3. Introduction
Au sein d'un établissement hospitalier, le laboratoire
représente un des secteurs majeurs et certainement
l'un des plus emblématiques . Le laboratoire se
compose de plusieurs services et est constitué d'une
diversité de dispositifs médicaux, les différents services
sont :
Service de biologie.
Service de biochimie.
Service d'Hématologie.
4. 1. Interaction Lumière – Matière
La spectrophotométrie est l'étude quantitative des interactions entre la lumière et la matière.
La lumière traverse une substance, elle est en partie transmise et en partie absorbée.
Si une substance absorbe dans le domaine visible (400nm<λ0<800nm), alors elle est colorée.
Eclairée par de la lumière blanche, elle prendra la couleur des radiations
qui parviennent à traverser, couleurs complémentaires des couleurs absorbées.
Lecture du cercle chromatique :
Les couleurs sont placées par ordre croissant de longueur d'onde le long du cercle.
Deux couleurs complémentaires se trouvent l'une en face de l'autre.
La spectrophotométrie est une méthode d'analyse qui permet de déterminer l'absorbance d'une substance chimique en solution.
L'absorbance d'une substance chimique dépend de la nature et de la concentration de cette substance ainsi que de la longueur
d'onde à laquelle on l'étudie.
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5. 1. Interaction Lumière – Matière
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Lumière
VISIBLE
Infra
rouge
Ultra
violet
Rayons
X
Rayons
Gamma
Rayonnement
radio
SPECTRE DES ONDES ÉLECTROMAGNÉTIQUES
6. 2. Définition et présentation du spectromètre
C'est un appareil mesurant la quantité de lumière absorbée ou bien transmise par une solution, pour des longueurs d'onde
données. Afin de permettre de tracer des courbes d'analyses spectrales utilisées pour étudier la composition de solutions, de
déterminer la concentration de solutions ou de suivre l'apparition d'une espèce chimique colorée au cours du temps.
Nous mesurons la valeur de l' « absorption » appelée plus précisément absorbance (appelée aussi densité optique) pour une
longueur d'onde choisie, notée A qui est définie par :
A = log10 (I0/Is)
avec I0 = intensité lumineuse du faisceau à l'entrée de la cuve et Is son intensité à la sortie de la cuve
A n'a pas d'unité.
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7. 2. Définition et présentation du spectromètre
Exemple d'utilisation du spectrophotomètre :
En biochimie
il est utilisé lors de la purification de protéines, pour les quantifier et déterminer leur niveau de pureté .
En médecine
L'analyse de différentes enzymes sanguines, dosage de la phosphatase alcaline : cholestase , infarctus du myocarde, hémolyse.
En chimie
L'analyse de l'absorption des solutions à une longueur d'onde donnée permet le dosage de ces solutions selon la loi de Beer-Lambert
Le suivi dans le temps de l'absorption est une méthode de caractérisation de la vitesse de réactions chimiques (cinétique).
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8. 2. Définition et présentation du spectromètre
Types des spectrophotomètres :
Spectrophotomètre monofaisceau –monocanal
Spectrophotomètre double faisceau –monocanal
Spectrophotomètre monofaisceau-multicanal :
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9. 2. Définition et présentation du spectromètre
• Spectrophotomètre monofaisceau –monocanal :
Il comporte un monochromateur ( en général un réseau par réflexion suivi d'une fente) qui permet de n'envoyer vers l'échantillon
qu'un intervalle de longueurs d'onde très étroit ( communément de l'ordre du nm )appelé la " bande passante ".
Grâce à un miroir réfléchissant, une partie de la puissance est envoyée vers un premier capteur, une partie égale vers l'échantillon.
Le faisceau transmis par l'échantillon absorbant est reçu par un capteur n°2 ( photodiode par exemple)
Types des spectrophotomètres :
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10. 2. Définition et présentation du spectromètre
• Spectrophotomètre double faisceau –monocanal :
Le faisceau issu de la source est envoyé vers un monochromateur puis vers un rupteur qui envoie alternativement le faisceau vers la
cuve de référence puis vers la cuve contenant l'échantillon.
Un système de miroir permet d'envoyer ces deux faisceaux vers le même capteur qui reçoit donc alternativement le faisceau de
puissance Po de référence et le faisceau de puissance P transmis par l'échantillon.
Le signal du capteur est alors traité par un microprocesseur qui permet d'afficher l'absorbance.
Types des spectrophotomètres :
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11. 2. Définition et présentation du spectromètre
• Spectrophotomètre monofaisceau-multicanal :
Ce type d'appareil ne comporte pas de monochromateur.
La lumière de la source est envoyée sur la cuve qui en transmet une partie vers un réseau.
Le réseau disperse cette lumière.
L'intérêt d'un tel dispositif est que la mesure de la puissance transmise se fait instantanément sur l'ensemble du spectre de longueurs
d'onde.
Types des spectrophotomètres :
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12. 2. Définition et présentation du spectromètre
Absorbance d'une solution
L'absorbance d'une solution, notée A, est une grandeur physique qui mesure la quantité de lumière absorbée en fonction de la
lumière qui traverse un échantillon de solution.
L'absorbance n'a pas d'unité et qui dépend de la longueur d'onde de la lumière et de la concentration de l'espèce colorée de la
solution.
L'absorbance d'une solution se mesure à l'aide d'un spectrophotomètre.
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14. 3. Utilisation du spectrophotomètre
Appareillage
Un spectrophotomètre UV-Visible est constitué :
- d'une source lumineuse ;
- d'une cellule de mesure ;
- d'un sélecteur de longueur d'onde ou monochromateur ;
- d'un système de mesure de l'intensité lumineuse ou détecteur ;
- d'un dispositif d'affichage et de traitement du signal
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15. 3. Utilisation du spectrophotomètre
- Sources lumineuses:
Beaucoup de spectromètres comportent deux lampes à usage de sources:
• une lampe à arc au deutérium sous moyenne pression pour la partie UV (<350 nm).
• une lampe à incandescence avec un filament de tungstène et une enveloppe de verre de silice (quartz) pour la partie visible du
spectre (à partir de 350 nm).
Appareillage
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16. 3. Utilisation du spectrophotomètre
- Sélecteur de longueurs d'onde
Le monochromateur, est un système qui permet d'extraire de la lumière émise par la source et de sélectionner les longueurs
d'onde du spectre. Il est constitué d'une fente d'entrée, d'un système de dispersion et d'une fente de sortie
Appareillage
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17. 3. Utilisation du spectrophotomètre
- Cellules
La cellule d'analyse se présente sous forme de parallélépipède à base carrée de 1 cm ayant deux faces opposées .
On utilise des cuves en plastique transparent ou en verre ordinaire , destinées aux mesures dans le domaine du visible et des
cuves en quartz pour les mesures dans le domaine de l'ultraviolet.
- Détecteurs
Le signal lumineux est convertit en signal électrique à l'aide d'un détecteur photo électrique. On utilise soit un tube
photomultiplicateur, soit un semi-conducteur (détecteur à transfert de charge ou photodiode au silicium).
Appareillage
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18. Principe
L'intensité de la lumière monochromatique émise (I0) est connue.
un faisceau parallèle de lumière (flux de lumière/ radiation lumineuse) monochromatique d'intensité I0 traversant une solution
absorbante de concentration C sur une longueur de cuve de 1 cm. L'intensité du faisceau émergeant est P .
On définit la transmittance par:
NB : Po ou I désigne la même notion : intensité
3. Utilisation du spectrophotomètre
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19. Principe
Une fois le détecteur mesure le flux lumineux en sortie. L'absorbance est directement affichée sur un écran du
spectrophotomètre.
3. Utilisation du spectrophotomètre
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20. Influence de la longueur d'onde
La courbe ci-dessous donne le spectre d'absorption d'une solution de diiode de concentration molaire 10–4 mol.L–1 (dans l'iodure
de potassium à 0,1 mol.L-1 ) en fonction de la longueur d'onde de la lumière monochromatique.
3. Utilisation du spectrophotomètre
L'absorbance dépend de la longueur d'onde de la lumière.
Le maximum d'absorption du diiode se situe autour de λ = 350 nm, ce qui explique la coloration jaune de la solution
(absorption dans l'ultraviolet).
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21. Réglage du zéro
pour que la diminution de l'intensité lumineuse ne provienne que de l'espèce
colorée à étudier, il faut éliminer toutes les autres causes d'absorption.
Pour s'affranchir de tous ses paramètres, on étalonne le spectrophotomètre
en effectuant le réglage du zéro avec une cuve contenant le solvant et les
espèces autres que celle à étudier. Cette solution s'appelle un blanc.
Variation de la longueur d'onde d'étude
Courbe absorbance
A partir d'une série de variation de longueur d'onde on trace la
courbe de l'absorbance du solution en fonction des longueurs d'onde
Afin de pouvoir calculer la concentration d'une solution , la mesure de
son absorbance est obligatoire . Il faut travailler en étapes :
4. Mesure de l'absorbance avec spectrophotomètre
Absorbance maximale A
En remarquant la courbe on détermine l'absorbance maximale ,
qu'on pourra placer pour vérifier la loi de Bert Lambert afin de
calculer la concentration
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22. 4. Mesure de l'absorbance avec spectrophotomètre
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23. max 650 nm
Spectre d'absorption Couleur absorbée
bande d'absorption
4. Mesure de l'absorbance avec spectrophotomètre
Exemple 1 :
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24. max 430 nm
bande d'absorption
Spectre d'absorption Couleur absorbée
4. Mesure de l'absorbance avec spectrophotomètre
Exemple 2 :
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25. 5. La loi de Beer-Lambert
La valeur de l'absorbance A dépend de la concentration C de l'espèce colorée.
Influence de la concentration
La courbe donne le spectre d'absorption d'une solution de diiode en fonction de sa concentration molaire, pour une longueur
d'onde fixée de λ = 400 nm.
L'absorbance de la solution est proportionnelle à la concentration en diiode jusqu'à une valeur limite de l'ordre de 10-1
mol.L-1.
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26. 5. La loi de Beer-Lambert
Loi de Beer-Lambert
l'absorbance dépend aussi de l'épaisseur l de l'échantillon traversée par le flux lumineux.
L'absorbance A est donc proportionnelle à la concentration C et à l'épaisseur l de la cuve.
La relation entre l'absorbance A et la concentration C en espèce colorée est :
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27. Conditions de validité de la loi de Beer-Lambert
la lumière utilisée est monochromatique
la concentration n'est pas trop élevée : c ≈ 10-2 mol.L-1 en général pour que les interactions entre molécules soient
négligeable
NB : Il faut travailler en lumière monochromatique car ε est fonction de la nature du corps absorbant, de la température et
de la longueur d'onde. Pour avoir une bonne sensibilité, il faut déterminer la longueur d'onde que la solution absorbe le
plus, c'est à dire la longueur d'onde dont la teinte est complémentaire de celle de la solution.
5. La loi de Beer-Lambert
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28. • la solution est violette
• La solution absorbe tout sauf le bleu et le rouge
• la solution absorbe le vert
6. Application
Permanganate de Potassium
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30. •
- Spectre du Permanganate de Potassium
Pour chaque longueur d'onde du spectre de
la lumière blanche, l'absorbance de la
solution.
On peut déterminer la valeur maximale de
l'absorption : λmax.
Pour le permanganate de potassium, on a
une valeur de 520 nm située dans le
domaine du vert.
Cela est normal puisque la solution de
permanganate apparaît magenta et absorbe
au maximum dans sa couleur
complémentaire qui est le vert.
6. Applications
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31. •
- Déterminer la concentration
A partir de l'absorbance, on peut déterminer la concentration en espèce colorée d'une
solution. Il y a plusieurs possibilités pour déterminer la concentration d'une solution
colorée :
L'échelle de teintes
En effet, plus la solution est concentrée en espèce colorée et plus elle est foncée. On le voit ici avec C1,
C2, C3, C4. La concentration augmente de droite à gauche.
On n'aura pas la valeur exacte de la concentration, mais juste un encadrement. Pour avoir la valeur
exacte, on utilise la loi de Beer-Lambert et l'absorbance.
6. Applications
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32. •
- Déterminer la concentration
Loi de Beer-Lambert
Pour chaque concentration, on mesure l'absorbance A1, A2, A3, A4.
On mesure l'absorbance en fixant la longueur.
Ensuite, on trace la courbe qui représente l'absorbance en fonction de la concentration et on obtient
une droite qui passe par l'origine. C'est la loi de Beer-Lambert.
6. Applications
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33. Conclusion
• La spectroscopie d'absorption dans les régions de
l'ultraviolet (UV) et le visible du spectre électromagnétique
a été largement utilisée dans l'analyse pharmaceutique et
biomédicale à des fins quantitatives pour la caractérisation
des médicaments, impuretés.
• la possibilité d'avoir la non fiabilité des résultats à causes
des effets de lumière parasite et le type de solvant
peuvent également conduire à un non-respect de la loi
Beer-Lambert.
• On ne peut pas utiliser le spectrophotomètre pour un
grand nombre d'échantillons.
Un spectrophotomètre est un appareil de laboratoire
Le laboratoire se compose de plusieurs services et est constitué d'une diversité de dispositifs médicaux, les différents services sont :
Service de biologie.
Service de parasitologie.
Service de biochimie.
Service d'Hématologie.
, elle prendra la couleur des radiations qui parviennent à traverser, couleurs complémentaires des couleurs absorbées. Il s'agit de transitions électroniques.
La spectrophotométrie permet l'étude de solutions colorées dans l'infrarouge (1 100 nm au maximum), dans le visible et dans l'ultraviolet (190 nm).
Chaque photosite du capteur ne reçoit qu'un très petit intervalle de longueur d'onde l ± d l sur lequel il mesure la puissance Po(l )lorsque la cuve contient la référence ou P(l ) lorsque la cuve contient l'échantillon.
Une solution colorée absorbe une partie de la lumière qui la traverse.
Sources : UV : lampe à deutérium
visible : lampe à incandescence
Sources : UV : lampe à deutérium
visible : lampe à incandescence
Sources : UV : lampe à deutérium
visible : lampe à incandescence
La lampe à arc xénon qui couvre tout le domaine de 200 à 1100nm, est utilisée pour les appareils de routine. Cette source plus énergétique est souvent utilisée. Elle est choisie comme source unique par les constructeurs lorsqu'il s'agit d'un appareil de routine allant de 300 à 1100nm.
Le spectrophotomètre est un appareil permettant de mesurer l'absorbance d'une solution, pour différentes longueurs d'ondes. Pour cela, il fait passer un rayon d'une longueur d'onde choisie à travers une cuve contenant la solution à étudier (figure I.16). Les molécules de la solution absorbent plus ou moins le rayon lumineux, on définit alors l'absorbance pour cette longueur d'onde
Plus la concentration diminue et plus le spectre s'étale. Donc, si on ne se met pas à la longueur d'onde du maximum d'absorption, au bout d'une certaine concentration on aura des valeurs qui seront trop faibles à exploiter