Quantificação de transcritos maternos em oócitos bovinos submetidos a diferentes condições de maturação
https://doi.org/10.1590/S0102-09352010000600015
Quantification of maternal transcripts in bovine oocytes under different maturation systems
M.M. PereiraI,II; F.Q. CostaI; A.P. OliveiraI; R.V. SerapiãoI; M.A. MachadoI,II; J.H. M. VianaI; L.S.A. CamargoI
IEmbrapa Gado de Leite Rua Eugênio do Nascimento, 610, Dom Bosco 36038-330 - Juiz de Fora, MG
IIUniversidade Federal de Juiz de Fora - Juiz de Fora, MG
Comparou-se a quantidade relativa de transcritos de origem materna entre oócitos bovinos maturados in vivo e maturados em diferentes condições in vitro. Avaliou-se também o efeito dos sistemas de maturação in vitro sobre a viabilidade das células do cumulus. Para a maturação in vivo, os oócitos foram coletados 19-20h após aplicação de gonadorelina em doadoras superestimuladas com FSH e sincronizadas com implante de progesterona. Para a maturação in vitro, oócitos imaturos, obtidos de ovários coletados em matadouro, foram maturados sob diferentes tensões de oxigênio e suplementação proteica. Avaliou-se a abundância dos transcritos de Zar1, MATER e GDF9 por PCR em tempo real. A viabilidade das células do cumulus de oócitos maturados in vitro foi analisada pela coloração de Azul de Tripan. Observou-se sub-regulação (P<0,05) dos transcritos em oócitos submetidos às diferentes condições de maturação in vitro em relação aos maturados in vivo. Não houve diferença (P>0,05) na viabilidade das células do cumulus. Conclui-se que o sistema de maturação influencia a quantidade de transcritos de origem materna armazenados no citoplasma de oócitos bovinos.
Palavras-chave: bovino, maturação in vitro, expressão gênica, gene de efeito materno, soro, oxigênio
The relative abundance of maternal transcripts among bovine oocytes in vivo matured or under different in vitro conditions was compared. Viability of cumulus cells of in vitro matured oocytes was also evaluated. For in vivo maturation, oocytes were recovered from 19 to 20h after gonadorelin injection in donor cows, which were previously superestimulated with FSH and synchronized with progesterone implant. For in vitro maturation, immature cumulus-oocyte complexes, obtained from ovaries collected at slaughterhouse, were matured under different oxygen tensions and protein supplementation. Relative amount of Zar1, MATER, and GDF9 transcrispts were analyzed by real time PCR. Cumulus cell viability was analyzed by trypan blue. The expression of maternal effect genes were down-regulated (P<0.05) in oocytes matured under different in vitro conditions when compared to those in vivo matured. There was no difference (P>0.05) on cumulus cell viability among different in vitro maturation conditions. In conclusion, different maturation conditions affect the relative abundance of maternal transcripts stored into oocyte cytoplasm.
Keywords: cattle, in vitro maturation, gene expression, maternal effect gene, serum, oxygen
Na produção in vivo de embriões bovinos, aproximadamente 80% do oócitos ovulados desenvolvem-se até blastocisto, enquanto na produção in vitro (PIV) apenas 40% atingem esse estágio (Lonergan e Fair, 2008). O ambiente de maturação in vitro (MIV) influencia essa baixa taxa, uma vez que a PIV que utiliza esses oócitos é menos eficiente que a de oócitos maturados in vivo (Rizos et al., 2002; Bertagnolli et al., 2004). Experimentos anteriores verificaram que oócitos obtidos de maturação in vivo, após estímulo hormonal com FSH e GnRH, são mais competentes em se desenvolver até blastocistos do que os maturados in vitro (Van de Leemput et al., 1999; Humblot et al., 2005), o que sugere que a MIV deve determinar condições subótimas para o desenvolvimento de oócitos imaturos.
A maturação dos complexos cumulus-oócitos (COC) inclui modificações citoplasmáticas, manutenção de um estoque de proteínas e transcritos e expansão das células do cumulus, quepodem ser influenciadas pelas condições de cultivo, quando submetidos à MIV (Watson et al., 2000; Warzych et al., 2007). As condições de cultivo comumente utilizadas para a maturação in vitro envolvem o uso de 10% de soro e 20% de tensão atmosférica de oxigênio. O soro de vaca em cio (SVC) é rotineiramente utilizado como suplementação proteica na MIV, e o soro fetal bovino (SFB) no cultivo in vitro (CIV) de embriões (Camargo et al., 2009). Todavia, o soro possui compostos indefinidos e, quando utilizado no cultivo embrionário, altera a criotolerância e a abundância relativa de transcritos (Rizos et al., 2003). De forma similar, observa-se que o uso de alta tensão de O2 no cultivo embrionário altera a abundância relativa de mRNAs em embriões (Correa et al., 2008). Contudo, pouco se sabe dos efeitos dessas condições na MIV sobre o estoque de transcritos armazenados no citoplasma do oócito imaturo.
Genes de efeito materno são aqueles responsáveis por codificarem produtos, como mRNA e proteínas, que são estocados no citoplasma de oócitos e vitais para o desenvolvimento inicial do embrião, geralmente até a fase de transição materno zigótica (Lindeman e Pelegri, 2009). Entre esses genes, encontram-se o Maternal Antigen That Embryo Requeres (MATER) e o Zygote Arrest1 (Zar1). O MATER e o Zar1 são genes específicos de oócitos e possuem participação no desenvolvimento embrionário inicial em camundongos. Embriões de fêmeas nulas (nocaute) para o gene Mater não se desenvolvem além de duas células (Tong et al., 2000). De modo similar, embriões de fêmeas nocaute para Zar1 não se desenvolvem além de quatro células (Wu et al., 2003). Contudo, o papel de ambos os genes no desenvolvimento embrionário bovino ainda precisa ser investigado (Bettegowda et al., 2008). O Growth differention factor (GDF9) é um fator secretado pelo oócito, o qual influencia a foliculogênese (Eppig, 2001) e é apontado como tendo um papel importante na comunicação oócito-células foliculares e na expansão das células do cumulus durante o processo de maturação (Gilchrist et al., 2008). Além disso, o GDF9 na MIV pode aumentar a competência de desenvolvimento dos oócitos, influenciando a produção subsequente de embriões (Hussein et al., 2006).
O objetivo deste trabalho foi comparar a quantidade de transcritos específicos entre oócitos bovinos maturados in vivo e oócitos maturados in vitro em diferentes condições de cultivo, bem como avaliar a viabilidade das células do cumulus entre diferentes condições de maturação in vitro.
Para obtenção de oócitos maturados in vivo,foram utilizadas vacas mestiças (oito animais, Holandês-Gir), que receberam um implante intravaginal de progesterona (CIDR®, Eazi-Breed CIDRO - São Paulo, Brasil) e aplicação de 2mg de benzoato de estradiol (Estrogin®, Farmavet - São Paulo, Brasil) no dia 0 (D0). No quarto dia, os animais receberam 180mg de hormônio folículo estimulante (FSH; Pluset®, Serono, Itália) em seis doses de decrescentes, com intervalo de 12h. No sexto dia, receberam 0,53mg de cloprostenol sódico (Ciosin®, Cooper - São Paulo, Brasil) e, no sétimo dia, removeu-se o CIDR® e injetaram-se 2,5mg de gonadorelina (Gestran-Plus®, Tecnopec, São Paulo - Brasil). A aspiração folicular foi realizada entre 19 e 20h após a injeção de gonadorelina. Os oócitos foram recuperados por meio de filtro de coleta de embriões, e foram selecionados para a extração de RNA total somente os que possuíam células do cumulus expandidas e citoplasma de coloração homogênea.
Para a obtenção de oócitos maturados in vitro, foram aspirados folículos com diâmetro entre 2 e 8mm de ovários de fêmeas bovinas mestiças coletados em matadouro. Foram selecionados os COC de graus 1 e 2 (Viana et al., 2004) e divididos em quatro condições de maturação in vitro: G1 (0,1% PVA em 20% O2); G2 (10% SVC em 20% O2), G3 (0,1% PVA em 5% O2) e G4 (10% SVC em 5% O2). A MIVfoi realizada em meio TCM-199 (Gibco, Invitrogen - Califórnia, USA) e 20µg/mL de FSH (Pluset - Barcelona, Espanha), em estufa com 5% de CO2 a 38.5ºC por 21h. Ao final da maturação in vitro, oócitos foram selecionados seguindo o mesmo parâmetro descrito para oócitos maturados in vivo.
Para a quantificação em PCR em tempo real, os oócitos maturados in vivo e in vitro foram expostos à solução de 0,1% de hialuronidase para remoção total das células do cumulus. Foram utilizados três pools de 10 oócitos para o grupo de maturação in vivo e para os grupos de MIV, totalizando 30 oócitos para cada grupo. A extração do RNA foi realizada com o RNeasy Micro kit (Qiagen - Hilden, Alemanha), segundo recomendações do fabricante. O RNA foi eluído em água RNAse-free, gerando um volume final de 11µL (~55ng de RNA). A transcrição reversa foi obtida com o kit SuperScript III First-Strand Synthesis Supermix (Invitrogen), usando-se primer oligo dT20, segundo recomendações do fabricante. O volume final foi de 20µL (~14.000ng) de DNA complementar (cDNA). A quantificação relativa foi realizada em triplicata, utilizando-se o aparelho Real-Time PCR (ABI Prism 7300 Sequence Detection Systems - Foster City, CA, EUA). As reações foram feitas com SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) e 200ng de cDNA. O cDNA foi desnaturado a 95ºC por 2min, seguidos de 45 ciclos de 95ºC por 15s; 53ºC por 30s e extensão a 60ºC por 30s. Após PCR, foi realizada análise da curva de melting e análise em gel de agarose para confirmar a especificidade do produto gerado. O gene da β-actina foi utilizado com controle endógeno, e os oócitos maturados in vivo como calibradores de comparação. Os primers para os transcritos de Zar1, MATER, GDF9 e β-actina estão descritos na Tab. 1. A eficiência dos primers foi calculada usando-se o programa LinRegPCR (Ramakers et al., 2003) e utilizada na quantificação relativa dos produtos dos genes. Os resultados foram analisados pelo software REST® (Pfaffl et al., 2002), usando-se teste aleatório de realocação fixa em combinações duplas. Considerou-se P<0,05 como nível de significância.
Para avaliar a viabilidade das células do cumulus após a maturação in vitro em diferentes condições, utilizou-se a coloração com o Azul de Tripan (Sigma) (Jewgenow et al., 1998). As células foram avaliadas visualmente quanto à coloração com auxílio de microscópio óptico (Nikon, 1.25, Tókio, Japão). A viabilidade celular foi analisada por ANOVA e pelo teste SNK. O nível de significância foi de P<0,05 e os valores são apresentados como médias ± EP da média.
O protocolo hormonal para obtenção de oócitos maturados in vivo resultou, em média, 21,5±4,6 folículos por animal, que produziram 13,7±3,9 oócitos por coleta, resultando em taxa de recuperação de 63,2%. Obteve-se a taxa de 56,3% (n=62) de oócitos que apresentavam células do cumulus expandidas e citoplasma homogêneo. Procedimentos semelhantes, com superestímulo com FSH e indução do pico pré-ovulatório de LH com GnRH, foram utilizados em estudos anteriores para obtenção de oócitos maturados in vivo (Van de Leemput et al., 1999; Humblot et al., 2005). Os resultados do procedimento adotado no presente experimento foram semelhantes aos de Humblot et al. (2005), que obtiveram 21,6±1,4 folículos por animal, com 10,7±0,9 oócitos por coleta, realizando a coleta 20h após aplicação do GnRH. Contudo, a taxa de recuperação de 45,7% foi mais baixa que a observada no presente estudo.
Em relação aos transcritos maternos, observou-se menor quantidade relativa nos oócitos submetidos às condições de maturação in vitro quando comparados com aqueles maturados in vivo (Fig. 1). Os transcritos dos genes MATER e GDF9 apresentaram-se sub-regulados em todos os grupos de maturação in vitro (P<0,05; Fig. 1), enquanto os transcritos do gene Zar1 apresentaram-se sub-regulados para as condições de maturação que envolvia a suplementação com SVC ou PVA em baixa tensão de oxigênio (5% de O2) e SVC em alta tensão de oxigênio (20% de O2), sem alteração para os oócitos maturados com PVA em 20% de O2 (Fig. 1).
Em camundongos, os transcritos maternos MATER e Zar1 parecem ter papel importante na ativação do genoma embrionário (Tong et al., 2000; Wu et al., 2003). Contudo, a função do produto de ambos os genes ainda não está esclarecida em oócitos e embriões bovinos (Bettegowda et al., 2008). Transcritos de MATER e Zar1 estão presentes em oócitos bovinos a partir de folículos primários (Pennetier et al., 2004), e a sua quantidade se reduz com o reinício da meiose, seja pela maturação in vitro ou in vivo (Thélie et al., 2007). Contudo, variações na quantidade desses transcritos podem não estar associadas à competência do oócito em desenvolver após a fecundação in vitro (Mota et al., 2009). Independentemente da função, o presente resultado sugere que transcritos dos genes MATER e Zar1 podem ser afetados pelas condições de maturação in vitro. Thélie et al. (2007) verificaram redução abaixo de um terço da quantidade de transcritos poliadenilados durante a maturação, entre eles transcritos do gene MATER e Zar1, porém sem alteração na quantidade total dos transcritos desses genes. Essas são observações importantes, pois enquanto o alongamento da cauda poli-A causa estabilidade e previne degradação enzimática, o seu encurtamento torna o transcrito traducionalmente inativo (Eichenlaub-Ritter e Peschke, 2002). Brevini et al. (2007) sugeriram haver associação entre a extensão da poliadenilação, estabilidade do mRNA e competência do oócito durante a maturação para assegurar concentração adequada de transcritos, para o desenvolvimento embrionário inicial. O presente estudo utilizou primer para formas poliadeniladas (oligo dT20), e as menores quantidades de transcritos observadas nos tratamentos in vitro podem estar associadas a falhas dos oócito maturados in vitro em manter concentrações adequadas das formas poliadeniladas dos genes MATER e Zar1.
Curiosamente, a expressão do gene Zar1 nos oócitos maturados com PVA em tensão elevada de oxigênio (20%) foi semelhante (P>0,05) à dos oócitos maturados in vivo, embora tenha sido apresentada sub-regulada em quase duas vezes. No cultivo embrionário, um dos efeitos de elevada tensão de oxigênio é a maior formação de radicais livres (Bavister, 1995), o que pode interferir na expressão de genes (Rinaudo et al. 2006; Correa et al., 2008). Todavia, não está claro se pode haver algum envolvimento entre concentração de radicais livres e expressão de transcritos maternos em oócitos submetidos à maturação in vitro.
A expressão do gene GDF9 apresentou-se sub-regulada (P<0,001) nos oócitos submetidos às diferentes condições de maturação in vitro (Fig. 1). O GDF9 está associado à expansão das células do cumulus, induzida pela síntese de ácido hialurônico com participação do FSH (Eppig, 2001), e também à maior competência do oócito (Hussein et al., 2006). Transcritos de GDF9 têm sido encontrados em oócitos e embriões bovinos até estágio de 5-8 células (Pennetier et al., 2004). A maior quantidade de transcritos de GDF9 nos oócitos maturados in vivo pode ser resultado do ambiente folicular, determinando uma comunicação eficiente entre oócitos e células foliculares para o reinício e a progressão da meiose oocitária. Interessante é que a expansão das células do cumulus dos oócitos maturados in vivo, pela avaliação visual, foi maior do que nos maturados in vitro, dificultando até a sua identificação e manipulação nas placas de cultivo. Essa observação pode estar associada à melhor comunicação entre oócito e células foliculares dentro do ambiente folicular, via GDF9.
A presença de células do cumulus viáveis durante a MIV é importante para o sucesso da PIV de embriões, sendo a ponte entre o oócito e o ambiente in vitro (Tanghe et al., 2002). Neste estudo, observou-se que as diferentes condições de MIV não interferiram na viabilidade das células do cumulus (Fig. 2) e, portanto, baixa concentração de oxigênio na ausência de soro pode ser usada sem influenciar a viabilidade dessas células somáticas.
Em resumo, o presente estudo mostrou que oócitos submetidos a diferentes condições de maturação in vitro, com diferentes tensões de oxigênio e suplementação sérica, possuem quantidade de transcritos de origem materna alterada quando comparado com oócitos maturados in vivo. Isso pode significar menor quantidade de transcritos disponíveis para uso posterior à fecundação, durante o desenvolvimento embrionário inicial e pode estar associado ao potencial de desenvolvimento do oócito pós-fecundação, uma vez que estudos anteriores demonstraram que oócito maturados in vivo possuem maior capacidade de se tornar blastocistos quando comparados com os maturados in vitro (Van de Leemput et al., 1999; Humblot et al., 2005).
As diferentes condições de maturação in vitro influenciam a abundância de transcritos de origem materna armazenados no citoplasma de oócitos bovinos.
Ao CNPq e à FAPEMIG (Projetos CVZ1825/06 e CVZ APQ 1015-5.04/07), pelo apoio financeiro, à Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de estudo, e ao matadouro de Juiz de Fora, pela doação dos ovários.
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