ScGET-seq
ஒற்றை செல் மரபணு மற்றும் எபிஜெனோம் பை டிரான்ஸ்போசேஸ் வரிசைமுறை (எஸ். சி. ஜி. இ. டி-செக்) என்பது திறந்த மற்றும் மூடிய குரோமாட்டின் விவரக்குறிப்புக்கான டிஎன்ஏ வரிசைமுறை முறையாகும். இதற்கு மாறாக, செயலில் உள்ள யூக்ரோமாட்டினை மட்டுமே இலக்காகக் கொண்ட டிரான்ஸ்போசேஸ்-அணுகக்கூடிய குரோமாட்டின் வரிசைமுறையுடன் (ஸ்கேட்டாக்-செக்) ஒற்றை செல் மதிப்பீட்டிற்கு மாறாக. SCGET-SEQ செயலற்ற ஹெட்டோரோக்ரோமாட்டினை ஆராயும் திறன் கொண்டது. இது டிஎன்எச் பயன்பாட்டின் மூலம் அடையப்படுகிறது, இது ஹெட்டோரோக்ரோமாட்டின் புரதம்-1-ஆல்பா (எச். பி.-1) இன் குரோமோடோமைனை (சிடி) டிஎன்5 டிரான்ஸ்போசேஸுடன் இணைப்பதன் மூலம் உருவாக்கப்படுகிறது. டிஎன்எச் பின்னர் ஹிஸ்டோன் 3 லைசின் 9 ட்ரைமெத்திலேஷன் (எச் 3 கே 9 மீ 3) ஐ இலக்காகக் கொள்ள முடியும், இது ஹெட்டோரோக்ரோமாட்டினுக்கான ஒரு மார்க்கர் ஆகும். அகின் முதல் ஆர்என்ஏ வேகம், இது செல்லுலார் வளர்ச்சியின் போக்கில் மரபணு வெளிப்பாட்டின் மாற்றங்களின் இயக்கவியலை ஊகிக்க ஸ்ப்லைஸ் செய்யப்பட்ட மற்றும் இணைக்கப்படாத ஆர்என்ஏவின் விகிதத்தைப் பயன்படுத்துகிறது, SCGET-SEQ இலிருந்து பெறப்பட்ட TnH முதல் Tn5 சமிக்ஞைகளின் விகிதத்தை குரோமாட்டின் வேகத்தைக் கணக்கிட பயன்படுத்தலாம், இது செல்லுலார் வளர்ச்சி பாதைகளின் போக்கில் குரோமாட்டின் அணுகலின் இயக்கவியலை அளவிடுகிறது. டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் ரெகுலேஷன் குரோமாட்டின் நிலைகளுடன் இறுக்கமாக இணைக்கப்பட்டுள்ளது. திறந்த அல்லது டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனுக்கு அனுமதிக்கப்படும் குரோமாட்டின், மரபணுவின் 2-3% ஐ மட்டுமே உருவாக்குகிறது, ஆனால் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணி பிணைப்பு தளங்களின் 94.4% ஐ உள்ளடக்கியது. மாறாக, மிகவும் இறுக்கமாக நிரம்பிய டிஎன்ஏ அல்லது ஹெட்டோரோக்ரோமாட்டின், மரபணு அமைப்பு மற்றும் ஸ்திரத்தன்மைக்கு காரணமாகும். செல்லுலார் வேறுபாடு செயல்முறைகளின் போக்கில் குரோமாட்டின் அடர்த்தியும் மாறுகிறது, ஆனால் ஹெட்டோரோக்ரோமாட்டினை நேரடியாக மதிப்பிடுவதற்கு உயர்-செயல்திறன் வரிசைமுறை முறைகள் இல்லை. புற்றுநோய் போன்ற பல மரபணு தொடர்பான நோய்கள் அவற்றின் எபிஜெனோமின் மாற்றங்களுடன் மிகவும் இணைக்கப்பட்டுள்ளன. குறிப்பாக புற்றுநோய்கள் ஒற்றை செல் பன்முகத்தன்மையால் வகைப்படுத்தப்படுகின்றன, இது மெட்டாஸ்டாசிஸ் மற்றும் சிகிச்சை எதிர்ப்பை இயக்க முடியும். இந்த செயல்முறைகளுக்கு அடித்தளமாக இருக்கும் வழிமுறைகள் இன்னும் பெரும்பாலும் அறியப்படவில்லை, இருப்பினும் ஒற்றை செல் தொழில்நுட்பங்களின் வருகை, ஒற்றை செல் எபிஜெனோமிக்ஸ் உட்பட, அவற்றின் தெளிவுபடுத்தலுக்கு பெரிதும் பங்களித்துள்ளது. 2015 ஆம் ஆண்டில், ஏடிஏசி-செக், இது டிஎன் 5 டிரான்ஸ்போசேஸை துண்டு துண்டாகப் பயன்படுத்துகிறது மற்றும் அணுகக்கூடிய குரோமாட்டின் அல்லது யூக்ரோமாட்டின், வரிசைப்படுத்தலுக்காக, ஒற்றை செல் தெளிவுத்திறனில் சாத்தியமானது. ஒவ்வொரு உயிரணுவிலும் உள்ள குரோமாட்டின் அமைப்பு மற்றும் இயக்கவியல் பற்றிய விரிவான பார்வையை வழங்குவதன் மூலம் ஹெட்டோரோக்ரோமாட்டின் பற்றிய தகவல்களையும் வழங்குவதன் மூலம் இந்த தொழில்நுட்பத்தை எஸ். சி. ஜி. இ. டி-செக் உருவாக்குகிறது. முறைகள் மாதிரி தயாரித்தல் எஸ். சி. ஜி. இ. டி-செக்-க்கான மாதிரி தயாரிப்பு தொடக்க பொருளுக்கு பொருத்தமான முறையைப் பயன்படுத்தி உயிரணுக்களில் இருந்து கருக்களை இடைநீக்கம் செய்வதன் மூலம் தொடங்குகிறது. அடுத்த கட்டம் டிஎன்எச் டிரான்ஸ்போசேஸை உற்பத்தி செய்வதாகும். டிஎன்5 என்பது நியூக்ளியோசோம்களால் (திறந்த குரோமாட்டின்) பிணைக்கப்படாத மரபணு பகுதிகளுக்கு அடாப்டர்களை வெட்டி இணைக்கும் ஒரு டிரான்ஸ்போசேஸ் ஆகும். HP-1a என்பது HP1 குடும்பத்தின் உறுப்பினர் மற்றும் H3K9me3 ஐ அடையாளம் கண்டு குறிப்பாக பிணைக்க முடியும். அதன் குரோமோடோமைன் இந்த குரோமாட்டின் மாற்றத்தை அங்கீகரிக்க ஒரு தூண்டப்பட்ட-பொருத்தம் பொறிமுறையைப் பயன்படுத்துகிறது. குரோமோடோமைன் கொண்ட HP-1a இன் முதல் 112 அமினோ அமிலங்களை Tn5 உடன் மூன்று பாலி-டைரோசின்-கிளைசின்-செரின் (TGS) இணைப்பியைப் பயன்படுத்தி இணைப்பது TnH டிரான்ஸ்போசேஸை உருவாக்க வழிவகுக்கிறது, இது H3K9me3 ஆல் குறிக்கப்பட்ட ஹெட்டோரோக்ரோமாட்டினை இலக்காகக் கொள்ளும் திறன் கொண்டது. நூலகத் தயாரிப்பு ஒற்றை-செல் ATAC-SEQ க்கான மாற்றியமைக்கப்பட்ட நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி செய்யப்படுகிறது, அங்கு நியூக்ளியஸ் சஸ்பென்ஷன் முதலில் Tn5 டிரான்ஸ்போசேஸ் மற்றும் பின்னர் TnH உடன் தொடர்ச்சியாக அடைகாக்கப்படுகிறது. தரவு பகுப்பாய்வு தரவு பகுப்பாய்வின் குறிக்கோள்கள் பின்வருமாறுஃ கிளஸ்டரிங்கைப் பயன்படுத்தி தனித்துவமான உயிரணு எண்ணிக்கையை அடையாளம் கண்டு வகைப்படுத்த மரபணு முழுவதும் குரோமாட்டின் அணுகலை சுயவிவரப்படுத்த நகல்-எண் மாறுபாடுகள் மற்றும் ஒற்றை-நியூக்ளியோடைடு மாறுபாடுகளை முன்கூட்டியே செயலாக்க பிந்தைய வரிசைமுறை, ரீட்களை டிம்ல்டிப்லெக்ஸ் செய்து பொருத்தமான குறிப்பு மரபணுவுடன் வரைபடமாக்க வேண்டும். நகலெடுக்கப்பட்ட வாசிப்புகள் அடையாளம் காணப்பட்டு அகற்றப்படுகின்றன. "சிகரங்கள்" அல்லது வரைபடம் செய்யப்பட்ட வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கையில் செறிவூட்டப்பட்ட டி. என். ஏவில் உள்ள பகுதிகள் அடையாளம் காணப்படுகின்றன. தரக் கட்டுப்பாடு செய்யப்படுகிறது, மேலும் குறைந்த எண்ணிக்கையிலான ரீட்கள் அல்லது சில கண்டறியப்பட்ட அம்சங்களைக் கொண்ட செல்கள் வடிகட்டப்படுகின்றன. நான்கு எண்ணிக்கை மேட்ரிக்ஸ்கள் (ஒவ்வொரு நெடுவரிசையும் ஒரு கலமாகவும், ஒவ்வொரு வரிசையும் ஒரு அம்சமாகவும் இருக்கும் மேட்ரிக்ஸ்கள்) உருவாக்கப்படுகின்றனஃ Tn5-dhs, Tn5-நிரப்பு, TnH-dhs மற்றும் TnH-நிரப்பு, அணுகக்கூடிய மற்றும் சுருக்கமான குரோமாடினிலிருந்து சமிக்ஞையைக் குறிக்கின்றன. பகுப்பாய்வு பரிமாணக் குறைப்பு, காட்சிப்படுத்தல் மற்றும் கிளஸ்டரிங் ஒவ்வொரு மேட்ரிக்ஸும் பகிரப்பட்ட பகுதிகளை வடிகட்டி பின்னர் இயல்பாக்கப்பட்டு பதிவு 2 மாற்றப்படுகிறது. முதன்மை கூறு பகுப்பாய்வு (பிசிஏ) பயன்படுத்தி நேரியல் பரிமாணக் குறைப்பு செய்யப்படுகிறது. செல்களின் குழுக்கள் கே-என்என் வழிமுறை மற்றும் லைடன் வழிமுறை ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி அடையாளம் காணப்படுகின்றன. இறுதியாக, மேட்ரிக்ஸ் காரணிமயமாக்கல் மற்றும் யு. எம். ஏ. பி குறைப்பு ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி நான்கு மேட்ரிக்ஸ்கள் இணைக்கப்படுகின்றன. செல் அடையாள சிறுகுறிப்பு செல் அடையாள சிறுகுறிப்புக்கு இரண்டு அணுகுமுறைகள் உள்ளனஃ ஏடிஏசி சிகரங்களின் அம்ச சிறுகுறிப்பின் அடிப்படையில் சிறுகுறிப்பு, மற்றும் குறிப்பு எஸ். சி. ஆர். என். ஏ-செக்யூ தரவுகளுடன் ஒருங்கிணைப்பின் அடிப்படையில் சிறுகுறிப்பு. Tn5 மற்றும் TnH சமிக்ஞைகளின் விகிதத்தைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், குரோமாட்டின் மறுவடிவமைப்பு எவ்வளவு விரைவாகவும் எந்த திசையிலும் நடைபெறுகிறது என்பதை விவரிக்கும் அளவு மதிப்புகளைக் கணக்கிட முடியும் (குரோமாட்டின் திசைவேகம்). மிகவும் மாறும் பகுதிகளை தனிமைப்படுத்துவதன் மூலமும், எந்த டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகள் அங்கு பிணைக்கின்றன என்பதை அடையாளம் காண்பதன் மூலமும், கொடுக்கப்பட்ட செல்லுக்குள் நடக்கும் மாறும் எபிஜெனெடிக் செயல்முறைகளையும், அந்த செயல்முறைகளுக்கு பல்வேறு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகளின் பங்களிப்புகளையும் ஊகிக்க குரோமாட்டின் திசைவேகத்தைப் பயன்படுத்தலாம். எதிர்கால குரோமாட்டின் மறுவடிவமைப்பு மரபணு வெளிப்பாட்டின் மாற்றங்களுக்கு முன்னதாக உள்ளது மற்றும் செல்லுலார் மாற்றங்களின் பாதைகள் மற்றும் வழிமுறைகள் பற்றிய புரிதலை மேம்படுத்துகிறது. எனவே, பன்முகத் தரவுகளை ஒருங்கிணைப்பதற்கான தளங்கள் மற்றும் கருவிகள் செயலில் உள்ள ஆராய்ச்சியின் பகுதிகளாகும், ஆர்என்ஏ வேகத்துடன் குரோமாட்டின் வேகத்தை ஒருங்கிணைப்பதன் மூலம் தற்காலிக மற்றும் திசை கூறுகளை இணைப்பது வேறுபாடு பாதைகள் பற்றிய கூடுதல் தகவல்களை வெளிப்படுத்த முன்மொழியப்பட்டுள்ளது. வரம்புகள் SCGET-SEQ ஆனது SCATAC-SEQ போன்ற சில வரம்புகளைக் கொண்டுள்ளது. இரண்டு செயல்முறைகளுக்கும் சாத்தியமான உயிரணுக்களில் இருந்து அணுக்கரு மாதிரிகள் மற்றும் அதிக செல்லுலார் நம்பகத்தன்மை தேவைப்படுகிறது. குறைந்த செல்லுலார் நம்பகத்தன்மை அதிக பின்னணி டிஎன்ஏ மாசுபாட்டிற்கு வழிவகுக்கிறது, அவை உண்மையான உயிரியல் சமிக்ஞைகளை துல்லியமாக பிரதிநிதித்துவப்படுத்துவதில்லை. கூடுதலாக, ஸ்காடாக்-செக் மற்றும் எஸ். சி. ஜி. இ. டி-செக் தரவுகளின் முரட்டுத்தனமான மற்றும் சத்தமான தன்மை பகுப்பாய்வை சவாலானது, மேலும் இந்த தரவை எவ்வாறு சிறப்பாக நிர்வகிப்பது என்பது குறித்து இன்னும் ஒருமித்த கருத்து இல்லை மற்றொரு வரம்பு என்னவென்றால், எஸ். சி. ஜி. இ. டி-செக் இன்னும் மொத்த மரபணு வரிசைமுறை மூலம் எஸ். என். வி முடிவுகளின் சரிபார்ப்பு தேவைப்படுகிறது. மொத்த எக்ஸோம் வரிசைமுறைக்கும் எஸ். சி. ஜி. இ. டி-செக் முடிவுகளுக்கும் இடையே பிறழ்வுகளின் அதிக தொடர்பு இருந்தாலும், எஸ். சி. ஜி. இ. டி-செக் அனைத்து எக்ஸோம் எஸ். என். வி. களையும் பிடிக்கத் தவறிவிட்டது. குறிப்புகள் மூலக்கூறு உயிரியல் நுட்பங்கள்