Avis juridique important

|

31972L0199

Kommissionens tredje direktiv 72/199/EEG av den 27 april 1972 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen

Europeiska gemenskapernas officiella tidning nr L 123 , 29/05/1972 s. 0006 - 0034 Finsk specialutgåva Område 3 Volym 4 s. 0184  Dansk specialutgåva: Serie III Område 1966-1972 s. 0071  Svensk specialutgåva Område 3 Volym 4 s. 0184  Engelsk specialutgåva: Serie III Område 1966-1972 s. 0074  "Grekisk specialutgåva" Område 03 Volym 8 s. 0007  Spansk specialutgåva: Område 03 Volym 6 s. 0008  Portugisisk specialutgåva: Område 03 Volym 6 s. 0008

KOMMISSIONENS TREDJE DIREKTIV av den 27 april 1972 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen (72/199/EEG)EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIVmed beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen,med beaktande av rådets direktiv av den 20 juli 1970(1) om införande av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiella foderkontrollen, särskilt artikel 2 i detta, ochmed beaktande av följande:I det nämnda direktivet krävs att den officiella foderkontrollen skall utföras med gemenskapsmetoder för provtagning och analys i syfte att kontrollera att produkterna uppfyller de krav som framgår av bestämmelser i lagar och andra författningar som gäller foders kvalitet och sammansättning.I kommissionens direktiv 71/250/EEG(2) av den 15 juni 1971 och 71/393/EEG(3) av den 18 november 1971 har redan ett antal gemenskapsmetoder för analys fastställts. Mot bakgrund av den utveckling som därefter skett bör en tredje metodsamling antas.De åtgärder som beslutas om i detta direktiv är förenliga med Ständiga foderkommitténs yttrande.HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.Artikel 1 Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkontrollen skall utföras med de metoder som beskrivs i bilaga 1 till detta direktiv då det gäller halter av stärkelse, råprotein, råprotein som är lösligt i pepsin och saltsyra, fri och total gossypol samt pepsinaktivitet.De allmänna bestämmelser som anges i del 1 (Inledning) av bilagan till kommissionens första direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen skall tillämpas på de metoder som beskrivs i bilaga 1 till det här direktivet.Artikel 2 Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkontrollen skall utföras med de metoder som beskrivs i bilaga 2 till detta direktiv då det gäller att upptäcka och identifiera antibiotika av tetracyklingruppen samt även vid bestämning av halter av klortetracyklin, oxytetracyklin, tetracyklin, oleandomycin, tylosin och virginiamycin i foder.De allmänna bestämmelser som anges i del 1 (Inledning) av bilagan till kommissionens första direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971, med undantag av sådana som gäller beredning av provet för analys, skall tillämpas på de metoder som beskrivs i bilaga 2 till det här direktivet.Artikel 3 Medlemsstaterna skall senast den 1 juli 1973 sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast underrätta kommissionen om detta.Artikel 4 Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.Utfärdat i Bryssel den 27 april 1972.På kommissionens vägnarS. L. MANSHOLTOrdförande(1) EGT nr L 170, 3.8.1970, s. 2.(2) EGT nr L 155, 12.7.1971, s. 13.(3) EGT nr L 279, 20.12.1971, s. 7.BILAGA 1 1. BESTÄMNING AV STÄRKELSE Polarimetrisk metod1. Syfte och räckviddMed denna metod kan halten av stärkelse samt av nedbrytningsprodukter av stärkelse med hög molekylvikt bestämmas i foder med undantag av sådana foder som innehåller betsnitsel, betmassa, torkad betblast eller torkade betblad, potatismos, vattenfri jäst, inulinrika produkter (t.ex. snitsel och mjöl av jordärtskockor) eller fettgrevar.2. PrincipMetoden omfattar två bestämningar. I den första behandlas det varma provet med utspädd saltsyra. Efter klarning och filtrering mäts lösningens optiska rotation polarimetriskt.I den andra extraheras provet med 40-procentig etanol. Efter att filtratet surgjorts med saltsyra, klarats och filtrerats mäts den optiska rotationen på samma sätt som vid den första bestämningen.Genom att multiplicera skillnaden mellan de båda mätningarna med en känd faktor erhålls provets stärkelsehalt.3. Reagens3.1 25-procentig (vikt/vikt) saltsyra, d: 1,1263.2 1,128-procentig (vikt/volym) saltsyraKoncentrationen måste kontrolleras genom titrering med natriumhydroxidlösning 0,1 M och 0,1-procentigt metylrött (vikt/volym) i 94-procentig etanol (volym/volym). 10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 M.3.3 Carrez-lösning I: lös upp 21,9 g zinkacetat Zn(CH3COO)2  7 2H2O och 3 g isättika i vatten. Fyll på vatten till 100 ml.3.4 Carrez-lösning II: lös upp 10,6 g kaliumferrocyanid K4 [Fe (CN)6]  7 3H2O i vatten. Fyll på vatten till 100 ml.3.5 40-procentig etanol (volym/volym), d: 0,948 vid 20°C.4. Utrustning4.1 250 ml Erlenmayerkolv med standardkoppling av matterat glas och återloppskylare4.2 Polarimeter eller sackarimeter5. Utförande5.1 Beredning av provetKrossa provet tills det är tillräckligt finfördelat för att helt kunna passera genom ett såll med 0,5 mm runda maskor.5.2 Bestämning av den totala optiska rotationen (P eller S) (se anmärkning 7.1)Väg upp 2,5 g av det krossade provet med 1 mg noggrannhet och placera det i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 25 ml saltsyra (3.2), skaka om så att provet fördelas jämnt och tillsätt ytterligare 25 ml saltsyra (3.2). Sänk ned kolven i kokande vattenbad under kraftig och jämn omskakning under de tre första minuterna för att förhindra agglomeratbildning. Vattenbadet måste innehålla så mycket vatten att det förblir vid kokpunkten då kolven sänks ned i det. Kolven får inte tas upp ur vattenbadet vid omskakningen. Ta upp kolven ur vattenbadet efter exakt 15 minuter, tillsätt 30 ml kallt vatten och kyl omedelbart till 20°C.Tillsätt 5 ml Carrez-lösning I (3.3) och skaka om under en minut. Tillsätt därefter 5 ml Carrez-lösning II (3.4) och skaka på nytt om under en minut. Fyll på vatten till full volym, homogenisera och filtrera. Om filtratet inte är fullständigt klart (vilket är sällsynt) upprepas bestämningen med en större kvantitet Carrez-lösning I och II, till exempel 10 ml.Mät lösningens optiska rotation i ett 200 mm rör med polarimetern eller sackarimetern.5.3 Bestämning av den optiska rotationen (P'm eller S'm) hos ämnen som är lösliga i 40-procentig etanolVäg upp 5 g av provet med 1 mg noggrannhet, placera det i en 100 ml mätkolv och tillsätt cirka 80 ml etanol (3.5) (se anmärkning 7.2). Låt kolven stå en timme i rumstemperatur och skaka under denna tid om kraftigt vid sex tillfällen så att provet blandas väl med etanolen. Fyll på etanol (3.5) till full volym, homogenisera och filtrera.Flytta med pipett 50 ml av filtratet (= 2,5 g av provet) till en 250 ml Erlenmayerkolv, tillsätt 2,1 ml saltsyra (3.1) och skaka om kraftigt. Anslut en återloppskylare till Erlenmayerkolven som därefter sänks ned i kokande vattenbad. Ta efter exakt 15 minuter upp Erlenmayerkolven ur vattenbadet, flytta innehållet till en 100 ml mätkolv (skölj med litet kallt vatten) och kyl ned till 20°C.Klargör med Carrez-lösning I (3.3) och II (3.4), fyll på vatten till full volym, homogenisera, filtrera och mät den optiska rotationen på det sätt som anges i 5.2 andra och tredje styckena.6. ResultatberäkningStärkelsehalten uttryckt i procent av provet beräknas på följande sätt:6.1 Polarimetrisk mätningProcent stärkelse = >NUM>2000 (P-P')>DEN>[á]D20°där:P = den totala optiska rotationen i graderP' = optisk rotation i grader för ämnen som är lösliga i 40-procentig etanol[á]D20° = ren stärkelses specifika optiska rotation. De konventionellt accepterade värdena för denna faktor är:+ 185,9°: risstärkelse+ 195,4°: potatisstärkelse+ 184,6°: majsstärkelse+ 182,7°: vetestärkelse+ 181,5°: kornstärkelse+ 181,3°: havrestärkelse+ 184,0°: andra typer av stärkelse och stärkelsemixer i foderblandningar.6.2 Sackarimetrisk mätningProcent stärkelse = >NUM>2000>DEN>[á]D20°7 >NUM>(2N  7 0,665) (S-S')>DEN>100 = >NUM>26,6 N (S-S')>DEN>[á]D20°där:S = total optisk rotation i sackarimetriska graderS' = optisk rotation i sackarimetriska grader för ämnen som är lösliga i 40-procentig etanolN = sackarosvikt i gram i 100 ml vatten som ger en optisk rotation på 100 sackarimetriska grader i ett 200 mm rör. Vikten varierar på följande sätt beroende på vilken typ av sackarimeter som används:16,29 g för franska sackarimetrar,26,00 g för tyska sackarimetrar,20,00 g för övriga sackarimetrar.[á]D20° = ren stärkelses specifika optiska rotation (se 6.1)6.3 RepeterbarhetSkillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 0,4, absolutvärde, om stärkelsehalten är under 40 % och 1 %, relativvärde, om stärkelsehalten är 40 % eller högre.7. Anmärkningar7.1 Om provet innehåller mer än 6 % karbonater, beräknat som kalciumkarbonat, måste dessa avlägsnas genom behandling med den exakt beräknade mängd utspädd svavelsyra som krävs, innan den totala optiska rotationen bestäms.7.2 Då det gäller produkter med hög laktoshalt, som mjölkserum i pulverform och skummjölkspulver, förfar man på följande sätt efter att 80 ml etanol (3.5) har tillsatts: Anslut en återloppskylare till kolven som nedsänks i 50° C vattenbad under 30 minuter. Låt svalna och fortsätt analysen enligt anvisningarna i 5.3.2. BESTÄMNING AV RÅPROTEIN 1. Syfte och räckviddMed denna metod kan råproteinhalten i foder bestämmas på konventionellt sätt på grundval av kvävehalten som bestäms enligt Kjeldahlmetoden.2. PrincipProvet bryts ned genom våtförbränning. Den sura lösningen alkaliseras med natriumhydroxidlösning. Den ammoniak som frigörs destilleras av och insamlas i en uppmätt mängd svavelsyra varefter överskottet svavelsyra titreras med natriumhydroxidlösning.3. Reagens3.1 Kaliumsulfat pa3.2 Katalysator: kopparoxid CuO pa eller kristalliserat kopparsulfat CuSO4  7 5H2O pa eller kvicksilver eller kvicksilveroxid HgO pa3.3 Zinkgranulat pa3.4 Svavelsyra pa, d: 1,843.5 Svavelsyra 0,1 M3.6 Svavelsyra 0,5 M3.7 Metylröttindikator: lös upp 300 mg metylrött i 100 ml 95 96-procentig etanol (volym/volym)3.8 40-procentig natriumhydroxidlösning (vikt/volym)3.9 Natriumhydroxidlösning 0,1 M3.10 Natriumhydroxidlösning 0,25 M3.11 Mättad natriumsulfidlösning pa3.12 8-procentig natriumtiosulfatlösning (vikt/volym), Na2S2O3  7 5H2O pa3.13 Pimpstensgranulat som saltsyresköljts och föraskats4. UtrustningApparatur för nedbrytning genom förbränning samt destillering enligt Kjeldahlmetoden (se anmärkning 7.1)5. Utförande5.1 NedbrytningVäg upp 1 g av provet med 1 mg noggrannhet och placera detta i nedbrytningsapparatens kolv. Tillsätt 10 g kaliumsulfat (3.1), en lämplig mängd katalysator (3.2) (0,3 0,4 g kopparoxid eller 0,9 1,2 g kopparsulfat eller en droppe kvicksilver eller 0,6 0,7 g kvicksilveroxid), 25 ml svavelsyra (3.4) och något pimpstensgranulat (3.13). Homogenisera. Upphetta kolven - först måttligt och under omskakning då och då tills massan har karboniserats och skummet försvunnit, därefter intensivare tills vätskan kommit i konstant kokning. Se till att kolvens väggar inte blir överhettade och att organiska partiklar inte fastnar på dem. När lösningen har blivit klar och färglös (eller ljusgrön om en kopparbaserad katalysator används) fortsätts kokningen under en timme, varefter lösningen får svalna.5.2 DestilleringTillsätt försiktigt 250 350 ml vatten under ständig omrörning så att sulfaterna löses upp fullständigt. Låt svalna. Tillsätt något zinkgranulat (3.3).Tillför, efter att mängden mätts upp exakt, 25 ml svavelsyra 0,1 M (3.5) eller 0,5 M (3.6), beroende på den antagna kvävehalten (se anmärkning 7.2), till destilleringsapparatens uppsamlingskolv samt tillsätt några droppar metylröttindikator (3.7).Förbind kolven med destilleringsapparatens kylare och sänk ned kylarens slutstycke minst 1 cm (se anmärkning 7.3) i vätskan i uppsamlingskolven. Häll långsamt 100 ml 40-procentig natriumhydroxidlösning (3.8) i kolven genom dropptratten. Om en kvicksilverbaserad katalysator används, tillsätts också antingen 10 ml natriumsulfidlösning (3.11) eller 25 ml natriumtiosulfatlösning (3.12).Upphetta kolven så att cirka 150 ml vätska destilleras på 30 minuter. Kontrollera mot slutet av denna tid det erhållna destillatets pH med lackmuspapper. Om reaktionen är basisk fortsätts destilleringen. Avbryt när destillatet är neutralt på lackmuspapper. Under destilleringen skall färgreaktionen iakttas och innehållet i kolven skakas om då och då. Om vätskan blir gul tillsätts omedelbart en exakt uppmätt volym svavelsyra 0,1 M (3.5) eller 0,5 M (3.6).5.3 TitreringÖverskottet svavelsyra titreras i uppsamlingskolven med natriumhydroxidlösning 0,1 M (3.9) eller 0,25 M (3.10), beroende på vilken koncentration av svavelsyra som använts, tills färgen blir blekgul.5.4 Verifiering av metodenFör att fastställa om reagensen är fria från kväve utförs ett blankprov (destillering och titrering) med uteslutande av analysprovet. För kontroll av metodens tillförlitlighet utförs analysen (nedbrytning, destillering och titrering) på 1,5 2,0 g acetanilid pa (smältpunkt 114°C; % N: 10,36) med tillsats av 1 g kvävefri sackaros. 1 g acetanilid förbrukar 14,80 ml svavelsyra 0,5 M.6. ResultatberäkningFastställ hur stor volym svavelsyra som förbrukats. 1 ml svavelsyra 0,1 M motsvarar 1,4 mg kväve. Multiplicera kvävemängden med faktorn 6,25. Uttryck resultatet i procent av provet.RepeterbarhetSkillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga:- 0,2, absolutvärde, för råproteinhalter under 20 %,- 1,0 %, relativvärde, för halter på lägst 20 % och högst 40 %,- 0,4, absolutvärde, för halter över 40 %.7. Anmärkningar7.1 Apparattyper som kräver att materialet flyttas mellan nedbrytning och destillering får användas. Om sådana apparater används måste flyttningen ske utan förlust av material.7.2 Då det gäller produkter med låg kvävehalt kan volymen svavelsyra 0,1 M som skall placeras i uppsamlingskolven minskas till 10 15 ml, om så är nödvändigt, varefter vatten fylls på till 25 ml.7.3 Om destilleringsapparatens kolv inte är försedd med dropptratt, tillsätts natriumhydroxiden omedelbart innan kolven ansluts till kylaren, varvid vätskan skall hällas långsamt längs med kylarens väggar så att den inte blandas med syralösningen.3. BESTÄMNING AV RÅPROTEIN SOM LÖSES AV PEPSIN OCH SALTSYRA 1. Syfte och räckviddMed denna metod kan man fastställa hur stor del råprotein som under vissa definierade förhållanden löses av pepsin och saltsyra. Metoden kan tillämpas på alla foder.2. PrincipProvet upphettas under 48 timmar vid 40°C i en lösning av pepsin och saltsyra. Suspensionen filtreras och filtratets kvävehalt fastställs enligt metoden för bestämning av råprotein.3. Reagens3.1 Saltsyra, d: 1,1253.2 Saltsyra 0,075 M3.3 2,0 E/mg pepsin. Pepsinaktiviteten definieras i metodbeskrivningen i del 4 av denna bilaga och måste fastställas enligt denna metod.3.4 Cirka 0,02-procentig (vikt/volym) nyberedd lösning av pepsin i saltsyra (3.2); aktivitet: 400 E/l3.5 Skumhämmande emulsion (t.ex. silikon)3.6 Samtliga reagens som upptas i förteckningen i punkt 3 av metoden för bestämning av råprotein4. Utrustning4.1 Vattenbad eller inkubator inställd på 40°C ± 1°C4.2 Kjeldahlapparatur för nedbrytning och destillering5. Utförande5.1 Beredning av lösningen (se anmärkning 7.2)Väg upp 2 g av provet med 1 mg noggrannhet och placera det i en 500 ml mätkolv. Tillsätt 450 ml lösning av pepsin i saltsyra (3.4) som i förväg upphettats till 40°C och skaka om för att förhindra agglomeratbildning. Kontrollera att suspensionens pH är lägre än 1,7. Placera kolven i vattenbadet eller inkubatorn (4.1) och behåll den där under 48 timmar. Skaka om efter 8, 24 och 32 timmar. Tillsätt efter 48 timmar 15 ml saltsyra (3.1), kyl till 20°C, fyll på vatten till full volym och filtrera.5.2 NedbrytningTa 250 ml av filtratet och placera det i destilleringsapparatens (4.2) kolv. Tillsätt de reagens som är nödvändiga för nedbrytningen enligt anvisningarna i metoden för bestämning av råprotein (andra meningen i punkt 5.1). Homogenisera och koka upp. Om det bildas skum tillsätts några droppar skumhämmande emulsion (3.5). Låt fortsätta att koka kraftigt tills vattnet har förångats nästan fullständigt. Sänk värmen och avlägsna noggrant de sista resterna av vatten.När lösningen blivit klar och färglös (eller ljusgrön om en kopparbaserad katalysator används) fortsätts kokningen under ytterligare en timme. Låt svalna.5.3 Destillering och titreringUtförs enligt anvisningarna i metoden för bestämning av råprotein (punkt 5.2 och 5.3).5.4 BlankprovUtför ett blankprov enligt samma metod men med uteslutande av analysprovet.6. ResultatberäkningSubtrahera den volym svavelsyra som förbrukats i blankprovet från den som förbrukats av analysprovet. 1 ml svavelsyra 0,1 M motsvarar 1,4 mg kväve.Multiplicera kvävemängden med faktorn 6,25. Uttryck resultatet i procent av provet.RepeterbarhetSkillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga:- 0,4, absolutvärde, för halter under 20 %,- 2,0 %, relativvärde, för halter på lägst 20 % och högst 40 %,- 0,8, absolutvärde, för halter över 40 %.7. Anmärkningar7.1 De värden som erhålls med denna metod har inget direkt samband med nedbrytbarhet in vivo.7.2 Produkter med en olje- eller fetthalt över 10 % måste först avfettas genom extraktion med petroleumeter (kokpunkt 40 60°C).4. BERÄKNING AV PEPSINAKTIVITET 1. Syfte och räckviddMed denna metod är det möjligt att fastställa aktiviteten hos det pepsin som används vid bestämning av råprotein som löses av pepsin och saltsyra.2. PrincipHemoglobin behandlas med pepsin under definierade förhållanden i ett saltsyremedium. Den del av proteinet som inte hydrolyseras fälls ut i triklorättiksyra. Natriumhydroxid och Folin-Ciocalteureagens tillsätts till filtratet. Den optiska densiteten hos denna lösning mäts vid 750 nm och den motsvarande kvantiteten tyrosin avläses från en kalibreringskurva.Definition: Definitionen av pepsinenheten är den kvantitet av detta enzym som, under de förutsättningar som gäller för denna metod, per minut frigör en kvantitet hydroxiarylgrupper som, efter att ha färgats av Folin-Ciocalteureagensen, har en optisk densitet som motsvarar den optiska densiteten hos en mikromol tyrosin som färgats på samma sätt.3. Reagens3.1 Saltsyra 0,2 M3.2 Saltsyra 0,06 M3.3 Saltsyra 0,025 M3.4 5-procentig triklorättiksyrelösning (vikt/volym)3.5 Natriumhydroxidlösning 0,5 M3.6 Folin-Ciocalteureagens. Placera 100 g natriumvolframit (Na2WO4  7 2H2O), 25 g natriummolybdat (Na2MoO4  7 2H2O) och 700 ml vatten i en tvåliters rundbottnad kolv som är försedd med standardanslutning av matterat glas. Tillsätt 50 ml fosforsyra (d: 1,71) och 100 ml koncentrerad saltsyra (d: 1,19), anslut en återloppskylare till kolven, koka upp och låt koka sakta under 10 timmar. Låt svalna, avlägsna återloppskylaren, tillsätt 175 g litiumsulfat (Li2SO4  7 2H2O), 50 ml vatten och 1 ml brom. Koka under 15 minuter för att avlägsna överskottet brom.Låt svalna, flytta lösningen till en enliters mätkolv, fyll på vatten till full volym, homogenisera och filtrera. Ingen grönaktig färgton får finnas kvar. Späd före användning ut en del reagens med två delar vatten.3.7 Hemoglobinlösning: Väg upp en mängd hemoglobin (cirka 2 g proteinsubstrat, bestämt enligt Anson) som motsvarar 354 mg kväve(1) och placera detta i en 200 ml kolv som är försedd med standardanslutning av matterat glas. Tillsätt några ml saltsyra (3.2), anslut kolven till vakuumpumpen och skaka om tills hemoglobinet har lösts fullständigt. Frigör vakuumet och tillsätt under omskakning saltsyra (3.2) till 100 ml. Bered denna lösning omedelbart före användandet.3.8 Standardtyrosinlösning: lös upp 181,2 mg tyrosin i saltsyra (3.1) och fyll på med samma syra till 1 liter (lagerhållen lösning). Ta 20,0 ml av denna lösning och späd med saltsyra (3.1) till 100 ml. 1 ml av denna lösning innehåller 0,2 mikromol tyrosin.4. Utrustning4.1 Vattenbad inställt på 25°C ± 0,1°C med ultratermostat4.2 Spektrofotometer4.3 Kronometer, högsta avvikelse: 1 sekund4.4 pH-mätare5. Utförande5.1 Beredning av lösningen (se anmärkning 7.1)Lös upp 150 mg pepsin i 100 ml saltsyra (3.2). Överför med pipett 2 ml av lösningen till en 50 ml mätkolv och fyll på saltsyra (3.3) till full volym. pH-mätaren måste visa ett värde på 1,6 ± 0,1. Sänk ned kolven i vattenbadet (4.1).5.2 HydrolysÖverför med pipett 5,0 ml hemoglobinlösning (3.7) till ett provrör, upphetta till 25°C i vattenbadet (4.1), tillsätt 1,0 ml av den pepsinlösning som erhållits enligt punkt 5.1 och blanda med hjälp av en glasstav som är tjockare i ena ändan med cirka 10 pendelrörelser. Lämna provröret i vattenbadet vid 25°C under exakt 10 minuter, räknat från den tid då pepsinlösningen tillsattes (tidslängd och temperatur måste iakttas noggrant). Tillsätt därefter 10,0 ml triklorättiksyrelösning (3.4) som i förväg upphettats till 25°C, homogenisera och filtrera genom ett torrt filter.5.3 Färgutveckling och mätning av optisk densitetÖverför med pipett 5,0 ml av filtratet till en 50 ml Erlenmayerkolv, tillsätt 10,0 ml natriumhydroxidlösning (3.5) samt, under ständig omskakning, 3,0 ml utspätt Folin-Ciocalteureagens (3.6). Bestäm efter 5 10 minuter lösningens optiska densitet mot vatten med spektrofotometer vid 750 nm i celler som är 1 cm tjocka.5.4 BlankprovUtför vid varje bestämning ett blankprov enligt följande:Överför med pipett 5,0 ml hemoglobinlösning (3.7) till ett provrör, upphetta till 25°C i vattenbadet (4.1), tillsätt 10,0 ml triklorättiksyrelösning (3.4) som i förväg upphettats till 25°C, homogenisera och tillsätt därefter 1,0 ml av den pepsinlösning som erhållits enligt punkt 5.1. Blanda med en glasstav och lämna provröret i vattenbadet (4.1) vid 25°C under exakt 10 minuter. Homogenisera och filtrera genom ett torrt filter. Fortsätt enligt punkt 5.3.5.5 KalibreringskurvaI 50 ml Erlenmayerkolvar placeras provmängder på 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 och 5,0 ml standardtyrosinlösning (3.8), motsvarande 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 respektive 1,0 mikromol tyrosin. Komplettera serien med en tyrosinfri referenslösning. Fyll på saltsyra (3.1) till 5,0 ml. Tillsätt 10,0 ml natriumhydroxidlösning (3.5) samt, under ständig omskakning, 3,0 ml utspätt Folin-Ciocalteureagens (3.6). Mät den optiska densiteten på det sätt som anges i punkt 5.3 sista meningen. Rita kalibreringskurvan genom att föra in värdena för optisk densitet vid respektive kvantitet tyrosin.6. ResultatberäkningAvläs från kalibreringskurvan den kvantitet tyrosin i mikromol som motsvarar den färgade lösningens optiska densitet efter korrigering med blankvärdet.Pepsinaktiviteten i mikromol hos tyrosin vid 25°C, per mg och minut, beräknas med följande formel:Enheter per mg (E/mg) = >NUM>0,32 a>DEN>pdär:a = kvantitet tyrosin i mikromol avläst från kalibreringskurvanp = vikt i mg av det pepsin som tillsatts enligt punkt 5.27. Anmärkningar7.1 Den kvantitet pepsin som skall lösas upp måste vara sådan att en optisk densitet av 0,35 ± 0,035 erhålls vid den slutliga fotometriska mätningen.7.2 Två enheter per mg enligt denna metod motsvarar:3,64 Anson-millienheter/mg (mikromol tyrosin/mg/min vid 35,5°C), eller36 400 handelsenheter/g (mikromol tyrosin/g/10 min vid 35,5°C).5. BESTÄMNING AV FRI OCH TOTAL GOSSYPOL 1. Syfte och räckviddMed denna metod kan halter av fri gossypol, total gossypol och kemiskt besläktade ämnen bestämmas i bomullsfrö, bomullsfrömjöl och bomullsfrökakor samt i foderblandningar som innehåller sådana ämnen, om halterna överstiger 20 ppm.2. PrincipGossypolen extraheras under närvaro av 3-aminopropan-1-ol, antingen med en blandning av propan2-ol och hexan (vid bestämning av fri gossypol) eller med dimetylformamid (vid bestämning av total gossypol). Gossypolen omvandlas med anilin till gossypol-dianilin och detta ämnes optiska densitet mäts vid 440 nm.3. Reagens3.1 Propan-2-ol/hexanblandning: blanda 60 (volym)delar propan-2-ol pa med 40 delar n-hexan.3.2 Lösningsmedel A: placera i en enliters mätkolv cirka 500 ml propan-2-ol/hexanblandning (3.1), 2 ml 3-aminopropan-1-ol, 8 ml isättika och 50 ml vatten. Fyll på med propan-2-ol/hexanblandningen (3.1) till full volym. Detta reagens är hållbart i en vecka.3.3 Lösningsmedel B: Överför med pipett 2 ml 3-aminopropan-1-ol och 10 ml isättiksyra till en 100 ml mätkolv. Kyl till rumstemperatur och fyll på N,N-dimetylformamid till full volym. Detta reagens är hållbart i en vecka.3.4 Anilin pa: Om den optiska densiteten vid blankprovet överstiger 0,022, destilleras anilinet över zinkpulver och de första och sista tio procenten av destillatet avlägsnas. Om detta reagens kylförvaras i en brun, proppförsluten glaskolv är det hållbart i flera månader.3.5 Standardgossypollösning A: placera 27,9 mg gossypolacetat i en 250 ml mätkolv. Lös upp och fyll på till full volym med lösningsmedel A (3.2). Överför med pipett 50 ml av denna lösning till en 250 ml mätkolv och fyll på lösningsmedel A till full volym. Gossypolhalten i denna lösning är 0,02 mg per ml. Låt lösningen stå en timme i rumstemperatur innan den används.3.6 Standardgossypollösning B: placera 27,9 mg gossypolacetat i en 50 ml mätkolv. Lös upp och fyll på till full volym med lösningsmedel B (3.3). Gossypolhalten i denna lösning är 0,5 mg per ml.Standardgossypollösningarna A och B förblir stabila under 24 timmar om de skyddas från ljus.4. Utrustning4.1 Blandare (tumlare): cirka 35 varv per minut4.2 Spektrofotometer5. Utförande5.1 TestprovHur stor mängd som skall användas för testprovet beror på den antagna gossypolhalten hos provet. Det är fördelaktigt att arbeta med ett litet testprov och en relativt stor analysmängd av filtratet så att en så stor mängd gossypol erhålls att en exakt fotometrisk mätning blir möjlig. Vid bestämning av fri gossypol i bomullsfrö, bomullsfrömjöl och bomullsfrökakor bör testprovet inte väga mer än 1 g; då det gäller foderblandningar kan det gå upp till 5 g. I de flesta fall är det lämpligt att analysmängden uppgår till 10 ml; den bör innehålla 50 100 µg gossypol. Vid bestämning av total gossypol bör testprovet väga mella 0,5 och 5 g så att 2 ml av filtratet innehåller 40 200 µg gossypol.Analysen skall utföras vid rumstemperatur, d.v.s. cirka 20°C.5.2 Bestämning av fri gossypolPlacera testprovet i en 250 ml kolv med hals av matterat glas efter att kolvens botten täckts med krossat glas. Tillsätt med pipett 50 ml lösningsmedel A (3.2), tillslut kolven och blanda under en timme i blandaren. Filtrera genom torrt filter och samla upp filtratet i en liten kolv med hals av matterat glas. Täck under filtreringen tratten med klockglas. Överför med pipett identiska analysmängder av filtratet med en gossypolhalt av 50 100 µg till två 25 ml mätkolvar (A och B). Fyll, om så är nödvändigt, på lösningsmedel A (3.2) upp till 10 ml. Fyll därefter på innehållet i kolv A upp till full volym med propan-2-ol/hexanblandningen (3.1). Denna lösning skall användas som referenslösning för mätvärdena av provlösningen.Överför med pipett 10 ml lösningsmedel A (3.2) till två andra 25 ml mätkolvar (C och D). Fyll på innehållet i kolv C till full volym med propan-2-ol/hexanblandningen (3.1). Denna lösning skall användas som referenslösning för mätvärdena av blankprovslösningen.Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till kolvarna D och B. Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad så att färgen framträder. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till full volym, homogenisera och låt stå under en timme.Fastställ blankprovlösningens (D) optiska densitet genom jämförelse med referenslösningen (C) samt provlösningens (B) optiska densitet genom jämförelse med referenslösningen (A) i spektrofotometern vid 440 nm med 1 cm glasceller.Subtrahera blankprovlösningens optiska densitet från provlösningens (korrigerad optisk densitet). Beräkna utifrån det erhållna värdet halten fri gossypol enligt anvisningarna i punkt 6.5.3 Bestämning av total gossypolPlacera ett testprov som innehåller 1 5 mg gossypol i en 50 ml mätkolv och tillsätt 10 ml lösningsmedel B (3.3). Förbered samtidigt ett blankprov genom att fylla 10 ml lösningsmedel B (3.3) i en annan 50 ml mätkolv. Upphetta de två kolvarna under 30 minuter över kokande vattenbad. Kyl till rumstemperatur och fyll på innehållet i de båda kolvarna till full volym med propan-2-ol/hexanlösningen (3.1). Homogenisera och låt sedimentera under 10 15 minuter; filtrera därefter och samla upp filtraten i kolvar med halsar av matterat glas.Överför med pipett 2 ml av provfiltratet till var och en av två 25 ml mätkolvar samt 2 ml av blankprovsfiltratet till var och en av två andra 25 ml kolvar. Fyll på innehållet i den ena kolven i varje par till 25 ml med propan-2-ol/hexanblandningen (3.1). Dessa lösningar skall användas som referenslösningar.Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till var och en av de båda andra kolvarna. Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad så att färgen framträder. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan2-ol/hexanblandning (3.1) till 25 ml, homogenisera och låt stå under en timme.Bestäm den optiska densiteten enligt anvisningarna i punkt 5.2 för fri gossypol. Beräkna utifrån det erhållna värdet halten total gossypol enligt anvisningarna i punkt 6.6. ResultatberäkningResultaten kan beräknas antingen utifrån den specifika optiska densiteten (6.1) eller med utnyttjande av en kalibreringskurva (6.2).6.1 Utifrån specifik optisk densitetDe specifika optiska densiteterna är under de angivna förutsättningarna:fri gossypol: E >NUM>1 %>DEN>1 cm = 625total gossypol: E >NUM>1 % >DEN>1 cm = 600Provets halt fri eller total gossypol beräknas med följande formel:% gossypol = >NUM>E  7 1250 >DEN>E >NUM>1 % >DEN>1 cm 7 p  7 adär:E = korrigerad optisk densitet, bestämd enligt anvisningarna i punkt 5.2,p = testprovets vikt i g,a = analysmängd filtrat i ml.6.2 Utifrån kalibreringskurva6.2.1 Fri gossypolFörbered två serier om vardera fem 25 ml mätkolvar. Överför med pipett mängder på 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 och 10,0 ml standardgossypollösning A (3.5) till vardera av de båda serierna. Fyll på lösningsmedel A (3.2) till 10 ml. Komplettera varje serie med en 25 ml mätkolv som endast innehåller 10 ml lösningsmedel A (3.2) (blankprov).Fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till 25 ml i kolvarna i den första serien (även i den kolv som är avsedd för blankprovet) (referensserie).Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till varje kolv i den andra serien (även den kolv som är avsedd för blankprovet). Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad så att färgen framträder. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till full volym, homogenisera och låt stå under en timme (standardserie).Bestäm, enligt anvisningarna i punkt 5.2, den optiska densiteten hos lösningarna i standardserien genom jämförelse med motsvarande lösningar i referensserien. Rita kalibreringskurvan genom att föra in de optiska densiteterna vid motsvarande kvantitet gossypol (i µg).6.2.2 Total gossypolFörbered sex 50 ml mätkolvar. I den första kolven placeras 10 ml lösningsmedel B (3.3) och i de övriga 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 respektive 10,0 ml standardgossypollösning B (3.6). Fyll på lösningsmedel B (3.3) upp till 10 ml i varje kolv. Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till full volym och homogenisera.Placera 2,0 ml av dessa lösningar vardera i två serier om sex 25 ml mätkolvar. Fyll kolvarna i den första serien med propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till 25 ml (referensserie).Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till var och en av kolvarna i den andra serien. Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till full volym, homogenisera och låt stå under en timme (standardserie).Bestäm, enligt anvisningarna i punkt 5.2, den optiska densiteten hos lösningarna i standardserien genom jämförelse med motsvarande lösningar i referensserien. Rita kalibreringskurvan genom att föra in de optiska densiteterna vid motsvarande kvantitet gossypol (i µg).6.3 RepeterbarhetSkillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga:- 15 %, relativvärde, för gossypolhalter under 500 ppm,- 75 ppm, absolutvärde, för halter på minst 500 ppm och högst 750 ppm,- 10 %, relativvärde, för halter över 750 ppm.(1) Bestäm kvävehalten med halvmikro-Kjeldahlmetod (teoretisk halt: 17,7 % kväve).BILAGA 2 1. PÅVISANDE OCH IDENTIFIERING AV ANTIBIOTIKA AV TETRACYKLINGRUPPEN 1. Syfte och räckviddMed denna metod är det möjligt att påvisa och identifiera antibiotika av tetracyklingruppen i foder som innehåller lägst 0,1 ppm antibiotika samt i koncentrat och premixer.2. PrincipProvet extraheras med en blandning av metanol och saltsyra. Extraktet och referenslösningarna undergår stigande papperskromatografi. Antibiotikan påvisas och identifieras genom att dess Rf-värden jämförs med standardsubstansernas, antingen genom fluorescens i UV-ljus (hög halt antibiotika) eller genom bioautografi på ett agarsubstrat som inokulerats med B. cereus.3. Reagens och odlingssubstrat3.1 Buffertlösning, pH 3,5Citronsyremonohydrat pa 10,256 gDinatriumvätefosfat Na2HPO4  7 2H2O pa 7,45 gAceton pa 300 mlDestillerat vatten till 1000 ml3.2 Fosfatbuffertlösning, pH 5,5Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 130,86 gDinatriumvätefosfat Na2HPO4  7 2H2O pa 6,947 gDestillerat vatten till 1000 ml3.3 Eluant I: blandning av ren nitrometan/ren kloroform/1,3-diklorpropan-2-ol; volymproportion: 20/10/1,5; bereds omedelbart före användning3.4 Eluant II: blandning av ren nitrometan/ren kloroform/2-pikolin; volymproportion: 20/10/3; bereds omedelbart före användning3.5 Blandning ren metanol/saltsyra (d: 1,19): volymproportion 98/23.6 Saltsyra 0,1 M3.7 Ammoniak, d: 0,913.8 Standardsubstanser: klortetracyklin, oxytetracyklin, tetracyklin, vilkas aktivitet uttrycks som väteklorid3.9 Mikroorganism: B. cereus ATCC nr 11 778Underhåll av parentalstammen, beredning av sporsuspensionen och inokulering av odlingssubstratet: följ instruktionerna i punkt 3.1 och 3.2 i den metod för bestämning av klortetracyklin-, oxytetracyklin- och tetracyklinhalt genom diffusion på agar som beskrivs i del 2 av denna bilaga.3.10 Odlingssubstrat(1)Glukos 1 gTryptisk pepton 10 gKöttextrakt 1,5 gJästextrakt 3 gAgar 20 gDestillerat vatten till 1000 mlJustera pH-värdet till 5,8 omedelbart före användning.3.11 0,1-procentig (vikt/volym) 2,3,5-trifenyltetrazoliumkloridlösning och 5-procentig (vikt/volym) glukoslösning.4. Utrustning4.1 Apparatur för stigande papperskromatografi (pappershöjd: 25 cm); Schleicher och Schüllpapper (2040b eller 2043b) eller motsvarande4.2 Centrifug4.3 Inkubator inställd på 30°C4.4 UV-lampa för påvisande av fluorescens4.5 Glasplattor, cirka 20 x 30 cm, för bioautografi5. Standardlösningar5.1 Lagerhållna lösningarBered med saltsyra (3.6) lösningar av standardsubstanserna (3.8) med koncentrationer motsvarande 500 µg per ml av klortetracyklin-HCl, oxytetracyklin-HCl respektive tetracyklin-HCl.5.2 Referenslösningar för påvisande genom UV-ljusSpäd ut lösningarna (5.1) med fosfatbuffertlösning (3.2) för att erhålla lösningar med koncentrationer motsvarande 100 µg per ml av klortetracyklin-HCl, oxytetracyklin-HCl och tetracyklinHCl.5.3 Referenslösningar för påvisande genom bioautografiSpäd ut lösningarna (5.1) med fosfatbuffertlösning (3.2) för att erhålla lösningar med koncentrationer motsvarande 5 µg per ml av klortetracyklin-HCl, oxytetracyklin-HCl och tetracyklinHCl.6. ExtraktionOm den antagna antibiotikahalten är lägre än 10 ppm kan antingen det homogeniserade provet eller den finaste delen som avskilts vid siktningen användas, eftersom antibiotikan huvudsakligen påträffas i denna del.Slamma provet i blandningen (3.5) och centrifugera. Samla upp dekanteringsvätskan (supernatanten) och använd den antingen i ursprungligt skick eller, om så är nödvändigt, utspädd med blandningen (3.5) så att antibiotikahalterna blir cirka 100 µg per ml (6.1) och 5 µg per ml (6.2).7. Påvisande och identifiering7.1 KromatografiDränk in papperet med buffertlösningen, pH 3,5 (3.1). Avlägsna överskottsvätskan genom att pressa papperet mellan torra ark filtrerpapper. Placera därefter volymer på 0,01 ml av referens lösningarna (5.2 och 5.3) och extraktet (6.1 och 6.2) på papperet. För att uppnå en god separering är det nödvändigt att papperet har korrekt vätskehalt; därför bör man låta det torka en tid om så är nödvändigt.Framkalla genom stigande kromatografi. Använd eluant I (3.3) för påvisande genom bioautografi och eluant II (3.4) för påvisande genom UV-ljus. När lösningsmedlets kant har stigit 15 20 cm (cirka 1 timme och 30 minuter) avbryts kromatografin och papperet torkas.7.2 Påvisande genom UV-ljusOm antibiotikahalten överstiger 1 µg per cm² kommer, efter att kromatogrammet har behandlats med ammoniakångor, guldgula fläckar att framträda vid bestrålning under UV-lampan (4.4).7.3 Påvisande genom bioautografiHäll odlingssubstratet (3.10), som i förväg inokulerats med B. cereus (3.9), på glasplattor (4.5) och placera papperet i odlingssubstratet. Efter fem minuters kontakt med substratet avlägsnas papperet och placeras på en annan plats i odlingssubstratet där det sedan förblir under inkubationsperioden. Inkubera därefter över natten vid 30°C. Om något antibiotikum av tetracyklingruppen finns i provet framträder ljushämningszoner i det grumliga odlingssubstratet.För att fixera kromatogrammet förångas lösningen (3.11) på papperet efter inkubering.7.4 IdentifieringDe relativa Rf-värdena för antibiotika av tetracyklingruppen anges nedan. Dessa värden kan variera något beroende på papperets kvalitet och vätskehalt.Klortetracyklin (CTC) 0,60Tetracyklin (TC) 0,40Oxytetracyklin (OTC) 0,204-epi-CTC 0,154-epi-TC 0,134-epi-OTC 0,10Den antibiotiska aktiviteten är lägre hos "epi"-föreningar än hos normala föreningar.2. BESTÄMNING AV KLORTETRACYKLIN, OXYTETRACYKLIN OCH TETRACYKLIN A. GENOM AGARDIFFUSION1. Syfte och omfattningMed denna metod kan halter av klortetracyklin (CTC), oxytetracyklin (OTC) och tetracyklin (TC) bestämmas i foder, koncentrat och premixer, om de överstiger 5 ppm. Halter under 5 ppm kan bestämmas med grafisk interpolation.2. PrincipDå det gäller halter på 50 ppm eller lägre extraheras provet med utspädd formamid. Om halterna överstiger 50 ppm extraheras provet med en blandning av aceton, vatten och saltsyra vid bestämning av CTC och med en blandning av metanol och saltsyra vid bestämning av OTC och TC.Därefter späds extrakten ut och deras antibiotiska aktivitet bestäms genom att man mäter CTC:s, OTC:s eller TC:s diffusion på ett agarsubstrat som tillförts B. cereus. Diffusionen påvisas genom att hämningszoner bildas vid förekomst av mikroorganismen. Dessa zoners diameter är direkt proportionell till logaritmen på den antibiotiska koncentrationen.3. Mikroorganism: B. cereus, ATCC nr 11 7783.1 Underhåll av parentalstammenInokulera B. cereus i ett rör med snedagar som tagits från ett odlingssubstrat (4.1), som är fritt från metylenblått och borsyra. Inkubera över natten vid cirka 30°C. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera snedagar på nytt med den var fjortonde dag.3.2 Beredning av sporsuspensionenSamla in bakterierna från ett rör snedagar (3.1) med 2 3 ml fysiologisk koksaltlösning (4.5). Tillför denna suspension till en Rouxkolv som innehåller 300 ml odlingssubstrat (4.1) fritt från metylenblått och borsyra och med en agarkoncentration av 3 4 %. Inkubera under 3 5 dagar vid 28 30°C och samla därefter in sporerna i 15 ml etanol (4.6), efter att sporbildning kontrollerats i mikroskop, samt homogenisera. Denna suspension är hållbar minst 5 månader i kylskåp.Fastställ genom förberedande prov på plattor med bassubstratet för bestämningen (4.1) vilken kvantitet av inokulatet som, vid de olika antibiotikakoncentrationer som används, ger största möjliga hämningszoner som fortfarande är tydliga. Vanligtvis ligger denna kvantitet mellan 0,2 och 0,3 ml per 1 000 ml. Odlingssubstratet inokuleras vid en temperatur av mellan 50 och 60°C.4. Odlingssubstrat och reagens4.1 Bassubstrat för bestämningen(2)Glukos 1 gTryptisk pepton 10 gKöttextrakt 1,5 gJästextrakt 3 gAgar (beroende på kvalitet) 10 20 g"Tween 80" 1mlFosfatbuffertlösning, pH 5,5 (4.2) 10 ml5-procentig borsyrelösning (vikt/volym) 15 ml0.5-procentig lösning av metylenblåtti etanol 4 mlDestillerat vatten till 1000 mlJustera pH-värdet till 5,8 omedelbart före användning.4.2 Fosfatbuffertlösning, pH 5,5Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 130,86 gDinatriumvätefosfat Na2HPO4  7 2H2O pa 6,947 gDestillerat vatten till 1000 ml4.3 Fosfatbuffertlösning, pH 5,5, utspädd 1/104.4 Fosfatbuffertlösning, pH 8Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 1,407 gDinatriumvätefosfat Na2HPO4  7 2H2O pa 57,539 gDestillerat vatten till 1000 ml4.5 Steril fysiologisk koksaltlösning.4.6 20-procentig etanol (volym/volym).4.7 Saltsyra 0,1 M4.8 70-procentig formamid (volym/volym): nybereds före användning; pH-värdet justeras till 4,5 med svavelsyra, cirka 2 M.4.9 Blandning av ren aceton/vatten/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportionerna 65/33/2.4.10 Blandning av ren metanol/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportionerna 98/2.4.11 Standardsubstanser: CTC, OTC, TC. Dessas aktivitet uttrycks som väteklorid.5. Standardlösningar5.1 KlortetracyklinBered en lösning som skall hållas i lager med en koncentration motsvarande 500 µg per ml klortetracyklin-HCl genom att tillsätta saltsyra (4.7) till standardlösningen (4.11). Denna lösning är hållbar en vecka i kylskåp.Av denna utgångslösning bereds en standardarbetslösning S8 med en koncentration motsvarande 0,2 µg per ml klortetracyklin-HCl. Utspädning sker med fosfatbuffertlösningen, pH 5,5, utspädd 1/10 (4.3), med tillsats av 0,01 % amidsvart(3).Bered därefter genom successiv utspädning (1+1) med buffertlösningen (4.3) följande koncentrationer:S4 0,1 µg/mlS2 0,05 µg/mlS1 0,025 µg/ml5.2 OxytetracyklinBered, enligt anvisningarna i 5.1, av en utgångslösning med en koncentration motsvarande 400 µg per ml oxytetracyklin-HCl en standardarbetslösning S8 som innehåller 1,6 µg oxytetracyklinHCl per ml samt följande koncentrationer:S4 0,8 µg/mlS2 0,4 µg/mlS1 0,2 µg/ml5.3 TetracyklinBered, enligt anvisningarna i 5.1, av en utgångslösning med en koncentration motsvarande 500 µg per ml tetracyklin-HCl en standardarbetslösning S8 som innehåller 1,0 µg tetracyklin-HCl per ml samt följande koncentrationer:S4 0,5 µg/mlS2 0,25 µg/mlS1 0,125 µg/ml6. Extraktion6.1 Halter på högst 50 ppmTillsätt formamid (4.8) till analysprovet i de kvantiteter som anges i nedanstående tabell. Skaka om på platta under 30 minuter. Späd därefter omedelbart ut med fosfatbuffertlösning (4.3) enligt nedanstående tabell så att koncentrationen U8 erhålls. Denna lösnings formamidkoncentration får inte överstiga 40 %.Centrifugera eller dekantera så att lösningen blir klar. Bered därefter koncentrationerna U4, U2 och U1 genom successiv utspädning (1+1) med fosfatbuffertlösningen (4.3).>Plats för tabell> 6.2 Halter över 50 ppm6.2.1 KlortetracyklinTillsätt till ett analysprov på 2 10 g (beroende på provets antagna halt av antibiotika eller tillverkarens garanti) blandning (4.9) i proportionen 20 gånger provets volym. Skaka om på platta under 30 minuter. Under extraktionen måste pH-värdet konstant ligga under 3; justera, om så är nödvändigt, till pH 3 med 10-procentig ättiksyra för mineralblandningar. Ta en del av extraktet för analys och justera pH-värdet till 5,5 med fosfatbuffertlösning, pH 8 (4.4) och tillsätt samtidigt bromkresolgrönt (som växlar färg från gult till blått). Späd ut med fosfatbuffertlösning, pH 5,5, utspädd 1/10 (4.3) så att koncentrationen U8 uppnås (se 6.1).Förbered sedan koncentrationerna U4, U2 och U1 genom successiva utspädningar (1 : 1) med fosfatbuffertlösning (4.3).6.2.2 Oxytetracyklin och tetracyklinFölj anvisningarna i punkt 6.2.1, men använd blandning (4.10) i stället för blandning (4.9).7. Bestämningsmetod7.1 Inokulering av odlingssubstratetInokulera bassubstratet för bestämningen (4.1) i sporsuspensionen (3.2) vid 50 60°C.7.2 Preparering av brickornaDiffusion på agar utförs på brickor med fyra koncentrationer av standardlösningen (S8, S4, S2, S1) och fyra koncentrationer av extraktet (U8, U4, U2, U1). Samtliga fyra koncentrationer extrakt och standardlösning måste placeras på varje bricka.Välj därför brickor med en yta som tillåter att minst åtta hål, 10 13 mm i diameter, görs i agarsubstratet. Beräkna vilken kvantitet inokulerat odlingssubstrat (7.1) som krävs för att täcka brickorna med ett jämnt, cirka 2 mm tjockt lager. Försöket bör helst utföras på brickor av planglas som är försedda med en helt jämn aluminium- eller plastring, 200 mm i diameter och 20 mm hög.Fyll med pipett noggrant uppmätta kvantiteter antibiotikalösning, mellan 0,10 och 0,15 ml beroende på hålens diameter.Upprepa för varje prov diffusionen minst fyra gånger med varje koncentration så att en utvärdering av 32 hämningszoner ingår i varje bestämning.7.3 InkubationInkubera brickorna under cirka 18 timmar vid 28 30°C.8. UtvärderingMät hämningszonernas diameter, helst genom projektion. För in mätvärdena på semilogaritmiskt papper så att logaritmen på koncentrationerna förs in vid hämningszonernas diameter. Rita linjerna för standardlösningen respektive extraktet. Förutsatt att ingen interferens förekommer skall de båda linjerna vara parallella.Logaritmen på den relativa aktiviteten beräknas med följande formel:>NUM>(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8)  7 0,602 >DEN>U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet9. RepeterbarhetSkillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 10 % relativvärde.B. GENOM TURBIDIMETRI1. Syfte och räckviddDenna metod gör det möjligt att bestämma halter av klortetracyklin (CTC), oxytetracyklin (OTC) och tetracyklin (TC) i högre koncentrationer än 1 g per kg, förutsatt att ingen påverkan sker från andra substanser som grumlar extrakten. Denna metod är snabbare än agardiffusion.2. PrincipProvet extraheras vid bestämning av CTC med en blandning av aceton, vatten och saltsyra och vid bestämning av OTC och TC med en blandning av metanol och saltsyra.Därefter späds extrakten ut och deras antibiotiska verkan bestäms genom mätning av ljustransmissionen hos ett odlingssubstrat som har ympats med Staphylococcus aureus och tillsatts den antibiotiska substansen. Ljustransmissionen beror på antibiotikakoncentrationen.3. Mikroorganism: Staphylococcus aureus K 141(4)3.1 Underhåll av parentalstammenInokulera S. aureus i ett provrör med snedagar som tagits från odlingssubstratet (4.1) och som tillsatts 1,5 till 3 % agar (beroende på kvaliteten). Inkubera över natten vid 37°C. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera den på nytt med snedagar var fjärde vecka. Förbered samtidigt delodlingar för laboratoriebruk.3.2 Beredning av inokulatet24 timmar före användning inokuleras snedagar på nytt i en delodling och inkuberas över natten vid 37°C. Slamma hela den odling som finns i ett agarrör i cirka 2 ml bassubstrat (4.1) och överför därefter suspensionen sterilt till cirka 100 ml av samma bassubstrat (4.1). Inkubera i vattenbad vid 37°C tills stammens tillväxt går in i sin logaritmiska fas (1'n 2 timmar).4. Odlingssubstrat och reagens4.1 Bassubstrat för bestämning(5)Pepton 5 gJästextrakt 1,5 gKöttextrakt 1,5 gNatriumklorid 3,5 gGlukos 1,0 gKaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 1,32 gdiKaliumvätefosfat K2HPO4 pa 3,68 gDestillerat vatten till 1 000 mlpH efter sterilisering: 6,8 7,04.2 Fosfatbuffertlösning, pH 4,5Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 13,6 gDestillerat vatten till 1 000 ml4.3 Saltsyra 0,1 M4.4 Blandning rent aceton/vatten/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportionerna 65/33/24.5 Blandning ren metanol/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportionerna 98/24.6 Cirka 10-procentig (vikt/volym) formaldehydlösning4.7 Standardsubstanser: CTC, OTC, TC, vilkas aktivitet uttrycks som väteklorid.5. StandardlösningBered genom tillsats av saltsyra (4.3) till standardsubstansen (4.7) en lösning som hålls i lager med en koncentration motsvarande 400 500 µg/ml CTC/HCl, OTC/HCl eller TC/HCl. I kylskåp är denna lösning hållbar i en vecka.6. Extraktion6.1 KlortetracyklinPlacera 1 2 g av provet i en 200 eller 250 ml mätkolv. Tillsätt cirka 100 ml av blandningen (4.4) och skaka om under 30 minuter på en platta. Fyll på fosfatbuffertlösning, pH 4,5 (4.2) till full volym. Homogenisera och låt sedimentera.6.2 Oxytetracyklin och tetracyklinPlacera 1 2 g av provet i en 200 eller 250 ml mätkolv. Tillsätt cirka 100 ml av blandningen (4.5) och skaka om under 30 minuter på en platta. Fyll på fosfatbuffertlösning, pH 4,5 (4.2) till full volym. Homogenisera och låt sedimentera.7. Bestämningsmetod7.1 Beredning av standardserien och extraktetSpäd ut standardlösningen (5) och extraktet (6) med fosfatbuffertlösningen, pH 4,5 (4.2) så att en serie koncentrationer erhålls. Vid varje bestämning ritas en kalibreringskurva för respektive koncentration så att åtminstone två värden för extraktet kan interpoleras. Utspädningsgraderna väljs beroende på stammens växtförhållanden som kan variera mellan olika laboratorier. Vanligtvis används följande metod:7.1.1 KlortetracyklinSpäd ut standardlösningen (5) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att en standardarbetslösning erhålls med en koncentration motsvarande 0,2 µg/ml CTC/HCl. Gör därefter i ordning provrör med sex utspädningsgrader, var och en i dubbel uppsättning, genom att späda med fosfatbuffertlösningen (4.2) enligt följande:>Plats för tabell> Späd ut extraktet (6.1) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att en antagen CTC/HClkoncentration av 0,12 µg/ml erhålls. Placera 1 ml vardera av denna lösning i två provrör och 0,75 ml (= 0,09 µg) vardera i två andra provrör. Fyll på fosfatbuffertlösning (4.2) till 1 ml i de två senare provrören.7.1.2 Oxytetracyklin och tetracyklinSpäd ut standardlösningen (5) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att en standardarbetslösning erhålls med en koncentration motsvarande 0,6 µg/ml OTC/HCl eller TC/HCl. Gör därefter i ordning provrör med sju utspädningsgrader, var och en i dubbel uppsättning, genom att späda med fosfatbuffertlösningen (4.2) enligt följande:>Plats för tabell> Späd ut extraktet (6.2) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att en antagen OTC/HCl- eller TC/HCl-koncentration av 0,48 µg/ml erhålls. Placera 1 ml vardera av denna lösning i två provrör och 0,5 ml (= 0,24 µg) vardera i två andra provrör. Fyll på fosfatbuffertlösning (4.2) till 1 ml i de två senare provrören.7.2 Inokulering av odlingssubstratetInokulera bassubstratet för bestämningen (4.1) med inokulatet (3.2) så att, med fotometer vid 590 nm, 85 % ljustransmission erhålls i en 5 cm cell, respektive 92 % i en 2 cm cell, efter att apparaturen ställts in på 100 % transmission på det ej inokulerade bassubstratet (4.1).7.3 YmpningPlacera 9 ml av det inokulerade odlingssubstratet (7.2) i varje provrör (7.1.1 eller 7.1.2). Vid ifyllningen måste utrustningen vara ren men inte nödvändigtvis steriliserad.7.4 InkubationInkubationen måste utföras i ett vattenbad som hela tiden håller 37°C ± 0,1°C under omrörning. Inkubationsperioden (vanligtvis 2∝ 3 timmar) måste vara så lång att det blir möjligt att rita transmissionskurvor med gradienter som tillåter noggrann uppmätning. Stoppa därefter den fortsatta tillväxten genom att snabbt injicera 1 ml formaldehydlösning (4.6) i varje provrör.7.5 Mätning av tillväxtenMät transmissionerna med fotometer vid 590 nm, varvid apparaturen ställs in på 100 % transmission på den klaraste standardlösningen (vilket innebär den högsta antibiotikahalten). Eftersom skillnaderna i grumlighet mellan de olika provrören blir mycket små bör celler på minst 2 cm (helst 5 cm) användas.8. ResultatberäkningRita kalibreringskurvan på millimeterpapper genom att föra in de fotometriska transmissionerna vid respektive antibiotikakoncentrationer. Interpolera extraktets transmissionsvärden på kurvan. Beräkna provets antibiotikahalt.9. RepeterbarhetSkillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 10 %, relativvärde.3. BESTÄMNING AV OLEANDOMYCIN - genom agardiffusion -1. Syfte och räckviddMed denna metod kan, också då tetracykliner förekommer i provet, oleandomycinhalter över 0,5 ppm bestämmas i foder, koncentrat och premixer.2. PrincipProvet extraheras med en lösning av tri(hydroxymetylamino)metan i utspädd metanol. Efter centrifugering späds extraktet ut och dess antibiotiska verkan bestäms genom mätning av oleandomycinets diffusion i ett agarsubstrat som ympats med B. cereus. Diffusionen påvisas genom att mikroorganismen orsakar att det bildas hämningszoner. Dessa zoners diameter är direkt proportionell till logaritmen på antibiotikakoncentrationen.3. Mikroorganism: B. cereus K 250 TR(6) (resistent mot tetracykliner)3.1 Underhåll av parentalstammenInokulera B. cereus i ett provrör med snedagar som tagits från odlingssubstratet (4.1) till vilket 100 µg per 5 ml oxytetracyklin har tillsatts. Inkubera över natten vid cirka 30°C. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera snedagar på nytt var fjärde vecka.3.2 Beredning av sporsuspensionenSamla in bakterierna från ett provrör med snedagar (3.1) med cirka 3 ml fysiologisk koksaltlösning (4.3). Ympa med denna suspension en Rouxkolv som innehåller 300 ml odlingssubstrat (4.1) med en agarkoncentration av 3 4 %. Inkubera under 3 5 dagar vid 28 30°C och samla därefter upp sporerna i 15 ml etanol (4.4), efter att sporbildningen kontrollerats i mikroskop, och homogenisera. Denna suspension är hållbar minst fem månader i kylskåp.Fastställ genom förberedande prov på plattor med bassubstratet för bestämningen (4.1) vilken kvantitet av inokulatet som, vid de olika koncentrationer av oleandomycin som används, ger största möjliga hämningszoner som fortfarande är tydliga. Vanligtvis ligger kvantiteten mellan 0,1 och 0,2 ml per 1 000 ml. Odlingssubstratet inokuleras vid 60°C.4. Odlingssubstrat och reagens4.1 Bassubstrat för underhåll av parentalstammen(7)Glukos 1 gTryptisk pepton 10 gKöttextrakt 1,5 gJästextrakt 3 gAgar (beroende på kvalitet) 10 20 gDestillerat vatten till 1000 mlJustera pH-värdet till 6,5 omedelbart före användning.4.2 Bassubstrat för bestämningen(8)Substratet (4.1) med pH justerat till 8,84.3 Steril fysiologisk koksaltlösning4.4 20-procentig etanol (volym/volym)4.5 Ren metanol4.6 0,5-procentig tri(hydroxymetylamino)metanlösning pa (vikt/volym)4.7 ExtraktionslösningRen metanol 50 mlDestillerat vatten 50 mlTri(hydroxymetylamino)metan pa 0,5 g4.8 Standardsubstans: oleandomycin med känd aktivitet5. StandardlösningLös upp en del av standardsubstansen (4.8) i 5 ml metanol (4.5) och späd med lösningen (4.6) så att en oleandomycinkoncentration av 100 µg/ml erhålls.Av denna utgångslösning bereds en standardarbetslösning S8 som innehåller 0,1 µg/ml oleandomycin genom utspädning med lösningen (4.6). Bered därefter genom successiv utspädning (1 : 1) med lösningen (4.6) följande koncentrationer:S4 0,05 µg/mlS2 0,025 µg/mlS1 0,0125 µg/ml6. ExtraktionTa 2 10 g av provet, beroende på dess antagna oleandomycinhalt, tillsätt 100 ml lösning (4.7) och skaka om under 30 minuter på en platta.Centrifugera, ta en del av extraktet och späd ut med lösningen (4.6) så att en antagen oleandomycinkoncentration av 0,1 µg/ml (U8) erhålls. Bered därefter koncentrationerna U4, U2 och U1 genom successiva utspädningar (1 : 1) med lösningen (4.6).7. Bestämningsmetod7.1 Inokulering av odlingssubstratetInokulera bassubstratet för bestämningen (4.2) i sporsuspensionen (3.2) vid 60°C.7.2 Preparering av brickornaDiffusion på agar utförs på brickor med fyra koncentrationer av standardlösningen (S8, S4, S2, S1) och fyra koncentrationer av extraktet (U8, U4, U2, U1). Samtliga fyra koncentrationer standardlösning och extrakt måste placeras på varje bricka.Välj därför brickor med en yta som tillåter att minst åtta hål, 10 13 mm i diameter, görs i agarsubstratet. Beräkna vilken kvantitet inokulerat odlingssubstrat (7.1) som krävs för att täcka brickorna med ett jämnt, cirka 2 mm tjockt lager. Försöket bör helst utföras på brickor av planglas som är försedda med en helt jämn aluminium- eller plastring, 200 mm i diameter och 20 mm hög.Fyll med pipett noggrant uppmätta kvantiteter antibiotikalösning, mellan 0,10 och 0,15 ml beroende på hålens diameter.Upprepa för varje prov diffusionen minst fyra gånger med varje koncentration så att en utvärdering av 32 hämningszoner ingår i varje bestämning.7.3 InkubationInkubera brickorna under cirka 18 timmar vid 28 30°C.8. UtvärderingMät hämningszonernas diameter, helst genom projektion. För in mätvärdena på semilogaritmiskt papper så att logaritmen på koncentrationerna förs in vid hämningszonernas diameter. Rita linjerna för standardlösningen respektive extraktet. Förutsatt att ingen interferens förekommer skall de båda linjerna vara parallella.Logaritmen på den relativa aktiviteten beräknas med följande formel:>NUM>(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8)  7 0,602 >DEN>U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet9. RepeterbarhetSkillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 10 % relativvärde.4. BESTÄMNING AV TYLOSIN - genom agardiffusion -1. Syfte och räckviddMed denna metod kan tylosinhalter över 2 ppm bestämmas i foder, koncentrat och premixer.2. PrincipProvet behandlas med en pH 8 fosfatbuffertlösning som i förväg upphettats till 80°C och sedan extraherats med metanol. Efter centrifugering späds extraktet ut och dess antibiotiska verkan bestäms genom mätning av tylosinets diffusion i ett agarsubstrat som ympats med Sarcina lutea. Diffusionen påvisas genom att mikroorganismen orsakar att det bildas hämningszoner. Dessa zoners diameter är direkt proportionell till logaritmen på antibiotikakoncentrationen.3. Mikroorganism: Sarcina lutea ATCC nr 93413.1 Underhåll av parentalstammenInokulera Sarcina lutea i ett provrör med snedagar som tagits från odlingssubstratet (4.1) och justera pH-värdet till 7,0. Inkubera över natten vid cirka 35°C. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera snedagar på nytt varje månad.3.2 Beredning av bakteriesuspensionenSamla in bakterierna från ett nyberett provrör med snedagar (3.1) med 2 3 ml fysiologisk koksaltlösning (4.4). Ympa med denna suspension en Rouxkolv som innehåller 250 ml odlingssubstrat (4.1) vars pH-värde justerats till 7,0. Inkubera under 24 timmar vid 35°C och samla därefter upp bakterierna i 25 ml fysiologisk koksaltlösning (4.4). Homogenisera och späd ut suspensionen så att ljustransmissionen blir cirka 75 % vid 650 nm.Denna suspension kan användas under en vecka om den förvaras i kylskåp.Fastställ genom förberedande prov på plattor med bassubstratet för bestämningen (4.1) vilken kvantitet av inokulatet som, vid de olika koncentrationer av tylosin som används, ger största möjliga hämningszoner som fortfarande är tydliga. Odlingssubstratet inokuleras vid 48 50°C.4. Odlingssubstrat och reagens4.1 Bassubstrat för bestämningen(9)Glukos 1 gTryptisk pepton 10 gKöttextrakt 1,5 gJästextrakt 3 gAgar (beroende på kvalitet) 10 20 gDestillerat vatten till 1000 mlJustera omedelbart före användning pH-värdet till 7,0 vid underhållet av parentalstammen och beredningen av bakteriesuspensionen samt till 8,0 vid bestämningen.4.2 Fosfatbuffertlösning, pH 8Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 0,523 gdiKaliumvätefosfat K2HPO4 pa 16,730 gDestillerat vatten till 1000 ml4.3 Fosfatbuffertlösning, pH 7Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 5,5 gdiKaliumvätefosfat K2HPO4 pa 13,6 gDestillerat vatten till 1000 ml4.4 Steril fysiologisk koksaltlösning4.5 Ren metanol4.6 10-procentig metanol (volym/volym)4.7 Blandning fosfatbuffertlösning (4.2)/ren metanol i volymsproportionerna 60/404.8 Standardsubstans: tylosin med känd aktivitet5. StandardlösningarTorka standardsubstansen (4.3) i vakuumugn (5 mm kvicksilver) under tre timmar vid 60°C. Väg upp 10 50 mg i mätkolv, lös upp detta i 5 ml metanol (4.5) och späd ut lösningen med fosfatbuffertlösningen, pH 7 (4.3) så att en tylosinbaskoncentration av 1000 µg/ml erhålls.Av denna utgångslösning bereds en standardarbetslösning S8 som innehåller 2 µg/ml tylosinbas genom utspädning med blandningen (4.7).Bered därefter genom successiv utspädning (1 : 1) med blandningen (4.7) följande koncentrationer:S4 1 µg/mlS2 0,5 µg/mlS1 0,25 µg/ml6. ExtraktionTa, för koncentrat, 10 g av provet och, för premixer och foder, 20 g. Tillsätt 60 ml fosfatbuffertlösning, pH 8 (4.2), som i förväg upphettats till 80°C, och homogenisera under 2 minuter (hushållsmixer, Ultra-turrax o.s.v.).Låt stå under 10 minuter, tillsätt 40 ml metanol (4.5) och homogenisera under 5 minuter. Centrifugera extraktet och späd ut en del av det med blandningen (4.7) så att en antagen tylosinbaskoncentration av 2 µg/ml (U8) erhålls. Bered därefter koncentrationerna U4, U2 och U1 genom successiva utspädningar (1 : 1) med blandningen (4.7).Om halterna är mindre än 10 ppm indunstas extraktet tills det är torrt i rotationsindunstare vid 35°C och återstoden löses upp i 40-procentig metanol (4.6).7. Bestämningsmetod7.1 Inokulering av odlingssubstratetInokulera vid 48 50°C bassubstratet för bestämningen (4.1) justerat till pH 8,0 i bakteriesuspensionen (3.2).7.2 Preparering av brickornaDiffusion på agar utförs på brickor med fyra koncentrationer av standardlösningen (S8, S4, S2, S1) och fyra koncentrationer av extraktet (U8, U4, U2, U1). Samtliga fyra koncentrationer standardlösning och extrakt måste placeras på varje bricka.Välj därför brickor med en yta som tillåter att minst åtta hål, 10 13 mm i diameter, görs i agarsubstratet. Beräkna vilken kvantitet inokulerat odlingssubstrat (7.1) som krävs för att täcka brickorna med ett jämnt, cirka 2 mm tjockt lager. Försöket bör helst utföras på brickor av planglas som är försedda med en helt jämn aluminium- eller plastring, 200 mm i diameter och 20 mm hög.Fyll med pipett noggrant uppmätta kvantiteter antibiotikalösning, mellan 0,10 och 0,15 ml beroende på hålens diameter.Upprepa för varje prov diffusionen minst fyra gånger med varje koncentration så att en utvärdering av 32 hämningszoner ingår i varje bestämning.7.3 InkubationInkubera brickorna över natten vid 35 37°C.8. UtvärderingMät hämningszonernas diameter, helst genom projektion. För in mätvärdena på semilogaritmiskt papper så att logaritmen på koncentrationerna förs in vid hämningszonernas diameter. Rita linjerna för standardlösningen respektive extraktet. Förutsatt att ingen interferens förekommer skall de båda linjerna vara parallella.Logaritmen på den relativa aktiviteten beräknas med följande formel:>NUM>(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8)  7 0,602 >DEN>U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet9. RepeterbarhetSkillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 10 % relativvärde.5. BESTÄMNING AV VIRGINIAMYCIN - genom agardiffusion -1. Syfte och omfattningMed denna metod kan virginiamycinhalter över 2 ppm bestämmas i foder, koncentrat och premixer.2. PrincipProvet behandlas med en "Tween 80"-metanollösning. Efter centrifugering eller filtrering späds extraktet ut och dess antibiotiska verkan bestäms genom mätning av virginiamycinets diffusion i ett agarsubstrat som ympats med Sarcina lutea. Diffusionen påvisas genom att mikroorganismen orsakar att det bildas hämningszoner. Dessa zoners diameter är direkt proportionell till logaritmen på antibiotikakoncentrationen.3. Mikroorganism: Sarcina lutea ATCC nr 93413.1 Underhåll av parentalstammenInokulera S. lutea i ett provrör med snedagar som tagits från odlingssubstratet (4.1). Inkubera över natten vid cirka 35°C. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera snedagar på nytt var fjortonde dag.3.2 Beredning av bakteriesuspensionenSamla in bakterierna från ett nyberett provrör med snedagar (3.1) med 2 3 ml fysiologisk koksaltlösning (4.3). Ympa med denna suspension en Rouxkolv som innehåller 250 ml odlingssubstrat (4.1). Inkubera under 24 timmar vid 35°C och samla därefter upp bakterierna i 25 ml fysiologisk koksaltlösning (4.3). Homogenisera och späd ut suspensionen så att ljustransmissionen blir cirka 75 % vid 650 nm. Denna suspension kan användas under en vecka om den förvaras i kylskåp.Fastställ genom förberedande prov på plattor med bassubstratet för bestämningen (4.1) vilken kvantitet av inokulatet som, vid de olika koncentrationer av virginiamycin som används, ger största möjliga hämningszoner som fortfarande är tydliga. Odlingssubstratet inokuleras vid 48 50°C.4. Odlingssubstrat och reagens4.1 Bassubstrat för bestämningen(10)Glukos 1 gTryptisk pepton 10 gKöttextrakt 1,5 gJästextrakt 3 gAgar (beroende på kvalitet) 10 20 gDestillerat vatten till 1000 mlJustera pH-värdet till 6,5 före användning.4.2 Fosfatbuffertlösning, pH 6Kaliumdivätefosfat KH2PO4 pa 8,0 gdiKaliumvätefosfat K2HPO4 pa 2,0 gDestillerat vatten till 1000 ml4.3 Steril fysiologisk koksaltlösning4.4 Ren metanol4.5 Blandning fosfatbuffertlösning (4.2)/ren metanol i volymsproportionerna 80/204.6 0,5-procentig "Tween 80"-metanollösning (vikt/volym)4.7 Standardsubstans: virginiamycin med känd aktivitet5. StandardlösningarFramställ en lösning av standardsubstansen (4.7) i metanol som innehåller 800 µg/ml virginiamycin. Av denna utgångslösning bereds en standardarbetslösning S8 som innehåller 1 µg/ml virginiamycin genom utspädning med blandningen (4.5). Bered därefter genom successiv utspädning (1 + 1) med blandningen (4.5) följande koncentrationer:S4 0,5 µg/mlS2 0,25 µg/mlS1 0,125 µg/ml6. Extraktion6.1 Produkter med högst 50 ppm halt virginiamycinTa 10 20 g av provet, tillsätt 100 ml av lösningen (4.6) och skaka om under 30 minuter på en platta. Centrifugera eller filtrera, ta 20 ml av den klara lösningen och indunsta fullständigt i rotationsindunstare. Lös upp återstoden i minst 20 ml av blandningen (4.5) så att en antagen virginiamycinkoncentration av 1 µg/ml (= U8) erhålls. Bered därefter koncentrationerna U4, U2 och U1 genom successiva utspädningar (1 : 1) med blandningen (4.5).6.2 Produkter med över 50 ppm halt virginiamycinTa 1 10 g av provet, tillsätt 100 ml av lösningen (4.6) och skaka om under 30 minuter på en platta. Centrifugera eller filtrera, och späd därefter med blandningen (4.5) så att en antagen virginiamycinkoncentration av 1 µg/ml (= U8) erhålls. Bered därefter koncentrationerna U4, U2 och U1 enligt anvisningarna i punkt 6.1.7. Bestämningsmetod7.1 Inokulering av odlingssubstratetInokulera bassubstratet för bestämningen (4.1) i bakteriesuspensionen (3.2) vid 48 50°C.7.2 Preparering av brickornaDiffusion på agar utförs på brickor med fyra koncentrationer av standardlösningen (S8, S4, S2, S1) och fyra koncentrationer av extraktet (U8, U4, U2, U1). Samtliga fyra koncentrationer standardlösning och extrakt måste placeras på varje bricka.Välj därför brickor med en yta som tillåter att minst åtta hål, 10 13 mm i diameter, görs i agarsubstratet. Beräkna vilken kvantitet inokulerat odlingssubstrat (7.1) som krävs för att täcka brickorna med ett jämnt, cirka 2 mm tjockt lager. Försöket bör helst utföras på brickor av planglas som är försedda med en helt jämn aluminium- eller plastring, 200 mm i diameter och 20 mm hög.Fyll med pipett noggrant uppmätta kvantiteter antibiotikalösning, mellan 0,10 och 0,15 ml beroende på hålens diameter.Upprepa för varje prov diffusionen minst fyra gånger med varje koncentration så att en utvärdering av 32 hämningszoner ingår i varje bestämning.7.3 InkubationInkubera brickorna under cirka 18 timmar vid 28 30°C.8. UtvärderingMät hämningszonernas diameter, helst genom projektion. För in mätvärdena på semilogaritmiskt papper så att logaritmen på koncentrationerna förs in vid hämningszonernas diameter. Rita linjerna för standardlösningen respektive extraktet. Förutsatt att ingen interferens förekommer skall de båda linjerna vara parallella.Logaritmen på den relativa aktiviteten beräknas med följande formel:>NUM>(U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8)  7 0,602 >DEN>U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2   S1 - S2Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet9. RepeterbarhetSkillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på samma prov får inte överstiga 10 % relativvärde.(1) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.(2) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.(3) Amidsvart används för att påvisa hämningszonerna i standardlösningen (blå ringar).(4) Denna stam som isolerats av LUFA i Kiel växer snabbare än S. aureus ATCC 6538 P.(5) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat medliknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.(6) Stammen har isolerats av LUFA i Kiel.(7) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.(8) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.(9) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som ger samma resultat, får användas.


Avis juridique important

|

31980L0780

Rådets direktiv 80/780/EEG av den 22 juli 1980 om tillnärmning av medlemsstaternas lagstiftning om backspeglar för tvåhjuliga motorfordon med eller utan sidvagn, samt backspeglarnas montering på sådana fordon

Europeiska gemenskapernas officiella tidning nr L 229 , 30/08/1980 s. 0049 - 0056 Finsk specialutgåva Område 13 Volym 10 s. 0236  "Grekisk specialutgåva" Område 13 Volym 9 s. 0142  Svensk specialutgåva Område 13 Volym 10 s. 0236  Spansk specialutgåva: Område 13 Volym 11 s. 0057  Portugisisk specialutgåva: Område 13 Volym 11 s. 0057

RÅDETS DIREKTIV av den 22 juli 1980 om tillnärmning av medlemsstaternas lagstiftning om backspeglar för tvåhjuliga motorfordon med eller utan sidvagn, samt backspeglarnas montering på sådana fordon (80/780/EEG)EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS RÅD HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIVmed beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen, särskilt artikel 100 i detta,med beaktande av kommissionens förslag,med beaktande av Europaparlamentets yttrande(1)med beaktande av Ekonomiska och sociala kommitténs yttrande(2), ochmed beaktande av följande:De tekniska krav som tvåhjuliga fordon måste uppfylla enligt nationell lagstiftning gäller bland annat deras backspeglar.Dessa krav skiljer sig åt från en medlemsstat till en annan, oavsett om de redan har trätt i kraft eller bara finns som förslag. För att undanröja handelshinder till följd av detta bör alla medlemsstater anta samma krav, antingen som tillägg till eller i stället för sina nuvarande regler.Antalet tvåhjuliga fordon och deras användning ökar. Det är därför nödvändigt att dessa fordon förses med en eller två backspeglar som medger sikt bakåt och åt sidorna.Ett harmoniserat förfarande för typgodkännande av backspeglarna gör det möjligt för varje medlemsstat att kontrollera överenstämmelsen med gemensamma konstruktions- och provningskrav och att upplysa övriga medlemsstater om sina resultat genom att sända dem kopior av EEG-typgodkännandeintyget för varje backspegeltyp. Märkning för EEG-typgodkännande på alla speglar som tillverkats i överensstämmelse med den godkända typen undanröjer behovet av tekniska kontroller på dessa speglar i andra medlemsstater.HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.Artikel 11. Alla medlemsstater skall utfärda EEG-typgodkännande för alla typer av backspeglar som är avsedda att monteras på fordon enligt artikel 7 och som uppfyller kraven på konstruktion och provning enligt bilaga 1.2. En medlemsstat som utfärdat EEG-typgodkännande skall vidta de åtgärder som behövs för att kontrollera att de serietillverkade exemplaren överenstämmer med den godkända typen, vid behov i samarbete med de behöriga myndigheterna i andra medlemsstater. En sådan kontroll skall begränsas till stickprover.Artikel 2Medlemsstaterna skall, för varje backspegeltyp som godkänns enligt artikel 1, översända EEG-typgodkännandemärke enligt tillägget till bilaga 1 till tillverkaren eller dennes auktoriserade representant.Medlemsstaterna skall vidta alla lämpliga åtgärder för att förhindra användning av märkningar som kan leda till oklarhet om vilka backspeglar som typgodkänts enligt artikel 1.Artikel 31. Ingen medlemsstat får förbjuda saluförande av backspeglar med hänvisning till deras konstruktion eller funktion om de är försedda med EEG-typgodkännandemärke.2. Denna bestämmelse får dock inte hindra en medlemsstat att vidta sådana åtgärder beträffande backspeglar med EEG-typgodkännandemärke om dessa vid upprepade tillfällen inte överenstämmer med den godkända typen.En stat som vidtar åtgärder skall så snart som möjligt upplysa övriga medlemsstater och kommissionen om vilka åtgärder som vidtagits och ange skälen för sina beslut. Bestämmelserna i artikel 5 skall också gälla.Bristande överensstämmelse med den godkända typen enligt vad som sägs i punkten 1 skall anses föreligga om kraven i bilaga 1 inte uppfylls.Artikel 4De behöriga myndigheterna i varje medlemsstat skall till motsvarande myndigheter i övriga medlemsstater inom en månad översända kopior av EEG-typgodkännandeintyget för varje typ av backspegel som de godkänt eller vägrat godkänna.Artikel 51. Om den medlemsstat som utfärdat EEG-typgodkännande finner att ett antal backspeglar med samma EEG-typgodkännandemärke inte överensstämmer med den typ som godkänts, skall denna stat vidta nödvändiga åtgärder för att se till att de serietillverkade examplaren överensstämmer med den godkända typen. De behöriga myndigheterna i denna stat skall upplysa motsvarande myndigheter i andra medlemsstater om de åtgärder som vidtagits, vilket om det är motiverat kan innebära en återkallelse av EEG-typgodkännandet. Nämnda myndigheter skall vidta samma åtgärder om de upplyses av de behöriga myndigheterna i en annan medlemsstat om en sådan bristande överenstämmelse.2. De behöriga myndigheterna i medlemsstaterna skall inom en månad upplysa varandra om eventuell återkallelse av ett EEG-typgodkännande och om skälen till en sådan åtgärd.3. Om den medlemsstat som utfärdat ett EEG-typgodkännande ifrågasätter en rapport om bristande överensstämmelse skall berörda medlemsstater försöka lösa tvisten. Kommissionen skall hållas informerad och vid behov överlägga med parterna för att åstadkomma en lösning.Artikel 6Av varje beslut som fattas enligt de bestämmelser som anpassats med anledning av detta direktiv för att vägra utfärda eller återkalla ett typgodkännande för en typ av backspegel eller för att förbjuda dess saluförande eller användning skall i detalj framgå de skäl på vilka det grundas. Beslutet skall tillkännages för den berörda parten, som samtidigt skall upplysas om sina möjligheter att överklaga beslutet enligt medlemsstatens lagstiftning och om de tidsgränser som gäller härför.Artikel 7I detta direktiv avses med fordon alla tvåhjuliga motordrivna fordon med eller utan sidvagn som är avsedda för användning på väg och är konstruerade för en högsta hastighet som överstiger 25 km/tim.Artikel 8I detta direktiv avses med termen nationellt typgodkännande det administrativa förfarande som kallas:- "agréation par type/aanneming" i belgisk lag,- "standardtypegodkendelse" i dansk lag,- "allgemeine Betriebserlaubnis" i tysk lag,- "réception par type" i fransk lag,- "type-approval" i irländsk lag,- "omologazione" eller "approvazione del tipo" i italiensk lag,- "agréation" i luxemburgsk lag,- "typegoedkeuring" i nederländsk lag,- "type-approval" i brittisk lag.Artikel 91. På begäran av en tillverkare eller dennes auktoriserade representant skall medlemsstaterna kontrollera att en fordonstyp uppfyller kraven i bilaga 2. En ansökan avseende en specifik fordonstyp får inte lämnas in till mer än en medlemsstat.2. När kontrollerna är slutförda skall medlemsstaten utfärda ett backspegelintyg för fordonet (hädanefter kallat enbart "intyg") enligt mallen i tillägget till bilaga 2, och särskilt ange om fordonstypen uppfyller kraven i detta direktiv eller inte.3. Den medlemsstat som utfärdat ett intyg där det anges att en fordonstyp uppfyller kraven i detta direktiv skall, om så är nödvändigt, vidta åtgärder för att kontrollera att de serietillverkade fordonen överenstämmer med den typ för vilken intyget utfärdats, vid behov i samarbete med de behöriga myndigheterna i andra medlemsstater. En sådan kontroll skall begränsas till stickprover.Artikel 10De behöriga myndigheterna i en medlemsstat skall inom en månad sända en kopia av intygen för alla kontrollerade fordonstyper till de behöriga myndigheterna i övriga medlemsstater. Den sökande skall också tillställas en kopia av intyget. Övriga medlemsstater skall betrakta detta dokument som bevis på att kraven i detta direktiv uppfyllts.Artikel 111. I de medlemsstater där fordon eller särskilda kategorier därav är underkastade nationellt typgodkännande skall detta godkännande baseras på kraven i detta direktiv i stället för på motsvarande nationella krav, om tillverkaren eller dennes representant begär detta.2. Ingen medlemsstat där fordon eller särskilda kategorier därav inte är underkastade nationellt typgodkännande får vägra att sådana fordon registreras eller förbjuda att de saluförs, tas i bruk eller används med motiveringen att kraven i detta direktiv uppfyllts i stället för motsvarande nationella krav.Artikel 121. En medlemsstat som utfärdat ett intyg av vilket framgår att en fordonstyp uppfyller kraven i detta direktiv skall vidta nödvändiga åtgärder för att säkerställa att den informeras om ändringar på fordonstypen eller om att produktionen av fordonstypen har upphört.2. Om staten i fråga anser att en sådan ändring inte kräver någon ändring i de uppgifter som legat till grund för intyget, skall de behöriga myndigheterna i denna stat upplysa tillverkaren eller dennes auktoriserade representant om detta.3. Om staten i fråga däremot finner att en ändring måste medföra nya kontroller och att det därför är nödvändigt att ändra i intyget eller upprätta ett nytt, skall de behöriga myndigheterna i denna stat upplysa tillverkaren eller dennes representant om detta samt, inom en månad från det datum då de nya dokumenten upprättades, överlämna dessa dokument till de behöriga myndigheterna i övriga medlemsstater, tillsammans med en uppgift om ramnumret på det sista fordon som tillverkades enligt det gamla intyget och, där så är lämpligt, ramnumret på det första fordon som tillverkades enligt det ändrade eller nya intyget.Artikel 13Varje ändring som är nödvändig för att anpassa kraven i bilagorna till tekniska framsteg skall antas enligt det förfarande som beskrivs i artikel 13 i rådets direktiv 70/156/EEG av den 6 februari 1970 om tillnärmning av medlemsstaternas lagstiftning om typgodkännande av motorfordon och släpvagnar till dessa fordon(3), i dess senaste lydelse enligt direktiv 78/547/EEG(4).Artikel 141. Medlemsstaterna skall införa de bestämmelser som krävs för att följa detta direktiv inom 18 månader från anmälan och skall genast upplysa kommissionen om detta.2. Medlemsstaterna skall se till att kommissionen tillställs texterna till de huvudbestämmelser i den nationella lagstiftningen som de antar med anledning av detta direktiv.Artikel 15Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.Utfärdat i Bryssel den 22 juli 1980.På rådets vägnarG. THORNOrdförande(1) EGT nr C 197, 4.8.1980, s. 66.(2) EGT nr C 182, 21.7.1980, s. 2.(3) EGT nr L 42, 23.2.1970, s. 1.(4) EGT nr L 168, 26.6.1978, s. 39.BILAGA 1KRAV FÖR EEG-TYPGODKÄNNANDE AV BACKSPEGLAR1. Backspeglarna på alla fordon måste uppfylla kraven för EEG-typgodkännande i rådets direktiv 71/127/EEG av den 1 mars 1971 om tillnärmning av medlemsstaternas lagstiftning om backspeglar för motorfordon(1), i dess senaste lydelse enligt direktiv 79/795/EEG(2) och till vilket följande komplettering görs:1.1. Backspegelklass som omfattas av detta direktivDessa backspeglar tillhör klass L, för vilken EEG-typgodkännande definieras i punkt 1.2.1.2. EEG-typgodkännande för backspeglar i klass LBackspeglar i klass L typgodkänns enligt kraven för backspeglar i klass III, med undantag för följande krav:1.2.1. Medelradien "r" för buktningen mätt över den reflekterande ytan får inte vara mindre än 1 000 mm eller större än 1 200 mm.1.2.2. Måtten på den reflekterande ytan skall vara sådana att:- den på runda backspeglar har en diameter på 100 till 150 mm,- den på icke runda backspeglar medger inskrivning av en cirkel med minst 100 mm diameter. Den reflekterande ytan måste rymmas inom en kvadrat med 150 mm sida.1.3. Exempel på EEG-typgodkännandemärke för backspeglar i klass L>Hänvisning till >FörklaringEn spegel med EEG-typgodkännandemärke enligt ovan är en klass L-spegel som typgodkänts i Italien (e 3) under nummer 177.TILLÄGG MALL FÖR EEG-TYPGODKÄNNANDEINTYG>Hänvisning till >>Hänvisning till >>Hänvisning till >(1) EGT nr L 68, 22.3.1971, s. 1.(2) EGT nr L 239, 22.9.1979, s. 1.BILAGA 2KRAV FÖR FASTSÄTTNING AV BACKSPEGLAR PÅ FORDONAntal och krav beträffande fastsättning1. Alla tvåhjuliga fordon som är konstruerade för en högsta hastighet av högst 100 km/tim måste ha en backspegel med EEG-typgodkännandemärke. Denna backspegel skall vara placerad till vänster på fordonet i medlemsstater med högertrafik och till höger på fordonet i medlemsstater med vänstertrafik.2. Alla tvåhjuliga fordon med en högsta konstruktiv hastighet överstigande 100 km/tim måste ha två backspeglar med EEG-typgodkännandemärke, en på vardera fordonssidan.3. Backspeglarna måste vara fastsatta så att de inte vibrerar överdrivet vid normal användning av fordonet.4. Backspeglarna skall vara placerade så att föraren får en klar överblick av vägen bakom och vid sidan av fordonet när han sitter på förarplatsen i normal körställning.5. Föraren måste kunna justera backspeglarna från förarplatsen.6. Kraven i rådets direktiv 71/127/EEG beträffande siktfält gäller inte för speglar i klass L.Tillägg MALL>Hänvisning till >>Hänvisning till >


title: Europaparlamentets och rådets direktiv 2000/77/EG av den 14 december 2000 om ändring av rådets direktiv 95/53/EG om fastställande av principerna för organisationen av officiell kontroll på djurfoderområdet

text:
Avis juridique important

|

32000L0077

Europeiska gemenskapernas officiella tidning nr L 333 , 29/12/2000 s. 0081 - 0083

Europaparlamentets och rådets direktiv 2000/77/EGav den 14 december 2000om ändring av rådets direktiv 95/53/EG om fastställande av principerna för organisationen av officiell kontroll på djurfoderområdetEUROPAPARLAMENTET OCH EUROPEISKA UNIONENS RÅD HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIVmed beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen, särskilt artikel 152.4 i detta,med beaktande av kommissionens förslag(1),med beaktande av Ekonomiska och sociala kommitténs yttrande(2),efter att ha hört Regionkommittén,i enlighet med förfarandet i artikel 251 i fördraget(3), mot bakgrund av det gemensamma utkast som godkändes av förlikningskommittén den 11 oktober 2000, ochav följande skäl:(1) I rådets direktiv 95/53/EG av den 25 oktober 1995(4) fastställs principerna för hur den officiella kontrollen på djurfoderområdet skall utföras. Erfarenheten har visat att det i förekommande fall bör vara möjligt att på gemenskapsnivå ange dessa principer mer exakt för att fastställa ett tillförlitligt och harmoniserat förfarande och för att införa det nya kontrollsystemet för produkter från tredje land vilka används i foder.(2) För att på lämpligt sätt skydda människors och djurs hälsa samt miljön bör kommissionens och medlemsstaternas experter ha möjlighet att utföra kontroller på plats inte endast inom gemenskapen utan även i tredje land, särskilt om det i ett tredje land uppstår något problem som negativt kan påverka sundheten hos djurfoder som har släppts ut på gemenskapsmarknaden.(3) Vidare bör kommissionen ha möjlighet att vid behov skicka ut experter inom gemenskapen för att på plats kontrollera att gemenskapsbestämmelserna följs samt i förekommande fall besluta om gemenskapsåtgärder.(4) Av samma anledning bör ett system för skyddsåtgärder fastställas. Inom ramen för detta system måste kommissionen kunna agera genom att besluta om åtgärder som är lämpliga med hänsyn till situationen.(5) Genom direktiv 95/53/EG har rådet fastställt principen om utarbetande av årliga samordnade gemenskapskontrollprogram på grundval av en rekommendation från kommissionen.(6) I särskilda fall när hänsynen till människors eller djurs hälsa motiverar det, bör de kontroller som utförs av och i medlemsstaterna skärpas. För att garantera en enhetlig och effektiv tillämpning av kontrollerna i hela gemenskapen bör kommissionen i dessa fall få befogenheter att besluta om särskilda samordnade kontrollprogram.(7) De åtgärder som krävs för att genomföra detta direktiv bör antas i enlighet med rådets beslut 1999/468/EG av den 28 juni 1999 om de förfaranden som skall tillämpas vid utövandet av kommissionens genomförandebefogenheter(5).(8) Rådets direktiv 95/53/EG bör följaktligen ändras i enlighet därmed.HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.Artikel 1Direktiv 95/53/EG ändras härmed på följande sätt:1. I artikel 5 skall följande stycke läggas till:"Vid behov skall tillämpningsföreskrifter för denna artikel antas i enlighet med förfarandet i artikel 23."2. I artikel 7 skall följande stycke läggas till:"Vid behov skall tillämpningsföreskrifter för denna artikel antas i enlighet med förfarandet i artikel 23."3. Följande artiklar skall införas:"Artikel 9a1. Om ett problem som kan innebära allvarlig risk för människors eller djurs hälsa eller för miljön uppstår eller sprids på ett tredje lands territorium skall kommissionen, på eget initiativ eller på begäran av en medlemsstat, beroende på hur allvarlig situationen är omedelbart anta följande åtgärder i enlighet med det förfarande som avses i artikel 23a:- Avbryta importen av produkter från hela eller en del av det berörda tredje landet eller från en eller flera särskilda produktionsanläggningar samt, när så är lämpligt, från eventuellt transiteringstredjeland.- Fastställa särskilda villkor för produkter som är avsedda för import från hela eller en del av det berörda tredje landet.2. I brådskande fall kan emellertid kommissionen provisoriskt anta de åtgärder som avses i punkt 1 efter att ha informerat medlemsstaterna om detta. Kommissionen skall i enlighet med det förfarande som avses i artikel 23a inom tio arbetsdagar hänskjuta frågan för yttrande till Ständiga foderkommittén om förlängning, ändring eller upphävande av de nämnda åtgärderna. Så länge som de av kommissionen antagna åtgärderna inte har ersatts av en annan rättsakt skall de fortsätta att tillämpas.3. Om en medlemsstat officiellt underrättar kommissionen om att skyddsåtgärder behöver vidtas och kommissionen inte agerar i enlighet med punkt 1 får den medlemsstaten besluta om tillfälliga skyddsåtgärder med avseende på importen. Om en medlemsstat beslutar om tillfälliga skyddsåtgärder skall den omedelbart underrätta de övriga medlemsstaterna och kommissionen. Kommissionen skall i enlighet med det förfarande som avses i artikel 23 inom tio arbetsdagar hänskjuta frågan för yttrande till Ständiga foderkommittén om förlängning, ändring eller upphävande av de nationella tillfälliga skyddsåtgärderna.Artikel 9b1. Kommissionens och medlemsstaternas experter får vid behov utföra kontroller på plats i tredje länder för att undersöka om de garantier som dessa länder ger angående villkor för produktion och avyttring av produkter kan anses åtminstone motsvara de garantier som krävs i gemenskapen.2. De kontroller som anges i punkt 1 skall utföras för gemenskapens räkning och gemenskapen skall stå för kostnaderna.3. Kommissionen skall underrätta medlemsstaterna om resultatet av de kontroller som anges i punkt 1.4. Vid behov skall tillämpningsföreskrifter för denna artikel antas i enlighet med förfarandet i artikel 23."4. Rubriken på kapitel IV skall ersättas med följande:"ALLMÄNNA BESTÄMMELSER OCH KONTROLLER"5. Följande artikel skall införas:"Artikel 17a1. Utan att det påverkar bestämmelserna i artikel 15, och i den utsträckning som det är nödvändigt för en enhetlig tillämpning av kraven i detta direktiv, får kommissionens och medlemsstaternas experter, i samarbete med behöriga nationella myndigheter, på plats kontrollera att bestämmelserna i detta direktiv tillämpas, särskilt bestämmelserna i artiklarna 4, 5, 7, 11 och 12.Kommissionen skall utse medlemsstaternas experter på förslag av medlemsstaterna.2. Den medlemsstat på vars territorium en kontroll utförs skall ge kommissionens och medlemsstaternas experter all hjälp för att de skall kunna utföra sitt uppdrag.3. Resultatet av kontrollerna skall diskuteras med den behöriga myndigheten i den berörda medlemsstaten innan en slutrapport utarbetas och skickas ut.Kommissionen skall underrätta medlemsstaterna och Europaparlamentet om resultatet av kontrollerna.4. Om kommissionen eller en medlemsstat anser att resultatet av en kontroll gör det motiverat skall dessa granskas i Ständiga foderkommittén. Kommissionen skall fatta de beslut som är nödvändiga i enlighet med förfarandet i artikel 23.5. Kommissionen skall övervaka situationen samt ändra eller upphäva de beslut som avses i punkt 4 i enlighet med förfarandet i artikel 23.6. Tillämpningsföreskrifter för denna artikel skall antas i enlighet med förfarandet i artikel 23."6. I artikel 22 skall följande punkt läggas till:"4. Utan att det påverkar punkterna 1, 2 och 3 skall kommissionen vidta nödvändiga åtgärder i enlighet med förfarandet i artikel 23 om skyddet av människors eller djurs hälsa eller av miljön gör det nödvändigt att snabbt införa begränsade, särskilda och samordnade kontrollprogram på gemenskapsnivå.Dessa program skall särskilt användas i situationer som orsakats av en särskild händelse."7. Artikel 23 skall ersättas med följande:"Artikel 231. Kommissionen skall biträdas av Ständiga foderkommittén (nedan kallad kommittén).2. När det hänvisas till denna artikel skall artiklarna 5 och 7 i beslut 1999/468/EG tillämpas, med beaktande av bestämmelserna i artikel 8 i det beslutet.Den tid som avses i artikel 5.6 i beslut 1999/468/EG skall vara tre månader.3. Kommittén skall själv anta sin arbetsordning."8. Följande nya artikel 23a skall införas:"Artikel 23a1. Kommissionen skall biträdas av Ständiga foderkommittén (nedan kallad kommittén).2. När det hänvisas till denna artikel skall artiklarna 5 och 7 i beslut 1999/468/EG tillämpas, med beaktande av bestämmelserna i artikel 8 i det beslutet.Den tid som avses i artikel 5.6 i beslut 1999/468/EG skall vara 15 dagar.3. Kommittén skall själv anta sin arbetsordning."Artikel 21. Medlemsstaterna skall sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv senast den 29 december 2001.De skall genast underrätta kommissionen om detta.2. När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av en sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.3. Medlemsstaterna skall till kommissionen överlämna texterna till de centrala bestämmelser i nationell lagstiftning som de antar inom det område som omfattas av detta direktiv.Artikel 3Detta direktiv träder i kraft samma dag som det offentliggörs i Europeiska gemenskapernas officiella tidning.Artikel 4Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.Utfärdat i Bryssel den 14 december 2000.På Europaparlamentets vägnarN. FontaineOrdförandePå rådets vägnarD. GillotOrdförande(1) EGT C 346, 14.11.1998, s. 9.(2) EGT C 138, 18.5.1999, s. 17.(3) Europaparlamentets yttrande av den 16 december 1998 (EGT C 98, 9.4.1999, s. 150), rådets gemensamma ståndpunkt av den 15 november 1999 (EGT C 17, 20.1.2000, s. 8) och Europaparlamentets beslut av den 11 april 2000 (ännu ej offentliggjort i EGT). Rådets beslut av den 20 november 2000 och Europaparlamentets beslut av den 14 december 2000.(4) EGT L 265, 8.11.1995, s. 17. Direktivet senast ändrat genom rådets direktiv 1999/20/EG (EGT L 80, 25.3.1999, s. 20).(5) EGT L 184, 17.7.1999, s. 23.


title: Kommissionens direktiv (EU) 2016/2309 av den 16 december 2016 om anpassning för fjärde gången av bilagorna till Europaparlamentets och rådets direktiv 2008/68/EG om transport av farligt gods på väg, järnväg och inre vattenvägar till den vetenskapliga och tekniska utvecklingen (Text av betydelse för EES )

text:
               20.12.2016

               SV

               Europeiska unionens officiella tidning

               L 345/48

         KOMMISSIONENS DIREKTIV (EU) 2016/2309
   av den 16 december 2016
   om anpassning för fjärde gången av bilagorna till Europaparlamentets och rådets direktiv 2008/68/EG om transport av farligt gods på väg, järnväg och inre vattenvägar till den vetenskapliga och tekniska utvecklingen
   (Text av betydelse för EES)
   EUROPEISKA KOMMISSIONEN HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV
   med beaktande av fördraget om Europeiska unionens funktionssätt,
   med beaktande av Europaparlamentets och rådets direktiv 2008/68/EG av den 24 september 2008 om transport av farligt gods på väg, järnväg och inre vattenvägar (1), särskilt artikel 8.1, och
   av följande skäl:

               (1)

               I bilaga I avsnitt I.1, bilaga II avsnitt II.1 och bilaga III avsnitt III.1 till direktiv 2008/68/EG hänvisas det till bestämmelser i internationella avtal om inrikestransporter av farligt gods på väg, järnväg och inre vattenvägar enligt definitionerna i artikel 2 i det direktivet.

               (2)

               Dessa internationella avtal uppdateras vartannat år. Senast ändrade versioner av dessa avtal gäller därför från och med den 1 januari 2017, med en övergångsperiod fram till och med den 30 juni 2017.

               (3)

               Bilaga I avsnitt I.1, bilaga II avsnitt II.1 och bilaga III avsnitt III.1 till direktiv 2008/68/EG bör därför ändras i enlighet med detta.

               (4)

               De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från kommittén för transport av farligt gods.

         HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
   Artikel 1
   Ändring av direktiv 2008/68/EG
   Direktiv 2008/68/EG ska ändras på följande sätt:

               1.

               Avsnitt I.1 i bilaga I ska ersättas med följande:
               ”I.1   ADR
               I bilagorna A och B till ADR, som gäller från och med den 1 januari 2017, ska ’kontraktsslutande part’ i förekommande fall ersättas med ’medlemsstat’.”

               2.

               Avsnitt II.1 i bilaga II ska ersättas med följande:
               ”II.1   RID
               I bilagan till RID, som återfinns i bihang C till COTIF och som gäller från och med den 1 januari 2017, ska ’kontraktsslutande part’ i förekommande fall ersättas med ’medlemsstat’.”

               3.

               Avsnitt III.1 i bilaga III ska ersättas med följande:
               ”III.1   ADN
               I bestämmelser som bifogas ADN, som gäller från och med den 1 januari 2017, samt i artiklarna 3 f, 3 h, 8.1 och 8.3 i ADN, ska ’kontraktsslutande part’ i förekommande fall ersättas med ’medlemsstat’.”

         Artikel 2
   Införlivande
   1.   Medlemsstaterna ska senast den 30 juni 2017 sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De ska genast överlämna texten till dessa bestämmelser till kommissionen.
   När en medlemsstat antar dessa bestämmelser ska de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av en sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen ska göras ska varje medlemsstat själv utfärda.
   2.   Medlemsstaterna ska till kommissionen överlämna texten till de centrala bestämmelser i nationell lagstiftning som de antar inom det område som omfattas av detta direktiv.
   Artikel 3
   Ikraftträdande
   Detta direktiv träder i kraft den tjugonde dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.
   Artikel 4
   Adressater
   Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

      Utfärdat i Bryssel den 16 december 2016.

            På kommissionens vägnar

         Jean-Claude JUNCKER

            Ordförande

      (1)  EUT L 260, 30.9.2008, s. 13.