Purificazione delle biomolecole: elettroforesi  - WeSchool


L’elettroforesi è una tecnica che permette di dividere molecole in base alla loro 
carica elettrica
 ed è particolarmente utilizzata per separare proteine e acidi nucleici. Questa metodica sfrutta il campo elettrico generato da due placche (elettrodi), il 
catodo
, carico negativamente, e l’
anodo
, carico positivamente, se queste sono collegate a un generatore di corrente. Di conseguenza gli anioni e i cationi migreranno rispettivamente verso il catodo e l’anodo, a causa della 
forza elettrostatica
.





















Videolezione "Studio di funzione: il procedimento"

























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Nella vaschetta che ospita i due elettrodi viene aggiunta una soluzione salina, che propaga la corrente da un capo all’altro, e un gel che fornisce supporto solido ai campioni da separare. Senza di esso infatti le molecole diffonderebbero nel liquido, rendendo inutile l’esperimento. Nel gel vengono appositamente create delle fossette, chiamate pozzetti, nelle quali inserire il campione. La purificazione avviene perchè il gel stesso funge anche da rete, in grado, grazie alle proprie maglie, di rallentare le molecole più grandi, lasciando passare più facilmente le più piccole. Ciò è possibile grazie alla natura chimica del gel, costituito da molecole lineari (poliacrilammide o agarosio) che formano un 
setaccio molecolare
.


Grazie a questa tecnica è quindi possibile dividere macromolecole biologiche dotate di carica in base alla loro dimensione, la quale è calcolabile per ogni singola molecola poichè direttamente proporzionale alla distanza coperta a partire dal pozzetto. Poichè questo fenomeno varia a seconda del tipo di gel usato, della sua concentrazione e dalla natura del campione, esistono soluzioni di molecole a dimensione nota (chiamate ladder), la cui divisione sul gel permette di dedurre la dimensione delle molecole d’interesse. Gli acidi nucleici sono sempre dotati di carica negativa, per la presenza di gruppi fosfato, e quindi essi migreranno sempre verso l’anodo. Le proteine invece hanno una carica variabile, che dipende dal pH della soluzione in cui si trovano. Gli amminoacidi con catene laterali ionizzabili risentono infatti di questo fattore ambientale. Per risolvere questo problema si utilizza una sostanza (sodiododecilsolfato, SDS) in grado di “srotolare” le proteine e di garantire loro una carica negativa uniforme lungo tutta la molecola. In questo modo anche le proteine migreranno verso l’anodo. Utilizzando una versione modificata dell’elettroforesi è anche possibile separare le proteine in base al loro punto isoelettrico.


Per visualizzare la presenza di una molecola in un certo punto del gel (chiamata banda) è necessario utilizzare una sostanza che in qualche modo la evidenzi. Per le proteine si utilizza il colorante blu di Comassie o il nitrato d’argento (AgNO
3
), per gli acidi nucleici l’etidio bromuro, osservabile ai raggi UV. Per purificare la singola banda contenente la molecola d’interesse è quindi necessario tagliare con un bisturi la zona intorno ad essa e sciogliere il gel in una adeguata soluzione.



