Nun kann man feststellen, um wie viel sich die Schmelztemperatur der Hybrid-DNA gegenüber der reinen DNA eines Organismus erniedrigt hat.
Bei dieser Methode vereinigt (hybridisiert) man singel-copy-DNA (komplementäre Einzelstränge) von zwei verschiedenen Organismen. Nun kann man feststellen, um wie viel sich die Schmelztemperatur der Hybrid-DNA gegenüber der reinen DNA eines Organismus erniedrigt hat. Eine Verringerung der Schmelztemperatur um 1° C entspricht in etwa einem Unterschied von 1 %, d.h. dem Austausch eines Nucleotids in 100 Nucleotiden. Die Methode wurde 1966 von ELLIOT BRITTEN und D. KOHNE entwickelt. Mit dieser Methode können lediglich Ähnlichkeiten zwischen Organismen festgestellt werden, was eine Aufstellung von exakten Stammbäumen verhindert.