title: A doua directivă a Comisiei din 14 mai 1982 privind apropierea legislației statelor membre cu privire la metodele de analiză necesare pentru verificarea compoziției produselor cosmetice

text:
               13/Volumul 06

               RO

               Jurnalul Ofícial al Uniunii Europene

               36

         31982L0434

               L 185/1

               JURNALUL OFÍCIAL AL UNIUNII EUROPENE

      A DOUA DIRECTIVĂ A COMISIEI

   din 14 mai 1982
   privind apropierea legislației statelor membre cu privire la metodele de analiză necesare pentru verificarea compoziției produselor cosmetice
   (82/434/CEE)
   COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,
   având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Economice Europene,
   având în vedere Directiva 76/768/CEE a Consiliului din 27 iulie 1976 privind apropierea legislației statelor membre cu privire la produsele cosmetice (1), modificată de Directiva 79/661/CEE (2), în special articolul 8 alineatul (1),
   întrucât Directiva 76/768/CEE prevede testarea oficială a produselor cosmetice cu scopul constatării îndeplinirii condițiilor prescrise în dispozițiile Comunității privind compoziția produselor cosmetice;
   întrucât toate metodele de analiză necesare trebuie să fie stabilite cât mai repede posibil; întrucât prima etapă în atingerea acestui obiectiv a fost deja parcursă prin definirea anumitor metode în Directiva 80/1335/CEE a Comisiei (3), a doua etapă constă în definirea metodelor de identificare a unor agenți de oxidare și de determinare a apei oxigenate în produsele cosmetice pentru îngrijirea părului, de identificare și determinare semicantitativă a anumitor coloranți de oxidare în vopselele de păr, de identificare și determinare a azotitului, de identificare și determinare a formaldehidei libere, de determinare a rezorcinolului în șampon și loțiuni de păr, de determinare a metanolului față de etanol sau 2-propanol;
   întrucât măsurile stabilite de prezenta directivă sunt în conformitate cu avizul Comitetului privind adaptarea Directivei 76/768/CEE la progresul tehnic,
   ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ:
   Articolul 1
   Statele membre adoptă toate măsurile necesare pentru a asigura ca în timpul testării oficiale a produselor cosmetice:

               —

               identificarea agenților de oxidare și determinarea perhidrolului în produsele de îngrijire a părului,

               —

               identificarea și determinarea semicantitativă a anumitor coloranți de oxidare în vopselele de păr,

               —

               identificarea și determinarea azotitului,

               —

               identificarea și determinarea formaldehidei libere,

               —

               determinarea rezorcinolului în șampoane și loțiuni de păr,

               —

               determinarea metanolului față de etanol sau 2-propanol

         să fie efectuate în conformitate cu metodele descrise în anexă.
   Articolul 2
   Statele membre pun în aplicare actele cu putere de lege și actele administrative necesare pentru a se conforma prezentei directive până la 31 decembrie 1983.
   Statele membre informează de îndată Comisia cu privire la aceasta.
   Articolul 3
   Prezenta directivă se adresează statelor membre.

      Adoptată la Bruxelles, 14 mai 1982.

            Pentru Comisie

         Karl-Heinz NARJES

            Membru al Comisiei

      (1)  JO L 262, 27.9.1976, p. 169.

      (2)  JO L 192, 31.7.1979, p. 35.

      (3)  JO L 383, 31.12.1980, p. 27.
   ANEXĂ
   I.   IDENTIFICAREA AGENȚILOR OXIDANȚI ȘI DETERMINAREAAPEI OXIGENATE ÎN PRODUSELE PENTRU ÎNGRIJIREA PĂRULUI
   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE
   Determinarea iodometrică a apei oxigenate în produsele cosmetice este posibilă numai în absența altor agenți de oxidare care formează iod din ioduri. Prin urmare, înainte de determinarea iodometrică a apei oxigenate, sunt necesare detectarea și identificarea tuturor celorlalți agenți de oxidare prezenți. Această identificare se face în două etape; prima etapă se referă la persulfați, bromați și apă oxigenată, iar cea de-a doua la peroxidul de bariu.
   A.   IDENTIFICAREA PERSULFAȚILOR, BROMAȚILOR ȘI APEI OXIGENATE
   1.   PRINCIPIU
   Persulfatul de sodiu, persulfatul de potasiu și persulfatul de amoniu; bromatul de potasiu, bromatul de sodiu și apa oxigenată – provenită sau nu din peroxidul de bariu – sunt identificate cu ajutorul cromatografiei pe hârtie, folosindu-se doi solvenți de developare.
   2.   REACTIVI
   Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.
   Soluții apoase de referință 0,5 % (m/v) ale următorilor compuși:
   2.1.1.   Persulfat de sodiu
   2.1.2.   Persulfat de potasiu
   2.1.3.   Persulfat de amoniu
   2.1.4.   Bromat de potasiu
   2.1.5.   Bromat de sodiu
   2.1.6.   Apă oxigenată
   2.2.   Solvent de developare A, 80 % (v/v) etanol
   2.3.   Solvent de developare B, benzen – metanol – 3-metil-1-butanol – apă (raport volumetric 34:38:18:10)
   2.4.   Agent de detectare A, soluție apoasă de iodură de potasiu 10 % (m/v)
   2.5.   Agent de detectare B, soluție apoasă de amidon 1 % (m/v)
   2.6.   Agent de detectare C, acid clorhidric 10 % (m/m)
   2.7.   Acid clorhidric 4 n
   3.   APARATURĂ ȘI ECHIPAMENT
   3.1.   Hârtie cromatografică (hârtie Whatman nr. 3 și nr. 4 sau echivalentă)
   3.2.   Micropipete de 1 μl
   3.3.   Baloane cotate de 100 ml
   3.4.   Filtre cutate
   3.5.   Aparatură pentru cromatografie descendentă pe hârtie
   4.   PREGĂTIREA PROBEI
   4.1.   Produși solubili în apă
   Se prepară două soluții din fiecare probă prin dizolvarea a 1 g și respectiv 5 g de produs în 100 ml apă. Se folosește 1 μl din fiecare dintre aceste soluții pentru realizarea cromatografiei pe hârtie descrise în secțiunea 5.
   4.2.   Produși greu solubili în apă
   4.2.1.   Se cântăresc 1 g și, respectiv, 5 g de probă și se dispersează în 50 ml apă, se aduce la semn cu apă, în fiecare din cele două cazuri, și se amestecă. Se filtrează cele două dispersii prin filtrul cutat (3.4) și se folosește 1 μl din fiecare filtrat pentru realizarea cromatografiei pe hârtie descrise în secțiunea 5.
   4.2.2.   Se prepară încă o dată două dispersii din fiecare probă prin dispersarea a 1 g și respectiv 5 g în 50 ml apă, acidificată cu acid clorhidric diluat (2.7), se aduce la semn cu apă și se amestecă. Se filtrează dispersiile peste filtrul cutat (3.4) și se folosește 1 μl din fiecare filtrat pentru realizarea cromatografiei pe hârtie descrise în secțiunea 5.
   4.3.   Creme
   Se dispersează 5 g și 20 g din fiecare produs în 100 ml apă și se folosesc dispersiile pentru realizarea cromatografiei pe hârtie descrise în secțiunea 5.
   5.   METODĂ
   5.1.   În două tancuri cromatografice separate se pun cantități adecvate de solvent A (2.2) și B (2.3), cu scopul realizării cromatografiei descendente pe hârtie. Se saturează tancurile cromatografice cu vapori de solvent pentru cel puțin 24 ore.
   5.2.   Se pune câte 1 μl din soluția probă și din soluția de referință preparată conform secțiunilor 4 și 2.1 pe câte un punct de pornire de pe banda de hârtie cromatografică (Whatman nr. 3 sau echivalentă) de lungime 40 cm și lățime 20 cm (3.1) sau alt format adecvat și se evaporă soluția în aer.
   5.3.   Se pune banda cromatografică (5.2) în tancul cromatografic umplut cu soluție de developare A (5.1) și se developează până când frontul de solvent avansează 35 cm (aproximativ 15 ore).
   5.4.   Se repetă procedeul descris în secțiunile 5.2 și 5.3, utilizând hârtie cromatografică (Whatman nr. 4 sau echivalentă) (3.1) și solvent de developare B. Se cromatografiază până când frontul solventului avansează 35 cm (aproximativ 5 ore).
   5.5.   După developare se îndepărtează cromatogramele și se usucă la aer.
   Se pun în evidență petele din cromatogramă prin pulverizare succesivă cu:
   5.6.1.   agent de detectare A (2.4), urmat la scurt timp de agentul de detectare B (2.5). Petele de persulfați apar primele în cromatogramă și sunt urmate de petele de apă oxigenată. Se marchează petele cu un creion;
   5.6.2.   agent de detectare C (2.6) pe cromatogramele obținute conform secțiunii 5.6.1; prezența bromaților este indicată prin pete albastru-cenușiu pe cromatogramă.
   5.7.   În condițiile menționate mai sus, corespunzătoare solvenților de developare A (2.2) și B (2.3), valorile Rf ale substanțelor de referință (2.1) sunt aproximativ următoarele:

                  Solvent de developare A (2.2)

                  Solvent de developare B (2.3)

               Persulfat de sodiu

               0,40

               0,10

               Persulfat de potasiu

               0,40

               0,02 + 0,05

               Persulfat de amoniu

               0,50

               0,10 + 0,20

               Bromat de sodiu

               0,40

               0,20

               Bromat de potasiu

               0,40

               0,10 + 0,020

               Apă oxigenată

               0,80

               0,80

         B.   IDENTIFICAREA PEROXIDULUI DE BARIU
   1.   PRINCIPIU
   Peroxidul de bariu se identifică prin formarea apei oxigenate după acidificarea probei (A.4.2) și prin prezența ionului de bariu:

               —

               în absența persulfaților (A), prin adăugarea de acid sulfuric diluat la o porțiune acidificată din soluția probă (B.4.1), în urma căreia se formează un precipitat alb de sulfat de bariu. Prezența ionilor de bariu în probă (B.4.1) este încă o dată confirmată prin cromatografie pe hârtie în modul descris mai sus (B.5);

               —

               când peroxidul de bariu și persulfații sunt prezenți simultan (B.4.2), prin asimilarea reziduului din soluție (B.4.2) într-o bază; după dizolvarea în acid clorhidric, prezența ionilor de bariu este confirmată în soluția topiturii (B.4.2.3) prin cromatografie pe hârtie și prin precipitarea sulfatului de bariu.

         2.   REACTIVI
   2.1.   Metanol
   2.2.   Acid clorhidric concentrat 36 %(m/m)
   2.3.   Acid clorhidric 6 n
   2.4.   Acid sulfuric 4 n
   2.5.   Sare disodică a acidului rodizonic
   2.6.   Clorură de bariu (BaCl2•2H2O)
   2.7.   Carbonat de sodiu anhidru
   2.8.   Clorură de bariu, soluție apoasă 1 % (m/v)
   2.9.   Solvent de developare constând în metanol, acid clorhidric concentrat (36 %) și apă (raport volumetric 80:10:10).
   2.10.   Agent de detectare, soluție apoasă 0,1 % (m/v) de sare disodică a acidului rodizonic, proaspăt preparată chiar înainte de folosire.
   3.   APARATURĂ ȘI ECHIPAMENT
   3.1.   Micropipete de 5 μl
   3.2.   Creuzete de platină
   3.3.   Balon cotat de 100 ml
   3.4.   Hârtie cromatografică Schleicher și Schull 2043 b sau echivalentă. Se curăță hârtia prin developare peste noapte într-un tanc cromatografic descendent (A.3.5), conținând solvent de developare (B.2.9), și apoi se usucă.
   3.5.   Hârtie de filtru cutată
   3.6.   Aparatura uzuală pentru realizarea cromatografiei descendente pe hârtie.
   4.   PREGĂTIREA PROBEI
   4.1.   Produse care nu conțin persulfați
   4.1.1.   Se dispersează 2 g de produs în 50 ml apă și se aduce pH-ul dispersiei la aproximativ 1 cu acid clorhidric (B.2.3).
   4.1.2.   Se transferă dispersia cu apă într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn cu apă și se amestecă. Se folosește această dispersie pentru analiza prin cromatografie pe hârtie descrisă în secțiunea 5 și pentru identificarea bariului prin precipitarea sulfatului.
   4.2.   Produse care conțin persulfați
   4.2.1.   Se dispersează 2 g de produs în 100 ml de apă și se filtrează.
   4.2.2.   Se adaugă la reziduul uscat carbonat de sodiu (B.2.7) de 7 până la 10 ori greutatea sa, se amestecă și se topește amestecul într-un creuzet de platină (B.3.2) pentru o jumătate de oră.
   4.2.3.   Se răcește la temperatura camerei, se dizolvă topitura în 50 ml apă și se filtrează (B.3.5).
   4.2.4.   Se dizolvă reziduul din topitură în acid clorhidric (B.2.3) și se aduce la 100 ml cu apă. Se folosește această soluție pentru analiza cromatografiei pe hârtie descrise în secțiunea 5 și pentru identificarea bariului prin precipitare din sulfat.
   5.   METODĂ
   5.1.   Se pune o cantitate adecvată de solvent de developare (B.2.9) într-un tanc pentru cromatografie ascendentă pe hârtie și se saturează tancul pentru cel puțin 15 ore.
   5.2.   Pe o bucată de hârtie cromatografică – tratată în prealabil conform secțiunii B.3.4 – se aplică 5 μl din fiecare dintre soluțiile preparate conform secțiunilor B.4.1.2 și B.4.2.4 și soluție de referință B.2.8 în trei puncte de pornire.
   5.3.   Se usucă la aer petele de probă și de referință. Se developează cromatograma până când frontul solventului urcă 30 cm.
   5.4.   Se îndepărtează cromatograma din vas și se usucă la aer.
   5.5.   Se pun în evidență petele de pe cromatogramă prin pulverizarea pe hârtie a agentului de detectare B.2.10. În prezența bariului, pe cromatogramă apar pete roșii cu o valoare a Rf de aproximativ 0,10.
   C.   DETERMINAREA APEI OXIGENATE
   1.   PRINCIPIU
   Determinarea iodometrică a apei oxigenate se bazează pe următoarea reacție:

   Această conversie are loc încet, dar poate fi accelerată prin adăugare de molibdat de amoniu. Iodul format se determină prin titrare cu tiosulfat de sodiu și este o măsură a conținutului de apă oxigenată.
   2.   DEFINIȚIE
   Conținutul de apă oxigenată măsurat în modul descris mai sus se exprimă ca procent masic de produs (% m/m).
   3.   REACTIVI
   Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.
   3.1.   Acid sulfuric 2 n
   3.2.   Iodură de potasiu
   3.3.   Molibdat de amoniu
   3.4.   Tiosulfat de sodiu 0,1 n
   3.5.   Soluție de iodură de potasiu 10 % (m/v), proaspăt preparată chiar înainte de folosire
   3.6.   Soluție de molibdat de amoniu 20 % (m/v)
   3.7.   Soluție de amidon 1 % (m/v)
   4.   APARATURĂ ȘI ECHIPAMENT
   4.1.   Pahare de 100ml
   4.2.   Biurete de 50ml
   4.3.   Baloane cotate de 250ml
   4.4.   Cilindri gradați de 25 și 100 ml
   4.5.   Pipete de 10 ml cu un singur marcaj
   4.6.   Flacoane conice de 250ml
   5.   METODĂ
   5.1.   Într-un pahar de 100 ml se cântăresc 10 g (m grame) de produs, conținând aproximativ 0,6 g apă oxigenată. Se transferă conținutul cu apă într-un balon cotat de 250 ml, se aduce cu apă la semn și se amestecă.
   5.2.   Într-un pahar conic de 250 ml (4.6) se pun cu pipeta 10 ml de soluție de probă (5.1) și se adaugă succesiv 100 ml acid sulfuric 2 n (3.1), 20 ml soluție de iodură de potasiu (3.5) și trei picături de soluție de molibdat de amoniu (3.6).
   5.3.   Iodul format se titrează imediat cu soluție de tiosulfat de sodiu 0,1 n (3.4) și exact înainte de virare se adaugă câțiva mililitri de soluție de amidon ca indicator (3.7). Se înregistrează consumul de tiosulfat de sodiu 0,1 n (3.4), în mililitrii (V).
   5.4.   În modul descris mai sus în secțiunile 5.2 și 5.3, se realizează o determinare oarbă, înlocuind 10 ml din soluția probă cu 10 ml apă. Se înregistrează consumul de soluție de tiosulfat de sodiu 0,1 n în determinarea oarbă (Vo ml).
   6.   CALCUL
   Se calculează conținutul de apă oxigenată din produs ca procent masic (% m/m) cu ajutorul formulei de mai jos:

               % peroxid de hidrogen

         în care:

               m

               =

               cantitatea în grame de produs analizat (5.1),

               Vo

               =

               consumul în mililitri de soluție de tiosulfat 0,1 n pentru determinarea oarbă (5.4),

               V

               =

               consumul în mililitri de soluție de tiosulfat 0,1 n în titrarea soluției de probă (5.3).

         7.   REPETABILITATE (1)

   Pentru un produs conținând aproximativ 6 % m/m apă oxigenată, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel pe aceeași probă nu trebuie să depășească o valoare absolută de 0,2 %.
   II.   IDENTIFICAREA ȘI DETERMINAREA SEMICANTITATIVĂ A ANUMITOR COLORANȚI DE OXIDARE ÎN VOPSELELE PENTRU PĂR
   1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE
   Prezenta metodă este adecvată pentru identificarea și determinarea semicantitativă a următoarelor substanțe în vopselele pentru păr, sub formă de cremă sau lichide:

               Substanțe

               Simbol

               Fenilendiamine

               o-fenilendiamină

               (OPD)

               m-fenilendiamină

               (MPD)

               p-fenilendiamină (Anexa V)

               (PPD)

               Metilfenilendiamine

               4-metil-1,2-fenilendiamină (toluen-3,4-diamină)

               (OTD)

               4-metil-1,3-fenilendiamină (toluen-2,4-diamină)

               (MTD)

               2-metil-1,4-fenilendiamină (toluen-2,5-diamină)

               (PTD)

               Diaminofenoli

               2,4-diaminofenol

               (DAP)

               Hidrochinonă

               1,4-benzendiol

               (H)

                  α-Naftol

               (α-N)

               Pirogalol

               1,2,3-trihidroxibenzen

               (P)

               Rezorcinol

               1,3-dihidroxibenzen

               (R)

         2.   PRINCIPIU
   Coloranții de oxidare sunt extrași la pH 10 cu etanol 96 % din vopselele în formă de cremă sau lichid și identificați prin cromatografie în strat subțire, uni- sau bi-dimensională.
   Pentru determinarea semicantitativă a acestor substanțe, cromatograma probelor este comparată folosind patru sisteme de developare cu substanțele de referință produse în același timp și în condiții pe cât posibil similare.
   3.   REACTIVI
   Toți reactivi trebuie să fie de puritate analitică.
   3.1.   Etanol anhidru
   3.2.   Acetonă
   3.3.   Etanol, 96 % v/v
   3.4.   Soluție amoniacală, 25 %
   3.5.   Acid ascorbic L(+)
   3.6.   Cloroform
   3.7.   Ciclohexan
   3.8.   Azot tehnic
   3.9.   Toluen
   3.10.   Benzen
   3.11.   n-butanol
   3.12.   2-butanol
   3.13.   Acid hipofosforos, soluție 50 % v/v
   3.14.   Reactiv diazo. Unul din următoarele:

               —

               clorbenzensulfonat de 3-nitro-1-benzendiazoniu (forma de sare stabilă) ca în Roșu 2 JN – Francolor.

               —

               naftalinbenzoat de 2-clor-4-nitro-1-benzendiazoniu (formă de sare stabilă) ca în Reactiv NNCD – nr. crt. 74 150 FLUKA

         ori un echivalent.
   3.15.   Azotat de argint
   3.16.   p-dimetilaminobenzaldehidă
   3.17.   2,5-dimetilfenol
   3.18.   Clorură ferică hexahidrată (FeCl3 6H2O)
   3.19.   Acid clorhidric, soluție 10 % m/v
   3.20.   Substanțe de referință
   Substanțele de referință sunt cele indicate în primul paragraf, „Scop și obiective”. În cazul compușilor de amine, substanțele de referință trebuie să fie ori hidrocloruri (mono sau bi), ori baze libere.
   3.21.   Soluții de referință 0,5 % (m/v)
   Se prepară câte o soluție 0,5 % (m/v) din fiecare dintre substanțele de referință din secțiunea 3.20.
   Într-un balon cotat de 10 ml se cântăresc 50 mg ± 1 mg substanță de referință.
   Se adaugă 5 ml etanol 96 % (3.3) și 250 mg acid ascorbic (3.5).
   Se alcalinizează soluția prin adăugarea soluției de amoniac (3.4) pentru a obține un pH aparent de 10 (se verifică cu hârtie indicatoare).
   Se adăugă până la 10 ml etanol 96 % (3.3) și se amestecă.
   Soluțiile pot fi păstrate o săptămână într-un loc rece și ferit de lumină.
   În anumite cazuri, după adăugarea acidului ascorbic și a amoniacului, se poate forma un precipitat. În acest caz trebuie lăsat să se sedimenteze înainte de lucru.
   3.22.   Solvenți de developare
   3.22.1.   Acetonă – cloroform – toluen (raport volumetric 35:25:40)
   3.22.2.   Cloroform – ciclohexan – etanol absolut – amoniac 25 % (raport volumetric 80:10:10:1)
   3.22.3.   Benzen – 2-butanol – apă (raport volumetric 50:25:25). Se agită bine și se folosește faza superioară după separare la temperatura camerei (20 până la 25 °C)
   3.22.4.   n-butanol – cloroform – reactiv M (raport volumetric 7:70:23). Se separă cu grijă la temperatura camerei (20 până la 25 °C) și se folosește faza inferioară.

               Prepararea reactivului M

               Soluție amoniacală 25 % (v/v):

               24 volume

               Acid hipofosforos 50 % (3.13):

               1 volum

               Apă:

               75 volume.

      Notă: Solvenții de developare conținând amoniac trebuie bine agitați imediat înainte de folosire.
   3.23.   Spray-uri indicatoare
   3.23.1.   Reactiv diazo
   Se prepară o soluție apoasă 5 % (m/v) din reactiv ales (3.14). Această soluție trebuie să fie proaspăt preparată, chiar înainte de folosire.
   3.23.2.   Reactiv Ehrlich
   Se dizolvă 2 g p-diametilaminobenzaldehidă (3.16) în 100 ml acid clorhidric soluție apoasă 10 % (m/v) (3.19).
   3.23.3.   2,5-dimetilfenol - clorură ferică hexahidrată

      Soluție 1: se dizolvă 1 g dimetilfenol (3.17) în 100 ml etanol 96 % (3.3).

      Soluție 2: se dizolvă 4 g clorură ferică hexahidratată (3.18) în 100 ml etanol 96 % (3.3).
   Pentru developare, aceste soluții sunt pulverizate separat, întâi soluția 1, apoi soluția 2.
   3.23.4.   Azotat de argint amoniacal
   Peste o soluție apoasă de azotat de argint 5 % (m/v) (3.15) se adaugă soluție de amoniac 25 % (3.4), până la dizolvarea precipitatului. Acest reactiv trebuie preparat imediat înainte de folosire.
   Reactivul nu se păstrează.
   4.   APARATURĂ
   Echipament de laborator obișnuit pentru cromatografie în strat subțire.
   4.1.1.   Capac de plastic sau sticlă astfel construit, încât placa cromatografică să fie înconjurată de azot în timpul apariției petelor și uscării. Această precauție este necesară din cauza susceptibilității la oxidare a anumitor coloranți.
   4.1.2.   Microseringă de 10 μl, gradată cu diviziuni de 0,2 μl, cu ac cu secțiune pătrată, sau, mai bine, un distribuitor cu repetiție de 50 μl, montat pe un stativ cu clemă, astfel încât placa să fie menținută sub azot.
   4.1.3.   Plăci cu silicagel pentru cromatografie în strat subțire, gata preparate, de 0,25 mm grosime, format 20 × 20 cm (Macherey și Nagel, Silica G-HR, care au suport de plastic, sau echivalente).
   4.2.   Centrifugă, 4 000 rotații/minut.
   4.3.   Eprubete de centrifugă de 10 ml, cu capace filetate căptușite cu PTFE sau echivalent.
   5.   PROCEDURĂ
   5.1.   Tratarea probelor
   Se îndepărtează primii 2 sau 3 cm din crema scoasă din tub.
   Se pun într-o eprubetă de centrifugă (4.3), suflată în prealabil cu azot, următoarele: 300 mg acid ascorbic cu 3 g cremă ori 3 g lichid omogenizat.
   Se adaugă cu picătura amoniac 25 % (3.4) până la pH 10. Se adaugă până la 10 ml etanol 96 % (3.3).
   Se omogenizează sub azot (3.8), se pune capacul și apoi se centrifughează (la 4 000 rotații/min) timp de 10 minute.
   Se folosește lichidul supernatant.
   5.2.   Cromatografie
   5.2.1.   Punctarea plăcilor
   Sub atmosferă de azot (3.8), se aplică pe o placă cromatografică (4.1.3) 1 μl din fiecare dintre soluțiile de referință descrise mai sus pe 9 puncte situate la aproximativ 1,5 cm unul de celălalt, de-a lungul unei linii situate la aproximativ 1,5 cm de muchia plăcii.
   Aceste pete de soluție de referință sunt dispuse după cum urmează:

               1

               2

               3

               4

               5

               6

               7

               8

               9

               R

               P

               H

               PPD

               DAP

               PTD

               OPD

               OTD

               MPD

               MTD

               α-n

         În plus, la punctele 10 și 11 se aplică câte 2 μl din soluția de probă obținută conform secțiunii 5.1.
   Se menține placa sub azot (3.8) până în momentul în care este cromatografiată.
   5.2.2.   Developare
   Se pune placa într-un tanc în prealabil suflat cu azot (3.8), saturat cu unul dintre cei patru solvenți (3.22), și se lasă la developat la temperatura camerei (20 până la 25 °C), în întuneric, până când frontul de solvent migrează aproximativ 15 cm față de linia de bază.
   Se îndepărtează placa și se usucă sub azot (3.8) la temperatura camerei.
   5.2.3.   Pulverizare
   Se pulverizează placa imediat cu una dintre cele patru soluții specificate la punctul 3.23.
   5.2.4.   Identificare
   Se compară valoarea Rf și culoarea obținută pentru probă cu acelea ale substanțelor de referință cromatografiate.
   Tabelul I exemplifică valorile Rf și culorile pentru fiecare substanță, în funcție de solvent și de indicatorul folosit.
   În cazul unei identificări incerte, confirmarea poate fi uneori realizată printr-o metodă de fixare, adăugând la extractul de probă soluția de substanță de referință corespunzătoare.
   5.2.5.   Estimare semicantitativă
   Se compară vizual intensitatea petelor pentru fiecare substanță identificată la 5.2.4. cu un șir adecvat de concentrații ale substanțelor de referință.
   În cazul în care concentrația uneia sau a mai multor substanțe găsite în probă este excesivă, se diluează extractul de probă și se repetă măsurarea.
   TABELUL I
   Valori Rf și culorile obținute imediat după pulverizare

               Substanțe dereferință
               (3.20)

               Solvenți de developare

               Spray-uri indicatoare

               Valori Rf

               Culori rezultate

               (3.22.1)

               (3.22.2)

               (3.22.3)

               (3.22.4)

               Diazo
               (3.23.1)

               Ehrlich
               (3.23.2)

               Dimetilfenol
               (3.23.3)

               AgNO
               (3.23.4)

               OPD

               0,62

               0,60

               0,30

               0,57

               maro pal

               -

               -

               maro pal

               MPD

               0,40

               0,60

               0,47

               0,48

               maro-violet (*)

               galben

               maro pal

               maro pal

               PPD

               0,20

               0,50

               0,30

               0,48

               maro

               roșu aprins (*)

               violet

               gri

               OTD

               0,60

               0,60

               0,53

               0,60

               maro (*)

               portocaliu pal

               maro pal

               maro cenușiu

               MTD

               0,40

               0,67

               0,45

               0,60

               maro roșiatic (*)

               galben

               maro

               negru

               PTD

               0,33

               0,65

               0,37

               0,70

               maro

               portocaliu

               violet (*)

               gri

               DAP

               0,07

               -

               0

               0,05

               maro(*)

               portocaliu

               violet

               maro

               H

               0,50

               0,35

               0,80

               0,20

               -

               portocaliu

               violet

               negru (*)

               α-N

               0,90

               0,80

               0,90

               0,75

               maro-portocaliu

               -

               violet (*)

               negru

               P

               0,37

               -

               0,67

               0,05

               maro

               violet foarte pal

               maro foarte pal

               maro (*)

               R

               0,50

               0,37

               0,80

               0,17

               portocaliu (*)

               violet pal

               maro foarte pal

               maro pal

                           1.

                           OPD este indicat numai slab; solventul (3.22.3) trebuie să fie folosit pentru a-l separa clar de OTD.

                           2.

                           (*) Indică developarea celei mai bune culori.

         6.   EXAMINARE PRIN CROMATOGRAFIE BIDIMENSIONALĂ ÎN STRAT SUBȚIRE
   Acest procedeu bidimensional de cromatografie în strat subțire necesită folosirea unor standarde și reactivi suplimentari.
   6.1.   Substanțe și soluții de referință suplimentare
   6.1.1.   β-naftol (β-N)
   6.1.2.   2-aminofenol (OAP)
   6.1.3.   3-aminofenol (MAP)
   6.1.4.   4-aminofenol (PAP)
   6.1.5.   2-nitro-1,4-fenilendiamină (2-NPPD)
   6.1.6.   4-nitro-1,2-fenilendiamină (4-NOPD)
   Se prepară câte o soluție 0,5 % (m/v) din fiecare substanță de referință suplimentară, conform descrierii de la punctul 3.21.
   6.2.   Solvent de developare suplimentar
   6.2.1.   Acetat de etil – ciclohexan – soluție de amoniac 25 % (raport volumetric 65:30:0,5)
   6.3.   Sistem de indicație suplimentar
   Se pune un vas de sticlă într-un tanc de developare pentru cromatografie în strat subțire, se adaugă aproximativ 2 g iod cristalizat și se acoperă vasul cu un capac potrivit.
   6.4.   Cromatografie
   6.4.1.   Se desenează două linii, așa cum se arată în figura 1, pe suprafața absorbantă a unei plăci în strat subțire (4.1.3).
   6.4.2.   Sub atmosferă de azot (4.1.1), se pun 1 până la 4 μl extract (5.1) la punctul de bază 1 (figura 1), care este la 2 cm față de cele două laturi. Cantitatea de extract depinde de intensitatea petelor de pe cromatogramele 5.2.
   6.4.3.   Coloranții de oxidare identificați sau presupuși a fi identificați la 5.2 se împart între punctele 2 și 3 (figura 1); distanța între puncte este de 1,5 cm. Se pun 2 μl din fiecare soluție de referință – cu excepția DAP, din care trebuie puși 6 μl. Se operează în atmosferă de azot (6.4.2).
   6.4.4.   Se repetă operația de la 6.4.3. la punctele de bază 4 și 5 (figura 1) și se păstrează placa sub atmosferă de azot până în momentul în care este cromatografiată (distanța între puncte 1,5 cm).
   6.4.5.   Se suflă cu azot (3.8) tancul cromatografic și se pune în acesta o cantitate adecvată de solvent de developare 3.22.2. Se pune placa (6.4.4) în tanc și se developează în prima direcție de eluție (figura 1), la întuneric.
   Se eluează până când frontul de solvent atinge linia marcată pe placă (aproximativ 13 cm).
   6.4.6.   Se scoate placa din tanc și se plasează în tancul cromatografic în prealabil suflat cu azot pentru evaporarea solventului de eluție pentru cel puțin 60 de minute.
   6.4.7.   Cu o eprubetă gradată, se pune o cantitate adecvată de solvent de eluție (6.2) într-un tanc suflat cu azot (3.8), se pune placa rotită cu 90o în tanc (6.4.6) și se cromatografiază în a doua direcție (de asemenea în întuneric), până când frontul de solvent atinge linia desenată pe suprafața absorbantă. Se scoate placa din tanc și se evaporă solventul de eluție în aer.
   6.4.8.   Se pune placa pentru 10 minute în tancul cromatografic cu vapori de iod (6.3) și se interpretează cromatograma bidimensională folosind valorile Rf și valorile culorilor pentru substanțele de referință cromatografiate în același timp (tabelul II este un ghid al valorilor Rf și al culorilor).

      Notă Pentru a obține colorarea maximă a petelor, se lasă cromatograma expusă în atmosferă timp de 30 de minute după developare.
   6.4.9.   Prezența coloranților de oxidare găsiți la 6.4.8 poate fi confirmată definitiv prin repetarea operațiilor descrise de la 6.4.1 la 6.4.8 și adăugând la punctul de bază 1 în vârful cantității de extract specificate la 6.4.2 1 μl din substanțele de referință identificate la 6.4.8. Dacă nu se găsește nici un alt punct în comparație cu cromatograma obținută la 6.4.8, interpretarea cromatogramei 6.4.8 este corectă.
   TABEL II
   Culoarea substanțelor de referință după cromatografiere șidevelopare cu vapori de iod

               Substanțe de referință

               Culoare după developare cu vapori de iod

               R

               bej

               P

               maro

               α-n

               violet

               β-n

               maro pal

               H

               maro-violet

               MPD

               maro gălbui

               PPD

               maro-violet

               MTD

               maro închis

               PTD

               maro gălbui

               DAP

               maro închis

               OAP

               portocaliu

               MAP

               maro gălbui

               PAP

               maro-violet

               2-NPPD

               maro

               4-NOPD

               portocaliu

         Figura 1

   III.   IDENTIFICAREA ȘI DETERMINAREA AZOTITULUI
   A.   IDENTIFICARE
   1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE
   Prezenta metodă este adecvată pentru identificarea azotitului în produsele cosmetice, în special în creme și paste.
   2.   PRINCIPIU
   Prezența azotitului este indicată prin formarea de derivați colorați cu 2-aminobenzaldehidă fenilhidrazonă (Nitrin®).
   3.   REACTIVI
   Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.
   3.1.   Acid sulfuric diluat: se diluează 2 ml acid sulfuric concentratcu 11 ml apă distilată.
   3.2.   Acid clorhidric diluat: se diluează 1 ml acid clorhidric concentratcu 11 ml apă distilată.
   3.3.   Metanol
   3.4.   O soluție de 2-aminobenzaldehidă fenilhidrazonă (reactiv Nitrin®) în metanol.
   Se cântăresc 2,0 g de Nitrin® și se transferă cantitativ într-un balon cotat de 100 ml. Se adaugă cu picătura 4 ml acid clorhidric diluat (3.2) și se amestecă. Se umple până la semn cu metanol și se amestecă până când soluția devine complet limpede. Se depozitează soluția într-un flacon din sticlă brună (4.3).
   4.   APARATURĂ
   4.1.   Pahare de laborator de 50 ml
   4.2.   Balon cotat de 100 ml
   4.3.   Flacon din sticlă brună de 125 ml
   4.4.   Sticlă de ceas de 10 × 10 cm
   4.5.   Spatule de plastic
   4.6.   Hârtie de filtru de 10 × 10 cm
   5.   PROCEDURĂ
   5.1.   Se întinde uniform o parte din probă pe sticla de ceas (4.4), stratul ce acoperă suprafața nedepășind 1 cm.
   5.2.   Se îmbibă hârtia de filtru (4.6) cu apă distilată. Se așază peste probă și se presează hârtia de filtru cu spatula de plastic (4.5).
   5.3.   Se lasă un minut și se aplică pe centrul hârtiei de filtru:

               —

               două picături de acid sulfuric diluat (3.1),

               —

               urmate de 2 picături soluție de Nitrin® (3.4).

         5.4.   După 5 până la 10 secunde, se îndepărtează hârtia de filtru și se examinează la lumină naturală. Prezența azotitului este indicată prin colorarea în roșu purpuriu.
   Dacă conținutul de azotit este scăzut, colorația roșu purpuriu devine galbenă după 5 până la 15 secunde. Această schimbare de culoare are loc numai după 1-2 minute, atunci când azotitul este prezent în cantitate mare.
   6.   OBSERVAȚIE
   Intensitatea culorii roșu purpuriu și durata de timp înainte de modificarea în galben poate da o indicație asupra conținutului de azotit în amestec.
   B.   DETERMINARE
   1.   DOMENIU DE APLICARE
   Metoda descrie determinarea azotitului în produsele cosmetice.
   2.   DEFINIȚIE
   Conținutul de azotit în probă, determinat conform acestei metode, este exprimat în procente (%) masice de azotit de sodiu.
   3.   PRINCIPIU
   După diluarea probei în apă și limpezire, azotitul prezent este făcut să reacționeze cu sulfonilamidă și N-1-naftiletilendiamină și se măsoară densitatea optică a culorii obținute, la 538 nm.
   4.   REACTIVI
   Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.
   Reactivi de limpezire: acești reactivi nu pot fi folosiți după mai mult de o săptămână de la preparare.
   4.1.1.   Reactiv Carrez I:
   Se dizolvă 106 g cianoferat de potasiu, (II) K4Fe(CN)6·3H2O, în apă distilată și se diluează cu apă până la 1 000 ml.
   4.1.2.   Reactiv Carrez II:
   Se dizolvă 299,5 g acetat de zinc, Zn (CH3COO)2·2H2O și 30 ml acid acetic glacial în apă distilată și apoi se diluează cu apă până la 1 000 ml.
   4.2.   Soluție de azotit de sodiu:
   Într-un balon cotat de 1 000 ml se dizolvă 0,500 g azotit de sodiu în apă distilată și se diluează cu apă până la semn. Se diluează 10,0 ml din această soluție standard stoc până la 500 ml; 1 ml din această ultimă soluție = 10 micrograme de NaNO2.
   4.3.   Soluție de hidroxid de sodiu 1 n
   4.4.   Soluție de hidroclorură de sulfanilamidă 0,2 %
   Se dizolvă 2,0 g sulfanilamidă în 800 ml apă la cald. Se răcește și se adaugă 100 ml acid clorhidric concentrat, agitându-se în acest timp. Se adaugă apă până la 1 000 ml.
   4.5.   Acid clorhidric 5 n
   4.6.   Reactiv N-1-naftil:
   Această soluție trebuie preparată în ziua în care se folosește. Se dizolvă 0,1 g dihidroclorură de N-1- naftiletilendiamină în apă și se diluează cu apă până la 100 ml.
   5.   APARATURĂ
   5.1.   Balanță analitică
   5.2.   Baloane cotate de 100, 250, 500 și 1 000 ml
   5.3.   Pipete gradate sau de gaze
   5.4.   Cilindri gradați de 100 ml
   5.5.   Hârtie de filtru cutată, fără azotit, diametru 15 cm
   5.6.   Baie de apă
   5.7.   Spectrofotometru cu cuvă optică de lungime de cale 1 cm
   5.8.   pH-metru
   5.9.   Microbiuretă de 10 ml
   5.10.   Pahare de laborator de 250 ml.
   6.   PROCEDURĂ
   6.1.   Se cântăresc, cu o precizie de 0,1 mg, aproximativ 0,5 g (m grame) din proba omogenizată; se transferă cantitativ cu apă distilată fierbinte într-un pahar de 250 ml (5.10) și se completează cu apă distilată fierbinte până la 150 ml. Se pune paharul (5.10) în baia de apă (5.6) la 80 °C pentru o jumătate de oră. În această perioadă, conținutul se agită din când în când.
   6.2.   Se răcește la temperatura camerei și se adaugă succesiv, sub agitare, 2 ml reactiv Carrez I (4.1.1) și 2 ml reactiv Carrez II (4.1.2).
   6.3.   Se adaugă soluție de hidroxid de sodiu 1 n (4.3) pentru a aduce pH-ul la 8,3 (se folosește pH-metrul (5.8)]. Se transferă cantitativ conținutul într-un balon cotat de 250 ml (5.2) și se aduce la semn cu apă distilată.
   6.4.   Se amestecă conținutul și se filtrează prin hârtie de filtru cutată (5.5).
   6.5.   Se pipetează (5.3) într-un balon cotat de 100 ml (5.2) o porțiune adecvată (V ml) de filtrat limpede, dar nu mai mult de 25 ml, și se adaugă apă distilată până la un volum de 60 ml.
   6.6.   După amestecare, se adaugă 10,0 ml soluție hidroclorură de sulfanilamidă (4.4) și 6,0 ml de acid clorhidric 5 n (4.5). Se amestecă și se lasă să stea 5 minute. Se adaugă 2,0 ml reactiv N-1-naftil (4.6), se amestecă și se lasă să stea 3 minute. Se diluează cu apă până la semn și se amestecă.
   6.7.   Se prepară probă-martor prin repetarea operațiilor 6.5 și 6.6 fără adăugarea reactivului N-1-naftil (4.6).
   6.8.   Se măsoară (5.7) densitatea optică la 538 nm a soluției obținute la 6.6 folosind soluția-martor (6.7) ca referință.
   6.9.   Se citește de pe graficul de etalonare (6.10) conținutul de azotit de sodiu în micrograme per 100 ml de soluție (m1 micrograme) care corespunde densității optice măsurate la punctul 6.8.
   6.10.   Folosind 10 μg per ml soluție azotit de sodiu (4.2), se realizează un grafic de etalonare pentru concentrațiile 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg de azotit de sodiu per 100 ml.
   7.   CALCUL
   Se calculează conținutului de azotit de sodiu din probă, în procente masice, folosind următoarea formulă:
   în care:

               m

               =

               masa probei analizate, în grame, (6.1),

               m1

               =

               conținutul de azotit de sodiu determinat la 6.9, în micrograme,

               V

               =

               numărul de mililitri de filtrat folosit pentru măsurare (6.5).

         8.   REPETABILITATE (1)

   Pentru un conținut de aproximativ 0,2 % m/m azotit de sodiu, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel pe aceeași probă nu trebuie să depășească o valoare absolută de 0,005 %.
   IV.   IDENTIFICAREA ȘI DETERMINAREA FORMALDEHIDEI LIBERE
   1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE
   Prezenta metodă descrie identificarea și determinarea formaldehidei libere. Ea este aplicabilă tuturor produselor cosmetice și cuprinde trei părți:
   1.1.   Identificare
   1.2.   Determinarea colorimetrică cu pentan-2,4-dionă
   Prezenta metodă este inadecvată atunci când formaldehida se află în combinație sau este polimerizată, ca în cazul donorilor de formaldehidă. Dacă rezultatul depășește concentrația maximă admisă, trebuie să se folosească metoda care urmează.
   1.3.   Determinarea cu bisulfit
   În majoritatea compușilor combinați sau polimerici, formaldehida nu este luată în considerare cu această metodă. Totuși, anumite combinații instabile (hexametilen tetramină, de exemplu) sunt determinate. În plus, măsurarea alcalinității este dificilă în prezența unei soluții tampon.
   2.   DEFINIȚIE
   Conținutul de formaldehidă liberă din probă, determinat conform acestei metode, este exprimat în procente masice.
   3.   PRINCIPIU
   3.1.   Partea I – Identificare
   Într-un mediu de acid sulfuric, formaldehida virează reactivul Schiff în roz sau mov.
   3.2.   Partea II – Determinarea cu pentan-2,4-dionă
   Formaldehida reacționează cu pentan-2,4-dionă în prezența acetatului de amoniu și formează 3,5-diacetil-1,4-dihidrolutidină. Aceasta se extrage cu 1-butanol și se măsoară absorbanța extractului la 410 nm.
   3.3.   Partea III – Determinarea cu bisulfit
   Formaldehida reacționează cu sulfitul într-un mediu acid la 0 °C și formează un compus de adiție. Protonii în exces se titrează cu hidroxid de sodiu. Protonii consumați formează baza de calcul pentru determinarea cantitativă a formaldehidei. Un test-martor fără bisulfit permite măsurarea alcalinității sau acidității mediului.
   4.   REACTIVI
   Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.
   4.1.   Acid acetic glacial
   4.2.   Acetat de amoniu anhidru
   4.3.   1-butanol
   4.4.   Acid sulfuric, aproximativ 2 n
   4.5.   Soluție proaspătă de sulfit de sodiu 0,1 m
   4.6.   Reactiv Schiff: într-un pahar se cântăresc 100 mg fucsină și se dizolvă cu 75 ml apă la 80 °C.
   După răcire, se adaugă 2,5 g sulfit de sodiu heptahidratat (Na2SO3·7H2O) și 1,5 ml acid clorhidric concentrat. Se aduce la 100 ml.
   (Acest reactiv nu mai poate fi utilizat după două săptămâni).
   4.7.   Reactiv pentan-2,4-dionă
   Într-un balon cotat de 1 000 ml se dizolvă:

               150 g

               acetat de amoniu (4.2),

               2 ml

               pentan-2,4-dionă (proaspăt distilată la presiune redusă – nu trebuie să manifeste nici o absorbție la 410 nm),

               3 ml

               acid acetic glacial (4.1).

         Se aduce la 1 000 ml cu apă (pH-ul soluției: aproximativ 6,4).
   Acest reactiv trebuie să fie proaspăt preparat.
   4.8.   Soluție de acid sulfuric standard 0,1 n
   4.9.   Soluție hidroxid de sodiu standard 0,1 n
   4.10.   Soluție de iod 0,1 n
   4.11.   Tiosulfat de sodiu 0,1 n
   4.12.   Soluție stoc de formaldehidă
   Se toarnă 5 g soluție de formaldehidă 37 până la 40 % într-un balon cotat de 1 000 ml și se aduce la semn.
   Se determină concentrația acestei soluții astfel: se îndepărtează 10,00 ml; se adaugă 25,00 ml soluție de iod 0,1 n (4.10) și 10 ml soluție hidroxid de sodiu 1 n.
   Se lasă să stea 5 minute.
   Se adaugă 11 ml HCl 1 n și se titrează excesul de soluție standard de iod 0,1 n (4.10) cu soluție de tiosulfat de sodiu 0,1 n, folosind ca indicator soluție de amidon.
   1 ml soluție de iod 0,1 n (4.10) este echivalent cu 1,5 mg formaldehidă.
   4.13.   Soluție etalon de formaldehidă
   Se pipetează 5,00 ml soluție stoc într-un balon gradat de 100 ml și se aduce la semn cu apă demineralizată.
   Se pipeteaază 5,00 ml de soluție de mai sus într-un balon gradat de 500 ml și se aduce la semn cu apa demineralizată.
   1 ml din această soluție conține aproximativ 1 μg formaldehidă.
   Se calculează conținutul exact.
   4.14.   Soluție timolftaleină, 0,1 g/100 ml de etanol 50 %
   4.15.   Soluție reactiv de referință: la fel ca reactivul 4.7, dar fără pentan-2,4-dionă.
   5.   APARATURĂ
   5.1.   Aparatură standard de laborator
   5.2.   Filtru pentru separarea fazelor, Whatman 1 PS (sau echivalent)
   5.3.   Centrifugă
   5.4.   Spectrofotometru
   5.5.   Cuve de sticlă cu lungime optică de 1 cm
   5.6.   Potențiometru cu înregistrator grafic
   5.7.   Electrozi de sticlă/calomel (se recomandă folosirea unor electrozi speciali de joasă temperatură).
   6.   PROCEDURĂ
   6.1.   Identificare
   6.1.1.   Într-un pahar de 10 ml se cântăresc 2 g din proba testată.
   6.1.2.   Se adaugă două picături de acid sulfuric 2 n (4.4) și 2 ml reactiv Schiff (4.6) (acest reactiv trebuie să fie absolut incolor în momentul utilizării.).
   Se agită și se lasă să stea 5 minute.
   6.1.3.   Dacă în intervalul de 5 minute soluția devine roz sau mov, atunci formaldehida este prezentă în exces de 0,01 % și se determină prin procedeul 6.2 și, dacă este necesar, prin 6.3.
   6.2.   Determinarea prin colorimetrie cu pentan-2,4-dionă
   6.2.1.   Soluție de probă
   6.2.1.1.   Într-un balon cotat de 100 ml se cântărește, cu o precizie de 0,001 g, o cantitate (m grame) din proba testată, corespunzând unei cantități presupuse de formaldehidă de aproximativ 150 micrograme.
   6.2.1.2.   Se aduce la 100 ml cu apă demineralizată și se amestecă.
   6.2.1.3.   Într-un pahar Erlenmeyer de 50 ml se pun:

               10,00 ml soluție de la 6.2.1.2,

               5,00 ml reactiv pentan-2,4-dionă (4.7),

               apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

         6.2.2.   Soluție de referință
   Posibila interferență a culorilor datorată culorii de fundal în proba de testare se elimină prin folosirea acestei soluții de referință.
   Într-un flacon Erlenmeyer de 50 ml se pun:

               10,00 ml soluție de la 6.2.1.2,

               5,00 ml soluție reactiv de referință (4.15),

               apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

         6.2.3.   Soluție-martor
   Într-un pahar Erlenmeyer de 50 ml se pun:

               5,00 ml reactiv pentan-2,4-dionă (4.7),

               apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

         6.2.4.   Determinare
   6.2.4.1.   Se agită paharele de la 6.2.1.3, 6.2.2 și 6.2.3 și se introduc într-o baie de apă la 60 °C pentru exact 10 minute. Se lasă la răcit timp de 2 minute într-o baie de apă cu gheață.
   6.2.4.2.   Se transferă în pâlnii de separare de 50 ml conținând 10,0 ml 1-butanol. Se clătește fiecare balon cu 3 până la 5 ml apă și se adaugă și apele de limpezire în pâlnii. Se agită puternic acest amestec exact 30 secunde. Se lasă să se separe.
   6.2.4.3.   Se filtrează prin filtrul de separare a fazelor în cuvele de măsurare. Centrifugarea (5 000 rotații/min, timp de 5 minute) este mai puțin practică și durează mai mult.
   6.2.4.4.   Se măsoară densitatea optică A1 a extractului soluției probă 6.2.1.3 la 410 nm față de extractul soluției de referință 6.2.2.
   6.2.4.5.   Se măsoară similar extractul de soluție-martor de la 6.2.3 față de 1-butanol (A2)
   Atenție:
   Toate aceste operații trebuie efectuate într-un interval de timp de 25 de minute din momentul introducerii paharelor Erlenmeyer în baia de apă la 60 °C.
   6.2.5.   Curba de etalonare
   6.2.5.1.   Într-un pahar Erlenmeyer de 50 ml se pun:

               5,00 ml soluție standard (4.13),

               5,00 ml reactiv pentan-2,4-dionă (4.7),

               apă demineralizată până la un volum final de 30 ml.

         6.2.5.2.   Se continuă conform descrierii din secțiunea 6.2.4.5, se măsoară densitatea optică față de 1-butanol (4.3).
   6.2.5.3.   Se repetă procedura cu 10, 15, 20 și 25 ml soluție standard.
   6.2.5.4.   Pentru a obține valoarea zero se procedează ca la 6.2.4.5.
   6.2.5.5.   Se construiește curba de etalonare după scăderea valorii zero (6.2.4.5) din fiecare dintre densitățile optice obținute la 6.2.5.2 și 6.2.5.3. Legea lui Beers este valabilă până la o valoare de 30 μg de formaldehidă.
   6.3.   Determinare cu bisulfit
   6.3.1.   Prepararea probei testate
   6.3.1.1.   Pentru test
   Într-un pahar tarat se cântărește, cu o precizie de 0,001 g, o cantitate din proba testată (m grame) corespunzând unei cantități presupuse de formaldehidă între 3 și 20 mg.
   6.3.1.2.   Pentru testul de referință
   În mod similar, se cântărește o probă de referință (m grame).
   6.3.2.   Determinare
   6.3.2.1.   Într-un pahar de 100 ml se introduc 50 ml sulfit de sodiu 0,1 n (4.5) și se adaugă 10,00 ml acid sulfuric 0,1 n (4.8). Se agită.
   6.3.2.2.   Se introduce paharul într-un amestec de gheață cu sare cu scopul menținerii unei temperaturi de + 2 °C. Se toarnă în proba testată 6.3.1.1.
   6.3.2.3.   Se titrează rapid potențiometric cu hidroxid de sodiu 0,1 n (4.9), se agită continuu și se menține temperatura între + 2 și + 4 °C (punctul neutru se găsește între pH 9 și 11). Fie V1 volumul de hidroxid de sodiu 0,1 n (4.9) necesar pentru această titrare.
   6.3.3.   Test-martor
   Se titrează o soluție preparată în plus ca la 6.3.2.1 în condițiile descrise la 6.3.2.
   Fie V2 volumul de hidroxid de sodiu 0,1 n necesar pentru această titrare.
   6.3.4.   Test de referință
   Se determină aciditatea sau alcalinitatea probei prin titrare potențiometrică cu hidroxid de sodiu de 0,1 n (4.9) sau acid sulfuric 0,1 n (4.8) în proba testată de masă m′. Fie v′ volumul de hidroxid de sodiu 0,1 n sau de acid sulfuric 0,1 n necesar pentru această titrare.
   6.3.5.   Observații
   Este importantă respectarea strictă a condițiilor de testare.
   Este posibilă efectuarea determinării în prezența timolftaleinei (4.14) ca indicator.
   7.   PREZENTAREA REZULTATELOR
   7.1.   Calculul pentru metoda colorimetrică
   7.1.1.   Se scade A2 din A1 și se citește de pe curba de etalonare (6.2.5.5) cantitatea C, în micrograme, de formaldehidă în soluția testată (6.2.1.3).
   7.1.2.   Se calculează conținutul de formaldehidă din probă ca procente masice (% m/m) cu ajutorul formulei:

   7.2.   Calculul pentru metoda titrării cu bisulfit
   Se raportează volumul de hidroxid de sodiu 0,1 n (4.9) sau de acid sulfuric 0,1 n (4.8) luat în testul de referință la masa m:

   Pentru un produs neutru, v este, bineînțeles, zero.
   7.2.1.   În cazul unui produs acid:

   7.2.2.   În cazul unui produs alcalin:

   7.3.   Observație
   Dacă rezultatele celor două metode diferă, trebuie luată în considerare numai cifra mai mică.
   8.   REPETABILITATE (1)

   Pentru un conținut de formaldehidă de 0,2 %, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel pe aceeași probă nu trebuie să depășească 0,005 % pentru metoda colorimetrică și 0,05 % pentru titrarea cu bisulfit.
   V.   DETERMINAREA REZORCINOLULUI ÎN ȘAMPOANE ȘI LOȚIUNI PENTRU PĂR
   1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE
   Prezenta metodă stabilește determinarea prin cromatografie de gaze a rezorcinolului în șampoane și loțiuni de păr. Metoda este adecvată pentru concentrații în probă de la 0,1 la 2,0 % procente masice.
   2.   DEFINIȚIE
   Conținutul de rezorcinol din probă determinat conform acestei metode este exprimat în procente masice.
   3.   PRINCIPIU
   Rezorcinolul și 3,5-dihidroxitoluenul, (5-metilrezorcinol) adăugat ca standard intern, sunt separate din probă prin cromatografie în strat subțire. Amândoi componenții sunt izolați prin decuparea petelor lor de pe placa de strat subțire și extragere cu metanol. În final, compuși extrași sunt uscați, sililați și determinați prin cromatografie de gaze.
   4.   REACTIVI
   Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.
   4.1.   Acid clorhidric 25 % (m/m)
   4.2.   Metanol
   4.3.   Etanol 96 % (v/v)
   4.4.   Folii cu silicagel pentru cromatografie în strat subțire gata preparate (plastic sau aluminiu) cu indicator fluorescent. Se dezactivează după cum urmează: se pulverizează cu apă foliile acoperite în prealabil cu silice, până se glazurează. Se lasă plăcile pulverizate să se usuce în aer la temperatura camerei pentru una până la trei ore.
   Notă:
   Dacă plăcile nu sunt dezactivate, se pot produce pierderi de rezorcinol prin adsorbția ireversibilă pe silice.
   4.5.   Solvent de developare; acetonă – cloroform – acid acetic (raport volumetric 20:75:5)
   4.6.   Soluție standard de rezorcinol; se dizolvă 400 mg rezorcinol în 100 ml etanol 96 % (4.3) (1 ml corespunde la 4 000 μg rezorcinol).
   4.7.   Soluția standard intern: se dizolvă 400 mg 3,5-dihidroxitoluen (DHT) în 100 ml etanol 96 % (4.3) (1 ml corespunde la 4 000 μg DHT).
   4.8.   Amestec standard: într-un balon cotat de 100 ml se amestecă 10 ml soluție 4.6 și 10 ml soluție 4.7, se aduce la semn cu etanol 96 % (4.3) și se amestecă (1 ml corespunde la 400 μg rezorcinol și 400 μg DHT).
   Agenți de sililare
   4.9.1.   N, O-bi(trimetilsilil) trifluoroacetamidă (BSTFA)
   4.9.2.   Hexametildisilazan (HMDS)
   4.9.3.   Trimetilclorosilan (TMCS)
   5.   APARATURĂ
   5.1.   Echipament uzual pentru cromatografia în strat subțire și cromatografia de gaze
   5.2.   Sticlărie de laborator
   6.   PROCEDURĂ
   6.1.   Pregătirea probei
   6.1.1.   Într-un pahar de 150 ml se cântărește cu precizie probă din produs (m grame) care conține aproximativ 20 până la 50 mg rezorcinol.
   6.1.2.   Se acidifiază cu acid clorhidric (4.1) până când amestecul devine acid (este nevoie de aproximativ 2 până la 4 ml), se adaugă 10 ml (40 mg DHT) soluție standard intern (4.7) și se amestecă. Se transferă cu etanol (4.3) într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn cu etanol și se amestecă.
   6.1.3.   Se aplică 250 μl soluție (6.1.2) pe o folie de silice dezactivată (4.4) sub formă de linie continuă de aproximativ 8 cm lungime. Linia trebuie să fie cât se poate de subțire.
   6.1.4.   Se aplică 250 μl amestec standard (4.8) pe aceeași placă și în același mod (6.1.3).
   6.1.5.   Se picură pe două puncte de pe linia de pornire câte 5 μl din fiecare dintre soluțiile 4.6 și 4.7 pentru a ajuta la localizare după developarea plăcii.
   6.1.6.   Se developează placa într-un tanc necăptușit (nesaturat) umplut cu solvent de developare 4.5 până când frontul de solvent atinge 12 cm de la linia de pornire; de obicei aceasta durează 45 de minute. Se usucă placa în aer și se localizează zona de rezorcinol/DHT sub lumină UV (254 nm). Cei doi componenți au aproximativ aceleași valori Rf. Se marchează benzile cu creionul la 2 mm distanță de marginea întunecată exterioară a benzilor. Se îndepărtează aceste zone și se colectează adsorbantul fiecărei benzi într-un flacon de 10 ml.
   6.1.7.   Se extrag adsorbantul conținând proba și cel ce conține amestecul standard, fiecare în modul următor:
   Se adaugă 2 ml metanol (4.2) și se extrage timp de o oră sub agitare continuă. Se filtrează amestecul și se repetă extracția timp de alte 15 minute cu 2 ml metanol.
   6.1.8.   Se combină extractele și se evaporă solventul prin uscare peste noapte într-un exicator cu vid umplut cu desicant adecvat. Nu se încălzește deloc.
   Se sililează reziduurile (6.1.8) conform 6.1.9.1 sau 6.1.9.2.
   6.1.9.1.   Cu o microseringă se adaugă peste amestec 200 μl BSTFA (4.9.1) și se lasă 12 ore într-un vas închis, la temperatura camerei.
   6.1.9.2.   Cu o microseringă se adaugă 200 μl HMDS (4.9.2) și 100 μl TMCS (4.9.3) și se încălzește amestecul timp de 30 de minute la 60 °C într-un vas închis. Se răcește amestecul.
   6.2.   Cromatografie de gaze
   6.2.1.   Condiții de cromatografiere
   Coloana trebuie să realizeze o rezoluție, R, egală sau mai bună decât 1,5, unde:

   în care:

               r1 și r2

               =

               timpii de retenție pentru două vârfuri, în minute,

               w1 și w2

               =

               lățimea acelorași vârfuri la jumătatea înălțimii, în mm,

               d

               =

               viteza graficului, în mm pe minut.

         S-au găsit adecvate următoarele condiții pentru cromatografia de gaze și pentru coloană:

               Coloană

               material:

               oțel inoxidabil

               lungime:

               200 cm

               diametrul intern:

               ~ 3 mm

               umplutură:

               10 % OV-17 pe Chromosorb WAW, ochiuri 100-200

               Detector cu ionizare cu flacără

               Temperaturi:

               coloană:

               185 °C (izotermă)

               detector:

               250 °C

               injector:

               250 °C

               Gaz purtător:

               azot

               debit:

               45 ml/min

         Pentru reglările debitelor de hidrogen și aer se urmează instrucțiunile fabricantului.
   6.2.2.   Se injectează 1până la 3 μl din soluțiile obținute la 6.1.9 în cromatograful de gaze. Se efectuează 5 injectări pentru fiecare soluție (6.1.9), se măsoară ariile vârfurilor, se face media acestora și se calculează raportul ariilor vârfurilor: S = aria vârfului pentru rezorcinol/aria vârfului pentru DHT.
   7.   CALCUL
   Concentrația de rezorcinol din probă, exprimată în procente de masă (% m/m), este dată de:

   în care:

               M

               =

               masa probei analizate, în grame (6.1.1),

               S probă

               =

               raportul mediu al ariilor vârfurilor, conform 6.2.2, pentru probă,

               S amestec standard

               =

               raportul mediu al ariilor vârfurilor, conform 6.2.2, pentru amestecul standard.

         8.   REPETABILITATE (1)

   Pentru un conținut de rezorcinol de aproximativ 0,5 %, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel pe aceeași probă nu trebuie să depășească o valoare absolută de 0,025 %.
   VI.   DETERMINAREA METANOLULUI FAȚĂ DE ETANOL SAU 2-PROPANOL
   1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE
   Prezenta metodă descrie analiza prin cromatografie de gaze a metanolului în toate tipurile de produse cosmetice (inclusiv aerosoli).
   Pot fi determinate niveluri relative de la 0 până la 10 %.
   2.   DEFINIȚIE
   Conținutul de metanol determinat conform acestei metode este exprimat în procente masice de metanol față de etanol sau 2-propanol.
   3.   PRINCIPIU
   Determinarea se realizează prin cromatografie de gaze.
   4.   REACTIVI
   Toți reactivii trebuie să fie de puritate analitică.
   4.1.   Metanol
   4.2.   Etanol absolut
   4.3.   2-propanol
   4.4.   Cloroform, liber de alcooli prin spălare cu apă
   5.   APARATURĂ
   5.1.   Cromatograf de gaze:

               cu detector catarometru pentru probele cu aerosoli,

               cu detector cu ionizare cu flacără pentru probele non-aerosoli.

         5.2.   Baloane cotate de 100 ml
   5.3.   Pipete de 2 ml, 20 ml, 0 până la 1 ml
   5.4.   Microseringi de 0 până la 100 μl și 0 până la 5 μl
   și (numai pentru probele cu aerosoli) seringi speciale etanșe cu robinet cu sertar (vezi procedeul de prelevare a probelor prezentat în figura 5) (2).
   6.   PROCEDURĂ
   6.1.   Pregătirea probei
   6.1.1.   Probele din produsele cu aerosoli se prelevează conform capitolului II din anexa la Directiva 80/1335/CEE a Comisiei din 22 decembrie 1980 (2) și apoi se analizează prin cromatografie de gaze în condițiile de la punctul 6.2.1.
   6.1.2.   Probele din produsele fără aerosoli se prelevează conform susmenționatului capitol II, se diluează cu apă până la un nivel de 1-2 % etanol sau 2-propanol și apoi se analizează prin cromatografie de gaze în condițiile de la punctul 6.2.2.
   6.2.   Cromatografie de gaze
   Pentru probele cu aerosoli se folosește detectorul catarometru.
   6.2.1.1.   Coloana este umplută cu 10 % Hallcomid M18 pe Chromosorb WAW cu 100-200 de ochiuri.
   6.2.1.2.   Coloana trebuie să realizeze o rezoluție, R, egală sau mai bună decât 1,5, unde:

   în care:

               r1 și r2

               =

               timpii de retenție pentru două vârfuri, în minute,

               w1 și w2

               =

               lățimea acelorași vârfuri la jumătatea înălțimii, în mm,

               d

               =

               viteza graficului, în mm pe minut.

         6.2.1.3.   Următoarele condiții permit atingerea acestei rezoluții:

               Coloana

               material:

               oțel inoxidabil

               lungime:

               3,5 m

               diametru:

               3 mm

               Curent punte catarometru:

               150 mA

               Gaz purtător:

               heliu

               presiune:

               2,5 bari

               debit:

               45 ml/min.

               Temperaturi:

               injector:

               150 °C

               detector:

               150 °C

               încălzitor coloană:

               65 °C

         Măsurarea ariilor vârfurilor poate fi îmbunătățită prin integrare electronică.
   Pentru probele fără aerosoli
   6.2.2.1.   Coloana se umple cu Chromosorb 105 sau Porapak QS și se folosește un detector cu ionizare cu flacără.
   6.2.2.2.   Coloana trebuie să realizeze o rezoluție, R, egală sau mai bună decât 1,5 unde:

   în care:

               r1 și r2

               =

               timpii de retenție pentru două vârfuri, în minute,

               w1 și w2

               =

               lățimea acelorași vârfuri la jumătatea înălțimii, în mm,

               d′

               =

               viteza graficului, în mm pe minut.

         6.2.2.3.   Condițiile care permit obținerea acestei rezoluții sunt:

               Coloana

               material:

               oțel inoxidabil

               lungime:

               2 m

               diametru:

               3 mm

               Senzitivitate electrometru:

               8 × 10-10 A

               Gaze:

               purtător:

               azot

               presiune:

               2,1 bari

               debit:

               40 ml/min

               Auxiliar:

               hidrogen

               presiune:

               1,5 bar

               debit:

               20 ml/min

               Temperaturi:

               injector:

               150 °C

               detector:

               230 °C

               încălzitor coloană:

               120 până la 130 °C.

         7.   GRAFIC STANDARD
   7.1.   Pentru procedura prin cromatografie de gaze 6.2.1 (coloană Hallcomid M18), se folosesc următoarele amestecuri standard. Aceste amestecuri se prepară prin măsurare cu pipeta, dar se determină cantitatea exactă prin cântărirea imediată a pipetei sau flaconului după fiecare adăugare.

               Concentrație relativă
               (m/m %)

               Metanol
               (ml)

               Etanol sau 2-propanol
               (ml)

               Cloroform adăugat până la un volum de

               aproximativ 2,5 %

               0,5

               20

               100 ml

               aproximativ 5,0 %

               1,0

               20

               100 ml

               aproximativ 7,5 %

               1,5

               20

               100 ml

               aproximativ 10,0 %

               2,0

               20

               100 ml

         Se injectează 2 până la 3 μl în cromatograf, în condițiile de la punctul 6.2.1.
   Se calculează raportul ariilor vârfurilor (metanol/etanol) sau (metanol/2-propanol) pentru fiecare amestec. Se trasează graficul standard folosind:

               axa X:

               % metanol față de etanol sau 2propanol,

               axa Y:

               raportul ariilor vârfurilor (metanol/etanol) sau (metanol/2propanol).

         7.2.   Pentru procedura prin cromatografie de gaze 6.2.2 (Porapak QS sau Chromosorb 105) se folosesc următoarele amestecuri standard. Aceste amestecuri se prepară prin măsurare cu pipeta, dar se determină cantitatea exactă prin cântărirea imediată a pipetei sau flaconului după fiecare adăugare.

               Concentrație relativă
               (m/m %)

               Metanol
               (μl)

               Etanol sau 2- propanol
               (ml)

               Apă adăugată până la un volum de

               aproximativ 2,5 %

               50

               2

               100 ml

               aproximativ 5,0 %

               100

               2

               100 ml

               aproximativ 7,5 %

               150

               2

               100 ml

               aproximativ 10,0 %

               200

               2

               100 ml

         Se injectează 2 până la 3 μl în cromatograf, în condițiile de la punctul 6.2.2.
   Se calculează raportul ariilor vârfurilor (metanol/etanol) sau (metanol/2-propanol) pentru fiecare amestec. Se trasează graficul standard folosind:

               axa X:

               % metanol față de etanol sau 2propanol,

               axa Y:

               raportul ariilor vârfurilor (metanol/etanol) sau (metanol/2propanol).

         7.3.   Graficul standard trebuie să fie o linie dreaptă.
   8.   REPETABILITATE (1)

   Pentru un conținut de metanol de 5 % față de etanol sau 2-propanol, diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate în paralel nu trebuie să depășească 0,25 %.

      (1)  Vezi standardul ISO 5725.

      (2)  JO L 383, 31.12.1980, p. 27.