Deterministic Barcoding in Tissue for Spatial Omics Sequencing
ஒரு திசு மாதிரியில் இடஞ்சார்ந்த மரபணு வெளிப்பாடு பன்முகத்தன்மையைப் படிப்பதற்கான பல-ஓமிக்ஸ் அணுகுமுறையை உருவாக்குவதற்காக 2020 ஆம் ஆண்டில் யேல் பல்கலைக்கழகத்தில் ராங் ஃபேன் மற்றும் சகாக்களால் இடஞ்சார்ந்த ஓமிக்ஸ் வரிசைமுறைக்கான திசுவில் நிர்ணயிக்கப்பட்ட பார்கோடிங் (டிபிஐடி-செக்) உருவாக்கப்பட்டது. இந்த முறை புதிய அல்லது உறைந்த ஃபார்மால்டிஹைட்-நிலையான திசு மாதிரிகளில் ஒற்றை செல் தெளிவுத்திறனில் எம். ஆர். என். ஏ மற்றும் புரத நிலைகளை இணை வரைபடமாக்க பயன்படுத்தப்படலாம். டிபிஐடி-செக் அடுத்த தலைமுறை வரிசைமுறை (என்ஜிஎஸ்) மற்றும் மைக்ரோஃப்ளூயிடிக்ஸ் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்துகிறது. இந்த முறை ஒரு திசு மாதிரியின் ஒரே நேரத்தில் இடஞ்சார்ந்த டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வு செய்ய அனுமதிக்கிறது. உயர் வரையறை இடஞ்சார்ந்த டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் (எச். டி. எஸ். டி) மற்றும் ஸ்லைடு-செக் போன்ற முந்தைய இடஞ்சார்ந்த டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் பயன்பாடுகளில் டிபிஐடி-செக் மேம்படுத்துகிறது, ஒரு பிக்சலுக்கு கண்டறியக்கூடிய மரபணுக்களின் எண்ணிக்கையை அதிகரிப்பதன் மூலமும், செல்லுலார் தெளிவுத்திறனை அதிகரிப்பதன் மூலமும், செயல்படுத்துவதை எளிதாக்குவதன் மூலமும். பல்லுயிர் அமைப்புகளில் பயன்பாடுகள் ஒவ்வொரு தனிப்பட்ட உயிரணுவின் செயல்பாடும் அவற்றின் இடஞ்சார்ந்த இருப்பிடம் மற்றும் சுற்றுப்புறங்களால் பாதிக்கப்படுகிறது. எனவே, ஒரு திசு முழுவதும் எம்ஆர்என்ஏ மற்றும் புரத அளவுகள் இரண்டையும் ஒரு இடஞ்சார்ந்த சூழலில் சுயவிவரப்படுத்த டிபிஐடி-செக்கை செயல்படுத்துவது பல உயிரியல் செயல்முறைகளைப் பற்றிய சிறந்த புரிதலுக்கு வழிவகுக்கும். டி. பி. ஐ. டி-செக் புற்றுநோயியல், வளர்ச்சி உயிரியல் மற்றும் நோயியல் போன்ற பல்வேறு துறைகளில் பயன்படுத்தப்படலாம். வளர்ச்சி உயிரியலில் பயன்படுத்துவது ஆர்கனோஜெனெசிஸ் எவ்வாறு நிகழ்கிறது என்பதைப் பற்றிய சிறந்த புரிதலுக்கு வழிவகுக்கும், மேலும் புற்றுநோயியலில் இது ட்யூமரிஜெனெசிஸ் மற்றும் முன்னேற்றத்தில் பன்முகத்தன்மையின் பங்கு பற்றிய கூடுதல் நுண்ணறிவை வழங்கக்கூடும். செயல்முறை DBiT-SEQ துல்லியமாக கட்டுப்படுத்தப்பட்ட வடிவத்தில் ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடு பார்கோடுகளை வழங்க ஒரு மைக்ரோஃப்ளூயிடிக்ஸ் அமைப்பைப் பயன்படுத்துகிறது. இந்த அமைப்பு A1B1, A1B2 என்று பெயரிடப்பட்ட பிரிவின் குறுக்கே தனித்துவமான பார்கோடுகளின் கட்டத்தை உருவாக்க செங்குத்தாக இரண்டு செட் ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடு பார்கோடுகளைப் (A1-A50 மற்றும் B1-B50) பயன்படுத்துகிறது. சாதனத் தயாரிப்பு DBiT-SEQ க்கு பார்கோடுகளை வழங்க விசேஷமாக வடிவமைக்கப்பட்ட மைக்ரோஃப்ளூயிடிக்ஸ் சாதனம் தேவைப்படுகிறது. மைக்ரோஃப்ளூயிடிக்ஸ் மைக்ரோன் அளவில் திரவங்களை துல்லியமாக கையாள உதவுகிறது. DBiTseq சாதனம் ஒரு சிலிக்கான் வேஃபர் அச்சில் போடப்பட்ட பாலிடைமெத்தில்சிலோக்சேன் (PDMS) பயன்படுத்தி தயாரிக்கப்படுகிறது. இந்த சாதனம் பயனரை திரவ வினைப்பொருட்களை பொருத்தமான சேனல்களில் சிறப்பு உபகரணங்கள் இல்லாமல் மேக்ரோ அளவில் டெபாசிட் செய்ய அனுமதிக்கிறது. இந்த வினையூக்கிகள் பின்னர் திசு பிரிவின் மேற்பரப்பு முழுவதும் 10,25 அல்லது 50 மைக்ரோமீட்டர் அகலமுள்ள கால்வாய்கள் வழியாக வெற்றிடத்தால் இழுக்கப்படுகின்றன. டி. பி. ஐ. டி-செக் சாதனத்தின் மற்ற கூறுகள் இரண்டு பி. டி. எம். எஸ் நீர்த்தேக்கங்கள் மற்றும் திசுக்களுக்கு சாதன ஃப்ளஷ் வைத்திருக்க ஒரு அக்ரிலிக் கிளாம்ப் அமைப்பு ஆகும். திசு தயாரிப்பு மற்றும் ஆன்டிபாடி கறை படிதல் டி. பி. ஐ. டி-செக்கின் ஒரு நன்மை, திசு சரிசெய்தல் எனப்படும் ஒரு செயல்பாட்டில் ஃபார்மால்டிஹைடுடன் பாதுகாக்கப்பட்ட திசு ஸ்லைடுகளில் அதைப் பயன்படுத்தும் திறன் ஆகும், இது மற்ற இடஞ்சார்ந்த ஓமிக்ஸ் முறைகளுடன் பொருந்தாது. திசுக்கள் உறைந்து, சரி செய்யப்பட்டு, கண்ணாடி ஸ்லைடுகளில் பொருத்தப்பட்ட மிக மெல்லிய துண்டுகளாகப் பிரிக்கப்படுகின்றன. மாதிரியில் உள்ள புரதங்களைப் பற்றிய தகவல்கள் தேவைப்பட்டால், திசு முதலில் ஆன்டிபாடி-பெறப்பட்ட டிஎன்ஏ குறிச்சொற்களால் (ஏடிடி) கறைபடிந்திருக்கும். ஏ. டி. டி. க்கள் ஒரு தனித்துவமான பார்கோடு வரிசை மற்றும் பாலி-ஏ வால் வரிசையைக் கொண்ட ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடுடன் இணைக்கப்பட்ட ஒரு ஆன்டிபாடியால் ஆனவை. பாலி-ஏ வால் பார்கோடு ஏ இல் உள்ள பாலி-டி வரிசையால் அங்கீகரிக்கப்படும், இது ஒரு இடஞ்சார்ந்த இருப்பிடத்துடன் தொடர்புடையதாக இருக்கும். ஆன்டிபாடி கறை படிந்ததைத் தொடர்ந்து (விரும்பினால்), முதல் மைக்ரோஃப்ளூயிடிக்ஸ் சிப்பைப் பயன்படுத்தி திசு மாதிரியில் 50 பார்கோடுகளின் முதல் தொகுப்பு பயன்படுத்தப்படுகிறது. ஒவ்வொரு 'ஏ' ப்ரைமரிலும் ஒரு தனித்துவமான பார்கோடு வரிசை, ஒரு பிணைப்பு இணைப்பு மற்றும் ஒரு பாலி டி வரிசை உள்ளது. பாலி-டி வரிசை திசு மாதிரியில் உள்ள எம்ஆர்என்ஏக்கள் மற்றும் முன்பு பயன்படுத்தப்பட்ட ஏடிடிகளில் உள்ள பாலி-ஏ வாலுடன் பிணைக்கிறது. தலைகீழ் படியெடுத்தல் பின்னர் பார்கோடு மற்றும் எம்ஆர்என்ஏ அல்லது ஆன்டிபாடி டேக் வரிசையைக் கொண்ட முதல் சிடிஎன்ஏ இழையை உருவாக்குகிறது. சிப் பி பின்னர் அதே திசு ஸ்லைடில் பயன்படுத்தப்படுகிறது. சிப் பி இரண்டாவது செட் பார்கோடுகளை முதல் செங்குத்தாக வழங்கும், இது ஒரு கிரிட் வடிவத்தை உருவாக்கும். ஒவ்வொரு 'பி' ஒலிகோ நியூக்ளியோடைடிலும் ஒரு தனித்துவமான பார்கோடு வரிசை, ஒரு பி. சி. ஆர் கைப்பிடி, ஒரு பிணைப்பு இணைப்பு மற்றும் சிடிஎன்ஏ சுத்திகரிப்புக்கான பயோட்டின் ஆகியவை உள்ளன. பிணைப்பு இணைப்பு வரிசைகள் ஏ மற்றும் பி பார்கோடுகளை ஒரே டிஎன்ஏ இழையாக இணைக்க பயன்படுத்தப்படுகின்றன. இறுதியாக, ஒரு லைசிஸ் படி திசுவிலிருந்து சி. டி. என். ஏவை அனைத்து பார்கோடட் இழைகளையும் கொண்ட ஒரு தொகுக்கப்பட்ட மாதிரியாக பிரித்தெடுக்கிறது. நூலகத் தயாரிப்பு மற்றும் வரிசைமுறை படி 3 இல் உற்பத்தி செய்யப்படும் சிடிஎன்ஏ லைசேட், பார்கோடு பி இல் உள்ள பயோடினை அடையாளம் காணும் ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் மணிகளைப் பயன்படுத்தி சுத்திகரிக்கப்படுகிறது. நிரப்பு சிடிஎன்ஏ ஸ்ட்ராண்ட் பின்னர் தலைகீழ் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மூலம் ஒருங்கிணைக்கப்படுகிறது, அதைத் தொடர்ந்து பிசிஆர் பெருக்கம் மற்றும் நூலகத்தின் இறுதி சுத்திகரிப்பு. நூலகம் பின்னர் அடுத்த தலைமுறை (இல்லுமினா) வரிசைமுறையைப் பயன்படுத்தி வரிசைப்படுத்தப்படுகிறது. தரவு பகுப்பாய்வு பார்கோடுகளிலிருந்து பெறப்பட்ட இடஞ்சார்ந்த தகவல்களின் துல்லியமான தொடர்பை செயல்படுத்த ஒவ்வொரு பார்கோடிங் படிக்கும் முன்னும் பின்னும் திசு ஸ்லைடு படம்பிடிக்கப்படுகிறது. ஒவ்வொரு எம்ஆர்என்ஏ வரிசையுடனும் பார்கோடுகளை தொடர்புபடுத்துவது திசுவின் இடஞ்சார்ந்த டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் வரைபடத்தை வழங்குகிறது. இது ஒரு ஒற்றை-செல் முறை அல்ல என்றாலும், 10 யுஎம் சேனல்கள் ஒரு சதுரத்திற்கு 1 முதல் 2 செல்களை மட்டுமே கைப்பற்றி, ஒற்றை-செல் தெளிவுத்திறனை உருவாக்குகின்றன. ADT வரிசைகள் இடஞ்சார்ந்த புரோட்டியோமிக் தகவல்களைப் பிடிக்கிறது, அவை டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் தரவுகளுடன் ஒப்பிடப்படலாம். குறிப்பிட்ட உயிரணு எண்ணிக்கையை இரண்டு வழிகளில் அடையாளம் காணலாம். முதலாவதாக, ஒவ்வொரு உயிரணு வகைக்கும் முந்தைய ஒற்றை-செல் ஆர்என்ஏ-செக் (எஸ். சி. ஆர். என். ஏ-செக்) சுயவிவரங்களுடன் டிரான்ஸ்கிரிப்டோமை பொருத்துவதன் மூலம். இரண்டாவதாக, SCRNA-SEQ தரவு இல்லாமல் திசு வகைகளை வேறுபடுத்தக்கூடிய ஒரு முறை அங்கீகார மென்பொருளான இடஞ்சார்ந்த வேறுபட்ட வெளிப்பாட்டை (SpatialDE) பயன்படுத்துகிறது. நன்மைகள் மற்றும் வரம்புகள் டிபிஐடி-செக் எம்ஆர்என்ஏக்கள் மற்றும் புரதங்களின் இணை வரைபடத்தை அனுமதிப்பதன் மூலம் பிற இடஞ்சார்ந்த-ஓமிக்ஸ் நுட்பங்களை விட ஒரு நன்மையை வழங்குகிறது. இது பகுப்பாய்விற்கான டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் தரவு இரண்டையும் வழங்குகிறது. இந்த நுட்பத்தை எளிதில் செயல்படுத்தலாம் மற்றும் ஆராய்ச்சியாளரின் தேவைகள் மற்றும் ஆர்வமுள்ள புரதங்களுக்கு ஏற்ப மாற்றியமைக்கலாம். இந்த முறையை எச் & இ மற்றும் நோயெதிர்ப்பு திசு மாதிரிகள் மற்றும் ஃபார்மால்டிஹைட் பொருத்தப்பட்ட திசு மாதிரிகள் ஆகியவற்றில் வெற்றிகரமாகப் பயன்படுத்தலாம். பார்கோடிங்கிற்கு பயன்படுத்தப்படும் சேனல்களை 10 மைக்ரோமீட்டர், 25 மைக்ரோமீட்டர் மற்றும் 50 மைக்ரோமீட்டர் தெளிவுத்திறன் தேவைகளுக்கு ஏற்ப மாற்றலாம். வரம்புகள் DBiT-SEQ இன் தெளிவுத்திறன் ஒற்றை செல் தெளிவுத்திறனைக் கொண்டிருக்கவில்லை, ஆனால் இது ஒற்றை செல் தெளிவுத்திறனுக்கு அருகில் உள்ளது. பிக்சல் அளவு ~ 5 மைக்ரோமீட்டர் என்ற கோட்பாட்டு வரம்பைக் கொண்டுள்ளது, இது ஒரு செல் அவதானிப்பின் ஒற்றை அல்லது பகுதியை அனுமதிக்கும் அளவுக்கு சிறியது, ஆனால் அது செயல்படுத்தப்படவில்லை. தற்போதைய சேனல் உள்ளமைவுகளுடன் ஒரு திசுவில் மேப்பிங் பகுதிக்கு ஒரு அளவு வரம்பு உள்ளது, 10 மைக்ரோமீட்டர் சேனல்களைப் பயன்படுத்தி இது திசுவின் 1 மிமீ × 1 மிமீ பகுதியை மட்டுமே வரைபடமாக்க அனுமதிக்கிறது. இந்த வரம்பை சமாளிக்க கூடுதல் பார்கோடிங் சேனல்கள் பரப்பளவை அதிகரிக்க சேர்க்கப்படலாம். சுருக்கமான திசுக்கள் உயிரணுக்களின் பன்முகத்தன்மை கொண்ட மக்களால் ஆனவை. இந்த செல்கள் எவ்வாறு ஒன்றிணைந்து செயல்படுகின்றன என்பதையும், திசுக்களில் உள்ள ஒவ்வொரு உயிரணு வகையின் பங்கையும் புரிந்துகொள்வது புற்றுநோய் ஆராய்ச்சி மற்றும் வளர்ச்சி உயிரியல் போன்ற துறைகளில் முக்கியமானது. ஒற்றை செல் ஓமிக்ஸ் தொழில்நுட்பங்களின் முன்னேற்றங்கள் இந்த சிக்கலான சூழல்களைப் புரிந்துகொள்வதற்கான நமது முயற்சியை மேம்படுத்தியிருந்தாலும், இடஞ்சார்ந்த தகவல்கள் குறிப்பிடத்தக்க வகையில் இல்லை. இடஞ்சார்ந்த ஓமிக்ஸின் வருகையால் இது மேம்படுத்தப்பட்டுள்ளது. டி. பி. ஐ. டி-செக் நிலையான அல்லது புதிய திசு பிரிவுகளிலிருந்து இடஞ்சார்ந்த டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மற்றும் புரோட்டியோமிக் தகவல்களைப் பெற அணுகக்கூடிய முறையை வழங்குகிறது. 10, 25 அல்லது 50 மைக்ரோ மீட்டர் தெளிவுத்திறனுடன், டிபிஐடி-செக் ஒற்றை செல் தெளிவுத்திறனுக்கு அருகில் வழங்குகிறது மற்றும் மிகவும் சிறப்பு வாய்ந்த இமேஜிங் உபகரணங்கள் தேவையில்லாமல் இடஞ்சார்ந்த ஓமிக்ஸ் தரவை வழங்குகிறது. குறிப்புகள் ஓமிக்ஸ் டிஎன்ஏ பார்கோடிங்