title: Directiva 98/73/CE a Comisiei din 18 septembrie 1998 de efectuare a celei de-a douăzeci și patra adaptări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a Consiliului privind armonizarea actelor cu putere de lege și a actelor administrative privind clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoaseText cu relevanță pentru SEE.

text:
               13/Volumul 24

               RO

               Jurnalul Ofícial al Uniunii Europene

               125

         31998L0073

               L 305/1

               JURNALUL OFÍCIAL AL UNIUNII EUROPENE

      DIRECTIVA 98/73/CE A COMISIEI

   din 18 septembrie 1998
   de efectuare a celei de-a douăzeci și patra adaptări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a Consiliului privind armonizarea actelor cu putere de lege și a actelor administrative privind clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoase
   (Text cu relevanță pentru SEE)
   COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,
   având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Europene,
   având în vedere Directiva 67/548/CEE a Consiliului din 27 iunie 1967 privind armonizarea actelor cu putere de lege și a actelor administrative privind clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoase (1), astfel cum a fost modificată ultima dată prin Directiva 97/69/CE a Comisiei (2), în special articolul 28,
   întrucât anexa I la Directiva 67/548/CEE conține o listă de substanțe periculoase specificând pentru fiecare clasificarea și modalitățile de etichetare; întrucât, din cunoștințele științifice și tehnice actuale, reiese că lista cu substanțe periculoase din anexa menționată trebuie adaptată și completată;
   întrucât anexa V la Directiva 67/548/CEE definește metodele pentru determinarea proprietăților fizico-chimice, a toxicității și ecotoxicității substanțelor și preparatelor; întrucât este necesară adaptarea acestei anexe la progresul tehnic;
   întrucât măsurile prevăzute de prezenta directivă sunt conforme cu avizul Comitetului pentru adaptarea la progresul tehnic a directivelor privind eliminarea barierelor tehnice din calea comerțului cu substanțe și preparate periculoase,
   ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ:
   Articolul 1
   Directiva 67/548/CEE se modifică după cum urmează:

               1.

               Anexa I se modifică după cum urmează:

                           (a)

                           intrările din anexa I la prezenta directivă înlocuiesc intrările corespunzătoare din anexa I la Directiva 67/548/CEE;

                           (b)

                           intrările din anexa II la prezenta directivă se introduc în anexa I la Directiva 67/548/CEE.

               2.

               Anexa V se modifică după cum urmează:

                           (a)

                           în partea A din anexa V la Directiva 67/548/CEE se introduc textele anexelor III A, III B și III C la prezenta directivă;

                           (b)

                           în partea C din anexa V la Directiva 67/548/CEE se introduce textul anexei III D la prezenta directivă.

         Articolul 2
   Statele membre adoptă și pun în aplicare actele cu putere de lege și actele administrative necesare aducerii la îndeplinire a prezentei directive până la 31 octombrie 1999. Acestea informează de îndată Comisia cu privire la aceasta.
   Atunci când statele membre adoptă aceste dispoziții, ele cuprind o trimitere la prezenta directivă sau sunt însoțite de o asemenea trimitere la data publicării lor oficiale. Statele membre stabilesc modalitatea de efectuare a acestei trimiteri.
   Articolul 3
   Prezenta directivă intră în vigoare în a douăzecea zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Comunităților Europene.
   Articolul 4
   Prezenta directivă se adresează statelor membre.

      Adoptată la Bruxelles, 18 septembrie 1998.

            Pentru Comisie,

         Ritt BJERREGAARD

            Membru al Comisiei

      (1)  JO L 196, 16.8.1967, p. 1.

      (2)  JO L 343, 13.12.1997, p. 19.
   ANEXO IBILAG IANHANG IΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IANNEX IANNEXE IALLEGATO IBIJLAGE IANEXO ILIITE IBILAGA I

   ANEXO IIBILAG IIANHANG IIΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IIANNEX IIANNEXE IIALLEGATO IIBIJLAGE IIANEXO IILIITE IIBILAGA II

   ANEXA III A
   A.18. DETERMINAREA MASEI MOLECULARE NUMERICE MEDII ȘI A DISTRIBUȚIEI MASELOR MOLECULARE A POLIMERILOR
   1.   METODA
   Această metodă cromatografică pe gel permeabil urmează orientarea OCDE TG 118 (1996). Principiile fundamentale și toate celelalte informații tehnice sunt prezentate în bibliografie.
   1.1.   Introducere
   Proprietățile polimerilor sunt atât de diversificate, încât este imposibil de descris o metodă unică, care să indice cu precizie condițiile de separare și evaluare, care să acopere toate eventualitățile și particularitățile întâlnite la separarea polimerilor. Sistemele complexe de polimeri, în special, se pretează mai rar la cromatografia pe gel permeabil. În cazul în care cromatografia pe gel permeabil nu este aplicabilă, se poate determina conținutul de polimeri cu masă moleculară medie, utilizând alte metode (vezi anexa). Într-o astfel de situație, este necesară furnizarea tuturor detaliilor legate de metoda folosită, cu justificarea alegerii.
   Metoda descrisă în continuare se bazează pe norma DIN 55672 (1). Aceasta furnizează indicații detaliate asupra modului de realizare a experiențelor și de evaluare a rezultatelor. Dacă este necesară modificarea condițiilor experimentale, schimbările trebuie justificate. Pot fi utilizate alte normative, cu condiția menționării tuturor referințelor. Metoda descrisă utilizează pentru etalonare eșantioane de polistiren a căror polidispersie este cunoscută și ar putea fi, probabil, adaptată pentru cazul altor polimeri, de exemplu polimerii solubili în apă și polimerii ramificați cu catenă lungă.
   1.2.   Definiții și unități
   Masa moleculară numerică medie Mn și masa moleculară medie ponderală Mw se determină prin ecuațiile următoare:

   unde:

               Hi

               este amplitudinea semnalului detectat, corespunzător volumului de retenție Vi, față de nivelul de referință;

               Mi

               este masa moleculară a fracțiunii de polimer, corespunzătoare volumului de retenție Vi și

               n

               este numărul de puncte experimentale.

         Lărgimea distribuției maselor moleculare, care reprezintă o măsură a polidispersiei sistemului este exprimată de raportul Mw/Mn.
   1.3.   Substanțe de referință
   Metoda cromatografiei pe gel permeabil este o metodă relativă, fiind necesar să se procedeze la o etalonare. În general, aceasta se realizează cu ajutorul polistirenilor etalon cu lanț liniar și distribuție îngustă, pentru care se cunosc atât masele moleculare medii Mn și Mw, cât și distribuția maselor moleculare. Curba de etalonare nu poate fi utilizată pentru determinarea masei moleculare a unui eșantion necunoscut decât dacă condițiile de separare a eșantioanelor și etaloanelor au fost selecționate într-un mod identic.
   O relație determinată între masa moleculară și volumul de eluare nu este valabilă decât în condițiile particulare ale unei experiențe date. Printre aceste condiții figurează, înainte de toate: temperatura, solventul (sau amestecul de solvenți), condițiile cromatografice, precum și coloana de separare sau sistemul de coloane.
   Masele moleculare ale eșantioanelor determinate prin această metodă constituie valori relative; le vom numi „mase moleculare în echivalent-polistiren”. Aceasta semnifică faptul că, în funcție de diferențele chimice și structurale dintre eșantioanele testate și etaloane, masele moleculare pot devia față de valorile absolute, într-o manieră mai mult sau mai puțin importantă. Dacă sunt utilizate alte etaloane, de exemplu polietilenglicol, poli(etilenoxid), poli(metacrilat de metil) sau acid poliacrilic, este important să se justifice motivul.
   1.4.   Principiul metodei
   Cromatografia pe gel permeabil permite determinarea distribuției maselor moleculare, precum și a maselor moleculare medii (Mn, Mw). Cromatografia pe gel permeabil reprezintă o metodă particulară de cromatografie lichidă, în cadrul căreia eșantionul pentru testat este separat în funcție de volumul hidrodinamic al fiecărui constituent (2).
   Separarea se efectuează pe măsură ce eșantionul înaintează printr-o coloană umplută cu un material poros, în general un gel organic. Moleculele mici pot penetra în pori, în vreme ce moleculele mari sunt excluse. Din acest motiv, traseul moleculelor mari este mai scurt; acestea sunt separate primele. Moleculele de dimensiuni medii penetrează parțial în pori, fiind separate mai târziu. Moleculele cele mai mici, a căror rază hidrodinamică medie este mai mică decât cea a porilor de gel, pot penetra în toți porii. Acestea vor fi eluate ultimele.
   În situația ideală, dimensiunea speciilor moleculare este cea care decide integral separarea, dar în practică este greu de evitat interferența unor fenomene de absorbție. O umplere neregulată a coloanei, ca și existența unui volum mort important, pot agrava situația (2).
   Detecția se efectuează, de exemplu, prin măsurarea indicelui de refracție sau al absorbției în UV, pentru realizarea unei curbe de distribuție simple. Totuși, pentru a putea asocia acestei curbe valorile maselor moleculare reale, este necesară etalonarea coloanei prin trecerea unui polimer cu masa moleculară cunoscută și, în cazul ideal, cu o structură cât mai apropiată, de exemplu diferiți polistireni standard. În general, se va obține o curbă Gauss; uneori, aceasta poate prezenta o asimetrie, pe partea maselor moleculare mici; axa verticală indică cantitatea (greutatea) speciilor de diferite mase moleculare eluate, iar pe axa orizontală figurează logaritmul masei moleculare.
   1.5.   Criterii calitative
   Reproductivitatea (deviația-standard relativă) a volumului de eluare trebuie să fie cel mult egală cu 0,3 %. Există modalități de ameliorare a reproductivității de analiză, grație unei corecții ce utilizează un standard intern, dacă un cromatograf este evaluat în funcție de timp și nu satisface criteriile menționate mai sus [vezi informațiile complementare la (1)]. Polidispersările depind de masele moleculare ale etaloanelor. În cazul polistirenilor etalon, valorile tipice sunt:

               MP < 2 000

               Mw/Mn < 1,20

               2 000 ≤ MP ≤ 106

               Mw/Mn < 1,05

               MP > 106

               Mw/Mn < 1,20

         (MP este masa moleculară a etalonului, corespunzătoare semnalului maxim).
   1.6.   Descrierea metodei
   1.6.1.   Prepararea soluțiilor etalon de polistiren
   Se vor dizolva polistirenii etalon, amestecând cu grijă până la diluția aleasă. Soluțiile se vor prepara ținând cont de recomandările fabricantului.
   Concentrațiile etaloanelor alese depind de diferiți factori, cum ar fi: volumul de injecție, viscozitatea soluției și sensibilitatea detectorului. Volumul de injecție maxim trebuie să fie adaptat lungimii coloanei, având grijă să nu o supraîncarce. Volumele de injecție curente pentru separările analitice prin metoda cromatografică pe gel permeabil, pentru o coloană de 30 cm × 7,8 mm, variază de obicei între 40 și 100 μl. Se pot obține și volume mai mari, dar acestea nu trebuie să depășească 250 μl. Se va determina raportul optim între volumul de injecție și concentrație, înainte de etalonarea coloanei.
   1.6.2.   Prepararea soluției de eșantion
   În principiu, prepararea soluțiilor de eșantion se realizează în condiții identice. Eșantionul se dizolvă într-un solvent adecvat, de exemplu THF, agitând cu grijă. În nici un caz nu se va dizolva într-o baie cu ultrasunete. Dacă este necesar, soluția de probă se purifică cu ajutorul unui filtru cu membrană, cu dimensiunea porilor cuprinsă între 0,2-2 μm.
   Prezența particulelor nedizolvate trebuie menționată în raportul final, în măsura în care acestea pot rezulta din specii cu mase moleculare mari. Trebuie să se recurgă la o metodă potrivită pentru determinarea procentajului în greutate al particulelor nedizolvate. Analiza soluțiilor se va face în termen de 24 ore.
   1.6.3.   Aparatură
   Un aparat pentru cromatografie pe gel permeabil este compus din următoarele elemente:

               —

               un rezervor pentru solvent;

               —

               un sistem pentru degazare (dacă este necesar);

               —

               o pompă;

               —

               un amortizor de impulsuri (dacă este necesar);

               —

               un sistem de injecție;

               —

               coloane cromatografice;

               —

               un detector;

               —

               un debitmetru (dacă este necesar);

               —

               un sistem de înregistrare și tratare a datelor;

               —

               un recipient pentru recuperarea soluțiilor utilizate.

         Sistemul cromatografic pe gel permeabil trebuie să fie inert față de solventul utilizat (de exemplu utilizarea capilarelor din oțel, atunci când solvent este THF).
   1.6.4.   Injecția și sistemul de pompare a solventului
   Un volum definit din soluția de probă este injectat în coloană, într-o zonă bine definită, cu ajutorul unui aparat pentru eșantionare automată sau manuală. Dacă se operează manual, retragerea ori împingerea prea bruscă a pistonului seringii poate determina modificări în distribuția maselor moleculare observate. Este indicat ca sistemul de pompare a solventului să fie lipsit de pulsații; este de preferat ca acesta să includă un amortizor de impulsuri. Debitul este de ordinul a 1 ml/min.
   1.6.5.   Coloana
   În funcție de natura eșantionului testat, polimerul se caracterizează făcând recurs la o singură coloană sau la mai multe coloane, conectate în serie. În comerț sunt disponibile mai multe materiale poroase pentru coloane, cu proprietăți definite (de exemplu dimensiunea porilor, limita de excludere). Alegerea unui gel de separare sau a lungimii de coloană depinde, pe de o parte, de proprietățile eșantionului testat (volume hidrodinamice, distribuția maselor moleculare) și, pe de altă parte, de condițiile particulare ale separării, cum ar fi: natura solventului, temperatura și debitul (1) (2) (3).
   1.6.6.   Talere teoretice
   Coloana (sau combinația de coloane) utilizată pentru separare trebuie caracterizată prin numărul de talere teoretice. Pentru aceasta, în cazul în care solventul de eluare este THF, se trece o soluție de etilbenzen sau o altă substanță dizolvată nepolară potrivită printr-o coloană de lungime cunoscută. Numărul de talere teoretice este dat de ecuația următoare:

       sau
   unde:

               N

               este numărul de talere teoretice

               Ve

               este volumul de eluare, corespunzător semnalului maxim

               W

               este lărgimea semnalului maxim, la nivelul liniei de bază

               W1/2

               este lărgimea semnalului maxim, la jumătatea înălțimii coloanei.

         1.6.7.   Eficacitatea separării
   În afară de numărul de talere teoretice, parametru determinant al lărgimii de bandă, eficacitatea de separare este o altă importantă caracteristică determinată de panta curbei de calibrare. Eficacitatea de separare a unei coloane se calculează cu ajutorul relației următoare:

   unde

               Ve, Mx

               este volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară Mx,

               Ve, (10Mx)

               este volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară de 10 ori mai mare.

         Rezoluția sistemului este în general definită după cum urmează:

   unde

               Ve1 și Ve2

               sunt volumele de eluare ale celor doi polistireni standard la semnalul maxim,

               W1 și W2

               sunt lărgimile vârfului la nivelul liniei bazei,

               M1 și M2

               sunt masele moleculare corespunzătoare semnalului maxim (aceste mase ar trebui să fie diferite printr-un factor 10).

         Valoarea lui R pentru sistemul de coloane trebuie să fie superioară valorii de 1,7 (4).
   1.6.8.   Solvenți
   Toți solvenții trebuie să aibă o mare puritate (se va folosi THF de puritate 99,5 %). Rezervorul pentru solvent (la nevoie, pus în atmosferă de gaz inert) trebuie să fie suficient de mare pentru a permite etalonarea coloanei și mai multe analize de eșantioane. Solventul va fi degazat înainte de a fi pompat în coloană.
   1.6.9.   Reglarea temperaturii
   Temperatura componentelor interne critice (bucla de injecție, coloana sau coloanele, detectorul și tuburile) trebuie să fie constantă și compatibilă cu solventul ales.
   1.6.10.   Detectorul
   Detectorul înregistrează în mod cantitativ concentrația eșantionului eluat din coloană. Pentru evitarea unei lărgimi nedorite a picului, volumul cuvei detectorului va fi ales cât mai mic posibil. Acesta nu trebuie să depășească 10 μl, cu excepția detectoarelor ce funcționează prin difuzia luminii și a viscozimetrelor. În general, detecția se realizează prin refractometrie diferențială. Totuși, dacă proprietățile specifice ale eșantionului sau ale solventului pentru eluare o cer, se pot folosi alte tipuri de detectoare, cum ar fi cele UV/VIS sau IR, viscozimetrele etc.
   2.   REZULTATE ȘI PROCESUL VERBAL AL TESTĂRII
   2.1.   Rezultate
   Se va face referință la normele DIN (1) în ceea ce privește criteriile de evaluare detaliate, la fel pentru specificațiile relative la colectarea și interpretarea datelor.
   Pentru fiecare eșantion analizat, se vor realiza două experiențe independente. Rezultatele acestora se vor analiza separat.
   Parametrii Mn, Mw, Mw/Mn, Mp se determină pentru fiecare măsurătoare. Trebuie indicat în mod explicit că valorile măsurate sunt valori relative corespunzând unor echivalenți de masă moleculară ale standardului folosit.
   După determinarea volumelor și a timpilor de retenție (eventual corectate cu ajutorul unui standard intern) se vor reprezenta grafic valorile log MP (MP fiind semnalul maxim al polimerilor standard), în funcție de una dintre acele cantități. Sunt necesare cel puțin 2 puncte de etalonare pentru fiecare factor 10 de masă moleculară. Pentru trasarea întregii curbe sunt necesare cel puțin 5 puncte de măsură; această curbă va acoperi masa moleculară estimată a eșantionului. Punctul extrem al curbei de etalonare, spre partea maselor moleculare mici, se poate defini folosind n-hexilbenzenul sau altă substanță dizolvată nepolară adecvată. Masele moleculare medii, ca număr și ca greutate, sunt în general determinate prin prelucrarea informatică a datelor, bazată pe formule menționate la punctul 1.2. Dacă s-a optat pentru o prelucrare manuală, este indicat să se consulte ASTM D 3536-91 (3).
   Curba de distribuție va fi prezentată sub forma unui tabel sau a unui grafic (frecvența diferențială sau procentajele cumulative în funcție de log M). În cazul reprezentării grafice, o putere de 10 pentru masa moleculară corespunde în mod normal unei lărgimi de aproximativ 4 cm, în vreme ce pentru maximul de semnal este adecvată o înălțime de aproximativ 8 cm. În cazul curbelor de distribuție cumulative, diferența între 0 – 100 % pe axa ordonatei trebuie să fie în jur de 10 cm.
   2.2.   Procesul-verbal al testării
   Procesul-verbal al experimentului va cuprinde informațiile următoare:
   2.2.1.   Substanța testată

               —

               informații disponibile legate de substanța testată (natură, aditivi, impurități);

               —

               descrierea tratamentului aplicat eșantionului, observații, probleme.

         2.2.2.   Dispozitivul experimental

               —

               un rezervor pentru solvent, gaz inert, sistem pentru degazarea solventului, compoziția solventului, impurități;

               —

               pompă, amortizor de impulsuri, sistem de injecție;

               —

               coloane de separare (fabricant, toate precizările legate de caracteristicile coloanei, cum ar fi dimensiunea porilor, natura materialului de separare etc., numărul, lungimea și ordinul coloanelor utilizate);

               —

               numărul de talere teoretice ale coloanei (sau al combinației de coloane), eficacitatea separării (resorbția sistemului);

               —

               informații legate de simetria semnalelor maxime;

               —

               temperatura coloanei, modul de reglare a temperaturii;

               —

               detector (principiul de măsurare, tip, volumul cuvei);

               —

               debitmetru, dacă există (fabricant, principiul de măsurare);

               —

               sistemul utilizat pentru culegere și prelucrarea datelor (echipament și programe informatice).

         2.2.3.   Etalonarea sistemului

               —

               descrierea detaliată a metodei utilizate pentru determinarea curbei de etalonare;

               —

               precizări asupra criteriilor de calitate proprii acestei metode (de exemplu coeficientul de corelare, eroarea pătratică medie etc.);

               —

               informații asupra tuturor extrapolărilor, ipotezelor și aproximărilor efectuate în cursul proceselor experimentale, precum și asupra evaluării și prelucrării datelor;

               —

               toate măsurătorile efectuate pentru stabilirea curbei de etalonare trebuie prezentate sub forma unui tabel care cuprinde, pentru fiecare punct de etalonare, următoarele informații:

                           —

                           denumirea eșantionului;

                           —

                           fabricantul eșantionului;

                           —

                           valorile caracteristice MP, Mn, Mw, Mw/Mn ale etaloanelor furnizate de fabricant, deduse din măsurătorile ulterioare, completate de indicațiile legate de metoda de determinare;

                           —

                           volumul de injecție și concentrația soluției injectate;

                           —

                           valoarea de MP utilizată pentru etalonare;

                           —

                           volumul de eluare sau timpul de retenție corectat, măsurat la semnalul maxim;

                           —

                           MP calculat la semnalul maxim;

                           —

                           procentajul de eroare la MP calculat și la valoarea de etalonare.

         2.2.4.   Evaluare

               —

               evaluare în funcție de timp: toate metodele care vizează ameliorarea reproductivității cerute (metode de corecție, standard intern etc.);

               —

               se precizează dacă evaluarea s-a efectuat plecând de la volumul de eluare sau de la timpul de retenție;

               —

               se indică limitele de evaluare, dacă un pic nu a fost complet analizat;

               —

               se descriu metodele de netezire, dacă s-au folosit;

               —

               se indică procedeele de preparare și pretratare a eșantionului;

               —

               dacă există, se indică prezența particulelor nedizolvate;

               —

               se indică volumul de injecție (μl) și concentrația de injecție (mg/ml);

               —

               se menționează observațiile privind efectele generatoare de deviații, în raport cu profilul ideal de cromatografie pe gel permeabil;

               —

               se descriu în detaliu toate modificările aduse procedurilor de analiză;

               —

               se precizează intervalele de eroare;

               —

               se consemnează orice alte informații și observații utile pentru interpretarea rezultatelor.

         3.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

               (1)

               DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatografie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

               (2)

               Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatogrphy, J. Wiley & Sons.

               (3)

               ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPG). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

               (4)

               ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

         Anexă
   Exemple de alte metode de determinare a masei moleculare numerice medii (Mn) a polimerilor
   Cromatografia pe gel permeabil reprezintă metoda preferată pentru determinarea Mn, mai ales atunci când dispunem de un ansamblu de substanțe standard cu o structură comparabilă cu cea a polimerului. Totuși, atunci când folosirea metodei cromatografiei pe gel permeabil prezintă dificultăți practice sau când ne putem aștepta ca substanța să nu satisfacă un criteriu reglementar pentru Mn (ceea ce cere o confirmare), există metode alternative, ca de exemplu:
   1.   Utilizarea proprietăților coligative
   1.1.   Ebulioscopia și crioscopia înseamnă măsurarea creșterii punctului de fierbere (ebulioscopia) sau coborârii punctului de congelare (crioscopia) ale unui solvent atunci când este adăugat un polimer. Metoda se bazează pe faptul că dizolvarea unui polimer într-un lichid are un efect asupra punctelor de fierbere sau de congelare ale acestuia care depinde de masa moleculară a polimerului (1) (2).
   Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20 000.
   1.2.   Coborârea presiunii vaporilor consistă în măsurarea presiunii vaporilor unui lichid de referință înainte și după adăugarea unor cantități stabilite de polimeri (1) (2).
   Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20 000 (în teorie; în practică, nu reprezintă decât o valoare limitată).
   1.3.   Osmometria cu membrană se bazează pe principiul osmozei, adică tendința naturală a moleculelor de solvent de a traversa o membrană semipermeabilă plecând de la o soluție diluată către o soluție concentrată, așa încât să se realizeze echilibrul. În experiment, concentrația soluției diluate este nulă, în timp ce soluția concentrată conține polimerul. Trecerea solventului de-a lungul membranei induce o diferență de presiune care depinde de concentrație și de masa moleculară a polimerului (1) (3) (4).
   Domeniul de aplicare corespunde valorilor lui Mn între 20 000 și 200 000.
   1.4.   Osmometria - faza de vapori constă în comparația vitezei de evaporare a unui aerosol de solvent pur cu viteza a cel puțin trei aerosoli care conțin polimerul la diferite concentrații (1) (5) (6).
   Domeniul de aplicare corespunde unei Mn < 20 000.
   2.   Analiza grupurilor terminale
   Pentru a se utiliza această metodă, trebuie cunoscute atât structura globală a polimerului, cât și natura grupurilor terminale situate în capetele catenei (acestea trebuie să poată fi diferențiate de catena principală, de exemplu prin spectrul lor RMN sau prin titrarea și formarea derivaților). Determinarea concentrației moleculare a grupurilor terminale prezente pe polimer poate apoi să furnizeze o valoare a masei moleculare (7) (8) (9).
   Domeniul de aplicare corespunde valorilor lui Mn, ce pot atinge valoarea de 50 000 (cu o fiabilitate descrescătoare).
   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE LA ANEXĂ

               (1)

               Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.

               (2)

               Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

               (3)

               ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

               (4)

               Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25-52.

               (5)

               ASTM D 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

               (6)

               Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons.

               (7)

               Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K.-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, München.

               (8)

               Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

               (9)

               Amiya, S., et.al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

         ANEXA III B
   A.19 DETERMINAREA CONȚINUTULUI ÎN POLIMERI CU MASĂ MOLECULARĂ MICĂ
   1.   METODA
   Această metodă cromatografică pe gel permeabil urmează orientarea OCDE TG 119 (1996). Principiile fundamentale și toate celelalte informații tehnice sunt prezentate în bibliografie.
   1.1.   Introducere
   Proprietățile polimerilor sunt atât de diversificate, încât este imposibil de descris o metodă unică, care să indice cu precizie condițiile de separare și evaluare, care să acopere toate eventualitățile și particularitățile întâlnite la separarea polimerilor. Sistemele complexe de polimeri, în special, se pretează mai rar la cromatografia pe gel permeabil. În cazul în care cromatografia pe gel permeabil nu este aplicabilă, se poate determina conținutul de polimeri cu masă moleculară medie, utilizând alte metode (vezi anexa). Într-o astfel de situație, este necesară furnizarea tuturor detaliilor legate de metoda folosită, cu justificarea alegerii.
   Metoda descrisă în continuare se bazează pe norma DIN 55672 (1). Aceasta furnizează indicații detaliate asupra modului de realizare a experiențelor și de evaluare a rezultatelor. Dacă este necesară modificarea condițiilor experimentale, schimbările trebuie justificate. Pot fi utilizate alte normative, cu condiția menționării tuturor referințelor. Metoda descrisă utilizează pentru etalonare eșantioane de polistiren a căror polidispersie este cunoscută și ar putea fi, probabil, adaptată pentru cazul altor polimeri, de exemplu polimerii solubili în apă și polimerii ramificați cu catenă lungă.
   1.2.   Definiții și unități
   Masa moleculară mică se definește în mod arbitrar ca fiind o masă moleculară inferioară celei de 1 000 daltoni.
   Masa moleculară medie (numerică) Mn și masa moleculară medie (greutate) Mw, sunt determinate cu ajutorul ecuațiilor următoare:

   unde:

               Hi

               este amplitudinea semnalului detectat, corespunzător volumului de retenție Vi, în funcție de nivelul de referință,

               Mi

               este masa moleculară a fracțiunii de polimer, corespunzătoare volumului de retenție Vi și

               n

               este numărul de puncte experimentale.

         Lărgimea de distribuție a maselor moleculare, care reprezintă o măsură a polidispersiei sistemului este exprimată de raportul Mw/Mn.
   1.3.   Substanțe de referință
   Metoda cromatografiei pe gel permeabil este o metodă relativă, fiind necesar să se procedeze la o etalonare. În general, aceasta se realizează cu ajutorul polistirenilor etalon cu lanț liniar și distribuție îngustă, pentru care se cunosc atât masele moleculare medii Mn și Mw, cât și distribuția maselor moleculare. Curba de etalonare nu poate fi utilizată pentru determinarea masei moleculare a unui eșantion necunoscut, decât dacă condițiile de separare a eșantioanelor și etaloanelor au fost selecționate într-un mod identic.
   O relație determinată între masa moleculară și volumul de eluare nu este valabilă decât în condițiile particulare ale unei experiențe date. Printre aceste condiții figurează, înainte de toate: temperatura, solventul (sau amestecul de solvenți), condițiile cromatografice, precum și coloana de separare sau sistemul de coloane.
   Masele moleculare ale eșantioanelor determinate prin această metodă constituie valori relative; le vom numi „mase moleculare în echivalent-polistiren”. Aceasta semnifică faptul că, în funcție de diferențele chimice și structurale dintre eșantioanele testate și etaloane, masele moleculare pot devia față de valorile absolute, într-o manieră mai mult sau mai puțin importantă. Dacă sunt utilizate alte etaloane, de exemplu polietilenglicol, poli(etilenoxid), poli(metacrilat de metil) sau acid poliacrilic, este important să se justifice motivul.
   1.4.   Principiul metodei
   Cromatografia pe gel permeabil permite determinarea distribuției maselor moleculare, precum și a maselor moleculare medii (Mn, Mw). Cromatografia pe gel permeabil reprezintă o metodă particulară de cromatografie lichidă, în cadrul căreia eșantionul pentru testat este separat în funcție de volumul hidrodinamic al fiecărui constituent. (2).
   Separarea se efectuează pe măsură ce eșantionul înaintează printr-o coloană umplută cu un material poros, în general un gel organic. Moleculele mici pot penetra în pori, în vreme ce moleculele mari sunt excluse. Din acest motiv, traseul moleculelor mari este mai scurt; acestea sunt separate primele. Moleculele de dimensiuni medii penetrează parțial în pori, fiind separate mai târziu. Moleculele cele mai mici, a căror rază hidrodinamică medie este mai mică decât cea a porilor de gel, pot penetra în toți porii. Acestea vor fi eluate ultimele.
   În situația ideală, dimensiunea speciilor moleculare este cea care decide integral separarea, dar în practică este greu de evitat interferența unor fenomene de absorbție. O umplere neregulată a coloanei, ca și existența unui volum mort important pot agrava situația (2).
   Detecția se efectuează, de exemplu, prin măsurarea indicelui de refracție sau al absorbției în UV, pentru realizarea unei curbe de distribuție simple. Totuși, pentru a putea asocia acestei curbe valorile maselor moleculare reale, este necesară etalonarea coloanei prin trecerea unui polimer cu masa moleculară cunoscută și, în cazul ideal, cu o structură cât mai apropiată, de exemplu diferiți polistireni standard. În general, se va obține o curbă Gauss; uneori aceasta poate prezenta o asimetrie, pe partea maselor moleculare mici; axa verticală indică cantitatea (greutatea) speciilor de diferite mase moleculare eluate, iar pe axa orizontală figurează logaritmul masei moleculare.
   Conținutul în polimeri cu masă moleculară mică se deduce cu ajutorul acestei curbe. Calculul nu poate fi exact decât dacă speciile cu masă moleculară mică se comportă în același fel cu ansamblul polimerului, pe unitatea de masă.
   1.5.   Criterii calitative
   Reproductivitatea (deviația-standard relativă) a volumului de eluare trebuie să fie cel mult egală cu 0,3 %. Există modalități de ameliorare a reproductivității de analiză, grație unei corecții ce utilizează un standard intern, dacă un cromatograf este evaluat în funcție de timp și nu satisface criteriile menționate mai sus [vezi informațiile complementare la (1)]. Polidispersările depind de masele moleculare ale etaloanelor. În cazul polistirenilor etalon, valorile tipice sunt:

               MP < 2 000

               Mw/Mn < 1,20

               2 000 ≤ MP ≤ 106

               Mw/Mn < 1,05

               MP > 106

               Mw/Mn < 1,20

         (MP este masa moleculară a etalonului, corespunzătoare semnalului maxim).
   1.6.   Descrierea metodei
   1.6.1.   Prepararea soluțiilor etalon de polistiren
   Se vor dizolva polistirenii etalon, amestecând cu grijă până la diluția aleasă. Soluțiile se vor prepara ținând cont de recomandările fabricantului.
   Concentrațiile etaloanelor alese depind de diferiți factori, cum ar fi: volumul de injecție, viscozitatea soluției și sensibilitatea detectorului. Volumul de injecție maxim trebuie să fie adaptat lungimii coloanei, având grijă să nu o supraîncarce. Volumele de injecție curente pentru separările analitice prin metoda cromatografică pe gel permeabil, pentru o coloană de 30 cm x 7,8 mm, variază de obicei între 40 și 100 μl. Se pot obține și volume mai mari, dar acestea nu trebuie să depășească 250 μl. Se va determina raportul optim între volumul de injecție și concentrație, înainte de etalonarea coloanei.
   1.6.2.   Prepararea soluției de eșantion
   În principiu, prepararea soluțiilor de eșantion se realizează în condiții identice. Eșantionul se dizolvă într-un solvent adecvat, de exemplu THF, agitând cu grijă. În nici un caz nu se va dizolva într-o baie cu ultrasunete. Dacă este necesar, soluția de probă se purifică cu ajutorul unui filtru cu membrană, cu dimensiunea porilor cuprinsă între 0,2-2 μm.
   Prezența particulelor nedizolvate trebuie menționată în raportul final, în măsura în care acestea pot rezulta din specii cu mase moleculare mari. Trebuie să se recurgă la o metodă potrivită pentru determinarea procentajului în greutate al particulelor nedizolvate. Analiza soluțiilor se va face în termen de 24 ore.
   1.6.3.   Corecție legată de prezența impurităților și a aditivilor
   Fiind vorba despre conținutul în specii cu M < 1 000, este necesar, în general, să se aplice o corecție care să țină cont de prezența compușilor particulari nepolimerici (cum ar fi impuritățile sau aditivii), cu excepția cazului în care conținutul măsurat nu depășește valoarea de 1 %. Această corecție se poate realiza prin analiza directă a soluției de polimer sau a eluatului pentru cromatografia pe gel permeabil.
   În cazul în care eluatul este prea diluat pentru a permite analizarea, după traversarea coloanei, este necesar să fie concentrat. Va fi, eventual, necesară evaporarea soluției până la sec, urmată de redizolvare. Concentrarea soluției se va efectua astfel încât să nu intervină nici o modificare a compoziției. Tratamentul soluției, după faza cromatografiei pe gel permeabil, este funcție de metoda de analiză utilizată pentru determinarea cantitativă.
   1.6.4.   Aparatură
   Un aparat pentru cromatografie pe gel permeabil este compus din următoarele elemente:

               —

               un rezervor pentru solvent;

               —

               un sistem pentru degazare (dacă este necesar);

               —

               o pompă;

               —

               un amortizor de impulsuri (dacă este necesar);

               —

               un sistem de injecție;

               —

               coloane cromatografice;

               —

               un detector;

               —

               un debitmetru (dacă este necesar);

               —

               un sistem de înregistrare și tratare a datelor;

               —

               un recipient pentru recuperarea soluțiilor utilizate.

         Sistemul cromatografic pe gel permeabil trebuie să fie inert față de solventul utilizat (de exemplu utilizarea capilarelor din oțel, atunci când solvent este THF).
   1.6.5.   Injecția și sistemul de pompare a solventului
   Un volum definit din soluția de probă este injectat în coloană, într-o zonă bine definită, cu ajutorul unui aparat pentru eșantionare automată sau manuală. Dacă se operează manual, retragerea ori împingerea prea bruscă a pistonului seringii poate determina modificări în distribuția maselor moleculare observate. Este indicat ca sistemul de pompare a solventului să fie lipsit de pulsații; este de preferat ca acesta să includă un amortizor de impulsuri. Debitul este de ordinul a 1 ml/min.
   1.6.6.   Coloana
   În funcție de natura eșantionului testat, polimerul se caracterizează făcând recurs la o singură coloană sau la mai multe coloane, conectate în serie. În comerț sunt disponibile mai multe materiale poroase pentru coloane, cu proprietăți definite (de exemplu dimensiunea porilor, limita de excludere). Alegerea unui gel de separare sau a lungimii de coloană depinde, pe de o parte, de proprietățile eșantionului testat (volume hidrodinamice, distribuția maselor moleculare) și, pe de altă parte, de condițiile particulare ale separării, cum ar fi: natura solventului, temperatura și debitul (1) (2) (3).
   1.6.7.   Talere teoretice
   Coloana (sau combinația de coloane) utilizată pentru separare trebuie caracterizată prin numărul de talere teoretice. Pentru aceasta, în cazul în care solventul de eluare este THF, se trece o soluție de etilbenzen sau o altă substanță dizolvată nepolară potrivită, printr-o coloană de lungime cunoscută. Numărul de talere teoretice este dat de ecuația următoare:

       sau
   unde:

               N

               este numărul de talere teoretice;

               Ve

               este volumul de eluare, corespunzător semnalului maxim;

               W

               este lărgimea semnalului maxim, la nivelul liniei de bază;

               W1/2

               este lărgimea semnalului maxim, la jumătatea înălțimii coloanei.

         1.6.8.   Eficacitatea separării
   În afară de numărul de talere teoretice, parametru determinant al lărgimii de bandă, eficacitatea de separare este o altă importantă caracteristică determinată de panta curbei de calibrare. Eficacitatea de separare a unei coloane se calculează cu ajutorul relației următoare:

   unde:

               Ve, Mx

               este volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară Mx;

               Ve, (10 Mx)

               este volumul de eluare al polistirenului cu masa moleculară de 10 ori mai mare.

         Rezoluția sistemului este în general definită după cum urmează:

   unde

               Ve1 și Ve2

               sunt volumele de eluare ale celor doi polistireni standard la semnalul maxim;

               W1 și W2

               sunt lărgimile vârfului la nivelul liniei bazei;

               M1 și M2

               sunt masele moleculare corespunzătoare semnalului maxim (aceste mase ar trebui să fie diferite printr-un factor 10).

         Valoarea lui R pentru sistemul de coloane trebuie să fie superioară valorii de 1,7 (4).
   1.6.9.   Solvenți
   Toți solvenții trebuie să aibă o mare puritate (se va folosi THF de puritate 99,5 %). Rezervorul pentru solvent (la nevoie, pus în atmosferă de gaz inert) trebuie să fie suficient de mare pentru a permite etalonarea coloanei și mai multe analize de eșantioane. Solventul va fi degazat înainte de a fi pompat în coloană.
   1.6.10.   Reglarea temperaturii
   Temperatura componentelor interne critice (bucla de injecție, coloana sau coloanele, detectorul și tuburile) trebuie să fie constantă și compatibilă cu solventul ales.
   1.6.11.   Detectorul
   Detectorul înregistrează în mod cantitativ concentrația eșantionului eluat din coloană. Pentru evitarea unei lărgimi nedorite a picului, volumul cuvei detectorului va fi ales cât mai mic posibil. Acesta nu trebuie să depășească 10 μl, cu excepția detectoarelor ce funcționează prin difuzia luminii și a viscozimetrelor. În general, detecția se realizează prin refractometrie diferențială. Totuși, dacă proprietățile specifice ale eșantionului sau ale solventului pentru eluare o cer, se pot folosi alte tipuri de detectoare, cum ar fi cele UV/VIS sau IR, viscozimetrele etc.
   2.   REZULTATE ȘI PROCESUL-VERBAL AL TESTĂRII
   2.1.   Rezultate
   Se va face referință la normele DIN (1) pentru ceea ce privește criteriile de evaluare detaliate, la fel pentru specificațiile relative la colectarea și interpretarea datelor.
   Pentru fiecare eșantion analizat, se vor realiza două experiențe independente. Rezultatele acestora se vor analiza separat. În toate cazurile, este esențial să se determine și datele relative la blancuri, acestea fiind tratate în același mod ca eșantioanele.
   Trebuie indicat în mod explicit că valorile măsurate sunt valori relative corespunzând unor echivalenți de masă moleculară ale standardului folosit.
   După determinarea volumelor și a timpilor de retenție (eventual corectate cu ajutorul unui standard intern) se vor reprezenta grafic valorile log MP (MP fiind semnalul maxim al polimerilor standard), în funcție de una dintre acele cantități. Sunt necesare cel puțin 2 puncte de etalonare pentru fiecare factor 10 de masă moleculară. Pentru trasarea întregii curbe sunt necesare cel puțin 5 puncte de măsură; această curbă va acoperi masa moleculară estimată a eșantionului. Punctul extrem al curbei de etalonare, spre partea maselor moleculare mici, se poate defini folosind n-hexilbenzenul sau altă substanță dizolvată nepolară adecvată. Se determină porțiunea de curbă corespunzătoare maselor moleculare mai mici de 1 000 și se va corecta, dacă va fi necesar, luând în considerare prezența impurităților și a aditivilor. În general, curbele de eluare sunt evaluate prin intermediul unui sistem de prelucrare informatică a datelor. Dacă s-a optat pentru o prelucrare manuală, este indicat să se consulte ASTM D 3536-91 (3).
   Dacă un polimer insolubil este reținut în coloană, masa sa moleculară este, foarte probabil, superioară celei corespunzătoare fracțiunii solubile și trebuie ținut cont de aceasta, pentru a evita subestimarea conținutului în polimeri de masă moleculară mică. În anexă se află indicațiile ce permit corecția conținutului în polimeri de masă moleculară mică, luând în considerare polimerii insolubili.
   Curba de distribuție va fi prezentată sub forma unui tabel sau a unui grafic (frecvența diferențială sau procentajele cumulative în funcție de log M). În cazul reprezentării grafice, o putere de 10 pentru masa moleculară corespunde în mod normal unei lărgimi de aproximativ 4 cm, în vreme ce pentru maximul de semnal este adecvată o înălțime de aproximativ 8 cm. În cazul curbelor de distribuție cumulative, diferența între 0-100 % pe axa ordonatei trebuie să fie în jur de 10 cm.
   2.2.   Procesul-verbal al testării
   Procesul-verbal al experimentului va cuprinde informațiile următoare:
   2.2.1.   Substanța testată:

               —

               informații disponibile legate de substanța testată (natură, aditivi, impurități);

               —

               descrierea tratamentului aplicat eșantionului, observații, probleme.

         2.2.2.   Dispozitivul experimental:

               —

               un rezervor pentru solvent, gaz inert, sistem pentru degazarea solventului, compoziția solventului, impurități;

               —

               pompă, amortizor de impulsuri, sistem de injecție;

               —

               coloane de separare (fabricant, toate precizările legate de caracteristicile coloanei, cum ar fi dimensiunea porilor, natura materialului de separare etc., numărul, lungimea și ordinul coloanelor utilizate);

               —

               numărul de talere teoretice ale coloanei (sau al combinației de coloane), eficacitatea separării (resorbția sistemului);

               —

               informații legate de simetria semnalelor maxime;

               —

               temperatura coloanei, modul de reglare a temperaturii;

               —

               detector (principiul de măsurare, tip, volumul cuvei);

               —

               debitmetru, dacă există (fabricant, principiul de măsurare);

               —

               sistemul utilizat pentru culegere și prelucrarea datelor (echipament și programe informatice).

         2.2.3.   Etalonarea sistemului:

               —

               descrierea detaliată a metodei utilizate pentru determinarea curbei de etalonare;

               —

               precizări asupra criteriilor de calitate proprii acestei metode (de exemplu coeficientul de corelare, eroarea pătratică medie etc.);

               —

               informații asupra tuturor extrapolărilor, ipotezelor și aproximărilor efectuate în cursul proceselor experimentale, precum și asupra evaluării și prelucrării datelor;

               —

               toate măsurătorile efectuate pentru stabilirea curbei de etalonare trebuie prezentate sub forma unui tabel care cuprinde, pentru fiecare punct de etalonare, următoarele informații:

                           —

                           denumirea eșantionului;

                           —

                           fabricantul eșantionului;

                           —

                           valorile caracteristice MP, Mn, Mw, Mw/Mn ale etaloanelor furnizate de fabricant, deduse din măsurătorile ulterioare, completate de indicațiile legate de metoda de determinare;

                           —

                           volumul de injecție și concentrația substanței injectate;

                           —

                           valoarea de MP utilizată pentru etalonare;

                           —

                           volumul de eluare sau timpul de retenție corectat, măsurat la semnalul maxim;

                           —

                           MP calculat la semnalul maxim;

                           —

                           procentajul de eroare la MP calculat și la valoarea de etalonare.

         2.2.4.   Informații asupra conținutului în polimeri cu masă moleculară mică:

               —

               descrierea metodelor de analiză utilizate și a modului în care au fost conduse experimentele;

               —

               informații privind procentajul conținutului în specii de masă moleculară mică (greutate/greutate) în raport cu ansamblul eșantionului;

               —

               informații legate de impurități, aditivi și alte substanțe nepolimerice, în procentaj ponderal, funcție de ansamblul eșantionului.

         2.2.5.   Evaluare:

               —

               evaluare în funcție de timp: toate metodele care vizează ameliorarea reproductivității cerute (metode de corecție, standard intern etc.);

               —

               se precizează dacă evaluarea s-a efectuat plecând de la volumul de eluare sau de la timpul de retenție;

               —

               se indică limitele de evaluare, dacă un pic nu a fost complet analizat;

               —

               se descriu metodelor de netezire, dacă s-au folosit;

               —

               se indică procedeelor de preparare și pretratare a eșantionului;

               —

               dacă există, se indică prezența particulelor nedizolvate;

               —

               se indică volumul de injecție (μl) și concentrația de injecție (mg/ml);

               —

               se menționează observațiile privind efectele generatoare de deviații, în raport cu profilul ideal de cromatografie pe gel permeabil;

               —

               se descriu în detaliu toate modificările aduse procedurilor de analiză;

               —

               se precizează intervalele de eroare;

               —

               se consemnează orice alte informații și observații utile pentru interpretarea rezultatelor.

         3.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

               (1)

               DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatografie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

               (2)

               Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley & Sons.

               (3)

               ASTM D 3536-91 (1991) Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPG). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

               (4)

               ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

         Anexă
   Indicații care permit corecția conținutului de polimeri cu masă moleculară mică, luând în considerare polimerii insolubili
   Prezența unui polimer insolubil într-un eșantion antrenează o pierdere de masă în cursul analizei cromatografice pe gel permeabil. Polimerul insolubil este ireversibil reținut în coloană sau în filtrul eșantionului, atunci când partea solubilă a eșantionului traversează coloana. Dacă indicele de refracție diferențial (dn/dc) al polimerului poate fi estimat sau măsurat, este posibilă estimarea masei pe care eșantionul a pierdut-o în coloană. În acest caz, se efectuează o corecție cu ajutorul unui etalon extern al refractometrului, cu etaloane având concentrația și raportul dn/dc, cunoscute. În exemplul următor, s-a utilizat un etalon de poli(metacrilat de metil).
   Etalonarea externă, practicată în timpul analizei polimerilor acrilici, constă în analizarea cu ajutorul metodei cromatografice pe gel permeabil a unei soluții etalon de poli(metacrilat de metil) în tetrahidrofuran, cu concentrația cunoscută; rezultatele servesc la calcularea constantei refractometrului, conform ecuației următoare:
   K = R/(C × V × dn/dc)
   unde:

               K

               este constanta refractometrului (µV sec/ml);

               R

               este răspunsul etalonului de polimetacrilat de metil (µV sec);

               C

               este concentrația etalonului de polimetacrilat de metil (mg/ml);

               V

               este volumul de injecție (ml) și

               dn/dc

               este indicele de refracție diferențial al unei soluții de polimetacrilat de metil în tetrahidrofuran (ml/mg).

         Următoarele date caracterizează în general un etalon de polimetacrilat de metil:

               R

               =

               2 937 891

               C

               =

               1,07 mg/ml

               V

               =

               0,1 ml

               dn/dc

               =

               9.10-5 ml/mg.

         Valoarea K rezultată, 3,05 × 1011, este apoi utilizată pentru a calcula răspunsul teoretic al detectorului, adică ceea ce s-ar obține dacă 100 % din polimerul injectat s-ar alege la traversarea detectorului.
   ANEXA III C
   A.20. COMPORTAMENTUL DE DIZOLVARE – EXTRACȚIE AL POLIMERILOR ÎN APĂ
   1.   METODA
   Metoda descrisă urmează orientarea OCDE TG 120 (1997). Mai multe informații tehnice se găsesc în referințele bibliografice (1).
   1.1.   Introducere
   În cazul anumitor polimeri, cum ar fi polimerii în emulsie, poate fi necesar un tratament inițial, înainte de utilizarea metodei expuse. Metoda nu este aplicabilă polimerilor lichizi, nici polimerilor care reacționează cu apa în condițiile experimentale.
   Dacă este dificil sau imposibil să se pună în practică metoda, comportamentul de dizolvare-extracție al polimerilor poate fi studiat cu ajutorul altor metode. În acest caz, metoda utilizată va fi în întregime detaliată și justificată.
   1.2.   Substanțe de referință
   Nici una
   1.3.   Principiul metodei
   Comportamentul de dizolvare-extracție al polimerilor în mediu apos se determină prin metoda flaconului (vezi A.6., Solubilitatea în apă, metoda flaconului), căreia i se vor aduce modificările descrise mai jos.
   1.4.   Criterii calitative
   Fără
   1.5.   Descrierea metodei
   1.5.1.   Aparatură
   Aparatura necesară pentru aplicarea metodei este următoarea:

               —

               un dispozitiv care permite măcinarea eșantionului până la obținerea unei pulberi, cum ar fi un concasor ce produce particule de dimensiuni determinate;

               —

               un sistem de agitare, cu posibilitatea de reglare a temperaturii;

               —

               un sistem de filtrare cu membrane;

               —

               un dispozitiv de analiză;

               —

               site standardizate.

         1.5.2.   Prepararea soluției de eșantion
   Inițial trebuie măcinat un eșantion reprezentativ, până la dimensiuni ale particulelor cuprinse între 0,125 și 0,25 mm, utilizând sitele potrivite. Poate fi necesară o răcire pentru a garanta stabilitatea eșantionului sau pentru a se proceda la concasare. Materialele de tipul cauciucului pot fi pulverizate la temperatura azotului lichid (1).
   Dacă nu este posibilă obținerea de particule la dimensiunile cerute, se vor reduce dimensiunile acestora cât mai mult posibil și se va consemna rezultatul. În cuprinsul raportului, este necesar să se indice modul în care eșantionul pulverizat a fost conservat înainte de analiză.
   1.5.3.   Mod de lucru
   Se cântăresc trei eșantioane din substanța testată, fiecare de 10 g, în trei recipiente prevăzute cu dop de sticlă și se adaugă câte 1 000 ml apă în fiecare recipient. Dacă manipularea a 10 g de polimer se dovedește imposibilă, este indicat să se folosească cea mai mare cantitate care poate fi manipulată; volumul de apă va fi mărit în mod proporțional.
   Recipientele se vor închide bine, apoi se vor agita la temperatura de 20 °C. Se va folosi un dispozitiv de agitare care funcționează la temperatură constantă. După 24 ore, conținutul fiecărui recipient este centrifugat sau filtrat, iar concentrația polimerului în faza apoasă limpede, va fi determinată cu ajutorul unei metode potrivite de analiză. Dacă nu există o metodă adecvată, care să permită o analiză în faza apoasă, se poate obține o estimare a solubilității - extractibilității totale, prin cântărirea, după uscare, a reziduu-lui filtrat sau a precipitatului centrifugat.
   De asemenea, este necesară diferențierea cantitativă a impurităților și aditivilor, pe de o parte, și a speciilor de masă moleculară mică, pe de altă parte. În cazul unei determinări gravimetrice, este important să se realizeze o analiză inițială, fără substanță de testare, în scopul de a lua în considerare reziduurile generate prin metoda experimentală.
   În mod similar, se poate determina comportamentul de dizolvare-extracție al polimerilor în apă, la 37 °C, pentru pH 2 și pH 9, așa cum a fost descrisă experiența realizată la 20 °C. Valorile pH-ului pot fi obținute prin adăugare de soluții-tampon adecvate sau adăugare de acizi ori baze potrivite; dintre acestea, se pot enumera: acid clorhidric, acid acetic, hidroxizi de sodiu și de potasiu de calitate analitică sau amoniac.
   Trebuie realizate una sau două experiențe, conform metodei. În cazul în care sunt disponibile metode suficient de specifice pentru analizarea directă a polimerului în faza apoasă, un experiment ca acela descris mai sus este destul. Însă atunci când aceste metode nu există, iar determinarea comportamentului de dizolvare-extracție al polimerului nu se poate face decât indirect – respectiv prin determinarea conținutului în carbon organic total (COT) al extractului apos –, este necesară o experiență suplimentară. De asemenea, și aceasta se va face în triplicat, cu eșantioane de polimer de 10 ori mai mici și cu aceleași cantități de apă, ca și la primul experiment.
   1.5.4.   Analiza
   1.5.4.1.   Experimente realizate cu eșantioane de dimensiuni unice
   Este posibil să dispunem de metode care permit o analiză directă a polimerilor, în fază apoasă. În caz contrar, poate fi luată în considerare analiza indirectă a polimerilor dizolvați sau extrași. Pentru aceasta, se va determina conținutul total în părți solubile, care se va corecta ținând cont de substanțele nepolimerice.
   Pentru a determina conținutul total în specii polimerice, analiza extrasului apos se poate realiza:

               fie printr-o metodă suficient de sensibilă, de exemplu:

                           —

                           determinarea COT cu persulfat sau dicromat, pentru a se obține CO2, urmată de o estimare prin IR sau de o analiză chimică;

                           —

                           spectrometria de absorbție atomică (SAA) sau echivalentul acesteia, emisie în plasmă cuplată prin inducție (PCI) în cazul polimerilor ce conțin siliciu sau un metal;

                           —

                           absorbția UV sau spectrofluorimetria pentru polimerii arilici;

                           —

                           cromatografia în fază lichidă cuplată cu spectrometria de masă, pentru eșantioane cu mase moleculare mici,

               fie prin evaporate completă, în vid, a extrasului apos, urmată de o analiză a reziduului prin spectroscopie (IR, UV etc.) sau prin SAA-PCI.

         Dacă o astfel de analiză a fazei apoase este imposibilă, extrasul apos se va obține cu ajutorul unui solvent organic nemiscibil în apă (o hidrocarbură clorurată, de exemplu). Apoi solventul este evaporat și reziduul se analizează (prin IR, UV sau SAA-PCI), pentru determinarea conținutului său în polimer specificat. Toți constituenții acestui reziduu, care se dovedesc a fi impurități sau aditivi, trebuie separați, în scopul determinării gradului de dizolvare-extracție al polimerului.
   Atunci când astfel de substanțe sunt prezente în cantități relativ importante, poate fi necesară supunerea reziduului unei analize cromatografice în fază lichidă, de înaltă performanță, sau în fază gazoasă, de exemplu, în scopul diferențierii acelor impurități prezente de monomeri și derivați monomerici, astfel încât conținutul real în aceste ultime specii să poată fi determinat.
   În anumite cazuri, o simplă evaporare completă a solventului organic, urmată de cântărirea reziduu-lui uscat, poate fi suficientă.
   1.5.4.2.   Dozări realizate cu două eșantioane de mărimi diferite
   Conținutul în carbon organic total trebuie determinat pentru toate extrasele apoase.
   Se realizează o determinare prin gravimetrie asupra părții nedizolvate sau neextrase a eșantionului. Dacă după centrifugarea sau filtrarea conținutului fiecărui recipient reziduul de polimer aderă încă la peretele recipientului, trebuie clătit respectivul recipient cu filtratul, până când nu se mai observă urme de reziduu. După aceea, filtratul este refiltrat sau centrifugat. Reziduurile depuse pe filtru sau în tubul centrifugei sunt uscate la 40 °C, în vid, apoi se cântăresc. Se va continua uscarea, până la obținerea unei mase constante.
   2.   REZULTATE
   2.1.   Dozări realizate cu eșantioane de dimensiuni unice
   Rezultatele obținute pentru fiecare dintre cele trei flacoane, precum și valorile medii trebuie consemnate și exprimate în unități de masă per volum de soluție (în general, în mg/l) sau în unități de masă per masa de eșantion de polimer (de obicei, în mg/g). În plus, pierderea de masă de eșantion (calculată prin raportarea masei soluției la masa inițială de eșantion) va fi de asemenea menționată. Trebuie calculate deviațiile standard relative. Diversele valori vor fi menționate o dată, pentru produsul total (polimer + principalii aditivi etc.) și repetate, pentru polimerul singur (pentru a cunoaște, după separare, mărimea relativă a respectivilor aditivi).
   2.2.   Experimente realizate cu eșantioane de dimensiuni diferite
   Diferitele concentrații ale carbonului organic total în extrasele apoase, provenite din cele două serii a câte trei experiențe, precum și valorile medii pentru fiecare serie, trebuie consemnate și exprimate în unități de masă per volum de soluție (în general, în mgC/l), precum și în unități de masă per masa de eșantion inițial (de obicei, în mgC/g).
   Dacă nu există diferențe între rezultatele corespunzătoare rapoartelor dimensiune de eșantion/volum de apă mare sau mic, aceasta poate semnifica faptul că toți constituenții susceptibili a fi extrași au fost efectiv extrași. În acest caz, o analiză directă nu este de regulă necesară.
   Diferitele mase de reziduu trebuie consemnate și exprimate în procente de masă inițială de eșantion. Se vor calcula valori medii pentru fiecare experiență. Diferența dintre 100 și procentajul obținut reprezintă procentul de materii solubile și extractibile din eșantioanele inițiale.
   3.   PROCESUL-VERBAL AL TESTĂRII
   3.1.   Procesul-verbal al testării
   Procesul verbal al testării trebuie să cuprindă următoarele informații:
   3.1.1.   Substanța testată:

               —

               informații disponibile, legate de substanța testată (natură, aditivi, impurități, proporția speciilor cu masă moleculară mică).

         3.1.2.   Condiții experimentale:

               —

               descrierea metodelor utilizate și a condițiilor experimentale;

               —

               descrierea metodelor de analiză și detecție.

         3.1.3.   Rezultate:

               —

               rezultate de solubilitate - extractibilitate în mg/l: toate valorile și valorile medii obținute pentru experiențele de extracție în diferite soluții, repartizate în polimeri și impurități, aditivi etc.;

               —

               rezultate de solubilitate - extractibilitate în mg/g de polimer;

               —

               concentrațiile carbonului organic total în extractele apoase, masa soluției și procentajele calculate, dacă s-a făcut măsurarea;

               —

               pH-ul fiecărui eșantion;

               —

               informații privind valorile obținute în experiențele-martor (fără solvent);

               —

               dacă este necesar, se va menționa instabilitatea chimică a substanței testate, în cursul procedurii experimentale și în cursul analizei;

               —

               toate informațiile importante pentru interpretarea rezultatelor.

         4.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

               (1)

               DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

         ANEXA III D
   C.13 BIOCONCENTRAREA: EXPERIENȚA CU REÎNNOIRE CONTINUĂ ASUPRA PEȘTILOR
   1.   METODA
   Prezenta metodă de bioconcentrare reproduce directivele OECD TG 305 (1996).
   1.1.   Introducere
   Prezenta metodă descrie o procedură de caracterizare a potențialului de bioconcentrare în cazul peștilor supuși la o reînnoire continuă a anumitor substanțe. Regimurile experimentale cu reînnoire continuă sunt de departe preferate, dar și cele semistatice sunt acceptate, în măsura în care sunt îndeplinite criteriile de validitate.
   Metoda oferă toate informațiile necesare executării experimentului, însă lasă libertatea indispensabilă de adaptare a conceptului experimental la condițiile specifice fiecărui laborator și nu impune în mod strict caracteristicile substanțelor testate. În special, sunt indicate produsele organice stabile, pentru care valorile log Pow sunt cuprinse între 1,5 și 6,0 (1), însă metoda este aplicabilă și substanțelor superlipofile (log Pow > 6,0). Pentru acestea din urmă, estimarea prealabilă a factorului de bioconcentrare (BCF), denumit uneori KB, va fi probabil superioară valorii factorului de bioconcentrare în starea staționară (BCFSS), la care ne putem aștepta în cazul unei experiențe de laborator. Evaluările preliminare ale factorului de bioconcentrare pentru produsele organice ale căror valori log Pow ajung până la aproximativ 9,0 pot fi calculate cu ajutorul ecuației Bintein și al (2). Potențialul de bioconcentrare se caracterizează pentru anumiți parametrii, cum ar fi: constanta de viteză de absorbție (k1), constanta de viteză de eliminare (k2) și BCFSS.
   Substanțele experimentale marcate radioactiv pot facilita analiza eșantioanelor de apă și de pești; de asemenea, pot servi la definirea degradării, dacă este necesar să o identificăm și să o cuantificăm. Dacă se măsoară totalul de reziduu radioactiv (de exemplu prin combustia ori solubilizarea țesuturilor), BCF-ul se bazează pe compusul de origine, toți metaboliții reținuți și carbonul asimilat. Factorii BCF care se bazează pe reziduurile radioactive totale nu pot fi, așadar, comparați direct cu un factor BCF derivat dintr-o analiză chimică particulară exclusiv a compusului de origine.
   Proceduri de epurare pot fi utilizate, în cadrul studiilor cu markeri radioactivi, pentru determinarea BCF pe baza compusului original, iar principalii metaboliți vor fi determinați dacă se consideră necesar. De asemenea, există posibilitatea combinării unui studiu de metabolism al peștilor, cu un studiu de bioconcentrare, prin analiza și identificarea reziduurilor tisulare.
   1.2.   Definiții și unități

      Bioconcentrare/Bioacumulare: creșterea concentrației substanței testate la/sau într-un organism (țesuturile specifice ale acestuia) în raport cu concentrația acestei substanțe în mediul ambiant.

      Factor de bioconcentrare (BCF sau KB): în orice moment din faza de absorbție a experienței de acumulare, concentrația substanței testate la/în pești sau pe țesuturi determinate ale acestora [Cf în µg/g (ppm)], raportată la concentrația substanței chimice din mediul ambiant [CW în µg/ml (ppm)].

      Factor de bioconcentrare în stare staționară (BCFSS sau KB): nu se modifică prea mult într-o perioadă mare de timp, concentrația substanței experimentale din mediul ambiant fiind constantă pentru aceeași perioadă de timp.

      Platoul sau starea staționară: în reprezentarea grafică a substanței experimentale la pești (Cf), funcție de timp, este de așteptat pentru curbă să devieze paralel față de axa timpului, iar pentru trei analize succesive ale Cf – realizate asupra unor eșantioane prelevate la intervale de cel puțin două zile – să rămână într-o plajă de 20 % una față de alta; nu există diferențe semnificative între cele trei perioade de eșantionare. Când se analizează eșantioane reunite, se efectuează minimum patru analize succesive. Dacă substanțele experimentale au caracteristici de absorbție lente, este preferabil să se opteze pentru intervale săptămânale.

      Factori de bioconcentrare: se calculează direct, plecând de la constantele cinetice (k1/k2), se numesc factori de concentrare cinetică, BCFk.

      Coeficient de partiție octanol-apă (POW): raportul de solubilitate a unui produs chimic în n-octanol și în apă, la echilibru (Metoda A.8), de asemenea desemnat prin KOW. Logaritmul lui POW indică potențialul de bioconcentrare al unui produs chimic în organismele acvatice.

      Faza de expunere sau de absorbție: timpul în care peștii sunt expuși la produsul chimic testat.

      Constanta de viteză de absorbție (k1): valoare numerică ce definește viteza de creștere a concentrației substanței testate la/în pești (sau în țesuturile specifice ale acestora), atunci când sunt expuși la acea substanță chimică (k1 este exprimată în zile-1).

      Faza de post-expunere sau de eliminare (pierdere): ca urmare a transferării peștilor dintr-un mediu care conține substanța testată într-un mediu care nu conține acea substanță, timp în care eliminarea (sau pierderea netă) de substanță de către pești (sau de către țesuturile specifice) este studiată.

      Constanta de viteză de eliminare (pierdere) (k2): valoare numerică ce definește viteza de scădere a concentrației substanței testate la/în pești (sau în țesuturile specifice ale acestora), ca urmare a transferării lor dintr-un mediu care conține substanța testată într-un mediu care nu conține acea substanță (k2 este exprimată în zile-1).
   1.3.   Principiul metodei experimentale
   Experimentul se împarte în două faze: faza de expunere (absorbție) și de post-expunere (eliminare). În cursul fazei de absorbție, grupele separate de pești dintr-o specie sunt supuse la cel puțin două concentrații ale substanței totale. Apoi aceștia sunt transferați într-un mediu care nu conține respectiva substanță, pentru faza de eliminare. Aceasta din urmă este întotdeauna necesară, în afară de cazul în care absorbția substanței în timpul fazei de absorbție a fost nesemnificativă (de exemplu, dacă BCF este mai mic de 10). Concentrația substanței testate la/în pești (sau în țesuturile specificate ale acestora) este urmărită de-a lungul celor două faze ale experimentului. În afară de cele două concentrații experimentale, un grup martor de pești este menținut în condiții identice, cu excepția substanței testate, care este absentă. Acest lucru este necesar pentru stabilirea eventualelor relații între efectele nefaste observate la testul de bioconcentrare și acest grup martor, precum și pentru deducerea concentrației de bază a substanței testate.
   Faza de absorbție durează 28 de zile, în cazul în care nu se demonstrează mai devreme că a fost atins echilibrul. Se poate estima durata fazei de absorbție și timpul necesar pentru obținerea stării staționare cu ajutorul ecuațiilor din anexa 3. Perioada de epurare începe așadar cu transferarea peștilor în alt recipient curat, conținând același mediu, cu excepția substanței testate. Atunci când devine posibil, se calculează factorul de bioconcentrare, de preferință sub formă de raport (BCFSS) de concentrație de pești (Cf) și în apă (CW), în starea de echilibru aparent și în calitate de factor de bioconcentrare cinetică, și BCFk ca și raport al constantelor de viteză de absorbție (k1) și de epurare (k2), considerând o cinetică de ordinul întâi. Dacă se constată că nu a urmat o cinetică de ordinul întâi, trebuie utilizate modele mai complexe (anexa 5).
   Dacă nu se obține o stare staționară în 28 de zile, faza de absorbție se va prelungi până la obținerea acesteia sau timp de 60 de zile, preferându-se alternativa cea mai scurtă; apoi începe faza de eliminare.
   Constanta de viteză de absorbție, constanta de viteză de epurare (pierdere) (sau constantele, atunci când este vorba de modele complexe), factorul de bioconcentrare și, dacă este posibil, limitele de încredere pentru fiecare dintre acești parametri, sunt calculate pornind de la modelul care descrie cel mai fidel măsurătorile de concentrație a substanței testate, în pești și în apă.
   Factorul BCF se exprimă în funcție de greutatea totală umedă de pește. Totuși, pentru anumite studii, pot fi utilizate țesuturi sau organe specifice (de exemplu mușchi, ficat), dacă peștii sunt suficient de mari sau dacă pot fi separați în părți comestibile (fileuri) și necomestibile (viscere). Existând o relație clară care leagă potențialul de bioconcentrare și lipofilia pentru numeroase substanțe organice, va exista și o relație corespunzătoare între conținutul lipidic la peștii pentru experiență și bioconcentrațiile observate pentru aceste substanțe. Așadar, pentru a elimina această variabilă din rezultatele experiențelor cu substanțe foarte lipofile (adică având log POW > 3), bioconcentrarea trebuie exprimată în funcție de masa corporală totală și de conținutul lipidic.
   Dacă este posibil, conținutul lipidic se va stabili folosind același material biologic care a servit la determinarea concentrației substanței testate.
   1.4.   Informații despre substanța testată
   Înainte de a executa experiența de bioconcentrare, următoarele informații trebuie cunoscute despre substanța testată:

               (a)

               solubilitatea în apă;

               (b)

               coeficientul de partiție octanol-apă POW (de asemenea, KOW, determinat printr-o metodă HPLC în A.8);

               (c)

               hidroliza;

               (d)

               fototransformarea în apă, la radiația solară sau solară artificială simulată și în condițiile de radiații ale experienței de bioconcentrare (3);

               (e)

               tensiunea superficială (adică pentru substanțele la care log POW nu a putut fi măsurat);

               (f)

               presiunea de vapori;

               (g)

               biodegradabilitatea numită „facilă” (dacă este cazul).

         De asemenea, trebuie cunoscută toxicitatea relativă pentru specia de pești utilizată pentru experiență, de preferință LC50 asimptotică (adică independentă de timp). Este indispensabil să se utilizeze o metodă analitică potrivită cu exactitatea, precizia și sensibilitatea cunoscute, pentru a cuantifica substanța testată în soluția experimentală și în materialul biologic, precum și informații precise legate de prepararea și păstrarea eșantioanelor. De asemenea, trebuie să fie cunoscută limita de detecție analitică a substanței testate, atât în apă, cât și în țesuturile peștilor. Dacă se utilizează o substanță pentru testat marcată cu 14C, trebuie cunoscut procentajul de radioactivitate asociat impurităților.
   1.5.   Condițiile de validitate ale testării
   Pentru ca un test să fie valabil, trebuie îndeplinite următoarele condiții:

               —

               variația de temperatură să fie mai mică de ± 2 °C;

               —

               concentrația oxigenului dizolvat să nu coboare sub 60 % din nivelul de saturație;

               —

               concentrația substanței testate în vase să fie menținută la ± 20 % din media valorilor măsurate în timpul fazei de absorbție;

               —

               mortalitatea și alte efecte sau maladii indezirabile înregistrate la peștii-martor sau la cei supuși experimentului să fie mai mici de 10 % la sfârșitul experimentului; atunci când experimentul se prelungește pe mai multe săptămâni sau luni, mortalitatea sau alte efecte indezirabile apărute la cele două grupe de pești trebuie să fie mai mici de 5 % pe lună și să nu depășească 30 % în total.

         1.6.   Compuși de referință
   Utilizarea compușilor de referință având un potențial de bioconcentrare cunoscut, ar putea sprijini controlul asupra procedurii experimentale, dacă este necesar. Totuși, nu se pot încă recomanda substanțe specifice.
   1.7.   Descrierea metodei experimentale
   1.7.1.   Aparatura
   Se vor evita materialele care pot prezenta un efect indezirabil de absorbție, de dizolvare sau de lesivaj asupra peștilor, și aceasta pentru toate echipamentele folosite. Se vor utiliza bazine standard rectangulare sau cilindrice, din materiale inerte chimic, de capacitate adaptată regimului de umplere. Se va reduce la mimimum folosirea de țevi din plastic flexibil. Este preferabilă tubulatura din teflon (R), oțel inoxidabil și/sau sticlă. Experiențele au dovedit că, pentru substanțele cu coeficienți mari de absorbție, cum ar fi piretrinele de sinteză, poate fi necesară sticla silanizată. În acest caz, echipamentul se va arunca după utilizare.
   1.7.2.   Apa
   În general se utilizează apă naturală, provenită dintr-o sursă nepoluată și de calitate uniformă. Calitatea apei utilizate pentru diluție trebuie să permită supraviețuirea speciei de pești aleasă, în perioada de aclimatare și în cursul experimentului, fără apariția vreunui comportament anormal. În cazul ideal, ar trebui demonstrat că speciile supuse experimentului pot supraviețui, crește și reproduce în apa de diluție (de exemplu prin creștere în laborator sau printr-un studiu de toxicitate asupra unui ciclu biologic). Apa va fi caracterizată cel puțin prin pH, duritate, materii solide totale, carbon organic total și, de preferință, prin conținutul de substanțe amoniacale, nitrați și alcalinitate; pentru speciile marine, apa va fi caracterizată și prin salinitate. Se cunosc perfect principalii parametrii optimi pentru pești, iar anexa 1 indică concentrațiile maxime recomandate unui anumit număr de parametri privind apa folosită la experiment, dulce și marină.
   Pe toată perioada testării, apa trebuie să fie de calitate constantă. pH-ul se aduce la valori cuprinse între 6,0 și 8,5, însă pentru un experiment dat, pH-ul trebuie să rămână în interiorul unei plaje de ± 0,5 unități de pH. Pentru a avea siguranța că apa de diluție nu influențează rezultatele studiului (de exemplu prin complexarea substanței testate) sau că nu afectează negativ performanțele stocului de pești, se vor preleva în mod regulat eșantioane pentru analiză. De exemplu, este convenabil de făcut aceasta o dată la trei luni, interval în care o apă de diluție își păstrează calitățile relativ constante; se determină metalele grele (de exemplu Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), anionii și cationii principali (de exemplu Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidele (de exemplu cele organofosforice totale și cele organoclorurate totale), carbonul organic total și solidele aflate în suspensie. Dacă se demonstrează constanța calităților apei, pe parcursul a cel puțin un an, aceste analize se pot rări, iar intervalele dintre ele pot fi distanțate (de exemplu la șase luni).
   Conținutul în particule naturale, precum și în carbon organic total (TOC) din apa de diluție vor fi cât mai mici posibil, pentru a evita absorbția substanței testate în materiile organice, ceea ce i-ar putea reduce biodisponibilitatea (4). Valoarea maximă admisă este de 5 mg/l, pentru particulele de materie (materia uscată nu trece printr-un filtru de 0,45 µm) și de 2 mg/l, pentru carbonul organic total (vezi anexa 1). Dacă este necesar, apa se va filtra înainte de utilizare. De asemenea, contribuțiile peștilor testați (excreții), ale reziduurilor alimentare, ca și conținutul apei în carbon organic total trebuie să fie cât mai mici posibil. De-a lungul întregului experiment, concentrația în carbon organic din recipient nu trebuie să depășească cu mai mult de 10 mg/l (± 20 %), concentrația de carbon organic provenit din substanța testată și, eventua, pe cea a agentului de dizolvare.
   1.7.3.   Soluții de testat
   Se prepară o soluție stoc de substanță de testat, la concentrația dorită. De preferință, soluția stoc va fi preparată prin simplă amestecare ori agitare a substanței testate, în apa de diluție. Nu este recomandată utilizarea solvenților sau a dispersanților (agenți de dizolvare); se poate totuși recurge la aceștia, în anumite situații, pentru producerea soluției stoc, la concentrația necesară. Solvenții susceptibili a fi utilizați sunt: etanol, metanol, eterul monometilic de etilen glicol, eterul dimetilic de etilen glicol, dimetilformamida și trietilen glicolul. Dispersanții utilizabili sunt: Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloză 0,01 % și HCO-40. Se vor lua măsuri de precauție în cazul utilizării agenților ușor biodegradabili, aceștia putând provoca probleme de creștere bacteriană în testele cu reînnoire continuă. Substanța testată poate fi marcată radioactiv și trebuie să aibă cea mai mare puritate posibilă (de exemplu, de preferință, > 98 %).
   Pentru experimentele cu reînnoire continuă, se va utiliza aparatură care să aducă și să dilueze în permanență soluția stoc de substanță testată (cum ar fi pompe dozatoare, diluator proporțional, sistem saturator), pentru a aduce concentrațiile experimentale până la recipiente. Trebuie prevăzute minimum cinci volume de înlocuitor pe zi, pentru fiecare incintă experimentală. Se optează pentru metoda cu reînnoire continuă, însă dacă aplicarea acesteia devine imposibilă (de exemplu, organismele din cadrul experimentului suferă efecte nefaste), se poate recurge la o tehnică semistatică, în cazul în care criteriile de validare rămân satisfăcătoare. Debitul soluțiilor stoc și al apei de diluție va fi controlat cu 48 de ore înainte de experiment, iar în cursul derulării acestuia, cel puțin zilnic. Controlul comportă determinarea debitului în fiecare incintă experimentală, având grijă ca acesta să nu difere cu mai mult de 20 % pentru fiecare dintre ele.
   1.7.4.   Selecția speciilor
   Printre criteriile importante de selecție a speciilor figurează cel al facilității de procurare, dimensiunea și posibilitatea întreținerii ușoare în laborator. De asemenea, speciile de pești se aleg în funcție de importanța lor în materie de distracții, comerț sau ecologie. Speciile de pești trebuie să fie de sensibilitate comparabilă, să fi produs rezultate bune anterior etc.
   În anexa 2 se află o listă de specii recomandate pentru experiențe. Pot fi utilizate și alte specii, însă atunci procedura experimentală ar putea avea nevoie de adaptări, pentru a se determina condiții experimentale adecvate. Într-un asemenea caz, se expun motivațiile alegerii speciilor și a metodei experimentale folosite.
   1.7.5.   Păstrarea peștilor
   Populația de pești trebuie aclimatizată timp de cel puțin două săptămâni, în apă aflată la temperatura experimentală, oferindu-li-se hrană suficientă și de același tip cu cea folosită în cursul experimentului.
   După o perioadă de instalare de 48 de ore, se înregistrează rata mortalității, aplicându-se următoarele criterii:

               —

               mortalitate mai mare de 10 % din populație, în șapte zile: se renunță la întregul lot;

               —

               mortalitate cuprinsă între 5 și 10 % din populație, în șapte zile: se prelungește perioada de aclimatare cu șapte zile;

               —

               mortalitate mai mică de 5 % din populație, în șapte zile: se acceptă lotul – dacă mortalitatea depășește 5 % în următoarele șapte zile, se renunță la întregul lot.

         Peștii utilizați pentru experimente nu trebuie să prezinte maladii și nici anomalii observabile. Se elimină toți peștii bolnavi. Peștii nu vor fi tratați contra nici unei maladii două săptămâni înaintea experimentului și nici în cursul acestuia.
   1.8.   Executarea testului
   1.8.1.   Testul preliminar
   Se poate dovedi utilă o experimentare preliminară pentru optimizarea condițiilor de execuție ale experimentului real, în ceea ce privește, de exemplu, selecția concentrațiilor substanței testate, duratele fazelor de absorbție și de eliminare.
   1.8.2.   Condiții de expunere
   1.8.2.1.   Durata fazei de absorbție
   Se poate estima durata fazei de absorbție, cu ajutorul unei experiențe preliminare (de exemplu plecând de la un studiu anterior sau de la un produs chimic cu proprietăți de acumulare) sau pornind de la anumite relații empirice, bazate pe ceea ce se cunoaște despre solubilitatea în apă ori folosind coeficientul de partiție octanol/apă al substanței testate (a se vedea anexa 3).
   Faza de absorbție va dura 28 de zile, exceptând cazul în care se poate demonstra că a fost atins un echilibru mai devreme. Dacă nu se ajunge la o stare staționară în decurs de 28 de zile, faza de echilibru se va prelungi și se vor face alte măsurători până la obținerea stării staționare sau timp de 60 de zile (are întâietate alternativa cea mai scurtă).
   1.8.2.2.   Durata fazei de eliminare
   În general, jumătate din durata fazei de absorbție este suficientă pentru a se produce o reducere convenabilă (de exemplu 95 %) a conținutului corporal în substanță testată (a se vedea explicațiile privind estimarea din anexa 3). Dacă timpul necesar pentru realizarea unei pierderi de 95 % este prea lung, depășind, de exemplu, de două ori durata fazei de absorbție (adică mai mare de 56 de zile), se poate opta pentru o perioadă mai scurtă (respectiv, până ce concentrația substanței testate devine mai mică cu 10 % din concentrația stării staționare). Totuși, pentru substanțele având scheme de absorbție și eliminare mai complexe decât modelul peștilor în compartiment unic, după o cinetică de ordinul întâi, se utilizează faze de epurare mai lungi, pentru determinarea constantelor de viteză de eliminare. Această perioadă de timp poate fi totuși controlată prin intermediul perioadei în care concentrația substanței testate din pești se situează deasupra limitei de detecție analitice.
   1.8.2.3.   Numărul de pești pentru experiment
   Alegerea numărului de pești pentru concentrația experimentală se face astfel încât să fie disponibili cel puțin patru pești per eșantion, la fiecare eșantionare. Dacă se dorește o statistică mai performantă, numărul peștilor per eșantion va fi mărit.
   Dacă se folosesc pești adulți, se va indica dacă sunt masculi sau femele, ori dacă ambele sexe servesc experimentului. În această ultimă situație, înainte de a începe expunerea, trebuie verificat ca diferențele de conținut lipidic să nu fie semnificative; s-ar putea dovedi necesară utilizarea de loturi distincte de masculi și femele.
   Toate experiențele se fac utilizând pești de greutate asemănătoare, în sensul că cei mai mici nu vor avea o greutate mai mică decât 2/3 din cea a peștilor cei mai mari. Toți vor aparține aceleiași clase de vârstă și vor proveni din aceeași sursă. Greutatea și vârsta unui pește, având aparent efecte notabile asupra valorilor BCF (1), aceste informații vor fi înregistrate cu precizie. Este indicat ca un subeșantion din populația de pești să fie cântărit înainte de experiment, pentru estimarea greutății medii.
   1.8.2.4.   Încărcarea
   Raporturile apă/pești se măresc în scopul de a minimiza scăderea CW datorită adăugării peștilor la începutul experimentului, dar și pentru a evita diminuarea concentrației în oxigen dizolvat. Este important ca regimul de încărcare să fie adaptat speciei utilizate pentru experiment. Un regim de încărcare de 0,1-1,0 g de pește (produs viu) la litru de apă și pe zi este cel recomandat pentru toate cazurile experimentale. Se pot realiza încărcări mai rapide dacă se demonstrează că se poate ajusta concentrația necesară de substanță testată în limitele de ± 20 % și că, de asemenea, concentrația oxigenului dizolvat nu coboară sub 60 % din nivelul de saturare.
   La alegerea regimului de încărcare se va ține cont de habitatul normal al speciei. De exemplu, peștii bentonici pot necesita un acvariu cu suprafața fundului mai mare, spre deosebire de speciile pelagice, la același volum de apă.
   1.8.2.5.   Alimentația
   Pe parcursul perioadelor de alimentare și experimentale, peștii vor fi hrăniți după un regim adecvat, cu un conținut cunoscut în lipide și proteine totale, în cantitate suficientă menținerii peștilor în stare bună de sănătate, astfel încât greutatea lor corporală să se conserve. Peștii vor fi alimentați zilnic, în perioadele de aclimatare și în cele experimentale, cu rații de aproximativ 1 până la 2 % din greutatea lor corporală. Astfel, pentru cea mai mare parte dintre specii, se menține concentrația lipidică la un nivel relativ constant, de-a lungul experimentului. Cantitatea de hrană trebuie recalculată o dată pe săptămână, de exemplu, pentru menținerea greutății corporale și a conținutului lipidic la un nivel consistent. Pentru acest calcul, greutatea peștilor din fiecare incintă experimentală se va estima pornind de la greutatea peștilor eșantionați cel mai recent, din respectiva incintă. Nu se cântăresc peștii rămași în incintă.
   Hrana neconsumată și excrementele vor fi evacuate zilnic, prin sifonarea incintelor experimentale, la puțin timp după alimentare (30 minute-1 oră). Incintele vor fi menținute cât mai curate posibil în cursul întregului experiment, astfel încât concentrația de materie organică să fie cât mai mică, deoarece prezența carbonului organic poate limita biodisponibilitatea substanței testate (1).
   Numeroase alimente sunt derivate din făină de pește; acestea vor fi analizate pentru determinarea conținutului în substanță testată. De asemenea, trebuie analizat conținutul hranei în pesticide și metale grele.
   1.8.2.6.   Iluminare și temperatură
   În general, fotoperioada este de 12-16 ore la temperatura (± 2 °C) corespunzătoare speciei utilizate (vezi anexa 2). Tipul și caracteristicile iluminării vor fi clar definite. Se va ține seama de eventualele fototransformări ale substanței testate în condițiile de iradiere ale studiului. Iluminarea nu trebuie să expună peștii la fotoproduse nenaturale. În anumite cazuri poate fi esențială utilizarea de filtre pentru blocarea radiației UV mai mici de 290 nm.
   1.8.2.7.   Concentrații experimentale
   Peștii sunt expuși la o reînnoire continuă de cel puțin două concentrații apoase ale substanței testate. În mod normal, concentrația mare (sau cea mai mare) a substanței testate este stabilită la aproximativ 1 % din LC50 acută asimptotică și de cel puțin 10 ori mai mare decât limita sa de detecție în apă, prin metoda de analiză aleasă.
   Cea mai mare concentrație testată poate fi stabilită și împărțind LC50 la 96 ore, printr-un raport procentual adecvat acut/cronic (rapoartele procentuale adecvate ale anumitor produși chimici pot varia de la 3 la 100). Dacă este posibil, se alege altă concentrație (alte concentrații), astfel încât diferența față de cea căreia îi este superioară să atingă un factor zece. Dacă este imposibil, din cauza criteriului de 1 % al LC50 și a limitei analitice, poate fi utilizat un factor inferior celui de zece sau se poate accepta intervenția unei substanțe marcate radioactiv cu 14C. Nici una dintre concentrațiile utilizate nu va depăși solubilitatea substanței testate.
   Atunci când se utilizează un agent de dizolvare, concentrația acestuia nu va depăși 0,1 ml/l și trebuie să fie aceeași, în toate recipientele pentru experiment. Contribuția sa, adăugată celei a substanței testate, la conținutul global de carbon organic din apa pentru experiment trebuie să fie cunoscute. Totuși, se va face tot posibilul, să nu se recurgă la astfel de materiale.
   1.8.2.8.   Martori
   Apa de diluție martor sau, dacă este necesar, un martor conținând agentul de dizolvare, va fi disponibil pentru seria de teste, în măsura în care a fost stabilit că agentul nu are nici un efect asupra peștilor. În caz contrar, se vor folosi doi martori.
   1.8.3.   Frecvența de măsurare a calității apei
   În cursul experimentului, oxigenul dizolvat, TOC, pH-ul și temperatura vor fi măsurate în toate recipientele. Duritatea totală și, eventual, salinitatea vor fi măsurate pe martori și la un recipient cu conținutul având concentrația mare (cea mai mare). Oxigenul dizolvat și, eventual, salinitatea vor fi măsurate de cel puțin trei ori – la începutul, mijlocul și sfârșitul perioadei de absorbție – și cel puțin o dată pe săptămână, în perioada de eliminare. TOC se va măsura la începutul experimentului (24 și 48 ore înainte de demararea fazei de absorbție), înainte de adăugarea peștilor și cel puțin o dată pe săptămână, în perioadele de absorbție și de eliminare. Temperatura se va măsura zilnic, pH-ul – la începutul și la sfârșitul fiecărei perioade – iar duritatea, o dată pentru fiecare experiment. De preferință, temperatura va fi supravegheată continuu, cel puțin într-unul dintre recipiente.
   1.8.4.   Eșantionarea și analiza peștilor și a apei
   1.8.4.1.   Programarea eșantionării peștilor și a apei
   Se va preleva apă din incintele experimentale, pentru determinarea concentrației substanței testate, înainte de adăugarea peștilor și în cursul fazelor de absorbție și de epurare. Ca un minimum, apa va fi prelevată în același timp cu prelevarea peștilor și înainte de hrănirea lor. În timpul fazei de absorbție, concentrațiile de substanță testată se determină pentru a verifica dacă ele satisfac criteriile de validitate.
   În cursul fazei de absorbție, peștii sunt eșantionați de cel puțin cinci ori, iar în timpul fazei de epurare, de cel puțin patru ori. Uneori este dificil de calculat o valoare estimativă rezonabil de precisă pentru BCF, pe baza acestui număr de eșantioane, în special atunci când nu urmează o cinetică simplă de epurare, de ordinul întâi. În acest caz, se pot realiza eșantionările mai frecvent pentru cele două perioade (a se vedea anexa 4). Eșantioanele suplimentare sunt stocate și analizate numai dacă rezultatele primei serii de analize se dovedesc insuficiente pentru calculul BCF cu precizia dorită.
   În anexa 4 se găsește un exemplu de calendar acceptabil de eșantionare. Altele pot fi determinate cu ușurință, pe baza valorilor presupuse ale POW, pentru a calcula timpul de expunere, corespunzător unei absorbții de 95 %.
   Se continuă eșantionarea în cursul fazei de absorbție, până la obținerea unei stări staționare sau timp de 28 de zile, optându-se pentru varianta cea mai scurtă. Dacă nu se obține o stare staționară după 28 de zile, eșantionarea continuă până la obținerea unei astfel de stări sau timp de 60 de zile, optându-se pentru alternativa cea mai scurtă. Înainte de începerea fazei de eliminare, peștii se transferă în rezervoare curate.
   1.8.4.2.   Eșantionajul și prepararea eșantioanelor
   Se prelevează eșantioane de apă pentru analize, de exemplu prin sifonare cu ajutorul unui tub inert, într-un punct central al incintei experimentale. Întrucât se pare că fracțiile non biodisponibile de substanță testată nu pot fi separate de cele biodisponibile – nici prin filtrare și nici prin centrifugare – (în particular pentru cazul produselor chimice super-lipofile, adică cele care au log POW > 5) (1) (5), se poate renunța la supunerea eșantioanelor la astfel de tratamente.
   În schimb, trebuie avut grijă ca rezervoarele să fie cât mai curate posibil, iar conținutul în carbon organic va fi supravegheat pe întreaga durată a fazelor de absorbție și de eliminare.
   Un număr convenabil de pești (în mod normal, cel puțin patru), se prelevează din fiecare incintă experimentală pentru fiecare eșantionare. Peștii prelevați vor fi clătiți rapid cu apă, uscați cu ajutorul hârtiei absorbante și sacrificați în mod instantaneu, într-o manieră cât mai umană posibil, după care se cântăresc.
   Este preferabil să se analizeze peștii și apa imediat după eșantionare pentru a se evita orice degradare sau alte pierderi și pentru a calcula în mod aproximativ regimurile de absorbție și de purificare, în vreme ce experimentul continuă să se desfășoare. De asemenea, analiza imediată evită întârzierea constatării atingerii unui platou.
   În lipsa unei analize imediate, eșantioanele se vor conserva după o metodă convenabilă. Înainte de începerea studiului se vor aduna toate datele cu privire la metodele de stocare adecvate substanței testate; de exemplu congelare, menținere la 4 °C, durata stocării, extracția etc.
   1.8.4.3.   Calitatea metodei analitice
   Integralitatea procedurii fiind determinată, în principal, de exactitatea, precizia și sensibilitatea metodei analitice utilizate pentru substanța testată, trebuie controlat în mod experimental ca precizia și reproductivitatea analizei chimice, precum și recuperarea substanței testate – atât din apă, cât și din pești – să fie pe deplin satisfăcătoare, în cazul particular al respectivei metode. De asemenea, se are în vedere ca substanța testată să nu fie detectabilă în apa de diluție folosită.
   Dacă este necesar, valorile pentru CW și Cf derivate din experiment vor fi corectate după compararea cu valorile furnizate de martori și cu concentrația naturală a substanței testate. Pe tot parcursul testării, eșantioanele de pești și de apă sunt astfel manipulate, încât să se minimizeze contaminările și pierderile (rezultate, de exemplu, de absorbția prin materialul de eșantionare).
   1.8.4.4.   Analiza eșantioanelor de pești
   Dacă se utilizează materiale marcate radioactiv, se poate analiza marcajul radioactiv total (respectiv, compușii de origine și metaboliții) sau purifica eșantioanele, astfel încât compusul de origine să poată fi analizat separat. În plus, principalii metaboliți pot fi caracterizați fie la starea staționară, fie la sfârșitul fazei de absorbție, optându-se pentru varianta cea mai scurtă. Dacă BCF, în funcție de reziduurile marcate radioactiv totale, este ≥ 1 000 %, ar fi indicat (și, pentru anumite categorii de produse chimice, cum ar fi pesticidele, chiar recomandat cu tărie) să se identifice și cuantifice produsele de degradare reprezentând ≥ 10 % reziduuri totale în țesuturile peștilor, în starea staționară. Dacă aceste produse reprezintă ≥ 10 % reziduuri totale marcate radioactiv în țesuturile peștilor ele vor fi identificate și cuantificate; apoi, este recomandat ca acestea să fie identificate și cuantificate, de asemenea, în apa pentru experiment.
   În general, concentrația substanței testate trebuie să fie determinată pentru fiecare pește cântărit. Dacă nu este posibil, se pot pune în comun eșantioanele la fiecare testare, însă această metodă restrânge veridicitatea procedurilor statistice a rezultatelor. Dacă o anumită procedură și o finețe statistică specifică sunt urmărite, va fi convenabil să se folosească în experiment un număr adecvat de pești, pentru satisfacerea procedurii de regrupare și precizia statistică dorită (6) (7).
   BCF-ul va fi exprimat, atât în funcție de greutatea totală de produs viu, cât și pentru substanțele puternic lipofile, în funcție de conținutul lipidic. Conținutul lipidic al peștilor se determină, dacă este posibil, la fiecare eșantionare. Pentru stabilirea conținutului lipidic, se vor utiliza metode bine adaptate (ref. 8 și 2 ale anexei 3). Se recomandă tehnici de extracție prin cloroform/metanol ca metode standard (9). Metodele nu oferă rezultate identice (10), motiv pentru care este important să se precizeze care metodă s-a utilizat. Analiza lipidelor se va face, pe cât posibil, pe aceleași extracte consacrate și pentru analiza substanței testate, întrucât, adesea, lipidele trebuie scoase din extras înainte de a-l putea analiza prin cromatografie. Conținutul lipidic al peștilor (în mg/kg de produs proaspăt), la sfârșitul experienței, nu trebuie să difere față de cel inițial cu mai mult de ± 25 %. De asemenea, se va indica procentajul de solide din țesuturi, pentru a permite conversia concentrației lipidice a bazei umede la cea a bazei uscate.
   2.   DATE
   2.1.   Prelucrarea rezultatelor
   Curba de absorbție a substanței testate va rezulta din traseul concentrației sale în funcție de timp, la/în pești (sau în țesuturile specifice), în perioada fazei de absorbție, folosind o scară aritmetică. Dacă curba atinge un platou, adică adoptă aproximativ un traseu asimptotic la axa timpului, starea staționară BCFSS se va calcula, după cum urmează:

   Atunci când nu se obține nici o stare staționară, rămâne posibilitatea calculării unui BCFSS de o precizie suficientă pentru evaluarea riscurilor, pornind de la o „stare staționară” la 80 % (1,6/k2) sau 95 % (3,0/k2) de echilibru.
   În plus, factorul de concentrare (BCFk) va fi definit ca raport k1/k2 de două constante cinetice de ordinul întâi. Constanta de viteză de eliminare (k2) se determină, în general, plecând de la curba de eliminare (adică de la un traseu al descreșterii concentrației substanței testate din pești, în funcție de timp). Apoi, constanta de viteză de absorbție (k1) va fi calculată în funcție de k2 și de o valoare a Cf derivată din curba de absorbție (a se vedea și anexa 5). Metoda cea mai bună pentru obținerea BCFk și a constantelor de viteză k1 și k2 este aceea care recurge la metode informatice neliniare de estimare a parametrilor (11). Alternativ, se pot utiliza metode grafice pentru calculul k1 și k2. Dacă curba de purificare se dovedește a nu fi de ordinul întâi, trebuie utilizate modele mai complexe (a se vedea referințele din anexa 3) și să se ceară opinia unui biostatistician.
   2.2.   Interpretarea rezultatelor
   Rezultatele se vor interpreta cu precauție, atunci când concentrațiile măsurate de soluție experimentală se află la valori apropiate de limita de detecție a metodei de analiză.
   Claritatea cu care sunt definite curbele de absorbție și de eliminare dovedește buna calitate a datelor de bioconcentrare. Variația constantelor de absorbție/eliminare între cele două concentrații experimentale trebuie să fie mai mică de 20 %. Diferențele considerabile observate la ratele de absorbție/eliminare între cele două experimente de concentrare, vor fi înregistrate și explicate, dacă este posibil. În general, limita de încredere pentru BCF se apropie ± 20 %, în studiile bine concepute.
   3.   RAPORT
   Procesul-verbal al testării va cuprinde informațiile următoare:
   3.1.   Substanța testată:

               —

               natura fizică și, eventual, proprietățile fizico-chimice;

               —

               date de identificare chimică (inclusiv conținutul în carbon organic, dacă este necesar);

               —

               în cazul marcării radioactive, poziția precisă a atomului(ilor) marcat(ți) și procentajul de radioactivitate asociată impurităților.

         3.2.   Speciile utilizate:

               —

               denumire științifică, sușă, sursă, orice tratament prealabil eventual, aclimatare, vârstă, gama de dimensiuni etc.

         3.3.   Condițiile experimentale:

               —

               procedura utilizată (de exemplu, reînnoirea continuă sau semistatică);

               —

               tipul și caracteristicile iluminării utilizate și fotoperioada(ele);

               —

               conceptul experimental (de exemplu numărul și dimensiunea incintelor experimentale, regimul de înlocuire al volumelor de apă, numărul de subeșantioane și de pești per subeșantion, număr de concentrații testate, durata fazelor de absorbție și de epurare, frecvența eșantionării pentru pești și pentru apă);

               —

               metoda de preparare a soluțiilor-mamă și frecvența de reînnoire (agentul de dizolvare, concentrația sa și contribuția sa la conținutul în carbon organic al apei pentru experiență – vor fi menționate, dacă este cazul);

               —

               concentrațiile experimentale nominale, mediile valorilor măsurate și deviația standard a acestora în recipientele experimentale, precum și metoda de obținere;

               —

               sursa de apă de diluție, descrierea tuturor tratamentelor prealabile, rezultatele tuturor demonstrațiilor de aptitudine a peștilor de supraviețuire în această apă și caracteristicile apei: pH, duritate, temperatură, concentrația în oxigen dizolvat, nivelul clorului rezidual (dacă este măsurat), carbonul organic total, solide în suspensie, salinitatea mediului experimental (dacă este cazul) și orice alte măsurători făcute;

               —

               calitatea apei în recipientele experimentale, pH, duritate, temperatura și concentrația în oxigen dizolvat;

               —

               informații precise legate de alimentație (de exemplu tipul de hrană, sursă, compoziție – cel puțin conținutul în lipide și proteine dacă este posibil, cantitatea dată și frecvența);

               —

               informații legate de tratamentul peștilor și al apei eșantionate, inclusiv detalii de preparare, stocare, extracție, proceduri (și precizia) de analiză a substanței testate și conținutul în lipide (dacă s-a măsurat).

         3.4.   Rezultate:

               —

               rezultatele studiilor preliminare efectuate;

               —

               mortalitatea peștilor martor și a peștilor din fiecare incintă experimentală, precum și orice comportament anormal observat;

               —

               conținutul lipidic al peștilor (dacă a fost determinat cu ocazia experimentului);

               —

               curbele (din toate măsurătorile efectuate) exprimând absorbția și eliminarea produselor chimice experimentale la pești, timpul de acces la starea staționară;

               —

               Cf și CW (cu deviația standard și, eventual, intervalul) la momentul fiecărui eșantionări [Cf se exprimă în µg/g de produs viu (ppm), din întreg peștele sau din anumite țesuturi; de exemplu, lipidele și CW se exprimă în µg/ml (ppm)]. Valorile CW pentru seria martor (de asemenea, se indică concentrația de bază);

               —

               factorul de bioconcentrare în starea staționară (BCFSS) și/sau factorul de concentrare cinetică (BCFk) și, dacă este cazul, limitele de încredere la 95 % ale constantelor de viteză de absorbție și de eliminare (pierdere), toate exprimate în raport cu întregul corp și cu conținutul total de lipide, dacă acesta este măsurat, ale peștelui (ori ale anumitor țesuturi), limitele de încredere și deviația standard (dacă este disponibilă), metode de calcul/analiză ale rezultatelor pentru fiecare concentrație a substanței test utilizate;

               —

               atunci când se folosesc substanțe marcate radioactiv, poate fi semnalată acumularea tuturor metaboliților, dacă este necesar;

               —

               toate situațiile neobișnuite legate de experiment, toate devierile de la aceste proceduri și orice alte informații pertinente.

         Se minimizează rezultatele de tipul „nedetectabil la limita de detecție”, prin folosirea unei metode experimentale preliminare și elaborarea unui concept experimental, deoarece astfel de rezultate sunt inutile pentru calculul constantelor de viteză.
   4.   REFERINȚE BIBLIOGRAFICE

               (1)

               Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156.

               (2)

               Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390.

               (3)

               OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.

               (4)

               Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: Comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

               (5)

               US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

               (6)

               US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

               (7)

               US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.

               (8)

               Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, The Hague, Netherlands.

               (9)

               Gardner et al., (1995) Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105

               (10)

               Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp. 1431-1436.

               (11)

               CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method – Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.

               (12)

               ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.

         Anexa 1
   Caracteristici chimice acceptabile ale apei de diluție

               Substanța

               Concentrația- limită

               1

               Particule insolubile

               5 mg/l

               2

               Carbon organic total

               2 mg/l

               3

               Amoniac neionizat

               1 μg/l

               4

               Clor rezidual

               10 μg/l

               5

               Pesticide organofosforice totale

               50 ng/l

               6

               Pesticide organofluorurate totale + policlorobifenili

               50 ng/l

               7

               Clor organic total

               25 ng/l

               8

               Aluminiu

               1 μg/l

               9

               Arsen

               1 μg/l

               10

               Crom

               1 μg/l

               11

               Cobalt

               1 μg/l

               12

               Cupru

               1 μg/l

               13

               Fier

               1 μg/l

               14

               Plumb

               1 μg/l

               15

               Nichel

               1 μg/l

               16

               Zinc

               1 μg/l

               17

               Cadmiu

               100 ng/l

               18

               Mercur

               100 ng/l

               19

               Argint

               100 ng/l

         Anexa 2
   Specii de pești recomandate pentru experimente

               Specii recomandate

               Plaja de temperatură recomandată pentru experimente
               (°C)

               Lungimea totală recomandată pentru animalele utilizate
               (cm)

               1

               Danio rerio (1) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton - Buchanan) Zebra

               20-25

               3,0 ± 0,5

               2

               Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque)

               20-25

               5,0 ± 2,0

               3

               Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) Crap

               20-25

               5,0 ± 3,0

               4

               Oryzias lapites (Teleostei, Poeciliidae) (Temmink and Schlegel) Medaka

               20-25

               4,0 ± 1,0

               5

               Poccilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Guppy

               20-25

               3,0 ± 1,0

               6

               Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) Biban-soare

               20-25

               5,0 ± 2,0

               7

               Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) Păstrăv curcubeu

               13-17

               8,0 ± 4,0

               8

               Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) Ghidrin țepos

               18-20

               3,0 ± 1,0

         În anumite țări, au fost utilizate diverse specii marine și de estuar, de exemplu:

                  Leiostomus xanthurus

                  Leiostomus xanthurus

                  Cyprinodon variegatus

                  Cyprinodon variegatus

                  Menidia beryllina

                  Menidia beryllina

                  Cymatogaster aggregata

                  Cymatogaster aggregata

                  Parophrys vertulus

                  Parophrys vertulus

                  Leptocottus armatus

                  Leptocottus armatus

               Ghidrin țepos

                  Gasterosteus aculeatus

               Biban comun

                  Dicentracus labrax

               Obleț

                  Alburnus alburnus

         Recoltare
   Peștii de apă dulce menționați în tabelul de mai sus sunt ușor de crescut și/sau foarte disponibili, tot timpul anului, față de speciile marine sau de estuar, a căror disponibilitate este, în anumite țări, limitată. Ei se reproduc și trăiesc atât în fermele piscicole, cât și în laboratoare, în condițiile în care maladiile și paraziții se află sub control; așadar, animalele utilizate vor fi în stare bună de sănătate, cu ascendență genetică cunoscută. Pot fi găsiți aproape în întreaga lume.

      (1)  Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B, Vol. 252, p. 231.
   Anexa 3
   Estimarea duratei fazelor de absorbție și de eliminare
   1.   Prognoza pentru durata fazei de absorbție
   Înainte de executarea testării, se poate estima k2 și, deci, un procentaj de timp necesar pentru a ajunge la starea staționară, pornind de la relațiile empirice între k2 și coeficientul de separare n-octanol/apă (POW) sau între k2 și solubilitatea în apă (s).
   Se estimează k2 (zile-1) pornind, de exemplu, de la relația empirică următoare (1):

               log10k2 = -0,414 log10(Pow) + 1,47 (r2 = 0,95)

               (ecuația 1)

         Pentru alte relații, vezi referințele bibliografice (2).
   Dacă coeficientul de partiție (Pow) nu este cunoscut, se va proceda la o estimare (3) plecând de la solubilitatea în apă (s) a substanței, după cum urmează:

               log10(Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994)

               (ecuația 2)

         unde s = solubilitatea (mol/l): (n = 36)
   Aceste relații se aplică numai produselor chimice ale căror valori, log Pow, se situează între 2 și 6,5 (4).
   Timpul necesar pentru atingerea unui anumit procentaj din starea staționară va rezulta din ecuația cinetică generală, indicându-se absorbția și eliminarea (cinetica de ordinul I), prin aplicarea estimării k2:

   unde, dacă Cw este constant:

   Atunci când ne apropiem de starea staționară (t → → ∞), ecuația 3 se reduce (5) (6) la:

   Raportul k1/k2 · CW se apropie astfel de concentrația substanței din pești în „starea staționară” (Cf,s).
   Așadar, ecuația 3 poate fi transcrisă:

                  sau

               (ecuația 4)

         Timpul necesar pentru atingerea unui anumit procentaj din starea staționară poate fi prevăzut grație ecuației 4, atunci când k2 a fost în prealabil estimat cu ajutorul ecuațiilor 1 sau 2.
   Cu titlu informativ, durata optimă statistică a fazei de absorbție, care permite obținerea de rezultate statistice acceptabile (BCFk), este perioada necesară pentru ca curba logaritmului concentrației de substanță testată din pești, trasată în funcție de timp în scară lineară, să ajungă la punctul median, adică la 1,6/k2 sau la 80 % din starea staționară, fără a depăși 3,0/k2 sau 95 % din starea staționară (7).
   Timpul până la atingerea a 80 % din starea staționară este (ecuația 4):

                  SAU

               (ecuația 5)

         Similar, pentru 95 % din starea staționară:

               (ecuația 6)

         De exemplu, durata fazei de absorbție (abs.) a unei substanțe testate, având un log Pow = 4, va fi (folosind ecuațiile 1, 5 și 6):

               log10k2 = -0,414. (4) + 1,47

               k2 = 0,652 days-1

               abs (80 %) = 1,6/0,652, adică 2,45 zile (59 ore)

               sau

               abs (95 %) = 3,0/0,652, adică 4,60 zile (110 ore)

         În același mod, pentru o substanță testată cu s = 10-5 mol/l [log (s) = 5,0], durata de absorbție va fi (folosind ecuațiile 1, 2, 5 și 6):

               log10 (Pow)

               = -0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02

               log10k2

               = -0,414 (5,02) + 1,47

               k2

               = 0,246 days-1

               abs (80 %)

               = 1,6/0,246, adică, 6,5 zile (156 ore)

               sau

               abs (95 %)

               = 3,0/0,246, adică 12,2 zile (293 ore)

         De asemenea, se poate utiliza expresia alternativă:
   teq = 6,54 × 10-3 Pow + 55,31 (ore)
   pentru calculul timpului de atingere a stării staționare (4).
   2.   Estimarea duratei fazei de eliminare
   Se poate estima, de asemenea, timpul necesar pentru ca substanța testată ajunsă în corpul peștilor, să se reducă la un anumit procentaj din concentrația inițială, grație ecuației generale, ilustrând absorbția și eliminarea (cinetica de ordinul I) (1) (8).
   Pentru faza de eliminare, CW este considerată nulă. Ecuația poate fi redusă la:

   unde Cf,o este concentrația la începutul perioadei de eliminare. Se va obține apoi o eliminare de 50 %, la momentul (t50):

   În același mod, 95 % din faza de eliminare va fi atinsă la:

   Dacă ne plasăm la 80 % din faza de absorbție pentru prima perioadă (1,6/k2) și la 95 % din pierderi pentru faza de eliminare (3,0/k2), atunci faza de eliminare este aproximativ dublul duratei fazei de absorbție.
   Totuși, este important de menționat că aceste estimări se bazează pe ipoteza că schemele de absorbție și eliminare urmează o cinetică de ordinul întâi. Dacă nu este cazul, se vor folosi modele mai complexe [de exemplu, referința bibliografică (1)].
   Bibliografie (pentru anexa 3)

               (1)

               Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309-320.

               (2)

               Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

               (3)

               Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10.

               (4)

               Hawker D.W. and Connell D.W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707.

               (5)

               Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792.

               (6)

               Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehmann P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.

               (7)

               Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622.

               (8)

               Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3-19.

         Anexa 4
   Exemple teoretice de grafice de eșantionare pentru testele de bioconcentrare ale substanțelor cu log POW = 4

               Prelevări de pești

               Calendar de eșantionare

               Număr eșantioane de apă

               Număr de pești per eșantion

               Frecvența minimă cerută
               (zile)

               Eșantionare suplimentară

               Faza de absorbție

               -1
               0

               2 (1)

               2

                  Se adaugă 45-80 de pești

               I

               0,3

               0,4

               2
               (2)

               4
               (4)

               II

               0,6

               0,9

               2
               (2)

               4
               (4)

               III

               1,2

               1,7

               2
               (2)

               4
               (4)

               IV

               2,4

               3,3

               2
               (2)

               4
               (4)

               V

               4,7

               2

               6

                  Faza de epurare

                  Peștii se transferă într-o apă care nu conține produsul testat

               VI

               5,0

               5,3

               4
               (4)

               VII

               5,9

               7,0

               4
               (4)

               VIII

               9,3

               11,2

               4
               (4)

               IX

               14,0

               17,5

               6
               (4)

               Valorile dintre paranteze sunt numere de eșantioane (apă, pești) care trebuie prelevate, dacă se procedează la o eșantionare suplimentară.

                  Notă: Estimarea înaintea experimentului a lui k2, pentru un log POW = 4,0, este de 0,652 zile-1. Durata totală a experimentului este fixată la: 3 × abs. = 3 × 4,6 zile, adică 14 zile. Pentru estimarea „abs.” se utilizează anexa 3.

      (1)  Se prelevează apa după adăugarea a cel puțin 3 volume ale incintei experimentale.
   Valorile dintre paranteze sunt numere de eșantioane (apă, pești) care trebuie prelevate, dacă se procedează la o eșantionare suplimentară.

      Notă: Estimarea înaintea experimentului a lui k2, pentru un log POW = 4,0, este de 0,652 zile-1. Durata totală a experimentului este fixată la: 3 × abs. = 3 × 4,6 zile, adică 14 zile. Pentru estimarea „abs.” se utilizează anexa 3.
   Anexa 5
   Deosebirile dintre modele
   S-a presupus că majoritatea rezultatelor de bioconcentrare sunt „rezonabil” de bine descrise, printr-un model simplu cu două compartimente/doi parametri, respectiv printr-o curbă rectilinie ce reprezintă aproximativ punctele de măsură ale concentrațiilor de substanță testată din pești, în cursul fazei de eliminare, pe hârtie semilogaritmică. (Atunci când aceste puncte nu se pot reduce la o dreaptă, este indicat să se recurgă la modele mai complexe, a se vedea, de exemplu, Spacie and Hamelink, ref. 1 din bibliografia anexei 3).
   Metoda grafică pentru determinarea constantei de viteză de eliminare (pierdere) k2

   Se reprezintă, pe hârtie semilogaritmică, concentrația substanței testate, determinată la fiecare eșantion de pești, conform graficului de eșantionare. Panta acestei drepte este k2.
   Atenție: abaterile față de această linie dreaptă pot indica o schemă de eliminare mai complexă decât cinetica de ordinul întâi. O metodă grafică poate rezolva acest tip de eliminare care se abate de la cinetica de ordinul întâi.
   Metoda grafică pentru determinarea constantei de viteză de absorbție k1

   K2 fiind determinat, se calculează k1, după cum urmează:
   Se citește valoarea Cf în punctul median al curbei de absorbție netezite, aproximată cu o dreaptă, atunci când concentrația logaritmică este trasată în funcție de timp (pe o scară aritmetică).
   Metoda de calcul informatic a constantelor de viteză de absorbție și de eliminare (pierdere)
   Pentru obținerea factorului de bioconcentrare și a constantelor de viteză k1 și k2, se vor utiliza de preferință metode informatice neliniare de estimare parametrică. Aceste programe determină valorile pentru k1 și k2, utilizând un ansamblu de rezultate secvențiale ale concentrației în timp, funcție de model:

               0 < t < tc

               (ecuația 2)

               t < tc

               (ecuația 3)

         unde tc = timpul la sfârșitul fazei de absorbție.
   Această metodă furnizează estimarea deviațiilor standard a k1 și k2.
   întrucât în majoritatea cazurilor se poate estima k2 pornind de la curba de eliminare, și aceasta cu o precizie destul de mare, și întrucât există o strânsă corelare între cei doi parametri k1 și k2, este de dorit să se calculeze mai întâi k2, pornind numai de la datele de eliminare, și după aceea să se calculeze k1, de la datele de absorbție, cu ajutorul unei regresii neliniare.