Que é Cytometry de fluxo multicolorido?
Os cientistas usam o cytometry de fluxo multicolorido para identificar e caracterizar subpopulações celulares visadas usando marcadores fluorescentes múltiplos. A tecnologia considerou avanços rápidos nos últimos anos conduzir às melhorias no método, tendo por resultado uma técnica robusta e segura para executar a análise celular complexa ràpida e eficientemente avaliando diversos parâmetros simultaneamente.
Apenas em segundos, o ensaio pode investigar milhares de pilhas. Também, o repertório dos anticorpos altamente específicos usados identificando substâncias está expandindo continuamente. Mais a este, uns instrumentos mais avançados do cytometry de fluxo foram desenvolvidos, permitindo a análise simultânea sobre de 20 parâmetros. Em conseqüência, o cytometry de fluxo multicolorido foi instrumental em avançar o progresso da pesquisa nas ciências da vida.
Os princípios do cytometry de fluxo
O cytometry de fluxo é o componente básico do cytometry de fluxo multicolorido. Essencialmente, o procedimento foi projectado analisar simultaneamente os milhares de pilhas através dos parâmetros múltiplos, fazendo assim apenas em uma matéria dos segundos.
O processo começa com a colocação de uma amostra preparada na câmara do fluxo do instrumento do cytometry, onde incorpora um sistema da fluídica. Nesta fase, o processo de focalização hidrodinâmica é usado para separar a amostra em seus componentes da único-pilha. Durante este processo, um fluxo controlado é introduzido em torno da amostra, forçando o em um diâmetro estreito e obrigando as pilhas para separar.
Depois disto, as pilhas separadas passam através de um laser que grave cada pilha individual como um evento. Na interacção com o laser, o scatter dianteiro (FSC) e o scatter lateral (SSC) são produzidos por cada pilha, que é gravada pelo instrumento. Naquelas pilhas que são etiquetadas fluorescente, o fluoróforo torna-se entusiasmado como passa através do laser e emite-se esta luz enquanto retorna a seu terra-estado.
Esta luz emissora está medida enquanto passa com uma série de espelhos e de filtros até que alcance o detector apropriado para o comprimento de onda visado. Estes detectores, conhecidos como as câmaras de ar de photomultiplier (PMTs), reconhecem a fluorescência de um determinado, comprimento de onda predeterminado.
A fim permitir que somente os comprimentos de onda claros exigidos passem completamente, um filtro óptico (filtro dichroic) é usado para obstruir para fora comprimentos de onda indesejáveis e para actuar como um espelho, que guie os comprimentos de onda específicos da luz aos detectores.
Detecção no cytometry de fluxo
O cytometry de fluxo confia em uma combinação de fluorophores e de anticorpos como reagentes da detecção. Fluorophores pode absorver e emitir-se comprimentos de onda específicos da luz de uma vasta gama, segundo o fluoróforo. Isto é sabido como os espectros da absorvência e de emissão.
Durante o cytometry de fluxo, um comprimento de onda específico da luz é absorvido pelo fluoróforo. Esta energia clara é transferida aos elétrons fluoróforos, causando a excitação. Como os retornos fluoróforos a seu terra-estado, libera a energia sob a forma de um fotão de um comprimento de onda mais longo do que aquele que induziu inicialmente a excitação.
O elemento multicolorido do cytometry de fluxo confia nos painéis multicoloridos que exigem o uso de tinturas em tandem. As tinturas em tandem são compo de um fluoróforo fornecedor que gere características da excitação, e de um outro autómato fluoróforo que crie as características da emissão.
É usual para os espectros de emissão dos fluorophores sobrepr, que podem causar edições em ler os dados porque a sobreposição pode gerar um sinal do falso positivo. Dentro das experiências multicoloridos, esta sobreposição espectral pode ser um problema particular, que os meios ele devam ser controlados para pela compensação. A compensação elimina as possibilidades dos falsos positivos da sobreposição certificando-se que a fluorescência detectada iniciada do fluoróforo medido.
Métodos da detecção do antígeno
Há dois métodos da detecção do antígeno no cytometry de fluxo. O primeiro é o método directo, onde o anticorpo preliminar é conjugado directamente a um fluoróforo. O segundo é o método indirecto, onde o anticorpo preliminar é unconjugated e um anticorpo secundário fluoróforo-conjugado dirigido contra o anticorpo preliminar é usado para a detecção.
Há uns benefícios e uns inconvenientes de cada método; contudo, o método directo é o mais de uso geral nas experiências multicoloridos devido a sua facilidade comparativa da produção.
Instalação multicolorido da experiência
Construindo o painel é considerado para ser a parte a mais difícil da instalação multicolorido da experiência. Primeiramente, os antígenos que são do interesse são seleccionados. Os lasers que têm o comprimento de onda correspondente aos fluorophores são seleccionados então.
Em seguida, a população da pilha é considerada. Nos casos onde a expressão do antígeno é desconhecida e/ou a baixa população da pilha é esperada, um fluoróforo mais brilhante é usado. Onde uma expressão alta do antígeno e/ou uma população alta da pilha são esperadas, um fluoróforo mais não ofuscante é usado.
Após isto, as etapas devem ser tomadas para minimizar a sobreposição espectral sacrificando fluorochromes brilhantes para evitar a sobreposição e usando a compensação para controlar para esta.
Também, os controles devem ser incluídos na instalação. As pilhas Unstained podem ser usadas determinando populações negativas, tamanho de pilha, e granulosidade. Vivo/absolutamente os marcadores são úteis em isolar pilhas saudáveis. os controles positivos Único-manchados são usados ajustando a compensação, e considerando a intensidade da fluorescência menos uma que mancha, as populações positivas podem ser identificadas.
Finalmente, a concentração do anticorpo deve ser aperfeiçoada cansando os anticorpos. Isto ajuda a evitar o emperramento não específico ou a sensibilidade reduzida.
O cytometry de fluxo total, multicolorido tornou-se um método robusto e seguro para analisar as subpopulações dentro de uma pilha. Enquanto os avanços na tecnologia foram feitos, o método melhorou, e os pesquisadores estão tirando proveito dos tempos rápidos do teste e da capacidade analisar simultaneamente sobre 20 parâmetros de cada vez.
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