Assepsia de Sementes e Segmentos Nodais de Jatropha Gossypiifolia L.
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Assepsia de Sementes e Segmentos Nodais de Jatropha Gossypiifolia L. para a Iniciação do Cultivo in Vitro desta Espécie Medicinal Amazônica
RC: 18037 - 08/08/2018
DOI: 10.32749/nucleodoconhecimento.com.br/biologia/assepsia-de-sementes
VIEIRA, Carlos dos Reis [1], MALOSSO, Milena Gaion [2]
VIEIRA, Carlos dos Reis; MALOSSO, Milena Gaion. Assepsia de Sementes e Segmentos Nodais de Jatropha Gossypiifolia L. para a Iniciação do Cultivo in Vitro desta Espécie Medicinal Amazônica. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. Ano 03, Ed. 07, Vol. 07, pp. 20-30, Julho de 2018. ISSN:2448-0959
Seleção dos explantes
Procedimento de assepsia
A Jatropha gossypiifolia L. é uma espécie da família Euphorbiaceae cuja ocorrência estende-se da região Norte à Nordeste do Brasil. É uma espécie bastante utilizada na medicina popular pelas suas inúmeras propriedades terapêuticas contra carcinomas e antileucêmica devido, respectivamente à jatrofona e a jatropona, comumente encontrada em suas raízes, o que a torna uma ferramenta no combate ao câncer. O pinhão-roxo já apresenta um grande potencial como fitoterápico, no entanto, não pode ainda ser utilizada pela indústria farmacêutica, uma vez que ainda não existe um protocolo para a produção de biomassa vegetal desta planta capaz de suprir a produção em larga escala de um fármaco por ela composto, e a coleta indiscriminada dos acessos no meio ambiente levaria esta espécie à extinção. Assim, o objetivo de iniciar o cultivo in vitro desta espécie medicinal é uma proposta eficaz para a produção de biomassa vegetal como fonte de matéria-prima para a indústria farmacêutica, além da conservação e da manutenção de sua variabilidade genética, uma vez que os acessos podem ser inseridos em bancos de germoplasma. Para isso, foram realizados os experimentos de assepsia, iniciados com a imersão das sementes e dos segmentos nodais, isoladamente, em solução de Benomil 1% (m/v) por 1 hora sob agitação constante a 100 rpm. Em seguida, os explantes foram imersos em álcool 70% durante 1 minuto e depois mergulhados, respectivamente, nas soluções de 0,1; 0,5 e 1,0% (v/v) de hipoclorito de cálcio por 30 minutos, sob a mesma agitação. Posteriormente ao processo de assepsia, os explantes foram lavados 4 vezes com água destilada estéril e então, inoculados em tubos de ensaio contendo meio de cultura MS diluído pela metade. A contaminação dos explantes foi avaliada durante 30 dias, sendo que os dados foram coletados a cada 3 dias. A assepsia mais eficiente para a desinfestação de sementes desta espécie foi a de 1,0 mg/L de hipoclorito de sódio, que proporcionou 100% de plantas germinadas e apenas 10% e contaminação fúngica e 26,67% de contaminação fúngica. Já para os testes realizados com segmentos nodais, fica também indicado o tratamento de 1,0 mg/L de hipoclorito de sódio com a adição de 5,0 mg/L de ácido ascórbico no meio de cultura visando evitar a produção de compostos fenólicos, que induziu 100% de explantes vivos e apenas 3,33% de contaminação bacteriana e 30% de contaminação fúngica. Com isso, deu-se o primeiro passo para a iniciação de uma cultura in vitro do pinhão- roxo de modo que se possa, posteriormente, realizar a rápida multiplicação in vitro desta espécie medicinal brasileira, evitando a sua erosão genética e possível extinção.
Palavras-chave: Desinfestação, Micropropagação, Banco de Germoplasma, Pinhão-roxo.
No que se diz respeito às ações de conservação de plantas medicinais, a adoção de técnicas biotecnológicas é de extrema importância, visto que estas são capazes de multiplicar e conservar plantas em laboratórios, de modo que se torna desnecessário o uso de grandes áreas de solo para conservar a variabilidade genética de uma espécie vegetal (ZANONI & FERMENTE, 2011).
Dentre as estratégias utilizadas para a conservação, existem duas formas de preservação permanente: conservação ex vitro e in vitro (BENSUSAN, 2008). A primeira é realizada no habitat natural da espécie, em áreas de preservação permanente e a segunda se faz com o estabelecimento de banco de germoplasma, onde os propágulos são cultivados em meio de cultura estéril em laboratórios (AHUJA & JAIN, 2017).
A cultura de tecidos vegetais in vitro é uma técnica de grande importância prática para as áreas agrícola e florestal e também para as áreas cientificas, tal como a biologia de plantas, onde aparece como umas das técnicas mais amplamente utilizadas (FLÔRES et. al., 2011). E, por isso, Pinhal et al. (2011) afirmam que várias técnicas de cultura de tecidos podem ser utilizadas para diversos objetivos, tais como a técnica de micropropagação para a multiplicação de material genético em larga escala e em curto período de tempo, a de banco de germoplasma para a conservação, troca e avaliação de germoplasma, entre outras.
A micropropagação é uma técnica para propagar plantas dentro de tubos de ensaios ou similares de vidro transparente, sob condições adequadas de assepsia, nutrição e fatores ambientais como luz, temperatura, 02 e CO2 (SILVA et al., 2014), e esta técnica de cultura de tecido vegetal é amplamente utilizada na conservação de espécies vegetais. No entanto, o estabelecimento da cultura in vitro depende da eficiência do processo de assepsia, pois é nesse processo que eliminará todos os patógenos (bactérias, fungos filamentosos, leveduras etc.) que possam vir a comprometer a qualidade sanitária das plantas assim produzidas (PALÚ et al., 2011; PEREIRA et al., 2015) e da adaptação dos explantes ao meio de cultura, por isso, os meios de cultura são elaborados a partir das exigências das plantas inteiras, quanto aos nutrientes minerais (MARTENDAL et al., 2013). Entretanto, algumas modificações podem ser realizadas para atender as necessidades específicas da condição de cultivo in vitro (SASSAMORI, 2016).
A conservação de acessos geneticamente distintos em banco de germoplasma é muito importante, uma vez que são unidades conservadoras de material genético de uso imediato ou com potencial de uso futuro, onde ocorrem a introdução e o descarte de acesso quando necessários (VETTORAZZI, 2017). Portanto, o desenvolvimento de protocolos de assepsia de sementes e de segmentos nodais, torna-se uma ferramenta importante para iniciação de desenvolvimento de protocolos de micropropagação e de estabelecimento de banco de germoplasma para serem inseridas em programas de conservação, principalmente quando a espécie em estudo, apesar de não domesticada, já apresenta uso potencial como fitoterápico, sendo assim, estratégias importantes para minimizar o processo de erosão genética das espécies.
A conservação de plantas medicinais da Amazônia em banco de germoplasma é uma estratégia importante para garantir a sobrevivência das espécies endêmicas, bem como conservar a sua variabilidade genética, além de possibilitar a reintrodução dessas espécies em seu habitat natural (SOUZA, 2011).
A J. gossypiifolia é uma espécie que está exposta à erosão genética provocada pela coleta indiscriminada e pelos freqüentes desmatamentos provocados pelo homem nas áreas de ocorrência natural, além de ser uma espécie bastante coletada, já que é utilizada na medicina popular pelas suas inúmeras propriedades de interesse farmacológico.
Esta espécie apresenta um grande potencial como fitoterápico, uma vez que apresenta em suas raízes a jatrofona e a jatropona, que apresentam atividade contra carcinomas e antileucêmica (MARIZ et al, 2010), respectivamente, o que a torna uma ferramenta no combate ao câncer mas ainda não pode ser incluída em programas de produção em larga escala de fitomedicamentos, uma vez que ainda não há estudos fitotécnicos que permitam a rápida multiplicação desta espécie e, conseqüentemente, a produção de biomassa vegetal suficiente para uso como fonte sustentável de princípios ativos empregados pela indústria farmacêutica.
Considerando a gravidade desse problema, no momento em que toda a humanidade está preocupada em conservar a biodiversidade do planeta, avaliar diferentes protocolos de assepsia de sementes e de segmentos nodais provenientes de genótipos da Amazônia de Jatropha gossypiifolia L., visando a proposta de estudar técnicas de propagação a partir de métodos biotecnológicos, objetivando dar início protocolos de multiplicação e de conservação de em banco de germoplasma in vitro de indivíduos representativos da diversidade desta espécie, é uma atitude concreta de preservação para a utilização dessa espécie medicinal da Amazônia brasileira.
Todos os experimentos in vitro foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Coari – AM.
Foram coletados frutos e ramos de galhos de J. gossypiifolia em residências situadas na Rua Praça Ribeiro Junior do bairro Espírito Santo e na Rua Capitão Silva do Bairro Tauá-Mirim, no Município de Coari – AM.
Figura 1: Coletas em vários lugares do Município de Coari – AM. Fonte: Souza, M. P. F., 2013.
Após a coleta de Jatropha gossypiifolia L., 90 sementes foram retiradas dos frutos e os galhos tiveram seus segmentos nodais cortados em regiões específicas da posição 1 (apical), 2 (segmento nodal localizado logo abaixo da posição 1) e posição 2 (segmento nodal localizado logo abaixo da posição 2) obtendo-se 180 explantes destes tipo, para serem utilizados no experimento.
Figura 2: A- Sementes de pinhão-roxo; B- Obtenção de segmentos nodais de pinhão-roxo. Fonte: Souza, M. P. F., 2013.
O preparo do meio procedeu da seguinte maneira: para cada litro solução estoque do meio de cultura MS comprado da Sigma Aldrich®, diluído pela metade, foram adicionados 30,0 g de sacarose e o pH foi aferido para 6.0. Em seguida, foram adicionadas 8,0 g/L de ágar, e então distribuído em 180 tubos de ensaio com aproximadamente 5,0 mL de meio de cultura. Na sequência, foram autoclavados por 20 minuto a 20º C e 1 ATM visando a esterilização do material.
O procedimento de assepsia foi iniciado com separação dos explantes da planta matriz. Foram utilizados 3 Erlenmeyers de 500 mL contendo 30 explantes cada, que foram imersos em 100 mL de solução de Benomil 1% (m/v) por 1 hora sob agitação constante a 100 rpm. Em seguida, os explantes foram imersos em álcool 70% durante 1 minuto e depois mergulhados em solução de 0,1; 0,5 e 1,0% (m/v) de hipoclorito de cálcio, respectivamente, por 30 minutos, também sob a mesma agitação. Posteriormente ao processo de assepsia, tanto as sementes como os segmentos nodais foram lavados 4 vezes com água destilada estéril e então, inoculados em tubos de ensaio contendo meio de cultura MS diluído pela metade.
O experimento acima descrito foi repetido para os explantes do tipo segmento nodal, no entanto estes foram agora inoculados em meio de cultura MS/2 acrescido de 5,0 mg/L de ácido ascórbico.
As sementes e segmentos nodais foram mantidos em sala de crescimento e 30 dias após a inoculação, quando então foram avaliadas quanto à presença e/ou ausência de microrganismos. A taxa de germinação foi avaliada com 90 dias.
Os resultados destes experimentos foram expressos em porcentagem simples.
Para se estabelecer um protocolo de cultivo in vitro de uma espécie, a fase de assepsia que antecede os experimentos de multiplicação é de fundamental importância, pois é nessa fase que se elimina todo e qualquer tipo de patógeno que possa vir a comprometer a qualidade fitossanitária das plântulas produzidas in vitro (BRONDANI et al., 2009).
Tabela 1: Assepsia de sementes de Jatropha gossypiifolia L.
CONCENTRAÇÃO DE HIPOCLORITO DE CÁLCIO (%) EXPLANTES VIVOS
(%) CONTAMINAÇÃO Bacteriana (%) CONTAMINAÇÃO Fúngica (%)
0,1 100,0 26,67 33,33
0,5 100,0 23,33 26,67
1,0 100,0 10,00 26,67
O experimento de assepsia realizado com sementes de Jatropha gossypiifolia L. foi eficiente uma vez que, em qualquer das concentrações de hipoclorito de cálcio associadas a 1% de Benomil permite 100% de sobrevivência das sementes, conforme mostra a Tabela 1, onde também pode-se averiguar que a porcentagem de contaminação por fungos se estabiliza em 26,67% a partir da concentração de 0,5% de hipoclorito de cálcio e que a contaminação bacteriana é inversamente proporcional à concentração de hipoclorito de cálcio, chegando à apenas 10% com uma concentração de 1,0% deste agente desinfestante. A partir deste experimento, fica indicada a concentração de 1,0% de hipoclorito de cálcio para a desinfestação das sementes desta espécie.
Tabela 2: Assepsia de segmentos nodais de Jatropha gossypiifolia L.
CONCENTRAÇÃO DE HIPOCLORITO DE CÁLCIO (%) EXPLANTES VIVOS (%) CONTAMINAÇÃO BACTERIANA (%) CONTAMINAÇÃO FÚNGICA (%)
0,1 0,00 13,33 50,00
0,5 0,00 13,33 40,00
1,0 0,00 3,33 30,00
A assepsia de segmentos nodais é o primeiro procedimento para a inserção de genótipos-elite axênicos in vitro, durante o estabelecimento da metodologia de banco de germoplasma. A etapa de assepsia, na técnica de banco de germoplasma é de suma importância, pois sem ela, torna-se impossível inserir explantes oriundos de plantas matrizes já adultas, que contenham diversos genes de interesse biotecnológicos e que, nem sempre, estão presentes nos seus descendentes.
A Tabela 2 mostra que, embora a concentração de 1,0% de hipoclorito tenha resultado em apenas 3,33% de explantes contaminados por bactérias e 30% de contaminação fúngica, a assepsia foi ineficiente, pois 100% dos explantes submetidos ao hipoclorito de cálcio, em qualquer uma das concentrações testadas, oxidaram e morreram. Este fato pode ser explicado pela relação entre o tamanho do explante e a ação do agente desinfestante, uma vez que os tecidos pequenos são muito susceptíveis à degeneração dos tecidos causados pelo hipoclorito de cálcio (SOUZA et al., 2011). No entanto, o sucessivo escurecimento que culminou na oxidação dos seguimentos nodais podem também ser aferidos à liberação de compostos fenólicos, o que leva à necessidade de testar novamente essa assepsia mais barata de segmentos nodais na presença de um agente antioxidante no meio cultura e/ou na ausência de luz. Por isso, adicionamos o ácido ascórbico no meio de cultura e obtivemos os seguintes resultados:
Tabela 3: Assepsia de segmentos nodais de Jatropha gossypiifolia L. inoculado em meio de cultura acrescido de 5,0 mg/L de ácido ascórbico.
0,1 100,00 13,33 50,00
0,5 100,00 13,33 40,00
1,0 100,00 3,33 30,00
De maneira geral, o estabelecimento in vitro de segmentos nodais apresenta grandes problemas com relação à produção de compostos fenólicos e a baixa resposta morfogênica dos explantes (NAVROSKI et al, 2014). E a adição de solução de ácido ascórbico que variam entre 0,1 a 5,0 mg/L ao meio de cultura tem apresentado resultado satisfatório para a minimização dos efeitos da oxidação com relação às oxidações fenólicas no cultivo de plantas in vitro (FERMINO JUNIOR et al, 2009).
O escurecimento dos seguimentos nodais é causado por polifenoxidases que oxidam os fenóis formando quinonas, que por sua vez se polimerizam formando compostos de tons amarronzados que inibem a ação de muitas enzimas do metabolismo vegetal (FIGUEIRO et al., 2010). Em cultura de tecido, este mecanismo de resposta da célula pode ser evitado ao colocar a planta no escuro ou na presença de agentes antioxidantes nos três primeiros dias após a repicagem do explante, uma vez que este simples procedimento bloqueia a síntese da enzima PAL (Polifenilalaninaamônioliase) que é ativa pela luz e é também precursora das vias metabólicas de polifenoxidases (GIATTI & LIMA, 2007).
A Tabela 3 comprova que, como previsto, a oxidação por composto fenólico é a causa da morte dos explantes, uma vez que na presença do ácido ascórbico, que é inibidor de compostos fenólicos, 100% dos explantes continuaram vivos e vigorosos em qualquer uma das concentrações de hipoclorito de cálcio a que foram expostos. Nesta tabela, também verificamos que a adição de ácido ascórbico não promoveu nenhuma diferença na porcentagem de contaminação por fungos e por bactérias para esta espécie.
Deste modo, fica indicado o tratamento de assepsia realizado com 1,0% de hipoclorito de cálcio para a inserção de segmentos nodais em banco de germoplasma, em meio contendo 5,0 mg/L de ácido ascórbico, uma vez que a associação de ambos induziu 100% de explantes vivos, com apenas 3,33% de contaminação bacteriana e 30% de contaminação por fungos.
As contaminações que ocorrem frequentemente em culturas de tecidos vegetais podem ter várias origens: a ineficiência da técnica, o descuido do manipulador, microrganismos exógenos resistentes aos agentes químicos utilizados no processo de descontaminação e a presença de microrganismos endofíticos, que são principalmente fungos e bactérias que vivem no interior das plantas, habitando partes aéreas ou radiculares sem causar dano aparente a seus hospedeiros, assim, se diferenciam dos microrganismos fitopagenênicos, que causam doenças às plantas (MARTENDAL et al., 2013).
Através deste estudo esperou-se dar o primeiro passo para a rápida multiplicação in vitro desta espécie medicinal brasileira, possibilitando com isso novos ensaios para a rápida multiplicação de biomassa vegetal in vitro e evitando a sua erosão genética e possível extinção.
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[1] Discentes do curso de Bacharelado em Biotecnologia do Instituto de Saúde e Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas;
[2] Doutora em Biotecnologia. Docente do curso de Bacharelado em Biotecnologia do Instituto de Saúde e Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas. Coordenadora do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais.