title: Smernica Rady 98/81/ES z 26. októbra 1998, ktorou sa mení a dopĺňa smernica 90/219/EHS o obmedzenom použití geneticky modifikovaných mikroorganizmov

text:
Dôležité právne oznámenie

|

31998L0081

Úradný vestník L 330 , 05/12/1998 S. 0013 - 0031

		Smernica Rady 98/81/ESz 26. októbra 1998,ktorou sa mení a dopĺňa smernica 90/219/EHS o obmedzenom použití geneticky modifikovaných mikroorganizmovRADA EUROPSKEJ ÚNIE,so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva, najmä na jej článok 103s ods. l,so zreteľom na návrh Komisie [1],so zreteľom na stanovisko Hospodárskeho a sociálneho výboru [2],konajúc v súlade s postupom ustanoveným v článku 189c zmluvy [3],(1) keďže podľa zmluvy by činnosť spoločenstva týkajúca sa životného prostredia, mala vychádzať z princípu preventívneho konania a mala maž za cieľ zachovať, chrániť a zlepšiť životné prostredie a chrániť zdravie ľudí;(2) keďže obmedzené používanie geneticky modifikovaných mikroorganizmov (GMM) by malo byt' zatriedené vo vzťahu k rizikám, ktoré pre zdravie ľudí a životné prostredie predstavujú; keďže takéto zatriedenie by malo byť v súlade s medzinárodnou praxou a vychádzať z hodnotenia rizika;(3) keďže, aby sa zabezpečila vysoká úroveň ochrany, musí ochrana a iné ochranné opatrenia uplatňované na obmedzené použitie zodpovedať zatriedeniu obmedzeného použitia; keďže v prípade neistoty by sa mala použiť ochrana a iné ochranné opatrenia pre vyššiu triedu, pokým nie je použitie menej prísnych opatrení odôvodnené príslušnými údajmi;(4) keďže na kontrolu zneškodnenia materiálu z obmedzeného použitia GMM by mali byť prijaté príslušné opatrenia;(5) keďže GMM, ktoré sú zneškodňované bez príslušných ustanovení pre špecifické ochranné opatrenia na obmedzenie ich kontaktu s obyvateľstvom a životným prostredím nespadajú do rozsahu pôsobnosti tejto smernice; iné právne predpisy spoločenstva, ako je smernica Rady 90/220/EHS z 23. apríla 1990 o zámernom uvoľnení geneticky modifikovaných organizmov do životného prostredia [4] sa môžu uplatňovať;(6) keďže výnimky podľa tejto smernice neznamenajú výnimky podľa iných právnych predpisov spoločenstva, ktoré sa môžu použiť, ako je smernica 90/220/EHS;(7) keďže pri všetkých činnostiach týkajúcich sa GMM by sa mali použiť zásady správnej mikrobiologickej praxe a zásady bezpečnosti a hygieny pri práci v súlade s príslušnými právnymi predpismi spoločenstva;(8) keďže ochrana a iné ochranné opatrenia uplatňované na obmedzené použitia by mali byť pravidelne revidované;(9) keďže s pracovníkmi vykonávajúcimi činnosti spojené s obmedzeným použitím by mali byť vykonané porady v súlade s požiadavkami príslušných právnych predpisov spoločenstva, najmä smernice Rady 90/679/EHS z 26. novembra 1990 o ochrane pracovníkov pred rizikami týkajúcimi sa vystaveniu biologickým činiteľom pri práci (siedma individuálna smernica v zmysle článku 16 ods. 1 smernice 89/391/EHS) [5];(10) keďže v smernici 90/219/EHS [6] boli identifikované slabé miesta; keďže správne postupy a ohlasovacie požiadavky by mali byť spojené s rizikom obmedzeného použitia;(11) keďže smernica 90/219/EHS nepovoľovala dostatočné prispôsobovanie technickému pokroku; keďže technické časti tejto smernice vyžadujú prispôsobenie technickému pokroku;(12) keďže vykonanie smernice 90/219/EHS by mohla získať pridaním zoznamu GMM, ktoré sú bezpečné pre zdravie ľudí a životné prostredie; keďže tieto GMM by mali z dôvodu svojej bezpečnosti spĺňať určité kritériá;(13) keďže aby sa zohľadnila rýchlosť, akou sa vyvíjajú biotechnológie, povahu kritérií, ktoré sa majú vypracovať a obmedzený rozsah tohto zoznamu, je vhodné, aby Rada tieto kritériá definovala a revidovala;(14) keďže dnes existujú značné skúsenosti a poznatky o rizikách spojené s obmedzeným použitím GMM;(15) keďže smernica 90/219/EHS by mala byť preto príslušne zmenená a doplnená,PRIJALA TÚTO SMERNICU:Článok 1Smernica 90/219/EHS sa mení a dopĺňa takto:1. Články 2 až 16 sa nahrádzajú takto:"Článok 2"mikroorganizmus"  znamená: každú mikrobiologická entitu, bunkovú alebo nebunkovú, schopnú rozmnožovania alebo prenosu genetického materiálu, vrátane vírusov, viroidov a živočíšnych a rastlinných buniek v kultúrach;"geneticky modifikovaný mikroorganizmus" i) genetická modifikácia sa uskutoční aspoň pri použití techník uvedených v prílohe I, časť A;ii) výsledky techník uvedených v prílohe I, Časť B, sa nepovažujú za genetickú modifikáciu;"obmedzené použitie"  znamená: každú činnosť, v ktorej sú mikroorganizmy geneticky modifikované, alebo v ktorej sú takéto GMM pestované, uchovávané, prepravované, ničené, zneškodňované alebo používané akýmkoľvek iným spôsobom pri ktorom sa používajú zvláštne obmedzujúce opatrenia tak, aby sa obmedzil ich kontakt s obyvateľstvom a životným prostredím;"havária"  znamená každú udalosť, pri ktorej sa vyskytne významné neúmyselné uvoľnenie GMM počas ich obmedzeného použitia, ktorý by mohol znamenať okamžité alebo oneskorené nebezpečenstvo pre ľudské zdravie alebo životné prostredie;"používateľ"  znamená každú fyzickú alebo právnickú osobu zodpovednú za obmedzené použitie GMM;"ohlásenie"  znamená predloženie požadovaných informácií príslušným orgánom členského štátu.Článok 3Bez toho, aby bolo dotknuté ustanovenie článku 5 ods. 1 táto smernica sa nevzťahuje na:- genetickú modifikáciu, ak bola dosiahnutá prostredníctvom použitia techník/metód uvedených v prílohe II Časť A alebo- v prípade obmedzeného použitia len takých typov GMM, ktoré spĺňajú kritériá uvedené v prílohe II, Časť B, ktoré zaručujú ich bezpečnosť pre zdravie ľudí a životné prostredie. Tieto typy GMM sú uvedené v prílohe II, Časť C.Článok 4Článok 5 ods. 3 a ods. 6 a články 6 až 12 neplatia pre cestnú, železničnú, vnútrozemskú vodnú, morskú a leteckú prepravu GMM.Táto smernica sa nevzťahuje na uchovávanie, pestovanie, prepravu, ničenie, zneškodňovanie alebo použitie geneticky modifikovaných mikroorganizmov, ktoré boli uvedené na trh v súlade so smernicou 90/220/EHS z 23. apríla 1990 o zámernom uvoľnení geneticky modifikovaných organizmov do životného prostredia [7] alebo v súlade s inými právnymi predpismi spoločenstva, ktoré stanovujú špecifické hodnotenie environmentálneho rizika podobné tomu v uvedenej smernici za predpokladu, že obmedzené použitie bude spĺňať podmienky stanovené v súhlase s uvedením na trh, ak takéto podmienky existujú.Článok 51. Členské štáty zabezpečia, aby by boli vykonané všetky vhodné opatrenia na odvrátenie nepriaznivých účinkov na ľudské zdravie a životné prostredie, ktoré by mohli byť vzniknúť pri obmedzenom použití GMM.2. Používateľ preto vykoná hodnotenie obmedzeného použitia z hľadiska rizík pre zdravie ľudí a životné prostredie, ktoré by z nich mohli vyplynúť, použijúc aspoň prvky hodnotenia a postupy uvedené v prílohe III, časti A a B.3. Výsledkom hodnotenia uvedeného v odseku 2 bude konečné zatriedenie obmedzených použití do 4 tried pri uplatnení postupu stanoveného v prílohe III, ktoré výsledkom bude zatriedenie úrovní ochrany v súlade s článkom 6:Trieda 1 : činnosti nepredstavujúce žiadne alebo len zanedbateľné riziko, t. j. činnosti, pre ktoré je s cieľom ochrany zdravia ľudí alebo životného prostredia vhodná úroveň 1 ochrany.Trieda 2 : činnosti predstavujúce malé riziko, t. j. činnosti, pre ktoré je s cieľom ochrany zdravia ľudí alebo životného prostredia vhodná úroveň 2 ochrany.Trieda 3 : činnosti predstavujúce stredné riziko, t. j. činnosti, pre ktoré je s cieľom ochrany zdravia ľudí alebo životného prostredia vhodná úroveň 3 ochrany.Trieda 4 : činnosti predstavujúce vysoké riziko, t. j. činnosti, pre ktoré je s cieľom ochrany zdravia ľudí alebo životného prostredia vhodná úroveň 4 kontrolných opatrení.4. Ak existujú pochybnosti, ktorá trieda je pre navrhované použitie v uzavretých priestoroch vhodná, aplikujú sa prísnejšie ochranné opatrenia, ak dostatočný dôkaz a súhlas príslušného orgánu neoprávňuje použitie menej prísnych opatrení.5. Hodnotenie uvedené v odseku 2 musí zohľadniť najmä zneškodňovania odpadu a odpadových vôd. Ak to je vhodné, na ochranu zdravia ľudí a životného prostredia sa použijú potrebné bezpečnostné opatrenia.6. Užívateľ musí uchovávať záznamy z hodnotenia uvedeného v odseku 2 a sprístupniť ich príslušnému orgánu vo vhodnej forme ako súčasť ohlásenia v zmysle článku 7,9 a 10 alebo na požiadanie.Článok 61. Okrem rozsahu, v ktorom odsek 2 prílohy IV povoľuje použitie iných opatrení, použije používateľ všeobecné princípy a príslušnú úroveň ochrany a iné ochranné opatrenia ustanovené v prílohe IV zodpovedajúce príslušnej triede obmedzeného použitia tak, aby vystavenie pracoviska a životného prostredia akýmkoľvek GMM bolo na čo najnižšej rozumne uplatniteľnej úrovni a tak, aby bola zaistená vysoká úroveň bezpečnosti.2. Hodnotenie uvedené v článku 5 ods. 2 a úroveň ochrany a iné použité ochranné opatrenia sa musia preskúmavať pravidelne a ihneď ak:a) už použité opatrenia úrovne ochrany a iné ochranné opatrenia nie sú viac adekvátne alebo ak trieda priradená obmedzenému použitiu už nie je správna, alebob) existuje dôvod sa domnievať, že zaradenie už nie je z hľadiska nových vedeckých alebo technických poznatkov vhodné.Článok 7Ak sa majú priestory použiť prvýkrát na obmedzené použitie, užívateľ je povinný zaslať príslušným orgánom pred začatím takéhoto použitia ohlásenie obsahujúce aspoň informácie uvedené v prílohe V, časť A.Článok 8Po ohlásení uvedenom v článku 7 sa následné obmedzené použitie triedy 1 môže vykonať bez ďalšieho ohlásenia. Používatelia GMM v triede 1 použitia v uzavretých priestoroch musia uchovávať záznamy z každého hodnotenia uvedeného v článku 5 ods. 6, ktoré príslušnému orgánu na požiadanie sprístupnia.Článok 91. Pre prvé a následné použitia v uzavretých priestoroch triedy 2, ktoré sa majú vykonať v priestoroch ohlásených podľa článku 7 sa musí zaslať ohlásenie obsahujúce informácie uvedené v prílohe V, časť B.2. Ak boli priestory predmetom predchádzajúcej ohlásenia na vykonávanie obmedzeného použitia triedy 2 alebo vyššej a boli splnené všetky požiadavky s tým spojené, obmedzené použitie triedy 2 sa môže vykonávať bezprostredne po zaslaní nového ohlásenia.Žiadateľ však môže sám požiadať príslušný orgán a rozhodnutie vo veci formálneho povolenia. Tento musí rozhodnúť v lehote najviac 45 dní od dátumu ohlásenia.3. Ak priestory neboli predmetom prechádzajúceho ohlásenia na vykonávanie obmedzeného použitia triedy 2 alebo vyššej, obmedzené použitie triedy 2 sa môže vykonávať po 45 dňoch od zaslania ohlásenia uvedeného v odseku 1 v prípade absencie akéhokoľvek náznaku opačného stanoviska príslušného orgánu alebo v prípade súhlasu i skôr.Článok 101. Pre prvé a následné obmedzené použitie triedy 3 alebo triedy 4, ktoré sa majú vykonať v priestoroch ohlásených podľa článku 7 sa musí zaslať ohlásenie obsahujúce informácie uvedené v prílohe V, časť C.2. obmedzené používanie triedy 3 alebo 4 sa nesmie vykonávať bez predchádzajúceho súhlasu príslušného orgánu, ktorý musí svoje rozhodnutie oznámiť písomne:a) do 45 dní po zaslaní nového ohlásenia v prípade priestorov, ktoré boli predmetom predchádzajúceho ohlásenia na vykonávanie obmedzeného použitia triedy 3 alebo vyššej a v prípade ak boli splnené požiadavky súhlasu s použitím v uzavretých priestoroch tej istej alebo vyššej triedy, ako je trieda obmedzeného použitia, ktoré sa má vykonávať;b) do 90 dní po zaslaní ohlásenia v ostatných prípadoch.Článok 111. Členské štáty určia orgán alebo orgány, ktoré budú zodpovedné za vykonanie opatrení, ktoré prijmú na uplatňovanie tejto smernice a za prijímanie a potvrdzovanie ohlásení uvedených v článku 7, 9 a 10.2. Príslušné orgány preskúmajú súlad ohlásení s požiadavkami tejto smernice, presnosť a úplnosť informácií, správnosť hodnotenia uvedeného v článku 5 ods. 2 a triedu obmedzeného použitia, a ak to je vhodné, i vhodnosť ochrany a iných ochranných opatrení, odpadové hospodárstvo a havarijné opatrenia.3. Ak to je potrebné, príslušný orgán môže:a) požiadať používateľa o poskytnutie ďalších informácií alebo o zmenu podmienok navrhovaného obmedzeného použitia alebo zmenu triedy, ktorá je obmedzenému použitiu (použitiam) priradená. V tomto prípade môže príslušný orgán požadovať, aby sa obmedzené použitie, ak je navrhnuté, nezačínalo, alebo, ak sa už začalo, aby bolo pozastavené alebo ukončené, pokým príslušný orgán nevydá súhlas na základe ďalších získaných informácií alebo zmenených podmienok obmedzeného použitia;b) obmedziť lehotu, na ktorú je obmedzené použitie povolené alebo ho podriadiť určitým špecifickým podmienkam.4. Na účel výpočtu lehôt uvedených v článkoch 9 a 10 sa doba, počas ktorej príslušný orgán:- čaká na dodatočné informácie, ktoré môže od ohlasovateľa v súlade s odsekom 3 písm. a) vyžadovať, alebo- vykonáva verejný prieskum alebo porady v súlade s článkom 13nezapočítava.Článok 121. Ak sa užívateľ dozvie relevantné nové informácie alebo upraví obmedzené použitie spôsobom, ktorý môže mať významné dôsledky pre ním predstavované riziká, upovedomí čo najskôr príslušný orgán a zmení ohlásenie v zmysle článku 7, 9, a 10.2. Ak príslušný orgán obdrží informácie, ktoré môžu mať významné dôsledky pre riziká predstavované obmedzeným použitím, môže požadovať od užívateľa, aby upravil podmienky obmedzené použitia, pozastavil ho alebo ukončil.Článok 13Ak to členský štát považuje za vhodné, môže zabezpečiť, aby boli s verejnosťou prekonzultované aspekty navrhovaného obmedzeného použitia bez toho, aby boli dotknuté ustanovenia článku 19.Článok 14Príslušné orgány zabezpečia, aby pred začatím obmedzeného použitia:a) bol preň vypracovaný havarijný plán pre prípad, že by zlyhanie opatrení na ochranu mohlo viesť k vážnemu, či už bezprostrednému alebo následnému ohrozeniu ľudí mimo zariadenia alebo životného prostredia, okrem prípadov, keď už bol takýto havarijný plán vypracovaný na základe iných právnych predpisov spoločenstva;b) boli informácie o týchto havarijných plánoch, vrátane príslušných bezpečnostných opatrení, ktoré budú v prípade nehody prijaté, postúpené vhodným spôsobom organizáciám a orgánom, o ktorých sa predpokladá, že by mohli byť haváriou zasiahnuté, bez toho, že by o ne museli žiadať. Informácie sa musia aktualizovať v príslušných intervaloch. Musia byť tiež verejne prístupné.Dotknuté členské štáty sprístupnia v rovnakom čase ostatným dotknutým členským štátom rovnaké informácie, aké boli poskytnuté ich vlastným občanom, ako podklad pre všetky potrebné porady v rámci ich dvojstranných vzťahov.Článok 151. Členské štáty príjmu potrebné opatrenia aby, bol používateľ v prípade havárie povinný okamžite informovať príslušný orgán, uvedený v článku 11, a aby poskytol tieto informácie:- okolnosti havárie,- identitu a množstvá príslušných GMM,- všetky informácie potrebné pre posúdenie následkov havárie na zdravie obyvateľstva a na životné prostredie,- prijaté opatrenia.2. V prípade informácií poskytnutých podľa odseku 1 sú členské štáty povinné:- zabezpečiť, aby boli prijaté všetky potrebné opatrenia a okamžite upozorniť každý členský štát, ktorý by mohol byť haváriou zasiahnutý,- zhromažďovať, ak je to možné, informácie potrebné pre úplnú analýzu havárie, a ak to je vhodné, odporúčať spôsoby ako v budúcnosti predchádzať podobným haváriám a obmedziť ich účinky.Článok 161. Členské štáty sú povinné:a) poradiťsa s ostatnými členskými štátmi, o ktorých sa predpokladá, že by mohli byť pri havárii zasiahnuté, navrhnutú realizáciu havarijných plánov,b) čo najskôr informovať Komisiu o každej havárii v zmysle tejto smernice, kde uvedú podrobnosti o okolnostiach, identitu a množstvá príslušných GMM, o vykonaných havarijných opatreniach a ich účinnosti, a o analýze havárie vrátane odporúčaní ako obmedziť jej účinky a ako podobným nehodám v budúcnosti predchádzať.2. Komisia, v spolupráci s členskými štátmi, stanoví spôsob výmeny informácií v zmysle odseku 1. Takisto vypracuje a členským štátom sprístupní zoznam havárií v zmysle tejto smernice, vrátane analýzy príčin havárií, získaných skúseností a prijatých opatrení s cieľom predchádzania podobným haváriám v budúcnosti."2. Článok 18, 19 a 20 sa nahrádzajú takto:"Článok 181. Členské štáty zašlú koncom každého roka Komisii súhrnnú správu o obmedzených použitiach triedy 3 a 4 ohlásené počas príslušného roka podľa článku 10, vrátane popisu, účelu a rizík týchto použití.2. Členské štáty zašlú každé tri roky Komisii súhrnnú správu o ich skúsenostiach s touto smernicou, prvýkrát 5. júna 2003.3. Komisia každé tri roky zverejní súhrnnú správu vypracovanú na základe správ uvedených v odseku 2, prvýkrát k 5. júnu 2004.4. Komisia môže zverejniť všeobecné štatistické informácie o vykonaní tejto smernice a súvisiacich záležitostiach, pokiaľ neobsahujú informácie, ktoré by mohli spôsobiť užívateľovi ujmu z hľadiska hospodárskej súťaže.Článok 191. Ak sa odtajnenie týka jednej alebo viacerých položiek uvedených v článku 3 ods. 2 smernice Rady 90/313/EHS zo 7. júna 1990 o slobode prístupu k informáciám o životnom prostredí [8], ohlasovateľ môže označiť informácie v ohláseniach, poskytnutých podľa tejto smernice, ktoré sa majú považovať za dôverné. V takých prípadoch sa musí poskytnúť overiteľné odôvodnenie.2. Príslušný orgán po porade s ohlasovateľom rozhodne o tom, ktoré informácie budú považované za dôverné a informuje ho o svojom rozhodnutí.3. V žiadnom prípade nemôžu byť za dôverné považované tieto informácie predložené v zmysle článku 8, 9 alebo 10:- všeobecná charakteristika GMM, názov a adresa ohlasovateľa a miesto použitia,- trieda obmedzeného použitia a opatrenia ochrany,- vyhodnotenie predvídateľných účinkov, najmä účinkov škodlivých pre zdravie ľudí a životné prostredie.4. Komisia a príslušné orgány nesmú poskytnúť tretím stranám žiadne informácie, o ktorých sa v zmysle odseku 2 rozhodlo, že sú dôverné, a ktoré boli ohlásené alebo inak poskytnuté v zmysle tejto smernice a budú chrániť práva duševného vlastníctva vzťahujúce sa k obdržaným údajom.5. Ak ohlasovateľ z akýchkoľvek príčin odvolá ohlásenie, príslušný orgán musí rešpektovať dôvernosť predložených informácií.Článok 20O zmenách potrebných na prispôsobenie prílohy II Časť A a príloh III až V technickému pokroku a pre prispôsobenie prílohy 11 časť C sa rozhodne podľa postupu uvedeného v článku 21."3. Vkladá sa tento článok:"Článok 20aRada na návrh Komisie prijme do 5. decembra 2000 kvalifikovanou väčšinou prílohu II, časť B obsahujúcu kritériá pre zaradenie typov GMM do prílohy 11, časti C. Zmeny v prílohe II, Časť B prijme Rada na návrh Komisie kvalifikovanou väčšinou."4. Prílohy sa nahrádzajú prílohami uvedenými v prílohe k tejto smernici.Článok 21. Členské štáty prijmú zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou najneskôr do 18 mesiacov odo dňa nadobudnutia účinnosti. Bezodkladne o tom informujú Komisiu.Členské štáty uvedú priamo v prijatých ustanoveniach alebo pri ich úradnom uverejnení odkaz na túto smernicu. Podrobnosti o odkaze upravia členské štáty.2. Členské štáty oznámia Komisii znenie hlavných ustanovení vnútroštátnych právnych prepisov, ktoré prijmú v oblasti pôsobnosti tejto smernice.Článok 3Táto smernica nadobúda účinnosť v deň jej uverejnenia v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev.Článok 4Táto smernica je adresovaná členským štátom.V Luxemburgu 26. októbra 1998Za RadupredsedaW. Schüssel[1] Ú. v. ES C 356, 22.11.1997, s. 14 a Ú. v. C 369, 6.12.1997, s. 12.[2] Ú. v. ES C 295, 7.10.1996, s. 52.[3] Stanovisko Európskeho parlamentu z 12. marca 1997 (Ú.v. C 115, 14.4.1997, s. 59), Spoločná pozícia Rady zo 16. decembra 1997 (Ú. v. C 62, 26.2.1998, s. 1) a Rozhodnutie Európskeho parlamentu zo 16. júna 1998 (Ú.v. C 210, 6.7.1998).[4] Ú. v. ES L 117, 8.5.1990, s. 15. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 97/35/ES (Ú.v. L 169, 27.6.1997, s. 72).[5] Ú. v. ES L 374, 31.12.1990, s. 1. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 97/59/ES (Ú. v. L 282, 15.10.1997, s. 33).[6] Ú. v. ES L 117, 8.5.1990, s. 1. Smernica zmenená a doplnená smernicou Komisie 94/51/ES (Ú. v. L 297, 18.11.1994, s. 29).[7] Ú. v. ES L 117, 8.5.1990, s. 15. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 97/35/ES (Ú. v. ES L 169, 27.6.1997, s. 72).[8] Ú. v. ES L 158, 23.6.1990, s. 56.--------------------------------------------------PRÍLOHA"PRÍLOHA 1ČASŤ ATechniky genetickej modifikácie uvedené v článku 2 písm. b) bod i) sú, okrem iných:1. Techniky rekombinácie nukleovej kyseliny, vrátane vytvorenia nových kombinácii genetického materiálu prostredníctvom vloženia molekúl nukleovej kyseliny vytvorených akýmikoľvek prostriedkami mimo organizmu do akéhokoľvek vírusu, bakteriálneho plazmidu alebo iného vektorového systému a ich začlenenie do hostiteľského organizmu, v ktorom sa prirodzene nevyskytujú, ale v ktorom sú schopné pokračujúceho rozmnožovania,2. Techniky zahŕňajúce priame zavedenie dedičného materiálu pripraveného mimo mikroorganizmu do mikroorganizmu, vrátane mikroinjektáže, makroinjektáže a mikroenkapsulácie,3. Techniky bunkovej fúzie alebo hybridizácie, keď sú živé bunky s novou kombináciou dedičného genetického materiálu formované fúziou dvoch alebo viacerých buniek prostredníctvom metód, ktoré sa prirodzene nevyskytujú.ČASŤ BTechniky uvedené v článku 2písm. b) bod ii), o ktorých sa nepredpokladá, že budú mať za následok genetickú modifikáciu, za podmienky, že nezahŕňajú použitie molekúl alebo geneticky modifikovaných organizmov s rekombinantnou nukleovou kyselinou vytvorených technikami/metódami inými, ako sú techniky/metódy vylúčené prílohou II Časťou A:(1) oplodnenie in vitro;(2) prirodzené procesy, ako sú konjugácia, transdukcia, transformácia;(3) polyploidná indukcia.PRÍLOHA IIČASŤ ATechniky alebo metódy genetickej modifikácie produkujúce mikroorganizmy, vylúčené zo smernice za podmienky, že nebudú zahŕňať použitie molekúl rekombinantnej nukleovej kyseliny alebo GMM iných, ako sú vyprodukované jednou alebo viacerými technikami, uvedenými metódami:1. Mutagenéza.2. Bunková fúzia (vrátane fúzie protoplastov) prokaryotických druhov, ktoré si vymieňajú genetický materiál známymi fyziologickými procesmi.3. Bunková fúzia (vrátane fúzie protoplastov) buniek eukaryotických druhov vrátane produkcie hybridomasy a fúzií rastlinných buniek.4. Sebaklonovanie pozostávajúce v odstránení sekvencií nukleovej kyseliny z bunky organizmu, za ktorým môže, ale nemusí nasledovať opätovné vloženie celej alebo časti tejto nukleovej kyseliny (alebo syntetického ekvivalentu) s alebo bez predchádzajúcich enzymatických alebo mechanických krokov do buniek fylogeneticky úzko príbuzných druhov (druhu), ktoré si môžu vymieňať genetický materiál prirodzenými fyziologickými procesmi, ak sa o výslednom mikroorganizme nepredpokladá, že by mohol spôsobiť choroby ľudí, zvierat alebo rastlín.Sebaklonovanie môže zahŕňať použitie rekombinantných vektorov s dlhou históriou bezpečného použitia mikroorganizmov.ČASŤ BKritériá zaručujúce bezpečnosť geneticky modifikovaných mikroorganizmov pre zdravie ľudí a životné prostredie:.…(bude doplnené v súlade s postupmi v článku 20a)ČASŤ CTypy geneticky modifikovaných mikroorganizmov, ktoré spĺňajú kritériá uvedené v časti C:…(bude doplnené v súlade s postupom v článku 21)PRÍLOHA IIIZÁSADY PLATNÉ PRE HODNOTENIE PODĽA ČLÁNKU 5 ODS. 2Táto príloha popisuje vo všeobecnosti prvky, ktoré sa majú zobrať do úvahy a postup, ktorý sa má dodržať pri posudzovaní podľa článku 5 ods. 2 Najmä čo sa týka časti B, táto bude doplnená inštrukciami, ktoré vypracuje Komisia v súlade s postupom ustanoveným v článku 21.Tieto usmerňujúce poznámky budú dokončené najneskôr do 5. júna 2000.A. PRVKY HODNOTENIA1. Uvedené účinky sa môžu považovať za potenciálne škodlivé:- chorobné pre ľudí vrátane alergénnych a toxických účinkov,- chorobné pre živočíchy a rastliny,- škodlivé účinky v dôsledku nemožnosti liečby ochorenia alebo poskytnutia účinnej prevencie,- škodlivé účinky v dôsledku zavedenia do alebo rozšírenia v životnom prostredí,- škodlivé účinky v dôsledku prirodzeného transferu vloženého genetického materiálu do iných organizmov.2. Hodnotenie podľa článku 5 ods. 2 by malo vychádzať z:a) identifikácie všetkých potenciálne škodlivých účinkov, najmä tých, ktoré sú spojené s:i) mikroorganizmom príjemcu;ii) vloženým genetickým materiálom (pochádzajúcim z organizmu darcu);iii) vektorom;iv) mikroorganizmom darcu (len pokiaľ je mikroorganizmus darcu použitý počas operácie);v) výsledného GMM;b) charakteristík činnosti;c) závažnosti potenciálne škodlivých účinkov;d) pravdepodobnosti uskutočnenia potenciálne škodlivých účinkov.B. POSTUP3. Prvým štádiom v procese hodnotenia by mala byť identifikácia škodlivých vlastností príjemcu a, ak to je vhodné, i mikroorganizmu darcu, akýchkoľvek škodlivých vlastností spojených s vektorom alebo vloženým materiálom, vrátane akejkoľvek zmeny existujúcich vlastností príjemcu.4. Vo všeobecnosti by sa mali považovať za vhodné pre zaradenie do triedy 1 podľa definície v článku 5 iba tie GMM, ktoré vykazujú takéto vlastnosti:i) príjemca alebo parentálny mikroorganizmus len veľmi nepravdepodobne môže spôsobiť ochorenie ľudí, zvierat alebo rastlín [1];ii) povaha vektoru a inzertu je taká, že nevybavujú GMM fenotypom, ktorý by mohol spôsobiť ochorenie ľudí, živočíchov alebo rastlín [2] alebo ktorý by mohol mať za následok škodlivé účinky v životnom prostredí;iii) je predpoklad, že GMM nespôsobí ochorenia ľudí, živočíchov alebo rastlín [3] a pravdepodobne nemá škodlivé vplyvy na životné prostredie.5. Na získanie potrebných informácií na vykonanie tohto procesu môže používateľ najprv zobrať do úvahy príslušné právne predpisy spoločenstva (najmä smernicu Rady 90/679/EHS [4]. Do úvahy sa tiež môžu zobrať medzinárodné alebo národné klasifikačné systémy (napr. WHO, NIH, atď.) a ich revízie z hľadiska nových vedeckých poznatkov a technického pokroku.Tieto systémy sa týkajú prirodzene sa vyskytujúcich mikroorganizmov a ako také sú zvyčajne založené na schopnosti mikroorganizmu spôsobiť ochorenie ľudí, živočíchov alebo rastlín a na vážnosti a prenosnosti ochorenia, ktoré by mohlo byť spôsobené. Smernica 90/679/EHS zatrieďuje mikroorganizmy, ako biologické činitele, do štyroch rizikových tried na základe ich potenciálnych účinkov na zdravého dospelého človeka. Tieto rizikové triedy môžu byt' využité ako pomôcka pri kategorizácii činností pri obmedzenom použití do štyroch rizikových tried podľa článku 5 ods. 3 Používateľ tiež môže zobrať do úvahy klasifikačné systémy, ktoré sa vzťahujú na rastlinné a živočíšne patogény (zvyčajne vytvorené na vnútroštátnej úrovni). Uvedené klasifikačné systémy umožňujú iba predbežné zaradenie činnosti do rizikovej triedy a tomu zodpovedajúce ochranné a kontrolné opatrenia.6. Postup identifikácie nebezpečia vykonaný podľa odsekov 3 až 5 by mal viesť k určeniu úrovne rizika spojeného s GMM.7. Výber opatrení na ochranu a iných ochranných opatrení by mal potom vychádzať z úrovne rizika spojeného s geneticky modifikovaným mikroorganizmom spolu so zohľadnením:i) charakteristík životného prostredia, ktoré bude pravdepodobne vystavené účinkom (napr. či sa v životnom prostredí, ktoré by mohlo byť vystavené GMM, nachádzajú živé organizmy,ktoré by mohli byť nepriaznivo ovplyvnené mikroorganizmami používanými pri obmedzenom používaní);ii) charakteristík činností (napr. rozsah, povaha);iii) všetkých neštandardných operácií (napr. očkovanie živočíchov GMM; zariadenie, ktoré by mohlo produkovať aerosóly).Zohľadnenie položiek i) až iii) môže zvýšiť, znížiť alebo ponechať nezmenenú úroveň rizika spojenú s GMM určenú podľa odseku 6.8. Vyššie popísaná analýza povedie ku konečnému zaradeniu činnosti do jednej z tried popísaných v článku 5 ods. 39. Konečná klasifikácia obmedzeného použitia by mala byť potvrdená preskúmaním dokončeného hodnotenia podľa článku 5 ods. 2PRÍLOHA IVKONTROLNÉ A INÉ OCHRANNÉ OPATRENIAVšeobecné princípy1. Tieto tabuľky uvádzajú bežné minimálne požiadavky a opatrenia potrebné pre každú úroveň ochrany.Ochranu je tiež možné dosiahnuť prostredníctvom použitia správnych pracovných postupov, vzdelávania, vybavenia na kontrolované použitie a zvláštneho návrhu zariadenia. Nasledujúce zásady bezpečnosti a hygieny pri práci a princípy správnej mikrobiologickej praxe sa aplikujú pri všetkých činnostiach týkajúcich sa geneticky modifikovaných mikroorganizmov:i) vystavenie pracoviska a životného prostredia účinkom akýchkoľvek GMM držať na čo najnižšej možnej úrovni;ii) vykonávať inžinierske kontrolné opatrenia pri zdroji a zabezpečiť pre ne príslušné osobné ochranné prostriedky, ak to je potrebné;iii) adekvátne testovať a udržiavať kontrolné opatrenia a vybavenie;iv) ak je to potrebné, testovať prítomnosť životaschopných používaných organizmov nachádzajúcich sa mimo primárneho uzavretého priestoru;v) umožniť pracovníkom príslušné vzdelávanie;vi) ak sa to vyžaduje, vytvoriť výbory alebo podvýbory biologickej bezpečnosti;vii) v prípade potreby vytvoriť a uplatňovať miestne kódexy praxe pre bezpečnosť pracovníkov;viii) ak to je vhodné, vystaviť označenia oznamujúce bionebezpečie;ix) pracovníkom zabezpečiť hygienické a dekontaminačné zariadenia;x) viesť adekvátne záznamy;xi) zakázať na pracovisku jedenie, pitie, fajčenie, používanie kozmetiky alebo skladovanie potravín určených na ľudskú spotrebu;xii) zakázať pipetovanie ústami;xiii) poskytnúť písomne vypracované štandardné prevádzkové postupy, ak je to z hľadiska bezpečnosti vhodné;xiv) mať k dispozícii účinné dezinfekčné látky a špecifické dezinfekčné postupy pre prípad úniku GMM;xv) zabezpečiť bezpečne uskladnenie kontaminovaného laboratórneho vybavenia a materiálu, ak to je vhodné.2. Názvy tabuliek uvádzajú:Tabuľka 1 A uvádza minimálne požiadavky na laboratórne činnosti.Tabuľka 1 B uvádza dodatky a zmeny tabuľky 1 A platné pre činnosti týkajúce sa GMM v skleníkoch/pestovateľských miestnostiach.Tabuľka 1 C uvádza dodatky a zmeny Tabuľky 1 A platné pre činnosti spojené so živočíchmi a týkajúce sa GMM.Tabuľka II uvádza minimálne požiadavky na iné ako laboratórne činnosti.V niektorých prípadoch môže byť potrebné uplatňovať kombináciu opatrení z tabuľky I A a tabuľky II na rovnakej úrovniV niektorých prípadoch používatelia nemusia so súhlasom príslušného orgánu použiť opatrenia podľa príslušnej úrovne ochrany alebo môžu kombinovať opatrenia z dvoch rôznych úrovní.Slovo "voliteľný" v týchto tabuľkách znamená, že používateľ môže tieto opatrenia použiť podľa konkrétneho prípadu a podľa hodnotenia uvedeného v článku 5 ods. 23. Členské štáty môžu pri vykonaní tejto prílohy začleniť navyše všeobecné zásady v odseku 1 a 2 do týchto s cieľom väčšej jasnosti požiadaviek.Tabuľka I AKontrolné opatrenia a iné ochranné opatrenia pre laboratórne činnostiPopis | Úrovne ochrany || | 1 | 2 | 3 | 4 |1 | Laboratórne miestnosti: izolácia | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |2 | Laboratórium hermeticky uzatvoriteľné pre dezinfekciu plynom | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |Vybavenie3 | Ľahko umývateľné povrchy odolné vode, kyselinám, zásadám, rozpúšťadlám, dezinfekčným látkam a dekontaminačným činidlám | vyžaduje sa (pracovné stoly) | vyžaduje sa (pracovné stoly) | vyžaduje sa (pracovné stoly, podlaha) | vyžaduje sa (pracovné stoly, podlaha, strop, steny) |4 | Vchod do laboratória cez dekontaminačnú miestnosť | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa |5 | Nižší tlak úmerný tlaku okolitého prostredia | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | vyžaduje sa okrem | vyžaduje sa |6 | Odsávaný a vháňaný vzduch do laboratória by mal byť HEPA- filtrovaný | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | vyžaduje sa (HEPA)odsávaný vzduch okrem | vyžaduje sa (HEPA) – vháňaný aj odsávaný vzduch |7 | Aseptický box | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa | vyžaduje sa |8 | Autokláv | v areáli | v budove | v areáli | v laboratóriu: s dvomi dvierkami |Systém práce9 | Obmedzený prístup | nevyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |10 | Označenie bionebezpečia na dverách | nevyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |11 | Zvláštne opatrenie na kontrolu aerosólu v ovzduší | nevyžaduje sa | vyžaduje sa minimalizovať | vyžaduje sa zamedziť | vyžaduje sa zamedziť |13 | Sprcha | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa |14 | Ochranný odev | vhodný ochranný odev | vhodný ochranný odev a (voliteľné) obuv | vhodný ochranný odev | úplná výmena odevu a obuvi pred vstupom i výstupom |15 | Rukavice | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa | vyžaduje sa |18 | Účinná kontrola vektorov (napr. hlodavcom a hmyzu) | voliteľné | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |Odpad19 | Inaktivácia GMM v odpadových vodách, z umývadiel, na umývanie rúk, spŕch a v podobných odpadových vodách | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa |20 | Inaktivácia geneticky modifikovaných mikroorganizmov v kontaminovanom materiále a v odpade | voliteľné | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |Iné opatrenia21 | Laboratórium musí mať svoje vlastné vybavenie | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa |23 | Laboratórium musí mať pozorovacie okienko alebo alternatívne zariadenie tak, aby bolo vidieť prítomných | voliteľné | voliteľné | voliteľné | vyžaduje sa |Popis | Úrovne ochrany || | 1 | 2 | 3 | 4 |Budova1 | Skleník: trvalá konštrukcia | nevyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |Vybavenie3 | Vchod cez oddelenú miestnosť s dvoma vzájomne sa blokujúcimi dverami | nevyžaduje sa | voliteľné | voliteľné | vyžaduje sa |4 | Kontrola kontaminovanej odtekajúcej vody | voliteľné | minimalizovať odtekajúcu vodu | zabrániť odtoku | zabrániť odtoku |Systém práce6 | Opatrenia na kontrolu neželaných druhov ako hmyz, hlodavce, článkonožce | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |7 | Postupy pre prenos živého materiálu medzi skleníkom/pestovateľskou miestnosťou, ochranná štruktúra a laboratórium musia zabrániť rozšíreniu geneticky modifikovaných mikroorganizmov | minimalizovať rozšírenie | minimalizovať rozšírenie | zabrániť rozšíreniu | zabrániť rozšíreniu |Tabuľka I CKontrolné opatrenia a iné ochranné opatrenia pre činnosti v bunkách pre zvieratáVšetky ustanovenia tabuľky 1 A sa použijú s týmito dodatkami/modifikáciamiPopis | Úrovne ochrany || | 1 | 2 | 3 | 4 |Zariadenia1 | Izolácia buniek pre zvieratá | voliteľné | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |2 | Zariadenia pre zvieratá oddelené uzamykateľnými dverami | voliteľné | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |3 | Zariadenia pre zvieratá navrhnuté tak, aby uľahčili dekontamináciu (vodotesný a ľahko umývateľný materiál (klietky, atď.)) | voliteľné | voliteľné | vyžaduje sa | vyžaduje sa |4 | Podlaha a/alebo stropy ľahko umývateľné | voliteľné | vyžaduje sa (podlaha) | vyžaduje sa (podlaha a steny) | vyžaduje sa (podlaha a steny) |5 | Zvieratá sú držané vo vhodných uzavretých zariadeniach ako sú napr. klietky, koterce alebo nádrže | voliteľné | voliteľné | voliteľné | voliteľné |6 | Filtre na izolátoroch alebo izolovaných miestnostiach | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa | vyžaduje sa |Popis | Úrovne ochrany || | 1 | 2 | 3 | 4 |Všeobecné1 | Životaschopné mikroorganizmy by mali byť uzavreté v systéme, ktorý oddeľuje samotný proces od okolia (uzatvorený systém) | voliteľné | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |2 | Kontrola vychádzajúcich plynov z uzatvoreného systému | nevyžaduje sa | vyžaduje sa minimalizovať rozšírenie | vyžaduje sa predchádzať rozšíreniu | vyžaduje sa predchádzať rozšíreniu |3 | Kontrola aerosólov počas zberu vzoriek, pridávaní materiálu do uzatvoreného systému alebo prenose materiálu do ďalšieho uzavretého systému | voliteľné | vyžaduje sa minimalizovať rozšírenie | vyžaduje sa predchádzať rozšíreniu | vyžaduje sa predchádzať rozšíreniu |4 | Inaktivácia masy kultivačných tekutých médií pred ich odstránením z uzatvoreného systému | voliteľné | vyžaduje sa prostredníctvom overených prostriedkov | vyžaduje sa prostredníctvom overených prostriedkov | vyžaduje sa prostredníctvom overených prostriedkov |5 | Utesnenie by malo byť navrhnuté tak, aby minimalizovalo alebo zabránilo úniku | bez špecifických požiadaviek | minimalizovať rozšírenie | predchádzať rozšíreniu | predchádzať rozšíreniu |6 | Kontrolované miesto by malo byť navrhnuté tak, aby zadržal únik celého obsahu v uzatvorenom systéme | voliteľné | voliteľné | vyžaduje sa | vyžaduje sa |7 | Kontrolované miesto by malo byť hermeticky uzatvoriteľné pre dezinfekciu plynom | nevyžaduje sa | voliteľné | voliteľné | vyžaduje sa |Vybavenie8 | Vstup cez dekontaminačnú miestnosť | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa |9 | Ľahko umývateľné povrchy odolné vode, kyselinám, zásadám, rozpúšťadlám, dezinfekčným látkam a dekontaminačným činidlám | vyžaduje sa (pracovné stoly, ak sú) | vyžaduje sa (pracovné stoly, ak sú) | vyžaduje sa (pracovné stoly, ak sú, podlaha) | vyžaduje sa (pracovné stoly, podlaha, strop, steny) |10 | Zvláštne opatrenia na primeranú ventiláciu kontrolovaného miesta s cieľom minimalizácie kontaminácie vzduchu | voliteľné | voliteľné | voliteľné | vyžaduje sa |11 | Na kontrolovanom mieste by mal byť udržiavaný nižší tlak ako je v okolitom prostredí | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa |12 | Odsávaný a vháňaný vzduch z kontrolovaného priestoru by mal byť HEPA-filtrovaný | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | vyžaduje sa (odsávaný vzduch, voliteľné pre vháňaný vzduch) | vyžaduje sa (vháňaný aj odsávaný vzduch) |Systém práce13 | Uzatvorené systémy by mali byť umiestnené v kontrolovanom priestore | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa | vyžaduje sa |14 | Prístup by mal byť dovolený len pre nominovaný personál | nevyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |15 | Označenia biobezpečnosti by mali byť rozmiestnené | nevyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa | vyžaduje sa |17 | Pracovníci by sa mali osprchovať pred opustením kontrolovaného priestoru | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa |18 | Pracovníci by mali nosiť ochranný odev | vyžaduje sa (pracovný odev) | vyžaduje sa (pracovný odev) | vyžaduje sa | úplná výmena (odevu) pred vstupom i výstupom |Odpad22 | Inaktivácia geneticky modifikovaných mikroorganizmov v odpadových vodách z umývadiel na umývanie rúk, spŕch a v podobných odpadových vodách | nevyžaduje sa | nevyžaduje sa | voliteľné | vyžaduje sa |23 | Inaktivácia geneticky modifikovaných mikroorganizmov v kontaminovanom materiále a v odpade vrátane odpadových vôd pred konečným zneškodnením | voliteľné | vyžaduje sa, prostredníctvom overených prostriedkov | vyžaduje sa, prostredníctvom overených prostriedkov | vyžaduje sa, prostredníctvom overených prostriedkov |PRÍLOHA VČASŤ AInformácie potrebné pre ohlásenie podľa článku 7:- meno používateľa (používateľov) vrátane osôb zodpovedných za dozor a bezpečnosť,- informácie o školeniach a kvalifikácii osôb zodpovedných za dozor a bezpečnosť,- podrobnosti o akomkoľvek biologickom výbore alebo podvýbore,- adresa zariadenia a všeobecný popis zariadenia,- popis povahy práce, ktorá bude vykonaná,- trieda obmedzených použití,- iba pre obmedzené použitia triedy 1: súhrn hodnotenia podľa článku 5 ods. 2 a informácie o odpadovom hospodárstve.ČASŤ BInformácie potrebné pre ohlásenie podľa článku 9:- dátum predloženia ohlásenia podľa článku 7,- mená osôb zodpovedných za dozor a bezpečnosť a informácie o školeniach a kvalifikácii,- použitý príjemca, darca alebo parentálny mikroorganizmusy) a, ak je to vhodné, použitý(é) systém(y) hostiteľ — vektor,- zdroj(e) a zamýšľaná funkcia(ie) genetického materiálu(ov) zahrnuté do modifikácie(ií),- identita a charakteristika GMM,- účel obmedzeného použitia vrátane očakávaných výsledkov,- približné množstvá kultúr, ktoré budú použité,- popis kontrolných a iných ochranných opatrení, ktoré sa majú použiť, vrátane informácií o odpadovom hospodárstve, vrátane odpadov, ktoré sa majú produkovať, ich úprave, konečnej forme a miesta ich určenia,- súhrn hodnotenia podľa článku 5 ods.2,- informácie, ktoré príslušný orgán potrebuje na to, aby posúdil havarijné plány, ak sa podľa článku 14 vyžadujú.ČASŤ CInformácie potrebné pre ohlásenie podľa článku 10:a) - dátum predloženia ohlásenia podľa článku 7,- mená osôb zodpovedných za dozor a bezpečnosť a informácie o školeniach a kvalifikácii;b) - príjemca alebo parentálny mikroorganizmus y), ktoré sa majú použiť,- systém(y) hostiteľ — vektor, ktoré sa majú použiť (ak to je vhodné),- zdroj(e) a zamýšľaná funkcia(ie) genetického materiálu(ov) zahrnuté do modifikácie(í),- identita a charakteristika geneticky modifikovaných míkroorganizmov,- objemy kultúr, ktoré sa majú použiť;c) - popis kontrolných a iných ochranných opatrení, ktoré sa majú použiť, vrátane informácií o odpadovom hospodárstve, vrátane typu a formy odpadov, ktoré sa majú produkovať, ich úprave, konečnej forme a miesta ich určenia,- účel obmedzeného použitia vrátane očakávaných výsledkov,- popis častí zariadenia;d) informácie o prevencii havárií a havarijných plánoch, ak existujú:- akékoľvek špecifické nebezpečia vyplývajúce z umiestnenia zariadenia,- použité preventívne opatrenia, ako sú napríklad bezpečnostné vybavenie, poplachové systémy a metódy uzavretia,- postupy a plány na overenie stálej účinnosti kontrolných opatrení,- popis informácií poskytnutých pracovníkom,- informácie potrebné pre príslušné orgány, aby mohli posúdiť všetky havarijné plány, ak sa podľa článku 14 vyžadujú,e) kópiu hodnotenia uvedeného v článku 5 ods. 2."[1] Toto by sa malo vzťahovať len na živočíchy a rastliny v životnom prostredí, ktoré bude pravdepodobne vystavené účinkom.[2] Toto by sa malo vzťahovať len na živočíchy a rastliny v životnom prostredí, ktoré bude pravdepodobne vystavené účinkom.[3] Toto by sa malo vzťahovať len na živočíchy a rastliny v životnom prostredí, ktoré bude pravdepodobne vystavené účinkom.[4] Ú. v. ES L 374, 31.12.1990, s. 1. Smernica naposledy zmenená o doplnená smernicou Komisie 97/59/ES (Ú. v. ES L 282, 15.10.1997, s. 33).--------------------------------------------------


Dôležité právne oznámenie

|

32000L0045

Smernica Komisie 2000/45/ES zo 6. júla 2000, ktorou sa ustanovujú analytické metódy spoločenstva na stanovenie vitamínu A, vitamínu E a tryptofánu v krmiváchText s významom pre EHP

Úradný vestník L 174 , 13/07/2000 S. 0032 - 0050 CS.ES Kapitola 3 Zväzok 30 S. 12  - 30 ET.ES Kapitola 3 Zväzok 30 S. 12  - 30 HU.ES Kapitola 3 Zväzok 30 S. 12  - 30 LT.ES Kapitola 3 Zväzok 30 S. 12  - 30 LV.ES Kapitola 3 Zväzok 30 S. 12  - 30 MT.ES Kapitola 3 Zväzok 30 S. 12  - 30 PL.ES Kapitola 3 Zväzok 30 S. 12  - 30 SK.ES Kapitola 3 Zväzok 30 S. 12  - 30 SL.ES Kapitola 3 Zväzok 30 S. 12  - 30

		Smernica Komisie 2000/45/ESzo 6. júla 2000,ktorou sa ustanovujú analytické metódy spoločenstva na stanovenie vitamínu A, vitamínu E a tryptofánu v krmivách(Text s významom pre EHP)KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,so zreteľom na smernicu Rady č. 70/373/EHS z 20. júla 1970 o zavádzaní metód spoločenstva pre odber vzoriek a analýz na kontrolu krmiva [1], naposledy zmenenou a doplnenou Aktom o pristúpení Rakúska, Fínska a Švédska [2], a najmä článok 2,keďže:(1) Smernica 70/373/EHS stanovuje, že úradné kontroly krmív s cieľom overenia zhody s požiadavkami vyplývajúcimi z právneho poriadku, právnych predpisov a správnych predpisov, ktoré určujú ich kvalitu a zloženie, sa musia vykonávať za použitia metód spoločenstva pre odber vzoriek a analýzu.(2) Smernica Rady 70/524/EHS z 23. novembra 1970, ktorá sa týka prísad v potravinách [3], naposledy zmenená a doplnená nariadením Komisie (ES) č. 2439/1999 zo 17. novembra 1999 [4] stanovuje, že obsah vitamínu A a vitamínu E musí byť v prípade, ak sú pridané do zmesí a krmív, uvedený na označení.(3) Smernica Rady 79/373/EHS z 2. apríla 1979, ktorá sa týka obchodovania s kombinovanými krmivami [5] naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 2000/16/ES [6] smernicou Rady 93/74/EHS z 13. septembra 1993, ktorá sa týka krmív určených na osobitné výživové účely [7], naposledy zmenená a doplnená smernicou 96/25(ES) [8], stanovuje, aby na označení krmív boli uvedené aminokyseliny.(4) Na kontrolu týchto látok sa musia ustanoviť analytické metódy spoločenstva.(5) Opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre krmivá,PRIJALA TÚTO SMERNICU:Článok 1Členské štáty zabezpečia, aby sa analýzy vykonané s cieľom úradných kontrol obsahu vitamínu A, vitamínu E a tryptofánu v krmivách a zmesiach vykonávali za použitia metód, ktoré sú uvedené v prílohe k tejto smernici.Článok 2Členské štáty najneskôr do 31. augusta 2000 prijmú zákony, iné právne predpisy a administratívne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s ustanoveniami tejto smernice. Bezodkladne budú o tom informovať Komisiu.Tieto opatrenia sa budú uplatňovať od 1. septembra 2000.Keď členské štáty prijmú tieto opatrenia, budú obsahovať odkaz na túto smernicu alebo budú doplnené o takýto odkaz v prípade ich oficiálneho uverejnenia. Členské štáty prijmú postupy na uskutočnenie takéhoto odkazu.Článok 3Táto smernica nadobudne účinnosť v dvadsiaty deň po uverejnení v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev.Článok 4Táto smernica je adresovaná členským štátom.V Bruseli 6. júla 2000Za KomisiuDavid ByrneČlen Komisie[1] Ú. v. ES L 170, 3.8.1970, s. 2.[2] Ú. v. ES C 241, 29.8.1994, s. 1.[3] Ú. v. ES L 270, 14.12.1970, p. 1.[4] Ú. v. ES L 297, 18.11.1999, s. 8.[5] Ú. v. ES L 86, 6.4.1979, s. 30.[6] Ú. v. ES L 105, 3.5.2000, s. 36.[7] Ú. v. ES L 237, 22.9.1993, s. 23.[8] Ú. v. ES L 125, 23.5.1996, s. 35.--------------------------------------------------PRÍLOHAČasť A STANOVENIE VITAMÍNU A1. Cieľ a rozsahTáto metóda je určená na stanovenie vitamínu A (retinol) v krmivách a zmesiach. Vitamín A zahŕňa all-trans-retinyl alkohol a jeho cis-izoméry, ktoré sa stanovujú touto metódou. Obsah vitamínu A sa vyjadruje v medzinárodných jednotkách (IU) na kg. Jedna IU zodpovedá aktivite 0,300 μg all-trans-vitamín A alkoholu alebo 0,344 μg all-trans-vitamín A acetátu alebo 0,550 μg all-trans-vitamín A palmitátu.Limit stanovenia je 2000 IU vitamínu A/kg.2. PrincípVzorka sa hydrolyzuje etanolovým roztokom hydroxidu draselného a vitamín A sa extrahuje do petroléteru. Rozpúšťadlo sa odstráni odparením a zvyšok sa rozpustí v metanole a, ak je potrebné, zriedi sa na požadovanú koncentráciu. Obsah vitamínu A sa stanoví pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (RP-HPLC) prostredníctvom reverznej fázy za použitia UV detektora alebo fluorescenčného detektora. Parametre chromatografie sa nastavia tak, aby nedošlo k separácii all-trans-vitamín A alkoholu a jeho cis-izomérov.3. Reagencie3.1. Etanol, σ = 96 %3.2. Petroléter, interval varu 40 až 60 °C3.3. Metanol3.4. Roztok hydroxidu draselného, β = 50 g/100 ml3.5. Roztok askorbátu sodného, β = 10 g/100 ml (pozri Poznámky 7.7.)3.6. Sírnik sodný, Na2S. x H2O (x = 7 – 9)3.6.1. Roztok sírnika sodného, c = 0,5 mol/l v glycerole, β = 120 g/l (pre x = 9) (pozri Poznámky 7.8.)3.7. Roztok fenolftaleinu, β = 2 g/100 ml v etanole (3.1.)3.8. 2-propanol3.9. Mobilná fáza pre HPLC: zmes metanolu (3.3.) a vody, napr. 980 + 20 (v + v). Presný pomer sa stanoví na základe charakteristík použitej kolóny.3.10. Dusík bez obsahu kyslíka3.11. All-trans-vitamín A acetát, najvyššej čistoty s potvrdenou aktivitou, napr. 2,80 x 106 IU/g3.11.1. Zásobný roztok all-transacetátu vitamínu A (3.11.) do 100 ml kalibrovanej banky. Rozpusťte v 2-propanole (3.8.) a doplňte týmto rozpúšťadlom po značku. Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 1400 IU vitamínu A na ml. Presný obsah sa musí stanoviť podľa 5.6.3.1.3.12. All-trans-vitamín A palmitát, najvyššej čistoty s potvrdenou aktivitou, napr. 1,80 x 106 IU/g3.12.1. Zásobný roztok all-trans-vitamín A palmitátu: Navážte 80 mg s presnosťou 0,1 mg palmitátu vitamínu A (3.12.) do 100 ml kalibrovanej banky. Rozpusťte v 2-propanole (3.8.) a doplňte týmto rozpúšťadlom po značku. Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 1400 IU vitamínu A na ml. Presný obsah sa musí stanoviť podľa 5.6.3.2.3.13. 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) (pozri Poznámky 7.5.)4. Aparatúra4.1. Vákuová rotačná odparka4.2. Nádoby z hnedého skla4.2.1. 500 ml banky z plochým dnom alebo Erlenmeyerove banky so zábrusom4.2.2. Kalibrované banky so zábrusovými zátkami, s úzkym hrdlom, 10, 25, 100 a 500 ml4.2.3. Oddeľovacie lieviky, kónické, 1000 ml, so zábrusovými zátkami4.2.4. Srdcové banky, 250 ml, so zábrusovými zátkami4.3. Allihnov chladič, dĺžka plášťa 300 mm, so zábrusovým spojom, s prípojkou na prívod plynu4.4. Skladaný filtračný papier na oddelenie fáz, priemer 185 mm (napr. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)4.5. HPLC zariadenie so vstrekovacím systémom4.5.1. Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 250 mm x 4 mm alebo ekvivalent, C18, 5 alebo 10 μm, alebo ekvivalent (kritérium výkonu: iba jediný pík pre všetky izoméry retinolu v podmienkach HPLC)4.5.2. UV alebo fluorescenčný detektor s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou4.6. Spektrofotometer s 10 mm kremíkovými kyvetami4.7. Vodný kúpeľ s magnetickým miešadlom4.8. Extrakčný prístroj (pozri obrázok 1) pozostávajúci zo:4.8.1. skleného valca o objeme 1 l, so zábrusovým hrdlom a zátkou4.8.2. zábrusového nástavca s bočným ramenom a nastaviteľnou rúrkou prechádzajúcou cez stred. Nastaviteľná rúrka má mať spodný koniec v tvare písmena U a dýzu na opačnom konci tak, aby sa vrchná vrstva kvapaliny vo valci dala premiestniť do oddeľovacieho lievika.5. PostupPoznámka:Vitamín A je citlivý na UV svetlo a oxidáciu. Všetky činnosti sa majú prevádzať bez prítomnosti svetla (používať hnedé sklo alebo sklo obalené alumíniovou fóliou) a kyslíka (v prúde dusíka). Počas extrakcie sa má vzduch nad kvapalinou nahradiť dusíkom (zabráňte nadbytočnému tlaku občasným uvoľňovaním zátky).5.1. Príprava vzorkyZomeľte opatrne vzorku na takú jemnosť, aby prešla 1 mm otvormi sita, pričom zabráňte vytváraniu tepla. Mletie sa musí uskutočniť tesne pred vážením a zmydelnením, inak môžu nastať straty vitamínu A.5.2. ZmydelnenieNa základe obsahu vitamínu A navážte s presnosťou na 0,01 g, 2 až 25 g vzorky do 500 ml banky s plochým dnom alebo Erlenmeyerovej banky (4.2.1.). Postupne pridávajte za miešania 130 ml etanolu (3.1.), približne 100 mg BHT (3.13.), 2 ml roztoku askorbátu sodného (3.5.) a 2 ml roztoku sírnika sodného (3.6.). Pripevnite chladič (4.3.) k banke a ponorte banku do vodného kúpeľa s magnetickým miešadlom (4.7.). Zahrejte až po var a nechajte 5 minút refluxovať. Potom pridajte cez chladič (4.3.) 25 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4.) a nechajte za miešania a slabého prúdu dusíka refluxovať ďalších 25 min. Potom vypláchnite chladič približne 20 ml vody a ochlaďte obsah banky na teplotu miestnosti.5.3. ExtrakciaZmydelňovací roztok dekantáciou kvantitatívne preneste vymytím 250 ml vody do 1000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3.) alebo do extrakčného prístroja (4.8.). Vymyte zmydelňovaciu banku postupne 25 ml etanolu (3.1.) a 100 ml petroléteru (3.2.) a preneste tieto kvapaliny do oddeľovacieho lievika alebo do extrakčného prístroja. Podiel vody a etanolu v roztokoch má byť okolo 2:1. Intenzívne 2 minúty trepte a nechajte ustáť 2 minúty.5.3.1. Extrakcia na oddeľovacom lieviku (4.2.3.)Keď sa vrstvy oddelili (pozri poznámky 7.3.), preneste vrstvu petroléteru do ďalšieho oddeľovacieho lievika (4.2.3.). Zopakujte túto extrakciu dvakrát so 100 ml petroléteru (3.2.) a dvakrát s 50 ml petroléteru (3.2.).Premyte spojené extrakty v oddeľovacom lieviku jemným vírivým pohybom (na zabránenie vytvorenia emulzie) dvakrát po 100 ml vody, a potom opakovaným trepaním s ďalšími 100 ml dávkami vody, až kým po pridaní roztoku fenolftaleínu (3.7.) nebude voda bezfarebná (štvornásobné premytie je obvykle postačujúce). Premytý extrakt prefiltrujte do 500 ml kalibrovanej banky cez suchý skladaný filter na oddeľovanie fáz (4.4.), aby sa odstránila všetka suspendovaná voda (4.2.2.). Oddeľovací lievik a filter vymyte 50 ml petroléteru (3.2.), doplňte petroléterom (3.2.) po značku a dobre zamiešajte.5.3.2. Extrakcia na extrakčnom prístroji (4.8.)Po oddelení vrstiev (pozri poznámku 7.3.) vymeňte zátku skleného valca (4.8.1.) za zábrusový nástavec (4.8.2.) a nastavte spodný koniec nastaviteľnej rúrky v tvare písmena U tak, aby bola tesne nad úrovňou rozhrania. Tlakom z prívodu dusíka do bočného ramena preneste vrchnú vrstvu petroléteru do 1000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3.). Pridajte 100 ml petroléteru (3.2.) do skleného valca, zazátkujte a dobre zatraste. Nechajte oddeliť vrstvy a vrchnú vrstvu preneste opäť do oddeľovacieho lievika. Opakujte extrakciu s ďalšími 100 ml petroléteru (3.2.), potom dvakrát po 50 ml petroléteru (3.2.) a vrstvy petroléteru dajte do oddeľovacieho lievika.Premyte spojené extrakty petroléteru, ako je popísané v 5.3.1. a postupujte podľa uvedeného návodu.5.4. Príprava roztoku vzorky pre HPLCNapipetujte alikvotnú časť roztoku petroléteru (z 5.3.1. alebo 5.3.2.) do 250 ml srdcovej banky (4.2.4.). Odparte rozpúšťadlo takmer dosucha na rotačnej odparke (4.1.) za zníženého tlaku pri teplote kúpeľa nepresahujúcej 40 °C. Obnovte atmosferický tlak prídavkom dusíka (3.10.) a odpojte banku z rotačnej odparky. Odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.10.) a zvyšok ihneď rozpusťte v známom objeme (10 – 100 ml) metanolu (3.3.) (koncetrácia vitamínu A má byť v rozmedzí 5 IU/ml až 30 IU/ml).5.5. Stanovenie na HPLCVitamín A sa oddelí na C18 kolóne s reverznou fázou (4.5.1.) a koncentrácia sa meria UV detektorom (325 nm) alebo fluorescenčným detektorom (excitácia: 325 nm, emisia: 475 nm) (4.5.2.).Vstreknite alikvotnú časť (napr. 20 μl) roztoku metanolu pripraveného podľa 5.4. a vymyte mobilnou fázou (3.9.). Vypočítajte priemernú výšku píku (plochu) z niekoľkých vstreknutí toho istého roztoku vzorky a priemernú výšku píkov (plôch) z niekoľkých vstreknutí kalibračných roztokov.Podmienky HPLCNa účely usmernenia sa poskytujú nasledovné špecifikácie, iné špecifikácie sa môžu použiť za predpokladu, že poskytnú rovnocenné výsledky.Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.5.1.): | 250 mm x 4 mm, C18, 5 alebo 10 μm balenie alebo ekvivalent |Mobilná fáza (3.9.): | zmes metanolu (3.3.) a vody, napr. 980 + 20 (v + v) |Prietoková rýchlosť: | 1 - 2 ml/min |Detektor (4.5.2.): | UV detector (325 nm) alebo fluroscenčný detektor (excitácia: 325 nm, emisia: 475 nm) |5.6. Kalibrácia5.6.1. Príprava pracovných štandardných roztokovNapipetujte 20 ml zásobného roztoku vitamín A acetátu (3.11.1.) alebo 20 ml zásobného roztoku vitamín A palmitátu (3.12.1) do 500 ml banky s plochým dnom alebo Erlenmeyerovej banky (4.2.1.) a hydrolyzujte, ako je popísané v 5.2., ale nepridávajte BHT. Potom extrahujte petroléterom (3.2.) podľa 5.3. a doplňte petroléterom do 500 ml (3.2.). Odparte 100 ml tohto roztoku na rotačnej odparke (pozri 5.4.) takmer dosucha, odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.10.) a zvyšok opäť rozpusťte v 10,0 ml metanolu (3.3.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 560 IU vitamínu A na ml. Presný obsah sa musí stanoviť podľa 5.6.3.3. Pracovný štandardný roztok sa musí pripraviť tesne pred použitím.Napipetujte 2,0 ml tohto pracovného štandardného roztoku do 20 ml kalibrovanej banky, doplňte metanolom po značku (3.3.) a zamiešajte. Nominálna koncentrácia tohto zriedeného pracovného štandardného roztoku je 56 IU vitamínu A na ml.5.6.2. Príprava kalibračných roztokov a kalibračná krivkaPreneste postupne 1,0, 2,0, 5,0 a 10,0 ml zriedeného pracovného štandardného roztoku do 20 ml kalibrovaných baniek, doplňte metanolom po značku (3.3.) a zamiešajte. Nominálna koncentrácia týchto roztokov je 2,8, 5,6, 14,0 and 28,0 IU vitamínu A na ml.Vstreknite 20 μl každého kalibračného roztoku niekoľkokrát a stanovte priemernú výšku píkov (plôch). Utvorte kalibračnú krivku za použitia priemerných výšok píkov (plôch) pri zohľadnení výsledkov UV kontroly (5.6.3.3.).5.6.3. UV kontrola štandardných roztokov5.6.3.1. Zásobný roztok vitamín A acetátuNapipetujte 2,0 ml zásobného roztoku vitamín A acetátu (3.11.1.) do 50 ml kalibrovanej banky (4.2.2.), doplňte po značku 2-propanolom (3.8.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 56 IU vitamínu A na ml. Napipetujte 3,0 ml tohto zriedeného roztoku vitamín A acetátu do 25 ml kalibrovanej banky, doplňte po značku 2-propanolom (3.8.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 6,72 IU vitamínu A na ml. V spektrofotometri (4.6.) zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti 2-propanolu (3.8.) v rozmedzí 300 nm a 400 nm. Extinčné maximum musí ležať medzi 325 nm a 327 nm.Výpočet obsahu vitamínu A:+++++ TIFF +++++5.6.3.2. Zásobný roztok vitamín A palmitátuNapipetujte 2,0 ml zásobného roztoku vitamín A palmitátu (3.12.1.) do 50 ml kalibrovanej banky (4.2.2.), doplňte po značku 2-propanolom (3.8.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 56 IU vitamínu A na ml. Napipetujte 3,0 ml tohto zriedeného roztoku vitamín A palmitátu do 25 ml kalibrovanej banky, doplňte po značku 2-propanolom (3.8.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 6,72 IU vitamínu A na ml. V spektrofotometri (4.6.) zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti 2-propanolu (3.8.) v rozmedzí 300 nm a 400 nm. Extinčné maximum musí ležať medzi 325 nm a 327 nm.Výpočet obsahu vitamínu A:+++++ TIFF +++++5.6.3.3. Vitamín A pracovný štandardný roztokNapipetujte 5,0 ml tohto roztoku do 25 ml kalibrovanej banky a doplňte po značku 2-propanolom (3.8.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 6,72 IU vitamínu A na ml. V spektrofotometri (4.6.) zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti 2-propanolu (3.8.) v rozmedzí 300 nm a 400 nm. Extinčné maximum musí ležať medzi 325 nm a 327 nm.Výpočet obsahu vitamínu A:+++++ TIFF +++++6. Výpočet výsledkovStanovte koncentráciu roztoku vzorky v IU/ml za použitia kalibračnej krivky (5.6.2.) z priemernej výšky (plôch) píkov vitamínu A z roztoku vzorky.Obsah vitamínu A w v IU/kg vzorky je daný nasledovným vzorcom:w =500 . β . V. 1000V. mkde:β = koncentrácia vitamínu A v roztoku vzorky (5.4.) v IU/mlV1 = objem roztoku vzorky (5.4.) v mlV2 = objem alikvotnej časti z 5.4. v mlm = hmotnosť testovanej dávky v g7. Poznámky7.1. V prípade vzoriek s nízkou koncentráciou vitamínu A môže byť užitočné spojiť extrakty petroléteru z dvoch dávok zmydelnenia (navážené: 25 g) na jeden roztok vzorky pre stanovenie na HPLC.7.2. Hmotnosť vzorky odobratej na analýzu nesmie obsahovať viac ako 2 g tuku.7.3. Ak nedôjde k oddeleniu fáz, pridajte približne 10 ml etanolu (3.1.) na odstránenie emulzie.7.4. V prípade rybieho tuku a iných čistých tukov sa má doba zmydelnenia predĺžiť na 45 – 60 minút.7.5. Namiesto BHT sa môže sa použiť hydrochinón.7.6. Separácia izomérov retinolu na bežnej kolóne je možná.7.7. Namiesto roztoku askorbátu sodného sa môže použiť približne 150 g askorbovej kyseliny.7.8. Namiesto roztoku sírnika sodného sa môže použiť približne 50 g EDTA.8. OpakovateľnosťRozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení uskutočnených na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 15 % vzhľadom k vyššej hodnote.9. Výsledky kruhového testu [1]L : počet laboratóriín : počet jednotlivých hodnôtsr : štandardná odchýlka opakovateľnostisR : štandardná odchýlka reprodukovateľnostir : opakovateľnosťR : reprodukovateľnosťCVr : koeficient zmeny opakovateľnostiCVR : koeficient zmeny reprodukovateľnosti| Zmes | Zmesné krmivo | Minerálny koncentrát | Proteínové krmivo | Krmivo pre prasiatka |L | 13 | 12 | 13 | 12 | 13 |n | 48 | 45 | 47 | 46 | 49 |priemer [IU/kg] | 17,02 x 106 | 1,21 x 106 | 537100 | 151800 | 18070 |sr [IU/kg] | 0,51 x 106 | 0,039 x 106 | 22080 | 12280 | 682 |r [IU/kg] | 1,43 x 106 | 0,109 x 106 | 61824 | 34384 | 1910 |CVr [IU/kg] | 3,0 | 3,5 | 4,1 | 8,1 | 3,8 |SR [IU/kg] | 1,36 | 0,069 x 106 | 46300 | 23060 | 3614 |R [IU/kg] | 3,81 x 106 | 0,193 x 106 | 129640 | 64568 | 10119 |CVR [IU/kg] | 8,0 | 6,2 | 8,6 | 15 | 20 |+++++ TIFF +++++ČASŤ B STANOVENIE VITAMÍNU E1. Cieľ a rozsahTáto metóda je určená na stanovenie vitamínu E v krmivách a zmesiach. Obsah vitamínu E sa vyjadruje ako mg DL-α-tokoferol acetátu na kg. 1 mg DL-α-tokoferol acetátu zodpovedá 0,91 mg DL-α-tokoferolu (vitamín E).Limit stanovenia je 2 mg vitamínu E/kg.2. PrincípVzorka sa hydrolyzuje etanolovým roztokom hydroxidu draselného a vitamín E sa extrahuje do petroléteru. Rozpúšťadlo sa odstráni odparením a zvyšok sa rozpustí v metanole a, ak je potrebné, zriedi sa na požadovanú koncentráciu. Obsah vitamínu E sa stanoví pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (RP-HPLC) s reverznou fázou za použitia fluorescenčného detektora alebo UV detektora.3. Reagencie3.1. Etanol, σ = 96 %3.2. Petroléter, interval varu 40 – 60 °C3.3. Metanol3.4. Roztok hydroxidu draselného, β = 50 g/100 ml3.5. Roztok askorbátu sodného, β = 10 g/100 ml (pozri poznámky 7.7.)3.6. Sírnik sodný, Na2S. x H2O (x = 7 – 9)3.6.1. Roztok sírnika sodného, c = 0,5 mol/l v glycerole, β = 120 g/l (pre x = 9) (pozri poznámky 7.8.)3.7. Roztok fenolftaleinu, β = 2 g/100 ml v etanole (3.1.)3.8. Mobilná fáza pre HPLC: zmes metanolu (3.3.) a vody, napr. 980 + 20 (v + v). Presný pomer sa stanoví na základe charakteristík použitej kolóny.3.9. Dusík bez obsahu kyslíka3.10. DL-α-tokoferol acetát najvyššej čistoty s potvrdenou aktivitou3.10.1. Zásobný roztok DL-α-tokoferol acetátu: Navážte s presnosťou 0,1 mg, 100 mg DL-α-tokoferol acetátu (3.10.) do 100 ml kalibrovanej banky. Rozpusťte v etanole (3.1.) a doplňte týmto rozpúšťadlom po značku. 1 ml tohto roztoku obsahuje 1 mg DL-α-tokoferol acetátu. (UV kontrola pozri 5.6.1.3.; stabilizácia pozri poznámky 7.4.).3.11. DL-α-tokoferol najvyššej čistoty s potvrdenou aktivitou3.11.1. Navážte s presnosťou 0,1 mg, 100 mg DL-α-tokoferolu (3.10.) do 100 ml kalibrovanej banky. Rozpusťte v etanole (3.1.) a doplňte týmto rozpúšťadlom po značku. 1 ml tohto roztoku obsahuje 1 mg DL-α-tokoferolu. (UV kontrola pozri 5.6.2.3.; stabilizácia pozri poznámky 7.4.).3.12. 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) (pozri poznámky 7.5.)4. Aparatúra4.1. Vákuová rotačná odparka4.2. Nádoby z hnedého skla4.2.1. 500 ml banky z plochým dnom alebo Erlenmeyerove banky so zábrusom4.2.2. Kalibrované banky so zábrusovými zátkami, s úzkym hrdlom, 10, 25, 100 a 500 ml4.2.3. Oddeľovacie lieviky, kónické, 1000 ml, so zábrusovými zátkami4.2.4. Srdcové banky, 250 ml, so zábrusovými zátkami4.3. Allihnov chladič, dĺžka plášťa 300 mm, so zábrusovým spojom, s prípojkou na prívod plynu4.4. Skladaný filtračný papier na oddelenie fáz, priemer 185 mm (napr. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)4.5. HPLC zariadenie so vstrekovacím systémom4.5.1. Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 250 mm x 4 mm, C18, 5 alebo 10 μm balenie alebo ekvivalent4.5.2. Fluorescenčný alebo UV detektor s nastaviteľnou vlnovou dĺžkou4.6. Spektrofotometer s 10 mm kremíkovými kyvetami4.7. Vodný kúpeľ s magnetickým miešadlom4.8. Extrakčný prístroj (pozri obrázok 1) pozostávajúci zo:4.8.1. skleného valca o objeme 1 l, so zábrusovým hrdlom a zátkou4.8.2. zábrusového nástavca s bočným ramenom a nastaviteľnou rúrkou prechádzajúcou cez stred. Nastaviteľná rúrka má mať spodný koniec v tvare písmena U a dýzu na opačnom konci tak, aby sa vrchná vrstva kvapaliny vo valci dala premiestniť do oddeľovacieho lievika.5. PostupPoznámka:Vitamín E je citlivý na UV svetlo a oxidáciu. Všetky činnosti sa musia vykonávať bez prítomnosti svetla (používať hnedé sklo alebo sklo obalené alumíniovou fóliou) a kyslíka (v prúde dusíka). Počas extrakcie sa vzduch nad kvapalinou má nahradiť dusíkom (zabráňte nadbytočnému tlaku občasným uvoľňovaním zátky).5.1. Príprava vzorkyZomeľte opatrne vzorku na takú jemnosť, aby prešla 1 mm otvormi sita, pričom zabráňte vytváraniu tepla. Mletie sa musí uskutočniť tesne pred vážením a zmydelnením, inak môžu nastať straty vitamínu E.5.2. ZmydelnenieNa základe na obsahu vitamínu E navážte s presnosťou na 0,01 g, 2 až 25 g vzorky do 500 ml banky s plochým dnom alebo Erlenmeyerovej banky (4.2.1.). Postupne pridávajte za miešania 130 ml etanolu (3.1.), približne 100 mg BHT (3.12.), 2 ml roztoku askorbátu sodného (3.5.) a 2 ml roztoku sírnika sodného (3.6.). Pripevnite chladič (4.3.) k banke a ponorte banku do vodného kúpeľa s magnetickým miešadlom (4.7.). Zahrejte až po var a nechajte 5 minút refluxovať. Potom pridajte cez chladič (4.3.) 25 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4.) a nechajte za miešania a slabého prúdu dusíka refluxovať ďalších 25 min. Potom vypláchnite chladič približne 20 ml vody a ochlaďte obsah banky na laboratórnu teplotu.5.3. ExtrakciaZmydelňovací roztok dekantáciou kvantitatívne preneste vymytím 250 ml vody do 1000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3.) alebo do extrakčného prístroja (4.8.). Vymyte zmydelňovaciu banku postupne 25 ml etanolu (3.1.) a 100 ml petroléteru (3.2.) a preneste tieto kvapaliny do oddeľovacieho lievika alebo do extrakčného prístroja. Podiel vody a etanolu v roztokoch má byť okolo 2:1. Intenzívne 2 minúty trepte a nechajte stáť 2 minúty.5.3.1. Extrakcia na oddeľovacom lieviku (4.2.3.)Keď sa vrstvy oddelili (pozri poznámky 7.3.), preneste vrstvu petroléteru do ďalšieho oddeľovacieho lievika (4.2.3.). Zopakujte túto extrakciu dvakrát so 100 ml petroléteru (3.2.) a dvakrát s 50 ml petroléteru (3.2.).Premytý extrakt prefiltrujte do 500 ml kalibrovanej banky cez suchý skladaný filter na oddeľovanie fáz (4.4.), aby sa odstránila všetka suspendovaná voda (4.2.2.). Oddeľovací lievik a filter vymyte 50 ml petroléteru (3.2.), doplňte petroléterom (3.2.) po značku a dobre zamiešajte.5.3.2. Extrakcia na extrakčnom prístroji (4.8.)Po oddelení vrstiev (pozri poznámku 7.3.) vymeňte zátku skleného valca (4.8.1.) za zábrusový nástavec (4.8.2.) a nastavte spodný koniec nastaviteľnej rúrky v tvare písmena U tak, aby bola tesne nad úrovňou rozhrania. Tlakom z prívodu dusíka do bočného ramena preneste vrchnú vrstvu petroléteru do 1000 ml oddeľovacieho lievika (4.2.3.). Pridajte 100 ml petroléteru (3.2.) do skleného valca, zazátkujte a dobre zatraste. Nechajte oddeliť vrstvy a vrchnú vrstvu preneste opäť do oddeľovacieho lievika. Opakujte extrakciu s ďalšími 100 ml petroléteru (3.2.), potom dvakrát po 50 ml petroléteru (3.2.) a vrstvy petroléteru dajte do oddeľovacieho lievika.Premyte spojené extrakty petroléteru, ako je popísané v 5.3.1. a postupujte podľa uvedeného návodu.5.4. Príprava roztoku vzorky pre HPLCNapipetujte alikvotnú časť roztoku petroléteru (z 5.3.1. alebo 5.3.2.) do 250 ml srdcovej banky (4.2.4.). Odparte rozpúšťadlo takmer dosucha na rotačnej odparke (4.1.) za zníženého tlaku pri teplote kúpeľa nepresahujúcej 40 °C. Obnovte atmosferický tlak prídavkom dusíka (3.9.) a odpojte banku z rotačnej odparky. Odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.9.) a zvyšok ihneď rozpusťte v známom objeme (10 – 100 ml) metanolu (3.3.) (koncentrácia DL-α-tokoferolu má byť v rozmedzí 5 μg/ml až 30 μg/ml).5.5. Stanovenie na HPLCVitamín E sa oddelí na C18 kolóne s reverznou fázou (4.5.1.) a koncentrácia sa meria fluorescenčným detektorom (excitácia: 295 nm, emisia: 330 nm) alebo UV detektorom (292 nm) (4.5.2.).Vstreknite alikvotnú časť (napr. 20 μl) roztoku metanolu pripraveného podľa 5.4. a vymyte mobilnou fázou (3.8.). Vypočítajte priemernú výšku píkov (plôch) z niekoľkých vstreknutí toho istého roztoku vzorky a priemernú výšku píkov (plôch) z niekoľkých vstreknutí kalibračných roztokov.Podmienky HPLCNa účely usmernenia sa poskytujú nasledovné špecifikácie, iné špecifikácie sa môžu použiť za predpokladu, že poskytnú rovnocenné výsledky.Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.5.1.): | 250 mm x 4 mm, C18, 5 alebo 10 μm balenie alebo ekvivalent |Mobilná fáza (3.8.): | zmes metanolu (3.3.) a vody, napr. 980 + 20 (v + v) |Prietoková rýchlosť: | 1 – 2 ml/min |Detektor (4.5.2.). | Fluorescenčný detektor (excitácia: 295 nm, emisia: 330 nm) alebo UV detektor (292 nm) |5.6. Kalibrácia (DL-α-tokoferol acetát alebo DL-α-tokoferol)5.6.1. Štandard DL-α-tokoferol acetátu5.6.1.1. Príprava pracovného štandardného roztokuNapipetujte 25 ml zásobného roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1.) do 500 ml banky s plochým dnom alebo Erlenmeyerovej banky (4.2.1.) a hydrolyzujte, ako je uvedené v 5.2. Potom extrahujte petroléterom (3.2.) podľa 5.3. a doplňte petroléterom do 500 ml. Odparte 25 ml tohto roztoku na rotačnej odparke (pozri 5.4.) takmer dosucha, odstráňte zvyšné rozpúšťadlo prúdom dusíka (3.9.) a zvyšok opäť rozpusťte v 25,0 ml metanolu (3.3.). Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 45,5 μg DL-α-tokoferolu na ml, ekvivalent k 50 μg DL-α-tokoferolu acetátu na ml. Pracovný kalibračný roztok sa musí pripraviť tesne pred použitím.5.6.1.2. Príprava kalibračných roztokov a kalibračná krivkaml kalibrovaných baniek, doplňte po značku metanolom (3.3.) a zamiešajte. Nominálna koncentrácia týchto roztokov je 2,5, 5,0, 10,0 and 25,0 μg/ml, t. j. 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml and 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolu.Vstreknite 20 μl každého kalibračného roztoku niekoľkokrát a stanovte priemernú výšku píkov (plôch). Zostavte kalibračnú krivku použitím priemerných výšok píkov (plôch).5.6.1.3 UV kontrola zásobného roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1.)Zrieďte etanolom 5,0 ml zásobného roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1.) na 25,0 ml a zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti etanolu (3.1.) v spektrofotometri (4.6.) v rozmedzí 250 nm a 320 nm.Absorpčné maximum má byť pri 284 nm:+++++ TIFF +++++Pri tomto zriedení sa má dosiahnuť extinčná hodnota 0,84 až 0,88.5.6.2. Štandard DL-α-tokoferolu5.6.2.1. Príprava pracovného štandardného roztokuNapipetujte 2,0 ml zásobného roztoku DL-α-tocopherolu (3.11.1.) do 50 ml kalibrovanej banky, rozpusťte v metanole (3.3.) a doplňte po značku metanolom. Nominálna koncentrácia tohto roztoku je 40 μg DL-α-tokoferolu na ml, ekvivalent k 44,0 μg DL-α-tokoferolu acetátu na ml. Pracovný kalibračný roztok sa musí pripraviť tesne pred použitím.5.6.2.2. Príprava kalibračných roztokov a kalibračná krivkaml kalibrovaných baniek, doplňte po značku metanolom (3.3.) a zamiešajte. Nominálna koncentrácia týchto roztokov je 2,0, 4,0, 8,0 and 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolu, t. j. 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml a 22,0 μg/ml DL-α-tokoferolu acetátu.Vstreknite 20 μl každého kalibračného roztoku niekoľkokrát a stanovte priemernú výšku píkov (plôch). Zostavte kalibračnú krivku použitím priemerných výšok píkov (plôch).5.6.2.3. UV kontrola zásobného roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1.)Zrieďte etanolom 2,0 ml zásobného roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1.) na 25,0 ml a zmerajte UV spektrum tohto roztoku proti etanolu (3.1.) v spektrofotometri (4.6.) v rozmedzí 250 nm a 320 nm. Absorpčné maximum má byť pri 292 nm:+++++ TIFF +++++Pri tomto zriedení sa má dosiahnuť extinčná hodnota 0,6.6. Výpočet výsledkovStanovte koncentráciu roztoku vzorky v μg/ml (vypočítané ako α-tokoferol acetát) za použitia kalibračnej krivky (5.6.1.2 alebo 5.6.2.2) z priemernej výšky píku (plochy) vitamínu E z roztoku vzorky.Obsah vitamínu E w v mg/kg vzorky je daný nasledovným vzorcom:+++++ TIFF +++++kde:β = koncentrácia vitamínu E v roztoku vzorky (5.4.) v μg/mlV1 = objem roztoku vzorky (5.4.) v mlV2 = objem alikvotnej časti z 5.4. v mlm = hmotnosť testovanej dávky v g7. Poznámky7.1. V prípade vzoriek s nízkou koncentráciou vitamínu E môže byť užitočné spojiť extrakty petroléteru z dvoch dávok zmydelnenia (navážené: 25 g) na jeden roztok vzorky pre stanovenie na HPLC.7.2. Hmotnosť vzorky odobratej na analýzu nesmie obsahovať viac ako 2 g tuku.7.3. Ak nedôjde oddeleniu fáz, pridajte približne 10 ml etanolu (3.1.) na odstránenie emulzie.7.4. Po spektrofotometrickom meraní DL-α-tokoferol acetátu alebo roztoku DL-α-tokoferolu podľa 5.6.1.3. alebo 5.6.2.3 pridajte približne 10 mg BHT (3.12.) do roztoku (3.10.1. alebo 3.10.2.) a udržujte roztok v chladničke (doba uskladnenia je maximálne štyri týždne).7.5. Namiesto BHT sa môže sa použiť hydrochinón.7.6. Separácia α-, β-, χ-, δ- tokoferolu na bežnej kolóne je možná.7.7. Namiesto roztoku askorbátu sodného sa môže použiť približne 150 g kyseliny askorbovej.7.8. Namiesto roztoku sírnika sodného sa môže použiť približne 50 mg EDTA.8. OpakovateľnosťRozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 15 % vzhľadom k vyššej hodnote.9. Výsledky kruhového testu [2]L : počet laboratóriín : počet jednotlivých hodnôtsr : štandardná odchýlka opakovateľnostisR : štandardná odchýlka reprodukovateľnostir : opakovateľnosťR : reprodukovateľnosťCVr : koeficient zmeny opakovateľnostiCVR : koeficient zmeny reprodukovateľnosti| Zmes | Zmesné krmivo | Minerálny koncentrát | Proteínové krmivo | Krmivo pre prasiatka |L | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |n | 48 | 48 | 48 | 48 | 48 |priemer [mg/kg] | 17380 | 1187 | 926 | 315 | 61,3 |sr [mg/kg] | 384 | 45,3 | 25,2 | 13,0 | 2,3 |r [mg/kg] | 1075 | 126,8 | 70,6 | 36,4 | 6,4 |CVr [%] | 2,2 | 3,8 | 2,7 | 4,1 | 3,8 |sR [mg/kg] | 830 | 65,0 | 55,5 | 18,9 | 7,8 |R [mg/kg] | 2324 | 182,0 | 155,4 | 52,9 | 21,8 |CVR [%] | 4,8 | 5,5 | 6,0 | 6,0 | 12,7 |+++++ TIFF +++++Časť C STANOVENIE TRYPTOFÁNU1. Cieľ a rozsahTáto metóda je určená na stanovenie celkového a voľného tryptofánu v krmivách. Nerozlišuje D- a L- formy.2. PrincípNa účely stanovenia celkového tryptofánu sa vzorka hydrolyzuje v alkalickom prostredí saturovaným roztokom hydroxidu barnatého a pri 110 °C sa vypaľuje 20 hodín. Po hydrolýze sa pridá interný štandard.Na účely stanovenia voľného tryptofánu sa vzorka extrahuje v mierne kyslom prostredí za prítomnosti interného štandardu.Tryptofán a interný štandard v hydrolyzáte alebo extrakte sa stanovia fluorescenčnou detekciou za použitia HPLC.3. Reagencie3.1. Musí sa použiť dvakrát destilovaná voda alebo voda rovnakej kvality (konduktivita < 10 μS/cm)3.2. Štandard: tryptofán (čistota/obsah 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným3.3. Interný štandard: α-methyl-tryptofán (čistota/obsah 99 %) vysušený vo vákuu nad oxidom fosforečným3.4. Oktahydrát hydroxidu barnatého (Ba(OH)2 · 8H2O sa nesmie nechať dlho na vzduchu, aby sa nevytváral BaCO3, ktorý môže pôsobiť rušivo pri stanovení (pozri poznámky 9.3.).3.5. Hydroxid sodný3.6. Kyselina orto-fosforečná, w = 85 %3.7. Kyselina chlorovodíková, ρ20 = 1,19 g/ml3.8. Metanol, HPLC kvalita3.9. Petroléter, interval varu 40 – 60 °C3.10. Roztok hydroxidu, c = 1 mol/l:Rozpusťte 40,0 g NaOH (3.5.) vo vode a doplňte do 1 l (3.1.).3.11. Kyselina chlorovodíková, c = 6 mol/l:492 ml HCl (3.7.) doplňte do 1 l vodou.3.12. Kyselina chlorovodíková, c = 1 mol/l:82 ml HCl (3.7.) doplňte do 1 l vodou.3.13. Kyselina chlorovodíková, c = 0,1 mol/l:8,2 ml HCl (3.7.) doplňte do 1 l vodou.3.14. Kyselina orto-fosforečná, c = 0,5 mol/l:34 ml orto-fosforečnej kyseliny (3.6.) doplňte do 1 l vodou (3.1.)3.15. Koncentrovaný roztok tryptofánu (3.2.), c = 2,50 μmol/ml:V 500 ml odmernej banke rozpusťte 0,2553 g tryprofánu (3.2.) v kyseline chlorovodíkovej (3.13.) a doplňte po značku kyselinou chlorovodíkovou (3.13.). Skladujte pri – 18 °C maximálne štyri týždne.3.16. Koncentrovaný roztok interného štandardu, c = 2,50 μmol/ml:Skladujte pri - 18 °C maximálne štyri týždne.3.17. Kalibračný štandardný roztok tryptofánu a interného štandardu:Vezmite 2,00 ml koncentrovaného roztoku tryptofánu (3.15.) a 2,00 ml koncentrátu roztoku interného štandardu (α-metyl-tryptofán) (3.16.). Zrieďte vodou (3.1.) a metanolom (3.8.) na približne rovnaký objem a rovnakú koncentráciu metanolu (10 – 30 %), ako má konečný hydrolyzát.Tento roztok sa musí pripraviť tesne pred použitím.Počas prípravy chráňte pred priamym slnečným svetlom.3.18. Kyselina octová3.19. 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanol3.20. Etanolamín > 98 %3.21. Roztok 1 g 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19.) v 100 ml metanolu (3.8.)3.22. Mobilná fáza pre HPLC: Roztok 3,00 g octovej kyseliny (3.18.) + 900 ml vody (3.1.) + 50,0 ml roztoku (3.21.) 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19.) v metanole (3.8.) (1 g/100 ml). Etanolamínom (3.20.) upravte pH na 5,00. Doplňte do 1000 ml vodou (3.1.).4. Aparatúra4.1. HPLC zariadenie so spektrofluorimetrickým detektorom4.2. Kolóna na kvapalinovú chromatografiu, 125 mm x 4 mm, C18, 3 μm balenie alebo ekvivalent4.3. pH-meter4.4. Polypropylénová banka, objem 125 ml so širokým hrdlom a závitovým uzáverom4.5. Membránový filter, 0,45 μm4.6. Autokláv, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar4.7. Mechanická trepačka alebo magnetické miešadlo4.8. Vortexové miešadlo5. Postup5.1. Príprava vzoriekVzorka sa zomelie na takú veľkosť, aby prešla 0,5 mm otvormi v site. Vlhké vzorky sa musia buď vysušiť pri teplote nepresahujúcej 50 °C alebo pred zomletím lyofilizovať. Vzorky obsahujúce vysoký obsah tuku sa majú pred zomletím extrahovať petroléterom (3.9.).5.2. Stanovenie voľného tryptofánu (extrakt)Navážte do 250 ml Erlenmeyerovej banky s presnosťou 1 mg príslušné množstvo (1 - 5 g) pripravenej vzorky (5.1.). Pridajte 100,0 ml kyseliny chlorovodíkovej, c = 0,1 mol/l (3.13.) a 5,00 ml roztoku koncentrovaného interného štandardu (3.16.). Trepte alebo miešajte 60 min. na mechanickej trepačke alebo magnetickom miešadle (4.7.). Nechajte usadiť a napipetujte do kadičky 10,0 ml roztoku supernatantu. Pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej, c = 0,5 mol/l (3.14.). Upravte na pH 3,0 hydroxidom sodným, c = 1,0 mol/l (3.10.). Pridajte dostatočné množstvo metanolu (3.8.) na dosiahnutie koncentrácie v rozmedzí 10 a 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do odmernej banky príslušný objem a zrieďte vodou na objem potrebný pre chromatografiu (približne rovnaký objem, ako má kalibračný štandardný roztok (3.17.).Pred vstreknutím do HPLC kolóny prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (4.5.). Postupujte po chromatografické stanovenie podľa odseku 5.4.Chráňte štandardný roztok a extrakty pred priamym slnečným svetlom. Nie je možné analyzovať extrakty v ten istý deň, extrakty sa môžu skladovať pri 5 °C maximálne tri dni.5.3. Stanovenie celkového tryptofánu (hydrolyzát)Navážte do polypropylénovej banky (4.4.) s presnosťou 0,2 mg od 0,1 do 1 g pripravenej vzorky (5.1.). Navážená dávka vzorky má mať obsah dusíka okolo 10 mg. Pridajte 8,4 g oktahydrátu hydroxidu barnatého (3.4.) a 10 ml vody. Zamiešajte na vortexovom miešadle (4.8.) alebo magnetickom miešadle (4.7.). Ponechajte teflónový magnet v zmesi. Zmyte steny nádoby 4 ml vody. Nasaďte závitový uzáver a voľne uzavrite banku. Preneste do autoklávu (4.6.) s horúcou vodou a parou na 30 – 60 minút. Zatvorte autokláv a autoklávujte 20 hodín pri 110 (± 2) °C.Pred otvorením autoklávy znížte teplotu tesne pod 100 °C. Pridajte teplú zmes 30 ml vody, ktorá má teplotou miestnosti, aby ste zabránili kryštalizácii Ba(OH)2 · 8 H2O. Jemne zatraste alebo zamiešajte. Pridajte 2,00 ml koncentrovaného interného roztoku štandardu (α-methyl-tryptofán) (3.16.). Ochlaďte nádoby v kúpeli voda/ľad na 15 minút.Potom pridajte 5 ml kyseliny orto-fosforečnej, c = 0,5 mol/l (3.14.). Ponechajte nádobu v chladiacom kúpeli a neutralizujte HCl, c = 6 mol/l (3.11.) za miešania a upravte pH na 3,0 pomocou HCl, c = 1 mol/l (3.12.). Pridajte dostatočné množstvo metanolu na dosiahnutie koncentrácie v rozmedzí 10 a 30 % metanolu v konečnom objeme. Preneste do odmernej banky príslušný objem a zrieďte vodou na objem potrebný pre chromatografiu (napr. 100 ml). Prídavok metanolu by nemal spôsobiť precipitáciu.Pred vstreknutím do HPLC kolóny prefiltrujte niekoľko ml roztoku cez 0,45 μm membránový filter (4.5.). Postupujte po chromatografické stanovenie podľa odseku 5.4.Chráňte štandardný roztok a hydrolyzáty pred priamym slnečným svetlom. Hydrolyzáty nie je možné analyzovať v ten istý deň, môžu sa skladovať pri 5 °C maximálne tri dni.5.4. Stanovenie za použitia HPLCNa účely usmernenia sa poskytujú nasledovné špecifikácie pre izokratickú elúciu, iné špecifikácie sa môžu použiť za predpokladu, že poskytnú rovnocenné výsledky (pozri poznámky 9.1. a 9.2.):Kolóna na kvapalinovú chromatografiu (4.2.): | 125 mm x 4 mm, C18, 3 μm balenie alebo ekvivalent |Teplota kolóny: | Teplota miestnosti |Mobilná fáza (3.22.): | Roztok 3,00 g kyseliny octovej (3.18.) + 900 ml vody (3.1.) + 50,0 ml roztoku (3.21.) 1,1,1-trichloro-2-metyl-2-propanolu (3.19.) v metanole (3.8.) (1 g/100 ml). Etanolamínom (3.20.) upravte pH na 5,00. Doplňte do 1000 ml vodou (3.1.). |Prietoková rýchlosť: | 1 ml/min |Celková doba priebehu: | približne 34 min |Vlnová dĺžka detektora: | excitácia: 280 nm, emisia: 356 nm |Vstrekovaný objem: | 20 μl |6. Výpočet výsledkov+++++ TIFF +++++A = plocha píku interného štandardu, kalibračný štandardný roztok (3.17.)B = plocha píku tryptofánu, extrakt (5.2.) alebo hydrolyzát (5.3.)C = kalibračnému roztoku (3.17.)D = koncentrácia v μmol/ml (= 2,50) koncentrovaného tryptofánového roztoku (3.15.) pridaného ku kalibračnému roztoku (3.17.)E = extrakcii (5.2.) (= 5,00 ml) alebo k hydrolyzátu (5.3.) (= 2,00 ml)F = plocha píku interného štandardu, extrakt (5.2.) alebo hydrolyzát (5.3.)G = plocha píku tryptofánu, kalibračný štandardný roztok (3.17.)H = objem v ml (= 2,00 ml) koncentrovaného interného štandardného roztoku (3.16.) pridaného ku kalibračnému roztoku (3.17.)W = hmotnosť vzorky v g (prepočítaná na pôvodnú hmotnosť, ak bola vysušená alebo zbavená tuku.MW = molekulárna hmotnosť tryptofánu (= 204,23)7. OpakovateľnosťRozdiel medzi výsledkami dvoch paralelných stanovení vykonaných na tej istej vzorke nesmie presiahnuť 10 % vzhľadom k najvyššej hodnote.8. Výsledky kruhového testuPri kruhovom teste spoločenstva (štvrtý porovnávací test) až 12 laboratórií analyzovalo tri vzorky s cieľom potvrdenia hydrolyzačnej metódy. Každá vzorka sa analyzovala viackrát (5). Výsledky sú uvedené v nasledovnej tabuľke:L : počet laboratórií poskytujúcich výsledkyn : počet jednotlivých výsledkov získaný elimináciou extrémnych hodnôt (získané Cochranovým a Dixonovým testom pre extrémne hodnoty)sr : štandardná odchýlka opakovateľnostisR : štandardná odchýlka reprodukovateľnostir : opakovateľnosťR : reprodukovateľnosťCVr : koeficient zmeny opakovateľnosti, %CVR : koeficient zmeny reprodukovateľnosti, %| Vzorka 1 Krmivo pre ošípané | Vzorka 2 Krmivo pre ošípané s L - tryptofánom | Vzorka 3 Koncentrát krmiva pre ošípané |L | 12 | 12 | 12 |n | 50 | 55 | 50 |priemer [g/kg] | 2,42 | 3,40 | 4,22 |sr [g/kg] | 0,05 | 0,05 | 0,08 |r [g/kg] | 0,14 | 0,14 | 0,22 |CVr [%] | 1,9 | 1,6 | 1,9 |sR [g/kg] | 0,15 | 0,20 | 0,09 |R [g/kg] | 0,42 | 0,56 | 0,25 |CVR [%] | 6,3 | 6,0 | 2,2 |Pri kruhovom teste spoločenstva (tretí porovnávací test) až 13 laboratórií analyzovalo dve vzorky s cieľom potvrdenia metódy na extrakciu voľného tryptofánu. Každá vzorka sa analyzovala viackrát (5x). Výsledky sú uvedené v nasledovnej tabuľke:L : počet laboratórií poskytujúcich výsledkyn : počet jednotlivých výsledkov získaných elimináciou extrémnych hodnôt (získané Cochranovým a Dixonovým testom pre extrémne hodnoty)sr : štandardná odchýlka opakovateľnostisR : štandardná odchýlka reprodukovateľnostir : opakovateľnosťR : reprodukovateľnosťCVr : koeficient zmeny opakovateľnosti, %CVR : koeficient zmeny reprodukovateľnosti, %| Vzorka 1 Zmes pšenice a sóje | Vzorka 2 Zmes pšenice a sóje (vzorka 4) s prídavkom tryptofánu (0,457 g/kg) |L | 12 | 12 |n | 55 | 60 |priemer [g/kg] | 0,391 | 0,931 |sr [g/kg] | 0,005 | 0,012 |r [g/kg] | 0,014 | 0,034 |CVr [%] | 1,34 | 1,34 |sR [g/kg] | 0,018 | 0,048 |R [g/kg] | 0,050 | 0,134 |CVR [%] | 4,71 | 5,11 |Vykonal sa ďalší porovnávací test, kde až 7 laboratórií analyzovalo štyri vzorky s cieľom potvrdenia metódy hydrolýzu tryptofánu. Výsledky sú uvedené nižšie. Každá vzorka sa analyzovala päťkrát.L : počet laboratórií poskytujúcich výsledkyn : počet jednotlivých výsledkov získaných elimináciou extrémnych hodnôt (získané Cochranovým a Dixonovým testom pre extrémne hodnotysr : štandardná odchýlka opakovateľnostisR : štandardná odchýlka reprodukovateľnostir : opakovateľnosťR : reprodukovateľnosťCVr : koeficient zmeny opakovateľnosti, %CVR : koeficient zmeny reprodukovateľnosti, %| Vzorka 1 (Zmiešané krmivo pre ošípané) (CRM 117) | Vzorka 2 Rybia múčka s nízkym obsahom tuku (CRM 118) | Vzorka 3 Sójová múčka (CRM 119) | Vzorka 4 Sušené odstredené mlieko (CRM 120) |L | 7 | 7 | 7 | 7 |n | 25 | 30 | 30 | 30 |priemer [g/kg] | 2,064 | 8,801 | 6,882 | 5,236 |sr [g/kg] | 0,021 | 0,101 | 0,089 | 0,040 |r [g/kg] | 0,059 | 0,283 | 0,249 | 0,112 |CVr [%] | 1,04 | 1,15 | 1,30 | 0,76 |sR [g/kg] | 0,031 | 0,413 | 0,283 | 0,221 |R [g/kg] | 0,087 | 1,156 | 0,792 | 0,619 |CVR [%] | 1,48 | 4,69 | 4,11 | 4,22 |9. Poznámky9.1. Nasledovné špeciálne chromatografické podmienky môžu poskytnúť lepšiu separáciu tryptofánu a α-methyl-tryptofánu.Izokratická elúcia nasleduje po prečistení kolóny gradientom:Kolóna na kvapalinovú chromatografiu: | 125 mm x 4 mm, C18, 5 μm balenie alebo ekvivalent |Teplota kolóny: | 32 °C |Mobilná fáza: | A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (V + V) B: Metanol |Zostava gradientu: | 0 min | 100 % A | 0 % B |15 min | 100 % A | 0 % B |17 min | 60 % A | 40 % B |19 min | 60 % A | 40 % B |21 min | 100 % A | 0 % B |33 min | 100 % A | 0 % B |Prietoková rýchlosť: | 1,2 ml/min |Celková doba priebehu: | približne 33 min |9.2. Chromatografia sa môže odlišovať v závislosti na type HPLC a použitého balenia kolóny. Vybratý systém musí mať schopnosť poskytnúť základnú líniu separácie medzi tryptofánom a interným štandardom. Ďalej je dôležité, aby degradačné produkty boli dobre oddelené od tryptofánu a interného štandardu. Hydrolyzáty bez interného štandardu sa majú analyzovať, aby sa analyzovala základná línia na nečistoty pod internými štandardami. Je dôležité, aby bola doba priebehu dostatočne dlhá na elúciu všetkých degradačných produktov, v opačnom prípade môžu elučné píky interferovať s následnými chromatografickými priebehmi.V rozsahu svojej činnosti má chromatografický systém poskytovať lineárnu odozvu. Lineárna odozva sa má merať konštantnou (bežnou) koncentráciu interného štandardu a meniacimi sa koncentráciami tryptofánu. Je dôležité, aby veľkosť píkov tryptofánu a interného štandardu boli v rámci lineárneho rozsahu HPLC/fluorescenčného systému. Ak je (sú) píky tryptofánu a/alebo interného štandardu príliš malé alebo vysoké, analýza sa má opakovať pri inej veľkosti vzorky a/alebo zmenenom konečnom objeme.9.3. Hydroxid barnatýČím je hydroxid barnatý starší, tým sa ťažšie rozpúšťa. Toto môže viesť k tomu, že stanovenie na HPLC môže poskytnúť nízke hodnoty tryptofánu.[1] Uskutočnené pracovnou skupinou pre potraviny Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).[2] Uskutočnené pracovnou skupinou pre potraviny Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).--------------------------------------------------


title: Smernica Rady 81/1057/EHS zo 14. decembra 1981, ktorou sa dopĺňajú Smernice 75/362/EHS, 77/452/EHS a 78/1026/EHS o vzájomnom uznávaní diplomov, osvedčení a iných dokladov o formálnych kvalifikáciách lekárov, sestier zodpovedných za všeobecnú starostlivosť, zubných lekárov a veterinárnych lekárov so zreteľom na nadobudnuté práva

text:
Dôležité právne oznámenie

|

31981L1057

Úradný vestník L 385 , 31/12/1981 S. 0025 - 0026 Fínske špeciálne vydanie: Kapitola 16 Zväzok 1 S. 0050  Španielske špeciálne vydanie: Kapitola 06 Zväzok 2 S. 0126  Švédske špeciálne vydanie: Kapitola 16 Zväzok 1 S. 0050  Portugalské špeciálne vydanie Kapitola 06 Zväzok 2 S. 0126

		Smernica Rady 81/1057/EHSzo 14. decembra 1981,ktorou sa dopĺňajú smernice 75/362/EHS, 77/452/EHS a 78/1026/EHS o vzájomnom uznávaní diplomov, osvedčení a iných dokladov o formálnych kvalifikáciách lekárov, sestier zodpovedných za všeobecnú starostlivosť, zubných lekárov a veterinárnych lekárov so zreteľom na nadobudnuté právaRADA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho hospodárskeho spoločenstva, a najmä jej články 49, 57 a 66,so zreteľom na návrh Komisie [1],so zreteľom na stanovisko Zhromaždenia [2],so zreteľom na stanovisko Hospodárskeho a sociálneho výboru [3],keďže v smerniciach 3375/362/EHS [4], 77/452/EHS [5], 78/686/EHS [6] a 78/1026/EHS [7] o vzájomnom uznávaní diplomov, osvedčení a iných dokladov o formálnych kvalifikáciách lekárov, zdravotných sestier zodpovedných za všeobecnú starostlivosť, zubných lekárov a veterinárnych lekárov, vrátane opatrení na uľahčenie účinného uplatňovania práva usadiť sa a voľné poskytovanie služieb, sa ustanovenia týkajúce sa nadobudnutých práv vzťahujú na diplomy, osvedčenia a iné doklady o formálnych kvalifikáciách lekárov, zdravotných sestier zodpovedných za všeobecnú starostlivosť, zubných lekárov a zverolekárov, vydaných členskými štátmi pred vykonaním uvedených smerníc;keďže tieto ustanovenia výslovne nezahŕňajú diplomy, osvedčenia a iné doklady o formálnych kvalifikáciách, ktoré sú dokladom o odbornom vzdelaní nespĺňajúcom minimálne požiadavky na odborné vzdelanie stanovené v smerniciach 75/363/EHS [8], 77/453/EHS [9], 78/687/EHS [10] a 78/1027/EHS [11], ktoré bolo ukončené po vykonaní uvedených smerníc, ale ktoré sa začalo pred ich vykonaním;keďže je potrebné napraviť toto opomenutie,PRIJALA TÚTO SMERNICU:Článok 1Článok 9 ods. 1 a 2 smernice 75/362/EHS, článok 4 smernice 77/452/EHS, článok 7 ods. 1 a 2 smernice 78/686/EHS a článok 4 smernice 78/1026/EHS platia tiež pre diplomy, osvedčenia a iné doklady o formálnych kvalifikáciách, ktoré potvrdzujú absolvovanie odborného vzdelania, nespĺňajúceho minimálne požiadavky na odborné vzdelanie, uvedené v článkoch 1, 2, 3, 4 a 5 smernice 75/363/EHS, článku 1 smernice 77/453/EHS, článkoch 1, 2 a 3 smernice 78/687/EHS a článku 1 smernice 78/1027/EHS a ktoré bolo dokončené po vykonaní týchto smerníc, ale začalo sa pred ich vykonaním.Článok 2Členské štáty prijmú opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou najneskôr do 30. júna 1982. Bezodkladne o tom informujú Komisiu.Článok 3Táto smernica je adresovaná členským štátom.V Bruseli 14. decembra 1981Za RadupredsedaG. Howe[1] Ú. v. ES C 121, 23.5.1981, s. 3.[2] Ú. v. ES C 172, 13.7.1981, s. 114.[3] Ú. v. ES C 185, 27.7.1981, s. 7.[4] Ú. v. ES L 167, 30.6.1975, s. 1.[5] Ú. v. ES L 176, 15.7.1977, s. 1.[6] Ú. v. ES L 233, 24.8.1978, s. 1.[7] Ú. v. ES L 362, 23.12.1978, s. 1.[8] Ú. v. ES L 167, 30.6.1975, s. 14.[9] Ú. v. ES L 176, 15.7.1977, s. 8.[10] Ú. v. ES L 233, 24.8.1978, s. 10.[11] Ú. v. ES L 362, 23.12.1978, s. 7.--------------------------------------------------