Purificazione delle biomolecole: estrazione di acidi nucleici - WeSchool


Nel 1944 il medico canadese Oswald Avery scoprì che il DNA è la molecola che contiene l’informazione genica, necessaria per esempio alla sintesi delle proteine. Ciò fu possibile grazie alla purificazione del DNA a partire da cellule coltivate. Esistono dettagliati protocolli di laboratorio per estrarre gli acidi nucleici, ma per molti passaggi, esistono anche metodi “fai da te”, utilizzando sostanze o strumenti che ognuno di noi possiede in casa.





















Videolezione "Studio di funzione: il procedimento"

























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Le cellule di partenza possono essere ottenute utilizzando i globuli rossi contenuti nel sangue o lievito per pane. Aggiungendo un detergente come il comune sapone liquido, è possibile sciogliere non solo la membrana plasmatica, ma anche le membrane dei vari organelli. Questo è importante nel caso di cellule eucariotiche, il cui DNA e parte dell’RNA si trovano nel nucleo. In alternativa è possibile utilizzare metodi fisici per rompere le cellule, come l’aggiunta di piccole sferette di vetro agitate da una centrifuga. Otteniamo così l’estratto cellulare grezzo, ovvero tutto il contenuto originale della cellula.
Ma poichè nel citosol sono presenti enzimi in grado di degradare gli acidi nucleici (nucleasi), è necessario inattivare queste proteine, per impedire che il nostro prodotto di estrazione svanisca in poco tempo. A questo fine possiamo scaldare l’estratto grezzo, senza esagerare con le temperature e le tempistiche (60°C per 15 minuti), poichè anche gli acidi nucleici ne risulterebbero danneggiati. Per questo motivo in laboratorio si utilizzano sostanze specifiche (come l’EDTA) in grado di inibire selettivamente le nucleasi.
Oltre a questi enzimi, nell’estratto cellulare sono presenti moltissime altre proteine, in particolare gli istoni, che legano il DNA, impedendone l’isolamento. Per eliminare queste componenti dobbiamo aggiungere dei particolari enzimi, chiamati proteasi, che possono essere ottenuti dalla polpa o dal succo di alcuni frutti, come la papaia e l’ananas. Dopo che le proteasi hanno svolto il loro compito, vengono allontanate dagli acidi nucleici grazie all’aggiunta di solventi organici come il fenolo (C
6
H
6
O) o il cloroformio (CHCl
3
). Gli acidi nucleici si troveranno nella fase acquosa, distinta da quella organica in quanto si trova la di sopra di essa.
Per far precipitare gli acidi nucleici dalla soluzione acquosa è necessario aggiungere alcol, come il comune etanolo usato per disinfettare, a bassa temperatura (basta porlo in frigorifero). In questo modo il DNA e l’RNA precipiteranno, formano un sottile strato gelatinoso fra le due fasi che si vengono a creare. L’eliminazione delle proteine che è stata imposta precedentemente è fondamentale perchè anche esse precipiterebbero in presenza di etanolo. Per purificare ulteriormente gli acidi nucleici è necessario poi centrifugare il campione e raccogliere il pellet sul fondo. L’RNA e il DNA possono essere poi separati in diverso modo, per esempio sfuttando la diversa densità dei due (l’RNA è più denso), oppure eliminandone uno con l’aggiunta di una specifica nucleasi (DNAsi o RNAsi).

