Nesta Wikipédia, os atalhos de idioma estão na parte superior da página, em frente ao título do artigo.
Contents
move to sidebar
hide
Início
1Princípios do PCR
2Métodos de detecção no qPCR
3Quantificação
4Referências
5Ver também
6Ligações externas
Alternar o índice
PCR quantitativo em tempo real
25 línguas
العربية
Bosanski
Català
Čeština
Deutsch
English
Español
Eesti
فارسی
Suomi
Français
Galego
עברית
Italiano
日本語
한국어
Polski
Română
Русский
සිංහල
Türkçe
Українська
اردو
Tiếng Việt
中文
Editar hiperligações
Artigo
Discussão
português
Ler
Editar
Editar código-fonte
Ver histórico
Mais
Ler
Editar
Editar código-fonte
Ver histórico
Origem: Wikipédia, a enciclopédia livre.
Na Biologia Molecular, o PCR em tempo real (do inglês: real-time polymerase chain reaction), também conhecido como PCR quantitativo (qPCR) é uma técnica de laboratório baseada no princípio da reação em cadeia da polimerase (PCR). O procedimento monitora os níveis de ácidos nucleicos durante a amplificação, diferentemente do PCR convencional no qual a quantificação ocorre somente após o final da amplificação.
A reação em cadeia de polimerização em tempo real combina a metodologia de PCR convencional com um mecanismo de detecção e quantificação por fluorescência. A metodologia permite que os processos de amplificação, detecção e quantificação de DNA sejam realizadas em uma única etapa, agilizando a obtenção de resultados e diminuindo o risco de contaminação da amostra e dando maior precisão.
Princípios do PCR[editar | editar código-fonte]
O PCR permite a amplificação de um segmento específico de DNA a partir de uma mistura complexa de DNA contendo uma pequena quantidade do material de interesse[1]. O protocolo exige a presença da amostra a ser analisada, primers, dNTPs e DNA polimerase[1]. Geralmente, a amostra a ser analisada consiste no DNA complementar (cDNA) resultante da transcrição reversa do RNA. Os primers são fragmentos curtos de DNA de fita simples, complementares à sequência de interesse. Geralmente há um primer forward e um primer reverse. Os dNTPs são os nucleotídeos livres ATP, GTP, TTP e CTP, que contém as bases adenina, guanina, timina e citosina, respectivamente. A DNA polimerase é a enzima que catalisa a síntese do DNA, e é geralmente isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus.
A mistura contendo os componentes mencionados acima são submetidos a vários ciclos em um termociclador. Cada ciclo possui três etapas[2]:
1 - Desnaturação (melting), com aumento de temperatura, para que as duas fitas do cDNA se separem.
2 - Anelamento (anneling), com diminuição da temperatura, para que os primers pareiem com as sequências-alvo no DNA.
3 - Síntese, na qual a temperatura é a ideal para a atividade da DNA polimerase. A sequência reconhecida pelo primer é replicada.
Estes ciclos ocorrem de 30 a quarenta vezes, até que a sequência de interesse esteja suficientemente amplificada.
Métodos de detecção no qPCR[editar | editar código-fonte]
Os métodos mais comuns de detecção no qPCR são (1) corantes fluorescentes que se ligam a DNA de dupla fita e (2) sondas específicas a certas sequências de DNA[1].
Quanto ao primeiro método de detecção, o corante mais utilizado é o SYBR Green, que emite uma fluorescência maior quando ligado ao sulco menor do DNA de dupla fita, em comparação ao corante livre na solução[3]. Deste modo, quanto maior a quantidade de DNA de fita dupla em solução, maior o sinal fluorescente. O SYBR Green é não-específico, de modo que pode se ligar a qualquer sequência de DNA de fita dupla. O seu pico máximo de excitação ocorre a 497nm, enquanto o pico de emissão ocorre a 520nm[4].
Em relação ao segundo método de detecção, o método mais conhecido é o TaqMan. O protocolo exige uma DNA polimerase com atividade nuclease 5’ e uma sonda. A sonda consiste em curto oligonucleotídeo de fita simples específico contra o fragmento de interesse, com um fluoróforo repórter em sua extremidade 5’ e um quencher em sua extremidade 3’[3]. A sonda se liga ao DNA de interesse quando este está em sua forma desnaturada. Quando a sonda está intacta, o quencher impede a emissão de sinal pelo repórter. Durante a fase de amplificação, a atividade de nuclease da DNA polimerase hidrolisa o oligonucleotídeo da sonda ligada ao DNA, de modo que o repórter e o quencher são separados e sinal fluorescente é emitido[5].
Quantificação[editar | editar código-fonte]
Limiar do Ct. O valor de Ct corresponde ao número do ciclo no qual a curva de PCR cruza o limiar. O limiar é representado pela linha horizontal vermelha. As curvas de PCR à esquerda apresentam menor Ct.
Os dados de qPCR podem ser analisados como quantificação absoluta ou relativa. Na quantificação absoluta, o número total de cópias do produto do PCR é obtido após comparação com uma curva padrão.
Já na quantificação relativa, no qual o sinal da sequência de interesse é comparado com o de um controle, sendo o método do 2−ΔΔCt o mais utilizado[6]. Para este método, mede-se o valor de Ct, que é o número do ciclo em que o sinal de fluorescência emitido durante o qPCR atinge um limiar significantemente acima da fluorescência de fundo. Menores valores de Ct indicam maiores níveis de expressão, pois são necessários menos ciclos de amplificação para atingir o limiar. Já maiores valores de Ct indicam menores níveis de expressão[7].
É necessário medir os valores de Ct do gene-alvo e de um gene de expressão endógena, o qual geralmente é um gene de manutenção. Um exemplo de gene endógeno frequentemente utilizado é a β-actina. Os valores de Ct devem ser medidos em condições de tratamento e de controle. A equação para quantificação por 2−ΔΔCt é[6]:
q u a n t i d a d e r e l a t i v a = 2 − Δ Δ C t {\displaystyle quantidade\ relativa=2^{-\Delta \Delta Ct}}
Sendo que:
− Δ Δ C t = Δ C t t r a t a m e n t o − Δ C t c o n t r o l e {\displaystyle -\Delta \Delta Ct=\Delta Ct_{tratamento}-\Delta Ct_{controle}}
Δ C t = C t g e n e d e i n t e r e s s e − C t g e n e e n d o ´ g e n o {\displaystyle \Delta Ct=Ct_{gene\ de\ interesse}-Ct_{gene\ end{\acute {o}}geno}}
2−ΔΔCt corresponde ao valor de fold-change dos níveis de expressão durante o tratamento em relação ao controle. Um valor de 2−ΔΔCt igual a um indica níveis de expressão semelhantes entre o tratamento e a condição controle, valores significantemente maiores que 1 indicam expressão aumentada no tratamento, e valores significantemente abaixo de 1 indicam expressão gênica diminuída no tratamento[7]. O valor de 2−ΔΔCt não possui unidade.
Referências[editar | editar código-fonte]
↑ a b c Garibyan, Lilit; Avashia, Nidhi (março de 2013). «Polymerase Chain Reaction». Journal of Investigative Dermatology (3): 1–4. ISSN 0022-202X. PMC 4102308 . PMID 23399825. doi:10.1038/jid.2013.1. Consultado em 6 de janeiro de 2021
↑ Nelson, David L. (David Lee), 1942-; Lehninger, Albert L. Lehninger principles of biochemistry Seventh edition ed. New York, NY: [s.n.] OCLC 986827885 !CS1 manut: Nomes múltiplos: lista de autores (link)
↑ a b Tajadini, Mohamadhasan; Panjehpour, Mojtaba; Javanmard, ShaghayeghHaghjooy (2014). «Comparison of SYBR Green and TaqMan methods in quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of four adenosine receptor subtypes». Advanced Biomedical Research (em inglês) (1). 85 páginas. ISSN 2277-9175. PMC 3988599 . PMID 24761393. doi:10.4103/2277-9175.127998. Consultado em 6 de janeiro de 2021
↑ «Product information - SYBR Green I nucleic acid gel stain» (PDF). Sigma-Aldrich. Consultado em 6 de janeiro de 2021
↑ «How TaqMan Assays Work - US». www.thermofisher.com (em inglês). Consultado em 6 de janeiro de 2021
↑ a b Livak, Kenneth J.; Schmittgen, Thomas D. (dezembro de 2001). «Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method». Methods (em inglês) (4): 402–408. doi:10.1006/meth.2001.1262. Consultado em 6 de janeiro de 2021
↑ a b «Understanding qPCR results». Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal
Ver também[editar | editar código-fonte]
Reverse transcription polymerase chain reaction
Ligações externas[editar | editar código-fonte]
O Commons possui imagens e outros ficheiros sobre PCR quantitativo em tempo real
«Real-Time PCR for Systems Biology» (PDF) (em inglês)
Portal da biologia
Obtida de "https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=PCR_quantitativo_em_tempo_real&oldid=60180061"
Categoria:
Técnicas em biologia molecular
Categorias ocultas:
!CS1 manut: Nomes múltiplos: lista de autores
!CS1 inglês-fontes em língua (en)
Esta página foi editada pela última vez às 15h31min de 6 de janeiro de 2021.
Este texto é disponibilizado nos termos da licença Atribuição-CompartilhaIgual 3.0 Não Adaptada (CC BY-SA 3.0) da Creative Commons; pode estar sujeito a condições adicionais. Para mais detalhes, consulte as condições de utilização.