Bei dem Vergleich von Genen unterschiedlicher Organismen gibt es ein Problem.
Bei dem Verfahren geht man so vor, dass man zunächst die Gesamt-DNA eines Organismus isoliert und dann ein Markergen auswählt, das durch Klonierung oder meistens durch PCR in solchen Mengen vermehrt wird, dass es anschließend sequenziert werden kann. In der Regel wählt man die Markergene aus nicht kodierender DNA oder aus Mitochondrien-DNA (bei Tieren) bzw. Chloroplasten-DNA (bei Pflanzen) aus. Diese Gene haben nichts mit der Morphologie zu tun und unterliegen deshalb kaum adaptiven Faktoren, welche die äußere Gestalt der Organismen verändert haben. Für weit zurückliegende evolutionäre Ereignisse und damit für die großen Zusammenhänge im Stammbaum eignen sich besonders die für die Ribosomen verantwortlichen Gene des Kerns, da sie in allen Eukaryoten gleichermaßen zur Verfügung stehen und sehr konservativ sind. rDNA-Gene in tierischen Mitochondrien sind wesentlich variabler und damit gute Marker für Ereignisse, die in den letzten 100 Millionen Jahren stattfanden. Bei dem Vergleich von Genen unterschiedlicher Organismen gibt es ein Problem. Neben sogenannten orthologen Genen, die wirklich homolog sind, gibt es Gene, die durch multiple aber unterschiedliche Kopien zu sogenannten Multigenfamilien geworden sind. Gene einer Multigenfamilie nennt man auch paralog. Es besteht die Gefahr, an Stelle homologer Gene solche paralogen Gene zu vergleichen, woraus dann natürlicherweise falsche Stammbäume entstehen.