Behavior Biochemistry Bioengineering Biology Cancer Research Chemistry Developmental Biology Engineering Environment Genetics Immunology and Infection Medicine Neuroscience
JoVE Journal JoVE Encyclopedia of ExperimentsNew
Education
Biology Chemistry Environmental Sciences Physics Engineering Psychology Clinical Skills
JoVE Core JoVE Science Education JoVE Lab Manual
Videos Mapped to Your Course
Authors Librarians About
Sign In
Sign In Contact Us
Research
JoVE Journal JoVE Encyclopedia of ExperimentsNew
Education
JoVE Core JoVE Science Education JoVE Lab Manual
EN
EN - English CN - 中文 DE - Deutsch ES - Español KR - 한국어
EN
EN - English CN - 中文 DE - Deutsch ES - Español KR - 한국어
Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Automatic Translation
English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)
Cite This Article
Copy
Download
Reprints and Permissions
Abstract	
Protocol
Discussion
Materials
References
JoVE Journal Biology
Abstract	
Protocol
Discussion
Materials
References
Automatic Translation
English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)
Summary
MicroRNA (miRNA'lar), gen ekspresyonu önemli düzenleyiciler ve çok sayıda biyolojik süreçlerin önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. MiRNA-UTR etkileşimleri daha iyi anlamak için, biz, bir roman luciferase geninin ve tahlil reaktif, LightSwitch sistemi ile eşleştirilmiş 3 UTR lusiferaz gazetecilere bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk.
Abstract
MicroRNA (miRNA'lar) gen ekspresyonu önemli regülatörleri ve birçok biyolojik süreçlerin bir rol oynayabilir. Her biri benzersiz hedef mRNA'ların yüzlerce kadar olan 700'den fazla insan miRNA'lar şimdiye kadar tespit edilmiştir. Hesaplamalı araçları, ifade ve proteomik Testler ve kromatin-immunoprecipitation tabanlı teknikler belirli bir miRNA doğrudan hedefleri olan mRNA'ların tanımlamak için önemli ipuçları sağlar. Onlar için işlevsel kanıtlar sağlar ve hücre tabanlı bir sistem belirli miRNA 3'UTR etkileşimlerin etkileri Asitli Bunun yanı sıra, 3'UTR muhabir testleri ayrıntılı miRNA hedef çalışmaların önemli bir bileşeni haline gelmiştir. Kaldıraç 3'UTR muhabiri deneyleri için daha fazla araştırmacılar etkinleştirmek ve ölçek yüksek performans seviyesi testleri desteklemek için, biz, son derece optimize edilmiş LightSwitch Lusiferaz, insan 3'UTR lusiferaz gazetecilere genom bir koleksiyon yarattık Testi Sistemi. Bu sistem aynı zamanda, pozitif kontrol, çeşitli endojen 3'UTR muhabiri yapıları, ve bir dizi standart deney protokolleri olarak kullanmak için sentetik miRNA hedef muhabiri yapıları içerir.
Burada miRNA, verimli, tekrarlanabilir ve yüksek verimlilik analizi için uygun olduğunu taklit ile birlikte tek tek 3'UTR muhabir yapıları co-transfeksiyon için bir yöntem açıklanmaktadır.
Protocol
Giriş
MicroRNA birçok önemli biyolojik süreçlerin aktivitesini düzenleyen gen ekspresyonu önemli bir düzenleyici olarak ortaya çıkmıştır. 700'den fazla insan miRNA'lar Şimdiye kadar 1 tanımlanan, mutasyonlar ve miRNA'lar yanlış düzenleme, kanser ve kalp hastalığı 2,3 gibi çeşitli fizyolojik bozukluklar ile bağlantılı olması şaşırtıcı değil. Son çalışmalar miRNA düzenleyici bağlayıcı sitelerin çoğunluğu 3'UTRs 4,5 olduğunu göstermiştir ve bazı araştırmacılar, yüzlerce hücre 6 miRNA başına hedefleri olduğunu tahmin etmektedir . MiRNA'lar biyolojik önemi göz önüne alındığında, çok sayıda var miRNA'lar ve bunların her biri için çok sayıda hedefler, araştırmacılar, güvenilir, tercihen yüksek verimli çalışmalar için uygun platformlarda miRNA'lar endojen hedefleri tespit etmek mümkün olduğu kritik öneme sahiptir.
MiRBase, TargetScan ve PicTar 1,6,7 gibi hesaplama araçlarını kullanarak herhangi bir miRNA için olası mRNA hedefleri listeleri oluşturmak için güçlü bir yol olsa da, tahminlerin henüz sadece 8 güvenerek yeterince doğru değildir . Bu nedenle, araştırmacılar da hedefleri de novo öngörülen hedefler belirlemek veya doğrulamak için bir dizi deneysel yaklaşımlar kaldıraç. Birçok ekipleri ifade değişiklikleri miRNA aktivite olduğunda 4,9,10 tedirgin olan genleri tanımlamak için kararlı durum mRNA veya protein düzeyleri yüksek verimlilik önlemleri dayanıyordu. Bu tür değişiklikler, ancak bir miRNA bir transkript ve dolaylı veya alt sinyalizasyon etkileri üzerinde doğrudan etkileri arasında bir ayrım yapmaz, hiç kuşkusuz genel ifade değişiklikleri ölçerek biyolojik olarak anlamlı ve önemli bir ilk adımı temsil ediyor. MiRNA-mRNA doğrudan etkileşim için kanıt Diğer güçlü araçlar miRNA'lar ve mRNA'ların çapraz bağ argonaute proteinler (ve böylece RISC kompleksi), etkileşim ortakları belirlemek rağmen derhal işlevsel etkileri göstermek değildir kromatin-immunoprecipitation (ChIP) stratejileri gibi bağlayıcı bir olay 5,11. Böylece, belirli bir UTR miRNA etkisi için fonksiyonel kanıt 3'UTR muhabiri testlerin, kapsamlı bir miRNA çalışmanın önemli bir bileşeni haline gelmiştir. Hesaplamalı hedef öngörüleri veya ifade ve proteomik verileri ile birlikte ele alındığında bu hücre bazlı analiz verileri belirli bir 3'UTR doğrudan ilgi miRNA tarafından düzenlenir dair güçlü kanıtlar sağlar.
3'UTR muhabiri tahlil, ilgi bir gen 3'UTR lusiferaz muhabiri gen sonuna kadar erimiş. 3'UTR bir miRNA bir hedef ise, muhabir transkript istikrar ve / veya çeviri verimliliği fonksiyonel miRNA konsantrasyon değişimi ile değişecektir. Yani transkript-bazlı testlerin aksine, muhabir testlerinde istikrarlı bir devlet mRNA ve protein düzeyleri üzerindeki etkileri tespit yardımcı olur. Muhabir sistemleri de aslında interaction8 için gerekli olduğunu onaylamak için bir 3'UTR bir varsayılan miRNA bağlayıcı site mutagenizing fonksiyonel etkilerini incelemek için de kullanılıyor olabilir. Ifade diziler, proteomik teknikler ve argonaute ChIP kullanarak büyük ölçekli çalışmalar, çok az sayıda deneysel koşullar, hücre tabanlı muhabiri deneyleri için değerli genom veri sağlar miRNA-3 'çalışma için ölçeklendirme için en müsait UTR etkileşimler gibi koşullar yüzlerce ya da binlerce küçük moleküller veya diğer kütüphane tabanlı etkileyiciler yüksek verimli tarama için gerekli olabilir.
Birçok bilim adamı çalışma miRNA 3'UTR etkileşimleri muhabiri tahlil teknolojisini uyguladık. Ancak, birçok miRNA'lar her hedef yüzlerce farklı transkript, yüksek verimli bir ölçekte bu güçlü bir yaklaşım kullanmak için araştırmacılar için zor olduğunu fikri ile binlerce farklı oluşturmak için klonlama, doğrulama ve optimizasyon adımları çünkü 3'UTR muhabir vektörler pahalıdır maliyet. 3'UTR-muhabiri, küçük ve büyük ölçekli çalışmalar herhangi bir araştırmacı için ulaşılabilir kılmak amacıyla, biz, insan 3'UTRs yüksek optimize LightSwitch Lusiferaz Testi Sistemi içine önceden klonlanmış bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk. Muhabir sistemi de doğrulanmış kontrolü vektörler, pozitif kontrol olarak kullanılmak üzere 700'den fazla sentetik miRNA hedef muhabiri yapıları bir dizi ve bir dizi standart deney protokolleri içerir.
Aşağıdaki protokolü kullanarak, belirli bir insan 3'UTR ilgi miRNA bir hedef olup olmadığını sorabilirsiniz. Bu iş akışında kritik adımlar, deneysel tasarım, muhabir yapıları ve miRNA taklit transfeksiyon, lusiferaz muhabiri testleri ve veri analizi. Deneysel tasarım, düşünceli bir transfectable hücre hattı, deney ve kontrol muhabiri yapıları, ve miRNA taklit ve hedefleme kontrolleri önemlidir. Ortak yüksek transfectable adhHT1080, HepG2 gibi erent hücre hatları, HCT-116, Hela, 293, ve diğerleri genellikle bu protokol ile iyi çalışır.
Deneysel tasarım ile ilgili önemli notlar
LightSwitch Lusiferaz Testi Sistemi RenSP lusiferaz gen ve LightSwitch Lusiferaz Testi Reaktifler kullanan GoClone yapıları içeren bir tam optimize muhabiri sistemi. En iyi muhabir tahlil sonuçları elde etmek için önerilen LightSwitch Sistem tüm bileşenleri kullanın.
Şalt GoClone muhabiri yapıları ile herhangi bir oligos / plazmid Co-transfeksiyon non-spesifik bir şekilde genel lusiferaz sinyalleri azaltır. Bu nedenle, aşağıdaki transfeksiyon kombinasyonları gerçekleştirmek için önemlidir: sadece muhabir, muhabir + hedefleme kontrolü miRNA ve muhabiri + özel miRNA.
Empty_3UTR vektör (güçlü organizatörü, UTR yok) lusiferaz sinyal çok yüksek bir seviyeye sağlar ve transfeksiyon verimliliği için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir ve sentetik miRNA hedef muhabiri vektör taklit aktivite için bir pozitif kontrol olarak hizmet verebilir. Buna ek olarak, biz doğru sıra-özel vs non-spesifik etkileri ayırmak için GoClone 3'UTR temizlik kontrolleri ve rasgele denetimler kullanmanızı öneririz.
Çalışma protokolü ve mümkün pipetleme hata veya buharlaşma nedeniyle veri değişkenliği azaltmak için master miksler yapmak.
Bu protokol DharmaFect Duo transfeksiyon reaktifi (Dharmacon) kullanır.
1. Gün
ÖNEMLİ İPUCU: hücre hattı akıllıca seçin. En iyi sonuç için, transfectable olduğu bilinen bir hücre hattı kullanın. Biz de o belirli miRNA yüksek endojen seviyeleri ile hücre hatları içinde zayıflatılmış bir miRNA 3 'UTR muhabiri ölçülebilir yanıt taklit olduğunu bulduk. Hücre hattı ifade miRNA nasıl bilmiyorsanız, dolaylı bir hücre, testin dinamik aralık olarak bildiren yanı sıra belirli bir miRNA bolluğu önlemler SGG sentetik microRNA hedef deneyin.
1. Tohum hücreleri transfeksiyon süresi ≥ 80% izdiham verim.
Tohum hücreleri 100μl toplam hacmi 96-de beyaz TC plaka.
Izdiham değerlendirmek için net 96-plaka paralel, tohum hücrelerin uygun sayıda.
ÖNEMLİ İPUCU 1: Confluence taklit deney iyi sonuçlar elde anahtarıdır. Optimum demonte için, hücre Transfeksiyondan zamanda konfluent% 100 olmalıdır.
ÖNEMLİ İPUCU 2: En iyi sonuçları elde etmek için düşük geçit hücreleri kullanın. Çok kez geçişli olan hücreler gürültülü transfeksiyon veri verim eğilimindedir.
2. Gün
GoClonereporter yapıları ve miRNA'lar hazırlayın, sonra konfluent hücrelerin içine transfect.
2. Oluşturur hazırlayın
Çözülme GoClone yapıları oda sıcaklığında (plazmid DNA). İyice karıştırın.
Santrifüj kapağı yoğunlaşma kaldırmak için.
3. Mikro RNA'lar hazırlayın
Oda sıcaklığı ve yoğuşma kapakları kaldırmak için santrifüj çözülme microRNA (özel taklit ve hedefleme olmayan kontroller).
RNaz içermeyen su 2 mcM bir çalışma konsantrasyonu seyreltilir.
Deneysel bir miRNA ek olarak DAİMA olmayan bir hedefleme miRNA kontrolü de taklit ediyor. Co-transfecting plazmid ve küçük bir RNA oligo yalnız plazmid transfecting daha düşük sinyal yol açar.
Bir veya daha fazla pozitif kontroller içerir. SGG katalog sentetik miRNA hedef muhabiri vektörler yüzlerce birini kullanmayı düşünün.
Bir veya daha fazla negatif veya non-spesifik kontrolleri ekleyin. SGG kontrolleri 3 'UTRs housekeeping genler, rastgele parçaları ve / veya boş (hayır UTR insert) kontrolü de dahil olmak üzere bir dizi vardır. Bir veya daha fazla deneysel bir yapı ile birlikte bu denetimleri özel miRNA veya olmayan hedefleme kontrolü aşırı ekspresyonu atfedilebilecek herhangi bir non-spesifik etkileri normalleştirmek için izin verecektir.
4. Transfections hazırlayın
Her transfeksiyon için tek bir tahlil için aşağıdaki reaktifler birleştirmek:
Karışım 1
Bireysel GoClone muhabiri: 3.33 mcL
microRNA: * Değişir.
Serum ücretsiz medya: 10 mcL
* Etkili konsantrasyon miRNA 10 nM-100 nM değişebilir. Uygun konsantrasyonu için miRNA üreticisine danışın.
ÖNEMLİ İPUCU: taklit çok fazla eklemek etmeyin. Taklit konsantrasyonları için makul bir son 100uL reaksiyon aralığı 10-50 nM.
En az üç çoğaltma gerçekleştirinte her bir tedavi / UTR kombinasyonu transfections ve hata pipetleme izin vermek için ek hacim içerir.
Örneğin, hata veya buharlaşma pipetleme için ekstra dahil olmak üzere 3 çoğaltmak transfeksiyon kuyu için yeterli transfeksiyon karışımı elde etmek için tek bir reaksiyon hacimleri 3.5 ile çarpın.
Her muhabir için, aşağıdaki çoğaltır kurmak sadece muhabir, muhabir + hedefleme kontrolü miRNA ve muhabir + özel miRNA.
Olmayan bir hedefleme kontrolü için olduğu gibi, aynı zamanda hedef microRNA transfections ayarlayın.
DharmaFECT DUO (Dharmacon) karışımı olarak her transfeksiyon için aşağıdaki Makyaj:
Karışım 2
DharmaFect Duo: 0.15 mcL
Serum ücretsiz medya: 9,85 mcL
DharmaFECT Duo eklenecek miktar bağımlı hücre hattı olabilir.
Yukarıda belirtilen miktarda HT1080 hücreler için uygun.
Hücre hattı için uygun miktarını belirlemek için üreticinin belgelerine bakın.
İpucu: gazetecilere sayısına göre yukarıdaki miktarlar çarpılarak büyük bir transfeksiyon karışımı olun sayısını çoğaltır ve miRNA'lar sayısı test edilecek. Transfeksiyon karışımı hazırlamak için miktarı hesaplanırken, hataları ve buharlaşma pipetleme için hesap için ekstra bir miktar eklemeyi unutmayın.
DharmaFECT Duo karışım 5 dakika oda sıcaklığında inkübe izin verin.
5 dakika sonra, hazırlanan 10uL plazmid ve / veya miRNA (Karışım 1) her tüp DharmaFECT Duo karışımı (Karışım 2) 10μL ekleyin. Her tüp daha sonra çoğaltmak transfeksiyon başına 20μL hacmi içermelidir.
Her karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
20 dakika sonra, her tüp çoğaltmak transfeksiyon başına 100μL toplam 80 mcL çoğaltmak için önceden ısıtılmış (37 ° C), antibiyotik içermeyen, tam medya ekleyin. Birçok eş zamanlı olarak çoğaltır ve örnekler hazırlanması için kullanılan derin kuyu blok olabilir. Yukarı ve aşağı pipetleme çözüm karıştırın.
Inkübatör numaralı seribaşı plaka çıkarın. Hücrelerin en az% 80 konfluent olduğundan emin olun.
Her kuyudan medya kapalı dikkatlice pipetlemeyin.
Her iyi transfeksiyon karışımı (20uL DNA / reaktif karışımı + 80uL medya) 100μL ekle.
Gecede inkübatör yerleştirin plakası.
Aşırı inkübe etmeyin. En çok taklit eden 24 saat içinde iyi niyetli hedefleri üzerinde önemli sonuçlar üretecektir. 48 saat ölçülebilir baskı daha büyük olabilir, ama çok iyi değişkenlik iyi olacak.
Mimik deneyler inhibitörü deneyler daha kolaydır. En çok taklit eden 24 saat içinde gerçek hedefleri önemli ölçüde bastırmak da inhibitörü ilişkin de baskının önemli ölçülebilir olması için 48 saat alabilir ve hemen hemen her zaman taklit etkisi daha az belirgin olacaktır.
3. Gün
Not: Lusiferaz testlerin hemen yapılabilir ya da plakaları -80 dondurulmuş olabilir ° C (donma genellikle hücre lizis ve lusiferaz sinyal artar) . Dondurma ve en iyi sonuç için assaying önce hücreleri Çözülme.
LightSwitch Testi Reaktif eklemeden önce oda sıcaklığına kadar donmuş hücreleri çözülme izin UNUTMAYIN.
5. LightSwitch AssayReagents ile ölçün lusiferaz aktivitesini
Inkübatör plakasını çıkarın ve oda sıcaklığına getirmek.
LightSwitch Testi Reaktifler (LS010 kiti için, diğer kiti boyutları protokolleri çevrimiçi bulunabilir) hazırlayın:
Liyofilize Testi Yüzey tüp Solvent Yüzey 100μL ekleyerek sulandırın 100X Yüzey ışıktan koruyunuz ve oda sıcaklığında süresini en aza indirmek. 100X Yüzey, 2-3 haftayı-20C saklanabilir . En iyi sonuç için, taze sulandırılmış substrat kullanın.
Testi Buffer oda sıcaklığında su banyosunda 10 ml şişe çözülme Testi Çözüm hazırlayın ve kullanmadan önce sulandırılmış 100X Yüzey 100μL ekleyin. İyice karıştırın.
Doğrudan beyaz 96-plaka Her numune (100uL hücreleri + medya içeren) 100μL LightSwitch Assay Çözümü (buffer + substrat) eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın. Hücreleri başka bir plaka veya cam şişe biçimi, transfer örnekleri yetiştirilen olsaydı 100μL toplam hacmi (medya ya da PBS) beyaz 96 plaka.
Kapak plakası, ışıktan korumak ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Eğer birden fazla plaka assaying, böylece her bir plaka okuma 30 dakika önce kuluçkaya yanı sıra tahlil çözüm bocalama .
2 saniye boyunca her bir plaka lumi iyi okuyunnometer (SPECTRAmax L veya muadili).
(Lüminesans = Belirli miRNA / kontrol dışı hedef), hedefleme kontrolü üzerinde özel miRNA için her bir yapı için lusiferaz sinyal oranını hesaplarken demonte hesaplayın. UTR non-spesifik tedavi etkileri kontrol etmek için temizlik, rastgele ve boş yapıları verileri kullanın.
Temsilcisi Sonuçlar
Bir hedefleme miRNA varlığı 3'UTR hedefleri lusiferaz demonte göstermektedir.
Let-7a 3'UTR lusiferaz muhabiri faaliyet demonte Işıklı muhabiri okuduktan sonra, 24 saat süreyle inkübe 20nm izin 7a taklit veya hedefleme kontrolü ile inşa HT1080 hücrelerinde her muhabir co-transfecting 100ng tarafından ölçüldü LightSwitch Lusiferaz Testi Reaktifler kullanarak sinyal.
Şekil 1. Nokt ve ARID3B insan 3'UTRs let-7a microRNA hedeflerdir. Nokt ve ARID3B genlerin insan 3'UTR gazetecilere gelen sinyaller let-7a microRNA varlığı önemli ölçüde yere serdi taklit ederken temizlik ve rasgele sıra sinyalleri UTRs değil.
Discussion
Biz, canlı hücreler olarak miRNA 3'UTR etkileşimleri çalışmalarını sağlamak için ön klonlanmış insan 3'UTR-muhabiri yapıları bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk. İşte biz lusiferaz muhabiri sistemi kullanarak 3'UTR-muhabirleri ile birlikte transfecting miRNA taklit ve yüksek işlem tekrarlanabilir bir yöntem ortaya koymuştur.
Bu yöntem son derece transfectable hücre hattı kullanarak ve bir aşırı ekspresyonu tekniği ile miRNA faaliyet rahatsızlık vermesini araştırmacılar dayanır. Kötü transfectable hücre hatları kullanan araştırmacılar Sigma (Misyon 3'UTR Lenti GoClones) ile birlikte oluşturulan arkadaşı lentiviral 3'UTR muhabiri toplama kullanmayı düşünebilirsiniz. MiRNA ile hücrelerin tedavisinde aşırı ekspresyonu-tipi bir deneyde sonuçlar taklit eder, ve bu tür bir çalışmada, araştırmacılar, şu ya da gerçek fizyolojik şartlar temsil etmemektedir olabilir ki hesaba katması gerekiyor. Aşırı ekspresyonu endişeleri gidermek için, araştırmacılar pertürbasyon 12-14 iki farklı tipleri ile etkileşim çalışması miRNA inhibitörleri taklit için ek olarak kullanabilirsiniz.
Bir kez büyük olasılıkla miRNA hedefler belirlenmiştir, araştırmacılar siteler fonksiyonel etkileşim için gerekli olup olmadığını belirlemek için varsayılan miRNA bağlanma yerleri mutagenize isteyebilirsiniz. Ayrıca yüzlerce farklı potansiyel hedef UTRs (Boutz) test büyütmek isteyebilirsiniz. Buna ek olarak, araştırmacılar miRNA transkript istikrar ya da tercüme verimliliği etkileyen olup olmadığını olarak ilgilenen eğer lusiferaz muhabiri verileri önlemleri kararlı durum transkript seviyeleri karşılaştırıldığında olabilir. Orantılı bir değişim transkript düzeyleri ile ilişkili değildir lusiferaz sinyali herhangi bir değişiklik Çeviri verimliliği üzerinde bir etkisi işaret eder. Son olarak, araştırmacıların farklı UTRs göreli hassasiyeti miRNA konsantrasyonu 14 değişikliklere karşılaştırmak için muhabir vektörler bir doz yanıt eğrisi oluşturmak kullanabilirsiniz.
Disclosures
Yazarlar bu makalede yer alan araçlar ve reaktifler yapmak Şalt Genomik çalışanları. Bu makalenin Üretim Şalt Genomik sponsor oldu.
Materials
Name Company Catalog Number Comments
White Tissue Culture Plates (96-well solid bottom) VWR international 82050-736
Clear Tissue Culture Plates (96-well) with lid VWR international 353072
LightSwitch Luciferase Assay Reagent SwitchGear LS010
DharmaFECT Duo Transfection Reagent (0.75mL) Dharmacon T-2010-02
Foil Plate Sealing Tape E&K Scientific T592100
Breathable Plate Sealing Tape E&K Scientific T896100-S
Plate Luminometer Molecular Devices SpectraMax L
DOWNLOAD MATERIALS LIST
References
Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).
Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale. Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).
Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).
Baek, D., Villen, J., Shin, C. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance. PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).
Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
Lall, S., Krek, A., Chen, K. A genome-wide map of conserved microRNA targets in. 16, 460-471 (2006).
Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122. J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).
Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433, 769-773 (2005).
Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. Sequence-specific inhibition of small RNA function. PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).
Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. RNA. 10, 544-5450 (2004).
Liao, J. M., Lu, H. Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p. J. Biol. Chem. Epub. Forthcoming (2011).
Play Video
https://www.jove.com/t/3343
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite this Article
Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (55), e3343, doi:10.3791/3343 (2011).… More
Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (55), e3343, doi:10.3791/3343 (2011).
Less
Copy Citation
Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells. J. Vis. Exp. (55), e3343, doi:10.3791/3343 (2011).
Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Before you can use the favorites feature you must sign in or create an account.
Continue with Shibboleth
or
Forgot Password?
New to JoVE? Start your free trial
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
Submit
has access to
Please create an account to get access
Create Account
Back
Login to access JoVE
EMAIL
PASSWORD
Forgot Password?
Submit
Cancel
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
EMAIL
Reset Password
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To request a trial, please fill out the form below.
First Name *
Last Name *
Email Address *
Phone *
Select your role *
Professor / Instructor Postdoc Graduate / Ph.D. Student Undergraduate Student Lab Technician / Staff Researcher (Industry / Government) Medical Professional Librarian University / High School Administration Other
Please Clarify Your Role *
Get Started
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You
Please enjoy a free 12-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
Please click here to activate your free 12-hour trial. If you do not wish to begin your trial now, you can log back into JoVE at any time to begin.
Start Trial
✖
To prove you're not a robot, please enter the text in the image below
Enable Javascript for audio controls
Enter Captcha text here:
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
JoVE
Privacy • Terms of Use • Policies
Share on Twitter
Share on Facebook
Share on LinkedIn
Share on Wechat
Contact Us
Recommend to library
JoVE NEWSLETTERS
RESEARCH
JoVE Journal
Methods Collections
JoVE Encyclopedia of Experiments
Archive
ISSN 1940-087X
EDUCATION
JoVE Core
JoVE Science Education
JoVE Lab Manual
High Schools
Faculty Resource Center
Authors
Overview
Publishing Process
Editorial Board
Scope and Policies
Peer Review
FAQ
Submit
Librarians
Overview
Testimonials
Subscriptions
Access
Resources
Library Advisory Board
FAQ
ABOUT JoVE
Overview
Leadership
Blog
JoVE
Privacy • Terms of Use • Policies
Share on Twitter
Share on Facebook
Share on LinkedIn
Share on Wechat
Contact Us
Recommend to library
JoVE NEWSLETTERS
RESEARCH
JoVE Journal
Methods Collections
JoVE Encyclopedia of Experiments
Archive
ISSN 1940-087X
EDUCATION
JoVE Core
JoVE Science Education
JoVE Lab Manual
High Schools
Faculty Resource Center
Authors
Overview
Publishing Process
Editorial Board
Scope and Policies
Peer Review
FAQ
Submit
Librarians
Overview
Testimonials
Subscriptions
Access
Resources
Library Advisory Board
FAQ
ABOUT JoVE
Overview
Leadership
Blog
RESEARCH
JoVE Journal
Methods Collections
JoVE Encyclopedia of Experiments
Archive
ISSN 1940-087X
EDUCATION
JoVE Core
JoVE Science Education
JoVE Lab Manual
High Schools
Faculty Resource Center
Authors
Overview
Publishing Process
Editorial Board
Scope and Policies
Peer Review
FAQ
Submit
Librarians
Overview
Testimonials
Subscriptions
Access
Resources
Library Advisory Board
FAQ
ABOUT JoVE
Overview
Leadership
Blog
JoVE
Privacy • Terms of Use • Policies
Share on Twitter
Share on Facebook
Share on LinkedIn
Share on Wechat
Contact Us
Recommend to library
JoVE NEWSLETTERS
RESEARCH
JoVE Journal Methods Collections JoVE Encyclopedia of Experiments Archive
ISSN 1940-087X
EDUCATION
JoVE Core JoVE Science Education JoVE Lab Manual High Schools Faculty Resource Center
Authors
Overview Publishing Process Editorial Board Scope and Policies Peer Review FAQ Submit
Librarians
Overview Testimonials Subscriptions Access Resources Library Advisory Board FAQ
ABOUT JoVE
Overview Leadership Blog
JoVE
Share on Twitter
Share on Facebook
Share on LinkedIn
Share on Wechat
Contact Us
Recommend to library
JoVE NEWSLETTERS
Privacy • Terms of Use • Policies
Copyright © 2021 MyJoVE Corporation. All rights reserved
Copyright © 2021 MyJoVE Corporation. All rights reserved
X
mktb-title
mktb-description
mktb-action Close
mktb-title
mktb-description
mktb-action
We use cookies to enhance your experience on our website.
By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.	
Continue
Learn more Close
Your free access has ended.
Thank you for taking us up on our offer of free access to JoVE Education until June 15th. Your access has now expired.
If you would like to continue using JoVE, please let your librarian know as they consider the most appropriate subscription options for your institution’s academic community.