ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS INSTÁVEIS NOS LINFÓCITOS DE PACIENTES COM CÂNCER DE COLO DE TERO BR N DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - PDF
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Victoria Deluca Molinari
1 BR INIS-BR N DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS INSTÁVEIS NOS LINFÓCITOS DE PACIENTES COM CÂNCER DE COLO DE TERO AUTOR: SIMEY DE SOUZA LEÃ-O PEREIRA MAGNATA RECIFE - PERNAMBUCO - BRASIL SETEMBRO
2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIENCIAS DEPARTAMENTO DE ENERGIA NUCLEAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUIAÇÃO EM TECNOLOGIAS ENERGETICAS E NUCLEARES (PROTEN) ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS INSTÁVEIS EM LINFÓCITOS DE PACIENTES COM CÂNCER DE COLO DE ÚTERO SÍMEY DE SOUZA LEÃO PEREIRA MAGNATA RECIFE - PERNAMBUCO - BRASIL SETEMBRO
3 ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS INSTAÁVEIS EM LINFÔCITOS DE PACIENTES COM CÂNCER DE COLO DE UTERO
4 SÍMEY DE SOUIZA LEÃo PEREIRA MAGNATA ABERRAÇÕES CROM'OSSÔMICAS INSTÁVEIS EM LINFOCITOS DE PACIENTES COM CÂNCER DE COLO DE UTERO Dissertação submetida ao curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Tecníologias Energéticas Nucleares, do Departamento de Energia Nuclear, da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do título de Mestre em Ciências, Área de Concentração: Dosimetria e Instrumnentação Nuclear. ORIENTADOR: PROF. DR. ADEMIR DE JESUS AMARAL CO-ORIENTADOR: PROF. DR. ANDRÉ MACIEL NETTO RECIFE - PERNAMBUCO - BRASIL SETEMBRO- 2002
5 ABERRAÇÕES CROMOSSOMICAS INSTAVEIS NOS LINFOCITOS DE PACIENTES COM CANCER DE COLO DE ÚTERO Simey de Souza Leão Pereira Magnata APROVADA EM: ORIENTADOR: Prof. Dr. Ademir de Jesus Amaral CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. André Maciel Netto COMISSÃO EXAMINADORA: PrDr. WaIdeciro Colaç - DTEN -E Visto e permitida a impressão Coordenador doprotenmi)mufpe
6 Aos meus pais, Severino e Albertina, aos meus irmãos, Saulo, Sávio e Sindy, e ao meu marido, Flávio, minha homenagem e gratidão, A Tiago, dedico.
7 AGRADECIMENTOS Primreiramente a Deus, que está sempre ao meu lado, guiando minhas decisões e fortalecendo-me em todos os momentos da vida. Ao Departamento de Energia Nuclear por receber-me como aluna e aos colegas, professores e funcionários pela doce convivência ao longo de minhas atividades. Aos meus familiares que sempre respeitaram minhas decisões e me incentivaram apesar das dificuldades, sobretudo aos meus pais. Ao meu marido, pelo aor, carinho, incentivo, comrpreensão e apoio em todos os momentos, principalmente durante o desenvolvimento desta dissertação que foi concomitante comn a chegada do nosso filho. Ao meu filho, Tiago, minha vida, que desde o útero contribuiu para o bom desenvolvimento desta dissertação. Nunca me atrapalhou e mesmo inconscientemente entendia minhas dificuldades e contribuia mais que muitos adultos. Aos meus amigos, principalmente a Andréa Sarmento pela amizade e apoio e a Isvânia Serafim Barbosa, que cooperou em todos os momentos desta dissertação com paciência e carinho, sua ajuda foi fundamrental nessa dupla gravidez. Ao amigo e orientador Prof. Dr. Ademnir de Jesus Aaral, pela amizade, compreensão, disposição e confiança na elaboração e desenvolvimento desta dissertação. Ao amigo e co-orientador Prof. Dr. André Maciel Netto, pela atenção, cuidado durante todas as observações sugeridas e pela doce convivência. À amiga e Professora Dra. MW Teresa Jansem, pelo apoio desde a graduação e pela oportunidade de aprender ao seu lado. Obrigada pela constante disponibilidade. Ao Hemnocentro de Perniambuco (HEMOPE) pela confiança em aceitar-me. principalmente ao Dr. Polion Gomes e ao Dr. Raul MeIo. Obrigada por disponibilizar espaço fisico, profissionais especializados e tecnologia à conclusão desta dissertação. As amigas Graça Sotero, Márcia Bandeira, Júlia Netto, Ana Pedrosa e Bernadete pela amizade, carinho e apoio incondicional durante os experimentos no HEMOPE. Ao CERAPE, pela confiança e parceria, obrigada ao Dr. Homnero Cavalcanti e ao Dr. Ernesto Roester por disponibilizar sua equipe às necessidades da dissertação, agradeço a todos e a Dra. Taciana Soares pela contribuição quanto aos parâmetros fisicos. Ao CNPq, pelo recurso financeiro disponibilizado.
8 'A vida é uma eterna busca, e o conhecimento a única riqueza que ninguém pode confiscar'. (Argemiro de Souza Leão)
9 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS RESUMO SUMMARY x xi xii xiii xiv 1 INTRODUÇÃO 2 OBJETIVO 3 3 REVISÃO DE LITERATURA Os riscos e beneficios da radiação onizante Grandezas fisicas Dose absorvida (D) Dose equivalente (HT) Métodos dosirnétricos aplicados à medicin Dosirnetria ctogenética Linfócitos A estrutura dos crornossomos e suas aberrações Curva dose-efeito 17 4 MATERIAL E MÉTODOS Aprovação do conselho de ética 2_ 4.2 Perfil dos pacientes Protocolo de tratamento Coleta de sangue 24
10 Página 4.5 Cultura de finfócitos Definição do protocolo de cultivo de linfócitos Transporte das amostras sanguíneas Escolha do meio de cultura Escolha do anticoagulante Fitohemaglutinina Soro bovino fetal Incubação da cultura Retirada da cultura Preparo das lâminas Coloração Bandeamento G Interpretação microscópica 36 5 RESULTADOS E DISCULSSÃO Dose de 0,08 Gy para a localização do tumor Dose de 1,80 Gy para tratamento do tumor Obtenção das aberrações a partir da curva dose-efeito biológico 46 6 CONCLUSõES 49 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 50 APÊNDICE - A Radioterapia e suas aplicações 55 ANEXO 1 - Termo de consentimento livre e esclarecido 61 ANEXO 2 - nformações clínicas das pacientes 6
11 ix LISTA DE FIGURAS Figuras Página 1 - Linfócitos maduros Controle do ciclo celular Etapas da mitose e interfase Metáfase celular e crornossomo condensado Classificação dos cromnossornos segundo a posição do centrômero, Curvas dose-efeito Fonte de 6 ">Co utilizada pelas pacientes do CERAPE Campos de irradiação Câmara de fluxo lamninar Processamento das amostras 27 11I- Procedimento detalhado da cultura Estufa do laboratório de citogenética do HEMOPE Foto ilustrativa da centrifuga utilizada no 1-EMOPE Representação gráfica do preparo das lâimnas Sequência de etapas para a coloração das lâminas Análise das lâminas com microscópio óptico (-EMOPE) Aberrações cromiossômicas instáveis Cariótipo humano de paciente do sexo feminino avaliada 39
12 LISTA DE TABELAS Tabelas Página 1- Eficiência biológica relativa 7 2- Número de linfócitos em humanos 12 3-Descrição da dose recebida por região anatômica Amostras estudadas ComposiÇão do soro bovino fetal 3 6- Quantificação das aberrações cromossômicas instáveis espontâneas Leucograma das pacientes Resultados da primeira fase do tratamento (Dose de 0,08 Gy) Resultados da segunda fase do tratamento (Dose de 1,80 Gy) 42) 10O- Freqüência de aberrações de acordo com Venkatachalan et al., Comparação entre valores previstos por Lloyd e a, (1986) e os obtidos nesta 47 pesquisa.
13 Xi LISTA DE ABREVIATURAS HEMOPE - CERAPE - DNA - RNA - lcrp - RBE - Dref D,- ICRU - LET - D - s - hemocentro de Perinmbuco centro de radioterapia de Pernambuco ácido desoxirribonucléico ácido nbonucléico comissão internacional de proteção radiológica eficiência biológica relativa dose referência ou padrão dose teste comissão internacional de unidades e medidas transferência linear de energia dose absorbida sistema internacional de unidades Gy - gray - joule kg - kilograma de -energia d - Q -fator depositada pela radiação massa do material absorvedor ponderal de qualidade á natureza da radiação H, dose equivalente Sv - sievert E - dose equivalente efetiva -j fator ponderal de qualidade relacionado ao tecido Go fase de latência. ou repouso celular G- primeira, fase da interfase - fase da iterfase para síntese do DNA G 2 - CDK - p - q - X - fase da interfase que antecede a mitose proteínas dependentes de ciclina braço curto dos cromossomos braço longo dos croinossomos cromossorno sexual - cronmossonio sexual masculino
14 xii IAEA - apgência internacional de energia atômica 137 c - césio- 137 cg - centigray num - minuto <>Co - cobalto- 60 ml - h - ~horas mililitro p- - potencial hidrogenlônico KCI - M - rpm - EDTA - o c- cloreto de potássio molaridade rotações por minuto ácido etilenodianotetracético, graus centígrados - gramas 226 Rn - radônio U - urânio K - potássio c carbono- 14 rnrn 3 milímetros cúbicos %- percentual FISH - COMETA - tluorescent i-situ hiybrization the allkaline single-cell gel. electrophoresis assay M- primeira mnitose M2- segunda mitose Sr - estrôncio-90 - freqüência de croinossomos dicêntricos
15 Xiii ABERRAÇOES CROMOSSÔMICAS INSTÁVEIS EM LINFOCITOS DE PACIENTES COM CÂNCER DE COLO DE ÚTERO, RESUMO A determinação da dose absorvida é uma importante etapa na avaliação dos riscos associados à exposição de individuos a radiação onizante. Entretanto, a medida direta da dose nem sempre é possível, sobretudo nos casos de irradiação acidental. Nesse contexto, o uso de bioindicadores (efeitos biológicos) tem sido proposto, caracterizando assim a dosimetria biológica. Em particular, a contagem de aberrações cromossômicas instáveis (cromossomos dicêntricos, anéis e fragmentos), produzidas nos linfóácitos do sangue periférico de individuos irradiados, constitui o método biológico mais eficaz na avaliação retrospectiva da dose absorvida. Neste trabalho, amostras de sangue periférico de cinco pacientes portadoras de carcinoma de colo uterino, foram analisadas em três diferentes etapas do tratamento radioterápico com uma fonte de 60 Co. Para tanto, utilizou-se a análise citogenética clássica, objetivando correlacionar a freqüência de aberrações cromossômicas instáveis no lnfócito para a dose absorvida durante o tratamento. Foi observada uma boa concordância entre as doses estimadas com as frequências de aberrações cromossômicas obtidas e os valores de doses calculados para cada etapa da radioterapia, previamente determinados com auxílio da dosimetria fisica.. Os resultados do presente estudo evidenciam a importância da freqüência de aberrações crornossômicas instáveis como dosímetro biológico na avaliação da exposição localizada de indivíduos à radiação ionizante.
16 xiv UNSTABLE CHIROMOSOME ABERRATIONS ON PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYKTES FROM PATIENTS WITH CERVICAL UTERINE CANCER FOLLOWING RADIOTHERAPY. SUMMARY Absorbed dose determination is an important step for risk assessment related to an exposure to ionizing radiation. However, physical dosimetry cannot be always performed, principally in the case of retrospective, estimates. In this context, the use of bioindicators (biological effects) as been proposed, which defines the so-called biological dosimetry. In particular, scoring of unstable chromnosomes aberrations (dicentrics, centric rings and fragments) of peripherat blood lymphocytes, which is the most reliable biological method for estimating individual exposure to ionmzing Tadiation. In this work, blood samples from 5 patients, with cervical uterine cancer, were evaluated after partial-body radiotherapy with a source of 60Co. For this, conventional cytogenetic method was employed, based on Giemnsa coloration and fluorescence in situ hybridization, in order to correlate the frequency of unstable chromosome aberrations of blood. lymphocytes with absorbed dose, as a result of the radiotherapy. A good agreement was observed between the frequency of chromosome aberrations scored and the values of dose previously calculated by physical dosimetry during patient's radiotherapy. The results presented in this work point out the importance of concerning analyses of unstable chromosome aberrations as biological dosimeter in the investigation of partial-body exposure to ionizing radiation.
17 1.INTRODUÇÃO As interações da radiação ionizante com a matéria se traduzem pela transferência de energia para o meio, através do fenômeno de excitação e/ou de ionização. Em se tratando da matéria viva, fenômenos fisico-químicos ao nível celular podem resultar em efeitos biológicos, tais como alterações no código genético (CHECCUCCI, 1987; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1995). A dose absorvida é a grandeza fisica fundamental usada na avaliação dos efeitos da radiação ionizante no corpo humano, sendo definida como a relação entre a energia depositada pela radiação onizante na matéria, por unidade de massa. De um modo geral, a dosimetria pode ser classificada em: fisica, clínica e biológica. A dosimetria fisica avalia a dose com o auxílio de instrumentos sensíveis à radiação onizante, tais como filmes dosimétricos e dosímetros termoluminescentes (RIGHI et al, 1997). Quando a medida direta não é possível, modelos são empregados. A dosimetria clínica baseia-se na sintomatologia do indivíduo após exposição à radiação ionizante. Os parâmetros considerados são as reações locais, as alterações no sistema hematopoético, gastrointestinal e por fim no sistema nervoso. A dosimetria biológica estima a dose absorvida a partir do estudo de determinados efeitos biológicos radioinduzidos, principalmente ao nível celular. O indicador biológico de exposição à radiação ionizante mais utilizado é a quantificação das aberrações cromossômicas instáveis em linfóácitos do sangue periférico (cromossomos dicêntricos, fragmentos nucleares e cromossomos em anel). Nesse caso, a dose absorvida pelo indivíduo é estimada comparando-se os dados obtidos com curva dose versus efeito biológico. A avaliação da dose absorvida com base nessa metodologia é também denominada de
18 dosimetria citogenética. A opção pelo emprego da análise das aberrações cromossômicas instáveis em linfócitos é justificada pela facilidade da coleta de amostras de sangue e devido à manutenção dessas aberrações por um longo período após a irradiação. Além disso, vários trabalhos têm demonstrado que a presença dessas aberrações é resultante apenas da exposição de individuos à radiação ionizante (RAMALHO et al, 1991). Esta pesquisa é resultado da colaboração entre o Departamento de Energia Nuclear da Universidade Federal de Pernambuco, o Hemocentro de Pernambuco (HEMOPE), o Centro de Radioterapia de Pernambuco (CERAPE) e a Faculté de Medicine Xavier Bichat (Paris, França).
19 3 2. OBJETIVO O presente trabalho tem como objetivo avaliar o emprego da quantificação das aberrações cromossômicas instáveis (cromossomos dicêntricos, fragmentos nucleares e cromossomos em anel), a partir da análise do sangue periférico em linfóácitos de pacientes portadoras de câncer de colo de útero, as quais foram expostas parcialmente à radiação gama com finalidade terapêutica.
20 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1 Os Riscos e Benefícios da Radiação lonizante O uso da radiação onizante como ferramenta na medicina, para fins diagnósticos e terapêuticos, tem crescido ao longo dos anos e demonstrado ser de grande importância para elaboração e aprimoramento de tratamentos. A crescente utilização da radiação lonizante em diversas áreas e a possibilidade da mesma causar danos, levou à necessidade de melhor compreender a maneira como a mesma interage com a matéria, para otimização de suas aplicações (AMARAL ei ai., 1999) A interação da radiação ionizante com a matéria se traduz pela transferência de energia à mesma e depende da natureza da radiação, bem como do meio com o qual ela interage Como resultado, fenômenos fisicos e químicos ocorrem, podendo levar a alterações biológicas em nível celular, tissular, somático e molecular (EARLY ei ai., 1995; FARIA ei ai., 1999). As primeiras observações sobre danos biológicos datam de 1896, envolvendo operadores de aparelhos de raios-x que sofreram queimaduras (CAMERON e al, 1978). Desde então, a radiobiologia procura estudar os riscos associados à exposição de indivíduos à radiação onizante. Os efeitos biológicos resultantes de uma irradiação dependem da região celular atingida, ou seja, o núcleo ou o citoplasma, bem como do grau de diferenciação celular. Esses efeitos podem ser conseqüência das ações diretas ou indiretas da radiação na matéria. No efeito direto, a radiação ionizante atinge uma biomolécula essencial, como o ácido desoxirribonucléico (NA) e ácido ribonucléico (RNA) e as proteínas. No efeito indireto, a radiação incide sobre moléculas secundárias, originando espécies químicas altamente reativas, os chamados radicais livres, os quais são responsáveis por danos ao organismo. Isto ocorre, preferencialmente, com a molécula da água; é através da quebra desta molécula que 80% dos danos causados à célula ocorrem (RIGI e ai., 1997).
21 Numa célula, uma molécula fundamental é o )NA, que atua em diversas etapas do metabolismo celular. Assim, se o DNA for alterado pela radiação, com perdas ou modificações de bases, pode levar a alterações fisiológicas próprias e/ou a alterações nas gerações celulares delas originadas (ALBERTS e a, 1997). As modificações dos ácidos nucléicos devido à radiação ionizante podem ser classificadas em três grandes categorias (BENDERITTER ei al, 1999): 90Ruptura simples da cadeia do D)NA, 10 Modificação dos nucleotídeos ou das bases, É0 Formação de sítios não básicos, *F Quebras das pontes de hidrogênio. As alterações acima citadas podem ser causadas por diferentes fatores, como o uso de agentes tóxicos, o tipo de atividade social e/ou profissional desenvolvida pelo indivíduo, mas também pelos antecedentes médicos do mesmo (RIGH1 et al, 1997). Daí a importância, e muitas vezes a dificuldade, em identificar a causa dos efeitos, bem como quantificá-los. Para tanto, testes biológicos específicos devem ser empregados. Os efeitos da radiação podem ser abordados sob outros aspectos, classificando-os em estocásticos e determinísticos, podendo ainda ser subdivididos em somáticos e genéticos. A Comissão Internacional de Proteção Radiológica (ICRP), em sua 4 1, publicação (ICRP, 1984), define os efeitos determinísticos como sendo aqueles cuja severidade e frequência variam com a dose e só ocorrem quando a dose limiar é excedida. Por outro lado, em se tratando dos efeitos estocásticos, apenas a probabilidade de ocorrência, e não a severidade, é função da dose. Para esses efeitos não existe valor de dose limiar e se distribuem de maneira aleatória na população, tendo sido demonstrados em experimentos radiobiológicos e epidemiológicos. Sua probabilidade de ocorrência aumenta com a dose, possuindo um período de latência relativamente longo (COGGLE, 1985).
22 6 A classificação dos efeitos biológicos em somáticos e genéticos vai depender do tipo celular atingido. No primeiro caso, efeito somático, a célula atingida é responsável pela manutenção do funcionamento orgânico. No segundo caso, efeito genético, a célula é responsável pela transmissão de informações às futuras gerações de indivíduos (RIGHI et ai., 1987). De uma maneira geral, há tecidos que são mais sensíveis à radiação ionizante que outros. A radiosensibilidade, na maioria das vezes, obedece à lei de Bergonié e Tribondeau que afirma: "a radiosensibilidade celular é diretamente proporcional à sua atividade reprodutiva e inversamente proporcional ao seu grau de diferenciação" (SCAFF, 1997). Entretanto, essa lei não é universal, não sendo válida para todos os tipos de células, como os linfócitos, que são células diferenciadas, não se dividem, mas são altamente sensíveis às radiações onizantes. Na avaliação dos riscos da exposição radiação, um parâmetro bastante utilizado é a eficiência biológica relativa (RBE), definida como a relação entre a dose da radiação de raios-x de 250 kvp, utilizada como padrão (D,,r), para produzir um dado efeito biológico e a dose de uma determinada radiação teste (Dat), para produzir o mesmo efeito (equação 1). RBE = Dref 1 Di Essa relação pode assumir valores que variam de 1 até 20, a depender da natureza da radiação e do efeito biológico causado (SANDLER et al, 1996), conforme a Tabela 1.
23 Tabelal. Eficiência Biológica Relativa. Radiação Raios-X1 Raios gama1 Partículas beta1 RBE Partículas alfa (dentro do corpo) 10 a 20 Neutrons: Radiação que causa dano imediato 1 Catarata, leucemia e danos genéticos 4 a 1O Os valores da RBE dependem da natureza da radiação, mais precisamente da energia depositada por unidade de percurso, denominada de transferência linear de energia (LET). A Comissão Internacional de Unidades e Medidas (ICRU) define a LET como a energia depositada por unidade de comprimento (ICRU, 1970). A exposição da matéria viva a uma irradiação de LET elevada resultará em danos celulares com distribuição não randômica, enquanto naquelas resultantes de um feixe de baixo LET, os danos biológicos se distribuem aleatoriamente. 3.2 Grandezas Físicas Dose absorvida (D) A dose absorvida é definida como a quantidade de energia depositada pela radiação ionizante num meio qualquer, por unidade de massa do material absorvedor (equação 2). No Sistema Internacional de unidades (SI) a unidade utilizada é o Jkg, que é o gray (Gy) (CEMBER, 1997).
24 D= de (2) dm Entretanto, o conhecimento da dose absorvida é insuficiente na determinação do risco e do detrimento biológico causado pela irradiação, o que limita sua utilização em radioproteção. Neste contexto, a Comissão Internacional de Proteção Radiológica (ICRP) definiu o fator ponderal de qualidade (Q) relacionado natureza da radiação, instituindo assim a dose equivalente Dose equivalente (HT) A dose equivalente é a medida da equivalência em energia absorvida pelo tecido biológico, levando em consideração a RBE (equação 3). No SI, a sua unidade é o sievert (Sv), onde 1 Sv = 1 Joule! (kg). A determinação da dose equivalente exige o conhecimento do espectro da dose absorvida versus o fator de qualidade (Q)(CEMBER, 1997). HT,= D Q (3) A partir da definição anterior, denominou-se dose equivalente média ou efetiva, E, à soma das doses equivalentes ponderadas de todos os tecidos irradiados e órgãos (equação 4). Isso no intuito de servir como uma medida única do efeito da irradiação em relação ao corpo inteiro. A soma de todos os fatores wt é igual a 1. E= ZWT HT (4) onde: W = fator de peso do órgão, ou tecido HT = dose equivalente num órgãq qu tecido.
25 3.3 Métodos Dosimétricos Aplicados à Medicina Nos casos de exposição à radiação onizante, seja para fins diagnósticos ou terapêuticos, a dose absorvida deve ser determinada para otimizar essas aplicações e possibilitar o máximo beneficio aos pacientes, seguindo assim o que preconiza o princípio ALARA. O gerenciamento dos riscos associados a essas aplicações por meio da radioproteção, ademais, busca proporcionar aos profissionais de saúde, meios para avaliar os riscos biológicos, sendo a dosimetria uma ferramenta básica (RIGHI et a, 1987). Neste sentido, os métodos dosimétricos ajudam para uma melhor avaliação dos efeitos, das radiações ionizantes, pela associação dos mesmos aos diferentes níveis de dose. Dentre os métodos existentes, destacam-se: a dosimetria fisica, a clínica e a biológica (RIGHI et ai., 1987). Na dosimetria fsica, procura-se determninar a dose absorvida com o auxilio de instrumentos sensíveis à radiação ionizante. Entre os dosímetros mais utilizados encontram-se os filmes dosimétricos, as canetas dosimétricas e os dosímetros termnoluminescentes. Todavia, em muitos casos de exposições acidentais, os individuos expostos nem sempre estão fazendo uso dos dosímetros, a avaliação dosimétrica (muitas vezes dita retrospectiva) é desenvolvida a partir da avaliação dos efeitos biológicos resultantes. No caso da dosimetria clínica, essa avaliação limita-se aos sintomas apresentados pelos indivíduos expostos. Já a dosimetria biológica baseia-se em métodos que possam detectar os efeitos biológicos radioinduzidos, servindo como uma ferramenta diagnóstica na radiopatologia e radioproteção, pois obtém informações significantes sobre a dose nos indivíduos ou em grupos de risco (RIGHI et al, 1997). São muitas as aplicações que a dosimetria biológica pode ter (RIGHI et al, 1997). fl Exposições acidentais, Inspeções médicas, DO Radiosensibilidade individual, kwexposições a múltiplos riscos, 01 Defeitos no sistema de reparo do DNA,
26 lo moi Radioterapia, IP Modelos animais. Unma das mais importantes aplicações da dosimetria biológica ocorre quando há suspeita de exposição acidental. Nesses casos, os indivíduos expostos muitas vezes não estão usando dosimetros fsicos e a dosimetria biológica é capaz de informar se houve realmente uma exposição, através da análise do sangue periférico do indivíduo. Ela faz uso de amostras de sangue que é um bom parâmetro de escolha nos casos de inspeção médica para o controle da radiossensibilidade individual e das aplicações de radioterapia. Apesar de algumas situações permitirem o uso dos dosímetros fisicos e estes informarem a dose recebida, é importante a informação complementar da dosimetria biológica, pois permite o diagnóstico seguro e possibilita a confirmação de diagnósticos duvidosos da dosimetria fisica. A dosimetria biológica pode ser estudada sob diferentes aspectos, citados logo em seguida (BAUCHINGER, 1986), dentre os citados deve ser escolhido àquele que proporcionar resultados confiáveis e que ofereça uma metodologia de fácil acesso (CATENA ei ai., 1993). São eles: *0 Clínico, *0 Citológico, * Citogenético, M Bioquímico, NO Imunológico, *0 Genético. A dosimetria quando é estudada sob o aspecto clínico se fundamenta nos sintomas apresentados pelos indivíduos investigados, particularmente pela presença de náusea e de vômitos; esses sinais são considerados dosimetricamente significantes. As reações cutâneas representam indícios de irradiação localizada, mas também podem ocorrer alterações no sistema hematopoético e a depender da intensidade de radiação recebida, o indivíduo lesado
27 1 1 ainda pode apresentar distúrbios no sistema nervoso. Do ponto de vista itológico são observadas alterações nas células do tecido sanguíneo como a queda do número de linfóácitos na primeira fase da irradiação e a redução do número de plaquetas num momento mais grave. A análise bioquímica é feita ao observar os valores dos produtos orgânicos e estes são comparados com os valores de referência. As alterações imunológicas e genéticas também auxiliam nas observações dosimétricas e permitem. uma complementação de dados para o favorecimento de uma metodologia corretiva adequada (RIGHI et ai., 1971) Dosimetria citogenética A dosimetria citogenética, uma das subdivisões da dosimetria biológica, faz uso do sangue periférico para avaliação dos danos causados a tecidos e órgãos. Nessa dosimetria são consideradas somente as aberrações cromossômicas resultantes de lesões duplicadas, ou seja, que tiveram lugar na interfase. Com esse propósito, as aberrações cromossômicas em linfóácitos constituem um bom indicador biológico para a avaliação citogenética (CATENA et ai., 1993) Linfócitos O tecido linfóide no homem é formado por um aglomerado de células que se originam na medula óssea, e que são precursoras dos infóácitos T e B. O tecido linfóide central é formado pelo timo, o qual é precursor das células T; pela medula, precursora das células B, e pelos tecidos linfóóides periféricos, locais de distribuição das células e B. As células T originam-se da glândula tímica onde amadurecem e se diferenciam. Quando estão maduras, deixam o timo para circular, continuamente, do sangue para os nódulos linfáticos, retomando posteriormente ao sangue. São subdivididas em três classes: As T auxiliares, as T supressoras e as T citolíticas. As células B participam da imunidade humoral do organismo, sendo precursoras dos plasmócitos, que são responsáveis pela produção de anticorpos os quais atuam no mecanismo de defesa orgânica (ABRAS ei al, 1995).
28 12 Normalmente, as células T constituem 70% dos linfóácitos. Esse percentual varia com a idade do indivíduo, sendo menor para os indivíduos de faixa etária superior. A Tabela 2 apresenta valores típicos de concentração de linfócitos no sangue periférico para duas faixas etárias (WARA et al, 1977). Tabela 2. Número de linfócitos em humanos Idade Concentração de Linfócitos Adulto (21 anos) /mm 3 Recém nascidos /nm3 No tecido sanguíneo, os linfóácitos são exceção à regra de radiosensibilidade celular, como jfoi comentado. Os linfóácitos são células diferenciadas e que praticamente não se dividem; esses ficam normnalmente em repouso na fase G 0, na qual as atividades químicas e fisiológicas são mínimas. O citoplasma dos linfócitos maduros é reduzido, como pode ser visto na Figura 1 (IEATER, 1993), seu núcleo é denso e suas organelas celulares têm características próprias. As mitocôndrias estão em pequeno número, o complexo de Golgi é apenas uma pequena região e o retículo endoplasmático é rudimentar. Em média 90% dos linfócitos têm um tempo de vida de 3 anos, sendo as células T mais resistentes aos agentes agressores do organismo que as B (RIGIII et ai., 1997). Linfócito Figura 1. Linfócitos maduros (Wheater, 1993)
29 3 Um dos aspectos importantes da biocinética dos linfóácitos consiste na reposição ou substituição entre o sangue periférico e o sangue contido nos diversos órgãos do corpo humano, que permite aos mesmos executar seu papel imune e voltar dos mesmos à circulação periférica. Dessa forma, os linfócitos que tiverem aberrações cromossomicas oriundas de diferentes setores do corpo podem estar presentes no sangue periférico (IAEA, 1986). As vantagens da utilização da quantificação das aberrações nos linfócitos do sangue periférico na dosimetria citogenética podem ser resumidas nos seguintes itens: M Facilidade de coleta sangúínea, = Manutenção das aberrações cromossômicas instáveis radioinduzidas enquanto os mesmos não entram em divisão, m Vida média (dos linfócitos) relativamente longa, permitindo que as alterações radioinduzidas avaliadas até três meses após uma exposição à radiação onizante sejam representativas do ponto de vista de uma avaliação retrospectiva A estrutura dos cromossomos e suas aberrações O material genético do organismo está na forma de DNA que encontra-se em dupla hélice. Ele está organizado em estruturas chamadas de cromossomos que podemt ser visualizadas e estudadas no período de divisão celular (RIGHI ei al, 1993). Todos os eventos ocorrem mediante um ciclo celular, conforme a Figura 2 (ALBERTS et ai., 1997). São dois os períodos de divisão celular: a mitose e a mineose. A depender da necessidade orgânica, será realizado um ou outro período. Além disso, existe uma etapa que antecede à divisão; a interfase, que está subdividida em fases: G, S e G 2 (ALBERTS ei al, 1997).
30 14 O CICLO CELULAR Célula cout eromossomnos no nédeo OMúsSo Ceiuiaç X 1 ~~~ ~~Síntese de ONA Separaçio dos cmossomo II 7 X~~~~~~~Duplcaçio dos ecrounssormos Célula cem cr nnsoo duplicados Figura 2. Controle do ciclo celular Antes de entrarem no ciclo celular, as células se encontram numca fase denominada GO, onde as mesmas estão num período de latência aguardando o momento da divisão, este período pode ser muito curto ou muito longo, vai depender do tipo celular. A fase G 1 (G = " gap" ou lacuna) é um intervalo entre o término da mitose e o começo da síntese de DNA, a célula está monitorando seu crescimento e tamanho para quando for o momento oportuno continuar o ciclo de divisão. Na fase S (S síntese) ocorre a duplicação e na fase G 2 é fornecido à célula um intervalo de segurança para garantir uma completa replicação de DNA antes de iniciar a mitose (ALBERTS et al, 1997). O ciclo celular é controlado e opera como uma máquina automática, Figura 2 (ALBERTS et ai.., 1997). Um controlador central desencadeia um processo de cada vez em uma seqüência específica, este é regulado em certos pontos críticos do ciclo por mecanismo de retroalimentação. O sistema de controle do ciclo celular é u dispositivo bioquímic a
31 15 partir de uma série de proteínas que interagem entre si. São duas as famílias de proteínas que participam do controle do ciclo: as proteinoquinases, dependentes da ciclina (CDk) e as ciclinas (proteínas ativadoras especializadas). O ciclo é controlado em pontos de checagem, podendo ser interrompido ou acionado. Esses pontos localizam-se em G 1, exatamente antes de entrar na fase S e em G 2, no início da mitose (ALBERTS et ai., 1997).. Após a interfase, inicia-se a mitose. Esta é subdividida em 4 ou 5 etapas: prófase, prometáfase, metáfase, anáfase e telófase (TOMIPSON, 1995). Na Figura 3 (AIBERT et ai, 1997). podem ser observadas as etapas da mitose. Transição de Metáfase para Anáfase Interfase Prófase Pro-MetáfaseMtfs Anáfase Telófase Citocinese Figura 3. Etapas da mitose e interfase E durante a metáfase que os cromossomos se encontraram com a norfologia definitiva, ou seja, mais condensados e na região central (placa equatorial) e, portanto, mais visíveis ao microscópio óptico, (Figura 4). Nessa etapa, os cromossomos estão organizados em duas cromátides ligadas por uma região mais condensada, o centrômero. Esse divide o cromossomo em duas regiêes denominadas de "braços", o braço curto (p) e o braço longo (q). Cada cromátide consiste numa dupla hélice de ADN, sendo as proteínas do tipo histonas e não-histonas responsáveis pela estabilidade da estrutura (RIGIII et ai, 1997).
32 16 * ~Cronmatídes Irmãas Cíneto-coros Centrornero Fibras do Fuso Figura 4. Metáfase celular e cromosn condensado Algumas características como o número, o tamanho e a forma dos cromossomnos podem diferenciar as espécies animais. Na espécie humana, os cromossomos são em número de 46 (TOMPSON, 1995), sendo 22 pares somáticos e 1 par de cromossomos sexuais; dois do tipo X nas mulheres e um Y e um X nos homens. O estudo cromossomos exige a montagem do cariôtipo, onde os pares cromnossômicos são organizados em sete grupos; variando segundo a posição do centrômero, o tamanho do cromossomo e a distribuição de bandas de DNA ao longo do cromossomo. O cariotipo pode ser apresentado sob duas formas: o cariograma e o idiograma, o cariograma é em forma de fotografia e o idiograma na forma esquemática. A localização do centrômero no cromossomo classifica-os em: metacêntricos (centrômero na região mediana do cromossomo), submetacêntricos (centrômero deixando os braços do cromossomo desiguais), acrocêntricos (centrômero no término do braço curto) e telocêntrico (centrômero finalizando o cromossomo) (RIGIII e al, 1997), mostrado na Figura 5 (GUERRA, 1996).
33 17 Braço curto - Braço longo Figura. Classificação dos cromossomos segundo a posição do centrômero Curva dose-efeito Na dosimetria citogenética, a relação entre a quantificação das aberrações cromossômicas e as doses absorvidas são obtidas em laboratório por intermédio de curvas dose versus efeito biológico (BENDER, 1957; BUCKTON, 1983; BENDER et ai., 1988). Uma curva de dose-efeito é uma representação gráfica da relação entre a quantidade da radiação absorvida por uma célula ou organismo (Dose) e o efeito observado, por exemplo a frequência de aberrações cromossômicas (IAESA, 1986) A curva dose-efeito tanto pode ser linear como não-linear. Na resposta linear, a relação entre a dose e a resposta é proporcional formando uma linha reta. Na resposta não-linear, não é fixada uma proporção entre a dose e a resposta e o gráfico forma uma curva. As curvas não~ lineares são também chamadas de curvilíneas, sigmóides ou linear-quadráticas, baseadas em suas formas exatas (RIGifI et al, 1997). A forma da curva varia em função da qualidade e da taxa de dose. A Figura 6 (VOISIN et al, 2001) apresenta diferentes curvas dose-efeito linearquadrática, relacionando a frequência de aberrações dicêntricas, em linfócitos de sangue periférico, com da dose fisica, resultante da irradiação por feixes de diferentes naturezas, energias e taxas de dose.
34 1 8 0,2~~~~~Jjo Nih Dose (Gy)Q Figura Curvas 6. dose-efeito ( oi ;/an,201 A dosmetra ciogenticaconsste m tblcrafeüni eaerçe croossmics o demiconúleo emculura delnóio uao.veo suo ê demontradoque o efeios inuzido pelairradação n vio ei i osnu ã dnio (BENER,195; BUKTO, 183; ENDR e ay/mi 198. ~ Desafrm, oe-eesablce uacuv d clbrrã ar naisrasaleaçe ciogntiaseesablce, sim dserceid el idvíu. o nanoo lboaóro encntrramvalresdiereciaos evio à prtiuaiae prcoas eud AA UmacarcteíFigua 6.rvneasà dosetrefeitogvisnial é2001)o oíetoesa dempontro quesefteitos induiduos pe irrdiçm sepr vvoe comvio do sgets inicos. cioeéiaa ssimháaadoseorecebidapelo etblcr indivíduo.itninlet Nlerro entato o laoratro
35 19 biológico, aspecto útil que sugere o uso desta dosimetria nas análises por questões trabalhistas, como também periciais (RAMALHO et ai., 1998). Como já foi citado, o uso desta técnica é essencial em acidentes. O acidente de Chernoby1 (1986) envolveu milhares de pessoas, muitas porque estavam no local e outras por participarem das ações emergenciais. A área atingida precisava ser evacuada num raio de 30 km, mesmo com esses cuidados muitos foram atingidos. A análise dos danos causados, na primeira fase, baseou-se nos achados clínicos (WALD, 1971; USSR (IAEA), 1986). Os indivíduos mais expostos também passaram por estudos citogenéticos e foram estudados em três grupos, a cada etapa. Um grupo foi observado um mês após o acidente, o outro em 1990 e o terceiro grupo em 1995; os resultados obtidos sugerem a existência de uma resposta adaptativa ao longo dos anos (KOMAR et a., 1996). Isto porque o primeiro grupo apresentou uma frequência de aberrações três vezes superior ao grupo controle; houve uma queda nesse número no segundo grupo e o terceiro grupo teve valores semelhantes ao primeiro. O acidente de Goiânia (1987) resultou na morte de quatro pessoas, contaminação de 250 e irradiação de mais de mil (ANJOS, 2001). A exposição tinha uma natureza complexa, assim, não permitiu uma estimativa da dose recebida pelos envolvidos com acurácia pela dosimetria fsica. A dosimetria biológica foi de extrema utilidade na distinção das pessoas seriamente irradiadas. As amostras analisadas citogeneticamente possibilitaram dizer que as doses recebidas variaram de 0,0 Gy a 7,0 Gy e que nem sempre foram uniformes (KOMAR, et al, 1996). Neste contexto, uma consideração importante é a indagação de por quanto tempo pode-se considerar que a frequência de aberrações cromossômicas observadas é representativa do número original daquelas induzidas. Alguns autores afirmam existir uma diferença substancial no desaparecimento das aberrações e que esse tempo depende da dose recebida pelo indivíduo (RAMALHO et al, 1991). RAMALHO (1996) numa análise de dez individuos expostos ao ' 37 Cs, 7,5 anos após a exposição no acidente de Goiânia, com o objetivo de avaliar a cinética de desaparecimento dos linfócitos com aberrações, estimando o tempo de
36 20 vida dos mesmos n vivo; mostra que a freqüência de aberrações diminuiu em 5% nos individuos expostos a doses moderadas ou altas. Esses resultados podem explicar as discrepâncias entre os diversos autores, sobre as meias vidas de desaparecimento das aberrações instáveis. Em outro trabalho, RAMALHO et al (1991) utilizaram a dosimetria citogenética para confirmação de superexposição ocupacional à radiação onizante, ao estudar 104 casos de trabalhadores de Goiânia. Os mesmos também foram monitorados por filmes radiográficos; houve uma confirmação de 34% dos casos estudados. Afirmando que é corrente o uso da frequência de aberrações cromossômicas instáveis como dosímetro biológico, para estimar a dose recebida, outros 97 indivíduos que tinham provavelmente sido expostos foram monitorados com documentos por RAMALHIO et ai., (1998). A análise de amostras de urina mostrou que 60 individuos apresentavam níveis de contaminação interna de ' 37 Cs, mesmo assim, o estudo foi realizado e a dose pôde ser estimada. Vários autores afirmam que é corrente o uso da freqüência de aberrações cromossômicas instáveis como dosímetro biológico, para estimar a dose recebida Como o estudo das aberrações cromossômicas possibilita à equipe médica condições para um planejamento terapêutico mais adequado, em situações acidentais, como também periciais e epidemiológicas; o estudo desta técnica merece atenção. No eixo Norte-Nordeste do Brasil praticamente não são realizados estudos por dosimetría biológica, desta forma, este trabalho procurou mostrar a possibilidade e importância do uso desta modalidade de dosimetria, ratificando sua importância dosimétrica.
37 21 4. MATERIAL E MÉTODOS Neste trabalho foram utilizadas amostras de sangue de cinco pacientes do sexo feminino submetidas a tratamento com radiação onizante. Todas as voluntárias eram pacientes do sexo feminino, do Centro de Radioterapia de Pernambuco (CERAPE), do Hospital do Câncer de Pernambuco. Para a avaliação da frequência de aberrações cromossômicas instáveis, as amostras foram analisadas no H-emocentro do Estado de Pernambuco (HEMOPE). O hemnograma das pacientes envolvidas também foi obtido para observar o percentual de linfóácitos, e o cariótipo foi montado a fim de verificar alguma prevalência cromossômica quanto ao dano. 4.1 Aprovação do Conselho de Ética Estudos que envolvam pacientes necessitam uma atenção do ponto de vista ético. Dessa forma o projeto deste trabalho foi submetido ao conselho do CERAPE que está vinculado ao mesmo órgão do Hospital do Câncer de Pernambuco e teve sua devida aprovação. As pacientes tinham habitualmente apoio de psicólogos e assistentes sociais durante o tratamento no CERAPE. Esse suporte contribuiu para o esclarecimento às pacientes sobre o trabalho a ser desenvolvido. Durante esta etapa, foi apresentado às pacientes um termo de consentimento livre e esclarecido, Anexo 1, que foi assinado, em caso de concordância. Em seguida, foram acordados os horários e as condições das coletas com cada paciente. O Anexo 2 apresenta os dados presentes no prontuário das pacientes, visando fornecer informações complementares.
38 Perfil das Pacientes As pacientes envolvidas portavam a mesma patologia, carcinoma de colo uterino, nos níveis de 1I a VI, na faixa etária de 40 a 59 anos e estavam na fase inicial do tratamento. O CERAPE, em seu protocolo de tratamento para pacientes portadores de tumor de colo uterino, institui seções de teleterapia seguidas de braquiterapia (Apêndice), (http// - 23/07/ :43 h) propiciando menos incômodo, rapidez e mais eficiência ao tratamento (CATENA et al, 1993). A fim de evitar o estudo com doses cumulativas, como também o inicio da braquiterapia, trabalhou-se com as pacientes no inicio do tratamento. A teleterapia foi realizada com raios gama, a partir de uma fonte de 6 0 Co, Figura 7, a qual tinha uma taxa de exposição de 32,74 cgy.min-l. Figura 7. Fonte de '6>Co utilizada pelas pacientes do CERAPE. 2 O Carcinoma de colo uterino pode ser classificado nos níveis de 1 a IV. O agravamento do quadro estabelece a classificação. A partir do nível I as células danificadas estão presentes na circulação.
39 Protocolo de tratamento O tratamento das pacientes seguiu recomendação do médico oncologista e as possíveis variações dependeram da fase da patologia e das características fisicas de cada paciente. Esse procedimento foi executado pela equipe de Físicos do CERAPE. Todas as pacientes, selecionadas nesse estudo, receberam as mesmas doses: a primeira num valor de 0,08 Gy e as demais de 1,8 Gy, com um intervalo de 24 h entre as seções de radioterapia. O tempo de 24 horas foi selecionado, por ser suficiente para que fosse obtida uma alíquota de sangue decorrente da recirculação, ou seja, os linfócitos que receberam a dose de radiação estivessem bem distribuídos na circulação sanguínea das pacientes, permitindo, assim, que a amostra fosse homogênea. A primeira dose tinha o objetivo de demarcar a região anatômica do tumor e as doses seguintes de iniciar o tratamento sugerido pelo médico. A variação no tratamento foi dada pelo número de aplicações recomendadas, nesse trabalho foi utilizado um período curto do tratamento das pacientes, as duas primeiras seções. As pacientes eram irradiadas em quatro regiões anatômicas, perfazendo um valor total de 1,8 Gy em cada seção, segundo a Tabela 3. Tabela 3. Descrição da dose recebida por região anatômica Áreas irradiadas Dose (Gy) Região pélvica anterior 0,6 Região pélvica posterior 0,6 Lateral direita 0,3 Lateral esquerda 0,3 Total 1,8 As características fisicas das pacientes, como percentual de tecido adiposo e o diâmetro da região pélvica interferem na determinação do tempo de exposição à fonte. Com isso, o tempo de exposição das pacientes variou de 2 a 2,5 minutos em cada região anatômica. O campo determinado para as posições anterior e posterior foi de 17 cm X 17 cm, para as laterais
40 24 foi de 7 cm X 9 cm, com o irradiador de 6OCo a uma distância de 70 cm da pele do paciente (Figura 8). o Figura 8. Campos de irradiaçao. 4.4 Coleta de Sangue Para cada uma das cinco pacientes, foram realizadas três coletas de sangue em três situações distintas. Como as pacientes não tinham histórico de uso da radiação onizante com fins terapêuticos, foi possível estabelecer a freqüência de aberrações cromossômicas instáveis devido à radiação natural, por meio da coleta de amostras antes do tratamento. Posteriormente, outra amostra foi coletada 24 h após a primeira seção de teleterapia e uma terceira coleta foi realizada 24 h após a segunda seção de radioterapia. Bioensaios foram então realizados com quinze (15) amostras de sangue, nas quais as doses recebidas pelas pacientes, em cada situação, eram as mesmas.
41 25 As amostras estéreis de 5 ml de sangue venoso total foram coletadas em seringas, previamente heparinizadas. A coleta seguiu todas as recomendações inerentes a este procedimento e foram realizadas no CERAPE. A Tabela 4 apresenta as três amostras estudadas e as fases de tratamento em que as amostras foram coletadas, bem como as doses. Tabela 4. Amostras estudadas Paciente Dose (Gy) Fase do tratamento A 0,0 Antes de iniciar 0,08 ia aplicação 1,8 2' aplicação B 0,0 Antes de iniciar 0,08 ia aplicação 1,8 2a aplicação c 0,0 Antes de iniciar 0,08 ia aplicação 1,8 2a aplicação D 0,0 Antes de iniciar 0,08 1a aplicação 1,8 2a aplicação E 0,0 Antes de iniciar 0,08 1a aplicação 1,8 2' aplicação 4.5 Cultura de Linfócitos A metodologia para cultivar linfóácitos foi originalmente descrita por KRIPPALHNE (1955) e aperfeiçoada por NOWELL et al (1958) e por MOORIIEAD (1960) citados no trabalho de BEIGUEMAN (1982). A IAEA (1986) também recomenda esta metodologia e informa todas as etapas e ferramentas necessárias, tais como: meio de cultura adequado, estimulante dos linfócitos, soro bovino fetal e soluções para ajuste de ph. Essa etapa foi
42 26 realizada no Laboratório de Citogenética, do Departamento de Laboratórios, do Hemocentro de Perníambuco - HEMOPE, na câmara de fluxo laminar da Classe 1,2, ilustrada na Figura 9. Figura 9. Câmara de fluxo laminar Definição do protocolo de cultivo de linfócitos A metodologia adotada foi fruto de ua modificação da recomendada pela IAEA (1986), pois não foi utilizada nenhuma solução antibiótica. Essa metodologia modificada foi estabelecida na busca de uma adaptação entre a metodologia sugerida e à realidade de trabalho do Laboratório de Citogenética do HEMOPE. Para tanto, culturas testes foram realizadas a partir de amostras de sangue doadas por voluntários. As Figuras 10 e 1 mostram diagramas com as etapas do protocolo definido. 2 Câmara de fluxo laminar da classe HI é um equipamento indicado para manipulação de amostras biológicas que oferecem risco de contaminação, segundo as regras de biosegurança.
43 27 COLETA (5 ml de Sangue venoso total, com seringa heparinizada) ACONDICIONAMENTO: TRANSPORTE LABORATÓRIO DE CITOGENÉTICA (HEMOPE) Alíquota de 2 ml F -Alíquota de~~~~~~~4 0, de Inubç ESTUFA 37 C RETIRADA DA CULTURA 2 h de Incubação PREPARO DA LÂMINA COLORAÇÃO0 r ANÁLISE Figura 10. Processamento das amostras
44 28 RETIRADA DA ESTUFA CENTRIFUGAÇÃO (1500 rpm durante 6 minutos) Sobrenadante Descartado ~~~~~Precipitado"bto LAVAGEM~~~~~~~~~~~car Homogeneizar Fiur 1L-Poeiment dealhdo ar cutu dd ad
45 Transporte das amostras sanguíneas O transporte das amostras seguiu todas as recomendações necessárias a segurança de materiais biológicos. Segundo a IAEA (1986), em regiões tropicais, as amostras sangüíneas devem ser transportadas em recipientes térmicos, devidamente identificadas, já que pode haver temperaturas excessivas durante o transporte. O tempo médio de transporte das amostras de sangue do local de coleta (CERAPE) até o laboratório de análises (HEMOPE) foi de aproximadamente 30 minutos. Este valor é muito inferior ao valor máximo recomendado de 3 dias para transporte de amostras para fins de quantificação das aberrações cromossômicas instáveis (IAEA, 1986) Escolha do meio de cultura Os meios de cultura agem como uma solução nutritiva em cultivos de células. No caso dos linflócitos, podem ser utilizados os meios: Minimal Essential Medium (MEM), o Mic coy' s AS, o Hamn's FI1O e o RPMl Este último, RPMI 1640, é preferencialmente recomendado uma vez que diminui o tempo de cultivo e por possuir em sua composição uma mistura de sais enriquecida com ainoácidos e vitaminas. Este meio de cultura é destinado ao cultivo de células humanas e de outros animais, além de propiciar a sincronização da divisão celular, pois a timidina não está presente em sua composição (IAEA, 1986). Neste trabalho, foram utilizados 4 ml de meio RPMI 1640, dispostos em vidrarias do tipo âmbar, para minimizar a interferência da luz Escolha do anticoagulante A obtenção de cultura de linfócitos só é possível com o uso de um anticoagulante, podendo ser a heparina ou o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Como este último não proporciona, normalmente, um bom crescimento celular, a heparina foi utilizada. Outra
46 30 vantagem da heparina é ser um anticoagulante natural, extraído do figado e atuar na trombina impedindo a transformnação do fibrinogênio em ibrina, reduzindo ao mínimo a emólise (IAEA, 1986) Fitohemaglutinina Os linfóácitos precisam ser estimulados para sairem da fase G 0 e entrarem em divisão celular, foi esse o papel dos 2% de fitohemaglutinina utilizada neste trabalho. Esta mucoproteina, obtida de uma variedade do Phaseolus vulgaris 1., tem intensa atividade mitogênica e atua na estimulação das células T n vtro tanto em primatas, como em outras espécies. A transformação blástica de linfóácitos n vitro e sua consequente mitose tem sido amplamente empregada em vários laboratórios. A fitohemaglutinina é utilizada na obtenção de metáfases para a análise do cariótipo humano e de outros animais, para diagnósticos de má formação, como também para pequenas alterações cromossômicas (IAEA, 1986). Na imunologia, a fitohernaglutinina tem sido usada em pesquisas referentes à proporção de linfóácitos T presentes nos individuos associada à capacidade de resposta imunológica. Ela também tem utilidade nas pesquisas de alterações cromossômicas, decorrentes do uso de drogas mutagênicas ou de agentes fsicos como a radiação ionizante e para uso da dosimetria biológica (IAEA, 1986) Soro bovino fetal Como aditivo nutricional durante a cultura celular, optou-se pela utilização do soro da CULTILAB, composto segundo a Tabela 5 (ttp// :49 h), numa proporção de 20% na cultura, ou seja, a quantidade utilizada foi de ml. As condições de coleta, manipulação, processamento e estocagem do soro garantem as propriedades e qualidade do mesmo. É importante também que sejam feitos testes para detectar a presença de contaminantes tais como o mycoplasma (BEIGUEMAN, 1982).
CAPÍTULO 4 EFEITOS BIOLÓGICOS DA RADIAÇÃO
CAPÍTULO 4 EFEITOS BIOLÓGICOS DA RADIAÇÃO 4.1. ESTRUTURA E METABOLISMO DA CÉLULA 4.1.1. Estrutura básica da célula Embora as células sejam muito diferentes na aparência, tanto externa quanto interna, certas