Purificazione delle biomolecole: precipitazione e centrifugazione - WeSchool


Quando viene estratto tutto il contenuto di una cellula (estratto grezzo) ci troviamo di fronte ad una serie di molte 
macrolecole biologiche
 mischiate all’interno di un liquido. Nel caso degli eucarioti in questa miscela sono presenti anche gli 
organelli
, o quel che ne resta. Se ci interessa identificare, isolare o concentrare una particolare molecola in questa moltitudine è necessario utilizzare tecniche di purificazione. Fra esse la più semplice è la 
precipitazione
.





















Videolezione "Studio di funzione: il procedimento"

























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La precipitazione sfrutta la forza di gravità che permette a sostanze più grandi o più dense di cadere verso il basso più velocemente. La velocità di sedimentazione di una particella è infatti direttamente proporzionale alle sue dimensioni e alla differenza di densità fra la particella e il mezzo in cui si trova. Al contrario maggiore è la tendenza del mezzo a rallentare particelle in movimento (viscosità), minore sarà la velocità della particella. Questa relazione è definita dalla 
legge di Stokes
.
v = 2R
2
(d
p
-d
m
)g/
9
η
v
 = velocità delle particelle,
R
 = raggio della particella (assumendo sia sferica),
d
p
 = densità della perticella,
d
m
 = densità del mezzo,
g 
= accelerazione di gravità,
η
 = viscosità del mezzo.
Nel caso di sedimentazione spontanea, cioè senza alcun intervento di ulteriori forze, si parla di 
decantazione
. Le molecole si raccolgono sul fondo formando un 
pellet 
che va stratificandosi in modo da escludere il liquido in cui erano mescolate, chiamato quindi 
surnatante
. La decantazione è comunque un processo spesso troppo lento per tempistiche sperimentali, e non attuabile a campioni poco concentrati o con un piccoli volume. Per questo motivo si utilizza la 
centrifugazione
, che sfrutta la forza centrifuga imposta dal rotore dello strumento (una centrifuga da laboratorio) per accelerare il processo di sedimentazione. Modulando la velocità e le tempistiche della centrifuga è possibile dividere in maniera selettiva le varie macromolecole o i vari organelli. Questi ultimi, essendo più grandi e più densi, formeranno un pellet in minor tempo rispetto alle macromolecole. In seguito, con una micropipetta, si è in grado di raccogliere il surnatante e separarlo dal pellet.
Nel caso in cui si voglia precipitare in particolare proteine, si utilizza la tecnica del 
salting out
, che consiste nell’escludere le molecole di solvente, riducendo la solubilità della proteina stessa. A questo scopo vengono aggiunti alla soluzione sali come il solfato d’ammonio ( (NH
4
)2SO
4
 ), il cui utilizzo permette di ottenere protocolli di precipitazione specifici per le varie proteine. Ognuna di esse precipiterà soltanto intorno a una certa concentrazione di sale aggiunto, permettendo di separarla dalle altre in una 
soluzione
.

