Chemistry
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Identification des protéines d'immunité antibactérienne chez Escherichia coli à l'aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS et d'une analyse protéomique descendante
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Nous présentons ici un protocole pour l'identification rapide des protéines produites par des bactéries pathogènes séquencées génomiquement en utilisant la spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et l'analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. Les ions protéiques métastables se fragmentent en raison de l'effet acide aspartique et cette spécificité est exploitée pour l'identification des protéines.
Transcript
Le protocole démontre une méthode rapide d'identification des protéines bactériennes à l'aide de l'induction antibiotique et de la spectrométrie de masse. Le principal avantage de la technique est sa rapidité et sa simplicité. La préparation des échantillons n'est pas compliquée.
La technique peut être étendue à la caractérisation de toute bactérie pathogène, telle que les facteurs de virulence ou la résistance aux antibiotiques pour mieux informer le traitement approprié d'une infection bactérienne. Pour commencer, utilisez une boucle stérile d'un microlitre pour récolter les bactéries de colonies individuelles cultivées sur une plaque de gélose LB. Et transférer dans un tube de microcentrifugeuse à bouchon à vis à joint torique de deux millilitres contenant 300 microlitres d'eau de qualité HPLC.
Ensuite, vortexz brièvement le tube et abrasez les cellules par centrifugation, à une eau relique de 0,75 microlitre du surnageant de l'échantillon sur la cible MALDI en acier inoxydable, et laissez-le sécher. Superposer la tache de l'échantillon séché avec 0,75 microlitre d'une solution saturée d'acide sinapinique préparée dans 33% d'acétonitrile, 67% d'eau et 0,2% d'acide trifluoroacétique, et laisser sécher la tache. Une fois la tache séchée, chargez la cible dans le spectromètre de masse.
Ouvrez le logiciel d'acquisition et cliquez sur MS Linear Mode Acquisition Ou plage masse-charge et masse-charge des limites inférieure et supérieure dans leurs champs respectifs. Cliquez sur le point d'échantillonnage à analyser sur le modèle de cible MALDI. Appuyez ensuite sur le bouton gauche de la souris et faites glisser le curseur sur le point d'échantillonnage pour spécifier la région rectangulaire à échantillonner pour une ablation ou une ionisation au laser.
Relâchez le bouton de la souris pour lancer l'acquisition et collecter 1000 tirs laser pour chaque point d'échantillon. Si les ions ne sont pas détectés, augmentez l'intensité du laser en ajustant la barre d'échelle mobile sous l'intensité du laser jusqu'à ce que le signal d'ions protéiques soit détecté. Une fois l'acquisition du mode linéaire MS terminée, cliquez sur l'acquisition du mode MS/MS Reflectron.
Entrez la masse précurseur à analyser dans le champ Masse précurseur. Ensuite, entrez une largeur d'isolement en daltons dans la fenêtre Masse du précurseur pour le côté de masse faible et élevée de la masse du précurseur. Cliquez sur le bouton CID Off.
Cliquez ensuite sur le bouton Metastable Suppressor On. Ajustez l'intensité du laser à au moins 90% de sa valeur maximale en ajustant la barre d'échelle mobile comme démontré. Cliquez sur le point d'échantillon à analyser sur le modèle de cible MALDI, puis appuyez sur le bouton gauche de la souris et faites glisser le curseur sur le point d'échantillon pour spécifier la région rectangulaire à échantillonner pour l'ablation laser ou l'ionisation, relâchez le bouton de la souris pour lancer l'acquisition et collectez 10 000 tirs laser pour chaque point d'échantillon comme démontré.
Double-cliquez sur le fichier exécutable Protein Biomarker Seeker et la fenêtre de l'interface utilisateur graphique apparaîtra. Entrez la masse du biomarqueur protéique dans le champ Masse protéique mature et l'erreur de mesure de masse dans le champ Tolérance de masse. En option, cliquez sur le bouton Calculateur de masse protéique ionique b /y gratuit pour calculer la masse protéique à partir d'une paire d'ions fragments gratuits putatifs, et la fenêtre contextuelle de l'outil calculateur de masse protéique apparaîtra.
Entrez le rapport masse/charge de la paire d'ions fragments gratuits putatifs, cliquez sur le bouton Ajouter une paire et la masse protéique du calculateur apparaîtra. Copiez-collez cette valeur dans le champ Masse protéique mature et fermez la fenêtre de l'outil Calcul de masse protéique. Cliquez sur la case Définir la restriction des résidus.
Sélectionnez la longueur peptidique du signal terminal final, et la fenêtre contextuelle avec une échelle mobile et un curseur apparaîtra et déplacera le curseur vers la longueur de peptide de signal souhaitée. Si la longueur du peptide du signal n'est pas sélectionnée, une troncature de séquence sans restriction sera effectuée par le logiciel. Sous la condition d'ion fragment, sélectionnez résidus pour le clivage de l'épine dorsale polypeptidique en cliquant sur les cases d'un ou plusieurs résidus, D-E-N et / ou P.Et puis cliquez sur le bouton Entrer fragment Ions Plus One pour être recherché, et la page de fragment pop-up apparaîtra.
Cliquez ensuite sur le bouton Ajouter un fragment d'ion, et un champ déroulant apparaîtra pour chaque ion de fragment à entrer. Entrez les rapports masse par charge des ions fragments et leur tolérance masse par charge associée. Cliquez ensuite sur le bouton Enregistrer et fermer.
Dans la zone de droite de Combien d'ions fragments doivent être appariés, faites défiler pour sélectionner le nombre minimum d'ions fragments qui doivent être appariés pour l'identification, et sélectionnez les résidus de cystéine dans leur état oxydé. Si les protéines ne sont pas identifiées après la recherche, répétez la recherche avec des cystéines à l'état réduit. Sous la configuration du fichier, cliquez sur l'icône Sélectionner le fichier FASTA pour parcourir et sélectionner le fichier FASTA contenant les séquences de protéines in silico de la souche bactérienne précédemment construite.
Sélectionnez ensuite un dossier de sortie et créez un nom de fichier de sortie. Cliquez sur l'icône Exécuter la recherche sur les entrées de fichier. Une fenêtre contextuelle apparaîtra intitulée Confirmer les paramètres de recherche affichant les paramètres de recherche avant le lancement de la recherche.
Et si les paramètres de recherche sont corrects, cliquez sur Commencer la recherche. Si les paramètres sont incorrects, cliquez sur Annuler et entrez à nouveau les paramètres corrects. Une fois la recherche lancée, la fenêtre des paramètres se fermera et une nouvelle fenêtre contextuelle avec une barre de progression apparaîtra, montrant la progression de la recherche et un décompte en cours du nombre d'identifications trouvées.
Une fois la recherche terminée, la barre de progression sera fermée automatiquement et un résumé de la recherche sera affiché dans le champ de journal de l'interface utilisateur graphique avec une nouvelle fenêtre contextuelle affichant les identifications de protéines trouvées. Dans la présente étude, des cultures bactériennes ont été cultivées en LB avec deux concentrations différentes de mytomycine-C. Le spectre de masse de la culture bactérienne a grandi avec une concentration de mytomycine-C.
La protéine C du choc froid, la protéine E du choc froid et une protéine transmise par le plasmide de fonction inconnue ont été identifiées. L'ion protéique inconnu à 9780 a été analysé par MS / MS, et l'ion précurseur a été isolé avec une fenêtre de sélection d'ions temporels d'environ 100 daltons. L'ion fragment à la masse pour charger 9675,9 est un débordement de la dissociation de l'ion protéine métastable à 9655.
La séquence de la protéine d'immunité pour la colicine E3 contient des résidus basiques possibles de sites d'ionisation. Les ions fragments détectés à partir du clivage de l'épine dorsale polypeptidique, lorsque la forme réduite de cystéine a été utilisée pendant la recherche. La méthionine N-terminale est retirée en tant que modification post-traduction.
Lorsque la culture bactérienne a été cultivée à une concentration élevée de mytomycine-C, la protéine immunitaire de la bactériocine a été identifiée. Le pic inconnu à 9651 a été analysé par MS/MS, et l'ion précurseur a été isolé avec une fenêtre TIS plus étroite et asymétrique de moins 75 plus 60 daltons. La séquence de la protéine immunitaire de la bactériocine contient des résidus basiques possibles de sites d'ionisation.
Les ions fragments détectés à partir du clivage de l'épine dorsale polypeptidique, lorsque la forme réduite de cystéine a été utilisée pendant la recherche. avec les différentes concentrations d'antibiotiques, l'abondance relative des protéines peut varier. Et ceux-ci ont été analysés à l'aide de la spectrométrie de masse.
Lors de la récolte de cellules bactériennes, observez la morphologie des colonies et la croissance bactérienne en ce qui concerne les antibiotiques et la concentration. Une boucle d'un microlitre de cellules est nécessaire pour détecter les protéines.
TagsChimie numéro 171
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