas raras células endoteliais. Já nos enxertos tubulares tratados com ácido L-glutâmico, houve reendotelização parcial, inclusive com produção de matriz extracelular, indicando melhor biocompatibilidade do tecido tratado [10].
Em um trabalho subseqüente, Grimm et al. [8] analisaram a efetividade do tratamento com ácido L-glutâmico na prevenção da calcificação de pericárdios bovinos fixados em GDA. Fragmentos de pericárdio implantados na tela subcutânea de ratos Sprague-Dawley, por períodos de até 63 dias, evidenciaram significativa redução, não somente da reação inflamatória, como também da calcificação distrófica. Nos explantes tardios, com mais de 60 dias, o nível de cálcio nos pericárdios convencionais foi de 1,69 µg/mg de tecido, enquanto naqueles tratados com ácido L-glutâmico foi de apenas 0,13 µg/mg de tecido [8]. Esses valores são semelhantes aos encontrados neste estudo, nos quais os pericárdios do grupo controle apresentaram 1,93 µg de cálcio/mg de tecido, enquanto que nos pericárdios dos grupos IV e VI, onde o tratamento com ácido L-glutâmico se mostrou mais efetivo, os níveis de cálcio foram de 0,066 e 0,063 µg/mg de tecido nos enxertos explantados com 60 dias. Nos grupos III e IV, o ácido L-glutâmico foi empregado em concentrações idênticas, ou seja, 0,8%, mas com pH diferente, observando-se que os resultados do grupo IV foram melhores (pH ácido).
Quando se avaliaram os resultados obtidos com a utilização de ácido L-glutâmico a 8% e pH 7,4 (grupo V), pode-se observar que com 60 dias, neste grupo, ocorreu maior grau de calcificação do que nos grupos IV e VI, pH 3,5; porém o grupo V apresentou resultados melhores do que os obtidos no grupo III, no qual a concentração do ácido foi dez vezes menor (0,8%).
Grimm et al. [8], em seus experimentos, também testaram o ácido L-glutâmico em solução tamponada e em pH ácido (3,5), e concluíram que as valvas preparadas em pH fisiológico (8,4) favorecem a incorporação significativa de polímeros de glutaraldeído no tecido. Estes polímeros são moléculas grandes e pesadas e que podem se decompor e servir como uma reserva contínua de aldeídos tóxicos. Sendo assim, o ácido glutâmico no pH fisiológico compromete o seu potencial anticalcificante, pois a ligação química ácida-base é instável [8].
O benefício observado com o emprego de um pH mais ácido (3,5), provavelmente, resulta de dois mecanismos independentes: a) o meio ácido durante a exposição ao ácido L-glutâmico favorece a formação de aldeídos monoméricos, que são moléculas menores e mais leves, facilitando a lavagem e remoção do tecido; b) quando ocorre a ligação química entre o ácido e o aldeído, há transformação em éster e acetato, evitando que aldeído tóxico livre seja liberado no tecido.
Neste estudo, ficou evidente a redução significativa dos níveis de calcificação obtido com o tratamento do segmento pericárdico com ácido L-glutâmico.
Estudos devem ser feitos para evidenciar se a ação anticalcificante do ácido L- glutâmico mantém-se em biopróteses de pericárdio bovino, implantadas no sistema circulatório.
O tratamento de segmentos de pericárdio bovino com solução de 0,8% de ácido L-glutâmico em pH 3,5, fixados pelo GDA, foi efetivo na prevenção da calcificação quando implantados na tela subcutânea de ratos jovens, por até 60 dias. O tratamento com 8% de ácido L-glutâmico em pH 3,5 também se mostrou efetivo, porém o ácido L-glutâmico nesta concentração pode ser tóxico a outros tecidos. Sendo assim, para produção comercial de próteses cardíacas o melhor tratamento seria solução de 0,8% de ácido L-glutâmico com pH 3,5.
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