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31984L0449

Directiva 84/449/CEE da Comissão, de 25 de Abril de 1984, que pela sexta vez adapta ao sexta vez a progresso técnico a Directiva 67/548/CEE do Conselho relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem das substâncias perigosas

Jornal Oficial nº L 251 de 19/09/1984 p. 0001 - 0223 Edição especial finlandesa: Capítulo 15 Fascículo 5 p. 0003  Edição especial espanhola: Capítulo 13 Fascículo 17 p. 0003  Edição especial sueca: Capítulo 15 Fascículo 5 p. 0003  Edição especial portuguesa: Capítulo 13 Fascículo 17 p. 0003

 DIRECTIVA DA COMISSÃO    de 25 de Abril de 1984    que , pela sexta vez , adapta ao progresso técnico   a Directiva 67/548/CEE do Conselho relativa à   aproximação das disposições legislativas ,   regulamentares e administrativas respeitantes à   classificação , embalagem e rotulagem das   substâncias perigosas     ( 84/449/CEE )    A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS ,    Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade   Económica Europeia ,    Tendo em conta a Directiva 67/548/CEE do Conselho , de   27 de Junho de 1967 , relativa à aproximação das   disposições legislativas , regulamentares e   administrativas respeitantes à classificação ,   embalagem e rotulagem das substâncias perigosas (1) ,   alterada pela sexta vez pela Directiva 79/831/CEE   do Conselho (2) , e em especial os seus artigos   19 º , 20 º e 21 º ,    Considerando que o n º 1 do artigo 3 º da Directiva   79/831/CEE prevê a determinação das propriedades   físico-químicas da toxicidade e da ecotoxicidade das   substâncias e preparações de acordo com os métodos   previstos no Anexo V ;    Considerando que o artigo 19 º da Directiva 79/831/CEE ,   de 18 de Setembro de 1979 , prevê que o Anexo V seja   objecto do procedimento do Comité para adaptação ao   progresso técnico e que é , em especial , conveniente   tomar em consideração métodos reconhecidos e   recomendados pelos organismos internacionais competentes ,   quando existirem tais recomendações ;    Considerando que as disposições da presente directiva   estão em conformidade com o parecer do Comité para   adaptação ao progresso técnico das directivas que visam   eliminar os entraves técnicos ao comércio no sector das   substâncias e das preparações perigosas ,    ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA :    Artigo 1 º    O texto do Anexo V da Directiva 67/548/CEE é   substituído pelo texto do anexo da presente directiva .    Artigo 2 º    Os Estados-membros adoptarão e publicarão , antes de   1 de Julho de 1985 , as disposições necessárias para   darem cumprimento à presente directiva e desse facto   informarão imediatamente a Comissão . Aplicarão   estas disposições a partir de 1 de Julho de 1986 .    Artigo 3 º    Os Estados-membros são destinatários da presente   directiva .    Feito em Bruxelas em 25 de Abril de 1984 .    Pela Comissão    Karl-Heinz NARJES    Membro da Comissão    (1) DO n º L 196 de 16 . 8 . 1967 , p. 1 .    (2) DO n º L 259 de 15 . 10 . 1979 , p. 10 .    ANEXO    Presente anexo enuncia os métodos de ensaio para   determinação das propriedades físico-químicas ,   toxicológicas e ecotoxicológicas enumeradas nos   Anexos VII e VIII da Directiva 79/831/CEE .    Esses métodos são baseados em trabalhos e   recomendações dos organismos internacionais   competentes [ em especial a Organização de   Cooperação e Desenvolvimento Económicos ( OCDE ) ] .    Sempre que tais métodos não existam , são   aplicados os padrões nacionais ou os métodos   geralmente reconhecidos nos meios científicos . Os   ensaios devem , geralmente , ser efectuados sobre   a substância tal como ela é comercializada . A   incidência que possam eventualmente ter as impurezas   sobre os resultados do ensaio não devem ser   negligenciadas .    Sempre que os métodos do presente anexo não se   adaptem ao exame de determinada propriedade , o   declarante deve justificar o emprego de outros métodos .    As experiências e os estudos em animais devem   respeitar as regulamentações nacionais e ter em   conta os princípios humanitários assim como os   recentes desenvolvimentos internacionais no domínio   da protecção dos animais .    Entre diversos métodos equivalentes de ensaio ,   deve escolher-se o que necessite de um menor   número de animais .    INDICE     * Pág. *    PARTE A : MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DAS   PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS * 6 *    A.1 . Ponto de fusão/intervalo de fusão * 6 *    A.2 . Ponto de ebulição/intervalo de ebulição *   15 *    A.3 . Densidade relativa * 22 *    A.4 . Pressão de vapor * 27 *    A.5 . Tensão superficial * 39 *    A.6 . Hidrossolubilidade * 46 *    A.7 . Lipossolubilidade * 55 *    A.8 . Coeficiente de partição * 59 *    A.9 . Ponto de inflamação * 63 *    A.10 . Inflamabilidade ( sólidos ) * 65 *    A.11 . Inflamabilidade ( gases ) * 68 *    A.12 . Inflamabilidade ( substâncias e preparações   que , em contacto com a água ou o ar húmido ,   libertam gases facilmente inflamáveis em quantidades   perigosas ) * 70 *    A.13 . Inflamabilidade ( sólidos e líquidos ) * 74 *    A.14 . Propriedades explosivas * 76 *    A.15 . Auto-inflamabilidade ( determinação da   temperatura relativa de auto-ignição dos líquidos   voláteis e dos gases ) * 86 *    A.16 . Auto-inflamabilidade ( sólidos-determinação   da temperatura relativa de auto-ignição ) * 88 *    A.17 . Propriedades comburentes * 91 *    PARTE B : MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DA   TOXICIDADE * 96 *    Introdução geral * 96 *    B.1 . Toxicidade aguda - administração oral * 98 *    B.2 . Toxicidade aguda - administração por   inalação * 101 *    B.3 . Toxicidade aguda - administração cutânea *   105 *    B.4 . Toxicidade aguda - irritação da pele * 108 *    B.5 . Toxicidade aguda - irritação dos olhos * 111 *    B.6 . Toxicidade aguda - sensibilização   da pele * 115 *    B.7 . Toxicidade subaguda - administração   oral * 121 *    B.8 . Toxicidade subaguda - administração   por inalação * 124 *    B.9 . Toxicidade subaguda - administração   cutânea * 129 *    B.10 . Outros efeitos : mutagénese - prova   citogenética in vitro em mamífero * 133 *    B.11 . Outros efeitos : mutagénese - prova citogenética   in vivo em medula óssea de mamífero , análise   cromossómica * 136 *    B.12 . Outros efeitos : mutagénese - prova do   micronúcleo * 139 *    B.13 . Outros efeitos : mutagénese - ensaios de   mutação reversa em Escherichia coli * 142 *    B.14 . Outros efeitos : mutagénese - ensaios de   mutação reversa em Salmonella thyphimurium * 145 *    PARTE C : MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DA   ECOTOXICIDADE * 148 *    C.1 . Toxicidade aguda para os peixes * 148 *    C.2 . Toxicidade aguda para as dáfnias * 157 *    C.3 . Degradação biótica : ensaio de screening   OCDE alterado * 162 *    C.4 . Degradação biótica : ensaio AFNOR NF T   90/302 alterado * 172 *    C.5 . Degradação biótica : ensaio Sturm   alterado * 181 *    C.6 . Degradação biótica : ensaio em tubo   fechado * 190 *    C.7 . Degradação biótica : ensaio MITI   alterado * 201 *    C.8 . Degradação : carência bioquímica de   oxigénio * 214 *    C.9 . Degradação : carência química de   oxigénio * 216 *    C.10 . Degradação abiótica : hidrólise em   função do pH * 218 *    PARTE A : MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DAS   PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS    A.1 . PONTO DE FUSÃO/INTERVALO DE FUSÃO    1 . MÉTODOS    Os métodos descritos baseiam-se nas directivas da   OCDE (1) .    1.1 . Introdução    Os métodos e os aparelhos a seguir descritos   permitem determinar o ponto de fusão de produtos   químicos qualquer que seja o seu grau de pureza .    A selecção do método depende da natureza do   produto a ensaiar .    Por consequência , o factor limitativo está   ligado ao facto de a substância ser facilmente ,   dificilmente ou não pulverizável .    Para certas substâncias , é preferível a   determinação do ponto de congelação ou de   solidificação . É por esta razão que as normas   destas determinações figuram igualmente nas directivas .    1.2 . Definição e unidades    O ponto de fusão é definido como sendo a   temperatura a que tem lugar a transição da fase   sólida para a fase líquida , à pressão   atmosférica normal .    Idealmente , esta temperatura corresponde à   do ponto de solidificação ou de congelação .    Dado que a fase de transição de numerosas   substâncias se estende sobre uma larga gama de   temperaturas , aquela é muitas vezes descrita como   sendo o intervalo de fusão .    Conversão das unidades ( K em ° C ) :    t = T - 273,15    em que t é expresso em graus Celsius e T em   graus Kelvin .    1.3 . Substâncias de referência    Não é necessária a utilização de substâncias   de referência nos casos em que se estuda uma substância   nova . Estas devem servir essencialmente para calibração   periódica do método e para comparação dos   resultados , sempre que é aplicado outro método .    São enumeradas algumas substâncias de calibração   nas referências ( 2 ) .    1.4 . Princípio do método de ensaio    É determinada a temperatura ( ou o intervalo de   temperaturas ) de transição da fase sólida à   fase líquida . Na prática , as temperaturas do   início e do fim da fusão das substâncias a ensaiar ,   são determinadas , à pressão atmosférica ,   durante o aquecimento . São descritos três tipos   de métodos : o método do tubo capilar , o método da   barra quente e a determinação do ponto de   congelação .    1.4.1 . Método do tubo capilar    1.4.1.1 . Dispositivo com banho líquido    Uma pequena quantidade de substância finamente   pulverizada é introduzida num tubo capilar e   cuidadosamente compactada . Este tubo é aquecido ao   mesmo tempo que um termómetro e a elevação de   temperatura é ajustada de modo a ser inferior a 1 K   por minuto durante a operação . São mencionadas as   temperaturas inicial e final da fusão .    1.4.1.2 . Dispositivo com bloco metálico    Tal como descrito no ponto 1.4.1.1 , à excepção   do tubo capilar e do termómetro que são colocados   num bloco metálico aquecido e observados através   de aberturas existentes neste .    1.4.1.3 . Detecção fotoeléctrica    A amostra contida no tubo capilar é aquecida   automaticamente num cilindro metálico . Através de uma   abertura neste , é enviado um feixe luminoso através   da substância a testar por uma célula fotoeléctrica   cuidadosamente aferida . No momento da fusão as   propriedades ópticas da maioria das substâncias são   alteradas , dando a opacidade lugar à transparência .   Daí que a intensidade da luz que atinge a célula   fotoeléctrica aumente e envie um sinal de paragem   a um indicador digital que regista a temperatura do   termómetro de resistência de platina colocado na   câmara aquecida . Este metodo não é aplicável   a certas substâncias fortemente coradas .    1.4.2 . Métodos envolvendo superficies aquecidas    1.4.2.1 . Método da barra quente de Kofler    A barra quente de Kofler é constituída por duas   peças metálicas de condutividade térmica diferente ,   que são aquecidas electricamente . É construída   de modo a que o gradiente de temperatura seja quase   linear em todo o seu comprimento . A temperatura da barra   quente pode variar entre 283 e 543 K , com um   dispositivo de leitura da temperatura que compreende um   cursor com um índice e uma escala graduada ,   especialmente concebidos para a barra em questão .   Para determinação do ponto de fusão , deposita-se   uma fina camada de substância directamente sobre a   superfície da barra . Em alguns segundos , formar-se-à   uma fina linha de divisão entre a fase fluida e a   fase sólida . A temperatura à altura desta linha   é lida colocando o índice do cursor frente a esta   última .    1.4.2.2 . Microscópio de fusão    São utilizados diferentes tipos de microscópios de   platina aquecida para determinar os pontos de fusão   com muito pequenas quantidades de substância .   A temperatura é geralmente medida com o auxílio dum   termopar sensível , mas por vezes também com a ajuda   de um termómetro de mercúrio . O dispositivo-tipo tem   uma câmara aquecida que contém uma platina de   metal sobre a qual é colocada a lâmina de vidro   destinada a receber a amostra . O centro da platina   metálica é atravessado por um orifício que   permite a passagem da luz proveniente do espelho ,   iluminando o microscópio . Aquando da utilização ,   a câmara é fechada com a ajuda de uma placa de   vidro para impedir a circulação de ar na zona   de trabalho . O aquecimento da amostra é regulado   por meio de um reostato .    Para determinações mais precisas é possível   a utilização de luz polarizada para a análise de   substâncias opticamente anisótropas .    1.4.2.3 . Método do menisco    Este método aplica-se especificamente às   poliamidas .    Determinação da temperatura à qual se observa   a olho nu o deslocamento de um menisco de óleo de   silicone , preso entre uma superfície quente e uma   tampa de vidro colocada sobre a amostra de poliamida   a testar .    1.4.3 . Método de determinação do ponto de   congelação    A amostra é introduzida num tubo de ensaio especial   e colocado num aparelho que permite a determinação   do ponto de cristalização .    A amostra é agitada suavemente durante todo   o arrefecimento enquanto que a temperatura é lida   e registada de 30 em 30 segundos . Logo que algumas   determinações indiquem uma temperatura constante ,   o valor desta é considerado como o ponto de   cristalização ( após correcção termométrica ) .    1.5 . Critérios de qualidade    As condições de aplicação e a precisão dos   diferentes métodos de determinação do ponto de   fusão/intervalo de fusão são indicados no quadro   a seguir .    QUADRO : APLICABILIDADE DOS MÉTODOS    A . Métodos do tubo capilar    Método de medição * Substâncias facilmente   pulverizáveis * Substâncias dificilmente   pulverizáveis * Grama de temperatura * Precisão   máxima aproximada (1) * Observações *    Dispositivo com banho líquido * Sim * Algumas *   273 a 573 K * ± 0,3 K * Norma existente : JIS K 0064 *    Dispositivo com bloco metálico * Sim * Algumas *   293 a 573 K * ± 0,5 K * Norma existente : ISO 1218 ( E ) *    Detecção fotoeléctrica * Sim * Algumas com   dispositivo de aplicação * 253 a 573 K * ± 0,1 K * *    (1) Valor dependente do tipo de instrumento e do   grau de pureza das substâncias .    B . Métodos das superfície aquecida e do ponto de   congelação    Método de medição * Substâncias facilmente   pulverizáveis * Substâncias dificilmente   pulverizáveis * Grama de temperatura * Precisão   máxima aproximada (1) * Observações *    Banca quente de Kofler * Sim * Não * 283 a 543 K *   ± 1,0 K * Norma existente ANSI/ASTM D 3451-76 *    Microscópio de fusão * Sim * Algumas * 273 a 573 K   ( até 1 773 K ) * ± 0,2 K * Norma existente   DIN 53736 *    Método do menisco * Não * Específico para   poliamidas * 293 a 573 K * ± 0,5 K * Norama existente   ISO 1218 ( E ) *    Método do ponto de congelação * Para   substâncias líquidas * Para substâncias   líquidas * 223 a 573 K * ± 0,5 K * Norma existente   BS 4699 *    (1) Valor dependente do tipo de instrumento   e do grau de pureza das substâncias .    1.6 . Descrição dos métodos    Os procedimentos de quase todos os métodos   de ensaio estão descritos nas normas internacionais e   nacionais ( ver apêndice ) .    1.6.1 . Método do tubo capilar    Quando a elevação de temperatura é lenta ,   as substâncias finamente pulverizadas passam   habitualmente pelas fases de fusão representadas   na figura 1 .    Figura 1 : v. JO    Fase A : ( início da fusão ; ponto húmido ) :   finas gotículas aderem uniformemente à parede   interior do tubo capilar ;    Fase B : ( ponto de contracção ) : aparece   um espaço livre entre a amostra e a parede interior ,   devido à contracção do produto em fusão ;    Fase C : ( ponto de colapso ) : a amostra contraída   começa a curvar-se e a liquefazer-se ;    Fase D : ( ponto de liquefacção ) : formação   de um menisco completo à superfície , restando no   entanto ainda uma certa quantidade de partículas   da amostra sólidas ;    Fase E : ( fim da fusão ) : não existem já   partículas sólidas .    Durante a determinação do ponto de fusão ,   devem ler-se as temperaturas do início e do fim da   fusão .    1.6.1.1 . Dispositivos com um banho líquido    A figura 2 descreve um tipo de aparelho normalizado   ( JIS K 0064 ) . Todas as especificações   são expressas em milímetros ; o aparelho é   de vidro .    Figura 2 : v. JO    Banho líquido    O líquido a utilizar deve ser escolhido em   função do ponto de fusão . A parafina   líquida utiliza-se para pontos de fusão que   não ultrapassem os 473 K ; o ácido sulfúrico   concentrado ou o óleo de silicone para os pontos   de fusão que não ultrapassem os 573 K .    Pode ser utilizada uma mistura composta por três   partes de ácido sulfúrico e duas partes de sulfato   de potássio ( em peso ) para os pontos de fusão   superiores a 523 K .    Termómetro    Só podem ser utilizados os termómetros que   satisfaçam as exigências das seguintes normas   ou suas equivalentes : ASTM E 1-71 , DIN 12770 ,   JIS K 8001 .    Procedimento :    A substância seca é finamente pulverizada   num almofariz e introduzida num tubo capilar fechado   numa das extremidades , sendo a altura de enchimento   cerca de 3 mm após compacção . Para se obter uma   amostra uniformemente compactada , deve deixar-se cair o   tubo capilar de uma altura de cerca de 700 mm no interior   de um tubo de vidro colocado verticalmente sobre um   vidro de relógio .    Então , o tubo capilar é colocado no banho de modo   a que a parte central do reservatório de mercúrio   do termómetro fique em contacto com a parte do   capilar que contém a amostra . Geralmente , o tubo   capilar é introduzido no aparelho apenas no   momento em que o banho está a cerca de 10 K   abaixo do ponto de fusão .    O aquecimento do banho é regulado de modo a que o   aumento de temperatura seja de 3 K/minuto . O   líquido deve ser agitado . A cerca de 10 K abaixo da   temperatura esperada , o aumento da temperatura é   regulado para um máximo de 1 K/minuto .    Cálculo :    O cálculo do ponto de fusão efectua-se utilizando   a fórmula seguinte :    T = T D + 0,00016 ( T D - T E ) n    sendo ,    T = temperatura de fusão corrigida , expressa em K    T d = temperatura lida no termómetro D ,   expressa em K    T E = temperatura lida no termómetro E , expressa   em K    n = número de graduações da coluna de   mercúrio emergente do termómetro D .    1.6.1.2 . Bloco metálico    Aparelho    O aparelho compreende :     - um bloco metálico cilíndrico cuja parte   superior é cavada formando uma câmara de   aquecimento ( ver figura 3 ) ,     - uma rolha metálica perfurada , com 2 ou   mais orifícios que permitam a introdução dos   tubos no bloco ,     - um sistema de aquecimento do bloco metálico ,   que pode ser uma resistência eléctrica incluída no   bloco ,     - um reóstato para regular a potência no   caso de aquecimento eléctrico ,     - as paredes laterais da câmara são perfuradas   por quatro janelas em vidro resistente ao calor ,   diametralmente opostas . Face a uma destas janelas   é instalada uma ocular para observação do tubo   capilar . As três outras janelas permitem iluminar   o interior por meio de lâmpadas ,     - um tubo capilar , em vidro resistente ao calor   e fechado numa das extremidades ( ver 1.6.1.1 ) .    Termómetro :    Ver normas do ponto 1.6.1.1 .    Podem também ser utilizados instrumentos   termo-eléctricos de precisão equivalente .    Figura 3 : v. JO    Procedimento :    Ver 1.6.1.1 . A correcção do termómetro   não é necessária neste dispositivo . A   temperatura de fusão registada é considerada   como ponto de fusão .    1.6.1.3 . Detecção fotoeléctrica    Aparelho e procedimento :    O aparelho consiste numa câmara metálica   com sistema de aquecimento automático . Enchem-se   três tubos capilares , como descrito no   ponto 1.6.1.1 e colocam-se no forno .    Deve dispor-se de cinco variações lineares de   temperatura para calibrar o aparelho . O aumento   adequado da temperatura é regulado electricamente   a uma velocidade pré-seleccionada constante e linear .   Os registadores indicam a temperatura real do forno   e o ponto de fusão da substância nos tubos   capilares .    1.6.2 . Métodos envolvendo superfícies aquecidas    1.6.2.1 . Barra quente de Kofler    Ver apêndice .    1.6.2.2 . Microscópio de fusão    Ver apêndice .    1.6.2.3 . Método do menisco ( poliamidas )    Ver apêndice .    Na proximidade do ponto de fusão , o aumento   da temperatura deve ser inferior a 1 K por minuto .    1.6.3 . Métodos de determinação do ponto   de congelação    Ver apêndice .    2 . RESULTADOS    Impõe-se em certos casos uma correcção   do termómetro .    3 . RELATÓRIO DE ENSAIO    Deve ser indicado o método utilizado .    O ponto de fusão indicado no relatório é   no mínimo a média de duas determinações   que não ultrapassem os limites da precisão   aproximada ( ver quadro ) . Deve ser dada uma   estimativa da precisão . Se a diferença entre   as temperaturas inicial e final da fusão   se situar nos limites de precisão do método ,   a temperatura referente à fase final da fusão   é considerada como o ponto de fusão ; caso   contrário são indicadas as duas temperaturas .    Certas substâncias podem decompor-se ou   sublimar-se antes de terem atingido o ponto de fusão .   Este facto deve ser assinalado .    Devem ser dadas todas as informações e   observações de interesse para a interpretação   dos resultados , designadamente , relativamente a   impurezas e ao estado físico da substância .    4 . REFERÊNCIAS     ( 1 ) OCDE , Paris , 1981 , Test Guideline 102 -   Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .     ( 2 ) IUPAC , Physicochemical Measurements :   Catalogue of Reference Materials from National   Laboratories , Pure and Applied Chemistry , vol. 48 ,   1976 , p. 505-515 .    Apèndice    Para detalhes técnicos adicionais podem ser   consultadas , por exemplo , as seguintes normas :    1 . Métodos do tubo capilar    1.1 . Dispositivos com um banho líquido    ASTM E 324-69 * Standard Test Method for Relative   Initial and Final Melting Points and the Melting   Range of Organic Chemicals *    BS 4634 * Method for the Determination of Melting   Point and/or Melting Range *    DIN 53181 * Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen   nach Kapillarverfahren *    JIS K 00-64 * Testing Methods for Melting Point   of Chemical Products *    1.2 . Dispositivos com bloco metálico    DIN 53736 * Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur   von teilkristallinen Kunststoffen *    ISO 1218 ( E ) * Plastics-Polyamides-Determination of   « Melting Point » *    2 . Métodos com superfícies aquecidas    2.1 . Banca quente de Kofler    ANSI/ASTM D 3451-76 * Standard Recommended Practices   for Testing Polymeric Powder Coatings *    2.2 . Microscópio de fusão    DIN 53736 * Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur   von teilkristallinen Kunststoffen *    2.3 . Método do menisco ( poliamidas )    ISO 1218 ( E ) * Plastics-Polyamides-Determination of   « Melting-Point » *    ANST/ASTM D 2133-66 * Standard Specification for   acetal Resin Injection Moulding and Extrusion Materials *    NF T 51 050 * Résines de polyamides . Détermination   du « point de fusion » . Méthode du ménisque *    3 . Métodos de determinação do ponto de   congelação    BS 4633 * Method for the Determination of Crystallizing   Point *    BS 4695 * Method for Determination of Melting Point   of Petroleum Wax ( Cooling Curve ) *    DIN 10319 * Bestimmung des Gefrierpunktes von Milch *    DIN 51421 * Bestimmung des Gefrierpunktes von   Flugkraftstoffen , Ottokraftstoffen und Motorenbezolen *    DIN 51556 * Bestimmung des Erstarrungspunktes am   rotierenden Thermometer *    DIN 53175 * Bestimmung des Erstarrungspunktes von   Fettsaeuren *    NF T 60-114 * Point de fusion des paraffines *    A.2 . PONTO DE EBULIÇÃO/INTERVALO DE EBULIÇÃO    1 . MÉTODOS    Os métodos descritos baseiam-se nas directivas   da OCDE (1) .    1.1 . Introdução    Os métodos e dispositivos aqui descritos aplicam-se   às substâncias líquidas que não sofrem reacção   química a temperaturas inferiores à do ponto de   ebulição ( por ex. auto-oxidação , rearranjo ,   degradação , etc. ) . Os métodos aplicam-se a   substâncias líquidas puras ou impuras .    A importância dada à descrição do método que   recorre à detecção fotoeléctrica é devida ao   facto de que este permite a determinação , não   só do ponto de ebulição , mas também do ponto   de fusão , e ainda de que as determinações podem   ser efectuadas automaticamente .    O « método dinâmico » tem a vantagem de   poder ser igualmente utilizado para a determinação   da pressão do vapor , não sendo necessário corrigir   a temperatura de ebulição para a pressão normal   ( 101,325 KPa ) , pois esta pode ser mantida durante   a determinação . No entanto este método não   está ainda automatizado .    Observações    A influência das impurezas na determinação do   ponto de ebulição depende muito da sua natureza .   Esta influência pode ser considerável se a amostra   contiver um solvente muito volátil .    A composição da amostra varia em cada   determinação devido à volatilização dos   componentes de ponto de ebulição baixo . Nestas   condições , obtêm-se valores cada vez mais altos .    1.2 . Definições e unidades    A temperatura de ebulição normal é definida como   sendo a temperatura à qual a pressão do vapor   saturante de um líquido é igual à pressão   normal .    O valor medido do ponto de ebulição depende da   pressão atmosférica . Esta dependência pode ser   calculada quantitativamente pela equação de   Clapeyron-Clausius :    log p = D H v/2,3 RT + constante    sendo :    p : pressão do vapor da substância em Pascal    D H v = calor de vaporização em J mol -1    R = constante molar universal dosgases   = 8,31 J mol -1 K -1    T = temperatura expressa em K .    A temperatura no ponto de ebulição ( temperatura   de ebulição ) é dada à pressão ambiente no   momento da determinação .    Conversões :    Pressão ( unidade : kPa ) .    100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa ( a utilização da   unidade « bar » é ainda permitida , mas não   recomendável ) .    133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr ( a utilização das   unidades « Torr » e « mm Hg » não é   permitida ) .    Temperatura ( unidade : K )    t = T - 273,15     ( t en ° C et T em K ) .    1.3 . Substâncias de referência    Não é necessária a utilização de substâncias   de referência sempre que se estuda uma nova substância .   Estas substâncias de referência servem essencialmente   para aferir periodicamente o método e permitir comparar   resultados .    Nos métodos enumerados no apêndice figuram algumas   substâncias-padrão .    1.4 . Princípio do método de ensaio    Todos os métodos de determinação do ponto de   ebulição ( ou do intervalo de ebulição ) são   baseados na determinação da temperatura de ebulição .   Descrevem-se a seguir cinco métodos :    1.4.1 . Método do ebuliómetro    A pesar de os ebuliómetros terem sido originalmente   concebidos para a determinação do peso molecular   por elevação do ponto de ebulição , podem   igualmente ser utilizados na determinação exacta   do ponto de ebulição . A norma ASTM D 1120-72   ( ver apêndice ) descreve um aparelho muito simples   em que o líquido é aquecido até à ebulição   à pressão atmosférica em condições   de equilíbrio .    1.4.2 . Método dinâmico    Neste método mede-se a temperatura de recondensação   do vapor com a ajuda de um termopar colocado no refluxo   durante a ebulição . Neste método a pressão   pode ser alterada .    1.4.3 . Método da destilação para ponto e   intervalo de ebulição    Este método envolve a destilação do líquido ,   a determinação da temperatura de recondensação   do vapor e a determinação da quantidade do destilado .    1.4.4 . Método de Siwoloboff    Aquece-se uma amostra num tubo de ensaio que se   encontra imerso num banho líquido aquecido .    Mergulha-se no tubo de ensaio um capilar selado ,   contendo uma bolha de ar na sua parte inferior .   Determina-se a temperatura a que uma série contínua   de bolhas se desprende do capilar ou a temperatura a   que a série de bolhas se interrompe quando haja um   resfriamento momentâneo e o fluido começa   abruptamente a subir no capilar ( Siwoloboff ) .    1.4.5 . Detecção fotoeléctrica    Seguindo o princípio de Siwoloboff , a ascensão   das bolhas permite uma medição fotoeléctrica   automática .    1.5 . Critérios de qualidade    São indicadas no quadro I a aplicabilidade e a   precisão dos diferentes métodos utilizados para a   determinação do ponto de ebulição/intervalo   de ebulição .    1.6 . Descrição dos métodos    As técnicas de alguns métodos de ensaio são   descritas em normas internacionais ( ver apêndice ) .    1.6.1 . Ebuliómetro    Ver apêndice .    1.6.2 . Método dinâmico    Ver o método de ensaio A.4 para a determinação   da pressão do vapor . É registada a temperatura de   ebulição a 101,325 kPa .    1.6.3 . Método de destilação ( intervalo de   ebulição )    Ver apêndice .    QUADRO 1 : COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS    Métodos de medição * Precisão aproximada *   Observações *    Ebuliómetro * ± 1,4 K ( até 373 K ) (1) (2) *   Norma existente *     * ± 2,5 K ( acima de 373 K ) (1) (2) *   ASTM D 1120-72 (1) *    Método dinâmico * ± 0,5 K (2) * *    Método da destilação ( intervalo de ebulição ) *   ± 0,5 K * Exemplos de normas existentes *     * * ISO/R 918 *     * * DIN 53171 *     * * BS 4591/71 *    Método de Siwoloboff * ± 1 K a ± 2 K (2) * *    Detecção fotoeléctrica * ± 0,3 K ( a 373 K )   (2) * *    (1) Esta precisão é válida somente para os   aparelhos simples como o descrito na norma ASTM D   1120-72 ; é possível melhorá-lo utilizando   ebuliómetros mais aperfeiçoados .    (2) Válido somente para substâncias puras .    1.6.4 . Método de Siwoloboff    Introduzir a amostra num tubo de ensaio de cerca de 5 mm   de diâmetro aquecido num aparelho que serve para a   determinação do ponto de fusão ( ver figura 1 ) .    A figura 1 exemplifica um aparelho normalizado que   serve para determinar o ponto de fusão e o de ebulição   ( JIS K 0064 ) . As especificações são dadas   em milímetros e o aparelho é de vidro .    Figura 1 : v. JO    Um tubo capilar ( capilar de ebulição ) , selado   a cerca de 1 cm acima da sua extremidade inferior , é   mergulhado no tubo de ensaio contendo a substância   a testar . A parte selada do capilar deve ficar abaixo   da superfície do líquido . O tubo de ensaio   contendo o capilar de ebulição deve ser quer   apertado ao termómetro com um elástico ou fixado   lateralmente com um suporte ( fig. 2 ) .    Figura 2    Método de Siwoloboff : v. JO    Figura 3    Método alterado : v. JO    O líquido do banho é escolhido em função da   temperatura de ebulição . Pode ser utilizado ácido   sulfúrico ou óleo de silicone para temperaturas   até 573 K . A utilização de parafina líquida   só é conveniente para temperaturas inferiores   a 473 K .    De início , o aquecimento do banho deve ser   regular de modo a obter-se um aumento de temperatura   de 3 K/minuto . É conveniente agitar o líquido   do banho . A cerca de 10 K abaixo do presumível   ponto de ebulição , o aquecimento é   reduzido de tal modo que o aumento da temperatura   não ultrapasse 1K/minuto . Na proximidade da   temperatura de ebulição , começão a sair   bolhas do capilar .    O ponto de ebulição é definido pela temperatura   a que , aquando de um arrefecimento , a fila de bolhas   é interrompida e o líquido sobe no capilar . A   temperatura lida no termómetro neste preciso momento   corresponde à temperatura de ebulição da   substância a ensaiar .    No método alterado ( fig. 3 ) , o ponto de   ebulição é determinado num capilar de ponto   de fusão . A extremidade inferior deste é esticada   numa ponta fina de cerca de 2 cm de comprimento ( a ) e   aspirada para o seu interior uma pequena quantidade da   substância a testar . A ponta é então selada   de modo a deixar no interior uma pequena bolha de ar   na extremidade . Ao aquecer no aparelho de ponto de   fusão , a bolha de ar dilata-se ( b ) . O ponto de   ebulição corresponde à temperatura a que a amostra   da substância atinge o nível da superfície do   líquido do banho ( c ) .    1.6.5 . Detecção fotoeléctrica    A amostra da substância a testar é aquecida num   tubo capilar colocado no interior de um bloco   metálico aquecido .    Pelas aberturas existentes no bloco , é enviado um   feixe de luz através da substância para uma   célula fotoeléctrica aferida de modo preciso .   Durante o aumento de temperatura da amostra , escapam-se   algumas bolhas de ar do capilar de ebulição .   Quando a temperatura de ebulição é atingida ,   o número de bolhas aumenta fortemente . A alteração   da intensidade luminosa que se segue é registada   pela célula fotoeléctrica , a qual envia um sinal   de paragem ao indicador de temperatura de um   termómetro de resistência de platina colocado   no bloco .    Este método é particularmente útil pois   permite efectuar determinações inferiores à   temperatura ambiente até 253,15 K ( - 20 ° )   e isto sem nenhuma alteração do aparelho . Deve   apenas ser colocado numa câmara fria ou num banho   refrigerante . As instruções técnicas fornecidas   com o aparelho dão todos os pormenores necessários   a uma boa execução da determinação do ponto   de ebulição .    2 . RESULTADOS    Para pequenas variações da pressão normal   ( máx. ± 5 kPa ) , as temperaturas do ponto de   ebulição podem ser corrigidas ( T n ) pela equação   de Sidney-Young :    T n = T + f T × D p    sendo ,    D p = ( 101,325 - p ) ( atenção ao sinal )    p = pressão barométrica em kPa    f T = velocidade da variação do ponto de   ebulição com a pressão , em K/kPa    T = valor da temperatura de ebulição medida , em K    T n = valor da temperatura de ebulição corrigida ,   em K à pressão normal    Os factores de correcção da temperatura ( f T )   e as equações para a sua aproximação constam   das normas internacionais e nacionais citadas no texto   ( válidas para numerosas substâncias ) .    O método DIN 53171 , por exemplo , dá as   correcções para os solventes contidos em tintas :    QUADRO 2 : FACTORES DE CORRECÇÃO DA TEMPERATURA    Temperatura T em K * Factor de correcção   f T em K/kPA *    323,15 * 0,26 *    348,15 * 0,28 *    373,15 * 0,31 *    398,15 * 0,33 *    423,15 * 0,35 *    448,15 * 0,37 *    473,15 * 0,39 *    498,15 * 0,41 *    523,15 * 0,44 *    548,15 * 0,45 *    573,15 * 0,47 *    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    Deve ser indicado o método utilizado . O ponto de   ebulição determinado é a média de pelo menos duas   determinações que se situem dentro dos limites de   precisão indicados no quadro 1 . Caso as   determinações não sejam reprodutivas , outros   métodos devem ser encarados .    Devem ser indicados os valores determinados dos   pontos de ebulição bem como as suas médias e a   pressão ( ou pressões ) em kPa à qual foram   efectuadas as determinações .    A pressão deve ser de preferência próxima da   pressão normal . Sempre que a ebulição duma   substância a ensaiar se efectue numa longa gama   de temperatura , este intervalo de ebulição deve   constar do relatório .    Serão dadas estimativas em matéria de precisão   para todos os resultados .    Devem ser fornecidas todas as informações e   observações de interesse para a interpretação dos   resultados , nomeadamente no que se refere às   impurezas e ao estado físico da substância .    4 . REFERÉNCIAS     ( 1 ) OCDE , Paris , 1981 , Test Guideline 103 -   Decision of the Council C(81) 30 Final .    Apêndice    Para mais detalhes podem consultar-se as seguintes   normas :    1 . Ebuliómetro    ASTM D 1120-72 * Standard test method for boiling   point of engine antifreezes *    2 . Método da destilação ( intervalo de   ebulição )    ISO/R 918 * Test method for distillation ( distillation   yield and distillation range ) *    BS 4349/68 * Method for determination of distillation   of petroleum products *    BS 4591/71 * Method for the determination of   distillation characteristics *    DIN 53171 * Loesungsmittel fur Anstrichstoffe .   Bestimmung des Siedeverlaufes *    A.3 . DENSIDADE RELATIVA    1 . MÉTODO    Os métodos descritos baseiam-se nas directivas   da OCDE ( 1 ) .    1.1 . Introdução    Os métodos de determinação da densidade   relativa descritos , aplicam-se às substâncias   sólidas e líquidas , qualquer que seja o seu grau   de pureza . Os diversos métodos a aplicar estão   enumerados no quadro 1 .    1.2 . Definições e unidades    A densidade relativa ( D 4 20 ) dos sólidos ou   líquidos é a razão entre a massa de um certo   volume da substância a testar , determinada a   20 ° C , e a massa de igual volume de água ,   determinada a 4 ° C . A densidade relativa é   um valor abstracto ( sem dimensões ) .    A densidade ( p ) de uma substância é o   quociente da sua massa m pelo seu volume v .    Em unidades SI , a densidade é dada em quilograma   por metro cúbico ( Kg/m³ ) .    1.3 . Substâncias de referência ( 1 ) / ( 2 )    Não é necessária a utilização de substâncias   de referência sempre que se estuda uma nova substância .    Devem-se utilizar essencialmente para calibração   periódica das técnicas e para permitir a comparação   de resultados .    1.4 . Principio dos métodos    São aplicados quatro métodos .    1.4.1 . Métodos de flutuabilidade    1.4.1.1 Areometro ( para líquidos )    Podem obter-se determinações de densidade   suficientemente precisas e rápidas com a ajuda de   areometros flutuantes que permitem deduzir a densidade   de um líquido , através da profundidade de   imersão lida sobre uma escala graduada .    1.4.1.2 Balança hidrostática ( para substâncias   líquidas e sólidas )    A diferença entre o peso da amostra medido ao   ar e na água pode servir para determinar a sua   densidade .    No caso dos sólidos , a densidade medida só é   representativa da amostra utilizada . Para determinar a   densidade de um líquido , pesa-se um corpo com um   volume V conhecido , primeiro ao ar e depois no   líquido .    1.4.1.3 Método da esfera imersa ( para substancias   líquidas ) ( 3 )    Neste método , a densidade de um líquido é   determinada a partir da diferença entre os resultados   da pesagem desse líquido antes e depois da   imersão de uma esfera de volume conhecido no   líquido .    1.4.2 . Métodos picnométricos    Para os sólidos ou líquidos , podem utilizar-se   picnómetros de formas variades cujas capacidades são   conhecidas . A densidade é calculada a partir da   diferença de peso entre o picnómetro cheio e vazio ,   por um lado , e do seu volume conhecido , por outro .    1.4.3 . Picnómetro de comparação ao ar ( para   sólidos )    A densidade de um sólido , qualquer que seja a   sua forma pode ser determinada , à temperatura ambiente ,   com a ajuda de um picnómetro de comparação de   gás . O volume duma substância ao ar ou num gás   inerte é medido num tubo cilíndrico de volume   calibrado variável . Para o cálculo da densidade ,   é efectuada uma avaliação da massa após a   avaliação do volume .    1.4.4 . Densímetro oscilante ( 4 ) ( 5 ) ( 6 )    A densidade de um líquido pode ser medida com um   densímetro oscilante , isto é um oscilador   mecânico em forma de tubo em U , que oscila   a uma frequência dependente da sua massa .    A introdução da amostra altera a frequência   de ressonância do oscilador . O aparelho deve ser   calibrado com 2 substâncias líquidas de densidades   conhecidas .    Estas substâncias devem ser escolhidas de modo   a que as suas densidades cubram o intervalo de medida .    1.5 . Critérios de qualidade    Apresenta-se no quadro a aplicabilidade dos   diferentes métodos utilizados para a determinação da   densidade .    A precisão mencionada na norma ISO refere-se   unicamente a substâncias puras .    1.6 . Descrição dos métodos    As referências das normas citadas em exemplo ,   que podem ser consultadas para obter detalhes técnicos   suplementares constam do apêndice .    Os ensaios devem ser efectuados à temperatura   de 20 ° C e abranger , no mínimo , duas   determinações .    2 . RESULTADOS    Ver normas .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    O método ou a norma utilizada será objecto de um   relatório .    A densidade relativa ( D 4 20 ) deve ser indicada   de acordo com a definição do ponto 1.2 . ao mesmo   tempo que o estado físico da substância a examinar .   Devem ser dadas todas as informações e   observações relevantes para a interpretação   dos resultados , nomeadamente no que diz respeito   às impurezas e ao estado físico das substâncias .    QUADRO 1 : APLICABILIDADE DOS MÉTODOS    Métodos de medição * Densidade * Viscosidade   dinâmica máxima possivel * Observações *     * sólida * líquida * * *    1.4.1.1 . Aréometro * * X * 5 Pa s * ISO 387 *     * * * * ISO/R 649 *    1.4.1.2 . Balanca hidrostática * * * * ISO/R   1185 ( A ) *    a ) Sólidos * X * * * ISO/R 91 et *    b ) Líquidos * * X * 5 Pa s * R 758 *    1.4.1.3 . Método da esfera imersa * * X * 20 Pa s *   DIN 53217 *    1.4.2 . Picnómetro * * * * *    a ) Sólidos * X * * 500 Pa s * ISO/R 3507 *    b ) Líquidos * * X * * ISO/R 1183 ( B ) *     * * * * ISO/R 758 *    1.4.3 . Picnómetro de comparação ao ar * X * * *   DIN 55990 partie 3 *     * * * * DIN 53243 *    1.4.4 . Densímetro oscilante * * X * 5 Pa s * *    4 . REFERÊNCIAS     ( 1 ) OCDE , Paris , 1981 , Test Guideline 109 -   Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .     ( 2 ) IUPAC , Recommended reference materials for   realisation of Physico-chemical Properties . - Pure   and Applied Chemistry , Vol. 48 , 1976 , p. 508 .     ( 3 ) Wagenbreth , H. , Die Tauchkugel zur   Bestimmung der Dichte von Fluessigkeiten ,   Technisches Messen tm , Vol. 11 , 1979 , p. 427-430 .     ( 4 ) Leopold , H. , Die digitale Messung   von Fluessigkeiten , Elektronik , Vol. 19 , 1970 ,   p. 297-302 .     ( 5 ) Baumgarten , D. Fuellmengenkontrolle   bei vorgepackten Erzeugnissen-Verfahren zur   Dichtebestimmung bei fluessigen Produkten   und ihre praktische Anwendung . Die Pharmazeutische   Industrie , Vol. 37 , 1975 , p. 717-726 .     ( 6 ) Riemann , J. , Der Einsatz der digitalen   Dichtemessung im Brauereilaboratorium , Brauwissenschaft ,   Vol. 9 , 1976 , p. 253-255 .    Apêndice    Para mais detalhes técnicos , podem   consultar-se as seguintes normas :    1 . Métodos da flutuabilidade    1.1 . Aréometro    DIN 12790 * Hydrometer : general instructions *    ISO 387 * *    DIN 12791 * Part I : Density hydrometers :   construction , adjustment and use *     * Part II : Density hydrometers : standardised   sizes , designation *    ISO/R 649 * *    DIN 12793 * Laboratory glassware : range find   hydrometers *    1.2 . Balança hidrostática    Para substáncias sólidas :    ISO R 1183 * Method A. Methods for determining   the density and relative density of plastics   excluding cellular plastics *    ASTM-D-792 * Specific Gravity and Density of   Plastics by Displacement *    DIN 53479 * Testing of plastics and elastomers ;   determination of density *    Para substâncias líquidas    ISO R 91 * ISO R 758 *    DIN 51757 * Testing of mineral oils and related   materials ; determination of density . *    ASTM D 941-55 , ASTM D 1296-67 et ASTM D 1481-62 * *    ASTM D 1298 * Density , Specific gravity or API   gravity of crude Petroleum and liquid Petroleum   Products by Hydrometer Method *    BS 4714 * Density , Specific gravity or API gravity   of crude Petroleum and liquid Petroleum Products   by Hydrometer Method *    1.3 . Método da esfera imersa    DIN 53217 * Testing of paints , varnishes and   similar products ; determination of density by   pycnometer ( enlargement for immersed ball method   to be published in 1981 ) *    2 . Métodos picnométricos    2.1 . Para substâncias líquidas    ISO 3507 * Pycnometers *    ISO/ R 758 * Liquid chemical products :   determination fo density at 20 ° C *    DIN 12797 * Gay-Lussac pycnometer ( for   non-volatile liquids which are not too viscous ) *    DIN 12798 * Lipkin pycnometer ( for liquids with   a kinematic viscosity of less than 100 · 10 -6   m²s-1 at 15 ° C ) *    DIN 12800 * Sprengel pycnometer ( for liquids   as DIN 12798 ) *    DIN 12801 * Reischauer pycnometer ( for liquids   with a kinematic viscosity of less than 100 · 10 -6   m²s-1 at 20 ° C , applicable in particular also   to hydrocarbons and aqueous solutions as well as   to liquids with higher vapour pressure ,   approximately 1 bar at 90 ° C ) *    DIN 12806 * Hubbard pycnometer ( for viscous   liquids of all types which do not have a too   high vapour pressure , in particular also for   paints , varnishes and bitumen ) *    DIN 12807 * Bingham pycnometer ( for liquids ,   as in DIN 12801 ) *    DIN 12808 * Jaulmes pycnometer ( in particular   for ethanol-water mixture ) *    DIN 12809 * Pycnometer with ground-in thermometer   and capillary side tube ( for liquids which are not   too viscous ) *    DIN 53217 * Testing of paints , varnishes and   similar products : determination of density by pycnometer *    DIN 51757 * Point 7 : Testing of mineral oils and   related materials ; determination of density *    ASTM D 297 * Section 15 : Rubber Products-Chemical   Analysis *    ASTM D 2111 * Method C : Halogenated organic   compounds *    BS 4699 * Method for Determination of Specific   Gravity and Density of Petroleum Products   ( Graduated Bicapillary Pycnometer Method ) *    BP 5903 * Method for determination of Relative Density   and Density of Petroleum Products by the   Capillary-Stoppered Pycnometer Method *    2.2 . Para substâncias sólidas    ISO/R 1183 * Methods B : Methods for Determining   the Density and Relative Density of Plastics excluding   Cellular Plastics *    DIN 19683 * Determination of the Density of Soils *    3 . Picnómetro de comparação ao ar    DIN 55990 * Part 3 : Pruefung von Anstrichstoffen   und aehnlichen Beschichtungsstoffen ; Pulverlack ;   Bestimmung der Dichte *    DIN 53243 * Anstrichstoffe ; Chlorhaltige   Polymere : Pruefung *    A.4 . PRESSÃO DO VAPOR    1 . MÉTODO    Os métodos descritos são baseados nas directivas   da OCDE ( 1 ) .    1.1 . Introdução    É desejável dispor de informações referentes   à estrutura , ao ponto de fusão e ao ponto de   ebulição da substância , antes de proceder   a este ensaio .    Não existe qualquer método que seja   aplicável a toda a gama de pressões de vapor .   Por isso , são recomendados vários métodos   que vão de < 10 -3 Pa a 10 5 Pa .    De um modo geral , as impurezas têm incidência   sobre a pressão de vapor . A influência das   impurezas sobre a determinação depende em   grande parte da sua natureza . Este facto pode ser   relevante se se encontrar presente na amostra um solvente   altamente volátil .    1.2 . Definições e unidades    A pressão de vapor de uma substância é   a pressão de saturação exercida sobre   uma substância sólida ou líquida . No equilíbrio   termodinâmico , a pressão de vapor duma   substância pura é unicamente função da   temperatura .    A unidade SI de pressão que deve ser utilizada é   o Pascal ( Newton/m² ) .    Unidades correntes utilizadas antigamente e seus   factores de conversão são :    1 Torr ( mm Hg ) = 1,333 × 10² Pa    1 atmosfera ( física , atm ) = 1,013 · 10 5 Pa    1 atmosfera ( técnica , at ) = 9,81 × 10 4 Pa    1 bar = 10 5 Pa    A unidade SI de temperatura é o grau Kelvin ( K ) .    1.3 . Substâncias de referência    Não é necessário a utilização , em   todos os casos , de substâncias de referência no   estudo de uma nova substância . Estas substâncias   devem servir para verificar periodicamente   a credibilidade do método e permitir comparar   os resultados obtidos por outro método .    1.4 . Princípio dos métodos    Propõem-se cinco métodos de determinação da   pressão de vapor que são aplicáveis às   diferentes gamas de pressão de vapor . Em cada   um , a pressão de vapor é determinada a diferentes   temperaturas . Numa gama limitada de temperaturas ,   o logaritmo da pressão de vapor duma substância   pura é uma função linear do inverso da   temperatura .    1.4.1 . Método dinâmico    O método dinâmico é baseado na medida da   temperatura de ebulição que corresponde a uma   pressão específica .    Gama recomendada : de 10³ Pa até 10 5 Pa ;   entre 20 ° C e 100 ° C .    O presente método é também recomendado   para a determinação , de pontos de ebulição   que não ultrapassem 350 ° C .    1.4.2 . Método estático    Neste processo , a pressão de vapor que se   estabelece num sistema fechado em equilíbrio   termodinâmico , é determinado a uma temperatura   específica .    É aplicável ãos sólidos e líquidos que   contém um ou mais componentes .    Gama recomendada : de 10 Pa até 10 5 Pa ; entre   0 ° C e 100 ° C .    1.4.3 . Isoteniscópio    Este método normalizado é também um   método estático , mas não é usualmente   adaptável a sistemas com vários componentes .   Existe informação adicional na norma ASTM D-2879-75 .    Gama recomendada :    de 100 Pa a 10 5 Pa , entre 0 ° C e 100 ° C .    1.4.4 . Balança de pressão de vapor   Neste método determina-se a quantidade de   substância vaporizada de uma célula-reservatório   por unidade de tempo , através de um orificio de   tamanho conhecido , sob pressão reduzida , de forma   a que seja desprezável a quantidade de substância   que regressa á célula ( por ex. , por medida do   impulso imprimido a uma balança sensível pelo   jacto de vapor ou por medida da perda de peso da   célula-reservatório ) .    Gama recomendada :    de 10 -3 Pa até 1 Pa ; entre 0 ° C e 100 ° C .    1.4.5 . Método da saturação de gases    É enviada uma corrente de gás portador inerte   através da substância de modo a que ele saia   carregado de vapor saturante . Este vapor é em seguida   recolhido num colector adequado para o efeito . A   determinação da quantidade de substância   transportada para um volume conhecido de gás   portador , permite calcular a pressão de vapor a uma   determinada temperatura .    Gama recomendada :    até 1 Pa .    1.5 . Critérios de qualidade    O quadro seguinte apresenta uma comparação   dos diferentes métodos de determinação da   pressão de vapor , quanto a repetibilidade ,   reprodutibilidade , gama de medidas e normalização   existente .    QUADRO : CRITÉRIO DE QUALIDADE    Método de medição * Substância * Estimativa   de repetibilidade (1) * Estimativa de reprodutibilidade   (1) * Gama recomendade * Normalização existente *     * sólida * líquida * * * * *    1.4.1 . Método dinâmico * * X * até 25 % *   até 25 % * De 10³ Pa à 2 · 10³ Pa * - *     * * * 1 - 5 % * 1 - 5 % * De 2 · 10³ Pa à   10 5 Pa * - *    1.4.2 . Método estático * X * X * 5 - 10 % *   5 - 10 % * De 10 Pa à 10 5 Pa * - *    1.4.3 . Isoteniscópio * X * X * 5 - 10 % *   5 - 10 % * De 10² Pa à 10 5 Pa * ASTM-D 2879-75 *    1.4.4 . Balança de pressão de vapor * X * X *   5 - 20 % * até 50 % * De 10 -3 Pa à 1 Pa * - *    1.4.5 . Método da saturação de gases * X * X *   10 - 30 % * até 50 % * De < 10 -3 Pa até 1 Pa * - *    (1) Depende do grau de pureza .    1.6 . Descrição dos métodos    1.6.1 . Método dinâmico    1.6.1.1 . Aparelho    O aparelho de medida consiste num recipiente de   refluxo com refrigerante em vidro ou metal   ( ver fig. 1 ) , num dispositivo de regulação   e de medida da temperatura , bem como num   aparelho de regulação e de medição da   pressão . O aparelho de medição representado   no esquema é em vidro e compõe-se de cinco   partes principais :    Um tubo de parede parcialmente dupla , com   junta normalizada , um refrigerante , um recipiente de   arrefecimento e um orificio de admissão .    Um cilindro em vidro ligado a uma bomba   Cottrell , que é montado sobre a secção do tubo   onde se efectua a ebulição e que possui uma   superfície rugosa para evitar ressaltos da   ebulição .    Um termopar ou um termómetro de resistência   mergulhado numa pequena quantidade de óleo , inserido   num tubo de carga equipado com junta normalizada   macho na sua extremidade superior e selado na   extremidade inferior e que permite a medição da   temperatura .    Uma tubuladura que permite ligar o dispositivo   de regulação e de medição da pressão .    Um volume-tampão que é ligado ao aparelho   de medição por intermédio de um tubo capilar .    Um elemento de aquecimento que é inserido do   exterior pelo fundo do aparelho em vidro para aquecer   a coluna de ebulição . A energia necessária   é obtida por meio de um transformador-regulador   e controlada por um amperímetro .    Uma bomba de óleo que permite obter o vácuo   desejado ( entre 10² e 10 5 Pa aproximadamente ) .    Uma garrafa de azoto utilizada para obter a   pressão desejada é ligada ao aparelho por intermédio   de uma válvula e serve também para ventilar   o aparelho .    Um medidor de pressão de precisão , ligado   à tubuladura permite efectuar as medições .    1.6.1.2 . Processo de medição    Mede-se a pressão de vapor determinando o ponto de   ebulição da amostra a várias pressões , de   aproximadamente 10³ Pa a 10 5 Pa .    O ponto de ebulição ( ou o equilíbrio no caso   de mistura ) é atingido desde que a temperatura   permaneça constante ( para uma dada pressão ) .   Este processo não é aplicável às substâncias   que espumam .    Antes da medição , todos os elementos de vidro do   aparelho devem ser cuidadosamente limpos e secos e   depois evacuados . A substância é então introduzida   no aparelho . Quando os sólidos não estão em pó ,   o enchimento pode trazer problemas . No entanto é   possível remediá-los aquecendo a água da manga de   arrefecimento . Após o enchimento , o aparelho é   montado e a substância desgaseificada . É estabelecida   a mais baixa pressão desejada , o sistema de aquecimento   é posto a funcionar e o termopar ou o termómetro   de resistência e ligado a um registador . Logo que   este indique uma temperatura de ebulição fixa   à pressão constante , o equilíbrio é atingido .   Após o registo do ponto deste equilíbrio ,   estabelece-se uma pressão mais elevada . O processo   prossegue da mesma forma até que seja atingida uma   pressão de 10 5 Pa num total de cerca de 5 a 10   medições , que serão repetidas a pressões   decrescentes para verificação .    1.6.2 . Método estático    1.6.2.1 Aparelho    O aparelho de medição ( fig. 2 ) comporta não   só um sistema de aquecimento e um sistema de   arrefecimento de vidro e de metal para levar a amostra   à temperatura desejada , mas também um dispositivo   de regulação e de medida da pressão e da temperatura .    A célula que contém a amostra é ligada , por   um lado , à torneira de vácuo em aço inoxidável   e , por outro , a um tubo em U cheio de um líquido   manométrico adequado . A outra extremidade do tubo em U ,   termina numa tubuladura de três braços que conduzem ,   respectivamente , à bomba de vácuo , à garrafa   de azoto e ao medidor de pressão .    Para levar uma amostra à temperatura desejada , a   célula-reservatório assim como o corpo da torneira e   uma secção suficientemente importante do tubo em U   ( praticamente até à altura da torneira ) são   mergulhados num banho a temperatura constante . A   temperatura é medida e registada por meio dum   termopar ou dum termómetro de resistência ,   colocado próximo do exterior da célula .    Sempre que a amostra precise de ser fortemente   arrefecida , utiliza-se azoto líquido , ou uma   mistura de neve carbónica e álcool . Neste caso as   medições são efectuadas com a ajuda de um   ultracrióstato .    Uma bomba adequada permite evacuar o aparelho à   pressão desejada .    A pressão de vapor de uma substância é em geral   medida indirectamente com a ajuda de um indicador de   zero . Este indicador pode ser um tubo em U que contenha   um líquido , como é seguidamente descrito , ou ,   por exemplo , um manómetro de membrana . No banho   à temperatura controlada , a pressão de vapor   destrói o equilíbrio do líquido contido no   tubo em U . Restabelece-se o equilíbrio da pressão   por introdução de azoto no aparelho . O medidor   de precisão , que se encontra à temperatura   ambiente , permite medir a pressão do azoto   utilizado , a qual corresponde à pressão de vapor   da substância à temperatura constante correspondente .   Podem ser utilizados no tubo em U diferentes líquidos   ( mercúrio , óleos de silicone ou ftalatos ) ,   segundo a gama de pressões e o comportamento químico   da substância , na regulação do zero .    O mercúrio pode ser utilizado para a pressão   atmosférica até 10² Pa e os óleos de silicone   e os ftalatos de 10² Pa a 10 Pa ; quanto ao   manómetro de membrana , este pode ser utilizado para   pressões inferiores a 10 -1 Pa .    1.6.2.2 . Métodos de medição    Antes da medição , todos os componentes do   aparelho ( esquematizado na figura 2 ) , são   cuidadosamente limpos com o auxilio de solventes e   secas sob vácuo .    O tubo em U é cheio com o líquido desejado que   deve ser previamente desgaseificado a temperatura   elevada .    Após a introdução da substância a testar , o   aparelho é ligado e a célula é suficientemente   arrefecida . A torneira é então aberta e estabelecido   o vácuo no aparelho . Após alguns minutos a   torneira é fechada , a amostra levada à temperatura   desejada e o desvio das colunas de líquido do tubo   em U compensado pela introdução de azoto . Então   a célula é novamente arrefecida . Qualquer pressão   residual observada resultante deste arrefecimento deve-se ,   quer à presença de uma certa quantidade de ar   libertado pela amostra durante o aquecimento ( este   pode ser eliminado fazendo novamente o vácuo na   célula ) , quer a um arrefecimento insuficiente .   Por isso , é necessário utilizar azoto liquido   como refrigerante .    Quando a amostra estiver suficientemente desgaseificada ,   a dependência da pressão de vapor em relação   à temperatura , é determinada em intervalos   curtos de temperatura .    1.6.3 . Isoteniscópio    Uma descrição completa deste método   encontra-se na referência ( 2 ) . Para o princípio   do aparelho de medida veja-se a figura 3 . A semelhança   do método estático descrito no ponto 1.6.2 , o   isoteniscópio é aplicável aos sólidos   e líquidos .    No caso dos liquidos , a própria substância serve   de líquido de enchimento do manómetro auxiliar . No   caso dos sólidos , escolhe-se um dos manómetros   líquidos citados no ponto 1.6.2 , tendo em conta as   gamas de pressões e temperaturas exigidas . A esfera   do isoteniscópio para líquidos é cheia com a   substância que é desgaseificada a temperatura   elevada durante a ebulição .    A fracção da substância que é destilada   durante a desgaseificação e condensada na esfera   superior arrefecida , vai depois cair no tubo em U .   Sempre que este contenha uma quantidade suficiente de   substância desgaseificada é mergulhado com a esfera   inferior num banho termostatisado . Quando a temperatura   desejada é atingida , a pressão de vapor resultante   é medida de forma indirecta tal como no método   descrito no ponto 1.6.2 .    No caso dos sólidos , a ampola do lado da extremidade   mais longa do isoteriscópio é cheia com o líquido   desgaseificado do manómetro . O sólido é em   seguida introduzido na esfera inferior e desgaseificado a   temperatura elevada . O isoteriscópio é então   inclinado de tal modo que o líquido manométrico   possa correr para o tubo em U . A medição da   pressão de vapor em função da temperatura é   feita de acordo com a descrição apresentada   no ponto 1.6.2 .    1.6.4 . Balança de pressão de vapor    1.6.4.1 . Aparelho    A literatura descreve vários modelos deste   aparelho ( 1 ) . O aparelho representado na figura 4   ilustra bem o princípio deste método . Compõe-se   de um prato de base encimado por uma compânula de   protecção , duma bomba com dispositivo de medida   para vácuo e dum equipamento de determinação   de pressão de vapor com fixação do desvio da   agulha . O equipamento a seguir descrito é montado sobre   o prato de base :   - um forno de evaporação com manilha e canal   de alimentação rotativo . Trata-se de um recipiente   plano e cilindrico em cobre ( ou por vezes em vidro   reforçado com cobre ) , que é colocado num estribo   em cobre aparafusado numa peça de aço inoxidável   à altura do seu bordo saliente inferior . A peça de   aço inoxidável também é directamente montada   no prato de base com a ajuda de um elo de modo a poder   rodar em torno do eixo do forno . O aquecimento é   produzido por uma resistência encastrada na peça   de aço inoxidável , e assim , isolada da câmara   de vácuo ,     - a tampa do forno é em cobre e tem trés   orifícios de evaporação de secções diferentes ,   situados a 90 º uns dos outros . Por rotação do   forno , podem-se colocar o orifício escolhido ou uma   posição intermédia sob a fenda do refrigerante ,   disposto excentricamente em relação ao forno ,   o que permite centrar o feixe molecular sobre o prato da   balança ou desviá-lo . É montado um termopar ou   termómetro de resistência sobre a parede do forno   para medição da temperatura .     - a balança é um instrumento de bobina móvel .   A agulha é substituída por um pequeno tubo sobre o   qual são montados o travessão e os contrapesos .   O travessão possui um prato substituível constituido   por uma fina placa de alumínio revestida de ouro .   E ligado um fio de constante com uma espessura de   0,1 mm , aproximadamente no centro do travessão   sobre o qual é possível colocar os pesos padrões .   A pressão de vapor pode ser registada por um método   fotoeléctrico de registo do ponto zero .     - um cilindro em latão rodeia o prato da balança ,   com excepção das duas fendas , permitindo assim o   movimento do travessão e de uma abertura estreita para   a entrada do feixe molecular . A dissipação do   calor para o exterior é assegurada por uma barra de   cobre , que parte do cimo do cilindro e atravessa o   prato de base através de um tubo de aço inoxidável   termicamente isolado . A barra mergulha num vaso de   Dewar , que contém azoto líquido , sob o   prato de base .    1.6.4.2 . Método de medição    O forno de cobre é enchido com a substância e a   tampa é fechada ; o orifício do prato , a protecção   e o refrigerante são dispostos sobre o forno . A   campânula é posta no lugar e as bombas de vácuo   ligadas . A pressão a obter antes do início da   medição é de cerca de 10 -4 Pa ; a partir de 10 -2   Pa começa o arrefecimento do recinto de refrigeração .    A balança atinge , após algum tempo , uma   temperatura suficientemente baixa para que o jacto de vapor   que sai se condense sobre o prato da balança . Esta   condensação produz um sinal no registador ligado à   balança . Este sinal pode ser utilizado de duas   maneiras diferentes : no que se refere ao aparelho aqui   descrito , a pressão do vapor é determinada a partir   da pressão exercida sobre o prato da balança ( não   é necessária a massa molecular ) . Simultaneamente ,   é determinada a massa condensada e , por consequência ,   pode ser calculada a velocidade de evaporação a   partir do tempo de deposição . Isto é válido   para os aparelhos mais comuns . A pressão do vapor   pode então ser calculada a partir da velocidade de   evaporação e da massa molecular através da   fórmula de Hertz :    p = G * ( 2 ¶ RT × 10³/M )    em que ,    G = velocidade de evaporação ( kg/s.m² )    M = massa molecular ( g/mol )    T = temperatura ( K )    R = constante molar universal dos gases perfeitos   ( J/mol. K )    p = pressão de vapor ( Pa ) .    Logo que o vácuo necessário é atingido , é   feita uma série de medições à mais baixa das   temperaturas escolhidas . É aberto o orifício   necessário , o jacto de vapor atravessa a protecção   directamente montada acima da cobertura e vem embater   no prato arrefecido da balança . Este é dimensionado   de forma a que o jacto seja totalmente recolhido .   Sob a acção do momento do jacto de vapor ,   exerce-se uma força sobre o prato onde as moléculas   se condensam em contacto com a superfície fria . Esta   força faz desviar o travessão da balança da sua   posição de equilibrio . Na extremidade do travessão   há uma lamela que é observada opticamente com a   ajuda de um prisma e de dois fotodíodos .    Um circuito de controlo regula e conduz então   momentaneamente o travessão à posição de   equilíbrio . O binário necessário é registado e   corresponde , após uma aferição com a ajuda   dos pesos , à pressão de vapor da substância .    Para as medições seguintes , a temperatura é   aumentada a pequenos intervalos até ser atingido o   valor mais alto escolhido . A amostra é então   novamente arrefecida , podendo ser registada uma   segunda curva de pressão de vapor . As duas séries   de medições só são reprodutíveis se a   substância for suficientemente pura . Se a terceira   tentativa não confirmar os resultados da segunda , é   possível que a substância se decomponha às   temperaturas escolhidas para a determinação .    1.6.5 . Método da saturação de gases    1.6.5.1 . Aparelho    O aparelho utilizado neste método compreende um   certo número de elementos que estão esquematizados   na figura 5 e que são a seguir descritos ( 1 ) .    Gás inerte : o gás portador não deve reagir com   a substância do ensaio .    O azoto serve para a maioria dos casos , mas outros   gases podem ser utilizados , devendo ser , no entanto ,   sempre utilizados secos ( figura 5 , n º 4 : sonda   de humidade relativa ) .    Controlo do fluxo gasoso : é indispensável um   sistema adequado para assegurar um fluxo constante e   suficiente através da coluna de saturação .    Colectores de vapor : a sua escolha depende das   características da amostra assim como do método de   análise utilizado . O vapor deve ser recolhido   quantitativamente e de forma a permitir a análise   posterior . Utilizam-se para certas substâncias   colectores , que contenham líquidos tais como o hexano   ou o etilenoglicol . Para outros , recorre-se a   absorventes sólidos .    Permutador de calor : pode ser necessário para   determinações a diferentes temperaturas .    Coluna de saturação : após ter sido posta em   solução , a substância é repartida num suporte   inerte e em seguida introduzida na coluna de saturação .   As dimensões desta e a velocidade de escoamento devem   ser escolhidas de modo a assegurar a saturação   completa do gás portador . A coluna também deve ser   termostatizada . Para as determinações que se efectuem   a temperaturas superiores a 20 ° C , o espaço entre   as colunas e os colectores deve ser aquecido para   impedir a condensação da substância .    1.6.5.2 . Método de medição    Preparação da coluna de saturação :    Após ter sido posta em solução num solvente   volátil , a substância de ensaio é adicionada a   uma dada quantidade do material de suporte . A quantidade   de substância adicionada deve ser suficiente para   manter a saturação durante todo o tempo do ensaio .   O solvente é completamente evaporado ao ar ou num   evaporador rotativo e o material bem homogeneizado é   introduzido na coluna . Uma vez a amostra termostatizada ,   faz-se passar uma corrente de azoto através   do aparelho .    Medição :    Os colectores são ligados aos tubos de saída da   coluna , e o tempo é registado . O caudal é   controlado no início da experiência e a intervalos   regulares , através de um conta-bolhas ( ou ainda   continuamente , com a ajuda de um fluxómetro   mássico ) .    É necessário medir a pressão à saída   da coluna de saturação :    a ) Quer intercalando um medidor de pressão entre   o saturador e os colectores ( isto devido ao aumento   do espaço morto e à superfície de absorção ) ;    b ) Quer determinando as baixas de pressão através   dos colectores utilizados em função do débito   numa experiência separada ( este método pode   revelar-se pouco satisfatório para os colectores   de líquidos ) .    O tempo que é preciso para recolher a quantidade   de substância necessária nos diferentes métodos de   análise é determinado durante ensaios preliminares   ou por estimativa . Antes de calcular a pressão de   vapor a dada temperatura , convém efectuar ensaios   preliminares para determinar o débito máximo que   saturará completamente o gás portador com o vapor   da substância . Para isso é necessário que o gás   portador passe pelo saturador com lentidão suficiente ,   de forma a que nenhuma velocidade inferior forneça   uma pressão de vapor calculada mais elevada .    A escolha do método de análise será feita em   função da natureza da substância a testar ( por   exemplo , cromatografia em fase gasosa ou gravimetria ) .    É calculada a quantidade de substância transportada   num volume conhecido de gás portador .    1.6.5.3 . Cálculo da pressão de vapor    A pressão de vapor é calculada a partir da   densidade do vapor ( m/V ) , através da equação   seguinte :    p = m/V × RT/M    em que ,    p = pressâo de vapor ( Pa )    m = massa da substância absorvida ( g )    V = volume de gás saturado ( m³ )    R = constante molar universal dos gases perfeitos   ( J/mol. K )    T = temperatura ( K )    M = massa molecular ( g/mol )    Os volumes medidos devem ser corrigidos para se   ter em conta as diferentes pressões e a temperatura   entre o fluxómetro e o saturador termostatizado .   Se o fluxómetro é colocado a seguir ao colector de   vapor , podem ser necessárias correcções para   se ter em conta a evaporação eventual de produtos   contidos nos colectores ( 1 ) .    2 . RESULTADOS    Qualquer que seja o método escolhido , a pressão   do vapor deve ser determinada no mínimo a duas   temperaturas . São preferíveis três ou mais   valores de temperatura entre 0 ° C e 50 ° C para   verificar a linearidade da curva de pressão de vapor .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    Se possível , incluir no relatório , as   especificações seguintes :     - descrição da substância ( identificação   e impurezas ) ,     - no mínimo dois valores para a pressão de vapor   e para a temperatura , de preferência entre 0 ° C e   50 ° C . Devem ser igualmente incluídos todos os   valores medidos e uma curva log p em função de l/T .   E ainda necessária uma estimativa da pressao de   vapor a 20 ° C ou a 25 ° C ,    Em caso de transição ( mudança de estado ,   decomposição ) deve indicar-se o seguinte :     - descrição da alteração ,     - temperatura à qual aquela ocorre à   pressão atmosférica ,     - pressão de vapor a 10 ° C e a 20 ° C abaixo   da temperatura de transição assim como a 10 ° C   e a 20 ° C acima daquela temperatura ( excepto   na transição do estado sólido ao estado gasoso ) .    Devem ser assinaladas todas as informações e   notas úteis para a interpretação dos resultados .    Deve ser especificado o método utilizado .    4 . REFERÊNCIAS    ( 1 ) OECD Paris , 1981 , Test Guideline 104 ,   Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .     ( 2 ) OECD Paris , 1981 , Test Guideline 104 . ref.   ( 4 ) . Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .    Apéndice    Figura 1    Aparelho para medição da pressão de vapor ,   segundo o método dinâmico : v. JO    Figura 2    Aparelho para medição da pressão de vapor ,   segundo o método estático : v. JO    Figura 3    Isoteniscópio : v. JO    Figura 4    Aparelho para determinação da curva da pressão   do vapor , segundo o método da balança de   pressão de vapor : v. JO    Figura 5    Modelo de aparelho que serve para a determinação   da pressão de vapor , pelo método da saturação   de gases : v. JO    A.5 . TENSÃO SUPERFICIAL    1 . MÉTODO    Os métodos descritos baseiam-se nas directivas   da OCDE ( 1 ) .    1.1 . Introdução    Os métodos descritos aplicam-se à determinação   da tensão superficial de soluções aquosas .    Antes de se efectuarem estes ensaios , é útil   possuir sobre a substância informações preliminares   quanto à solubilidade na água , à estrutura , às   propriedades na hidrólise e à concentração   crítica de formação de micelas .    Os métodos seguintes aplicam-se à maioria das   substâncias químicas , qualquer que seja o seu   grau de pureza .    A determinação da tensão superficial pelo   método do tensiómetro de anel é limitada às   soluções aquosas que tenham uma viscosidade   dinâmica inferior a cerca de 200 m Pa s .    1.2 . Definições e unidades    A entalpia livre de superfície por unidade de   superfície é designada por tensão superficial .   Esta exprime-se por :    N/m ( unidades do SI )    mN/m ( subunidade do SI )    1N/m = 10³ dines/cm    1mN/m = 1 dine/cm no sistema CGS cuja utilização   não é autorizada .    1.3 . Substâncias de referência    Não é necessário utilizar substancias de   referência em todos os casos em que se estuda uma   nova substância . É principalmente na aferição   periódica do método e na comparação dos   resultados quando outro método é aplicado que ele   é necessário .    São dadas substâncias de referência cobrindo   uma vasta gama de tensões superficiais nas   referências ( 1 ) e ( 2 ) .    1.4 . Princípio dos métodos    Os métodos são baseados na medição da   força máxima que é necessario exercer   verticalmente sobre um estribo ou um anel em contacto   com a superfície do líquido a estudar , colocado   em recipiente adequado de forma a separá-lo desta   superfície , ou sobre uma placa , com um dos   bordos em contacto com a superfície , a fim   de assegurar o levantamento da película formada .    1.5 . Critérios de qualidade    Os métodos dão uma maior precisão do que a   provavelmente necessária para o controlo da   protecção do ambiente .    1.6 . Descrição dos métodos    1.6.1 . Método da placa    Ver ISO 304 ( substâncias tensioactivas -   determinação da tensão superficial por   arrancamento das películas líquidas ) .    1.6.2 . Método do estribo    Ver ISO 304 ( substâncias tensioactivas -   determinação da tensão superficial pelo   método do arrancamento das películas líquidas ) .    1.6.3 . Método do anel    Ver ISO 304 ( substâncias tensioactivas -   determinação da tensão superficial por   levantamento das películas liquidas ) .    1.6.4 . Método do anel harmonizado OCDE    1.6.4.1 . Aparelho    Os tensiometros comerciais são adequados . São   constituídos pelos seguintes elementos :     - porta-amostra móvel ,     - dinamometro ,     - corpo de medição ( anel ) ,     - recipiente de medida .    1.6.4.1.1 . Porta-amostra móvel .    Este serve de suporte ao recipiente de medição   termostatizado , que contém o líquido a   ensaiar . E montado sobre o mesmo suporte que o   dinamómetro .    1.6.4.1.2 . Dinamómetro .    Este ( ver figura ) é colocado sobre o porta-amostra .   O erro na determinação da força não deve   exceder ± 10 -6 N , o que equivale a um limite de erro   de ± 0,1 mg na determinação da massa . Na maioria   dos casos , a escala de medidas dos tensiómetros   disponíveis no comércio é calibrada em mN/m ,   podendo então ler-se directamente a tensão superficial   em mN/m com uma precisão de 0,1 mN/m .    1.6.4.1.3 . Corpo de medida ( anel )    O anel é habitualmente constituído por um fio   de platina ou de platina-irídio de cerca de 0,4 mm de   espessura e um perímetro médio de 60 mm . Este anel   é suspenso horizontalmente do estribo de montagem   que é ligado por uma haste metálica ao   dinamómetro ( ver figura ) .    Figura    Corpo de medição : v. JO     ( todas as dimensões são expressas em   milímetros )    1.6.4.1.4 . Recipiente de medida    Este contém a solução a testar e deve ser   um recipiente em vidro termostatizado . Deve ser   concebido de modo a que durante a determinação ,   a temperatura do líquido e da fase gasosa acima   da sua superfície , se mantenha constante e que não   haja evaporação . Recipientes cilíndricos de   vidro de diâmetro interior mínimo de 45 mm ,   satisfazem estas exigéncias .    1.6.4.2 . Preparação do aparelho    1.6.4.2.1 . Limpeza    Os recipientes de vidro devem ser limpos com cuidado .   Quando for necessário , devem ser lavados com uma   mistura sulfocrómica , depois com ácido fosfórico   xaroposo ( 83 a 98 % em peso de H3PO4 ) , passados   abundantemente por água corrente e em seguida com   água destilada , até terem uma reacção neutra ,   por fim são secos ou lavados com uma pequena porção   do líquido em estudo .    O anel será em primeiro lugar lavado abundantemente   com água corrente para eliminar todos os vestígios   de substâncias solúveis em água , mergulhado   alguns segundos na mistura sulfocrómica ,   passado com água bidestilada até se obter uma   reacção neutra e por fim , rapidamente secos à   chama de metanol .    Nota :    Os vestígios de substâncias que não são   dissolvidas ou destruídas pela mistura sulfocrómica   ou pelo ácido fosfórico , como os silicones ,   devem ser eliminados com a ajuda de um solvente   orgânico adequado .    1.6.4.2.2 . Aferição do aparelho    A aferição do aparelho consiste em verificar o   zero e em regulá-lo de modo a que a indicação   dada pelo aparelho permita uma determinação   fidedigna em mN/m .    Montagem :    O aparelho será nivelado , por exemplo , usando um   nível de bolha de ar colocado sobre o suporte ,   ajustando o parafuso de regulação .    Regulação do ponto zero :    Após montagem do anel no aparelho e antes da   sua imersão no líquido , o indicador do tensiómetro   deve ser regulado a zero ; verifica-se o paralelismo do   anel utilizando a superfície do líquido como espelho .    Aferição :    A aferição do aparelho pode ser efectuada por um   dos métodos seguintes :    a ) Com a ajuda de uma massa : este processo utiliza   cavaleiros de massa conhecida ( entre 0,1g e 1,0g )   que são colocados sucessivamente sobre o anel . O   factor de aferição F a , pelo qual se   multiplicam todas as leituras do instrumento , será   determinado pela equação ( 1 ) .     ( 1 ) F a = s r/s a    em que ,    s r = m.g/2b ( mN/m )    m = massa de cavaleiro ( g )    g = aceleração da gravidade ( 981 cm.s-2 do   nível do mar )    b = perímetro médio do anel ( cm )    s a = leitura do tensiómetro após colocação   do cavaleiro no anel ( mN/m ) ;    b ) Com a ajuda de água : este processo utiliza   água pura cuja tensão superficial é , por exemplo ,   de 72,3 mN/m a 23 ° C . É mais rápido do que a   aferição com os cavaleiros , mas comporta sempre   o risco de que a tensão superficial da água seja   alterada pelos vestígios de substâncias   tensioactivas .    O factor de aferição F b , pelo qual é   necessário multiplicar todas as leituras do   aparelho , determina-se pela equação ( 2 ) :     ( 2 ) F b = s o/s g    s o = valor dado na literatura para a tensão   superficial da água ( mN/m ) à temperatura   escolhida para o ensaio .    s b = valor medido da tensão superficial da água   ( mN/m ) a essa mesma temperatura .    1.6.4.3 . Preparação das amostras    As soluções aquosas das substâncias são   preparadas tendo em conta as concentrações   requeridas . É imprescindível que a dissolução   da substância seja completa .    A solução assim preparada deve ser mantida a uma   temperatura constante ( ± 0,5 ° C ) . Tendo em   conta que a tensão superficial duma solução   colocada no recipiente de medida se altera após   certo tempo , devem ser feitas várias medições   em momentos diferentes e é necessário traçar uma   curva das tensões superficiais em função do   tempo . Quando já não houver alterações , foi   atingido o estado de equilíbrio .    A poeira ou os vapores doutras substâncias   falseiam a medição . O trabalho deve pois ser efectuado   sob campânula de protecção .    1.6.5 . Condições do ensaio    As medições devem ser feitas a uma temperatura   de cerca de 20 ° C , com variações não   superiores a ± 0,5 ° C .    1.6.6 . Desenvolvimento do ensaio    Põe-se no recipiente de medida , cuidadosamente   limpo , a solução a medir , tendo o cuidado de   evitar a formação de espuma ; em seguida , o   recipiente de medida é colocado sobre o suporte   que e elevado até que o anel fique imerso por baixo da   superfície da solução . O suporte é então   baixado gradual e uniformemente ( a uma velocidade de   cerca de 0,5 cm/minuto ) , para retirar o anel da   superfície do líquido , e isto até que uma força   máxima seja atingida . A camada de líquido agarrada ao   anel não deve ser retirada . Uma vez concluídas as   determinações , o anel será de novo imerso   abaixo da superfície e as determinações repetidas   até que se chegue a uma tensão superficial constante .   Em cada determinação será registado o tempo que   decorre após a transferéncia da solução   para o recipiente . As leituras serão   efectuadas no ponto do valor máximo da força   necessária para retirar o anel da superfície   do líquido .    2 . RESULTADOS    Para calcular a tensão superficial , multiplica-se   primeiro o valor lido no aparelho em mN/m pelo factor   de aferição F a ou F b ( segundo o processo de   aferição utilizado ) . Obtém-se então um valor que   é somente uma aproximação e que deve pois ser   corrigido .    Harkins e Jordan ( 3 ) estabeleceram de modo empírico   os factores de correcção para os valores da tensão   superficial obtidos pelo método do anel , factores   que dependem das dimensões do anel , da densidade do   líquido e da sua tensão superficial .    Dado que é laboriosa a determinação do factor de   correcção próprio para cada medida a partir das   tabelas de Harkins e Jordan , é autorizada a   utilização de um processo simplificado de leitura   directa da tensão superficial corrigida , através   da tabela que é apresentada a seguir para soluções   aquosas ( Recorre-se à interpolação para as leituras   que se situam entre dois valores da tabela ) .    QUADRO : CORRECÇÃO DOS VALORES MEDIDOS DA   TENSÃO SUPERFICIAL    Válido somente para soluções   aquosas : r = 1 g/cm³    R = 9,55 mm ( raio médio do anel )    r = 0,185 mm ( raio do fio que constitui o anel )    Valor experimental ( mN/m ) * Valor corrigido   ( mN/m ) *     * Aferição com cavaleiros ( ver 1.6.4.2.2 . ( a ) ) *   Aferição com água ( ver 1.6.4.2.2 . ( b ) ) *    20 * 16,9 * 18,1 *    22 * 18,7 * 20,1 *    24 * 20,6 * 22,1 *    26 * 22,4 * 24,1 *    28 * 24,3 * 26,1 *    30 * 26,2 * 28,1 *    32 * 28,1 * 30,1 *    34 * 29,9 * 32,1 *    36 * 31,8 * 34,1 *    38 * 33,7 * 36,1 *    40 * 35,6 * 38,2 *    42 * 37,6 * 40,3 *    44 * 39,5 * 42,3 *    46 * 41,4 * 44,4 *    48 * 43,4 * 46,5 *    50 * 45,3 * 48,6 *    52 * 47,3 * 50,7 *    54 * 49,3 * 52,8 *    56 * 51,2 * 54,9 *    58 * 53,2 * 57,0 *    60 * 55,2 * 59,1 *    62 * 57,2 * 61,3 *    64 * 59,2 * 63,4 *    66 * 61,2 * 65,5 *    68 * 63,2 * 67,7 *    70 * 65,2 * 69,9 *    72 * 67,2 * 72,0 *    74 * 69,2 * - *   76 * 71,2 * - *    78 * 73,2 * - *    Esta tabela foi estabelecida baseando-se na   correcção de Harkins- Jordan e corresponde à   da norma DIN ( DIN 53914 ) referentes à água e   às soluções aquosas ( densidade r = 1 g/cm³ )   e para um anel disponível no comércio cujas   dimensões são R = 9,55 mm ( raio médio do   anel ) e r = 0,185 mm ( raio do fio que constitui o   anel ) . A tabela dá os valores corrigidos das   determinações da tensão superficial efectuadas   após aferição por meio de cavaleiros ou de   água pura .    Uma outra alternativa consiste , sem aferição   prévia , no cálculo da tensão superficial   segundo a seguinte fórmula :     s = f × F/4 ¶ R    em que ,    F = força medida no dinamómetro no ponto de   ruptura da película    R = raio do anel    f = factor de correcção ( 1 ) .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    O relatório deve conter , se possível , as   informações seguintes :     - método utilizado : método harmonizado do   tensiómetro de anel , ISO ou OCDE ,     - tipo de água ou solução utilizada ,     - descrição precisa da substância testada   ( identificação e impurezas ) ,     - resultados das determinações : tensão   superficial ( lida ) abrangendo as diferentes leituras e   a sua média aritmética , assim como o valor médio   corrigido ( tendo em conta o factor equipamento e a   tabela de correcção ) ,     - concentração da solução ,     - temperatura do ensaio ,     - idade da solução utilizada , em particular o   espaço de tempo entre a preparação da solução   e a medição ,     - evolução da tensão superficial da solução   em função do tempo a partir do momento em que foi   transferida para o recipiente de medida ,     - todas as informações e observações   de interesse para a interpretação dos   resultados devem ser assinalados , nomeadamente no que   se refere às impurezas e ao estado físico da   substância .    4 . REFERÊNCIAS     ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 115 -   Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .     ( 2 ) Pure and Applied Chem , Vol. 48 , 1976 , p. 511 .     ( 3 ) Harkins , W.D. , Jordan , H.F. , J. Amer .   Chem . Soc. , Vol. 52 , 1930 , p. 1751 .    A.6 . HIDROSSOLUBILIDADE    1 . MÉTODOS    Os métodos descritos baseiam-se nas directivas da   OCDE ( 1 ) .    1.1 . Introdução    É útil dispor de informações sobre a   substância , a sua fórmula de estrutura , a   pressão de vapor , a constante de dissociação   e hidrólise ( função do pH ) , para realizar   este ensaio .    Um só método não é suficiente para cobrir   toda a gama de solubilidades na água .    O método não é aplicável às substâncias   voláteis .    Os dois métodos de ensaio descritos permitem cobrir   a seguinte gama :     - a primeira , a seguir denominada « método   por eluição em coluna » , aplica-se às   substâncias essencialmente puras , de fraca   solubilidade ( < 10-2 g/l ) e estáveis na água ,     - a segunda , a seguir denominada « método do   frasco » , aplica-se às substâncias   essencialmente puras , de maior solubilidade   ( > 10-2 g/l ) e estáveis na água .    A hidrossolubilidade das substâncias pode ser   consideravelmente afectada pela presença de impurezas .    1.2 . Definições e unidades    A hidrossulubilidade duma substância é a   concentração mássica de saturação da   substância na água a uma dada temperatura .   Exprime-se em unidades de massa por volume da   solução .    A unidade SI é o kg/m³ ( g/l também pode ser   utilizado ) .    1.3 . Substâncias de referência    Não é necessária a utilização de   substâncias de referência nos casos em que se   estuda uma nova substância . Elas devem servir   essencialmente para controlar periodicamente o método   e permitir a comparação dos resultados desde que um   outro método seja utilizado .    1.4 . Princípio do método de ensaio    A quantidade aproximada da amostra e o tempo   necessário para obter a concentração màssica   de saturação devem ser determinados através   de um ensaio preliminar simples .    1.4.1 . Método por eluição sobre coluna    Este método é baseado na eluição da   substância de ensaio com água numa microcoluna   cheia com um material de suporte inerte como esferas   de vidro , silica-gel ou areia e carregada com um   excesso de substância a testar . A hidrossulubilidade   é determinada quando a concentração mássica do   eluído é constante . É indicada por um patamar   de concentração em função do tempo .    1.4.2 . Método do frasco    Neste método , a substância ( se sólida ,   deve ser pulverizada ) é dissolvida na água a uma   temperatura um pouco superior à do ensaio .   Quando é atingida a saturação , a mistura é   arrefecida , mantida à temperatura de ensaio e   agitada até que seja atingido o equilíbrio ( 2 ) .   Nesse momento , a concentração mássica da substância   na solução aquosa , que não deve conter   qualquer partícula não dissolvida , é   determinada de acordo com um método analítico   adequado .    1.5 . Critérios de qualidade    1.5.1 . Reprodutibilidade    Pelo que foi referido sobre o método de eluição   em coluna , a reprodutibilidade susceptível de ser   obtida é inferior a 30 % ; quanto ao método do   frasco , ela deve ser inferior a 15 % .    1.5.2 . Sensibilidade    Depende do método de análise , mas a concentração   mássica pode ser determinada até um mínimo de   10 -6 g/l .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Condições de ensaio    O ensaio deve ser efectuado de preferência a   20 ° C ± 0,5 ° C . Se se receia uma incidência   da temperatura na solubilidade ( > 3 % /° C ) ,   utilizar-se-ão igualmente duas outras temperaturas ,   pelo menos 10 ° C acima e abaixo da temperatura   inicialmente escolhida . Neste caso a temperatura é   ajustada a ± 0,1 ° C . Será mantida constante a   temperatura escolhida em todas as partes relevantes   da aparelhagem .    1.6.2 . Ensaio preliminar    Numa proveta de 10 ml , calibrada e tapada ,   adicionar a cerca de 0,1 g da amostra ( as substâncias   sólidas devem ser pulverizadas ) volumes crescentes   de água destilada à temperatura ambiente , segundo   a progressão indicada no quadro seguinte :    0,1 g solúvel em « x » ml de água *   0,1 * 0,5 * 1 * 2 * 10 * 100 * > 100 *    Solubilidade aproximada ( g/1 ) * > 1 000 *   1 000-200 * 200-100 * 100-50 * 50-10 * 10-1 * < 1 *    Após cada adição da quantidade de água   indicada , agitar vigorosamente a mistura durante   dez minutos , depois verificar visualmente se contém   partículas não dissolvidas . Então , se após   adição de 10 ml de água , a amostra ou alguma   porção não se encontrar dissolvida , é   transferida para outra proveta graduada de 100 ml ;   enche-se esta de água até 100 ml e agita-se . Se   a solubilidade é fraca , o tempo necessário   para dissolver a substância pode ser consideravelmente   longo ( prever 24 h ) . A solubilidade aproximada   está indicada no quadro anterior com o volume de   água ao qual se efectua a dissolução completa   da amostra . Se a substância permanece insolúvel ,   proceder a uma nova diluição a fim de se saber   se vai ser utilizado o método de eluição em   coluna ou o método por solubilidade em frasco .    1.6.3 . Método por eluição em coluna    1.6.3.1 . Material de suporte , solvente e eluente    Neste método , o material de suporte deve   ser inerte . Podem utilizar-se para o efeito esferas   de vidro ou sílica . Para aplicar a substância   de ensaio ao suporte , utiliza-se um solvente volátil   adequado , de bomgrau de pureza . Como eluente   ou solvente utiliza-se água bidestilada , obtida   em aparelhagem de vidro ou quartzo .    Nota :    Não utilizar água proveniente directamente   de um permutador de iões orgânico .    1.6.3.2 . Carga do material de suporte    Pesar e transferir cerca de 600 mg de material de   suporte para um balão de fundo redondo de 50 ml .    Dissolver uma quantidade adequada e pesada de   substância de ensaio , no solvente escolhido .   Juntar ao suporte uma quantidade conveniente dessa   solução . O solvente deve ser completamente   evaporado , por exemplo em evaporador rotativo , a fim   de assegurar a saturação do suporte em água ,   saturação que , de outro modo não se fará ,   devido ao efeito de partição à superfície .    A impregnação do suporte pode causar problemas   ( resultados errados ) , se a substância de ensaio   for depositada sob a forma de óleo ou em fase   cristalina diferente . Este problema deve ser examinado   experimentalmente .    Deixar o suporte assim impregnado mergulhado cerca de   2 horas em cerca de 5 ml de água e depois   transferir a suspensão para a microcoluna . Pode   igualmente verter-se nesta o suporte carregado   a seco , tendo sido a microcoluna   previamente cheia de água e depois   equilibrada durante cerca de 2 horas .    Técnica :    A eluição da substância a partir do suporte   pode efectuar-se segundo dois processos diferentes :     - bomba de circulação ( Ver figura 1 ) ,     - reservatório de nível ( Ver figura 4 ) .    1.6.3.3 . Método por eluição em coluna com   bomba de circulação    Aparelhagem :    É indicada na figura 1 uma montagem esquemática   dum sistema correntemente utilizado . A figura 2   mostra uma microcoluna adequada , embora qualquer   outra dimensão seja aceitável , na condição de   satisfazer os critérios de   reprodutibilidade e de sensibilidade . A coluna   deve ter um volume livre superior correspondente no   mínimo a 5 vezes o volume do suporte , mais um   volume mínimo de cinco amostras . Pode no entanto   reduzir-se esta dimensão se se utilizar um   acréscimo de solvente para substituir os cinco   volumes referidos , eliminados com as impurezas .    A coluna deve ser ligada a uma bomba de circulação   capaz de assegurar um débito aproximado de 25 ml/h .   Esta bomba é equipada com ligações em   politetrafluoretileno e/ou vidro . A coluna e a bomba   quando ligadas devem permitir a recolha de amostras   do efluente e o equilíbrio à pressão atmosférica   do reservatório . O material na coluna é suportado   por um pequeno tampão em lã de vidro ( 5 mm )   que serve igualmente para filtrar as partículas .   Como bomba de circulação pode utilizar-se   nomeadamente uma bomba peristáltica ( vigiar para   que contaminações ou absorções não afectem   o material que constitui o tubo ) ou uma bomba de   membrana .    Processo de medição :    A circulação na coluna e iniciada , sendo o   débito recomendado de 25 ml/h aproximadamente   ( cerca de 10 volumes de enchimento por hora para   a coluna acima descrita ) . Os cinco primeiros volumes   ( mínimo ) são rejeitados a fim de eliminar as   impurezas solúveis na água . Após o que ,   ligar a bomba de circulação , fazendo   funcionar o aparelho até atingir o estado de   equilíbrio que é definido pelas cinco amostras   sucessivas cujas concentrações não diferem   de modo aleatório de ± 30 % . Estas amostras   devem ser separadas umas das outras por um intervalo   de tempo correspondente à passagem de pelo menos   10 volumes através do enchimento .    1.6.3.4 . Método de eluição em coluna com   reservatório tampão    Aparelhagem ( Ver figuras 3 e 4 ) :    Reservatório : a ligação ao reservatório   é assegurada por uma junta esmerilada , ligada a um   tubo em politetrafluoretileno . Debito recomendado :   cerca de 25 ml/hora . Os sucessivos eluídos serão   recolhidos e analisados seguindo o método escolhido .    Processo de medição :    As fracções provenientes do intervalo médio   de eluição , para as quais as concentrações   são constantes ( ± 30 % ) em pelo menos cinco   fracções consecutivas , serão utilizadas para   determinar a hidrossolubilidade .    Repetir-se-á a operação com o débito   reduzido a metade . Se os resultados das duas   operações forem coincidentes , o ensaio é   considerado satisfatório ; se se constatar uma   solubilidade aparentemente mais elevada no débito   inferior , reduzir-se-á novamente a metade , até   que duas operações sucessivas dêem a mesma   solubilidade .    Nos dois casos ( bomba de circulação ou   reservatório de água ) , observar nas fracções   a eventual presença de matéria coloidal através   da detecção do efeito de Tyndall ( dispersão   da luz ) . A presença de tais partículas falseia   os resultados e o ensaio deve ser repetido melhorando   a acção de filtração na coluna . Examinar   o pH de cada amostra . Efectuar uma segunda operação   à mesma temperatura .    1.6.4 . Método por solubilidade em frasco    1.6.4.1 . Aparelhagem    Este método requer o seguinte material :     - material de vidro e equipamento normal de   laboratório ,     - dispositivo adequado para agitar as soluções   a temperaturas constantes e controladas ,     - centrifuga termostatizada , se necessário ,   em presença de emulsão ,     - equipamento para a determinação analítica .    1.6.4.2 . Processo de medição    Avaliar , a partir de um ensaio preliminar , a   quantidade de produto necessário para saturar um   volume escolhido de água . Este depende do método   analítico e do intervalo de solubilidade . Pesar   cerca de cinco vezes a quantidade do material atrás   determinado e introduzi-lo em três recipientes de   vidro com rolha também de vidro ( por exemplo :   tubos de centrífuga ou balões ) . Juntar a cada   recipiente o volume de água escolhido e fechá-los   então hermeticamente . Agitar os recipientes   fechados a 30 ° C ( utilizar um dispositivo de   agitação susceptível de operar a temperatura   constante , por exemplo , agitação magnética   em banho-maria controlado por termóstato ) . No   dia seguinte , retirar um dos recipientes e reequilibrar   durante 24 horas à temperatura do ensaio , agitando   de vez em quando . O conteúdo do recipiente é em   seguida centrifugado à temperatura do ensaio e é   determinada a concentração do composto na fase   aquosa límpida através de um método analítico   adequado . Os dois outros balões são tratados do   mesmo modo após um primeiro equílibrio a 30 ° C ,   durante dois e três dias respectivamente . Se as   concentrações de pelo menos os dois últimos   recipientes concordarem com a reprodutibilidade   exigida , o ensaio é considerado satisfatório .   Repetir o conjunto de operações , utilizando   tempos de equílibrio mais longos se os resultados   dos recipientes 1 , 2 e 3 acusarem uma tendência   para aumentar de valores .    O pH de cada amostra deve ser anotado .    1.6.5 . Análise    É preferível para estas determinações   um método de análise específico da substância   dado que pequenas quantidades de impurezas solúveis   podem provocar erros sensíveis na solubilidade   medida . Exemplos de métodos : cromatografia em fase   gasosa ou líquida , métodos titulimétricos ,   fotométricos ou voltamétricos .    2 . RESULTADOS    2.1 . Método por eluição em coluna    O valor médio determinado em pelo menos cinco   amostras consecutivas retiradas durante o estádio de   saturação deve ser calculado para cada operação ,   tal como o desvio padrão .    2.2 . Método do frasco    Os resultados individuais devem ser indicados para   cada um dos 3 frascos ; faz-se a média e   exprimem-se em unidades de massa por volume da   solução os resultados considerados constantes   ( reprodutibilidade inferior a 15 % ) ; esta   operação pode exigir a conversão das unidades   de massa em unidades de volume utilizando a densidade ,   sempre que a solubilidade é muito elevada ( > 100 g/l ) .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    3.1 . Método por eluição em coluna    O relatório deve conter , se possível , a   indicação dos resultados do ensaio preliminar ,   assim como os seguintes dados :     - descrição precisa da substância   ( identificação e impurezas ) ,     - concentrações individuais , débito e pH   de cada amostra ,     - desvios médios e padrões de pelo menos cinco   amostras no patamar de saturação de cada   operação ,     - média de duas operações aceitáveis   consecutivas ,     - temperatura da água durante o processo de   saturação ,     - método de análise utilizado ,     - natureza do material de suporte utilizado ,     - quantidade de substância depositada no suporte ,     - solvente utilizado     - evidência instabilidades químicas eventuais   da substância durante o ensaio e método utilizado ,     - todos os dados pertinentes para a interpretação   dos resultados .    3.2 . Método do frasco    O relatório deve conter , se possível , os   seguintes dados :     - descrição precisa da substância   ( identificação e impurezas ) ,     - resultados analíticos individuais e média ,   desde que seja determinado mais do que um valor para o   mesmo recipiente ,     - pH de cada amostra ,     - média dos valores para os diferentes recipientes   em concordância ,     - temperatura do ensaio ,     - método analítico utilizado ,     - evidência de eventuais instabilidades   químicas da substância durante o ensaio e método   utilizado ,     - todos os dados pertinentes para a interpretação   dos resultados .    4 . REFERêNCIAS     ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 105 .   Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .     ( 2 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 116 .   Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .    Apêndice    Figura 1    Esquema do dispositivo de ensaio : v. JO    Figura 2    Microcoluna tipo : v. JO    Figura 3    Microcoluna tipo : v. JO    Figura 4    Dispositivo de ensaio para a determinação   da hidrossolubilidade des substâncias pouco solúveis   e pouco voláteis : v. JO    A.7 . LIPOSSOLUBILIDADE    1 . MÉTODO    O método descrito baseia-se nas directivas da   OCDE ( 1 ) .    1.1 . Introdução    É útil , para a realização deste ensaio ,   dispor-se de dados preliminares sobre o coeficiente   de partição , hidrossolubilidade , fórmula   de estrutura e estabilidade da substância a   50 ° C . Este método só é aplicável às   substâncias essencialmente puras , estáveis a   50 ° C e não significativamente voláteis nas   mesmas condições .    O método não é conveniente para as   substâncias que reagem com os triglicéridos   nas condições do ensaio .    1.2 . Definições e unidades    A fracção mássica duma substância que forma   uma fase homogénea com uma gordura líquida ( óleo )   sem dar origem a reacções químicas , é   definida como lipossolubilidade . O valor máximo desta   fracção chama-se fracção mássica de   saturação e é dependente da temperatura .    A fracção mássica de saturação duma   substância deve ser indicada em miligramas por   100 gramas de gordura padrão , a 37 ° C ±   0,5 ° C .    Existe a seguinte relação entre a solubilidade   em grama por 100 gramas de solução ( S' ) e a   solubilidade em gramas por 100 gramas de solvente   ( S ) :    S = ( 100 × S' ) / ( 100 - S' ) g/100 g de   gordura padrão    Multiplicando S por 1000 , obtém-se a solubilidade   em miligramas por 100 gramas de gordura padrão .    1.3 . Substâncias de referência    As substâncias de referência não têm   necessariamente de ser utilizadas em todos os casos de   análise de uma nova substância . Elas servem   essencialmente para verificar periodicamente a   reprodutibilidade do método e permitir comparar   os resultados quando se utiliza um método diferente .    1.4 . Princípio do método    A substância é adicionada a uma gordura-padrão   líquida e em agitação . A quantidade de substância   é posta em excesso . A quantidade dissolvida é   determinada por um método analítico   adequado .    1.5 . Critérios de qualidade    1.5.1 . Especificidade    Presentemente não se conhece a reprodutibilidade   da medição .    Os resultados aplicam-se às gorduras-padrão   e a substâncias relativamente puras . Mesmo   a 37 ° C as gorduras podem formar emulsões ou   suspensões finas de substâncias sólidas .   Como estas interferem com a determinação   da fracção mássica , deve ser evitada a sua   formação .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparação    1.6.1.1 . Equipamento    Equipamento necessário :     - material de vidro normal de laboratório ,     - balança ,     - centrífuga termostatizada ,     - agitador em combinação com um sistema de   controlo da temperatura ,     - termostato .    1.6.1.2 . Gorduras-padrão    É necessária a utilização de gorduras-padrão   facilmente especificáveis . No apêndice consta um   exemplo .    1.6.1.3 . Ensaio preliminar    Deve ser efectuado um ensaio preliminar simplificado ,   para se determinar a quantidade aproximada de   substância necessária para obter a fracção   mássica de saturação à temperatura do   ensaio ( 37 ° C ) .    Nota    A velocidade de obtenção do equilíbrio   de saturação pode depender em larga medida da   granulometria ( caso das substâncias sólidas ) .   Por isso , estes produtos devem ser pulverizados .    1.6.1.4 . Preparação da substância    Pesar oito amostras e colocá-las em frascos   de ensaio de 50 ml . Normalmente a quantidade de cada uma   destas amostras deve ser a dupla da necessária à   saturação , tal como foi determinado pelo ensaio   preliminar .    Após adição de uma quantidade pesada de   cerca de 25 g de gordura padrão liquefeita e misturada ,   fechar hermeticamente os frascos e agitá-los . Metade   deles ( grupo 1 ) agitam-se a 30 ° C e a outra   metade ( grupo 2 ) a cerca de 50 ° C ,   durante pelo menos uma hora .    1.6.2 . Condições do ensaio    A determinação da lipossolubilidade é   efectuada a 37 ° C ± 0,5 ° C .    1.6.3 . Metodologia    Agitar o conteudo dos frascos dos dois grupos   a 37 ° C ± 0,5 ° C até obter uma mistura   perfeita .    O tempo de agitação necessário para   estabelecer o equilíbrio não pode , regra   geral , ser previsto . Nas substâncias líquidas ,   a saturação pode ser obtida em alguns minutos ;   para as substâncias sólidas pode levar horas .   O tempo de agitação não ultrapassa , em geral ,   as três horas . Depois , interromper a agitação   de dois dos frascos dos dois grupos e deixá-los   repousar a 37 ° C durante pelo menos uma hora ,   de modo a separar a quantidade de substância não   dissolvida e permitir a formação da fase   homogénea . Se se formar uma emulsão ou suspensão   ( por exemplo o efeito de Tyndall ) , eliminá-la   por um método adequado como a centrifugação   termostatizada .    Agitar o terceiro e o quarto frascos dos dois grupos ,   pelo menos durante 24 h deixando-os depois repousar   uma hora a 37 ° C ± 0,5 ° C .    Nota :    Se não se depositar nenhum sedimento ( para   as substâncias sólidas ) , ou se nenhuma   separação de fase aparecer ( para as   substâncias líquidas ) neste intervalo de tempo ,   o ensaio deve ser repetido com uma quantidade maior   de substância .    1.6.4 . Análise    Retirar uma amostra de cada fase de gordura saturada   para a análise . Pesá-la e determinar a fracção   mássica dissolvida .    Qualquer método analítico adequado pode ser   utilizado , quer directamente quer após extracção com   água ou com um solvente orgânico , ou por qualquer   outra técnica de separação .    Exemplos :     - espectrofotometria ,     - cromatografia em fase gasosa ou líquida ,     - voltametria .    2 . RESULTADOS    Se os resultados acusarem diferenças sensíveis ,   quer na sub-saturação quer na sobresaturação quer   ainda nos períodos de repouso longos ou curtos ,   o ensaio deve ser repetido com tempos de agitação   mais longos .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    Os dados seguintes devem , se possível , constar   do relatório do ensaio :     - descrição precisa da substância   ( identificação e impurezas ) ,     - especificação da gordura ( por exemplo :   descrição concreta , características ,   origem , composição ) ,     - método de análise , desvios e características   especiais .    Os resultados devem ser avaliados como foi anteriormente   descrito e mencionados no relatório do ensaio . Se não   se constatar nenhuma diferença significativa entre   os valores observados em mg/100g , devem os   valores individuais , o valor médio e os desvios   padrão ser registados . Se se notarem diferenças   significativas , mesmo depois de um novo   ensaio , só serão assinalados os resultados   individuais .    Todas as observações e dados pertinentes para   a interpretação dos resultados serão anotados .    4 . REFERÊNCIAS     ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 116 -   Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .    Apêndice    EXEMPLO DE UMA GORDURA-PADRÃO    O quadro seguinte indica a composição de uma   gordura-padrão .    Distribuição do ácido gordo    Número de átomos de C na fracção de ácido   gordo * 6 * 8 * 10 * 12 * 14 * 16 * 18 * outros *     % ( áreas por CGL ) * 0,5 * 7,5 * 10,3 * 50,4 *   13,9 * 7,6 * 8,6 * 1 *    Distribuição dos glicéridos    Número de átomos de C na fracção de   ácido gordo * 22 * 24 * 26 * 28 * 30 * 32 * 34 * 36 *   38 * 40 * 42 * 44 * 46 * 48 * 50 *     % ( áreas por CGL ) * 0,1 * 0,3 * 1,0 * 2,3 *   4,9 * 10,9 * 13,9 * 21,1 * 16,1 * 11,7 * 9,8 * 4,4 *   2,2 * 1,1 * 16,1 *    Pureza    Teor em monogliceridos ( enzimático ) * * 0,1 % *    Teor em diglicéridos ( enzimático ) * * 0,4 % *    Teor não saponificável * * 0,1 % *    Índice de Wijs * * 0,5 % *    Índice de acidez * 0,02 *    Teor em água ( K. Fischer ) * * 0,1 % *    Ponto de fusão claro * 28,5 ° C *    Espectro de absorção-tipo ( espessura da   camada d = 1 cm , comparação ; água , 35 ° C    Comprimento de onda ( nm ) * 290 * 310 * 330 *   350 * 370 * 390 * 430 * 470 * 510 *    Transmissão ( % ) * 2 * 15 * 37 * 64 * 80 *   88 * 95 * 97 * 98 *    Mínimo 10 % de transmissão da luz a 303 nm .    Esta gordura é uma mistura sintética de glicéridos   saturados , com uma distribução em ácidos gordos   e triglicéridos semelhante à de óleo de coco .    A.8 . COEFICIENTE DE PARTIÇÃO    1 . MÉTODO    O método descrito é baseado nas directivas da   OCDE (1)    1.1 . Introdução    É conveniente dispor de dados preliminares sobre   a constante de dissociação , a hidrossolubilidade   e a tensão superficial da substância para   executar este ensaio .    O método só se aplica às substâncias   essencialmente puras , solúveis na água e   no n-octanol . Não é aplicável às substâncias   tensioactivas .    1.2 . Definições e unidades    O coeficiente de partição ( P ) é definido   como sendo a razão das concentrações no ponto   de equilíbrio ( c i ) duma substância dissolvida   num sistema bifásico que consiste em dois solventes   praticamente não miscíveis . Neste caso   eles são o n-octanol e a água :    P O,A = C Octanol/C água    O coeficiente de partição ( P ) é ,   pois , o quociente entre duas concentrações ;   é geralmente indicado sob a forma do seu   logaritmo na base 10 ( log P ) .    1.3 . Substância de referência    Não é necessário utilizar substâncias de   referência em todos os casos em que se analisa uma   nova substância . Elas servem essencialmente para   controlar periodicamente a reprodutibilidade do   método e permitir comparar resultados quando se   utilizarem métodos diferentes .    1.4 . Princípio do método    Para a determinação do coeficiente de   partição , pretende-se atingir o equilíbrio entre   o conjunto dos elementos constitutivos do sistema   em interacção e determinar as concentrações   das substâncias dissolvidas nas duas fases . Na   literatura sobre o tema aparecem numerosas   técnicas que podem ser utilizadas para alcançar   este objectivo , isto é , a mistura completa das   duas fases seguida da sua separação , a fim   de determinar a concentração , após equilíbrio   da substância em estudo .    1.5 . Critérios de qualidade    1.5.1 . Reprodutibilidade    Para se obter um coeficiente de partição rigoroso ,   fazem-se determinações duplas em três séries   de condições de ensaios diferentes , podendo   variar a quantidade da substância assim como a   relação entre os volumes de solvente . Os   valores determinados deste coeficiente , expressos   sob a forma dos seus logaritmos decimais , devem   situar-se num intervalo de ± 0,3 unidades   logarítmicas .    1.5.2 . Sensibilidade    O intervalo de medição do método é   determinado pelo limite de detecção do processo   analítico . Isto deverá ser suficiente para a   estimativa dos valores de P O,A até 10 5 , desde   que a concentração do soluto , em cada fase ,   não exceda 0,01 mol/litro .    1.5.3 . Especificação    A lei da partição de Nernst aplica-se   apenas a soluções diluídas , com temperatura ,   pressão e pH constantes . Aplica-se estritamente   a substâncias puras dispersas em dois solventes   puros . Os resultados podem ser afectados pelo   aparecimento simultâneo , numaou nas duas fases ,   de vários solutos diferentes .    A associação ou a dissociação das   moléculas dissolvidas conduzem a desvios à lei   de partição de Nernst . Nestes casos verifica-se   uma dependência do coeficiente de partição   da concentração da solução .    Devido aos equilíbrios múltiplos em presença   este método de ensaio não deve ser aplicado   sem correcção aos compostos ionisáveis   ( utilizar soluções-tampão em vez de água   em tais situações ) .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Estimativa preliminar do coeficiente de   partição    O valor do coeficiente de partição por ser   estimado , quer por simples cálculo (2) quer   utilizando as solubilidades da substância de   ensaio em solventes puros (1) .   Logo ,    P estimativa = C saturação ( n-octanol ) /C   saturação ( água )    Pode igualmente fazer-se uma determinação   simplificada através de um ensaio preliminar simples .    1.6.2 . Preparação    n-Octanol : a determinação do coeficiente de   partição deve ser feita com um reagente de   qualidade analítica .    Água : utilizar água destilada ou bidestilada   proveniente de um aparelho de vidro ou de quartzo .    Nota :    Evitar a água proveniente directamente de um   permutador de iões .    1.6.2.1 . Pré-saturação dos solventes    Antes de se determinar o coeficiente de partição ,   as fases do sistema de solventes são saturadas   reciprocamente por agitação a temperatura do   ensaio . Para isso , agitar durante 24h num agitador   mecânico dois recipientes grandes que   contenham n-octanol puro de qualidade analítica ou   água , com uma quantidade suficiente do outro   solvente . Depois , deixar repousar até que as   fases se separem e que se atinja o estado de   saturação .    1.6.2.2 . Preparação para o ensaio    O volume do líquido deve encher quase completamente   o recipiente de ensaio a fim de evitar qualquer   perda por volatilização . A razão de volumes   e as quantidades de substância a utilizar são as   seguintes :     - estimativa preliminar do coeficiente de   partição ( ver atrás ) ,     - quantidade mínima de substância de ensaio   necessária para o processo analítico utilizado ,     - limite de concentração máxima em cada fase ,   de 0,01 mol/l .    Serão efectuados três ensaios . No primeiro ,   junta-se a razão de volumes calculada , no segundo   duas vezes o volume de n-octanol , e no terceiro ,   a metade do volume de n-octanol .    1.6.2.3 . Substância de ensaio    Para assegurar o equilíbrio durante o ensaio ,   é preparada uma solução de reserva em   n-octanol com uma concentração mássica   compreendida entre 1 e 100 mg/ml . A concentração   mássica real desta solução de reserva deve ser   determinada rigorosamente antes de ser utilizada   na determinação do coeficiente de partição .   Deve ser guardada em condições estáveis .    1.6.3 . Condições de ensaio    A temperatura do ensaio deve ser constante   ( ± 1 ° C ) e situar-se entre 20 ° C e   25 ° C .    1.6.4 . Processo de medição    1.6.4.1 . Estabelecimento do equilíbrio de   partição    Para cada série de condições do ensaio ,   preparar o dobro dos recipientes de ensaio que   contenham as quantidades necessárias , cuidadosamente   pesadas , dos dois solventes , assim como a quantidade   necessária da solução de reserva .    Medir os volumes de octanol . Colocar num   agitador adequado , ou agitar à mão , os   recipientes para o ensaio . Um método de agitação   recomendado consiste em rodar rapidamente de   180 ° C o tubo de centrífuga em torno do seu   eixo transversal de modo a que o ar eventualmente   retido atravesse as duas fases .    1.6.4.2 . Separação das fases    Para separação das fases , centrifuga-se a   mistura . Efectuar esta operação com uma   centrífuga de laboratório mantida à   temperatura ambiente ou , caso se utilize uma   centrífuga sem controlo de temperatura ,   reequilibrar os tubos à temperatura do   ensaio pelo menos uma hora antes da análise .    1.6.5 . Análise    Para determinar o coeficiente de partição , é   necessário analisar as concentrações da   substância nas duas fases . Para isso , retirar   uma porção de cada uma das duas fases de cada   tubo para cada uma das séries de condições   de ensaio e analisá-las segundo o processo   escolhido . A quantidade total da substância   presente nas duas fases deve ser calculada   e comparada com a quantidade de substância   inicialmente introduzida .    A amostragem da fase aquosa deve ser tal que   reduza ao mínimo o risco de serem incluídos   vestígios de octanol . Para tal pode utilizar-se   uma seringa de vidro com agulha permutável :   primeiro , enche-se parcialmente a seringa de ar   que é depois lentamente expulso , ao inserir-se   a agulha na camada de n-octanol . Um volume   adequado da fase aquosa é retirado com a seringa .   Retirar rapidamente a seringa da solução   e tirar a agulha . O conteúdo da seringa pode   então ser utilizado como a amostra aquosa . A   concentração nas duas fases distintas deve ser   determinada de preferência utilizando um processo   específico para a substância . Exemplos de   determinações físico-químicas adequadas :     - métodos fotométricos ,     - cromatografia em fase gasosa ,     - cromatografia em fase líquida a alta pressão .    2 . RESULTADOS    Se o P O,A medido for superior a 10 4 ,   recomenda-se a comparação dos resultados com   um valor de P O,A calculado , como por exemplo ,   segundo o método indicado na referência (3) .    A credibilidade dos valores determinados de P   pode ser verificada procedendo a uma comparação   da média das determinações em duplicado com   a média geral .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    Os seguintes dados devem , se possível , figurar   no relatório :     - descrição precisa da substância   ( identificação e impurezas ) ,     - temperatura a que foram feitas as determinações ,     - processo analítico utilizado para determinar   as concentrações ,     - concentrações medidas nas duas fases   por cada determinação ( por consequência ,   num total de 12 concentrações ) ,     - peso da substância de ensaio , volume   de cada fase utilizada em cada recipiente e   quantidade total calculada da substância   presente em cada fase , após equilibrio ,     - para cada série de condições de   ensaio e , para a média do conjunto das   determinações , os valores calculados dos   coeficientes de partição ( P ) e o valor   médio . Anotar qualquer presumível dependência   da concentração em relação ao coeficiente de   partição ,     - desvio padrão dos valores individuais de P   em relação à sua média ,     - valor médio de P do conjunto das determinações   expresso pelo seu logarítmo ( base 10 ) ,     - P O,A teórico calculado , se este foi   determinado ou se o valor medido for , > 10 4     - P H da água utilizada e da fase aquosa   durante o ensaio ,     - quaisquer observações e notas pertinentes   para a interpretação dos resultados .    4 . REFERÊNCIAS    (1) OECD , PARIS , 1981 , Test Guideline 107 .   Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .    (2) OECD , PARIS , 1981 , Test Guideline 107 .   ref (2) Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .    (3) OECD , PARIS , 1981 , Test Guideline 107 .   ref ( 10 ) Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .    A.9 . PONTO DE INFLAMAÇÃO    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Para realizar este ensaio é útil dispor de   informações preliminares sobre a inflamabilidade   da substância . O modo operatório é aplicado   às substâncias líquidas , na sua forma   comercial , cujos vapores podem ser inflamados por   fontes de inflamação . Os métodos de ensaio   aqui descritos só são válidos para os   intervalos do ponto de inflamação especificados   em cada método .    1.2 . Definições e unidades    O ponto de inflamação é a temperatura ,   corrigida para uma pressão de 101,325 kPa , à   qual o líquido a ensaiar liberta vapores num   recipiente de ensaio fechado nas condições   definidas no respectivo método e em quantidades   tais que daí resulte a formação de uma   mistura inflamável vapor/ar no recipiente de ensaio .    Unidade : ° C    t = T - 273,15     ( t em ° C e T em K ) .    1.3 . Substâncias de referência    Não é necessária a utilização de   substâncias de referência em todos os casos em que   se estudar uma nova substância . Regra geral   elas servem para a calibração periódica   do método e permitem a comparação de   resultados nos casos de aplicação de um outro   método .    1.4 . Princípio do método    A substância é colocada num recipiente de   ensaio , que é aquecido progressivamente até   que a concentração dos vapores no ar produza uma   mistura susceptível de se inflamar .    1.5 . Critérios de qualidade    1.5.1 . Reprodutibilidade    A reprodutibilidade depende do intervalo do   ponto de inflamação e do método utilizado ;   máximo : ± 2 ° C .    1.5.2 . Sensibilidade    A sensibilidade depende do método utilizado .    1.5.3 . Especificidade   A especificidade de certos métodos de ensaio   é limitada a certos intervalos do ponto de   inflamação e depende de certos dados relativos   à substância ( por ex. : alta viscosidade ) .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparação    A amostra da substância é colocada num   aparelho de ensaio de acordo com os pontos 1.6.3.1   e/ou 1.6.3.2 .    1.6.2 . Condições do ensaio    É conveniente instalar o aparelho ao abrigo de   correntes de ar .    1.6.3 . Desenvolvimento do ensaio    1.6.3.1 . Método do equilíbrio    Ver as normas ISO 1516 , ISO 3680 , ISO 1523 e   ISO 3679 .    1.6.3.2 . Método do não-equilíbrio    Aparelho de Abel :    Ver as normas BS 2000 , parte 170 , NF M07-011 e   NF T66-009 .    Aparelho de Abel-Pensky :    Ver as normas ( EN 57 ) , DIN 51755 , primeira parte   ( para temperaturas de 5 ° C a 65 ° C ) , DIN 51755 ,   segunda parte ( para temperaturas inferiores a 5 ° C )   e NF M07-036 .    Aparelho de Tag :    Ver as normas ASTM D-56 e ISO 2719 .    Aparelho de Pensky-Martens :    Ver as normas ISO 2719 , ( EN 11 ) , DIN 51758 ,   ASTM 8013 , ASTM D 93 , BS 2000-34 e NF M07-019 .    Notas :    Sempre que o ponto de inflamação determinado por   um método de não-equilíbrio ( ver 1.6.3.2 ) tem os   valores seguintes : 0 ± 2 ° C , 21 ± 2 ° C ,   55 ± 2 ° C , deve ser confirmado por um método   baseado no equilíbrio utilizando o mesmo aparelho .    Só os métodos susceptíveis de darem a   temperatura do ponto de inflamação podem ser   utilizados para uma notificação .    Para determinar o ponto de inflamação de líquidos   viscosos ( tintas , gomas , etc. ) contendo solventes ,   utilizar apenas aparelhos e métodos que permitam a   determinação do ponto de inflamação para   líquidos viscosos . Ver as normas ISO 3679 , ISO 3680 ,   ISO 1523 e DIN 53213 , parte 1 .    2 . RESULTADOS    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    O relatório deve abranger , se possível , as   informações seguintes :     - descrição precisa da substância   ( identificação e impurezas ) ,     - descrição do método utilizado e todas as   eventuais variantes ,     - os resultados e quaisquer informações ou   observações úteis para interpretação   dos resultados .    4 . REFERÊNCIAS    Nenhuma .    A.10 . INFLAMABILIDADE ( SÓLIDOS )    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Antes de se proceder a este ensaio , é útil   dispor de informações preliminares das propriedades   explosivas potenciais da substância .    O presente método é unicamente aplicável às   substâncias pulverulentas , granulosas ou pastosas .    De forma a não englobar todas as substâncias   susceptíveis de serem inflamadas , mas somente as que   ardem rapidamente ou as de combustão particularmente   perigosa de um ou de outro modo , só são   consideradas muito inflamáveis as substâncias cuja   velocidade de combustão exceda um certo limite .   Além disso , os pós metálicos susceptíveis de   serem consumidos serão igualmente considerados como   muito inflamáveis se a incandescência se propagar   por toda a amostra . Esta incandescência e as   dificuldades ligadas à extinção do fogo   constituem a principal razão para se considerar os   pós metálicos especialmente perigosos . Os agentes   de extinção habituais , como o dióxido de   carbono e/ou a água , podem aumentar   consideravelmente os riscos .    1.2 . Definição e unidades    O tempo de combustão é expresso em segundos .    1.3 . Substâncias de referência    Não especificadas .    1.4 . Princípio do método    A substância na forma comercial é disposta   numa pilha de 250 mm de comprimento . É em   seguida inflamada de acordo com as condições   definidas no ponto 1.6.3 e mede-se o tempo da   combustão .    1.5 . Critérios de qualidade    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparação    No caso de uma substância em pó ou em grânulos ,   a substância na sua forma comercial é posta a granel   numa forma metálica de 250 mm de comprimento e de   secção transversal triangular , cuja altura e   largura interiores são respectivamente de 10 mm e   20 mm . De ambos os lados da forma , no sentido do   comprimento , dispõem-se placas metálicas   destinadas a funcionar como limites laterais .   Estas placas ultrapassam em 2 mm o bordo superior da   secção triangular transversal ( Ver figura ) .   Em seguida deixa-se cair a forma três vezes de   uma altura de 2 cm sobre uma superfície dura .   Repor mais substância se necessário . Retirar   então as placas laterais e raspar o excesso de   substância . Colocar sobre a forma uma placa não   combustível e não porosa , inverter o conjunto e   desenformar .    Estender as substâncias pastosas sobre uma   superfície não combustível em forma de cordão   de 250 mm de comprimento e cerca de 1 cm² de secção   transversal .    Utilizar uma fonte de inflamação adequada , tal   como uma pequena chama ou um fio aquecido a uma   temperatura de pelo menos 1 000 ° C para inflamar a   pilha numa das extremidades .    1.6.2 . Condições do ensaio    No caso das substâncias sensíveis à humidade ,   efectuar o ensaio o mais rapidamente possível após   se ter retirado a substância do seu recipiente .    1.6.3 . Desenvolvimento do ensaio    Inflamar uma das extremidades da pilha . Logo que se   tenha queimado uma distância de 80 mm , medir a   velocidade de combustão nos 100 mm seguintes .   Efectuar o ensaio seis vezes seguidas utilizando cada   vez uma placa arrefecida e limpa .    2 . RESULTADOS    Para se proceder à avaliação , é necessário   dispor dos valores do tempo de combustão apurados   durante seis ensaios .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    3.1 . Relatório    O relatório deve conter , se possível , as   seguintes informações :     - descrição precisa da substância   ( identificação e impurezas ) ,     - descrição da substância de ensaio ,   seu estado físico , incluindo o conteúdo em humidade ,     - resultados das medições ,     - quaisquer notas complementares que possam ser   úteis para a interpretação dos resultados .    3.2 . Interpretação dos resultados    As substâncias pulverulentas , granulosas ou   pastosas devem ser consideradas como facilmente   inflamáveis sempre que o tempo de combustão   durante os seis ensaios efectuados de acordo com o   modo operatório descrito no ponto 1.6 , for inferior   a 45 segundos . Os pós metálicos ou de ligas metálicas   devem ser considerados inflamáveis sempre que a   chama ou a zona de reacção se estenda a toda a   amostra .    4 . REFERÊNCIAS    Nenhuma .    Apêndice    Figura    Forma e acessórios para a preparação da   pilha : v. JO    A.11 . INFLAMABILIDADE ( GASES )    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    O presente método permite determinar se os gases   misturados no ar à temperatura e pressão ambientes ,   apresentam um intervalo de inflamabilidade . As misturas   que contenham concentrações crescentes do gás   de ensaio são expostas a uma faísca eléctrica e   observa-se se se produz inflamação .    1.2 . Definição e unidades    O intervalo de inflamabilidade é o intervalo de   concentração entre os limites superior e inferior de   explosão . Os limites superior e inferior de   explosão são as concentrações no ar do gás   inflamável às quais o fogo não se   propaga .    1.3 . Substância de referência    Nao especificada .    1.4 . Princípio do método    A concentração do gás no ar é aumentada   gradualmente e a mistura é exposta em cada fase a uma   faísca eléctrica .    1.5 . Critérios de qualidade    Não fixados .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Aparelho    O recipiente de ensaio é um cilindro em vidro de   diâmetro interior mínimo de 50 mm e de altura   mínima de 300 mm disposto verticalmente . Os   eléctrodos de inflamação encontram-se distanciados   um do outro de 3 a 5 mm e colocados a 60 mm do fundo   do cilindro . O cilindro está equipado com uma válvula   de pressão . O aparelho deve ser protegido por   blindagem adequada para minimizar os danos de uma   eventual explosão .    A fonte de inflamação é uma faísca   induzida de 0.5 segundos de duração , gerada por   um transformador de alta tensão com uma tensão   de saída de 10 a 15 kV ( a potência   máxima é de 300 W ) .    1.6.2 . Condições do ensaio    Deve realizar-se à temperatura ambiente .    1.6.3 . Desenrolar do ensaio    Com a ajuda de bombas doseadoras , o cilindro de   vidro é cheio com uma mistura ar-gás de concentração   conhecida . Faz-se saltar uma faísca na mistura e   observa-se se uma chama se destaca da fonte de   inflamação e se se propaga de modo independente .   A concentração do gás é aumentada , cada vez , de   1 % em volume , até que a inflamação se produza   da forma anteriormente descrita .    2 . RESULTADOS    A propagação da chama constitui o único dado de   informação válida para a determinação desta   propriedade .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    O relatório deve conter , se possível , as   seguintes informações :     - descrição precisa da substância   ( identificação e impureza ) ,     - descrição do aparelho utilizado , mencionando   as suas dimensões ,     - temperatura ambiente a que decorrer o ensaio ,     - concentrações ensaiadas assim como os   resultados obtidos ,     - resultado do ensaio : gás não inflamável ou   facilmente inflamável ,     - desde que se conclua da não inflamabilidade ,   interessa declarar que todas as concentrações foram   ensaiadas aumentando-as cada vez de 1 % , de 0 a 100 % ,     - qualquer informação ou observação útil   para a interpretação dos resultados .    4 . REFERÊNCIAS    Nenhuma .    A.12 . INFLAMABILIDADE ( SUBSTÂNCIAS E   PREPARACÕES QUE , EM CONTACTO COM A ÁGUA OU O AR   HÚMIDO , LIBERTAM GASES FACILMENTE INFLAMÁVEIS EM   QUANTIDADES PERIGOSAS )    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Este método de ensaio pode ser utilizado para   determinar se da reacção duma substância com a   água resulta a libertação de uma quantidade perigosa   de um ou vários gases , susceptíveis de serem   facilmente inflamáveis ou tóxicos .    Pode ser aplicado às substâncias sólidas e   líquidas , mas não às que se inflamem   espontaneamente em contacto com o ar .    1.2 . Definições e unidades    Facilmente inflamáveis - substâncias e   preparações que , em contacto com a água ou o ar   húmidos , libertam uma quantidade perigosa de gases   facilmente inflamáveis , com um débito mínimo de   1 l/kg.h. Este limite não tem em conta a   toxicidade do gás .    1.3 . Princípio do método    O ensaio de substâncias abrange várias fases ,   a seguir descritas ; se a inflamação ocorre em   qualquer uma destas fases , já não é necessário   prosseguir o ensaio .    1.3.1 . Fase 1    Colocar a substância num cadinho que contenha   água destilada a 20 ° C e observar se o gás se   inflama ou não .    1.3.2 . Fase 2    Colocar a substância sobre um papel de filtro a   flutuar em água destilada a 20 ° C contida numa   cápsula , observar se o gás que se liberta se   inflama ou não . O papel de filtro serve apenas para   manter a substância imóvel , o que aumenta a   probabilidade de inflamação .    1.3.3 . Fase 3    Colocar a substância numa pilha de 2 cm de altura e   de 3 cm de diâmetro , aproximadamente . Juntar   algumas gotas de água à pilha e observar se o gás   que se liberta se inflama ou não .    1.3.4 . Fase 4    Misturar a substância com água destilada a 20 ° C   e medir o débito de libertação do gás de uma em   uma hora durante 7 horas . Se o débito for variável   ou se aumentar após 7 horas , o tempo de medida deve   ser prolongado até um máximo de 5 dias . O ensaio pode   ser interrompido se , em dado momento , o débito   exceder 1 l/kg.h.    1.4 . Substâncias de referência    Não especificadas .    1.5 . Critérios de qualidade    Não indicados .    1.6 . Descrição dos métodos    1.6.1 . Fase 1    1.6.1.1 . Condições do ensaio    A substância é utilizada na sua forma comercial   e o ensaio é realizado à temperatura ambiente   ( cerca de 20 ° C ) .    1.6.1.2 . Desenrolar do ensaio    Colocar uma pequena quantidade ( cerca de 2 mm   de diâmetro ) da substância num cadinho com   água destilada . Anotar se : i ) há libertação   de gás ; ii ) o gás se inflama . Se o gás   se inflamar , é desnecessário prosseguir o ensaio ,   sendo desde já de se considerar a substância   como perigosa .    1.6.2 . Fase 2    1.6.2.1 . Equipamento    Papel de filtro flutuando na superfície da água   destilada em recipiente adequado , por ex. , uma   cápsula de 100 mm de diâmetro .    1.6.2.2 . Condições do ensaio    A substância é utilizada na sua apresentação   comercial e o ensaio é realizado à temperatura ambiente   ( cerca de 20 ° C ) .    1.6.2.3 . Desenrolar do ensaio    Colocar uma pequena quantidade da substância de   ensaio ( cerca de 2 mm de diâmetro ) no centro de um   papel de filtro . Anotar se : i ) há libertação   de gás e ii ) o gás se inflama . Se o gás se   inflamar não é necessário prosseguir o ensaio   da substância , sendo esta desde logo considerada   como substância perigosa .    1.6.3 . Fase 3    1.6.3.1 . Condições de ensaio    A substância é utilizada na sua forma comercial   e o ensaio é realizado à temperatura ambiente   ( cerca de 20 ° C ) .    1.6.3.2 . Desenrolar do ensaio    Pôr a substância numa pilha de 2 cm de altura   e de aproximadamente 3 cm de diâmetro , tendo no   cimo uma pequena reentrância . Adicionar algumas   gotas de água na concavidade e anotar se :   i ) há libertação de gás ; ii ) o gás se   inflama . Se o gás se inflamar , não é   necessário prosseguir o ensaio da substância ,   sendo esta considerada desde logo como substância   perigosa .    1.6.4 . Fase 4    1.6.4.1 . Equipamento    A montagem do equipamento é indicada na figura   em apêndice .    1.6.4.2 . Condições do ensaio    Assegurar que o recipiente que contém a   substância está livre de partículas   pulverulentas ( < 500 µm ) . Se estas representarem   mais de 1 % , em peso , do total ou se a amostra   for friável , deve reduzir-se a dimensão das   partículas durante a armazenagem e a manipulação ;   caso contrário , a substância será utilizada   na forma comercial . Realizar o ensaio à temperatura   ambiente ( 20 ° C ) e à pressão atmosférica .    1.6.4.3 . Desenrolar do ensaio    Deitar água no funil de carga do aparelho . Pesar   e colocar no vaso cónico uma quantidade suficiente de   substância com um peso máximo de 25 g , a fim de   se obter uma libertação de gás de 100 a 250 cm³ .   Medir por qualquer meio adequado o volume de gás   libertado . Abre-se a torneira do funil para deixar   entrar a água no vaso cónico e liga-se o   cronómetro . Anotar o tempo necessário à   libertação total do gás e , se possível ,   proceder a leituras intermédias . O ensaio deve   ser realizado três vezes .    Se a identidade química do gás não for conhecida ,   este deve ser analisado . Se o gás contiver   constituintes facilmente inflamáveis e se se ignorar   se o conjunto da mistura é facilmente inflamável ,   preparar e ensaiar uma mistura com a mesma composição   de acordo com o método ( A.11 ) .    2 . RESULTADOS    Para que uma substância seja considerada como   perigosa é suficiente que uma inflamação ou uma   libertação de gás facilmente inflamável   tenha um débito superior a 1 l/kg.h nos três ensaios   ( 1.6.1 , 1.6.2 e 1.6.3 ) .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    O relatório deve incluir , se possível , os   dados seguintes :     - indicação e descrição precisa da   substância tal como foi recebida ( por ex. : cor ,   dimensão das partículas , estado físico ) ,     - qualquer preparação inicial da substância ,     - resultados dos ensaios ,     - identificação química do gás libertado ,     - debito do gás libertado ( 1.6.4 ) ,     - todas as informações pertinentes para a   interpretação dos resultados .    4 . REFERÊNCIAS     ( 1 ) ISO 1773 .     ( 2 ) OECD , Paris , Preliminary Test Guideline   for the Determination of Substances wich give off   Highly Inflammable Gases in Dangerous Amounts on   Contact with Water , A 80/28 - Final report of the   OECD chemical testing programme .     ( 3 ) UN doc. No ST/SG/AC10/1 rev. 1 .    Apêndice    Figura    Montagem do equipamento : v. JO    A . 13 . INFLAMABILIDADE ( SÓLIDOS E LÍQUIDOS )    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    É útil dispor de informações preliminares   sobre a auto-inflamabilidade duma substância . O   processo de ensaio é aplicável às substâncias   sólidas e líquidas tal como comercializadas ,   sujeitas a inflamar-se espontaneamente em pequenas   quantidades , pouco tempo após terem entrado em   contacto com o ar à temperatura ambiente .    As substâncias não cobertas por este método   são aquelas cuja inflamação espontânea apenas   ocorra após várias horas ou dias de exposição   à temperatura ambiente ou aquelas que só se   inflamam espontaneamente após exposição a uma   temperatura consideravelmente elevada .    1.2 . Definições e unidades    Os líquidos e os sólidos são considerados   como facilmente inflamáveis se se inflamam   espontaneamente pelo menos uma vez em cada seis   ensaios praticados nas condições descritas no   ponto 1.6 .    A auto-inflamabilidade dos líquidos pode   igualmente necessitar de ser testada segundo o método   citado no ponto A.15 . : Auto-inflamabilidade :   determinação da temperatura de auto-inflamabilidade   dos líquidos e gases voláteis .    1.3 . Substâncias de referência    Não especificadas .    1.4 . Princípio do método    A substância é posta em contacto com o ar à   temperatura de 25 ± 10 ° C durante 5 minutos .   Caso haja inflamação a substância é   considerada como facilmente inflamável .    1.5 . Critérios de qualidade    Reprodutibilidade : dada a importância de que o   aspecto da segurança se reveste ; um só resultado   positivo em 6 ensaios é suficiente para concluir   que a substância é altamente inflamável .    1.6 . Descrição do método de ensaio   1.6.1 . Equipamento    Encher uma cápsula de porcelana com cerca de   10 cm de diâmetro com terra de infusórios   ( diatomáceas ) , com uma espessura de cerca de   5 mm , à temperatura ambiente .    Nota :    A terra de infusórios ou qualquer outra substância   inerte semelhante que se encontre disponível , será   considerada representativa do solo no qual a substância   pode acidentalmente ser espalhada .    1.6.2 . Realização do ensaio    a ) Solidos pulverulentos    Deitar 1 ou 2 cm³ da substância pulverulenta   a ensaiar duma altura de cerca de 1 m sobre uma   superfície não combustível e observar se a   substância se inflama durante a queda ou durante os   5 primeiros minutos em que se encontrar depositada ;    b ) Líquidos    Deitar cerca de 5 cm³ do líquido a ensaiar numa   cápsula de porcelana preparada e observar se ele se   inflama num intervalo de 5 minutos .    2 . RESULTADOS    Para a avaliação são necessários os resultados   de 6 ensaios .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    O relatório deve conter , se possível , os   dados seguintes :     - descrição da substância a ensaiar .     - resultados do ensaio .    4 . REFERêNCIAS     ( 1 ) OECD , Paris , Preliminary Test Guideline   for the Determination of Pyrophoric Behaviour of Solids   and Liquids. A80/23 - Final report for the OECD   chemical testing programme .    A . 14 . PROPRIEDADES EXPLOSIVAS    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Trata-se de um método de ensaio que permite   determinar se uma substância ou preparação   sólida , líquida ou pastosa apresenta ou não   perigo de explosão , desde que sujeita ao efeito   duma chama ( sensibilidade térmica ) , ao choque   ou à fricção ( sensibilidade aos estímulos   mecânicos ) .    O método compreende três partes :    a ) Ensaio de sensibilidade térmica ;    b ) Ensaio de sensibilidade mecânica ( choque ) ;    c ) Ensaio de sensibilidade mecânica ( fricção ) .    O método fornece os dados que permitem avaliar   a probabilidade que certos estímulos comuns têm   de desencadear uma explosão . Não tem por fim   determinar se uma substância ou uma preparação   é ou não susceptível de explodir em certas   condições , nem de determinar em que medida a   decomposição inicial se pode propagar e causar   a explosão de toda a amostra .    O método é capaz de determinar se uma substância   ou preparação apresenta um perigo de explosão   ( sensibilidade térmica e mecânica ) nas   condições especiais definidas pela directiva .   Os ensaios são irrelevantes se os dados termodinâmicos   disponíveis ( calor de formação , calor de   decomposição , ausência de certos grupos reactivos   ( 1 ) na fórmula de estrutura ) permitem estabelecer   de forma razoavelmente segura que a substância ou a   preparação não é susceptível de se decompor ,   de formar gases e de desenvolver calor muito   rapidamente ( isto é , o material não deve   apresentar riscos de explosão ) . Admite-se , no   entanto , que o método não tem um valor definitivo .   Inclui um certo número de tipos seleccionados de   aparelhos específicos , largamente utilizados a   nível internacional e que dão , regra geral ,   resultados significativos .    O experimentador pode preferir um outro tipo de   aparelhos para os 3 métodos atrás citados com a   condição de que essa escolha seja justificada   cientificamente e que a aparelhagem seja reconhecida a   nível internacional . Neste caso deve ser   determinada a correlação dos seus resultados com   os obtidos com os aparelhos especificados .    1.2 . Definições e unidades    Substâncias e preparações explosivas :    As susceptíveis de explodir sob o efeito de   uma chama ou que são mais sensíveis ao choque   ou à fricção do que o dinitrobenzeno .    1.3 . Substâncias de referência    Meta-dinitrobenzeno , produto técnico cristalizado   para os ensaios por fricção e por choque .    1.4 . Princípio do método    E necessário um teste preliminar de protecção   para determinar as condições de segurança que   devem orientar a execução dos três ensaios de   sensibilidade .    1.4.1 . Ensaio preliminar de protecção    As amostras em quantidades muito reduzidas   ( cerca de 10 mg ) de substância ou de preparação   são submetidas : ao aquecimento sem limite a uma   chama de um bico de Bunsen , ao choque com todas as   formas adequadas de instrumentos e à fricção   utilizando um malho e uma bigorna ou qualquer outro   tipo de dispositivo de fricção . Tem por objectivo   determinar até que ponto a substância é sensível   e explosiva , de forma que os ensaios de   sensibilidade prescritos se realizem com certas   precauções , a fim de evitar quaisquer danos   corporais ao experimentador .    1.4.2 . Sensibilidade térmica    Este método consiste em aquecer a substância ou   preparação num tubo de aço com diferentes graus de   confinamento , seguros por placas com orifícios   de arejamento de diferentes diâmetros , para   determinar se a substância ou a preparação são   susceptíveis de explodir sob constrangimento   térmico .    1.4.3 . Sensibilidade mecânica ( choque )    O método consiste em submeter a substância ou   preparação ao choque de um malho sobre uma bigorna   em aço .    1.4.4 . Sensibilidade mecânica ( fricção )    Consiste em submeter a substância ou a preparação   a uma fricção entre superfícies padrão ,   em condições especificadas de carga e   movimento relativo .    1.5 . Critérios de qualidade    Não estabelecidos .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Equipamento    1.6.1.1 . Sensibilidade térmica ( efeito de chama )    O tubo de aço é feito de chapa batida a frio   ( ver apêndice ) por um processo de estiragem , com   as seguintes dimensões : diâmetro interior-24 mm ;   comprimento-75 mm ; espessura da parede-0,5 mm . Na   sua extremidade aberta tem uma manilha de fecho   ( fig. 1 ) . É munido ainda de uma placa circular de   ligação com um orifício central , resistente   à pressão . Esta placa está solidamente fixada   ao tubo por uma junta roscada de duas partes ( porca   e cabeça de porca ) . A cabeça de placa   ( ver fig. 1 ) tem uma espessura de 6 mm e é   constituída de aço-crómio resistente ao   calor ( ver apêndice ) .    O experimentador dispõe de uma série de placas   de ligação , cujos respiradouros apresentam   diferentes diâmetros ( 1 ; 1,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 4 ;   5 ; 6 ; 8 ; 10 ; 12 ; 14 ; 16 ; 18 ; 20 ... mm )   para determinar o grau de risco de explosão que a   substância ou a preparação apresenta .   A porca e a cabeça de porca ( fig. 1 ) são em   aço crómio-manganésio ( ver apêndice ) ,   não dando origem a faíscas até 800 ° C .   Os tubos em aço só são utilizados numa   experiência .    1.6.1.2 . Sensibilidade mecânica ( choque )    O material típico para queda de peso é   constituído essencialmente por : bloco de ferro   fundido ( ferro-fundido cinzento ) , uma base e   uma bigorna , coluna , guias , peso de queda e um   mecanismo de libertação . O bloco de aço   ( comprimento × largura × altura = 230 × 250 ×   200 mm ) com uma base moldada ( comprimento ×   largura × altura = 450 × 450 × 60 mm ) ,   sustém a bigorna de aço de 100 mm de   diâmetro e 70 mm de altura sobre o qual ela é   aparafusada . O suporte é aparafusado nas costas   do bloco e neste mesmo suporte é fixada a coluna ,   que consiste num tubo de aço estirado sem   soldadura de 90 mm de diâmetro exterior e 70 mm de   diâmetro interior . Quatro parafusos cravados num   bloco de betão de 60 × 60 × 60 cm mantêm o   peso de queda , de forma que as guias fiquem   absolutamente verticais e assegurem uma queda   fácil . O peso de 10 kg é em aço temperado ;   deve haver uma superfície de impacto em aço   temperado HRC 60 a 63 com um diâmetro mínimo de   25 mm . No ensaio , a altura da queda é de   0,4 m .    A substância a ensaiar é colocada numa matriz   constituída por dois cilindros coaxiais em aço   temperado , colocado um por cima do outro e um cilindro   de aço oco que se destina a servir de anel de   orientação . Os cilindros coaxiais devem ter um   diâmetro de 10 ( - 0,003 , - 0,005 ) mm , uma altura   de 10 mm , superfícies polidas e arestas arredondadas   ( raio da curvatura : 0,5 mm ) e dureza : HCR 58 a 65 .   O cilindro oco tem um diâmetro exterior de 16 mm ,   um orifício polido de 10 ( + 0,005 , + 0,010 ) mm ,   e uma altura de 13 mm . Se a explosão se produzir ,   não devem ser reutilizados em novos ensaios os   cilindros de aço e o cilindro oco . A matriz é   colocada sobre uma bigorna intermédia em aço de   26 mm de altura e centrada por um anel de centragem   e um anel de travagem , a fim de eliminar os gases   produzidos pela explosão .    1.6.1.3 . Sensibilidade mecânica ( fricção )    O aparelho para o ensaio por fricção consiste   numa placa de base fundida ( ferro fundido cinzento ) ,   sobre o qual se monta o dispositivo de fricção   propriamente dito , que compreende um munhão de veio   fixo em porcelana e várias placas móveis de   porcelana . A placa de porcelana é fixada numa   corrediça que se desloca entre dois carris . A   corrediça é accionada por uma barra transmissora ,   uma roldana excêntrica e uma engrenagem de   transmissão com motor eléctrico , de forma que   a placa de porcelana se desloque numa distância   de 10 mm , para trás e para a frente da barra   transmissora . O munhão de porcelana é   carregado com uma carga de cerca de 360 newtons .    As placas de porcelana são feitas de porcelana   técnica branca com as dimensões : comprimento =   25 mm , largura = 25 mm e altura = 5 mm . Ambas as   superfícies de fricção das placas são tornadas   ásperas antes de serem incendiadas por fricção ,   com uma esponja ( profundidade média 9 a 32 µm ) .    O munhão cilíndrico é igualmente de porcelana   técnica branca : comprimento = 15 mm , diâmetro = 10 mm ,   com extremidades esféricas e rugosas ( raio de curvatura   de 10 mm ) .    1.6.2 . Condições de ensaio    1.6.2.1 . Sensibilidade térmica ( efeito de chama )    Colocar a substância , 3 vezes em quantidades   iguais , na forma física tal como é fornecida ,   no tubo , até uma altura de 60 mm . Comprimir   ligeiramente de cada vez , aplicando uma força de   80 newtons sobre a superfície com a ajuda de um   pistão em madeira adequada e de diâmetro   ligeiramente inferior ao do tubo . Se a substância   for gelatinosa , evitar a formação de bolhas de   ar durante o enchimento .    1.6.2.2 . Sensibilidade mecânica ( choque )    Testar a substância no estado seco . A amostra deve   ter um volume de 40 mm³ , ou ser compatível à   aparelhagem indicada . No que diz respeito às   substâncias sólidas , com excepção das   pastosas , proceder da seguinte forma :    a ) Peneirar as substâncias pulverulentas ( malha   de 0,5 mm ) ; tudo o que passar na peneira é   utilizado no ensaio .    b ) Desagregar e peneirar as substâncias   comprimidas , moldadas ou condensadas ; a fracção   peneirada ( diâmetro de 0,5 a 1 mm ) é utilizada   no ensaio .    Para as substâncias líquidas , empurrar para   baixo o cilindro superior de aço até à   distância de 1 mm do cilindro inferior e   mantê-lo nesta posição .    1.6.2.3 . Sensibilidade mecânica ( fricção )    Testar a substância no estado seco . A amostra   deve ter um volume de 10 mm³ . Para as   substâncias sólidas , com excepção das   pastosas , proceder da forma seguinte :    a ) Peneirar as substâncias pulverulentas ( malha   de 0,5 mm ) ; tudo o que passar através da peneira é   utilizado no ensaio ;    b ) Desagregar e peneirar as substâncias   comprimidas , moldadas ou condensadas ; a fracção   peneirada ( diâmetro < 0,5 mm ) é utilizada no   ensaio .    1.6.3 . Desenvolvimento do ensaio    1.6.3.1 . Sensibilidade térmica ( efeito da chama )    O aquecimento é assegurado pelo gás propano ,   proveniente de uma garrafa de gás comprimido   industrial equipada com um regulador de pressão   ( 500 mbar ) , um fluxómetro e distribuído para   os quatro queimadores . Estes consomem 3,2 litros de   propano por minuto . Se forem utilizados outros   gases , terão de ser escolhidos queimadores   adequados , o consumo de gás e a entrada de ar de modo   que as medições comparativas efectuadas com as   substâncias inertes ( areia , ftalato de dibutilo )   mostrem nos tubos cheios , curvas temperatura/tempo   semelhantes às obtidas com o gás propano .    Os queimadores estão situados à volta da câmara   de ensaio , como indicado na figura 2 .    Ajustar os queimadores de tal modo que a ponta do   cone interno azul da chama quase toque o tubo . O   ensaio será efectuado numa câmara em aço ,   cujas dimensões são indicadas na figura 2 .    As dimensões dos queimadores de propano estão   indicadas nas figuras 3a e 3b .    São obrigatórias 2 séries de 3 ensaios . A   primeira utilizando uma placa ajustável com um   orifício de 2 mm de diâmetro e a segunda com um   orifício de diâmetro superior a 2 mm   ( por exemplo 6 mm ) .    Se a explosão se produzir durante a primeira   série ( orifício de 2 mm ) , já não é   necessário proceder às séries de ensaios seguintes .   Se a explosão não se produzir após 5 minutos ,   o ensaio está terminado .    1.6.3.2 . Sensibilidade mecânica ( choque )    Serão realizados 6 ensaios com o aparelho   de ensaio indicado para o choque , com uma massa de   10 kg que cai de 0,4 metros . Noutros aparelhos ,   a amostra é comparada com o m-dinitrobenzeno ,   de acordo com um processo estabelecido ( técnica   de « up-and-down » , etc. ) .    1.6.3.3 . Sensibilidade mecânica ( fricção )    Colocar o munhão de veio em porcelana sobre a   substância a ensaiar e enganchar os pesos . Na   realização do ensaio , as marcas deixadas pela   esponja sobre a placa de porcelana devem ser   transversais em relação à direcção do   movimento . Verificar se o munhão repousa sobre   a amostra , se a quantidade de substância   a ensaiar é suficiente e se a placa se desloca   correctamente sob o munhão , isto é , para que   ele execute um movimento de vaivém numa distância   de 10 mm em cada direcção e isto em 0,44 segundos .   Utilizar apenas uma parte da superfície para   cada ensaio .    2 . RESULTADOS    2.1 . Tratamento dos resultados    Os ensaios podem ser interrompidos desde que seja   obtido um resultado positivo num dos testes .    2.2 . Avaliação    Em princípio , uma substância ou uma   preparação é considerada como apresentando   perigo de explosão , se :    a ) Se produz uma explosão ( isto é , se o tubo   rebenta em 3 ou mais bocados ) no número fixado de   ensaios de sensibilidade térmica ;    ou se    b ) Se produz uma explosão ( a inflamação   é equivalente a uma explosão ) pelo menos uma vez   durante 6 ensaios realizados com a ajuda do   aparelho de ensaio por choque indicado , ou se   a amostra é mais sensível do que o m-dinitrobenzeno   quando um teste alternativo por choque for   realizado ;    ou se    c ) Se produz uma explosão ( a deflagração   ou a inflamação é equivalente a uma explosão )   pelo menos uma vez durante 6 ensaios realizados   com o aparelho de fricção indicado , ou se a amostra   é mais sensível do que o m-dinitrobenzeno ,   quando é realizado um teste alternativo por   fricção .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    3.1 . Relatório    O relatório deve conter , se possível , os   seguintes dados :     - identificação , composição , pureza ,   grau de humidade , etc. , da substância ou da   preparação de ensaio ,     - estado físico da amostra ; precisar se foi ou   não peneirada ,     - observações durante o ensaio ( tipo de   reacção , faíscas , chama , explosão , número de   fragmentos , etc. ) ,     - resultados de cada ensaio ,     - se for utilizado um outro aparelho , declarar   as justificações científicas da sua utilização ,   e a correlação entre os resultados obtidos com   o aparelho equivalente e o aparelho especificado ,     - todas as observações úteis , nomeadamente   referências aos ensaios praticados com produtos   similares , susceptíveis de serem pertinentes para   a interpretação correcta dos resultados .    3.2 . Interpretação e avaliação dos resultados    O relatório deve conter os resultados considerados   como errados , anormais ou não representativos .   Sempre que um dos resultados é rejeitado , dar uma   explicação e indicar os resultados de outro   ensaio alternativo ou suplementar .    Por vezes , o resultado pode ser falseado devido à   forma física ou à natureza volátil da   substância ou da preparação durante o ensaio ;   neste caso , é útil conhecer o resultado   que se obteria se a substância ou a preparação   fossem utilizadas na sua forma comercial . Ensaios   alternativos podem permitir a obtenção destes   dados . A não ser que se possa explicar deste modo   um resultado anómalo , ele deve ser aceite tal e   qual e utilizado consequentemente para classificar   a substância ou a preparação .    4 . REFERÊNCIAS     ( 1 ) Bretherick , L. , Handbook of Reactive   Chemical Hazards , London . Butterworths , 1979 ,   p. 60-63 .     ( 2 ) Koenen , H. , Ide , K. H. , UEber die   Pruefung explosiver Stoffe , I . Ermittlung der   Reibempfindlichkeit , Explosive Stoffe , Vol. 3 ,   1955 , p. 57-65 und p. 89-93 .     ( 3 ) Koenen , H. , Ide , K. H. , UEber die   Pruefung explosiver Stoffe , III . Ermittlung der   Empfindlichkeit explosiver Stoffe gegen thermische   Beanspruchung in einer Erhitzungskammer mit   verschiedenen definierten OEffnungen   ( Stahlhusenverfahren ) , Explosive Stoffe , Vol.   4 , 1956 , p. 119-125 , 143-148 .     ( 4 ) Koenen , H. , Ide , K. H. , Haupt W. , UEber   die Pruefung explosiver Stoffe , IV . Ermittlung der   Schlagempfindlichkeit explosiver Stoffe von fester ,   fluessiger und gelatinoser Beschaffenheit , Explosive   Stoffe , Vol. 6 , 1958 , p. 178-189 , 202-214 und 223-235 .     ( 5 ) ONU , 1980 , December , United Nations   Committee of Experts on the Transport of Dangerous   Goods ( document ST/SG/AC/.10/5/Add.3 , Table 4.3 ) .    Apêndice    Exemplos da especificação do material     ( 1 ) Spécification n º 1.0336.505 g ,   conformément à DIN 1623 , feuille 1     ( 2 ) Spécification n º 1.4873 , conformément   à la feuille « Stahl-Eisen-Werkstoff » 490-52 .     ( 3 ) Spécification n º 1.3817 , conformément   à la feuille « Stahl-Eisen-Werkstoff » 490-52 .    Figura 1 : v. JO    Figura 2 : v. JO    Figura 3a    Material : latão : v. JO    Figura 3b    Material : latão : v. JO    A.15 . AUTO-INFLAMABILIDADE ( DETERMINAÇÃO DA   TEMPERATURA RELATIVA DE AUTO-IGNIÇÃO DOS   LÍQUIDOS VOLÁTEIS E DOS GASES )    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    É útil dispor de informações preliminares   sobre a auto-inflamabilidade de uma substância .   A técnica seguidamente descrita é aplicável   às substâncias gasosas e líquidas   voláteis e aos seus vapores que , nas suas formas   comerciais , podem ser inflamados por uma   superfície quente em presença do ar . A   temperatura de auto-inflamibilidade pode ser   consideravelmente reduzida pela presença de   impurezas catalíticas .    1.2 . Definições e unidades    O grau de auto-inflamibilidade é expresso   em termos da temperatura de auto-ignição .    A temperatura de auto-ignição é a mais   baixa temperatura a que se inflama a substância de   ensaio misturada com ar e nas condições definidas   no método de ensaio .    1.3 . Substâncias de referência    Não especificadas .    1.4 . Príncipio do método    A auto-inflamabilidade dos gases e vapores   é determinada por meio do aparelho descrito na   norma ± EC 79-4 .    1.5 . Critérios de qualidade    A reprodutibilidade é função do intervalo   de temperatura de auto-ignição e do método   utilizado : máximo ± 0,5 ° C .    A sensibilidade depende do método de ensaio   utilizado .    A especificidade depende igualmente do método   utilizado .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Aparelho    O aparelho encontra-se descrito no método   referido no ponto 1.6.3 .    1.6.2 . Condições do ensaio    É ensaiada uma amostra da substância de   acordo com o ponto 1.6.3 .    1.6.3 . Desenvolvimento do ensaio    Ver as normas ± EC 79-4 , DIN 51794 , ASTM-E   659-78 e BS 4056 .    2 . RESULTADOS    Anotar a temperatura do ensaio , a pressão   atmosférica , a quantidade da amostra utilizada e   o intervalo de tempo que decorre antes de se produzir   a ignição .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    O relatório deve conter , se possível , as   seguintes informações :     - indicação precisa da substância   ( identificação e impurezas ) ,     - quantidade da amostra utilizada e pressão   atmosférica ,     - resultados das medições ( temperaturas do   ensaio , resultados referentes à ignição e   intervalos de tempo correspondentes ) ,     - qualquer observação útil complementar   para a interpretação dos resultados .    4 . REFERÊNCIAS    Nenhuma .    A.16 . AUTO-INFLAMABILIDADE ( SÓLIDOS -   DETERMINAÇÃO DA TEMPERATURA RELATIVA DE   AUTO-IGNIÇÃO )    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    As substâncias explosivas e as que sofrem   combustão espontânea em contacto com o ar à   temperatura ambiente não devem ser submetidas a   este ensaio .    O objectivo é , pois , fornecer dados preliminares   sobre a inflamabilidade espontânea das   substâncias sólidas a temperatura elevada .    Se o calor libertado , quer por uma reacção   da substância com o oxigénio , quer por   decomposição exotérmica , não se dissipa   com suficiente rapidez no ambiente , o auto-aquecimento   provoca uma auto-ignição . Esta produz-se ,   por consequência , sempre que a velocidade da   produção de calor excede a velocidade de   dissipação do mesmo .    O processo de ensaio é útil mesmo como   teste preliminar de protecção das substâncias   sólidas . Tendo em conta a natureza complexa   da ignição e da combustão de sólidos ,   a temperatura de auto-ignição determinada   segundo este método só serve para fins   comparativos .    1.2 . Definição e unidades    A temperatura de auto-ignição , tal como é   determinada por este método , é a temperatura   ambiente mínima expressa em graus Celsius ( ° C ) ,   à qual um certo volume de uma substância sofre   ignição espontânea em condições definidas .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método    Colocar um volume definido da substância   a ensaiar num forno à temperatura ambiente ; fazer   aumentar a temperatura do forno ate 400 ° C   a uma velocidade de 0,5 ° C por minuto e   registar a curva temperatura/tempo determinada   no centro da amostra . A temperatura do forno ,   à qual a temperatura da amostra atinge 400 ° C   por auto-aquecimento , é chamada temperatura de   auto-ignição , para os fins do presente ensaio .    1.5 . Critérios de qualidade    Nenhuns .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Equipamento    1.6.1.1 . Forno    Forno de laboratório de temperatura programada   ( volume : cerca de 2 l ) , equipado com   circulação de ar natural e válvula de   explosão . Deve garantir que os gases de   decomposição não possam entrar em contacto   com as resistências eléctricas de aquecimento ,   evitando-se assim qualquer risco potencial de   explosão .    1.6.1.2 . Cubo de rede em arame    Cortar , seguindo o modelo indicado na figura 1   ( Ver apêndice ) um pedaço de rede em arame   de aço inoxidável , com largura de malha   de 0,045 mm . Dobrar a rede em forma de cubo aberto ,   isto é , sem a face superior e fixá-la com   arame .    1.6.1.3 . Termopares    Termopares adequados .    1.6.1.4 . Registador    Qualquer registador de 2 canais , calibrado   de 0 a 600 ° C ou a tensões correspondentes .    1.6.2 . Condições do ensaio    O ensaio incidirá sobre as substâncias tal como   se apresentam na sua forma comercial .    1.6.3 . Desenvolvimento do ensaio    Encher o cubo da substância a ensaiar .   Comprimi-la suavemente e juntar nova quantidade até   encher completamente o cubo . Suspender a   amostra no centro do forno à temperatura ambiente .   Colocar um termopar no centro do cubo e outro entre   este e a parede do forno , para registo da   temperatura deste .    As temperaturas do forno e da amostra são   registadas continuamente , elevando a temperatura do   forno até 400 ° C , ou até ao ponto de   fusão do sólido ( se este valor for menor ) a uma   velocidade de 0,5 ° C/minuto .    Logo que a substância sofrer ignição , o   termopar da amostra indicará uma forte subida   de temperatura em relação à temperatura do   forno .    2 . RESULTADOS    É pertinente para a avalia , a temperatura do   forno à qual a temperatura da amostra atinge   400 ° C por auto-aquecimento ( Ver figura 2 ) .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    Do relatório devem constar os seguintes dados :     - descrição da substância ,     - resultados das medições , incluindo   a curva temperatura/tempo ,     - quaisquer observações complementares ,   pertinentes para interpretação dos resultados .    4 . REFERÊNCIAS    Nenhuma .    Apêndice    Figura 1    Modelo do cubo de ensaio de 20 mm : v. JO    Figura 2    Curva tipo da temperatura/tempo : v. JO    A.17 . PROPRIEDADES COMBURENTES    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Antes de efectuar este ensaio é útil possuir   informações preliminares sobre propriedades   potencialmente explosivas e toxicidade eventual   da substância .    Não é aplicável aos líquidos , gases ,   substâncias explosivas ou facilmente inflamáveis ,   peróxidos orgânicos e substâncias sólidas   que possam fundir nas condições do ensaio .    Este ensaio é irrelevante quando pelo exame   da estrutura química se demonstrar indubitavelmente   que a substância ou a preparação não dá   reacção exotérmica com um combustível .    Deve ser efectuado um ensaio prévio para   assegurar que para este ensaio não são necessárias   precauções especiais .    1.2 . Definições e unidades    Tempo de combustão : tempo de reacção   expresso em segundos , medido na zona de reacção   que se propaga pelo volume da amostra segundo   o processo descrito no ponto 1.6 .    Velocidade de combustão : expressa em milímetros   por segundo .    Velocidade máxima de combustão : o valor   mais elevado das velocidades de combustão obtido com   misturas que contenham 10 a 90 % , em peso , de   comburente ( oxidante ) .    1.3 . Substâncias de referência    O nitrato de bário ( de pureza analítica )   é utilizado como substância de referência para   o ensaio e ensaio preliminar .    O dicromato de potássio pode também ser   utilizado no ensaio preliminar .    Devem ser tomadas precauções especiais   para a manipulação do dicromato de potássio .    A mistura de referência é constituída   por nitrato de bário e por celulose em pó ,   preparada de acordo com o ponto 1.6 e   possuindo uma velocidade de combustão máxima   ( trata-se usualmente de uma mistura que contenha 60 % ,   em peso , de nitrato de bário ) .    1.4 . Princípio do método    É feito um ensaio prévio por razões   de segurança . Caso o ensaio preliminar mostre   que a substância tem propriedades oxidantes   é inútil o ensaio . Excluindo este caso ,   a substância ou a preparação é submetida ao   ensaio completo .    Neste ensaio , a substância e um combustível   definido são misturados em proporções   variáveis . Cada uma destas misturas é   então disposta numa pilha que é inflamada numa   extremidade . A velocidade máxima de combustão   determinada é comparada com a velocidade máxima   de combustão da mistura de referência .    1.5 . Critérios de qualidade    Se necessário , qualquer método de trituração   e de mistura é válido , desde que a diferença   entre a velocidade máxima de combustão obtida   e a média aritmética não exceda 10 % nos   6 ensaios .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Ensaio preliminar    Secar a substância , tal como se encontra   comercializada . Depois , misturá-la grosseiramente   com celulose ou serradura seca na proporção   de 2:1 ( Substância : celulose ou serradura )   em peso ; a mistura assim obtida é posta numa   pequena pilha cónica , de 3,5 cm de diâmetro   de base e de 2,5 cm de altura , por enchimento sem   compressão de uma forma cónica adequada ( por   exemplo : um funil em vidro de laboratório ,   cujo tubo é fechado ) .    A pilha é então posta numa superfície fria ,   impermeável e não condutora , sobre a fonte   de ignição . A fonte de ignição é composta   por um fio metálico inerte de platina ou níquel   ( que pode ser aquecido até cerca de 1 000 ° C ) ,   colocado aproximadamente a 1 mm acima da superfície   de ensaio e atravessando a base da pequena pilha   cónica . O ensaio deve ser realizado numa horte   ( Ver 1.6.3 ) .    A fonte de ignição permanece ligada durante   o teste .    A intensidade e duração da reacção   resultante são observadas e anotadas .    A substância ou preparação deve ser considerada   como oxidante se a reacção for vigorosa .    Sempre que haja dúvidas quanto ao resultado ,   é então necessário realizar o ensaio completo ,   a seguir descrito .    1.6.2 . Preparações    1.6.2.1 . Substância de ensaio    A amostra é tratada como se segue , a fim de   se obter uma granulometria inferior a 0,125 mm :   peneirar a substância tal como é comercializada .   Triturar a fracção que restou , repetindo a   operação tantas vezes quantas as necessárias   para que toda a amostra passe através do peneiro .    Podem ser utilizados quaisquer métodos de   trituração e peneiramento que respeitem os   critérios de qualidade .    Secar a substância a 105 ° C até se obter   um peso constante antes de se proceder à mistura .   Se a temperatura de decomposição da substância   for inferior a 105 ° C , a substância será   secada a uma temperatura menos elevada .    1.6.2.2 . Combustível    O combustível é a celulose em pó do tipo   utilizado em cromatografia em camada fina ou em   coluna . E adequada uma celulose cujo comprimento   em mais de 85 % das fibras esteja compreendido entre   0,020 mm e 0,075 mm . O pó da celulose é peneirado   num peneiro de 0,125 mm de malha .    Antes da preparação da mistura , secar a   celulose a 105 ° C até obter um peso constante .    Se for utilizada serradura de madeira no ensaio   preliminar , prepara-se uma serradura de madeira   macia que passe no peneiro de 1 600 microns , que   será misturada e depois seca durante 4 h em camadas   de espessura inferior a 25 mm . A serradura é   então arrefecida e conservada numa embalagem   estanque e tão cheia quanto possível . Utiliza-se   de preferência nas 24 h após a secagem .    1.6.2.3 . Misturas    Preparar misturas de comburente e de celulose   que contenham de 10 a 90 % , em peso , do comburente   por adições de 10 % . Para os casos limites ,   utilizar misturas intermédias para determinar com   maior precisão a velocidade máxima de combustão .    Nota :    As misturas de oxidante e de celulose devem ser   tratadas como potencialmente explosivas e devem ser   manipuladas com prudência .    Faz-se a pequena pilha utilizando uma forma metálica   de secção triangular com 250 mm de comprimento ,   altura interior de 10 mm e largura interior de 20 mm .    Colocar de ambos os lados da forma uma armação   metálica que exceda em 2 mm o bordo superior da   secção triangular ( Ver a figura no apêndice ) .   Encher , sem comprimir , a forma com um ligeiro   excesso da mistura . Após se ter deixado cair   uma vez a forma de uma altura de 2 cm sobre uma   superfície dura , eliminar o material excedentário   por meio de uma raspadeira actuando obliquamente .   Retirar então a armação metálica e nivelar   a superfície do pó com um rolo . Dispor uma   placa não combustivel sobre a forma , inverter   e desenformar .    1.6.2.4 . Fonte de ignição    Utilizar a chama dum queimador de gás ou um   fio de platina aquecido electricamente a 1 000 ° C .    1.6.3 . Condições de ensaio    Colocar o monte numa hotte , perpendicularmente   ao sentido da corrente de ar .    A velocidade de aspiração da hotte não   deve variar durante os ensaios e deve ser suficiente   para evitar que os fumos não se escapem para o   laboratório . Coloca-se um resguardo em torno do   aparelho .    Devido às propriedades higroscópicas da celulose   e das substâncias a ensaiar , o ensaio deve ser   realizado o mais rapidamente possível .    Aplicar uma chama ou o fio de platina incandescente   a uma extremidade do monte . Medir o tempo de   reacção numa distância de 200 mm , medido depois   da zona de reacção ter percorrido uma distância   inicial de 30 mm .    O ensaio é efectuado com a substância de referência .   Em seguida efectua-se pelo menos uma vez o ensaio   com cada uma das misturas , da substância a ensaiar   com a celulose . Se se encontrar uma velocidade de   combustão máxima significativamente maior do que a   da substância de referência , o ensaio pode ser   interrompido . De outro modo com as três misturas que   deram as 3 velocidades de combustão mais elevadas ,   os ensaios devem ser repetidos 5 vezes .    2 . RESULTADOS    Por razões de segurança será considerada   a velocidade máxima de combustão e não a média   das velocidades para caracterizar as propriedades   comburentes da substância examinada .   Para considerar uma dada mistura , a velocidade   de combustão mais elevada medida durante 6 ensaios .    Fazer um gráfico da velocidade de combustão   mais elevada para cada mistura em função do teor de   comburente .    Deduzir do gráfico a velocidade máxima de   combustão .    As 6 velocidades de combustão medidas para a   mistura que deu a velocidade máxima de combustão   não devem desviar-se de mais de 10 % da média   aritmetica . Caso contrário importa melhorar os   métodos de trituração e de mistura .    Comparar a velocidade máxima de combustão   obtida com a velocidade máxima de combustão da   mistura de referência ( ver 1.3 . ) .    3 . RELATÓRIO DO ENSAIO    3.1 . Relatório    O relatório conterá , se possível , os   elementos seguintes :     - descrição da substância a examinar ,     - todos os tratamentos da amostra ( por exemplo :   trituração/secagem , etc ) ,     - resultados das medições ,     - tipo de reacção ( por exemplo : combustão   rápida superficial , combustão envolvendo toda   a massa , quaisquer observações referentes aos   produtos de combustão , etc. ) ,     - todas as observações adicionais úteis   à interpretação dos resultados , incluindo uma   descrição da intensidade ( chama , faísca ,   fumos , lentidão da incandescência , etc. ) e a   duração aproximada da reacção observada   durante o teste preliminar de protecção para   a substância e para a substância de referência .    3.2 . Interpretação dos resultados    Uma substância é considerada como comburente   quando :    a ) No ensaio preliminar ela tem uma reacção   vigorosa ;    b ) No ensaio , a velocidade máxima de combustão   é superior ou igual à da mistura de referência   celulose e nitrato de bário .    4 . REFERÊNCIAS    Nenhumas .    Apêndice    Figura    Forma e acessórios para a preparação do   monte : v. JO    PARTE B : MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DA TOXICIDADE    INTRODUÇÃO GERAL : PARTE B    A . INTRODUÇÃO    Ver a introdução geral .    B . DEFINIÇÕES    i ) A tozicidade aguda inclui os efeitos desfavoráveis   que se manifestam durante um período imposto   ( habitualmente 14 dias ) após a administração   de uma dose única de substância .    ii ) A DL50 dose letal média ) é a dose única   que é , estatisticamente , responsável pela morte   de 50 % dos animais aos quais a substância foi   administrada . O valor de DL50 é expresso em peso da   substância testada em relação à unidade   de peso dos animais submetidos à experiência   ( mg/kg ) .    iii ) A CL50 ( concentração letal média )   é a concentração de uma substância que é ,   estatisticamente , responsável durante uma exposição   ou num intervalo definido após aquela , pela morte de   50 % dos animais expostos durante um período   determinado . O valor de CL50 é expresso em   peso da substância testada em relação a um   volume padrão de ar ( mg/l ) .    iv ) O nivel sem efeitos tóxicos é representado   pela dose ou o nível de exposição máxima ,   que não produz efeito desfavorável detectável   na experiência .    v ) A toxicidade subaguda/subcrónica inclui os   efeitos desfavoráveis que aparecem nos animais de   experiência como resultado de administrações   diárias de uma substância ou quando são expostos   diariamente durante um período breve em relação   ao seu tempo previsto de vida .    vi ) A dose máxima tolerável ( DMT ) é o   nível de intoxicação mais elevado que produz na   experiência onde é utilizada , sinais de   toxicidade sem alterar grandemente a sobrevivência dos   animais , por exemplo , aquando de um estudo de   carcinogenicidade , devido a efeitos diferentes   dos tumores .    vii ) A irritação cutânea consiste na   produção de alterações cutâneas reversíveis   de natureza inflamatória que aparecem após a   aplicação duma substância .    viii ) A irritação dos olhos é a produção   de modificações oculares reversíveis que   aparecem após a aplicação da substância   na superfície anterior do olho .    ix ) A sensibilização da pele ( dermites de   contacto alérgico ) é uma reacção cutânea   de origem imunologica a uma substância .    C . AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO    Há limites na extrapolação directa para   o homen dos resultados obtidos por experimentação   animal e dos obtidos in vitro ; é pois necessário   ter esse facto em conta aquando da avaliação e da   interpretação dos ensaios de toxicidade .    Desde que existam , os dados relativos ao homen   são considerados como os mais adequados para a   determinação dos efeitos potenciais das   substâncias químicas sobre a população humana .    MUTAGENICIDADE ( incluindo os ensaios de rastreio   da cancerigenicidade )    A avaliação preliminar do potencial mutagénico   de uma substância necessita da obtenção de   informações relativas a dois mecanismos :   mutação genética e alterações cromossómicas .    Estes dois mecanismos são estudados através   dos testes seguintes :    i ) Testes baseados na aparição de mutações   genéticas ( exactas ) nas células procariontes ,   tais como a Salmonella typhimurium ; pode igualmente   utilizar-se a Escherichia coli . A escolha de um   destes organismos é determinada pela natureza da   substância a testar .    ii ) Testes baseados na produção de alterações   cromossómicas das células dos mamíferos   cultivadas in vitro ; pode igualmente operar-se   in vivo ( o teste do micronúcleo ou a análise das   células da medula ossea no estádio de metafase ) .    D . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    A toxicologia é uma ciência experimental em   pleno desenvolvimento e existe na extensa bibliografia   sobre cada assunto . Informações úteis figuram   nas directivas correspondentes da Organização de   Cooperação e Desenvolvimento Económico ( OCDE ) .    Observações complementares    Cuidados a ter com os animais    Nas experiências toxicológicas é essencial   proceder a controlos rigorosos das condições   ambientais e usar técnicas de cuidados apropriados   relativamente aos animais .    i ) Condições de alojamento    As condições ambientais dos locais ou recintos   das experiências devem ser adequados à natureza   da espécie utilizada . Para os roedores , a   temperatura deve ser 22 ° C ( ± 3 ° C ) e humidade   relativa de 30 a 70 % ; para os coelhos e cobaias ,   a temperatura deve ser 20 ° C ( ± 3 ° C ) e   humidade relativa de 30 a 70 % .    Certas técnicas experimentais são particularmente   sensíveis aos efeitos da temperatura e , nestes   casos , indicações detalhadas relativamente às   condições adequadas , são incluídas na   descrição do método . Em todas as investigações   sobre os efeitos tóxicos , os valores da temperatura   e da humidade devem ser vigiados e registados no   relatório final do estudo .    Sempre que se utilizar iluminação artificial ,   é normalmente necessário alternar 12 horas de luz   com 12 horas de escuridão . Os dados relativos ao   programa de iluminação devem ser registados e   incluídos no relatório final .    Nos relatórios sobre experiências em animais ,   é importante indicar o tipo de gaiola utilizada , o   número de animais alojados em cada gaiola quer   durante a exposição as substâncias químicas   quer durante o período de observação que se   lhe segue .    ii ) Alimentação    Os regimes alimentares devem satisfazer todas   as necessidades alimentares da espécie sujeita à   experiência . Quando são incorporadas substâncias   a testar no alimento dos animais , o valor nutricional   desse alimento pode ficar reduzido , devido a uma   interacção entre a substância e um componente   alimentar .    A possibilidade de tal interacção deve ser   considerada , quando da interpretação dos resultados   do ensaio .    As impurezas contidas no regime alimentar e que se sabe   poderem influenciar a toxicidade não devem estar   presentes numa concentração tal que possam   originar interferências .    B.1 . TOXICIDADE AGUDA - ADMINISTRAÇÃO ORAL    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método de ensaio    São administrados oralmente doses crescentes   da substância de ensaio , por intubação ,   a vários lotes de animais de experiência ,   sendo utilizada uma só dose por lote .   Observam-se em seguida os efeitos e a mortalidade   devidos à substância . Os animais que morrem   durante o ensaio são autopsiados assim como   os que sobrevivem até à sua conclusão .   Este método é essencialmente destinado aos   estudos em roedores .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método de ensaio    1.6.1 . Preparação   Os animais são mantidos em condições de   alojamento e alimentação adequadas à   experiência , durante pelo menos os cinco dias   que a antecedem . Antes de começar o ensaio ,   os jovens animais adultos e saudáveis são   repartidos ao acaso entre os diferentes lotes   da experiência . Se necessário , a substância a   ensaiar é dissolvida ou posta em suspensão num   veículo apropriado . Recomenda-se a utilização   de soluções aquosas sempre que possível ou   então pode utilizar-se uma solução em óleo   vegetal e eventualmente uma solução com outros   veículos bem como uma suspensão . No que diz   respeito aos veículos não aquosos , a sua   toxicidade deve ser conhecida ou determinada antes   ou durante o ensaio . Normalmente , para os roedores ,   o volume não deve exceder 10 ml por quilograma do   peso corporal , excepto no caso das soluções   aquosas em que se pode utilizar 20 ml por quilograma .   A variação do volume de ensaio deve ser minimizada   pelo ajustamento da concentração , de modo a garantir   um volume constante para todas as doses estudadas .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Animais de experiência    Salvo contra-indicação , a ratazana é a espécie   preferida .    É necessário utilizar estirpes de laboratório   correntes . Para cada sexo , a diferença de peso   entre os animais utilizados para um ensaio não   deve exceder ± 20 % do valor médio adequado .    1.6.2.2 . Número e sexo    São utilizados pelo menos 10 roedores ( 5 fêmeas   e 5 machos ) por cada dose . As fêmeas devem ser   nulíparas e não grávidas .    1.6.2.3 . Doses    As doses devem ser em número suficiente , pelo   menos três , e espaçadas de modo adequado ,   para produzirem lotes que apresentem uma gama de   efeitos tóxicos e de taxas de mortalidade . Os   dados devem ser suficientes para permitirem traçar   uma curva doses/respostas e , se possível , uma   determinação válida de DL50 .    1.6.2.4 . Ensaio limite    Obtém-se uma estimativa adequada do potencial de   toxicidade oral aguda para a maior parte das   utilizações , se não se observar mortalidade   devida à substância , num lote tratado   ( 5 animais de cada sexo ) , nos catorze dias   que se seguem à administração duma dose   de 5 000 mg/kg .    1.6.2.5 . Período de observação    O período de observação deve no mínimo   estender-se a 14 dias . No entanto a sua duração   não deve ser fixada de forma rígida . Esse   período deve ser determinado em função das   reacções de toxicidade , velocidade da sua   aparição e duração do período de   recuperação ; pode pois ser prolongado em caso de   necessidade . O momento em que os sintomas de   toxicidade aparecem e desaparecem , assim como o   momento da morte , são importantes , sobretudo ,   se há tendência para a morte ser retardada .    1.6.3 . Técnica    Os animais devem estar em jejum antes da   administração da substância . No caso do rato ,   este deve ser privado de alimento durante a noite que   precede a administração da substância ; para os   animais com metabolismo mais rápido , é   conveniente encurtar o período de jejum ; a   água não será limitada .    No dia seguinte , os animais devem ser pesados   antes que a substância de ensaio lhes seja   administrada por intubação , à razão duma   dose única por lote . Se a administração duma   dose única não for possível , a substância   pode ser administrada em fracções mais pequenas   durante um período que não exceda 24 horas .    Após a administração da substância , os animais   podem ainda ser privados de alimento durante três a   quatro horas . Se a dose é administrada por fracções   durante um certo lapso de tempo , pode ser necessário   fornecer alimentos e água aos animais em função   da duração do tratamento . Uma vez a substância   administrada , as observações são efectuadas e   registadas de modo sistemático , estabelecendo-se ,   se possível , uma ficha individual para cada animal .   No primeiro dia , as observações devem ser   frequentes . Deve ser feito um exame clínico   cuidadoso , pelo menos uma vez por cada dia de   trabalho . Quaisquer outras observações devem   ser feitas diariamente de modo a reduzir a perda de   animais para o estudo , por exemplo , por autópsia   ou refrigeração de animais encontrados mortos   assim como o isolamento ou o sacrifício de animais   fracos ou moribundos . A observação diária deve   incidir , entre outras , sobre as alterações na   pele e pêlos , olhos , mucosas , aparelho   respiratório , sistema circulatório , sistema   nervoso autónomo e central , assim como da actividade   somatomotora e do comportamento . Devem ser observados   com especial atenção os tremores , convulsões ,   salivação , diarreias , letargia , sono e coma .   O momento da morte deve ser registado com a maior   precisão possível .    Os animais que morrem durante a experiência e os que   sobrevivem no fim desta são autopsiados . Devem   ser registadas todas as alterações patológicas   macroscópicas . Se necessário , retirar tecidos   para exame histopatológico .    2 . DADOS    Os dados devem ser resumidos num quadro que indique ,   para cada lote de experiência , o número de   animais no início do ensaio , o momento da morte   de cada animal , o número de animais que apresentam   outros sintomas de toxicidade , a descrição   dos efeitos tóxicos e os resultados da   autópsia . O peso de cada animal deve ser determinado   e registado pouco tempo antes da administração   da substância de ensaio e depois , uma vez por   semana e no momento da morte . As alterações dos   pesos devem ser calculadas e registadas quando a   sobrevivência ultrapassa um dia . O valor de DL50   determina-se por aplicação de um método   reconhecido . A avaliação dos dados deve incluir   a relação , caso exista , entre as exposições   dos animais à substância e a incidência assim   como a gravidade de todas as anomalias , incluindo as   anomalias do comportamento e clínicas , as lesões   macroscópicas , as alterações de peso corporal ,   a mortalidade e qualquer outro efeito tóxico .    3 . RESULTADOS .    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório deve conter , se possível , as   informações seguintes :     - espécie , estirpe , origem , ambiente , regime   alimentar , etc. ,     - condições experimentais ,     - doses ( com a indicação das concentraçãos   e , se necessário , do veículo ) ,     - quadro dos dados , resposta por sexo e por dose   ( número de animais que morrem , número de animais   com sintomas de toxicidade , número de animais   expostos ) ,     - momento da morte após administração da dose ,     - resultados das observações diárias ;     - valor do DL50 , para cada sexo , determinado   no décimo quarto dia ( com indicação precisa do   método de cálculo ) ,     - intervalo de confiança de 95 % para DL50 ,     - curva dose/mortalidade e declive dessa curva   ( se o método de cálculo o permitir ) ,     - resultados da autópsia ,     - resultados histopatológicos ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    B.2 . TOXICIDADE AGUDA - ADMINISTRAÇÃO POR   INALAÇÃO    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método de ensaio    São expostos vários lotes de animais de experiência   à substância de ensaio , em concentrações   crescentes , durante um período determinado , sendo   utilizada uma só concentração por lote .   Observa-se em seguida os efeitos e a mortalidade   devidos à substância . Os animais que morrem   durante o ensaio são autopsiados assim como os   que sobrevivem até à sua conclusão .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparação    Os animais são mantidos em condições de   alojamento e de alimentação adequadas à   experiência , pelo menos durante os cinco dias   que a antecedem . Antes do início do ensaio , os   jovens animais adultos e saudáveis são repartidos   ao acaso pelos diferentes lotes . Não é   necessário submetê-los a exposição   simulada , a menos que o dispositivo da exposição   utilizado o exiga .    Se necessário pode adicionar-se à substância   do ensaio um veículo adequado com o fim de se obter   uma concentração adequada da substância do   ensaio na atmosfera , e deve então ser utilizado   um grupo testemunha para este veículo . Se um   veículo ou outros aditivos são utilizados para   facilitar a dosagem , estes devem ser considerados   não tóxicos . Os dados já disponíveis podem   ser utilizados , se necessario .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Animais de experiência    Salvo contra-indicação , a ratazana é   a espécie preferida . Devem ser utilizadas estirpes   correntes de laboratório . Para cada sexo a diferença   de peso entre os animais utilizados para um dado ensaio   não deve exceder ± 20 % do valor médio   adequado .    1.6.2.2 . Número e sexo    Pelo menos 10 roedores ( 5 fêmeas e 5 machos )   são utilizados para cada nível de concentração .   As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas .    1.6.2.3 . Concentrações da exposição    As concentrações devem ser em número   suficiente , pelo menos três , e espaçadas de   forma conveniente para se obterem lotes que apresentem   uma gama de efeitos tóxicos e de taxa de mortalidade .   Os dados devem ser suficientes para permitir traçar   uma curva concentração/mortalidade e , se   possível , uma determinação válida do CL50 .    1.6.2.4 . Ensaio limite    Se uma exposição de 5 machos e 5 fêmeas a uma   concentração de 20 mg/l de um gás ou 5 mg/l de um   aerossol ou de partículas durante 4 horas ou ,   desde que tal não seja possível devido às   propriedades químicas e físicas ( isto é   explosivas ) da substância de ensaio , uma   exposição à concentração máxima possível ,   não causar a morte de qualquer animal em 14 dias ,   pode considerar-se inútil prosseguir o ensaio .    1.6.2.5 . Duração da exposição    A duração da exposição é de pelo menos 4 horas .    1.6.2.6 . Dispositivo experimental    Os animais devem ser expostos à substância por   meio de um dispositivo de inalação que produza uma   corrente de ar que assegure pelo menos 12 renovações   do ar por hora , um teor suficiente em oxigénio e   uma distribuição uniforme do produto do ensaio no   ar . Se se utilizar uma câmara , esta deve ser   concebida de forma a evitar , tanto quanto possível ,   que os animais fiquem amontoados , e que lhes assegure   uma exposição máxima , por inalação , à   substância de ensaio . Regra geral , para assegurar a   estabilidade da atmosfera de uma câmara , o   « volume » total dos animais da experiência   não deve exceder 5 % do volume da câmara . Pode   também recorrer-se a um sistema de exposição   oro-nasal , somente da cabeça ou de todo o corpo   em câmara individual ; os dois primeiros tipos de   exposição evitam a absorção da substância   do ensaio por outras vias .    1.6.2.7 . Período de observação    O período de observação deve estender-se ,   pelo menos , por catorze dias . No entanto , esta   duração não deve ser fixada de forma rígida ,   devendo ser determinada em função   das reacçóes de toxicidade , da rapidez   da sua aparição e da duração do período de   recuperação ; esta pode pois ser prolongada se   necessário . O momento em que os sintomas de toxicidade   aparecem e desaparecem assim como o momento da morte   são importantes , sobretudo se há tendência para   a morte ser retardada .    1.6.3 . Técnica    Pouco tempo antes da exposição , os animais são   pesados e depois expostos na câmara de exposição   à concentração de ensaio , durante pelo menos   4 horas , após a estabilização da concentração .   Esta deve ser rápida . A temperatura a qual se efectua   o ensaio deve ser mantida a 22 ° C ± 3 ° C .   O ideal será manter a humidade relativa entre 30 e 70 % ,   mas , em certos casos ( por exemplo aerossóis ) , isto   pode não ser possível . Os animais devem ser privados   de alimento e de água durante a exposição . É   conveniente utilizar um sistema de inalação que   funcione em condições dinâmicas   e que seja munido dum dispositivo para controlo   analítico da concentração .    Para determinar as concentrações de exposição   adequadas , recomenda-se um ensaio preliminar . O   sistema deve permitir criar condições de   exposição estáveis tão rapidamente quanto   possível . O débito do ar deve ser regulado de modo   a assegurar condições uniformes em toda a   câmara de exposição .     É conveniente medir ou manter sob vigilância :    a ) O débito do ar ( permanentemente ) ;    b ) A concentração real da substância de   ensaio na zona de respiração . Durante o   período de exposição , a concentração   não deve variar mais do que ± 15 % em relação   ao valor médio . No entanto , no caso de poeiras   ou de certos aerossóis , este grau de controlo   pode não ser obtido e é então aceitável um   desvio maior . As substâncias em partículas e os   aerossóis devem ser analisados tão frequentemente   quanto seja necessário para determinar ( pelo   menos uma vez ) a distribuição dos tamanhos   das partículas ;    c ) A temperatura e a humidade ;    d ) As observações realizam-se durante e   após a exposição e são registadas sistematicamente ;   deve ser estabelecida uma ficha individual para cada   animal . No primeiro dia as observações devem ser   frequentes . Deve ser efectuado um exame clínico   cuidadoso pelo menos uma vez em cada dia de   trabalho . Outras observações complementares   devem ser feitas diariamente , e a fim de se reduzir em   cada estudo o número de animais perdidos , devem   ser tomadas medidas adequadas , como por exemplo ,   autópsia ou refrigeração dos animais   encontrados mortos , assim como o isolamento ou   sacrifício dos animais fracos ou moribundos .    A observação diária deve incidir , entre   outras , sobre as alterações na pele , pêlos ,   olhos , mucosas , aparelho respiratório , sistema   circulatório , sistema nervoso autónomo e central   assim como da actividade somatomotora e do comportamento .   Devem ser observados com atenção particular a   respiração , tremores , convulsões , salivação ,   diarreias , letargia , sono e comas . Deve ser registado   o momento da morte com tanta precisão quanto possível .   O peso de cada animal deve ser determinado todas   as semanas após a exposição assim como no momento   da morte . Os animais que morrem durante a experiência   e os que sobrevivem no final desta são submetidos   a uma autópsia que incide , em particular ,   sobre todas as alterações nas vias respiratórias   superiores e inferiores . Devem ser registadas todas   as alterações . Se necessário , retirar tecidos   para exame histopatológico .    2 . DADOS    Os dados devem ser resumidos num quadro que   indique , para cada lote de experiência , o número de   animais no início do ensaio , o momento da morte   de cada animal , o número de animais que apresentam   outros sintomas de toxicidade , a descrição   dos efeitos tóxicos e os resultados da autópsia .   As alterações de peso devem ser calculadas   e registadas desde que a sobrevivência ultrapasse   um dia . O valor do CL50 deve ser determinado   por um método reconhecido . A avaliação dos   dados deve , nomeadamente , pôr em   evidência , caso exista , a relação entre a   exposição dos animais à substância do   ensaio e a incidência assim como a gravidade de todas   as anomalias , incluindo as alterações do   comportamento , as anomalias clínicas , as   lesões macroscópicas , as alterações do   peso corporal , a mortalidade e quaisquer outros   efeitos tóxicos .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio deve conter , se   possível , as informações seguintes :     - espécie , estirpe , origem , meio ambiente ,   regime alimentar , etc. ;     - condições experimentais :    descrição do dispositivo de exposição   incluindo : concepção , tipo , dimensões , fonte   de ar , sistema gerador de partículas e de   aerossóis , método de condicionamento do ar e ,   se for caso disso , modalidades da estadia dos animais   na câmara de ensaio .    Devem ser descritos os dispositivos utilizados   para a medição da temperatura e da humidade , assim   como da concentração e do tamanho das partículas   e dos aerossóis .    Dados relativos à exposição :    Devem ser apresentados sob a forma de um quadro que   indique os valores médios assim como uma medição   da variabilidade ( por exemplo : desvio-padrão ) ;   devem incluir :    a ) Débito de ar através do dispositivo de   inalação ;    b ) Temperatura e humidade do ar ;    c ) Concentrações nominais ( quantidade total   da substância do ensaio introduzida no dispositivo   de inalação dividida pelo volume de ar ) ;    d ) Se for caso disso , natureza do veículo ;    e ) Concentrações reais na zona de respiração ;    f ) Dimensões médias das partículas ;    g ) Duração da estabilização ;    h ) Duração da exposição ;     - quadro indicando as reacções , por sexo   e por nível de exposição ( número de animais   que morrem , número de animais que apresentam   sinais de toxicidade , número de animais expostos ) ,     - momento da morte durante ou após a exposição ,     - resultados das observações diárias ,     - valor de CL50 para cada sexo determinado no fim   do período de observação ( com indicação   precisa do método de cálculo utilizado ) ,     - intervalo de confiança de 95 % para o CL50 ,     - curva de concentração/mortalidade e declive   dessa curva ( se o método de cálculo o permitir ) ,     - resultados da autópsia ,     - quaisquer resultados histopatológicos ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    B.3 . TOXICIDADE AGUDA-ADMINISTRAÇÃO CUTÂNEA    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método    São administradas doses crescentes da substância   de ensaio , por aplicação cutânea a vários   lotes de animais de experiência , usando uma única   dose por cada lote . Observar em seguida os efeitos e a   mortalidade causada pela substância . Os animais que   morrem durante o ensaio são autopsiados , assim como   os que sobrevivem até à sua conclusão .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparações    Os animais são mantidos em condições de   alojamento e de alimentação adequadas à   experiência , pelo menos durante os dias que   a antecedem . Antes do ensaio , os jovens animais   adultos e saudáveis são repartidos ao   acaso pelos diferentes lotes . Cerca de 24 horas antes   do ensaio , cortam-se ou rapam-se os pêlos   da região dorsal do tronco dos animais , evitando   qualquer lesão da pele susceptível de alterar a sua   permeabilidade .    A superfície preparada para aplicação da   substância não deve ser inferior a 10 % da   superfície corporal . Quando o ensaio é   realizado com substâncias sólidas , que podem ser   pulverizadas se necessário , a substância   a ensaiar deve ser humedecida com água ou ,   se necessário , com um veículo adequado , de   forma a garantir um bom contacto com a pele . Se se   utilizar um veículo , a sua influência sobre   a penetração da substância na pele deve ser tida   em consideração . As substâncias líquidas   são geralmente aplicadas sem diluição .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Animais de experiência    Podem utilizar-se ratazanas ou coelhos adultos .   Podem igualmente utilizar-se outras espécies , mas   neste caso , justificando a sua utilização .   Devem ser utilizadas estirpes de laboratório   correntes . Para cada sexo , a diferença de peso   entre os animais utilizados para um ensaio não   deve exceder ± 20 % do valor médio adequado .    1.6.2.2 . Número e sexo    Pelo menos 10 animais ( 5 fêmeas e 5 machos )   com pele sã e intacta , por cada dose . As   fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas .   A utilização de um maior número de animais   pode justificar-se , sobretudo se se tratar de   coelhos .    1.6.2.3 . Doses    As doses devem ser em número suficiente , pelo   menos três , e espaçadas de modo a produzirem   lotes apresentando uma gama de efeitos tóxicos   e de taxas de mortalidade . Deve ser tomado em   consideração qualquer efeito irritante ou   corrosivo , aquando da escolha das doses . Os dados   devem ser suficientes para permitir traçar uma   curva doses/respostas e , se possível , permitir   uma determinação válida do DL50 .    1.6.2.4 . Ensaio limite    Se , aquando de um ensaio preliminar , a aplicação   da substância , em dose igual ou superior a 2 000 mg/kg   sobre a pele intacta de pelo menos cinco animais por   sexo , não provocar qualquer efeito letal devido à   substância durante catorze dias , pode considerar-se   inútil prosseguir o ensaio com outras doses .    1.6.2.5 . Período de observação    O período de observação deve pelo menos   estender-se por 14 dias . No entanto , a sua duração   não deve ser fixada de forma rígida . Deve ser   determinada em função das reacções de toxicidade ,   da rapidez da sua aparição e duração do   período de cura ; a duração pode pois ser   prolongada se necessário . O momento em que os   sintomas de toxicidade aparecem e desaparecem ,   a sua duração e o momento da morte são   importantes , sobretudo se há tendência para a   morte ser retardada .    1.6.3 . Técnica    Os animais devem ser colocados em gaiolas   individuais . A substância de ensaio deve ser   aplicada uniformemente sobre uma superfície   aproximadamente igual a 10 % da superfície   total do corpo . No caso de substâncias altamente   tóxicas , a superfície tratada pode ser menor ,   mas a substância de ensaio deve ser aplicada de modo   a formar uma camada tão delgada e uniforme   quanto possível .    As substâncias de ensaio são mantidas em   contacto com a pele por meio de um penso de gaze porosa ,   ou de um esparadrapo não irritante durante 24 horas .   A parte tratada deve , a1ém disso , ser   convenientemente coberta de modo a manter   o penso de gaze e a substância de ensaio no   lugar e a evitar que os animais possam ingerir   esta última . Podem utilizar-se aparelhos   de contenção para impedir a ingestão de   substância pelos animais mas não é recomendável   uma imobilização completa .    No final do período de exposição , a   substância do ensaio residual deve ser removida ,   se possível com água ou por meio de um outro   processo de limpeza da pele .    As observações devem ser registadas sistematicamente   à medida que são efectuadas , estabelecendo-se   uma ficha individual para cada animal . Os animais   devem ser observados frequentemente durante o   primeiro dia . Deve ser efectuado um exame   clínico cuidadoso pelo menos uma vez em cada dia de   trabalho . Quaisquer outras observações devem   ser feitas diariamente e devem ser tomadas medidas   adequadas para reduzir a perda de animais no estudo ,   por exemplo pela autópsia ou refrigeração dos   animais encontrados mortos , assim como o   isolamento ou sacrifício dos animais fracos   e moribundos . A observação diária deve   incidir , entre outras , sobre as alterações   nos pêlos , da pele tratada , dos olhos e   das mucosas , do aparelho respiratório ,   do sistema circulatório , do sistema nervoso autónomo   e central , assim como da actividade somatomotora   e do comportamento . São observados com   atenção particular : tremores , convulsões ,   salivação , diarreias , letargia , sono e comas .   O momento da morte deve ser registado com a maior   precisão possível . Os animais que morrem   durante a experiência e os que sobrevivem   no final desta são autopsiados . Devem ser   registadas todas as alterações patológicas   macroscópicas . Se necessário , retirar   tecidos para exame histopatológico .    2 . DADOS    Os dados devem ser resumidos num quadro que   indique para cada lote , o número de animais   no início do teste , o momento da morte de   cada animal , o número de animais que apresentam   outros sintomas de toxicidade , a descrição   dos efeitos tóxicos e os resultados da autópsia .   O peso de cada animal deve ser determinado e   registado pouco tempo antes da aplicação da   substância e depois uma vez por semana e   no momento da morte ; as alterações de peso   devem ser calculadas e registadas quando a   sobrevivência excede um dia . O valor de DL50 deve   ser determinado por aplicação de um método   reconhecido . A avaliação dos dados inclui   as relações , caso existam , entre a exposição   dos animais à substância e a incidência assim   como a gravidade de todas as anomalias , incluindo   as alterações de comportamento e as anomalias   clínicas , lesões macroscópicas , alterações   no peso corporal , efeitos sobre a mortalidade e   qualquer outro efeito tóxico .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório deve conter , se possível ,   as informações seguintes :     - espécie , estirpe , origem , meio ambiente ,   regime alimentar , etc. ,     - condições experimentais ( incluindo o   processo de limpeza de pele ) ,     - doses ( com indicação das concentrações e ,   se for caso disso , do veículo ) ,     - quadro dos dados , respostas por sexo e por   dose ( número de animais que morrem , número de   animais que apresentam sintomas de toxicidade ,   número de animais expostos ) ,     - momento da morte após a administração   da dose ,     - resultados e observações diárias ,     - o valor de DL50 para cada sexo , determinado   no décimo quarto dia , com indicação precisa do   método de cálculo ,     - intervalo de confiança de 95 % para o DL50   ( quando determinável ) ,     - curva dose/mortalidade e declive dessa curva ,   se o método de cálculo o permitir ,     - resultados da autópsia ,     - resultados histopatológicos ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    B . 4 . TOXICIDADE AGUDA    IRRITAÇÃO DA PELE    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método    A substância de ensaio é aplicada numa dose   única sobre a pele de vários animais de   experiência , constituindo cada um de entre eles   a sua própria testemunha . O grau da reacção   de irritação é observado e avaliado após   um lapso de tempo determinado ; será objecto de   uma descrição minuciosa , a fim de fornecer uma   avaliação completa dos efeitos . O período de   observação deve ser suficientemente longo para   poder avaliar completamente o carácter reversível   dos efeitos observados .    1.5 . Critério de qualidade   Nenhum .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparações    Vinte e quatro horas antes do ensaio , cortam-se   ou rapam-se os pêlos da região dorsal do animal .    Nesta operação , evitar escoriar a pele .   Só devem ser utilizados animais que apresentem uma   pele sã e intacta .    Se se submeterem a ensaio substâncias sólidas   ( que , se necessário , podem ser pulverizadas ) ,   a substância de ensaio deve ser suficientemente   humedecida com água ou , se necessário , com um   veículo adequado para garantir um bom contacto com   a pele . Neste último caso , deve ter-se em conta   a influência do veículo sobre a reacção   de irritação cutânea provocada pela substância   de ensaio . As substâncias líquidas são em   geral aplicadas sem diluição .    Não é necessário submeter as substâncias   fortemente ácidas ou alcalinas a um teste de   irritação primário da pele , devido ao   carácter previsível das suas propriedades corrosivas .   E inútil ensaiar as substâncias que se revelarem   muito tóxicas por via cutânea .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Animais de experiência    Apesar de poderem ser utilizadas várias espécies   de mamíferos , o coelho albino é a espécie   preferida .    1.6.2.2 . Número de animais    Utilizam-se pelo menos 3 animais adultos e sãos .   A utilização de um número maior pode revelar-se   necessária para esclarecer respostas equívocas .    1.6.2.3 . Doses    Salvo contra-indicações , um volume de   0,5 ml de substância líquida ou 0,5 g de   substância sólida ou semi-sólida é   aplicado no local escolhido . Não é necessário   um lote testemunha . Servem de testemunha as zonas   adjacentes de pele não tratada de cada animal .    1.6.2.4 . Período de observação    A duração do período de observação   não deve ser fixada de um modo rígido , deve   ser suficientemente longa para avaliar completamente   o carácter reversível ou irreversível dos   efeitos observados , mas não deve normalmente   exceder catorze dias .    1.6.3 . Técnica    Os animais devem ser colocados em gaiolas   individuais . A substância de ensaio deve ser   colocada sobre uma pequena superfície cutânea   ( cerca de 6 cm² ) e coberta com um pequeno   quadrado de gaze mantido no local por um esparadrapo   não irritante . Se se trata de líquidos ou   de certas pastas , pode ser necessário estender   primeiro a substância sobre o quadrado de gaze   e depois aplicar este sobre a pele . O quadrado   de gaze deve ser mantido em contacto com a pele   por meio dum penso semi-oclusivo adequado , durante   todo o período de exposição . A utilização   de um penso oclusivo pode , no entanto , ser necessário   em certos casos . É necessário impedir que o animal   tenha acesso ao quadrado de gaze com consequente   ingestão/inalação da substância de ensaio .    A duração da exposição é de 4 horas .   Se se suspeitar que a substância pode produzir uma   reacção cutânea grave ( por exemplo , ser   corrosiva ) , a duração da exposição deve   ser reduzida ( por exemplo a 1 hora ou a 3 minutos ) .    Quando se utilizar um período de exposição   inferior a 4 horas e se observar uma reacção   cutânea grave , não é necessário repetir   a experiência utilizando um período de exposição   de 4 horas . Podem ser indicadas exposições   mais longas sob certas condições , por exemplo   modos de utilização e de exposição previstos   para o homem . No final do período de exposição ,   a substância de ensaio deve ser eliminada , se   possível , com água ou um solvente adequado ,   tendo-se o cuidado de não alterar nem a   resposta existente nem a integridade da epiderme .    1.6.3.1 . Observação e classificação    A observação das manifestações   eritematosas e edematosas , assim como a sua   classificação serão efectuadas aos   30 e aos 60 minutos e , depois , às 24 , 48   e 72 horas após a remoção do penso . As   reacções de irritação são classificadas   e registadas de acordo com a escala que consta   do quadro em apêndice . Podem ser necessárias   outras observações para determinar o carácter   reversível das reacções . Além destas   observações relativas à irritação ,   qualquer lesão grave como a corrosão   ( destruição irreversível do tecido da   pele ) e qualquer outro efeito tóxico , devem   ser descritos integralmente .    2 . DADOS    Os dados devem ser resumidos num quadro que   indique , para cada animal , as classificações   para o eritema e edema durante todo o período   da observação . Deve registar-se qualquer lesão   grave , a descrição da intensidade e   da natureza da irritação , da corrosão ,   a sua reversibilidade assim como qualquer outro   efeito tóxico observado .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio deve conter , se possível ,   as informações seguintes :     - espécie , estirpe , origem , meio ambiente ,   regime alimentar , etc. ,     - condições experimentais ( incluindo   propriedades fisico-químicas importantes ,   modo de preparação e limpeza da pele ) ,     - quadro dos dados relativos à reacção   de irritação em cada animal e em cada observação   ( por exemplo 1 , 24 , 48 e 72 horas após   tirar o penso ) ,     - descrição de qualquer lesão grave   observada , incluindo a corrosão ,     - descrição da intensidade e da natureza   da irritação observadas e quaisquer resultados   histopatológicos ,     - descrição de qualquer efeito tóxico   além da irritação da pele ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    Apêndice    QUADRO : CLASSIFICAÇÃO DA REACÇÃO CUTÂNEA    Eritema e formação de escaras     * Valor *    Sem eritema * 0 *    Eritema muito leve ( apenas perceptível ) * 1 *    Eritema bem definido * 2 *    Eritema moderado a grave * 3 *    Eritema grave ( cor vermelha-violácea )   com leve escarificação ( lesão em profundidade ) * 4 *    Formação de edema    Sem edema * 0 *    Edema muito leve ( apenas perceptivel ) * 1 *    Edema ligeiro ( contorno da zona edematosa   bem definido por uma tumefacção nítida ) * 2 *    Edema moderado ( tumefacção de cerca de 1 mm ) * 3 *    Edema grave ( tumefacção superior a 1 mm   estendendo-se para além da região exposta ) * 4 *    B.5 . TOXICIDADE AGUDA    IRRITAÇÃO DOS OLHOS    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método    A substância de ensaio é aplicada sob a forma   de uma dose única , num dos olhos de cada animal   da experiência . O olho não tratado é   utilizado como testemunha . O grau de irritação   é avaliado e classificado em intervalos determinados ,   e é em seguida objecto duma descrição   que permite obter uma estimativa completa dos   efeitos . O período de observação deve ser   suficientemente longo para o carácter reversível   ou irreversível dos efeitos observados poder   ser avaliado completamente .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparações    Os dois olhos de cada animal da experiência ,   provisoriamente seleccionado para o ensaio , serão   examinados no decurso das 24 horas que precedem   a experiência . Os animais que apresentem uma   irritação dos olhos , defeitos oculares ou   uma lesão da córnea não devem ser utilizados .    Não é necessário submeter ao ensaio de   irritação de olhos as substâncias fortemente   alcalinas ou ácidas que tenham revelado uma   nítida actividade corrosiva num estudo de   irritação da pele ou em outros testes .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Animais de experiência    Apesar de terem sido utilizados diferentes   animais de experiência , recomenda-se a realização   do ensaio em coelhos albinos adultos e sãos .    1.6.2.2 . Número de animais    Devem ser utilizados pelo menos 3 animais . A   utilização de um número maior pode revelar-se   necessária para esclarecer respostas equívocas .    1.6.2.3 . Doses    Se a substância a testar é líquida ,   utiliza-se um volume de 0,1 ml . Para as substâncias   sólidas , as pastas e as substâncias em   partículas , a quantidade utilizada deve ter   um volume de 0,1 ml ou pesar cerca de 0,1 g   ( anota-se sempre o peso ) . Se a substância   de ensaio é sólida ou granulosa , deve ser   moída para se obter uma poeira fina . A medição   do volume das substâncias em partículas deve   ser precedida de uma compressão ligeira , por   exemplo , por pancadinhas no recipiente de medição .    1.6.2.4 . Período de observação    A duração do período de observação   não deve ser fixada rigidamente . Deve ser   suficientemente longa para avaliar o carácter   reversível ou irreversível dos efeitos observados ,   não devendo exceder normalmente 21 dias a   contar da instilação .    1.6.3 . Técnica    Os animais são colocados em gaiolas individuais .   A substância de ensaio é instilada no saco   conjuntival de um dos olhos de cada animal , após   ter sido afastada delicadamente a pálpebra inferior   do globo ocular . Em seguida , mantém-se   suavemente as pálpebras juntas durante cerca   de 1 segundo , para evitar o derrame da substância .   O olho não tratado servirá de testemunha .    Os olhos dos animais de experiência não   devem ser lavados durante as 24 horas que se seguem à   instilação da substância a ensaiar . Se   necessário pode-se fazer uma lavagem no final   da vigésima quarta hora . Para as substâncias   cujo carácter irritante é posto em evidência   por este ensaio , o valor da irrigação do   olho como meio de diminuir o efeito irritante   ou outros efeitos nocivos , pode ser examinado .   Neste caso é recomendada a utilização de   6 coelhos . Em 3 deles a lavagem será feita   4 segundos após a instilação da substância   de ensaio e nos outros 3 , 30 segundos depois .   Nos 2 lotes , a lavagem durará 5 minutos e   será efectuada utilizando um volume e uma   velocidade de circulação que não criem   alterações .    1.6.3.1 . Observação e classificação    Os olhos devem ser examinados após 1 , 24 , 48   e 72 horas . Se não se manifestar qualquer   irritação após 72 horas , o ensaio pode   ser terminado .    Pode revelar-se necessária uma observação   prolongada em caso de lesão persistente na   córnea ou qualquer outra irritação ocular ,   a fim de determinar a evolução das lesões   e o seu carácter reversível ou irreversível .   Além das observações relativas à córnea ,   à íris e à conjuntiva serão registadas   e descritas todas as outras lesões observadas .   A classificação da reacção ocular ( ver   quadro ) deve ser registada aquando de cada   exame . A classificação das respostas oculares   pode dar lugar a diversas interpretações .   A fim de ajudar os laboratórios de pesquisa   e as pessoas encarregadas de efectuar ou de   interpretar as observações , pode ser utilizado   um guia ilustrado com as irritações oculares .    Para facilitar o exame das reacções , pode   utilizar-se uma lupa binocular , uma lâmpada ,   um biomicroscópio ou qualquer outro aparelho   adequado . Após o registo das observações   efectuadas na vigésima quarta hora , o exame   dos olhos de alguns ou de todos os coelhos pode   ser prosseguido utilizando a fluoresceína .    2 . DADOS    Os dados devem ser resumidos sob a forma de um   quadro que indique , para cada animal , os indíces de   irritação no momento da observação indicada ,   uma descrição do grau e da natureza da irritação ,   a presença de lesões graves e qualquer efeito não   ocular observado .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio deve conter , se possível ,   as informações seguintes :     - dados relativos aos animais ( espécie ,   estirpe , origem , meio ambiente , regime alimentar ,   etc. ) ,     - condições experimentais ( incluindo as   propriedades físico-químicas importantes da   substância ) ,     - quadro com os efeitos irritantes/corrosivos   assinalados em cada animal no momento de cada   observação ( por exemplo , 1 , 24 , 48 e   72 horas ) ,     - descrições de qualquer lesão grave   observada ,     - descrição do grau e da natureza da   irritação ou da corrosão observadas , incluindo   a sua reversibilidade ,     - descrição do método utilizado para avaliar   a irritação após 1 , 24 , 48 e 72 horas ( por   exemplo lâmpada de fenda portátil ,   biomocroscópio , fluoresceína ) ,     - descrição de qualquer efeito local , não   ocular , observado ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    Apêndice    QUADRO : CLASSIFICAÇÃO DAS LESÕES OCULARES    Córnea    Opacidade : grau de densidade ( as observações   incidirão sobre as zonas mais densas )    Sem ulceração nem opacidade * 0 *    Zonas de opacidade ( para além de um ligeiro   embaciamento do brilho normal ) dispersas ou difusas ,   pormenores da íris claramente vísiveis * 1 *    Zona translúcida facilmente discernível ,   pormenores da íris ligeiramente encobertos * 2 *    Zona nacarada , detalhes da íris completamente   invísiveis , dimensões da pupila apenas   perceptíveis * 3 *    Córnea opaca , íris perceptível através da   opacidade * 4 *    Íris    Normal * 0 *    Pregas nitidamente mais profundas , congestão ,   hiperémia moderada ao redor da córnea ou   conjuntiva injectada , qualquer destes sintomas ou   combinações entre eles , continuando a íris a   reagir à luz ( uma reacção lenta é positiva ) * 1 *    Ausência de reacção à luz , hemorragia ,   destruição acentuada ( cada um dos sintomas ou o   conjunto ) * 2 *    Conjuntiva    Vermelhidão ( aplica-se às conjuntivas palpebrais   e ocular , à córnea e íris )    Vasos sanguíneos normais * 0 *    Clara hiperémia de certos vasos sanguíneos   ( olhos injectados ) * 1 *    Coloração púrpura difusa , vasos sanguíneos   individuais dificilmente discerníveis * 2 *    Coloração vermelha mantida difusa * 3 *    Quemose : pálpebras e/ou membranas pestanejantes   ( nictitantes )    Sem tumefacção * 0 *    Qualquer tumefacção superior à normal * 1 *    Qualquer tumefacção evidente com reviramento   parcial das pálpebras * 2 *    Tumefacção evidente com as pálpebras quase   meio fechadas * 3 *    Tumefacção com as pálpebras mais que meio   fechadas * 4 *    B . 6 . TOXICIDADE AGUDA    SENSIBILIZAÇÃO DA PELE    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método de ensaio/método de   maximização na cobaia    Após exposição inicial à substância de   ensaio ( período de indução ) os animais   são submetidos , 2 semanas após a última   exposição de indução , a uma exposição   desencadeante efectuada com esta mesma substância a   fim de estabelecer se foi induzido um estado de   hipersensibilidade . A sensibilização é   determinada por um exame da resposta cutânea à   exposição desencadeante .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método de ensaio    1.6.1 . Preparações    Jovens animais saudáveis ( idade inferior a um   ano ) são repartidos ao acaso por lotes tratados e   lotes testemunhas . Antes de administrar a   substância , corta-se ou rapa-se o pêlo da   região do ombro , evitando escarificar a pele .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Animais de experiência    Utilizam-se as cobaias albinas .    1.6.2.2 . Número e sexo    Podem utilizar-se animais machos ou fêmeas . Se se   utilizarem as fêmeas , estas devem ser nulíparas   e não grávidas . São utilizados 20 animais para   o lote tratado e pelo menos 10 para o lote   testemunha . Deve ser justificada a utilização de   um número de animais mais pequeno .    1.6.2.3 . Dose    A concentração da substância de ensaio é   fixada em função da concentração máxima que   pode ser perfeitamente tolerada aquando de cada fase de   indução .    A dose desencadeante não deve induzir qualquer   irritação cutânea nos animais não sensibilizados .   Estas doses são determinadas num estudo preliminar   reduzido ( 2 ou 3 animais ) .    1.6.2.4 . Períodos de observação    Durante o período de indução , vigia-se a   pele , para controlo de eventuais efeitos tóxicos .   Depois da exposição desencadeante , as reacções   cutâneas são registadas âs 48 e às 72 horas .    1.6.3 . Técnica    Os animais são pesados antes da fase de indução ,   assim como no fim do ensaio . Os pêlos da região do   ombro são rapados . O processo compreende duas fases .    1.6.3.1 . Indução    Dia 0 - grupo tratado    As injecções intradérmicas a seguir indicadas   são administradas aos pares , na região do ombro ,   de modo que uma injecção de cada par se situe dum   lado e do outro da linha média :    1 . 0,1 ml de Adjuvante Completo de Freund ( ACF ) ;    2 . 0,1 ml de substância de ensaio , se for caso   disso , num veículo ;    3 . 0,1 ml de substância de ensaio em ACF .    As injecções 1 e 2 são administradas na   proximidade uma da outra e o mais próximo possível   da cabeça , enquanto que a injecção 3 se   situa próximo da porção caudal da superfície   submetida ao ensaio .    Dia 0 - grupo testemunha    As injecções intradérmicas a seguir indicadas   são dadas aos pares , nos mesmos locais que as   anteriores :    1 . 0,1 ml de ACF ;    2 . 0,1 ml só de veículo ;    3 . 0,1 de veículo em ACF .    7 º dia - grupo tratado    São de novo rapados os pêlos da zona de ensaio .   Com um veículo adequado , a substância de   ensaio ( se necessário os líquidos podem ser aplicados   directamente ) é espalhada sobre um papel de filtro que   é aplicado na superfície do ensaio e mantido em   contacto com a pele por meio de um penso   adequado durante 48 horas .    7 º dia - grupo testemunha    A zona de ensaio é de novo rapada . O veículo é   aplicado isoladamente , segundo o mesmo método ,   sobre a superfície , e é mantido em contacto com   a pele por meio de um penso adequado , durante 48 horas .    1.6.3.2 . Desencadeamento    21 º dia    Rapam-se os pêlos dos flancos dos animais tratados   e dos animais testemunhas . Um penso contendo a   substância de ensaio e aplicado sobre o flanco   esquerdo dos animais tratados , enquanto que um penso   unicamente com veículo é colocado no flanco direito .   Os pequenos quadrados de tela são mantidos em contacto   com a pele com a ajuda dum penso adequado durante   24 horas .    O grupo testemunha é exposto de modo idêntico .    23 º e 24 º dias     - 21 horas após ter sido retirado o pequeno   quadrado de tela , a superfície exposta ao ensaio é   limpa e rapada , se necessário ,     - 3 horas mais tarde ( i.e. , 48 horas após o   início da aplicação desencadeante ) , observa-se   e regista-se a reacção cutânea ,     - 24 horas após esta observação , procede-se   a uma segunda observação ( 72 horas ) que é   registada .    Para determinar os resultados obtidos na primeira fase   desencadeante , pode prevêr-se uma segunda fase   desencadeante , se necessária , com um novo grupo   testemunha para o veículo , cerca de uma semana após   o primeiro ensaio .    1.6.3.3 . Observações e classificação    Todas as reacções cutâneas e todas as   observações não habituais resultantes de fases   de indução e de desecadeamento devem ser registadas   e assinaladas no relatório .    2 . DADOS    Os dados são resumidos no quadro que indica , para   cada animal , as reacções cutâneas assinaladas em   cada observação .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório    O relatório deve conter as informações   seguintes :     - estirpe da cobaia ,     - condições experimentais ,     - número , idade e sexo dos animais ,     - peso de cada animal no início e no final do   ensaio ,     - cada uma das observações individuais ,   incluindo se necessário o sistema de classificação ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e intepretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    Observações    O ensaio de maximização com a cobaia ( GPMT ) é   um ensaio do tipo adjuvante largamente utilizado .   Embora possam ser utilizados vários outros métodos ,   indicados em apêndice , que são úteis para revelar   a capacidade de uma substância poder provocar uma   reacção de sensibilização da pele , o GMPT é   considerado como o método ( de referência )   preferido .    A sensibilidade deste método e a sua capacidade   para revelar eventuais sensibilizadores da pele humana   são considerados importantes no estabelecimento de um   sistema de classificação da toxicidade aplicável   à saúde pública .    A escolha de qualquer outro método será regida por   critérios que garantam a sua validade . Entre esses   critérios figura uma resposta previsível a   alergenos-padrão , tais como o 2,4-dinitroclorobenzeno   ou a p-fenilenediamina , ou qualquer outro sensibilizador   potencial escolhido em função da classe da   substância testada .    Não existe um método de ensaio único que   permita identificar de modo adequado todas as   substâncias que tenham um potencial de sensibilização   da pele humana e que convenha a todas as substâncias .    Certos factores , como as características físicas   duma substância , incluindo a sua aptidão para a   penetração na pele e as suas formas de contacto   com os indivíduos susceptíveis de ficarem expostos ,   devem ser tomados em consideração , quando se   escolhe um ensaio . Os ensaios que utilizam as cobaias   podem ser subdivididos em ensaios de tipo adjuvante ,   nas quais qualquer estado alérgico é   potencializado pela dissolução ou pela suspensão   da substância a submeter a ensaio no Adjuvante   Completo de Freund e , em ensaio do tipo não   adjuvante . Em certos casos , pode ser escolhido um   ensaio que implique uma aplicação local em vez de   uma injecção intradérmica , utilizada na prova de   maximização com a cobaia . Nestes casos , convém   igualmente ter em consideração as características   físicas da substância do ensaio e as condições   de uma possível exposição humana .    Independentemente do método utilizado , a   sensibilidade da estirpe de cobaias utilizadas para o   ensaio de sensibilização cutânea deve ser verificada   em intervalos regulares ( 6 meses ) por meio de   sensibilizantes poderosos e moderados , conhecidos ,   e que conduzam a um número satisfatório de   respostas positivas .    Apêndice    Prova * Draize * Adjuvante completo de Freund ( ACF ) *   Optimização Mauer * Buehler * Prova epicutânea   ao ar livre * Adjuvante fraccionado *    Espécie * Cobaia * Cobaia * Cobaia * Cobaia *   Cobaia * Cobaia *    Via de administração * intradérmica ( id ) *   intradérmica ( id ) * intradérmica ( id ) *   epicutânea ( ec ) * epicutânea ( ec ) * id e ec *    Número de animais no lote de experiência * 20 *   8 - 10 * 10 - 10 * 10 - 20 * 6 - 8 * 10 - 20 *    Número de lotes de experiência * 1 * 1 * 1 * 1 *   1 a 6 * 1 *    Número de animais no lote testemunha * 20 *   8 - 10 * 10 - 10 * 10 - 20 * 6 - 8 * 10 - 20 *    Exposição de indução - via * id * id * id *   dérmica * dérmica * id e dérmica *    Número de exposições * 10 * 5 * 9 * 3 *   20 ou 21 * 4 *    Período de exposição * - * - * 24 h *   6 h de cada vez * contínua * 48 h de cada vez *    Tipo de penso * - * - * - * fechado * ao ar livre *   fechado *    Lote de experiência * SE (1) * SE em ACF *   SE em ACF * SE * SE * SE *    Lote testemunha * nenhum * só ACF * nenhum *   nenhum * Veículo ( v ) só * nenhum *    Zona submetida à prova * flanco esquerdo *   fanco direito * dorso * flanco esquerdo * flanco direito *   ombro *    Frequência * de 2 em 2 dias * de 2 em 2 dias *   de 2 em 2 dias * de 7 em 7 dias * diariamente *   dias 0 , 2 , 4 , 7 *    Duração * 0 - 18 dias * 0 - 8 dias * 0 - 21 dias *   0 - 14 dias * 0 - 20 dias * 0 - 7 dias *    Concentração * 2 - 10 duas vezes a da   primeira * a mesma em toda a zona * 0,1 ml de 0,1 % *   a mesma em toda a zona * a mesma no interior de   cada lote , diferente de um lote para outro *   a mesma em toda a zona *    Exposição de desencadeamento - via * id *   dérmica * id * dérmica * dérmica * dérmica *    Número de exposições * 1 * 2 * 2 * 1 * 2 * 1 *    Dias * 35 * 22 e 35 * 14 e 28 * 28 * 21 e 35 * 20 *    Périodo de exposição * - * - * 24 h * 6 h * - *   24 h *    Tipo de penso * - * ao ar livre * - * fechado *   ao ar livre * fechado *    Grupo(s) de experiência * SE * SE * SE * SE * SE * SE *    Grupo testemunha * SE * SE * SE * SE * SE * SE *    Superfície submetida à prova * flanco direito *   flanco esquerdo * dorso , nova zona * flanco direito *   flanco esquerdo * ombro *    Concentração * a mesma que a primeira *   4 diferentes * 0,1 ml de 0,1 % * a mesma que para   indução * 4 diferentes * metade da utilizada   para a indução *    Avaliação ( número de horas após a   exposição de desencadeamento ) * 24 , 48 *   24 , 48 , 72 * 24 * 24 , 48 * 24 , 48 e/ou 72 * 24 , 48 *    (1) SE = substância de ensaio .    B.7 . TOXICIDADE SUBAGUDA - ADMINISTRAÇÃO ORAL    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método    A substância de ensaio é administrada   diariamente por via oral , em doses crescentes a   vários lotes de animais de experiência ,   à razão de uma dose por lote durante um   período de 28 dias . Durante o período de   administração , os animais são observados   todos os dias , a fim de serem verificados os   efeitos tóxicos . Os animais que morrem durante o   ensaio são autopsiados assim como os que sobrevivem   até à sua conclusão .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método de ensaio    1.6.1 . Preparações    Os animais são mantidos nas condições de   alojamento e de alimentação adequados para a   experiência durante pelo menos os cinco dias que a   precedem . Antes de começar o ensaio , os animais   jovens saudáveis são repartidos ao acaso pelos   lotes de tratamento . As substâncias de ensaio   podem ser administradas nos alimentos , por   intubação , em capsúlas ou na água para   bebida . As doses devem ser administradas aos   animais do mesmo modo durante todo o período do   ensaio . Se , para facilitar a administração ,   se utilizar um veículo ou outros aditivos ,   estes devem ser conhecidos como não produzindo   efeitos tóxicos . Os dados publicados podem ,   se necessário , ser utilizados .   1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Animais de experiência    Salvo contra-indicações , a espécie preferida   é o rato . Devem utilizar-se animais jovens ,   saudáveis , de uma estirpe corrente de laboratório ;   nas condições ideais , a substância deve   ser administrada antes das ratazanas que atingiram a   idade de 6 semanas , não podendo em caso algum ter   mais de 8 semanas de idade . No inicio do ensaio ,   a variação do peso dos animais utilizados não   deve exceder em ± 20 % o valor médio .    1.6.2.2 . Número e sexo    Devem utilizar-se pelo menos 10 animais   ( 5 fêmeas e 5 machos ) para cada dose . As   fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas .   Se se planear o sacrifício de certo número de   animais durante a experiência , o número de   animais deve ser acrescido do número de animais   que se prevê vir a ser sacrificado antes do   estudo ficar completo . Além disso , um lote   satélite de 10 animais ( 5 de cada sexo )   pode ser tratado com a dose mais elevada durante   28 dias e ser objecto de uma observação   quanto à reversibilidade , à persistência   ou ao aparecimento tardio de efeitos tóxicos   durante os 14 dias que se seguem ao tratamento .    1.6.2.3 . Doses    Devem ser utilizadas no mínimo três doses   e uma testemunha . Com excepção da substância   de ensaio , os animais do lote testemunha devem   ser tratados do mesmo modo que os dos lotes da   experiência . Se se utilizar um veículo para   facilitar a administração , deve ser administrado   às testemunhas do mesmo modo que aos lotes tratados   e o volume recebido corresponderá ao administrado   ao lote tratado com a dose mais elevada . A dose   mais elevada deve produzir efeitos tóxicos que   não conduzam ( ou raramente ) à morte . A dose   mais fraca não deve fazer aparecer qualquer efeito   tóxico . Quando se disponha de informações   relativas à exposição humana , a dose mais   fraca deve ser superior a este valor .    Em condições ideais , a dose média deve   produzir efeitos tóxicos mínimos observáveis .   Se se utilizarem várias doses intermédias ,   estas devem ser suficientemente espaçadas de forma   a dar origem a uma gradação dos efeitos tóxicos .   Nos lotes a que correspondem as doses fracas e   intermédias , assim como no lote testemunha ,   a incidência de mortalidade deve ser fraca a fim   de permitir uma avaliação significativa dos   resultados .    Quando a substância de ensaio é administrada   no alimento , pode utilizar-se , quer uma concentração   alimentar constante ( ppm ou mg/kg ) , quer uma   dose constante , em relação com o peso corporal   dos animais ; deve ser indicado o método escolhido .   No caso de uma substância administrada por   intubação , as doses devem ser administradas   todos os dias à mesma hora . As doses devem ser   adaptadas ( semanalmente ou bisemanalmente ) a fim   de se manter um nível da dose constante , em   relação com o peso corporal do animal .    1.6.2.4 . Ensaio limite    Se uma experiência de 28 dias efectuada de acordo   com o método descrito anteriormente , com uma dose   de 1 000 mg/kg do peso corporal por dia ou com um   nível de dose mais elevado , em função de uma   possível exposição humana ( se conhecida )   não revelar qualquer efeito tóxico ,   pode considerar-se inútil o prosseguimento da   experiência . Quando se trata de substâncias com   baixa toxicidade , administradas com o regime   alimentar , interessa assegurar que a sua quantidade   e as suas propriedades não interferem com as   exigências nutricionais normais .    1.6.2.5 . Período de observação    Todos os animais devem ser observados diariamente ;   devem ser registados os sintomas de toxicidade   assim como o momento da sua aparição , a sua   intensidade e a sua duração . Devem ser   registados o momento da morte e o momento em que   aparecem e desaparecem os sintomas de toxicidade .    1.6.3 . Técnica    As doses de substâncias de ensaio são administradas   aos animais , idealmente , sete dias por semana ,   durante 28 dias . Os animais dos lotes satélites ,   previstos para observações complementares , devem   ser mantidos por mais 14 dias ainda , sem tratamento ,   com o fim de revelar a recuperação ou a persistência   dos efeitos tóxicos .    A observação diária deve incidir , entre   outras , sobre as alterações nos pêlos , olhos ,   mucosas , aparelho respiratório , sistema   circulatóro , sistema nervoso autónomo e   central , assim como a actividade somatomotora   e o comportamento . O consumo de alimentos ( e o   consumo da água , quando a substância a ensaiar   é administrada na água de beber ) , e ainda o   peso dos animais , devem ser determinados   semanalmente .    É necessária uma observação regular dos   animais de forma a evitar que , na medida do possível ,   eles sejam perdidos para a experiência por razões   tais como canibalismo , autólise dos tecidos ou   por erro na condução da experiência . Todos   os animais sobreviventes que pertençam aos lotes   tratados , não satélites , são autopsiados .   Os animais moribundos são imediatamente retirados   e autopsiados .    Os exames a seguir serão efectuados no final   do período do ensaio em todos os animais   ( incluindo os testemunhas ) :    1 . Exame hematológico compreendendo pelo   menos o hematócrito , a concentração de   hemoglobina , o número de eritrocitos e de   leucócitos , a fórmula leucocitária e ainda   um estudo da coagulação ;    2 . Determinações bioquímicas clínicas   do sangue , incluindo pelo menos um critério   relativo à exploração das funções   hepática e renal : alanina aminotransferase   ( antigamente conhecida por   glutamato-piruvato-transaminase ) e aspartato   aminotransferase ( antigamente conhecido por   glutamato-oxalacetato-trausaminase ) do soro ,   azoto da ureia , albumina , creatinina plasmática ,   bilirrubina total e proteínas séricas totais .   As outras determinações , eventualmente   necessárias para uma avaliação toxicológica   adequada , dizem respeito ao cálcio , fósforo ,   coloretos , sódio , potássio , glucose em   jejum , lípidos , hormonas , equilíbrio   ácido-básico , metaemoglobina e actividade   colinesterásica .    Podem ser realizadas outras análises bioquímicas   clínicas , se necessário , para aprofundar o   estudo dos efeitos observados .    1.6.3.1 . Autópsia    Todos os animais submetidos ao ensaio devem   ser objecto de uma autópsia geral . O fígado ,   os rins , as glândulas supra-renais e os   testículos são pesados no estado húmido   o mais rápidamente possível após a dissecação ,   para se evitar a sua secagem . O fígado , rins ,   pâncreas , glândulas supra-renais e coração ,   assim como qualquer outro órgão que apresente   lesões microcóspicas ou alterações   volumetricas , devem ser conservados em meio   adequado para eventuais exames histopatológicos   ulteriores .    1.6.3.2 . Exame histopatológico    Para o lote exposto a dose mais elevada e para   o lote testemunha , é preciso fazer um exame   histopatológico dos orgãos e dos tecidos   conservados .    Os órgãos e os tecidos que apresentam lesões   induzidas pela substância a ensaiar , ao nível   da dose mais elevada , devem ser examinados em todos   os lotes que foram expostos às doses mais fracas .   Os animais de qualquer lote satélite , devem ser   submetidos a um exame histopatológico , incidindo   particularmente sobre os órgãos e tecidos em   relação aos quais foram detectadas lesões   nos outros lotes tratados .    2 . DADOS    Os dados devem ser resumidos num quadro , indicando-se ,   para cada lote de experiência , o número de   animais do início do ensaio e o número de animais   que apresentam cada tipo de lesão .    Todos os resultados observados são avaliados por   um método estatístico adequado . Pode ser   utilizado qualquer método estatístico reconhecido .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio deve conter , se possível ,   as informações seguintes :     - espécie , estirpe , origem , meio ambiente ,   regime alimentar , etc. ,     - condições experimentais ,     - doses ( incluindo veículos , se for caso   disso ) e suas concentrações ,     - resposta tóxica por sexo e por dose ,     - nível sem qualquer efeito , se possível ,     - momento da morte durante a experiência   ou a indicação que os animais sobreviveram à   experiência ,     - efeitos tóxicos ou outros ,     - momento da observação de qualquer sintoma   anormal e sua evolução ,     - quantidade de alimentos e pesos corporais ,     - exames hematológicos efectuados e resultados   completos ,     - provas bioquímicas clínicas efectuadas e resultados   completos ,     - resultados da autópsia ,     - descrição detalhada de todas as observações   histopatológicas ,     - tratamento estatístico dos resultados ,   se aquele se revelar possível ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    B . 8 TOXICIDADE SUBAGUDA - ADMINISTRAÇÃO POR   INALAÇÃO    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A )    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B )    1.3 . Substância de referência    Nenhuma    1.4 . Princípios do método    Vários grupos de animais são expostos ,   diariamente , durante um período determinado , à   substância de ensaio , em concentrações crescentes ,   à razão de uma concentração para cada lote , durante   um período de 28 dias . Quando se utiliza um veículo para   se obter uma concentração adequada da substância   de ensaio na atmosfera , deve utilizar-se um lote   testemunha para o veículo . Durante o período de   administração , os animais são observados   diariamente a fim de detectar os sintomas de   toxicidade . Os animais que morrem durante a experiência   são autopsiados , acontecendo o mesmo aos que estejam   ainda vivos no final do ensaio .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparações    Os animais são mantidos em condições de   alojamento e de alimentação adequadas à   experiência durante pelo menos os cinco dias que a   precedem . Antes de se começar o ensaio , os jovens   animais saudáveis , são repartidos ao acaso pelo   número de lotes necessários . Quando for   necessário , pode adicionar-se um veículo   adequado à substância para se obter uma   concentração adequada na atmosfera . Se forem   utilizados veículos ou outros aditivos para facilitar   a dosagem , terão de ser conhecidos como não tóxicos .   Os dados publicados podem , se necessário , ser   utilizados .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Animais de experiência    Salvo contra-indicação , a ratazana é a espécie   preferida . Devem utilizar-se animais jovens , saudáveis   e de uma estirpe corrente de laboratório . No inicio   da experiência , a variação do peso dos animais   utilizados não deve exceder em ± 20 % o valor médio   adequado .    1.6.2.2 . Número e sexo    São utilizados pelo menos 10 animais ( 5 fêmeas   e 5 machos ) para cada grupo de ensaio . As fêmeas   devem ser nulíparas e não grávidas . Se se planear   sacrificar certo número de animais ao longo do ensaio ,   deve acrescentar-se o número de animais que se   prevé vir a sacrificar . Além disso , um grupo   satélite de 10 animais ( 5 animais de cada sexo ) , pode   ser tratado com a dose mais elevada durante 28 dias , sendo   observado quanto à reversibilidade , à persistência   ou ao aparecimento tardio de efeitos tóxicos durante   os 14 dias que se seguem ao tratamento .    1.6.2.3 . Concentrações da exposição    São necessárias pelo menos três concentrações   assim como um lote testemunha ou , se for caso disso , um   lote testemunha para o veículo ( correspondendo à   concentração do veículo no nível de exposição   mais elevado . Com excepção da inalação da   substância de ensaio , os animais do grupo testemunha   devem ser tratados do mesmo modo que os animais do grupo   de experiência . A dose mais elevada deve produzir   efeitos tóxicos , que não devem ocasionar , ou só   raramente , a morte . A dose mais fraca não deve fazer   aparecer qualquer efeito tóxico . Quando se dispõe   de informação relativa à exposição humana , a   concentração mais fraca deve ser superior a esse   valor . Em condições ideais , a concentração   intermédia deve produzir efeitos tóxicos   observáveis mínimos . Se se utilizarem várias   concentrações intermédias , as concentrações   devem ser suficientemente espaçadas para produzir uma   gradação dos efeitos tóxicos . Nos lotes com   concentrações fracas e intermédias , bem como nos lotes   testemunha , a incidência da mortalidade deve ser fraca a   fim de permitir uma avaliação significativa dos   resultados .    1.6.2.4 . Período de exposição    A exposição diária deve ser de 6 horas , podendo   no entanto ser necessárias diferentes durações ,   para dar resposta a certas exigências específicas .    1.6.2.5 . Equipamento    Os animais devem ser expostos à substância a   ensaiar , por meio de um dispositivo de inalação   concebido de modo a assegurar um fluxo de ar contínuo   ou pelo menos com 12 renovações de ar por hora , que   garantam um teor em oxigénio adequado e uma   distribuição uniforme do produto a ensaiar no ar .   Se se utilizar uma câmara , esta deve ser concebida   de modo a reduzir o empilhamento dos animais e a   assegurar-lhes uma exposição máxima à substância ,   por inalação . Regra geral , assegura-se a estabilidade   da atmosfera duma câmara , tendo em atenção que   « o volume » total dos animais não exceda 5 % do   volume da câmara . Pode também recorrer-se a um sistema   de exposição oro-nasal , só da cabeça ou do   corpo inteiro , em câmara individual ; os dois   primeiros tipos de exposição citados permitem   reduzir a penetração por outras vias .    1.6.2.6 . Período de observação    Os animais deverão ser observados diariamente , com   o fim de se verificar os sintomas de toxicidade ,   durante todo o período de tratamento e de recuperação .   O momento da morte e o momento em que os sintomas de   toxicidade aparecem e desaparecem devem ser registados .    1.6.3 . Técnica    Os animais são diariamente expostos à substância   de ensaio à razão de 5 ou 7 dias por semana , durante   um período de 28 dias . Os animais de qualquer grupo   satélite destinados a observações complementares   são mantidos vivos , durante ainda mais 14 dias , sem   tratamento , a fim de investigar a cura ou a   persistência dos efeitos tóxicos . A temperatura   à qual se efectua a prova é mantida a   22 ° C ± 3 ° C . Em condições óptimas , a   humidade relativa deve ser mantida entre 30 e 70 % mas ,   em certos casos , isso pode ser impossível ( por   exemplo nos ensaios com aerossóis ) . Durante a   exposição , os animais não devem receber nem   alimento nem água .    Deve ser utilizado um sistema de inalação que   funcione em condições dinâmicas incluindo um   dispositivo de controlo analítico da concentração .   Para determinar as concentrações de exposição   convenientes , recomenda-se a realização de um   ensaio preliminar . O débito deve ser ajustado para   assegurar concentrações homogéneas em toda a   câmara . O sistema deve permitir obter condições   de exposição estáveis tão rápidamente quanto   possível .    É conveniente medir e controlar :    a ) O débito do ar ( permanentemente ) ;    b ) A concentração real da substância medida na   zona de respiração . Durante o período de   exposição diária , a concentração não deve   variar mais do que ± 15 % em relação ao valor   médio . No entanto , no caso de poeiras e aerossóis ,   este grau de controlo pode não ser atingido e portanto   um desvio maior pode então ser aceite . Durante   toda a experiência , é preciso manter as   concentrações diárias tão constantes quanto   possível . Para partículas e aerossóis , a fim de   avaliar a estabilidade da distribuição do tamanho das   partículas , deve fazer-se uma medição destas   últimas tantas vezes quantas as necessárias ;    c ) Temperatura e humidade ;    d ) Durante e após a exposição são realizadas   observações que são sistematicamente registadas ;   devem ser conservados os registos individuais para cada   animal . Todos os animais devem ser observados diáriamente   e devem ser registados os sintomas de toxicidade assim   como o momento do seu aparecimento , a sua intensidade e   duração . As observações diárias devem incidir ,   entre outras , sobre as alterações da pele e dos   pêlos , dos olhos e mucosas , aparelho   respiratório , sistema circulatório , sistema   nervoso autónomo e central assim como da actividade   somatomotora e do comportamento . Os pesos dos animais   devem ser determinados todas as semanas . E igualmente   recomendado medir o consumo alimentar semanal . É   necessário vigiar os animais com regularidade a fim   de não haver perdas por razões de canibalismo ,   autólise dos tecidos ou erro na condução da   experiência . No final da experiência , todos os   animais sobreviventes dos grupos tratados não   satélites são autopsiados . Os animais moribundos   devem ser imediatamente retirados e autopsiados .    Os exames que se sequem serão efectuados no final   do ensaio em todos os animais ( incluindo os animais   testemunha ) :    i ) Exame hematológico incluindo pelo menos :   hematócrito , concentração de hemoglobina ,   número de eritrócitos e de leucócitos , fórmula   leucocitária , assim como um estudo da coagulação ;    ii ) Determinações bioquímicas clínicas do   dosangue , incluindo pelo menos um critério relativo à   exploração das funções hepática e renal :   alamina aminotransferase ( antigamente conhecida como   glutamato-piruvato-transaminase ) e aspartato   aminotransferase ( antigamente conhecido por   glutamato-oxalacetato-transaminase ) do soro , azoto da   ureia , albumina , creatinina plasmática ,   bilirrubina total e proteínas séricas totais . Outras   determinações eventualmente necessárias para   uma avaliação toxicológica adequada incluem :   cálcio , fósforo , cloretos , sódio , potássio ,   glucose , lípidos , hormonas , equilíbrio   ácido-básico , metaemoglobina , actividade   colinesterásica , etc . Podem ser necessárias   outras análises bioquímicas clínicas para   aprofundar o estudo dos efeitos tóxicos observados .    1.6.3.1 . Autópsia    Todos os animais de experiência devem ser submetidos   a uma autópsia geral . O fígado , rins , glândulas   supra-renais e os testículos serão pesados , no   estado húmido , o mais rápidamente possível após a   dissecação , a fim de evitar a sua secagem . Os   órgãos e os tecidos devem ser conservados num meio   adequado que permita eventuais exames histopatológicos   posteriores : vias respiratórias , fígado , rins ,   baço , glândulas supra-renais , coração , assim   como quaisquer outros órgãos que apresentem lesões   importantes ou alterações volumétricas . A   rinofaringe e os pulmões devem ser retirados inteiros ,   pesados e tratados por meio de um fixador adequado que   permita a conservação da estrutura pulmonar . Uma   perfusão adicionada de fixador é considerada um   método eficaz .    1.6.3.2 . Exame histopatológico    Para o lote exposto à concentração mais elevada ,   e para o(s) lote(s) testemunha(s) , faz-se um exame   histológico dos órgãos e tecidos conservados . Os   órgãos e os tecidos que apresentem lesões induzidas   pela substância a ensaiar às concentração mais   elevada devem ser examinados em todos os   grupos que foram expostos às concentrações mais   baixas . Os animais de todos os grupos satélites   devem ser objecto dum exame histológico particularmente   incidente sobre os órgãos e os tecidos que   revelarem lesões nos outros lotes tratados .    2 . DADOS    Os dados devem ser resumidos num quadro que indique   para cada lote da experiência , o número de animais   no início do ensaio e o número de animais que   apresenta cada um dos tipos de lesão .    Todos os resultados observados devem ser avaliados por   meio de um método estatístico adequado . Qualquer   método estatístico reconhecido pode ser utilizado .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio deve , se possível , conter   as seguintes informações :     - espécie , estirpe , origem , meio ambiente , regime   alimentar , etc. ,     - condições experimentais :    Descrição do aparelho de exposição ,   incluindo a concepção , tipo , dimensões , fonte   de ar , sistema gerador de partículas e aerossóis ,   método de condicionamento do ar , tratamento do ar   expirado e , se for caso disso , modalidades de   permanência dos animais na câmara de ensaio . Deve   ser descrito o equipamento utilizado para medição   da temperatura e , se necessário , da estabilidade das   concentrações dos aerossóis ou do tamanho das   partículas .    Dados relativos à exposição :    Devem ser apresentados sob a forma de um quadro que   indique os valores médios , assim como uma medição   da variabilidade ( por exemplo desvio padrão ) ;   devem incluir :    a ) Os débitos do ar através do dispositivo de   inalação ;    b ) A temperatura e humidade do ar ;    c ) As concentrações nominais ( quantidade total   da substância de ensaio introduzida no dispositivo de   inalação , dividida pelo volume do ar ) ;    d ) Se for caso disso , natureza do veículo ;    e ) Concentrações reais na zona de respiração ;    f ) Dimensões médias das partículas ( se   necessário ) .     - resposta tóxica por sexo e concentração ,     - momento da morte durante a experiência ou a   indicação de que os animais sobreviveram à   experiência ,     - efeitos tóxicos ou outros , nível sem qualquer   efeito ,     - momento da observação de qualquer sintoma   anormal e sua evolução ;     - quantidade de alimento e peso corporal ,     - exames hematológicos efectuados e seus resultados   completos ,     - provas bioquímicas clínicas efectuadas e seus   resultados completos ,     - resultados das autópsias ,     - descrição eventual de todas as observações   histopatológicas ,     - tratamento estatístico dos resultados , se   possível ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    B.9 . TOXICIDADE SUBAGUDA - ADMINISTRAÇÃO CUTÂNEA    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método    A substância de ensaio é aplicada diariamente por   via cuténea , em doses crescentes a vários lotes de   ensaio , à razão de uma dose por lote , durante um   período de 28 dias . Durante o período de aplicação   os animais são observados todos os dias a fim de se   verificarem os sintomas de toxicidade . São   autopsiados os animais que morrem durante a experiência ,   assim como os que sobrevivem à sua conclusão .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparações    Os animais são mantidos em condições de alojamento   e de alimentação adequadas para a experiência ,   durante pelo menos os 5 dias que a precedem . Antes de   começar o ensaio , os jovens animais saudáveis   são repartidos ao acaso em lotes tratados e lotes   testemunhas . Pouco tempo antes do ensaio , corta-se o   pêlo da região dorsal dos animais . Pode-se   rapar o pêlo , mas neste caso a operação deve ser   feita 24 horas antes da prova . Durante o corte ou a   rapagem deve procurar-se evitar qualquer lesão na pele . A   superfície corporal a preparar para a aplicação da   subtância a ensaiar não deve ser inferior a 10 % da   superfície corporal . O peso do animal deve ser considerado   para decidir sobre a zona a preparar e sobre as   dimensões da superfície a tratar . Quando o ensaio   se efectuar com substâncias sólidas que , se for caso   disso , podem ser pulverizadas , aquelas devem ser   humedecidas com água ou , se necessário , com um   veículo adequado de modo a assegurar um bom contacto com a   pele . As substâncias líquidas são geralmente   utilizadas não diluídas . Procede-se a uma   aplicação diária à razão de 5 a 7 dias em cada   semana .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Animais de experiência    Pode utilizar-se o rato , o coelho ou a cobaia adultos .   Podem também utilizar-se outras espécies mas a sua   utilização necessita de justificação . No início   da experiência , a variação de pesos entre os   animais não deve exceder ± 20 % do valor médio .    1.6.2.2 . Número e sexo    Pelo menos 10 animais ( 5 fêmeas e 5 machos ) , com   pele sã , devem ser utilizados para cada dose . As   fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas . Se se   planear sacrificar certo número de animais ao longo do   ensaio , deve acrescentar-se o número de animais que se   prevê vir a sacrificar antes do final da experiência .   Além disso , um grupo satélite de 10 animais   ( 5 animais para cada sexo ) pode ser tratado com o   nível da dose mais elevada durante 28 dias e ser   observado quanto à reversibilidade , à persistência   ou aparecimento tardio de efeitos tóxicos durante os 14   dias que se seguem ao tratamento .    1.6.2.3 . Doses    Utilizam-se pelo menos 3 doses , assim como um lote   testemunha e , se for caso disso , um lote testemunha   para o veículo . O período de exposição será   no mínimo de 6 horas por dia . A substância de ensaio   deve ser aplicada todos os dias à mesma hora e as doses   devem ser adaptadas semanalmente ou bissemanalmente a fim de   conservar um nível de dose constante em relação com   o peso corporal dos animais . Com excepção das   substâncias de ensaio , os animais do lote testemunha   devem ser tratados do mesmo modo que os dos lotes de   experiência . Se for utilizado um veículo para   facilitar a dosagem , este deve ser administrado ao lote   testemunha nas mesmas condições que para os lotes   tratados e a dose recebida corresponderá à recebida   pelo grupo tratado com a dose mais elevada . A dose mais   elevada deve produzir efeitos tóxicos que não   ocasionem ( ou raramente ) a morte . A dose mais fraca   não deve produzir o aparecimento de qualquer efeito   tóxico . Desde que se disponham de informações   relativas à exposição humana , a dose mais fraca não   deve exceder este valor . Em condições ideais , a dose   intermédia deve produzir efeitos tóxicos mínimos   observáveis . Se se utilizam várias doses   intermédias , estas devem ser suficientemente espaçadas   para originar uma gradação dos efeitos tóxicos .   Nos lotes correspondentes às doses fracas e intermédias ,   estas devem ser suficientemente espaçadas para   originar uma gradação dos efeitos tóxicos .   Nos lotes correspondentes às doses fracas e intermédias   assim como nos lotes testemunhas , a incidência de   mortalidade deve ser fraca , a fim de permitir uma   avaliação significativa dos resultados .    Se a aplicação da substância de ensaio provocar   uma grave irritação cutânea , as concentrações   devem ser reduzidas ; isto pode levar a uma diminuição ,   mesmo um desaparecimento , dos outros efeitos tóxicos   com a dose mais elevada . Além disso , se as lesões   cutâneas forem muito graves , pode tornar-se   necessário interromper a experiência e recomeçá-la   com concentrações mais fracas .    1.6.2.4 . Ensaio limite    Se uma experiência preliminar realizada com uma dose   de 1 000 miligramas/quilograma ou com uma dose   mais elevada em função da possível exposição   humana , quando esta seja conhecida , não provocar   qualquer efeito tóxico , pode considerar-se inútil   prosseguir a experiência .    1.6.2.5 . Período de observação    Os animais da experiência devem ser objecto de uma   observação diária a fim de se descobrir sintomas de   toxicidade . Devem ser indicados o momento da morte   assim como o momento no qual aparecem e desaparecem os   sintomas de toxicidade .    1.6.3 . Técnica    Os animais devem ser colocados em gaiolas individuais . A   substância de ensaio é administrada aos animais ,   sete dias por semana , durante um período de 28 dias .   Os animais de todos os grupos satélites destinados às   observações complementares devem ser mantidos vivos   por mais 14 dias , sem tratamento , a fim de se verificar a   cura ou a persistência dos efeitos tóxicos .   A duração diária da exposição é no   mínimo de 6 horas por dia . A substância de ensaio deve   ser aplicada uniformemente sobre uma superfície , que   represente cerca de 10 % da superfície total do corpo .   Quando se trata de substâncias altamente tóxicas , a   superfície coberta pode ser menor , mas a camada deve ser   tão fina e tão uniforme quanto possível .    Durante a exposição , a substância de ensaio   é mantida em contacto com a pele por meio de um quadrado   de gaze e de um esparadrapo não irritante . A superfície   tratada deve , além disso , ser convenientemente   coberta de modo a manter no lugar o penso de gaze e a   substância de ensaio e a evitar que os animais   possam ingerir esta última . Podem ser utilizados os   aparelhos de contenção para impedir a ingestão da   substância não sendo no entanto recomendada a   imobilização completa dos animais .    No fim do período de exposição , deve-se , se   possível , eliminar qualquer resíduo da substância   com água ou por qualquer outro processo adequado de   limpeza da pele .    Todos os animais devem ser observados diariamente e devem   ser registados os sintomas de toxicidade , assim como o   momento do seu aparecimento , a sua intensidade e a sua   duração . As observações diárias incidirão ,   entre outras , sobre as alterações na pele e no pêlo ,   nos olhos e mucosas , no aparelho respiratório , no   sistema circulatório , no sistema nervoso autonomo e   central , assim como da actividade somatomotora e do   comportamento . O peso dos animais deve ser determinado   semanalmente . É igualmente recomendado medir o   consumo alimentar semanal . E necessário observar   regularmente os animais a fim de assegurar que estes   não sejam perdidos para o estudo , por razões tais   como o canibalismo , autólise dos tecidos ou erro na   condução da experiência . No final da experiência ,   todos os animais sobreviventes dos lotes não satélites   são autopsiados . Os animais moribundos são imediatamente   retirados e autopsiados .    Os exames que se seguem serão efectuados no final da   experiência , em todos os animais ( incluindo os do   lote testemunha ) :    1 . Exame hematológico , incluindo pelo menos   hematócrito , concentração de hemoglobina ,   número de eritrócitos e de leucócitos , fórmula   leucocitária e ainda um estudo da coagulação ;    2 . Determinações bioquímicas clínicas do sangue   incluindo pelo menos critério relativo à   exploração das funções hepática e renal : alanina   aminotransferase ( antigamente conhecida como   glutamato-piruvato-transaminase ) e aspartato   aminotransferase ( antigamente conhecida por   glutamato-oxalacetato-transaminase ) do soro , azoto   da ureia , albumina , creatinina plasmática ,   bilirrubina total e proteínas séricas totais .    Outras determinações eventualmente necessárias   para uma avaliação toxicológica adequada incluem :   cálcio , fósforo , cloretos , sódio , potássio ,   glucose , lípidos , hormonas , equilíbrio   ácido-básico , metaemoglobina e actividade   colinesterásica .    Outras análises bioquímicas clínicas podem , se   necessário , ser efectuadas para aprofundar o estudo dos   efeitos observados .    1.6.4 . Autópsia    Todos os animais submetidos ao ensaio devem ser objecto   de uma autópsia geral . O fígado , os rins , as   glândulas supra-renais e os testículos devem ser pesados   no estado húmido e o mais rapidamente possível após a   dissecação , a fim de evitar a sua secagem . Os   órgãos e os tecidos ( isto é , a pele normal e   tratada ) , o fígado , os rins e os órgãos atingidos   ( isto é , os que apresentam lesões importantes ou   alterações volumétricas ) devem ser conservados num   meio adequado para eventuais exames histopatológicos   posteriores .    1.6.5 . Exame histopatológico    Deve fazer-se um exame histológico dos tecidos e   órgãos conservados , do lote exposto à dose mais   elevada e do lote testemunha . Os órgãos e tecidos que   apresentam lesões induzidas pela substância de   ensaio ao nível da dose mais elevada , devem ser   examinados em todos os lotes que tenham sido expostos   a doses mais fracas . Os animais do lote satélite devem   ser objecto de exame histológico incidindo   particularmente sobre os órgãos e tecidos nos   quais foram verificadas lesões nos outros lotes tratados .    2 . DADOS    Os dados devem ser resumidos num quadro , indicando , para   cada lote de experiência , o número de animais no   início do ensaio e o número de animais que apresentam   cada tipo de lesão .    Todos os resultados observados devem ser avaliados por   um método estatístico adequado . Pode ser   utilizado qualquer método estatístico reconhecido .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório deve conter , se possível , as seguintes   informações :     - dados relativos aos animais ( espécie , estirpe ,   origem , meio , ambiente , regime alimentar , etc. ) ,     - condições experimentais ,     - doses ( incluindo veículos , se for caso disso ) e   concentrações ,     - nível sem qualquer efeito , se possível ,     - resposta tóxicas por sexo e por dose ,     - momento da morte durante a experiência ou a   indicação de que os animais sobreviveram à   experiência ,     - efeitos tóxicos ou outros ,     - momento da observação de qualquer sintoma   anormal e sua evolução ,     - quantidade de alimento e peso corporal ,     - exames hematológicos efectuados e seus resultados   completos ;     - provas bioquímicas clínicas efectuadas e seus   resultados completos ,     - resultados das autópsias ,     - descripção pormenorizada de todas as observações   histopatológicas ,     - tratamento estatistico dos resultados , se possível ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    B.10 . OUTROS EFEITOS : MUTAGÉNESE    PROVA CITOGENÉTICA IN VITRO EM MAMÍFERO    1 . Método    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípios do método    A prova citogenética in vitro é um ensaio de   mutagenicidade a curto prazo , para a pesquisa de   aberrações cromossómicas estruturais nas células de   cultura dos mamíferos . Podem ser utilizadas culturas de   linhagens celulares já estabelecidas e também   culturas de células primárias . Após exposição   às substâncias de ensaio , com e sem uma mistura de   activação de enzimas hepáticos ( fracção   pós-mitocôndrica suplementada com cofactores ) ,   as culturas celulares são tratadas com um inibidor do   fuso mitótico , tal como a colchicina , com o fim de   acumular as cálulas numa fase de mitose do tipo   metafásico ( c-metafase ) . As cálulas são   recolhidas em momentos adequados e efectuam-se então   preparações cromossómicas . As preparações   são coradas e as células em metafase são   analisadas para pesquisa de aberrações cromossomicas .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparações    As substâncias do ensaio são preparadas em meio   de cultura ou dissolvidas em veículos adequados   antes do tratamento das células . Utilizam-se linhagens   celulares estabelecidas ou culturas de celulas   primárias , por exemplo cálulas de cricetos chineses   e linfãcitos humanos .    1.6.2 . Condições experimentais    Número de culturas :    São utilizadas pelo menos duas culturas para   cada ponto experimental .    Utilização de testemunhas positivas e negativas :    O solvente ( desde que este não seja o meio de cultura   ou água ) , a mistura de activação de enzimas   hepáticos , a mistura de activação de enzimas   hepáticos com o solvente assim como as testemunhas   não tratadas são utilizados como testemunhas negativas .    É incluída em cada experiência uma testemunha   positiva ; quando a mistura de activação de enzimas   hepáticas é utilizada para activar a substância   a testar , é necessário utilizar , como testemunha   positiva , uma substância que necessite de uma   activação metabólica .    Utilizam-se pelo menos 3 doses da substância a   testar , num intervalo de pelo menos uma variação   de dose de 1 logaritmo , sendo a dose mais elevada   capaz de reduzir a actividade mitótica em cerca   de 50 % .    Condições de cultura :    São utilizados um meio de cultura e condições   de incubação adequadas ( por exemplo temperatura ,   recipientes de cultura , concentrações em CO2   e humidade ) .    1.6.3 . Técnica    1.6.3.1 . Preparação das culturas    Linhagens celulares estabelecidas : as células   são obtidas a partir de culturas-mãe ( por exemplo   por tripsinização ou por isolamento selectivo por   agitação vigorosa ) , inoculadas em recipientes   de cultura com uma densidade conveniente e incubadas   a 37 ° C .    Linfócitos humanos : sangue heparinado é   adicionado ao meio de cultura , contendo fitoemaglutina ,   soro de feto de vitela assim como antibióticos ,   e incubado a 37 ° C .    1.6.3.2 . Tratamento das culturas com a substância   do ensaio    i ) Tratamento sem mistura de activação de   enzimas hepáticas    Todos os tratamentos devem cobrir o tempo de um   ciclo celular completo e os esquemas de fixação   devem garantir a análise das primeiras mitoses   posteriores ao tratamento das células tratadas nos   diferentes estádios do seu ciclo . Quando o tratamento   não cubra um ciclo celular completo , escolhem-se   tempos de fixação múltiplos a fim de se   retirarem amostras de células que se encontrem   em diferentes estádios do ciclo celular durante o   tratamento , isto é , G1 , S e G2 .    A substância de ensaio é adicionada às culturas   de linhagens celulares estabelecidas , quando estas se   encontrem na sua fase de crescimento esponencial . As   culturas de linfócitos humanos são tratadas   enquanto estão ainda em estado semi-síncrono .   Se a substância de ensaio alterar a duração do ciclo   celular , então o intervalo de fixação terá   de ser mudado em conformidade .    ii ) A mistura de activação de enzimas hepáticos   utilizados para o tratamento da substância de ensaio   deve estar presente tanto tempo quanto possível ,   sem exercer no entanto um efeito tóxico sobre as   células . Se , por razões de toxicidade , este   tratamento não cobrir a duração de um ciclo celular   completo , escolhem-se tempos de fixação múltiplos ,   a fim de se retirarem amostras de células que se   encontrem em estádios diferentes do ciclo celular   no momento do tratamento , isto é , G1 , S e G2 .    Colheita de células    As culturas celulares são tratadas com um inibidor   do fuso mitótico , 1 a 2 horas antes da sua colheita .   Cada cultura é colhida e tratada separadamente   para a preparação dos cromossomas .    1.6.2.3 . Preparação dos cromossomas    Esta preparação compreende um tratamento hipotónico   das células , a fixação , a montagem sobre as   lâminas e a coloração .    Análises    São analisadas no mínimo 100 metafases bem   espalhadas por cultura , para pesquisa de aberrações   cromossómicas . As lâminas são codificadas   antes da análise .    Para os linfócitos humanos , somente são   analisadas as metafases que contém 46 centrómetros .   Nas linhagens celulares estabelecidas , só são   analisadas as metafases que contêm ± 2 centrómetros   do número modal .    2 . DADOS    Os dados são apresentados sob a forma de   quadros . As aberrações do tipo cromatidiano   ( lacunas , fracturas , trocas mútuas ) , as do tipo   cromossómico ( lacunas , fracturas , cromossomas   minúsculos , anéis , dicêntricos , policêntricos )   e o número de metafases anormais ( lacunas   incluídas e excluídas ) são registados   separadamente , para todas as culturas tratadas ,   assim como para as culturas testemunhas .    Os dados são avaliados por métodos estatísticos   adequados .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio deve conter , se possível ,   as informações seguintes :     - células utilizadas ,     - condições experimentais : composição   do meio de cultura , concentração em CO2 , temperatura   de incubação , duração da incubação ,   doses , momento do tratamento , duração do   tratamento com o inibidor de fuso mitótico e   concentração daquele , tipo de mistura de   activação de enzimas hepáticos utilizado ,   testemunhas positivas e negativas ,     - número de culturas celulares ,     - número de metafases analisadas ( dados   indicados separadamente para cada cultura ) ,     - índice mitótico ,     - tipo e número de aberrações indicadas   separadamente para cada cultura tratada e cada testemunha ,   número modal de cromossomas nas linhagens celulares   estabelecidas utilizadas ,     - avaliação estatística ,     - discussão dos resultados ,   - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    B.11 . OUTROS EFEITOS : MUTAGÉNESE    PROVA CITOGENÉTICA IN VIVO EM MEDULA ÓSSEA   DE MAMÍFERO , ANÁLISE CROMOSSÓMICA    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definições    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método    A prova citogenética in vivo é um ensaio de   mutagenicidade a curto prazo , destinada a pesquisar   aberrações cromossómicas estruturais .    Estas são geralmente avaliadas no decorrer da   primeira mitose consecutiva ao tratamento . Com os   mutagéneos químicos , a maioria das aberrações   induzidas são do tipo cromatídico .    Neste método , utiliza-se a medula óssea de   mamíferos expostos , pelas vias adequadas , às   substâncias de ensaio e sacrificados em intervalos   sucessivos . Antes de serem sacrificados , os animais   são tratados por meio de substâncias tais como   a cochicina , que impedem a formação do fuso , com   o fim de acumular as células em fase de mitose   do tipo metafásico ( c-metafase ) . São efectuadas   preparações de cromossomas a partir de células   secas ao ar e depois coradas ; as metafases são em   seguida analisadas ao microscópio a fim de se   pesquisarem aberrações cromossómicas .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparações    As substâncias de ensaio são dissolvidas numa   solução fisiológica . Quando se trata de   substâncias insolúveis , estas são dissolvidas   ou postas em suspensão em veículos adequados .    São utilizadas soluções da substância de   ensaio preparadas recentemente .    Se é utilizado um veículo para facilitar a   dosagem , este não deve interferir com a substância   de ensaio nem produzir efeitos tóxicos .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Animais de experiência    Utilizam-se os roedores : ratazana , rato ou   criceto chinês . Os jovens animais adultos e   saudáveis são repartidos ao acaso em lotes   tratados e lotes testemunhas .    1.6.2.2 . Número e sexo    São utilizados pelo menos 5 fêmeas e 5 machos   em cada lote experimental e em cada lote testemunha .   Dez animais serão pois sacrificados por período e   por grupo , caso o programa experimental inclua vários   momentos de observação após o tratamento .    1.6.2.3 . Via de administração    Em geral , as substâncias de ensaio devem ser   administradas uma só vez . Em função das   informações toxicológicas de que se dispõe ,   pode ser utilizado um programa de administração   repetida . No entanto , isso só pode acontecer ,   caso a substância que deve ser submetida ao   ensaio não tenha um efeito citotóxico sobre a   medula óssea . A administração faz-se geralmente   por via oral ou por injecção intraperitoneal .   Podem , no entanto , ser usadas outras vias de   administração adequadas .    1.6.2.4 . Utilização de testemunhas positivas   e negativas    Uma substância , à qual se atribui a produção   de aberrações cromossómicas in vivo , é   utilizada como testemunha positiva , sendo igualmente   incluído no plano de cada experiência um lote   testemunha negativa ( solvente ) .    1.6.2.5 . Doses    Para o processo de base , utiliza-se uma dose de   substância de ensaio , que é a dose máxima   tolerada ou a que faz aparecer certos sinais de   citotoxicidade , por exemplo , uma inibição parcial   da mitose .    Podem ser utilizadas doses adicionais , quando sejam   indicadas por razões de ordem científica .    Se o ensaio servir de método de verificação ,   devem utilizar-se pelo menos duas doses suplementares .    1.6.3 . Técnica    O ensaio pode ser utilizado de dois modos :    i ) A substância de ensaio é administrada uma   vez aos animais , na dose máxima tolerada . Após o   tratamento , são colhidas amostras três vezes .   A colheita do meio é feita às 24 horas . Como a   cinética do ciclo celular pode ser influenciada   pela substância de ensaio , são realizadas uma   colheita anterior e uma colheita posterior com   intervalos adequados , no intervalo das 6 a 48 horas   que se seguem à administração da substância .   Quando forem utilizadas doses suplementares , convem   colher as amostras no período de sensibilidade   máxima ou , se esta não for conhecida , 24 horas   após o tratamento    ii ) Se os dados fármaco-cinéticos e metabólicos   indicarem um programa de tratamento repetido , pode   ser utilizada uma dosagem repetida e as amostras   devem ser colhidas 6 e 24 horas apos o último   tratamento .    Preparação da medula óssea    Antes de se sacrificarem os animais , injecta-se-lhes ,   por via peritoneal , uma dose adequada de inibidor   do fuso mitótico , a fim de se obter um número   de células adequadas em c-metafase . A medula óssea   obtém-se dos dois fémures dos animais sacrificados   recentemente , por lavagem com uma solução   isotómica . Após um tratamento hipotónico   adequado , as células são fixadas e depois   montadas sobre as lâminas . Após secagem ao ar ,   as lâminas são coradas .    Análise    As lâminas são codificadas antes de serem   analisadas ao microscópio . No mínimo 50 metafases   bem espalhadas e com o número completo de   centrómeros são analisadas por animal para   pesquisa das aberrações cromossómicas estruturais .   Os índices mitóticos podem , por outro lado ,   ser estabelecidos para cada animal .    2 . DADOS    Os dados são apresentados sob a forma de quadros .   As aberrações do tipo cromatídico e isocromatídico   ( lacunas , fracturas , re-arranjos ) e o número   de metafases anormais ( com e sem lacunas ) , assim   como os índices mitóticos ( se estabelecidos ) ,   são registados separadamente para todos os animais   tratados e também para os animais testemunhas . Os   valores médio e os desvios-padrão obtidos para cada   lote tratado assim como para cada lote testemunha são   igualmente registados . Os dados são avaliados por   métodos estatísticos adequados .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio deve conter as seguintes   informações :     - espécie , estirpe e idade dos animais utilizados     - número de animais de cada sexo dos lotes   tratados e dos testemunha ,     - condições experimentais : descrição   pormenorizada dos programas de tratamento e de colheitas ,   doses , duração do tratamento com inibidor de fuso   miótico e a concentração destas substâncias ,     - número de metafases analisadas por animal ,     - índices mitóticos ( se estabelecidos ) ,     - tipo e número de aberrações , indicadas   separadamente para cada animal tratado e para cada   animal testemunha ,     - avaliação estatística ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    B.12 . OUTROS EFEITOS : MUTAGÉNESE    PROVA DO MICRONÚCLEO    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método    A prova do micronúcleo é um ensaio in vivo   a curto prazo em mamíferos , destinado a pesquisar   as lesões cromossómicas ou as do aparelho   mitótico induzidas por substâncias químicas .   Este ensaio é baseado no aumento do número   de micronúcleos nos eritrócitos policromáticos   dos animais tratados em relação aos animais   testemunhas .    Os micronúcleos são formados de fragmentos   de cromossomas ou de cromossomas inteiros , abandonados   aquando da mitose . Quando os eritoblastos se   transformam em eritrócitos , o núcleo principal   é expulso , enquanto que o micronúcleo é   conservado no citoplasma . Para este ensaio utilizam-se   jovens eritrócitos policromáticos provenientes   da medula óssea de mamíferos de laboratório , que   foram expostos , pelas vias adequadas , às   substâncias de ensaio . Após a extracção da   medula óssea , os esfregaços são preparados   e corados . Contam-se ao microscópio o número de   micronúcleos presentes nos eritrócitos   policromáticos e estabelece-se uma relação   entre os eritrócitos policromáticos e   normocromáticos .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparações    As substâncias a testar são dissolvidas numa   solução isotómica . Se se tratar de substâncias   insolúveis , elas são dissolvidas ou postas   em suspensão em veículos adequados . Se for   utilizado um veículo , ele não deve interferir   com a substância do ensaio , nem produzir efeitos   tóxicos . Normalmente , utilizam-se soluções da   substância a testar , preparadas recentemente .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Animais de experiência    Recomenda-se a utilização de ratos , mas   também podem ser utilizados outros mamíferos .   Animais adultos jovens saudáveis são repartidos   ao acaso em lotes tratados e em lotes testemunhas .    1.6.2.2 . Número e sexo    Utilizam-se 5 fêmeas e 5 machos por lote tratado   e por lote testemunha .    São sacrificados 10 animais por período e por   lote , se o programa experimental incluir vários   momentos de observação apos o tratamento .    1.6.2.3 . Via de administração    Em geral , as substâncias devem ser administradas   uma só vez . Em função das informações   toxicológicas de que se dispõe , pode ser aplicado   um programa de tratamento repetido . No entanto , o   esquema de tratamento repetido só pode ser aplicado   se a substância a testar não tiver efeito   citotóxico sobre a medula óssea .    A administração faz-se geralmente por via oral   ou por injecção intraperitoneal . No entanto , podem   ser adequadas outras vias de administração .    1.6.2.4 . Utilização de testemunhas negativas   e positivas    Podem ser utilizadas testemunhas positivas assim   como negativas ( solvente ) para cada experiência .    1.6.2.5 . Doses    Para o processo de base , utiliza-se uma dose da   substância de ensaio , que é a dose máxima   tolerada ou a que faz aparecer certos sinais de   citotoxicidade , por exemplo , uma alteração   da relação eritrócitos policromáticos/eritrócitos   normocromáticos .    Podem ser utilizadas doses adicionais , quando sejam   justificadas por razões de ordem científica .    Se o ensaio serve de método de verificação , deve   utilizar-se pelo menos 2 doses suplementares .    1.6.3 . Técnica    O ensaio pode ser realizado de dois modos :    i ) A substância é administrada uma só vez   aos animais , na dose máxima tolerada . As colheitas das   amostras devem ser efectuadas no momento que   corresponde à sensibilidade máxima do ensaio , que   varia de acordo com a substância de ensaio . É   por isso que , quando se utiliza a dose máxima , se   devem colher as amostras da medula óssea pelo   menos por 3 vezes , no início do tratamento , e depois   com intervalos adequados , sem no entanto ultrapassar   as 72 horas .    Quando se utilizam doses suplementares , convém colher   as amostras no período de sensibilidade máxima   ou , se esta não é conhecida , 24 horas após   o tratamento .    ii ) Se os dados fármaco-cinéticos e metabólicos   indicam um programa de tratamento repetido , pode ser   utilizada uma dosagem repetida e as amostras devem ser   colhidas pelo menos por 3 vezes , o mais tardar   12 horas após o último tratamento e depois   em intervalos adequados sem no entanto ir além   das 72 horas .    Preparação da medula óssea    A medula óssea obtem-se por lavagem dos dois fémures   dos animais sacrificados recentemente com soro   de feto de vitelo . As células são sedimentadas   por centrifugação e a parte sobrenadante é   eliminada . Algumas gotas da suspensão celular   homogénea são depositadas e espalhadas em esfregaços   sobre lâminas . Após secagem ao ar , as   lâminas são coradas .    Análise    As lâminas são codificadas antes de serem analisadas   ao microscópio . Pesquisa-se a presença de   micronúcleos em pelo menos 1 000 eritrócitos   policromáticos por animal .    A relação entre os eritrócitos normocromáticos   e policromáticos é determinada , para cada animal ,   numa base de 1 000 eritrócitos .    2 . DADOS    Os dados são apresentados sob a forma de quadros .   O número de eritrócitos policromáticos , o   número de eritrócitos policromáticos   compreendendo os micronúcleos assim como a percentagem   de células micronucleadas , são registados   separadamente para cada animal tratado e para cada   animal testemunha , do mesmo modo que a relação   entre os eritrócitos normocromáticos e   policromáticos . As médias e os desvios padrão   são igualmente registados para cada lote tratado   e para cada lote testemunha . Os dados são   avaliados por métodos estatísticos adequados .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio deve conter , se possível ,   as seguintes informações :     - espécie e estirpe dos animais utilizados e   sua idade ,     - número dos animais de cada sexo dos lotes   tratados e dos testemunhas ,     - condições experimentais : descrição   pormenorizada dos programas de tratamento e de   colheitas , doses , dados relativos à toxicidade ,   testemunhas negativas e positivas ,     - critério de contagem dos micronúcleos     - relação dose-efeito , se possível ,     - avaliação estatística ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    B.13 . OUTROS EFEITOS : MUTAGÉNESE    ENSAIOS DE MUTAÇÃO REVERSA NA ESCHERICHIA COLI    1 . Método    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substância de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método    O sistema de reversão ao triptofano da E. coli ( trp )   é um ensaio microbiano que permite medir a reversão   trp - trp + , devido às substâncias químicas   responsáveis pela substituição de base ao   nível do genoma do organismo .    As bactérias são expostas às substâncias   do ensaio com e sem activação metabólica .   Após um período de incubação adequado num   meio mínimo , contam-se as colónias revertantes   e compara-se o número obtido com o das   revertantes espontâneas observadas numa cultura testemunha   não tratada e/ou em presença de solvente .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método    O ensaio pode ser realizado pelos métodos seguintes :    i ) Método da pré-incubação    ii ) Método de incorporação directa , onde   as bactérias e a substância de ensaio são misturadas   na gelose de recobrimento e depois vertidas na   superfície duma caixa de gelose selectiva .    1.6.1 . Preparações    1.6.1.1 . Bactérias    As bactérias são cultivadas a 37 ° C até   ao final da fase exponencial ou até ao início da   fase estacionária de crescimento . A densidade   celular aproximada deve ser de 10 8 - 10 9 células   por mililitro .    1.6.1.2 . Activação metabólica    As bactérias devem ser expostas à substância   de ensaio com ou sem uma mistura de activação   adequada de enzimas hepáticos de mamíferos   ( fracção pós-mitocôndrica suplementada   de co-factores ) , preparada a partir de cobaias   ou ratos pré-tratados com indutores enzimáticos .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Estirpes da experiência    São utilizadas as três estirpes seguintes :   WP2 , WP2 uvr A e WP2 uvr ApKM 101 . É conveniente a   utilização de métodos reconhecidos para a   preparação e a conservação das culturas .   As exigências do crescimento e da identificação   genética das estirpes , a sua sensibilidade aos   raios UV ou à mitomicina C , assim como a   resistência à ampicilina para a estirpe WP2   uvr ApKM 101 , devem ser verificadas . As estirpes   devem igualmente produzir revertantes espontâneos   nas gamas de frequência antecipadas .    1.6.2.2 . Meio de cultura    Utiliza-se um meio adequado à expressão   e à selecção dos mutantes , assim como uma   gelose de recobrimento adequada .    1.6.2.3 . Utilização de testemunhas negativas   e positivas    Devem utilizar-se em paralelo ensaios com   testemunhas não tratadas e com testemunhas em   presença de solventes . As testemunhas positivas   devem igualmente ser realizadas com os dois fins   seguintes :    i ) Confirmar a sensibilidade das estirpes   bacterianas . Podem ser utilizadas como testemunhas   positivas , para os ensaios sem activação   metabólica , o sulfonato de metilmetano , o   óxido de 4-nitroquinoleína ou a etilnitrosoureia ;    ii ) Garantir a actividade do sistema metabolisante   adequado . O 2-aminoantraceno constitui uma   testemunha positiva da actividade de um ( do ) sistema   metabolisante para todas as estirpes . É conveniente ,   se possível , utilizar uma testemunha positiva   que pertença à mesma classe química que   a substância submetida ao ensaio .    1.6.2.4 . Quantidade de substância a ensaiar   por placa    Pelo menos 5 quantidades diferentes da substância   de ensaio devem ser ensaiadas com variações   semilogarítimicas entre as caixas . As substâncias   são sujeitas ao ensaio até que os limites de   solubilidade ou de toxicidade sejam atingidos . A   toxicidade é posta em evidência por uma redução   do número de revertantes espontâneos , um   clareamento do fundo , ou pela taxa de   sobrevivência das culturas tratadas . As substâncias   químicas não tóxicas devem ser ensaiadas até   5 mg por caixa , antes que se possa considerar a   substância de ensaio como negativa .    1.6.2.5 . Condições de incubação    As caixas são incubadas de 48 a 72 horas a   37 ° C .    1.6.3 . Técnica    No método de incorporação directa em caixa ,   sem activação enzimática , junta-se a substância   de ensaio e 0,1 ml de cultura bacteriana recente ,   a 2,0 ml de gelose de recobrimento . Para os   ensaios com activação metabólica , junta-se   à gelose 0,5 ml da mistura de activação   de enzimas hepáticos , contendo uma quantidade   adequada da fracção pós-mitocôndrica ,   após adição da substância de ensaio e das   bactérias . O conteúdo de cada tubo é   misturado e vertido na superfície duma caixa   de gelose selectiva . A gelose de recobrimento   solidifica e as caixas são incubadas a 37 ° C ,   durante 48 a 72 horas . No final do período de   incubação , contam-se as colónias revertantes   por caixa .    Para o método de pré-incubação , uma mistura   contendo a substância , 0,1 ml de cultura bacteriana   fresca e uma quantidade adequada de mistura de   activação de enzimas hepáticos , ou a mesma   quantidade de solução tampão , pré-incubada   antes da adição de 2,0 ml de gelose de recobrimento .   O resto do modo operatório é idêntico ao utilizado   para o método de incorporação directa em caixa .    Todas as caixas preparadas para estes 2 métodos   são em triplicado .    2 . DADOS    O número de colónias revertantes por caixa   é indicado para as séries testemunhas e para as   séries tratadas . As contagens por caixa , o número   médio de colónias revertantes por caixa e os   desvios-padrão devem ser indicados para a substância   ensaiada e para as testemunhas .    Todos os resultados são confirmados durante uma   experiência independente .    Os dados devem ser avaliados por métodos estatísticos   convenientes .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio deve conter , se possível ,   as seguintes informações :     - bactérias e estirpe utilizadas ,     - condições experimentais : doses , toxicidade ,   composição do meio , métodos de tratamento   ( pré-incubação , incubação ) , mistura   de activação de enzimas hepáticos , substância   de referência , testemunhas negativas ,     - contagem por caixa , número médio de colónias   revertantes por caixa , desvio-padrão , relação   dose/efeito , se possível ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    B.14 . OUTROS EFEITOS : MUTAGÉNESE    ENSAIOS DE MUTAÇÃO REVERSA EM SALMONELLA   THYPHIMURIUM    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    Ver introdução geral , Parte B ( ponto A ) .    1.2 . Definição    Ver introdução geral , Parte B ( ponto B ) .    1.3 . Substâncias de referência    Nenhuma .    1.4 . Princípio do método    O sistema de reversão à histidina ( his ) da   Salmonella typhimurium é um ensaio microbiano ,   que permite medir a reversão his - * his + induzida   por substâncias químicas responsáveis por   substituições de base ou por mutações   deslocando o quadro de leitura ao nível do genoma   do organismo .    As bactérias são expostas à substância   de ensaio com ou sem activação metabólica   e vertidas numa superfície mínima de um meio .   Após um período de incubação conveniente ,   conta-se o número de colónias revertantes   e compara-se com o número de revertantes espontâneas   observadas numa cultura testemunha não tratada   e/ou em presença do solvente .    1.5 . Critério de qualidade    Nenhum .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Preparações    1.6.1.1 . Bactérias    São feitas crescer a 37 ° C culturas recentes   de bactérias , até final da fase exponencial   ou até ao início da fase estacionária   de crescimento . A densidade celular aproximada deve   ser de 10 8 - 10 9 células por mililítro .    1.6.1.2 . Activação metabólica    As bactérias devem ser expostas à substância   de ensaio com e sem uma mistura de activação   de enzimas hepáticas de mamíferos ( fracção   pós-mitocôndrica sem co-factores ) preparada a   partir de ratos ou de ratazanas pré-tratados com   indutores enzimáticos .    1.6.2 . Condições experimentais    1.6.2.1 . Estirpes da experiência    Devem ser utilizadas , pelo menos , as quatro estirpes   seguintes : TA 1535 , TA 1537 , TA 98 e TA 100 ;   podem ser usadas como suplemento outras estirpes ,   tais como , TA 1538 .    Convém utilizar métodos reconhecidos para a   preparação e a conservação das culturas .   As exigências de crescimento e da identificação   genética das estirpes , a sua sensibilidade aos   raios UV e ao cristal violeta , assim como a sua   resistência à ampicilina devem ser verificadas .   As estirpes devem igualmente produzir revertantes nas   gamas de frequência antecipadas .    1.6.2.2 . Meio    É utilizado um meio selectivo adequado , assim   como uma gelose de recobrimento adequada .    1.6.2.3 . Utilização de testemunhas negativas   e positivas    Devem utilizar-se em paralelo testemunhas não   tratadas e testemunhas em presença de solventes .    Devem igualmente ser utilizadas testemunhas positivas ,   com os 2 fins seguintes :    i ) Confirmar a sensibilidade das estirpes bacterianas .    Os compostos seguintes podem ser utilizados para os   ensaios sem activação metabólica :    Com * Estirpe de reversão *    TA 1535 , TA 100 * Azida de sódio *    TA 1538 , TA 98 * 2-nitrofluoreno *    TA 1537 * 9-amidoacridina *    ii ) Garantir a actividade do sistema metabólico   adequado . Uma testemunha positiva de actividade dum   sistema metabolizante é o 2-aminoantraceno para   todas as estirpes . Se possível , utilizar uma   testemunha positiva que pertença à mesma classe   química que a substância de ensaio .    1.6.2.4 . Quantidade de substância de ensaio   por caixa    Pelo menos 5 quantidades diferentes de substâncias   devem ser submetidas ao ensaio com variações   semilogarítmicas entre as caixas . As substâncias   são submetidas ao ensaio até que sejam atingidos os   limites de solubilidade ou de toxicidade . A toxicidade   é posta em evidência pela redução do número de   revertantes espontâneos , um clareamento do fundo ,   ou pela taxa de sobrevivência das culturas tratadas .   As substâncias químicas não tóxicas devem   ser submetidas ao ensaio até 5 mg por caixa , antes   que possa considerar a substância de ensaio como   negativa .    1.6.2.5 . Condições de incubação    As caixas são incubadas durante 48 a 72 horas ,   a 37 ° C .    1.6.3 . Técnica   Para o método de incorporação directa em caixa   sem activação enzimática , adiciona-se a   substância de ensaio e 0,1 ml de cultura bacteriana   recente a 0,2 ml de gelose de recobrimento . Para os   ensaios com activação metabólica , junta-se   à gelose 0,5 ml da mistura de activação de   enzimas hepáticas contendo uma quantidade   adequada de fracção pós-mitocóndrica , após   a adição da substância de ensaio e das   bactérias . Os conteúdos de cada tubo são   misturados e vertidos na superfície duma caixa   de gelose selectiva . A gelose deve solidificar   e as caixas são incubadas a 37 ° C , durante   48 a 72 horas . No final do período de incubação ,   contam-se as colónias revertantes por caixa .    Para o método de pré-incubação , uma mistura   contendo a substância de ensaio , 0,1 ml de cultura   bacteriana recente e uma quantidade adequada de mistura   de activação de enzimas hepáticas ou a mesma   quantidade de solução tampão , são pré-incubadas   antes da adição de 2,0 ml de gelose de   recobrimento . O resto da técnica é idêntica   à utilizada para o método de incorporação   directa em caixa .    Todas as caixas preparadas para estes dois métodos   são no mínimo em triplicado .    2 . DADOS    O número de colónias revertantes por caixa é   indicado para as séries testemunhas e para as séries   tratadas . As contagens por caixa , o número   médio de colónias revertantes por caixa e os   desvios padrão devem ser indicados para a substância   de ensaio e para as testemunhas . Todos os resultados   são confirmados durante uma experiência independente .   Os dados devem ser avaliados por métodos estatísticos   adequados .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio deve conter , se possível ,   as informações seguintes :     - bactérias , estirpe utilizada ,     - condições experimentais : doses , toxicidade ,   composição do meio , método de tratamento   ( pré-incubação e incubação ) , mistura   de activação de enzimas hepáticas , substâncias   de referência , testemunhas negativas ,     - contagem por caixa , número médio de   colónias revertantes por caixa , desvio padrão ,   relação dose/efeito , se possível ,     - discussão dos resultados ,     - interpretação dos resultados .    3.2 . Avaliação e interpretação    Ver introdução geral , Parte B ( ponto C ) .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Ver introdução geral , Parte B ( ponto D ) .    PARTE C : MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DA   ECOTOXICIDADE    C.1 . TOXICIDADE AGUDA PARA OS PEIXES    1 . Introdução    É aconselhável dispor , na medida do possível ,   de informações sobre a hidrossolubilidade , a   pressão de vapor , a estabilidade química , as   constantes de dissociação e a biodegradabilidade   da substância de ensaio , a fim de ser escolhido   o método de ensaio mais adequado ( com corrente   de passagem estática , semi-estática ou   dinâmica ) , para permitir assegurar concentrações   constantes satisfatórias da substância de ensaio   durante o periodo de ensaio .    As outras informações necessárias , por exemplo   fórmula estrutural , o grau de pureza , a natureza e a   percentagem das impurezas significativas , a presença   e quantidade de aditivos e ainda o coeficiente de   separação n-octanol/água , devem ser tidas   em consideração , para o planeamento do ensaio e a   interpretação dos resultados .    1.2 . Definição e unidades    A toxicidade aguda é o efeito desfavorável   visível , induzido num organismo durante uma curta   exposição ( dias ) a uma dada substância .    No presente ensaio , a toxicidade aguda é expressa   como a concentração letal média ( CL50 ) , quer   dizer , a concentração que na água é a   responsável pela morte de 50 % de um lote de   peixes submetidos aos ensaios , durante um período   de exposição contínua a indicar . As   concentrações da substância de ensaio   são indicadas em peso por volume ( mg/l ) e   igualmente em peso por peso ( partes por milhão ) .    1.3 . Substâncias de referência    Pode submeter-se aos ensaios uma substância   de referência , a fim de se demonstrar que , nas   condições de ensaio de laboratório , a resposta   da espécie submetida ao ensaio não variou de   forma significativa .    Nenhuma substância de referência é indicada   para este ensaio .    1.4 . Princípio do método de ensaio    Os peixes sao expostos à(s) substância(s) de   ensaio adicionada(s) à água , com uma dada   variação de concentrações , durante um   período mínimo de 48 horas , mas de preferência   96 horas . As mortalidades são registadas pelo   menos todas as 24 horas e as concentrações   responsáveis pela morte de 50 % dos peixes   ( CL50 ) , são calculadas , se possível ,   em cada observação .    1.5 . Critérios de qualidade   As mortalidade das testemunhas não deve ultrapassar   10 % no final do ensaio .    A concentração em oxigénio deve ser superior   a 60 % da saturação durante todo o ensaio .    A análise , as propriedades químicas ou o   sistema de ensaio utilizado devem evidenciar que a   concentração da substância submetida a ensaio   é mantida de modo satisfatório ( por exemplo , nos   limites de 80 % da concentração inicial durante   todo o ensaio ) .    1.6 . Descrição do método de ensaio    Podem ser utilizados 3 tipos de sistemas .    Ensaio estático :    Ensaio de toxicidade efectuado em organismos   aquáticos , durante o qual não intervém qualquer   renovação da solução de ensaio ( as soluções   permanecem sem alteração durante todo o ensaio ) .    Ensaio semi-estático :    Ensaio sem renovação contínua da solução ,   mas com uma renovação periódica quando o período   de ensaio se prolonga ( por exemplo , cada 24 horas ) .    Ensaio dinâmico :    Ensaio de toxicidade durante o qual a água é   constantemente renovada nos recipientes de ensaio , sendo   o produto químico submetido a ensaio transportado   pela água que renova o meio da prova .    1.6.1 . Reagentes    1.6.1.1 . Soluções da substância de ensaio    As soluções-padrão com as concentrações   exigidas são preparadas por dissolução da   substância em água desionizada , ou na   água , de acordo com o ponto 1.6.1.2 .    As soluções-padrão de substâncias com baixa   solubilidade na água podem ser preparadas por   dispersão ultrassónica ou , se necessário ,   recorrendo a solventes orgânicos , emulsionantes   ou dispersantes . Sempre que se utiliza este tipo   de produtos auxiliares , os peixes testemunhas   devem ser expostos a uma concentração de produto   auxiliar igual à que se apresenta na concentração   máxima da substância de ensaio . A concentração   destes produtos auxiliares não deve exceder 0,1 g/l .    As concentrações escolhidas para o ensaio são   preparadas por diluição da solução-mãe .   Se se realiza um ensaio com concentrações elevadas ,   a substância pode ser diluída directamente na   água de diluição .    O ensaio deve ser efectuado sem ajustamento do pH .   Quando surge uma alteração significativa do pH , é   aconselhável repetir o ensaio ajustando o pH   e registando tal facto nos resultados . Neste caso , o   valor do pH da solução-mãe deve ser ajustado   ao valor do pH da água de diluição , a menos   que haja razões especiais que se lhe oponham .   São preferidos o HCl e NaOH . Este ajustamento deve   ser efectuado de modo que a concentração da   substância de ensaio na solução-mãe , não   seja significativamente alterada . Se o ajustamento   provocar uma reacção química ou uma precipitação   da substância de ensaio , aquando do ensaio seguinte ,   essa observação deve ser referida .    1.6.1.2 . Águas para a criação e a diluição    Pode utilizar-se a água potável ( não contaminada   por concentrações perigosas de cloro , metais   pesados , ou outras substâncias ) , a água natural   de boa qualidade ou a água reconstituída ( ver   apêndice 1 ) . Preferem-se as águas cuja dureza   total está compreendida entre 50 e 250 mg/l ( em CaCO3 ) ,   com um pH de 6,0 - 8,5 .    1.6.2 . Aparelhagem    A aparelhagem deve ser constituída por material   químico inerte :     - sistema de diluição automática ( para o   ensaio dinâmico ) ,     - dispositivo de medição do oxigénio ,     - equipamento para a determinação da dureza   da água ,     - equipamento próprio para o controlo da   temperatura ,     - aparelho para medir o pH .    1.6.3 . Peixes submetidos a ensaio    Utiliza-se uma ou várias espécies , sendo   a escolha deixada ao critério do laboratório   que efectua o ensaio .    Recomenda-se que a espécie utilizada seja   escolhida com base em critérios práticos   determinantes , tais como : disponibilidade   imediata durante todo o ano , facilidade de   manutenção , aptidão para o ensaio ,   sensibilidade relativa , e um conjunto de factores   significativos económicos , biológicos ou   ecológicos . O peixe deve estar de boa saúde   e isento de malformações aparentes .    São indicadas no apêndice 2 , as espécies   de peixes recomendadas para o ensaio .    1.6.3.1 . Criação    Os peixes submetidos ao ensaio devem provir ,   de preferência , de um só lote , cujos espécimes   tenham o mesmo comprimento e a mesma idade .   Devem ser conservados durante pelo menos 12 dias   nas seguintes condições :     - recipientes :    São recomendados volumes de 300 l , no   mínimo , para os peixes de água fria e de 100 l ,   no mínimo , para os peixes de água quente ;     - carga :    variável segundo o sistema utilizado   ( recirculação ou dinâmica ) e a espécie   de peixe ;     - água :    ver ponto 1.6.1.2 ;     - iluminação :    fotoperíodos de 12 a 16 horas por dia ;     - concentração em oxigénio dissolvido :    no mínimo 80 % da saturação ;     - alimentação :    diária ou 3 vezes por semana , com paragem   24 horas antes do início do ensaio .    1.6.3.2 . Mortalidade    Após um período de adaptação de   48 horas , registar as mortalidades . Avaliar   a qualidade do lote de acordo com os critérios   seguintes :     - mortalidade em 7 dias superior a 10 %   da população : rejeição de todo o lote ,     - mortalidade em 7 dias compreendida entre   5 e 10 % da população : prolongar o período   de observação por outros 7 dias . Se não   se verificar qualquer outro caso de mortalidade ,   o lote é aceitável , caso contrário ele   deve ser rejeitado ,     - mortalidade em 7 dias inferior a 5 % :   aceitação do lote .    1.6.4 . Adaptação    Os peixes devem ser mantidos durante pelo   menos 7 dias , antes da sua utilização ,   nas condições do ensaio ( água e temperatura ) .    1.6.5 . Técnica    Antes do ensaio definitivo , pode proceder-se   a um ensaio tendo como finalidade determinar o   intervalo de concentrações eficazes . Este   ensaio fornecerá informações sobre o intervalo   de concentrações a utilizar aquando do   ensaio definitivo .    Proceder a um ensaio testemunha , quer dizer   sem substância de ensaio , utilizando , se for   caso disso , o produto auxiliar . Este ensaio   testemunha , junta-se à série dos ensaios   propriamente ditos .    As concentrações não devem diminuir mais   de 20 % durante o período do ensaio . Em função   das propriedades físicas e químicas da substância ,   escolher-se-á o método estático , semi-estático   ou dinâmico .    O peixe é exposto à substância de ensaio   nas condições seguintes :     - duração :    no mínimo 48 horas , de preferência 96 horas ;     - número de organismos :    no mínimo 10 por concentração ;     - recipientes :    com capacidade adequada em função da carga   recomendada ;     - carga biológica :    carga máxima recomendada para o ensaio estático   ou semi-estático : 1,0 g/l ; para os ensaios   dinâmicos , pode ser aceitável uma carga   mais elevada ;     - concentração do ensaio :    uma testemunha , pelo menos 5 concentrações ,   diferindo num factor constante que não exceda   1,8 e compreendidas no intervalo de mortalidade   de 0 % a 100 % ;     - água :    ver ponto 1.6.1.2 . ;     - iluminação :    fotoperíodos diários , de 12 a 16 horas ;     - temperatura :    a conveniente para a espécie escolhida   ( ver seguidamente ) , com cerca de ± 1 ° C ,   qualquer que seja o sistema do ensaio ;     - concentração em oxigénio dissolvido :    pelo menos 60 % da saturação ;     - alimentação :    nenhuma .    Os peixes são examinados nas 2 a 4 primeiras   horas e pelo menos com intervalos de 24 horas .   São considerados como mortos , se o toque   no pedúnculo caudal não produzir qualquer   reacção e se não for visível qualquer   movimento respiratório . Os peixes mortos são   eliminados em cada observação e as mortalidades   são registadas .    As anomalias visíveis ( por exemplo perda de   equilíbrio , alterações na natação , tensão   respiratória , pigmentação , etc. ) serão   registadas .    As medições do pH , do oxigénio dissolvido e da   temperatura são efectuadas directamente .    2 . AVALIAÇÃO DOS DADOS    Indicar , em papel log-probit , as percentagens de   mortalidade para cada período de exposição   recomendada , em função das concentrações . Unir   os pontos obtidos e anotar a concentração   correspondente a 50 % da resposta ( ver figura no   apêndice 3 ) .    Obtem-se assim o valor da CL50 , para o período de   exposição adequado .    Se os dados são adequados , a concentração letal   média ( CL50 ) e os seus limites de confiança   ( p = 0,05 ) podem ser avaliados utilizando um   método clássico .    O valor da CL50 deve ser arredondado para um ou no   máximo dois algarismos significativos .    Nos casos em que o declive da curva de resposta   concentração/percentagem é demasiadamente   acentuada para permitir o cálculo da CL50 , será   suficiente proceder a uma estimativa gráfica deste valor .    Quando duas concentrações consecutivas numa   relação de 1,8 derem apenas 0 ou 100 % de mortalidade ,   estes dois valores são suficientes para indicar o   intervalo em que se situa a CL50 .    Se se verificar que a estabilidade ou a homogeneidade da   substância de ensaio não pode ser mantida , esta   observação deve ser mencionada , e interpretar-se-ão   os resultados com certa prudência .    3 . APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS    O relatório conterá , se possível :     - informações sobre o organismo submetido ao   ensaio ( nome científico , estirpe , fornecedor ,   pré-tratamento eventual , tamanho e número   utilizados por cada concentração do ensaio ) ,     - lista das concentrações utilizadas e todas as   informações disponíveis sobre a estabilidade da   substância de ensaio em soluções com essas   concentrações ,     - descrição do equipamento de ensaio ,     - os métodos utilizados e os resultados obtidos ,   se se realizarem análises químicas ,     - origem da água de diluição e suas principais   características ( pH , dureza , temperatura ) ,     - eventualmente , as concentrações dos produtos   auxiliares ,     - no caso das substâncias com baixa solubilidade   na água , o método de preparação da solução-mão   e da solução do ensaio ,     - razões da escolha e os pormenores do método   de ensaio utilizado ( por exemplo : duração do ensaio ,   sistema estático , semi-estático , dinâmico ,   taxa de renovação , arejamento ou não , carga em   peixe , etc. ) ,     - informações sobre a iluminação ,     - concentração máxima testada que não provocou   mortalidade durante o ensaio ,     - concentração mínima testada que causou 100 % de   mortalidade durante o ensaio ,     - mortalidade cumulativa por cada concentração e   para o ensaio testemunha ( controlo com a ajuda de   produto auxiliar , se necessário ) nos tempos de   observação recomendados ,     - valores da CL50 em cada um dos tempos de observação   recomendados ( com limites de confiança a 95 % , se   possível ) ,     - métodos estatísticos utilizados para a   determinação dos valores de CL50 ,     - representação gráfica das percentagens de   mortalidade em função das concentrações no fim   do ensaio ,     - declive da curva de resposta   concentração/percentagem e os seus limites de   confiança de 95 % ,     - concentração do oxigénio dissolvido , o pH e   a temperatura das soluções de ensaio , cada 24 horas ,     - se uma substância de referência é utilizada ,   o seu nome e os resultados obtidos ,     - prova de que os critérios de qualidade foram   respeitados .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    (1) OCDE , Paris , 1981 . Test Guidelines 203 ,   Decision of the Council C ( 81 ) 30 , Final .    Apêndice I    Água reconstituída    Exemplos de água de diluição adequada    Os produtos químicos devem ser de qualidade analítica .    A água deve ser uma água destilada de boa qualidade ,   ou água desionizada com uma condutividade inferior a   5 µScm-1 .    Soluções-padrão    CaCl2 · 2 H2O ( cloreto de cálcio diidrato ) : *   11,76 g *    dissolver em água e completar o volume para 1 litro . * *    MgSO4 · 7 H2O ( sulfato de magnésio heptaidrato ) : *   4,93 g *    dissolver em água e completar o volume para 1 litro . * *    NaHCO3 ( hidrogenocarbonato de sódio ) : * 2,59 g *    dissolver em água e completar o volume para 1 litro . * *    KCl ( cloreto de potássio ) : * 0,23 g *    dissolver em água e completar o volume para 1 litro . * *    Água de diluição reconstituída    Misturar 25 ml de cada uma das quatro soluções-mãe   e completar o volume para 1 litro com água .    Arejar até saturação em oxigénio dissolvido .    O pH deve ser de 7,9 ± 0,3 .    Se necessário , ajustá-lo com NaOH ( hidróxido   de sódio ) ou HCl ( ácido clorídrico ) .    A água de diluição assim preparada é deixada em   repouso cerca de 12 horas e não deve ser arejada   posteriormente .    A soma dos iões Ca/Mg nesta solução é igual a   2,5 mmol/l . A relação entre os iões Ca:Mg é de   4:1 , e entre os iões Na:K é de 10:1 . A   alcalinidade total desta solução é igual a   0,8 mmol/l .   Os desvios eventuais na preparação da água de   diluição não devem alterar a composição   ou as propriedades desta água .    Apêndice 2    Espécies de peixes recomendadas para o ensaio    Espécie recomendada * Intervalo das temperaturas   de ensaio recomendado ( ° C ) * Comprimento total   recomendado do animal submetido ao ensaio ( cm ) *    Brachydanio rerio ( Teleostei , Cyprinidae )   ( Hamilton-Buchanan ) * * *    Peixe Zebra * 20 à 24 * 3,0 ± 0,5 *    Pimephales promelas ( Teleostei , Cyprinidae ) * * *   Fathead minnow * 20 à 24 * 5,0 ± 2,0 *    Cyprinus carpio ( Teleostei , Cyprinidae ) ( Linneaus   1758 ) * * *    Carpa comum * 20 à 24 * 6,0 ± 2,0 *    Oryzias latipes ( Teleostei , Poeciliidae ) ( Schlegel   1850 ) * * *    Killifish * 20 à 24 * 3,0 ± 1,0 *    Poecilia reticulate ( Teleostei , Poeciliidae )   ( Peeters 1859 ) * * *    Gambúsia * 20 à 24 * 3,0 ± 1,0 *    Lepomis macrochirus ( Teleostei , Centrarchidae )   ( Linneaus 1758 ) * * *    Bluegill * 20 à 24 * 5,0 ± 2,0 *    Salmo gairdneri ( Teleostei , Salmonidae ) ( Richardson   1836 ) * * *    Truta arco-íris * 13 à 17 * 6,0 ± 2,0 *    Leuciscus idus ( Teleostei , Cyprinidae ) ( Linneaus   1758 ) * * *    Bordalo * 20 à 24 * 6,0 ± 2,0 *    Aprovisionamento    Os peixes acima mencionados são fáceis de criar   e/ou largamente disponíveis durante todo o ano . Podem   reproduzir-se e desenvolver-se quer em explorações   piscícolas , quer em laboratório , em condições   sanitárias controladas . O animal submetido a ensaio   deve ser são e de origem conhecida . Estes peixes   encontram-se disponíveis quase por todo o mundo .    Apêndice 3    Exemplo de curva percentagem da   mortalidade/concentração    Exemplo de determinação de CL50 em papel   log-probit : v. JO    Apêndice 4    Exemplos de métodos normalizados    (1) OECD , Paris , 1981 , test guideline 203 .   Decision of the Council C ( 81 ) 30 , Final .    (2) ISO/TC/147/SC 5/WG/3 - Draft proposal for   screening chemicals and products for acute toxicity   to fish using a static , semi-static or flow-through   method - Document 7346/I , II , III , 1980/06/15ISO/DP .    (3) Eidgenoessiches Department des Innern ,   Schweiz : Richtlinien fuer Probenahme und Normung von   Wasseruntersuchungs-methoden - Part II 1974 .    (4) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen .   38 412 ( L1 ) und L ( 15 ) .    (5) AFNOR . Détermination de la toxicité   aiguë d'une substance vis-à-vis de Brachydanio   rerio . T90-303 .    (6) JIS K 0102 . Acute toxicity test for fish .    (7) Degradability , Ecotoxicity and Bioaccumulation .   The determination of the possible effects of   chemicals and wastes on the aquatic environment ,   Volume I and II , Government Publishing Office ,   The Hague , The Netherlands 1980 .    (8) Environmental Protection Agency 1975 . Methods   for the Acute Toxicity Test with Fish ,   Macroinvertebrates and Amphibians . The Committee   on Methods for Toxicity Tests with Aquatic   Organisms . Ecological Research Series   EPA-660-75-009 .    (9) Environmental Protection Agency . January 1978 .   Environmental Monitoring and Support Laboratory ,   Office of Research and Development . EPA-600/4-78-012 .    (10) Environmental Protection Agency : Toxic   Substance Control , March 16 1979 , Part IV .    (11) Standard methods for the Examination of Water   and Wastewater . 14th edition 1975 APHA-AWWA-WPCF .    (12) Commission of the European Communities .   Inter-laboratory test programme concerning the   study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect   to the fish . CEE Study D.8368 , 22 March 1979 .    (13) Litchfield , J.T. and Wilcoxon , F. , A simplified   method for Evaluating dose Effects Experiments , J.   Pharm. Exp. Therap. , Vol. 96 , 1949 , p. 99 .    C.2 . TOXICIDADE AGUDA PARA AS DÁFNIAS    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    É conveniente ter , na medida do possível ,   informações sobre a hidrossolubilidade , a   pressão de vapor , a estabilidade química ,   as constantes de dissociação e a biodegradabilidade   da substância , antes de ser iniciado o ensaio .    Informações suplementares ( por exemplo :   fórmula estrutural , pureza em percentagem , natureza e   percentagem das impurezas , presença e número   de aditivos e o coeficiente de separação em   n-octanol/água ) , devem ser tomadas em consideração   aquando do planeamento do ensaio e da interpretação   dos resultados .    1.2 . Definições e unidades    O que é exigido na directiva relativa ao valor   de CL50 referente à dáfnia , é satisfeito pela   determinação de CE50 , tal como é descrito   no presente método de ensaio .    No presente ensaio , a toxicidade aguda é expressa   pela concentração média eficaz ( CE50 ) de   imobilização . Isso corresponde à concentração   ( em valor inicial ) que inibe a mobilidade de 50 % das   dáfnias de um lote submetido ao ensaio durante   um período de 24 horas de exposição . O valor   de CE50 para 48 horas , pode igualmente ser determinado ,   se possível . Todas as concentrações das   substâncias de ensaio são expressas em peso   por volume ( mg/l ) e igualmente em peso por peso   ( partes por milhão ) .    Imobilização :    Os organismos que são incapazes de se deslocar   nos 15 segundos que se seguem a uma ligeira   agitação do recipiente são considerados como   imobilizados .    As concentrações da substância do ensaio   são indicadas em peso por peso ( partes por milhão ) .    1.3 . Substância de referência    Uma substância de referência pode ser submetida   a ensaio para demonstrar que , nas condições   de ensaio em laboratório , a sensibilidade   da estirpe utilizada para o ensaio não é   sensivelmente alterada .    Não é indicada qualquer substância de   referência para este ensaio .    1.4 . Princípio do método de ensaio    As dáfnias são expostas durante 24 horas à   substância de ensaio diluída em água   em diferentes concentrações ; se necessário ,   o tempo de exposição pode ser prolongado   até 48 horas .    Em condições de ensaio idênticas , para uma   gama de concentrações eficazes , concentrações   diferentes de substância de ensaio exercem efeitos   diferentes sobre a mobilidade das dáfnias .   Consequentemente , no final do ensaio a cada   concentração corresponde uma percentagem   diferente de imobilização das dáfnias .    As concentrações que provocam de 0 a 100 %   de imobilização são determinadas directamente   pela observação , enquanto que o CE50 - 24 horas   ( tal como o CE50 - 48 horas ) é determinado se   possível por cálculo .    Para este método , utiliza-se um sistema estático ,   sem renovação das soluções de ensaio , durante o   período de exposição .    1.5 . Critérios de qualidade    A imobilização das testemunhas não deve   exceder 10 % no final do ensaio .    A concentração em oxigénio não deve ser   inferior a 2 mg/l no final do ensaio .    As dáfnias submetidas ao ensaio não devem   ser arrastadas para a superfície da água , pelo   menos no lote testemunha .    1.6 . Descrição do método de ensaio    1.6.1 . Reagentes    1.6.1.1 . Soluções de substância de ensaio    As soluções-mãe , com as concentrações   exigidas , são preparadas dissolvendo a substância   em água desionizada ou em água que corresponda   às condições fixadas no ponto 1.6.1.2 .    Para as substâncias com baixa solubilidade na água ,   as soluções-padrão podem ser preparadas por   dispersão ultrassónica ou , se necessário , utilizando   solventes orgânicos , emulsionantes ou dispersantes .   Se se recorrer a estas substâncias , as dáfnias   testemunhas devem ser expostas a uma concentração de   produtos auxiliar , igual à presente na concentração   máxima da substância de ensaio . A concentração   destes produtos auxiliares não deve exceder 0,1 g/l .    As concentrações escolhidas para o ensaio são   preparadas por diluição da solução-mãe . Se   os ensaios incidirem sobre concentrações elevadas ,   a substância pode ser dissolvida directamente na   água de diluição .    O ensaio deve ser efectuado sem ajustamento do pH .   Nos casos de alterações significativas do pH , é   conveniente repetir o ensaio ajustando o pH e registando   os resultados . Neste caso , o valor do pH da   solução-mãe deve ser adaptado ao valor do pH   da água de diluição , salvo se houver   razões particulares para não agir deste modo .   É preferível utilizar para este efeito HCl   ou NaOH . Este ajustamento do pH deve ser efectuado   de modo a não alterar sensivelmente a concentração   da substância de ensaio na solução . Se o   ajustamento provocar uma reacção química ou uma   precipitação da substância de ensaio ,   este ensaio não deve prosseguir sem o registo   destas observações no relatório .    1.6.1.2 . Águas de criação e da diluição    Qualquer água natural ou reconstituída conveniente   para a criação das dáfnias ( ver apêndice ) ,   pode ser utilizada para este ensaio .    A fim de evitar a necessidade de proceder a adaptações   antes do ensaio , recomenda-se a utilização de   uma água de criação idêntica à utilizada   para o ensaio .    1.6.2 . Aparelhagem    Utiliza-se o material corrente de laboratório .   O material destinado a estar em contacto com as   soluções de ensaio , deve de preferência ser   de vidro :     - aparelho para medição do oxigénio ( com   microeléctrodo ou qualquer outro equipamento   adequado para medição do oxigénio em amostras   de pequeno volume ) ,     - aparelho adequado para a medição de   temperatura ,     - aparelho para a medição do pH ,     - aparelho para a medição da dureza da água .    1.6.3 . Organismo submetido ao ensaio     « Daphnia magna » ou « Daphnia pulex » ,   com mais de 6 horas de idade e com menos de 24 horas no   início do ensaio , criada em laboratório , isenta   de doenças e de origem conhecida ( criação -   pré-tratamentos eventuais , etc ) .    1.6.4 . Técnica    Um ensaio preliminar pode preceder o ensaio definitivo ,   que fornece informações sobre a gama de   concentrações a utilizar para o ensaio definitivo .   Um ensaio testemunha , realizado com os produtos   auxiliares , mas na ausência da substância   de ensaio , deve ser efectuado para além das   séries de ensaio .    As dáfnias são expostas à substância de   ensaio , nas seguintes condições :     - duração :    minímo 24 h ;     - número de organismos :    pelo menos 20 organismos por concentração   do ensaio , repartidos de preferência em 4 lotes   de 5 ou em 2 lotes de 10 ,     - carga biológica :    um mínimo de 2 ml de solução de ensaio   deve ser fornecido a cada organismo ,     - concentração do ensaio :    a solução do ensaio deve ser preparada imediatamente   antes da introdução das dáfnias , de   preferência sem utilizar qualquer solvente que não   seja a água . Ao mesmo tempo que a testemunha ,   devem submeter-se aos ensaios concentrações   que formem uma série geométrica com relação 1,8 ,   que permitam obter 0 e 100 % de imobilizações   após 24 h e uma série de imobilizações   intermédias que permitam o cálculo de CE50 - 24 horas ,     - água :    ver ponto 1.6.1.2 . ,     - iluminação :    é facultativo um ciclo luz escuridão ; a   obscuridade completa é aceitável ,     - temperatura :    a temperatura de ensaio deve situar-se entre   18 e 22 ° C , mas deve , para cada ensaio , ser constante   com ± 1,0 ° C de variação ,     - arejamento :    as soluções do ensaio não devem ser arejadas   por agitação ,     - alimento :    nenhum .    O pH e a concentração em oxigénio das testemunhas   e de todas as concentrações do ensaio devem ser   medidos no final do ensaio ; o pH das soluções de   ensaio não deve ser alterado .    As substâncias voláteis devem ser submetidas   ao ensaio em recipientes cheios e hermeticamente   fechados , suficientemente grandes para evitar   qualquer falta de oxigénio .    As dáfnias são examinadas pelo menos após   24 horas de exposição e de novo após 48 horas ,   se o ensaio tiver sido prolongado .    2 . AVALIAÇÃO DOS DADOS    Indicar em papel log-probit as percentagens das   imobilizações cumulativas em função das   concentrações , após uma exposição de pelo   menos 24 horas . Unir os pontos obtidos e anotar a   concentração correspondente a 50 % de imobilização .    Se os dados forem adequados , a concentração   média CE50 e os seus limites de confiança   ( p = 0,05 ) podem ser avaliadosutilizando um   método clássico .    O valor de CE50 deve ser arredondado para um   ou , no máximo , dois algarismos significativos .    Nos casos em que o declive da curva de resposta   concentração/percentagem é demasiadamente acentuado   para que se possa calcular o CE50 , é suficiente   fazer uma estimativa gráfica deste valor .    Quando duas concentrações , numa relação   de 1,8 , derem apenas 0 ou 100 % de imobilização ,   estes dois valores são suficientes para indicar   dentro de que limites se situa o CE50 .    Se se verificar que a estabilidade ou a homogeneidade   da substância de ensaio não pode ser mantida ,   convirá interpretar os resultados com prudência ,   e referir o facto no relatório .    3 . APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS    O relatório do ensaio conterá , se possível :     - as informações sobre o organismo submetido   ao ensaio ( nome científico , espécie , fornecedor ou   origem , pré-tratamento eventual , método de   criação , incluindo a fonte , natureza , quantidade   e frequência da alimentação ) ,     - número de dáfnias utilizadas em cada   concentração de ensaio ,     - concentrações utilizadas e qualquer informação   disponível sobre a estabilidade da substância de   ensaio a estas concentrações , na solução   do ensaio ,     - descrição dos recipientes utilizados : volume   da solução contida em cada um deles , número de   organismos ,     - métodos utilizados e resultados , caso sejam   efectuadas análises químicas ,     - origem da água de diluição e suas   características principais ,     - método de preparação das soluções-padrão   e das soluções de ensaio ,     - concentração de quaisquer produtos auxiliares   utilizados ( solventes orgânicos , dispersantes ,   etc. ) ,   - informações sobre a iluminação ,     - concentração mais elevada do ensaio , que   não provocou qualquer imobilização durante   o ensaio ,     - concentração mais fraca do ensaio , que provocou   100 % de imobilização durante o ensaio ,     - percentagens de imobilizações cumulativas no   ensaio testemunha , no ensaio testemunha com o   produto auxiliar e em cada concentracção do   ensaio , para os períodos de observação recomendados   ( 24h ou 24 e 48 horas ) ,     - valores de CE50 por cada período de observação   recomendado ( com limites de confiança a 95 % , se   possível ) ,     - representação gráfica das percentagens   de imobilização em função das concentrações   no final do ensaio ,     - métodos estatísticos utilizados para determinar   os valores de CE50 ,     - declive da curva de resposta   concentração/percentagem ao fim de 24 horas e seus   limites de confiança de 95 % ,     - concentração do oxigénio dissolvido ,   os valores do pH e da temperatura das soluções   de ensaio ,     - se for utilizada uma substância de referência ,   o seu nome e os resultados obtidos ,     - prova de que os critérios de qualidade foram   respeitados .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS     ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 202 .   Decision of the Council C ( 81 ) 30 , Final .     ( 2 ) ISO Inhibition of mobility of Daphnia magna   Straus ( Cladocera - crustacea ) ISO/6341 .     ( 3 ) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna   Straus ( Cladocera - crustacea ) NFT 90 301 .     ( 4 ) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412   ( L1 ) und ( L11 ) .    Apêndice    Água preparada    Exemplo de água de diluição adequada    Os produtos químicos devem ser de qualidade   pró-análise .    A água deve ser uma água destilada de boa qualidade ,   ou água desionizada com uma condutividade inferior   a 5v s cm-1 .    Soluções-mãe    CaCL2.2 H2O ( cloreto de cálcio diidratado ) : *   11,76 g *    dissolver e completar o volume para 1 litro , em   água . * *    MgSO4.7 H2O ( sulfato de magnésio heptaidratado ) : *   4,93 g *    dissolver e completar o volume para 1 litro , em   água . * *    NaHCO3 ( hidrogenocarbonato de sódio ) : *   2,59 g *    dissolver e completar o volume para 1 litro , em   água . * *    KCl ( cloreto de potássio ) : * 0,23 g *    dissolver e completar o volume de um litro , em   água . * *    Água de diluição preparada    Misturar 25 ml de cada uma das quatro soluções-mãe   e completar o volume para 1 litro , com água .    Arejar até saturação em oxigénio dissolvido .    O ph deve ser de 7,9 ± 0,3 . Se nececcário ,   ajustá-lo com NaOH ( hidróxido de sódio ) ou   HCl ( ácido clorídrico ) .    A água de diluição assim preparada é   deixada em repouso cerca de 12 horas e não deve ser   arejada posteriormente .    A soma dos iões Ca/Mg nesta solução é igual   a 2,5 mmol/l . A relação entre os iões   Ca : Mg é de 4 : 1 , e entre os iões   Na : K é de 10 : 1 .    A alcalinidade total desta solução é igual   a 0,8 mmol/l .    Os desvios eventuais na preparação da água   de diluiçao não devem alterar a composição ou as   propriedades desta água .    C.3 . DEGRADAÇÃO BIÓTICA :    ENSAIO DE SCREENING OCDE ALTERADO    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    O objectivo do método é a medição da   biodegradabilidade de compostos orgânicos não   voláteis e solúveis na água , em meio aquoso ,   aeróbico e com uma concentração inicial de   5 a 40 mg/l de carbono orgânico dissolvido por   litro ( COD/l ) . Se os limites de sensibilidade dos   analisadores de carbono orgânico forem melhorados ,   pode ser vantajoso nomeadamente para os compostos   tóxicos , utilizar concentrações mais baixas .   Convém determinar o teor em carbono orgânico   da substância de ensaio .    O método só é aplicável às substâncias   orgânicas na concentração utilizada no ensaio   ( 5 a 40 mg de COD/l ) :     - são solúveis na água ,     - têm uma pressão de vapor que pode ser   desprezada ,     - não têm efeito inibidor face às bactérias ,     - não são objecto de absorção importante   nas superfícies de vidro .    É útil conhecer as proporções relativas   dos principais elementos constitutivos da   substância de ensaio para interpretar os resultados   obtidos , nomeadamente se estes forem pouco elevados .    O conhecimento do limiar de toxicidade da substância   face aos microrganismos pode ter interesse para   interpretar os resultados pouco elevados ou para escolher   as concentrações de ensaio adequadas .    1.2 . Definições e unidades    A degradação é expressa como a percentagem   do desaparecimento do COD em relação ao seu valor   inicial .    D t = [ 1 - ( C t - C bl(t) ) / ( C0 - C bl(0) ) ]   × 100    D t = degradação em percentagem do desaparecimento   de COD , no tempo t    C o = concentração inicial em COD do meio de   cultura ( mg de COD/l )    C t = concentração em COD do meio de cultura   no tempo t ( mg de COD/l )    C bl(0) = concentração inicial em COD da   testemunha ( mg de COD/l )    C bl(t) = concentração em COD da testemunha ,   no tempo t ( mg de COD/l ) .    1.3 . Substâncias de referência    É conveniente utilizar substâncias de referência   adequadas para determinar a actividade do inócúlo .   Para este fim , pode utilizar-se a anilina , o acetato de   sódio ou o benzoato de sódio ( por exemplo ) . A   degradação destas substâncias deve ser superior   ou igual a 70 % em 10 dias , a contar do dia em que a   taxa de biodegradação observada é pela primeira   vez superior a 10 % . Para que o ensaio seja válido ,   estes resultados devem ser obtidos no prazo de 28 dias .   Caso contrário , deverá ser repetido utilizando   um inóculo de origem diferente .    1.4 . Princípio do método de ensaio    Dissolve-se num meio mineral ( solução de   elementos nutritivos minerais , enriquecida com uma   solução de oligo-elementos e com uma solução   de vitaminas indispensáveis ) uma quantidade   definida de substância de modo a obter uma concentração   correspondente de 5 a 40 mg COD/l . Em seguida , esta   solução é inoculada com um pequeno número   de microrganismos pertencentes a diferentes estirpes ,   é arejada de 20 a 25 ° C e mantida na obscuridade   ou sob luz difusa .    A degradação é seguida pela determinação   do COD durante um período de 28 dias .    O método é controlado com a ajuda duma substância   de referência .     « Ensaios em branco » não contendo nem   substância de ensaio nem substância de referência ,   serão efectuados paralelamente para determinar as   concentrações em COD no meio .    1.5 . Critérios de qualidade    A reprodutibilidade do método foi estabelecida aquando   de ensaios de intercomparação da CEE e da OCDE .    A concentração mais baixa da substância de   ensaio para a qual o método é aplicável , é   determinada em grande medida pelo limite de detecção   da análise do carbono orgânico ( 0,5 mgC/l ,   actualmente ) e pela sua concentração na solução   nutritiva .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Reagentes    1.6.1.1 . Água    É geralmente utilizada como solvente a água   desmineralizada ou a água destilada isentas de   vestígios de substâncias tóxicas ( em particular   cobre ) . Só pode ser utilizada a água desmineralizada   por destilação ou por permuta iónica .    A água destilada não deve conter mais de 10 % de   carbono orgânico introduzido pela substância de   ensaio .    É indispensável uma água de grande pureza para   a análise do COD nas concentrações compreendidas   entre 0 e 40 mg/l . As contaminações provêm   não somente das impurezas contidas na água , mas   também das resinas de permuta iónica e de   proliferações microbianas ( bactérias ou algas que   se desenvolvem sob a acção da luz , etc ) . Um   mesmo lote deve ser utilizado para uma série de   ensaios e a água deve ser controlada previamente   por análise do COD . Se necessário , pode ser   purificada pela radiação UV ou por outros meios .    1.6.1.2 . Solução nutritiva    A solução nutritiva contém , por litro , 1 ml de   cada uma das soluções a ) a f ) seguintes em   água ( 1.6.1.1 ) ( as iniciais PA significam   « pureza analítica » ) .    a ) KH2PO4 ( diidrogenofosfato de potássio ) : *   PA 8,50 g *    K2HPO4 ( monoidrogenofosfato de potássio ) : *   PA 21,75 g *    Na2HPO4 ( monoidrogenofosfato de sódio ) : *   PA 33,40 g *    NH4Cl ( cloreto de amónio ) : * PA 20,00 g *    dissolver e completar até 1 000 ml com   água ( 1.6.1.1 . ) * *    O pH deve ter um valor de 7,2 ; * *    b ) MgSO4.7H2O ( sulfato de magnésio   heptaidratado ) : * PA 22,50 g *    dissolver e completar até 1 000 ml com   água ( 1.6.1.1 . ) ; * *    c ) CaCl2 ( cloreto de cálcio ) : * PA 27,50 g *    dissolver e completar até 1 000 ml com   água ( 1.6.1.1 . ) . * *    Esta solução deve ser preparada exactamente antes   do ensaio ; * *    d ) FeCl3.6H2O [ cloreto de ferro ( III )   hexaidratado ] : * PA 0,25 g *    dissolver e completar até 1 000 ml com água   ( 1.6.1.1 . ) ; * *    e ) Solução extemporânea de oligo-elementos * *    MnSO4.4H2O [ sulfato de manganésio ( II )   tetraidratado ] ( = 0,23 mg MnSO4.H2O ) : *   PA 39,9 mg *    H3BO3 ( ácido bórico ) : * PA 57,2 mg *    ZnSO4.7H2O ( sulfato de zinco heptaidratado ) : *   PA 42,8 mg *     ( NH4 ) Mo7O24 [ molibdato de amónio ( IV ) ]   = 36,85 mg * *    (NH4)6Mo7O24.4H2O : * PA 34,7 mg *    Quelato de ferro = ( FeCl33 EDTA ) * PA 100,0 mg *    dissolver e completar até 1 000 ml com água   ( 1.6.1.1 . ) * *    Esterilização da solução-mãe de   oligoelementos a 120 ° C , sob 2 atmosferas ,   durante 20 minutos ; * *    f ) Solução de vitaminas * *    Biotina : * PA 0,2 mg *    Ácido nicotínico : * PA 2,0 mg *    Tiamina : * PA 1,0 mg *    Ácido p-aminobenzóico : * PA 1,0 mg *    Ácido pantoténico : * PA 1,0 mg *    Piridoxamina : * PA 5,0 mg *    Cianocobalamina : * PA 2,0 mg *    Ácido fólico : * PA 5,0 mg *    dissolver e completar até 100 ml com água   ( ponto 1.6.1.1 . ) . * *    A solução é filtrada por membrana estéril   com 0,2 µm . Em vez da solução 1.6.1.2 . ( f ) ,   pode-se utilizar 15 mg de extracto de levedura dissolvido   em 100 ml de água ( ponto 1.6.1.1 . ) .    1.6.1.3 . Substâncias de referência    Anilina ( destilado de fresco ) , acetato de sódio ,   benzoato de sódio .    1.6.1.4 . Solução de cloreto mercúrico    1 % de HgCl2 em água ( ponto 1.6.1.1 . ) .    1.6.2 . Aparelhagem    1.6.2.1 . Agitador podendo receber frascos Erlenmeyer   de 2 litros , com regulação automática de temperatura   ou colocado num recinto a 20-25 ° C .    1.6.2.2 . Frascos Erlenmeyer de 2 litros com colo   estreito . Antes da utilização , estes devem   ser cuidadosamente limpos com ácido clorídrico em   solução alcoólica , enxaguados e secos para   eliminação de todos os resíduos provenientes de   ensaios anteriores . Mesmo se forem novos , devem ser   limpos da mesma forma para suprimir qualquer risco   de contaminação .    1.6.2.3 . Dispositivo de filtração por membrana .    1.6.2.4 . Membranas filtrantes de 0,2 µm .    1.6.2.5 . Analisador de carbono .    1.6.3 . Preparação do inóculo    Qualquer uma das quatro partes seguintes pode ser   utilizada como inóculo desde que a sua validade seja   verificada por meio de uma substância de referência   ( ponto 1.6.1.3 ) .    1.6.3.1 . Inóculo à base de efluente secundário    É conveniente a escolha de um efluente secundário   de boa qualidade , proveniente de uma estação que   trate em particular águas domésticas . Este efluente   deve ser mantido em condições aeróbicas no período   entre a colheita e a utilização , e é filtrado   por filtro grosseiro , eliminando os primeiros 200 ml .   O filtrado , convenientemente arejado , deve ser   utilizado no próprio dia .    1.6.3.2 . Inóculo à base de terra    100 g de terra ( fértil , não estéril ) são   postos em suspensão em 1000 ml de água potavel   isenta de cloro ( as terras com forte teor em argila ,   areia ou carbono orgânico não podem ser utilizadas ) .   Após agitação , deixar respousar a suspensão   durante 30 minutos .    A camada sobrenadante é então filtrada por papel   de filtro grosseiro , rejeitando-se os primeiros 200 ml .   O filtrado é arejado imediatamente e o arejamento é   mantido até à sua utilização ; o inóculo   deve ser utilizado no dia da recolha .    1.6.3.3 . Inóculo à base de água de superfície    Uma amostra de água de superfície é filtrada   por papel de filtro grosseiro , rejeitando-se os   primeiros 200 ml . O filtrado , convenientemente arejado   até à sua utilização , é utilizado no proprio   dia da recolha .    1.6.3.4 . Inóculo misto    Misturam-se cuidadosamente volumes iguais dos 3 tipos   de inóculos definidos anteriormente , de forma a obter   o inóculo final .    A validade do inóculo é verificada por meio de   uma substância de referência ( 1.6.1.3 ) .    1.6.4 . Técnica    As substâncias de ensaio assim como a substância   de referência ( ponto 1.6.1.3 . ) são submetidas   respectivamente a ensaios em duplicado e a um ensaio em   branco . Os ensaios em branco são realizados com   inoculação , mas sem adição da substância   de ensaio ou de referência .    Prepara-se uma solução-mãe da solução de   ensaio em água ( ponto 1.6.1.1 . ) . Junta-se a   solução nutritiva ( ponto 1.6.1.2 . ) a quantidade   desta solução-mãe que permite obter uma   concentração de 5 a 40 mg de COD/l . A substância   de referência ( ponto 1.6.1.3 . ) deve ser submetida   ao ensaio na concentração inicial correspondente   a 20 mg COD/l .    Em cada um dos dois recipientes ( ponto 1.6.2.2 . ) ,   deitam-se 900 ml do meio nutritivo assim preparado e   inocula-se com 0,5 ml do inóculo ( ponto 1.6.3 . ) .   Tapam-se os recipientes com uma folha de alumínio   ( por exemplo ) evitando assim perturbar as trocas   gasosas entre o recipiente e a atmosfera ambiente ( não   se pode utilizar algodão por causa da análise   do COD ) . Dispõem-se em seguida os recipientes num   agitador mantido a uma temperatura constante de   20 a 25 ° C durante o ensaio e ao abrigo da luz .   O ar ambiente deve estar isento de poluentes e de   substâncias tóxicas ( solventes clorados , etc. ) .    Durante o ensaio de biodegração , as concentrações   em COD são objecto de uma dupla determinação no   primeiro dia e nos 27 º e 28 º dias . Devem ser   efectuadas três análises suplementares pelo   menos ( nas proximidades do 7 º , 14 º e 21 º dias ) ,   para se seguir a evolução da degradação .    Por cada determinação , retirar somente o volume   estritamente necessário . A centrifugação ou a   filtração por membrana , que precedem a determinação   do carbono , exigem volumes diferentes , segundo os   equipamentos . As perdas devido à evaporação do   meio de cultura devem ser corrigidas por adição   da quantidade de água necessária ( ponto 1.6.1.1 . ) .    Antes de cada colheita , o meio deve ser cuidadosamente   agitado e as substâncias aderentes às paredes do   recipiente devem ser dissolvidas ou postas em   suspensão . As amostras filtradas ou centrifugadas devem   ser analisadas no próprio dia ; caso contrário , é   necessário juntar-lhes 0,05 ml de solução de   HgCl2 ( ponto 1.6.1.4 . ) por cada 10 ml do meio ou   então conservá-las entre 2 e 4 ° C até 24 h ,   ou abaixo de - 18 ° C para períodos mais longos .    Se se observa um patamar antes do 28 º dia , pode   considerar-se o ensaio terminado . Se a degradação   começar nitidamente antes do 28 º dia sem atingir   um patamar é aconselhável prolongar o ensaio por   1 ou 2 semanas .    Todas estas operações exigem muitos cuidados , e os   recipientes , pipetas , etc. , devem estar limpos ( mas   não estéreis ) .    1.6.5 . Determinação do COD    São convenientes as membranas filtrantes se se   provar que não libertam carbono e que não absorvem a   substância de ensaio durante a filtração .    Se as amostras são centrifugadas , deve efectuar-se   esta operação a 40.000 ms-2 ( cerca de 4.000 g , por   15 minutos ) de preferência numa centrifugadora   refrigerada , em qualquer caso a menos de 40 ° C .    Nota    Parece não ser satisfatória a diferenciação   COT : COD por centrifugação em concentrações muito   fracas , quer porque não são eliminadas todas as   bactérias , quer porque o carbono que faz parte   integrante do plasma bacteriano é redissolvido . Em   concentrações mais altas ( * 10 mg/l ) , o erro de   centrifugação parece comparativamente fraco para uma   inoculação idêntica .    A amostra colhida ( cerca de 30 ml ) é imediatamente   centrifugada ou filtrada por membrana por meio dum   dispositivo de filtração ( ponto 1.6.2.3 . ) ,   utilizando membranas filtrantes tratadas como indicado   no ponto 1.6.2.4 . São desprezados os primeiros 20 ml .    A concentração em COD do filtrado restante ( cerca   de 10 ml ) é determinada duas vezes , com o analisador   de carbono ( ponto 1.6.2.5 . ) . Se o filtrado não   puder ser analisado no próprio dia , deve ser então   conservado como indicado no ponto 1.6.4 .    2 . AVALIAÇÃO DOS DADOS    Os resultados das determinações são transcritos   seguindo o modelo junto ( apêndice 1 ) e os valores   da biodegradação são calculados de acordo com 1.2 .    As concentrações em COD são arredondadas ao   décimo de miligrama por litro mais próximo e os   valores médios do D t à percentagem mais próximas .    O desenrolar do ensaio de degradação é   representado graficamente num diagrama , como é   indicado no modelo junto ( apêndice 2 ) .    Os resultados do ensaio de degradação são   válidos , se na mesma série de ensaios a substância   de referência mostrar uma percentagem de   eliminação em COD * 70 % em 10 dias , a contar do   dia em que a taxa de biodegradação observada   ultrapassar pela primeira vez 10 % . Este resultado deve   ser obtido num prazo de 28 dias , ou seja a duração   do ensaio , caso contrário toda a série é   eliminada .    3 . APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio conterá , se possível :     - os dados fornecidos ( apêndice 1 ) ,     - o desenrolar do ensaio de degradação é   representado num diagrama que indica a fase de   latência , a fase de degradação , o declive da curva ,   o intervalo de tempo ( o « intervalo de tempo »   significa aqui um período de 10 dias iniciado no dia   em que o nível de biodegradação observado excede pela   primeira vez 10 % ) ,     - as provas de validade do ensaio ( diminuição em   COD da substância de referência * a 70 % em 10   dias , a contar do dia em que a degradação excede 10 % ,   devendo este resultado ser obtido no prazo de 28 dias ,   ou seja , a duração do ensaio ) .    3.2 . Interpretação dos resultados    Sendo este teste muito rigoroso , um resultado pouco   elevado não significa necessariamente que a substância   submetida ao ensaio não é biodegradável nas   condições ambientais , mas que serão necessários   trabalhos complementares para estabelecer este facto .    As substâncias submetidas a ensaio para as quais foi   obtida uma taxa de biodegradação elevada durante   este ensaio serão consideradas como facilmente   biodegradáveis , caso esta taxa seja atingida em 10 dias   a contar do dia em que execeda pela primeira vez 10 % .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS     ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 301E .   Decision of the Council C(81) 30 Final .     ( 2 ) Gerike , P. , Fischer , W. K. , A correlation   study of biodegradability determinations with various   chemicals in various tests , Ecotoxicology and   Environmental Safety , Vol. 3 , No 2 , 1979 , p. 159-173 .     ( 3 ) Gerike , P. , Fischer , W. K. , A correlation study   of biodegradability determinations with various chemicals in   various tests II . Additional results and conclusions ,   Ecotoxicology and Environmental Safety , Vol. 5 , No 1 ,   1981 , p. 45-55    Apéndice 1    Degradação biótica : teste de screening OCDE alterado    Organismo responsável pelo ensaio : ...    Substância de ensaio : ...    Experiância n º : ...    Dados relativos ao ensaio    Concentração teórica : ... mg/l COD    Determinações do carbono     * Frasco n º * * Concentração de COD após ×   dias ( mg/l ) *     * * * 0 ( C0 ) * * * * * * * *    Ensaio : Solução nutritiva mineral com   substância a ensaiar e com inoculação * 1 * a1 * * *   * * * * * *     * * a2 * * * * * * * * *     * * C at = ( a1 + a2 ) /2 * * * * * * * * *     * 2 * b1 * * * * * * * * *     * * b2 * * * * * * * * *     * * C bt = ( b1 + b2 ) /2 * * * * * * * * *    Testemunha : Solução nutritiva mineral sem substância   a ensaiar mas com inoculação * 3 * bl1 * * * * * * * * *     * * bl2 * * * * * * * * *     * * C bl(t) = ( bl1 + bl2 ) /2 * * * * * * * * *    Avaliação dos dados brutos    Franco n º * Calculos dos resultados * % de   perda de COD após × dias *     * * 0 * * * * * * *     1 * D1 = [ 1 - ( C at - C bl(t) ) /   ( C0 - C bl(0) ) ] × 100 * 0 * * * * * * * *    2 * D2 = [ 1 - ( C bt - C bl(t) ) /   ( C0 - C bl(0) ) × 100 * 0 * * * * * * * *    Média (*) * D t = ( D1 + D2 ) /2 * 0 * * * * * * * *    (*) Não será estabelecida uma média entre D1 e   D2 em caso de desvio importante .    Degradação biótica : teste de screening OCDE   alterado ( Boletim )    Organismo responsável pelo ensaio : ...    Director do estudo : ...    Data do início do ensaio : ... Experiência n º ...    Substância do ensaio : ...    Estrutura química : ...    Solução-mãe :     * mg/l * mg/l COT (*) * mg/l COD (**) *    Concentração da substância a testar * * * *    (*) Um desvio entre os valores COD et COT indica uma   solubilidade insuficiente da substância a ensaiar .    (**) Todos os valores COD são determinados após   filtração por membrana ou centrifugação .    Analisador de carbono : ...    Inóculo : ...    Resultado do teste :    D T = ... % de perda de COD após ... dias .    Validação do resultado : ...    Substância de referência : ...    Resultado : ... % da perda de COD após ... dias .    Experiência de referência n º ...    Notas :    ... ( Data )    ... ( Assinatura )    Apêndice 2    Teste de screening OCDE alterado : v. JO    Teste de screening OCDE alterado : v. JO    C.4 . DEGRADAÇÃO    DEGRADAÇÃO BIÓTICA : ENSAIO AFNOR NF T 90/302   ALTERADO    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    O objectivo do método é a medição da   biodegrabilidade de compostos orgânicos não   voláteis e solúveis na água , em meio aquoso   aeróbico e com uma concentração de ensaio inicial   correspondente a 40 mg de carbono orgânico dissolvido   ( COD ) por litro . Se os limites de sensibilidade dos   analisadores de carbono orgânico forem melhorados ,   pode ser vantajoso , nomeadamente para os compostos   tóxicos , utilizar concentrações mais baixas .    Deve ser conhecido o teor em carbono orgânico da   substância de ensaio .    O método só é aplicável às substâncias   orgânicas , na concentração utilizada no ensaio   ( 40 mg COD/l ) :     - são solúveis na água ,     - têm uma pressão de vapor que pode ser desprezada ,     - não têm efeitos inibidores face às bactérias ,     - não são objecto de absorção importante nas   superfícies de vidro .    É útil conhecer as proporções relativas dos   principais elementos constitutivos da substância de   ensaio , para interpretar os resultados obtidos ,   nomeadamente se estes forem pouco elevados .    As informações sobre o toxicidade da substância   química face aos microrganismos podem ser vitais para   a interpretação de resultados pouco elevados .    1.2 . Definição e unidades    A degradação é expressa como a percentagem do   desaparecimento do COD , em relação ao seu valor   inicial :    D t = [ 1 - ( C t - C bl(t) ) / ( C0 - C bl(0) ) ] ×   100    em que ,    D t = degradação em percentagem do desaparecimento   de COD , no tempo T    C o = concentração inicial em COD do meio de   cultura ( mg COD/l )    C t = concentração em COD do meio de cultura no   tempo T ( mg COD/l ).    C bl(o) = concentração inicial em COD da testemunha   ( mg COD/l )    C bl(t) = concentração em COD da testemunha , no   tempo t ( mg COD/l )    1.3 . Substâncias de referência    É conveniente verificar o inóculo com a ajuda de   substâncias químicas de referência adequadas .    Para este fim pode utilizar-se a anilina , o acetato   de sódio ou o benzoato de sódio ( por exemplo ) ,   que devem apresentar uma eliminação do teor em COD   igual ou superior a 70 % em 28 dias ; caso tal não se   verifique , o ensaio é considerado nulo e deve ser   recomeçado , usando um inóculo proveniente de outra   origem .    Neste método de ensaio específico , é utilizada a   glucose , nomeadamente para o ensaio de inibição e   para avaliar a actividade do inóculo , o que pode   também ser feito com a anilina , o acetato de sódio e   o benzoato de sódio .    1.4 . Princípio do método de ensaio    As substâncias orgânicas dissolvidas na água são   biodegradadas pelos microrganismos químico-organotropos ,   que as utilizam como únicas fontes de carbono e de   energia . Estas substâncias são estudadas a uma   concentração tal que o teor inicial em carbono   orgânico seja igual a 40 mg/l . O carbono orgânico   restante em solução é medido pelo menos após 3 ,   7 , 14 e 28 dias . Simultaneamente , são estudados os   efeitos eventuais da substância de ensaio face ao   inóculo . O processo é controlado por meio de uma   substância de referência .    1.5 . Critérios de qualidade    A reprodutibilidade deste método foi estabelecida   aquando de ensaios de intercomparação dos métodos   CEE e OCDE .    A concentração mais baixa da substância de ensaio   para a qual o método é aplicável , depende em larga   medida do limite de sensibilidade da dosagem do carbono   orgânico que é , actualmente de 0,5 mg de C por litro   e da concentração de carbono orgânico dissolvido   na solução nutritiva .    1.6 . Descrição do método de ensaio    1.6.1 . Reagentes    Os produtos químicos devem ter uma pureza analítica   reconhecida .    1.6.1.1 . Água destilada   A água destilada não deve conter mais de   10 % do carbono orgânico introduzido pela substância   de ensaio .    1.6.1.2 . Solução nutritiva    Preparar o meio para o teste , como se indica a seguir   e utilizando material estéril . Para 1 l de solução ,   dissolver na água destilada , o seguinte ( PA = pureza   analítica ) :    (NH)2 SO4 ( sulfato de amónio ) : * PA 0,300 g *    NH4 NO3 ( nitrato de amónio ) : * PA 0,150 g *    KH2 PO4 ( diidrogenofosfato de potássio ) : * PA   0,300 g *    Na2 HPO4.12H2O ( monoidrogenofosfato de sódio ,   dodecaidratado ) : * PA 2,000 g *    MgSO4.7H2O ( sulfato de magnésio , heptaidratado ) : *   PA 0,050 g *    CaCl2.2H2O ( cloreto de cálcio , diidratado ) : *   PA 0,050 g *    Extracto de levedura : * PA 0,005 g *    O pH é de 7,5 ± 0,1 . * *    Adicionar 1 ml da solução de oligoelementos com a   composição seguinte : * *    FeSO4.7H2O [ sulfato de ferro(II) ,   heptaidratado ] : * PA 0,100 g *    MnSO4.H2O [ sulfato de magnanésio ( II ) ,   monoidratado ] : * PA 0,100 g *    K2MoO4 ( molibdato de potássio ) : * PA 0,025 g *    Na2B4O7.10H2O ( tetraborato de sódio ,   decaidratado ) : * PA 0,025 g *    CuCl2.2H2O [ cloreto de cobre ( II ) ,   diidratado ] : * PA 0,025 g *    Co(NO3)2.6H2O [ nitrato de cobalto ( II ) ,   hexaidratado ] : * PA 0,025 g *    ZnCl2 ( cloreto de zinco ) : * PA 0,025 g *    NH4VO3 ( vanadato de amónio ) : * PA 0,010 g *    Água destilada : 100 ml .     ( Esta solução de oligoelementos pode ser   conservada durante um mês a uma temperatura   compreendida entre + 1 e + 4 ° C . )    Perfazer o volume ( 1 1 ) e homogenizar . O meio deve   ser utilizado no prazo de 12 h .    1.6.1.3 . Substâncias de referência    Anilina ( recentemente destilada ) , acetato de sódio ,   benzoato de sódio e glucose .    1.6.2 . Aparelhagem    Material corrente de laboratório e :     - aparelho para medida do carbono orgânico ,     - espectrofotómetro ,     - centrifugadora ( 4.000 g ) ,     - dispositivo de agitação que permita arejamento   e agitação ,     - equipamento para medir o oxigénio dissolvido e o   pH , frascos cónicos de 500 ml de boca larga ,   estéreis , equipamento para filtração estéril ,   ( membrana com porosidade de 0,22 µm ) .    O material de vidro deve ser cuidadosamente lavado e   estar totalmente isento de vestígios de matérias   orgânicas ou tóxicas .    1.6.3 . Preparação do inóculo   Retirar um volume suficiente de uma mistura de três   amostras de águas de superfície poluídas e de   efluentes de saída de estações de depuração   urbanas , isentas de poluição específica importante .   O teor em bactérias de cada amostra deve ser de pelo   menos 10 5 bactérias/ml .    As amostras devem ser utilizadas para inoculações   num prazo de 12 h , incluindo o transporte , e não   devem ficar mais de 6 horas sem arejamento .    Filtrar sobre papel , para eliminar as partículas   insolúveis mais grossas , recolher o filtrado e   passá-lo por membrana com porosidade de   0,22 micrómetros .    Lavar com uma solução isotónica adequada .   Transferir as bactérias que ficaram depositadas na   membrana para um pequeno volume de qualquer solução   isotónica . Misturar bem . Medir a absorção a   620 nm e daí deduzir a concentração das bactérias   por referência a uma curva-padrão , estabelecida   previamente por contagem em meio sólido , utilizando a   estirpe Pseudomonas fluorescens ATCC 15433 . Juntar o   volume de solução necessária para estabelecer de   novo uma concentração em bactérias de ( 5 ± 3 )   × 10 7/ml . Utilizar o inóculo na hora seguinte .    1.6.4 . Ensaio    A incubação deve ser efectuada na ausência de   qualquer luz intensa , numa incubadora mantida a uma   temperatura de 20 a 25 ° C e isenta de vapores   tóxicos .    Preparar as soluções seguintes :    1 . Solução da substância de ensaio no meio de   prova de forma a obter uma concentração em carbono   orgânico de 40 mg/l .    2 . Solução de glucose no meio de prova de forma a   obter uma concentração em carbono orgânico de   40 mg/l .    3 . Solução contendo no meio de prova as   concentrações em substância de ensaio e em glucose ,   utilizadas .    4 . Dispor igualmente dum volume suficiente do meio de   prova .    Misturar separadamente as quatro soluções e   esterilizar por filtração por membrana .    As membranas filtrantes são adequadas se não   libertarem carbono nem absorverem a substância durante   a filtração .    Todas as manipulações necessárias devem ser   efectuadas em condições estéreis . Repartir as   soluções pelos frascos de ensaio ( previamente   esterilizados ) , de acordo com o seguinte esquema :    Frasco n º 1 ( ensaio ) : * 150 ml de solução 1 *    Frasco n º 2 ( ensaio ) : * 150 ml de solução 1 *    Frasco n º 3 ( ensaio ) : * 150 ml de solução 1 *    Frasco n º 4 ( testemunha-estéril ) : * 150 ml de   solução 1 *    Frasco n º 5 ( testemunha de glucose ) : * 150 ml de   solução 2 *    Frasco n º 6 ( testemunha de acção inibidora ) : *   150 ml de solução 3 *    Frasco n º 7 ( em branco ) * 150 ml de   solução 4 . *    Inocular os frascos 1 , 2 , 3 , 5 , 6 e 7 com 1,5 ml de   inóculo e misturar bem , por agitação manual .    Colher 3 a 5 ml de cada frasco .    Centrifugar as colheitas a 4 000 g durante 15 minutos ,   mantendo uma temperatura inferior a 26 ° C .    Recolher os sobrenadantes para as dosagens de carbono   orgânico correspondentes ao tempo zero .    Colocar os frascos no agitador , deixando-os aí   durante todo o ensaio : ao 3 º dia , a concentração   em oxigénio dissolvido deve ser pelo menos igual a   5 mg/l no frasco n º 5 .    Do mesmo modo que para as dosagens de carbono orgânico   no tempo zero , efectuar as mesmas dosagens para os   frascos 1 , 2 , 3 , 5 , 6 e 7 após um período mínimo   de 3 , 7 , 14 e 28 dias de incubação . No entanto ,   se o abaixamento do teor em carbono atingir 95 % do teor   inicial nos frascos 1 , 2 e 3 , considerar o ensaio   terminado .    O ensaio pode ser terminado antes do 28 º dia , se se   atingir um patamar antes desta data .    Se se manifesta uma degradação no 28 º dia , sem   no entanto atingir o patamar , então é conveniente   prolongar o ensaio por mais 1 ou 2 semanas .    No final do ensaio , fazer uma dosagem do carbono   orgânico no frasco n º 4 , da mesma forma que no   tempo zero e testar a esterilidade , por inoculação   num tubo com um meio de cultura líquido e incubando-o   a 25 ° C durante 5 dias .    Meio de cultura :     - extracto de levedura desidratada : * 3 g *     - peptona pancreática de caseína : * 6 g *     - água : * 1 000 ml . *    Dissolver os componentes do meio de cultura completamente   desidratado em água fervente . Se necessário , ajustar   o pH de modo a atingir , após esterilização ,   7,2 ± 0,2 a 20 ° C .    Quando as dosagens do carbono orgânico são diferidas   no tempo , conservar os sobrenadantes a 4 ° C , na   obscuridade , em frascos de vidro hermeticamente   fechados ; a duração máxima de conservação   aceitável é de 24 h . Quando a análise não pode   ser efectuada no espaço de 24 h , então congelar a   uma temperatura inferior a - 18 ° C .    Para compensar as perdas de água devidas à   evaporação , verificar antes de cada colheita de   amostra , o volume do meio no frasco e adicionar , se   necessário , água destilada esterilizada por   filtração em membrana com porosidade de   0,22 micrómetros , para levar o volume ao seu valor   medido após a colheita anterior .    2 . AVALIAÇÃO DOS DADOS    Os resultados das análises são transcritos segundo   o modelo junto ( apêndice 1 ) e os valores da   biodegradação são calculados de acordo com 1.2 .    Os resultados do ensaio de biodegradação são   válidos , quando são preenchidas as seguintes   condições :     - a taxa de degradação da glucose no frasco   n º 5 deve ser inferior a 80 % no 7 º dia ,     - no final do ensaio , o frasco n º 4 deve permanecer   estéril ,     - a concentração em oxigénio dissolvido no   3 º dia no frasco n º 5 deve ser de pelo menos 5 mg/l .    No 7 º dia a taxa de biodegradação da glucose no   frasco n º 6 deve ser no mínimo igual a 75 % do   valor observado no frasco n º 5 . Se este limite não   for atingido , pode supor-se que a substância submetida   a ensaio apresenta um efeito inibidor face às   bactérias presentes e que portanto o método não   lhe é aplicável na concentração fixada .    Notas    A comparação das percentagens de eliminação do   carbono nos frascos 1 , 2 e 3 por um lado , e no frasco   n º 4 , por outro , permite diferenciar as causas da   degradação observada :     - fenómenos físico-químicos no frasco n º 4 ,     - fenómenos físico-químicos e biológicos nos   frascos 1 , 2 e 3 .    3 . APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio conterá , se possível , uma   transcrição de todos os resultados das experiências   realizadas com a substância de ensaio , com a   substância de referência e nos ensaios em branco .    Mencionará nomeadamente os seguintes pontos :     - taxa de desaparecimento do produto no frasco n º 4 ,   no final do ensaio ,     - fenómenos de inibição eventualmente observados ,     - provas da validade do ensaio ,     - o desenrolar do ensaio de degradação é   representado num diagrama que indica a fase de latência ,   a fase de degradação , o declive da curva e o   intervalo de tempo ( o « intervalo de tempo »   significa aqui um periodo de 10 dias com início no dia   em que o nível de biodegradabilidade observado exceder   pela primeira vez 10 % ) .    3.2 . Interpretação dos resultados    Devido ao carácter rigoroso deste ensaio , um resultado   pouco elevado não significa necessariamente que a   substância submetida ao ensaio não seja   biodegradável nas condições ambientais ; indica   simplesmente que serão necessários outros estudos   para o provar . As substâncias químicas de ensaio   para as quais se obtém uma perda importante de COD   durante este ensaio , devem ser consideradas como   facilmente biodegradáveis , quando esta perda seja   atingida em 10 dias a contar do dia em que o nível de   biodegradação observado exceder pela 1 ª vez 10 % .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    (1) OECD , Paris , 1981 , Test guideline 301A .   Decision of the Council C(81) 30 , Final .    (2) Gerike , P. , Fischer , W.K. , A correlation   study of biodegradability determinations with various   chemicals in various tests , Ecotoxicology and   Environmental Safety , Vol. 3 , N º 2 , 1979 , p.   159-173 .    (3) Gerike , P. , Fischer W.K. , A correlation study   of biodegradability determinations with various chemicals   in various tests , II . Additional results and   conclusions , Ecotoxicology and Environmental Safety ,   Vol. 5 , N º 1 , 1981 , p. 45-55 .    (4) AFNOR : Method for the evaluation in aqueous medium   of the biodegradability of so-called « total » of   organic products . T 90-302 .    Apêndice 1    Ensaio AFNOR alterado NF T 90/302 ( Boletim )    Experiência n º : ...    Data do início do ensaio : ...    Substância de ensaio de referência : ...    Conclusão teórica do ensaio : ...    Doseamento do carbono : ...    Doseamento do carbono    Meio de cultura * Frasco n º * Concentração   de COD após x dias en mg/l *     * * t = 0 * 3 * 7 * 14 * 28 dias *    Ensaio * 1 * 1C0  1C3 * 1C7 * 1C14 * 1C28 *    Ensaio * 2 * 2C0 * 2C3 * 2C7 * 2C14 * 2C28 *    Ensaio * 3 * 3C0 * 3C3 * 3C7 * 3C14 * 3C28 *    Média * 1 - 3 * C0 * C3 * C7 * C14 * C28 *    Testemunha estéril * 4 * 4C0 * * * * 4C28 *    Testemunha glucose * 5 * 5C0 * 5C3 * 5C7 * 5C14 * 5C28 *    Testemunha inibidora * 6 * 6C0 * 6C3 * 6C7 * 6C14 * 6C28 *    Testemunha inóculo * 7 * C bl(0) * C bl(3) * C bl(7) *   C bl(14) * C bl(28) *    Cálculo     * t = 0 * 3 * 7 * 24 * 28 dias *    Ensaio [ 1 - ( C t - C bl(t) ) / ( C0 - C bl(0) ) ]   × 100 * 0 * * * * *    Testemunha glucose [ 1 - ( 5C t - C bl(t) ) /   ( 5C0 - C bl(0) ) ] × 100 * 0 * * * * *    Testemunha inibidora [ 1 - ( 6C t - C bl(t) ) /   ( 6C0 - C bl(0) ) ] × 100 * 0 * * * * *    Validade :     - oxigénio dissolvido , frasco n º 5 ,   terceiro dia : ... mg/l ;     - percentagem de biodegradação , frasco   n º 5 , sétimo dia : ... % ;     - percentagem de biodegradação , frasco   n º 6 , sétimo dia : ... % ;     - esterilidade , frasco n º 4 : ...    Apêndice 2    Ensaio AFNOR NF T 90/302 alterado : v. JO    Ensaio AFNOR NF T 90/302 alterado : v. JO    C.5 . DEGRADAÇÃO BIÓTICA : ENSAIO STURM   ALTERADO    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    O objectivo do método é a medição da   biodegradabilidade de substâncias orgânicas   não voláteis em meio aquoso , aeróbico , para   duas concentrações iniciais de 10 e 20 mg/l   ( concentrações base ) .    O teor em carbono orgânico do produto a examinar   deve ser conhecido ( análise do teor em carbono   orgânico total ou sua estimativa através da   fórmula empírica que permita o cálculo da   produção teórica de CO2 ) .    O método só é aplicável às substâncias   orgânicas que , para a concentração utilizada   no ensaio :     - têm uma pressão de vapor que se pode   desprezar .     - não exercem acção inibidora face às   bactérias .    O método pode , pelo menos em princípio , ser   aplicado às substâncias pouco solúveis   nas concentrações do ensaio .    As informações sobre as proporções relativas   dos principais componentes do material a ensaiar   serão úteis para a interpretação dos   resultados obtidos , em particular quando esses   resultados são baixos .    As informações relativas à toxicidade da   substância química face aos microrganismos   podem ser úteis para a interpretação dos   resultados baixos e para a escolha das concentrações   adequadas .    1.2 . Definição e unidades    A degradação é definida a partir da quantidade   de CO2 produzido pela substância , expressa em   percentagem do valor teórico de CO2 que ela deve   ter produzido ( « ThCO2 » ) , valor calculado   com base no teor em carbono orgânico da substância   a examinar .    1.3 . Substâncias de referência    Recomenda-se a utilização de uma substância   de referência adequada para verificação da   actividade do inóculo . Com esta finalidade pode   utilizar-se , por exemplo , a anilina , o acetato de   sódio ou o benzoato de sódio , que devem   apresentar uma produção de CO2 * 60 % nos   28 dias , caso contrário , o resultado não   deve ser considerado válido e o ensaio deve   ser repetido com um inóculo proveniente de uma   origem diferente .    1.4 . Principio do método de ensaio    A substância de ensaio é adicionada a um meio   líquido definido e inoculado com microrganismos   contidos na água dos esgotos e arejada a 20-25 ° C .   A temperatura é registada durante o período de   ensaio .    O CO2 libertado é captado sob a forma de   BaCO3 e a degradação é seguida pela   análise do CO2 durante um período de 28 días .   Tendo em conta os resultados dos ensaios testemunhas ,   a quantidade total de CO2 produzido pela substância   de ensaio é determinada para o período do ensaio   e expressa em percentagem em relação ao CO2   total que a substância examinada teria produzido   teoricamente , de acordo com o seu teor em carbono .    O processo é controlado por meio dum inóculo   testemunha ( ponto 1.6.1.3 . ) .    1.5 . Critérios de qualidade    A reprodutibilidade do método foi estabelecida   aquando de um ensaio de intercomparação da CEE   e da OCDE .    A produção endógena de CO2 por inóculo ,   medida num frasco testemunha , constitui a razão   principal pela qual a substância de ensaio a   utilizar não deve ter uma concentração inferior   a 5 mg/l . ( Quando o ensaio é adaptado para a   utilização de substâncias de referência   marcadas com 14C então a concentração pode   ser claramente mais baixa ) .    1.6 . Descrição do método de ensaio    1.6.1 . Reagentes    1.6.1.1 . Água de « alta qualidade »    Água bidestilada , isenta de substâncias   tóxicas ( em particular de cobre ) , de fraco teor   em carbono ( < 2,0 mg/1 COT ) e com uma resistividade *   18 megahoms/centímetro . A âgua destilada   não deve conter mais de 10 % de carbono orgânico   proveniente da substância de ensaio .    1.6.1.2 . Solução nutritiva    a ) Solução-mãe    FeCl3.6H2O [ cloreto de ferro ( III ) ,   hexaidratado ] : * 0,25 g *    dissolver em 1000 ml de água ( ponto 1.6.1.1 ) . * *    MgSO47H2O ( sulfato de magnésio , heptaidratado ) : *   22,50 g *    dissolver em 1000 ml de âgua ( ponto 1.6.1.1 ) . * *    CaCl2 ( cloreto de cálcio ) : * 27,50 g *    KH2PO4 ( diidrogenofosfato de potássio ) : * 8,50 g *    dissolver em 1000 ml de água ( 1.6.1.1 ) . * *    K2HPO4 ( monoidrogenofosfato de potássio ) : *   21,75 g *    Na2HPO4.2H2O ( monoidrogenofosfato de sódio ,   diidratado ) : * 33,40 g *    NH4Cl ( cloreto de amónio ) : * 1,70 g *    dissolver em 1000 ml de água ( ponto 1.6.1.1 ) . * *    (NH4)2SO4 ( sulfato de amónio ) : * 40,00 g *    dissolver em 1000 ml de água ( ponto 1.6.1.1 . ) ; * *    b ) Meio de ensaio    O meio de ensaio conterá , por litro , as quantidades   das soluções seguintes :     - 4 ml de solução de cloreto férrico ,     - 1 ml de solução de sulfato de magnésio ,     - 1 ml de solução de cloreto de cálcio ,     - 2 ml de solução de fosfato ,     - 1 ml de solução de sulfato de amónio .    O valor do pH deve ser de 7,2 ± 0,2 .    1.6.1.3 . Substâncias de referência    Anilina ( recentemente destilada ) , acetato de   sódio , benzoato de sódio .    1.6.1.4 . Hidróxido de bário 0,025 N ( 0,0125 M )    Dissolver 4 gramas de Ba (OH)2.8H2O por litro de   água de alta qualidade . Filtrar por filtro de   papel e selar a solução límpida para evitar   absorção de CO2 contido no ar . Aconselha-se   a preparação de uma quantidade de solução   superior a 5 litros para esta série de ensaios .    1.6.2 . Aparelhagem    1.6.2.1 . Aparelho de lavagem do CO2    Para uma série de 12 frascos de ensaio   ( 3 substâncias de ensaio ) são necessários :   ( O frasco de ensaio é um recipiente de vidro   escuro de capacidade de 4 a 5 litros . Nos casos   de utilização de material de vidro não escuro ,   o ensaio deve ser realizado às escuras ) .     - 4 recipientes de matéria plástica , com   capacidade de 1 litro , cheios com 700 ml de NaOH   10 N ( 10M ) ,     - 1 frasco Erlenmeyer , com capacidade de 1 litro ,   cheio com 700 ml solução Ba(OH)2 0,025 N   ( 0,0125 M ) ;     - 1 frasco Erlenmeyer de 1 litro destinado a   receber , eventualmente , o líquido excedente .    Estes recipientes são ligados em série ,   por meio de um tubo inerte , a uma fonte de ar   comprimido e o ar é injectado nas soluções   com um débito constante .    Para cada série de 4 frascos de ensaios   suplementares , juntar um frasco em plástico com   a capacidade de 1 litro , cheio com 700 ml de   NaOH 10 N ( 10 M ) .    1.6.2.2 . Aparelhagem de produção de CO2     - 4 frascos de ensaio em vidro escuro , com   uma capacidade de 4 a 5 litros , para cada   substância de ensaio .     - rolhas e tubos flexíveis , em material plástico .    1.6.2.3 . Frascos para absorver o CO2    Frascos lavadores de 100 ml , contendo hidróxido   de bário    1.6.3 . Preparação do inóculo    Os organismos a utilizar nos ensaios provém de   lamas activadas , colhidas recentemente numa estação de   depuração municipal , que funcione normalmente .   Esta estação não deve tratar efluentes   industriais , ou tratá-los sòmente em   pequena quantidade .    Desde a sua chegada ao laboratório , a lama   activada é arejada durante 4 horas . São   retirados 500 ml desta mistura e esta amostra é   homogeneizada mecanicamente durante 2 minutos .   A mistura é então deixada decantar durante   30 minutos .    Se o líquido sobrenadante contiver ainda uma   quantidade importante de particulas sólidas   após 30 minutos , pode prosseguir-se a decantação   por mais 30 a 60 minutos , ou adaptar a lama às   condições do laboratório para obter uma   melhor decantação .    Deixar decantar o líquido sobrenadante de   forma a obter um volume suficiente para assegurar um   inóculo de 1 % por frasco de ensaio , destinado à   medição do CO2 libertado . Evitar retirar   um excesso de particulas sólidas da lama , o   que poderia falsear a medição da produção   do CO2 .    É conveniente a contagem de microrganismos   no líquido sobrenadante . O inóculo deve   conter de 10 6 a 20 × 10 6 células/ml .    O inóculo deve ser utilizado no próprio dia   da sua preparação .    1.6.4 . Técnica    1.6.4.1 . Solução-mãe    Preparar uma solução-mãe da substância   de ensaio , em água de alta qualidade de modo   a obter-se uma concentração de 1000 mg/l .    As soluções-mãe são preparadas   tendo em conta o teor em carbono orgânico da   substância de ensaio . Se este teor for desconhecido ,   levar as soluções-mãe à concentração   exigida tendo em conta o peso das substâncias .   Para obter uma amostra homogénea , misturar bem   evitando a formação de espuma . No caso de   amostras sólidas , pode ser necessário fundi-las   e misturar o conteúdo dos recipientes antes de   retirar uma parte aliquota . Este aspecto da técnica   é extremamente importante , pois o cálculo da   taxa de biodegradação só será rigoroso se   o carbono orgânico adicionado ao sistema   de ensaio tiver uma quantidade correcta .    Se se situar entre 3 a 10 , o pH da solução-mãe   não deve ser corrigido , sendo o seu valor   determinado pelo tampão fosfato que entra na   composição do meio de ensaio . Se o pH se   situar fora dos limites indicados , ajustar uma   parte aliquota da solução-mãe para um   pH 7,0 ( ± 1,0 ) por meio de HCl ou NaOH 1N   ( 1 M ) , tendo o cuidado de homogeneizar cuidadosamente   a solução durante a adição de ácido ou de base .    Para confirmar a concentração nominal em carbono   orgânico da substância de ensaio , a solução-mãe   ( ou uma parte aliquota neutralizada ) , pode ser   submetida a uma análise do carbono orgânico   total . Esta análise impõe-se igualmente para   a solução-mãe da substância de referência .    Se a substância analisada não for solúvel   na água , juntar a quantidade necessária desta   substância , em peso ou em volume , directamente   no frasco do ensaio .    Se a substância a examinar não for solúvel   nas concentrações fixadas para o ensaio , podem ter   que ser tomadas medidas especiais como , por exemplo ,   a utilização de um processo de dispersão por   ultra-sons , para a obtenção de uma boa dispersão   da substância a submeter ao ensaio .    1.6.4.2 . Condições de ensaio    Devendo o inóculo ser utilizado a 1 % , é   necessário proceder a diluições a meio do   ensaio .    A forma mais cómoda de o fazer é a seguinte :    a ) Juntar 2470 ml de água de alta qualidade   ( ponto 1.6.1.1 ) a cada um dos frascos de ensaio   de 4 a 5 l ;    b ) Juntar a cada frasco de ensaio de 4 a 5 l ,   respectivamente 3 ml de solução-mãe de sulfato   de amónio , de sulfato de magnésio e de cloreto   de sódio e ainda 6 ml da solução tampão   fosfato e 12 ml de solução de cloreto férrico ;    c ) Juntar 30 ml de inóculo proveniente das   lamas activadas a cada frasco de ensaio de 4 a 5 l .    Eliminar o dióxido de carbono da mistura ,   fazendo borbulhar durante 24 h , ar isento de CO2 .    Após o período de arejamento , encher 3 frascos   absorventes com 100 ml de Ba(OH)2 0,025 N   ( 0,0125 M ) e ligá-los em série à saída   de cada frasco de ensaio .    1.6.4.3 . Realização do ensaio    Juntar primeiramente a substância de ensaio a   2 dos 4 frascos de ensaio . Cada substância é   submetida ao ensaio em 2 concentrações :   10 e 20 mg/l . Calcular a quantidade de   solução-mãe necessária por frasco , pela   fórmula seguinte :    Quantidade de solução-mãe por frasco   de ensaio , em ml : B × C/A    em que ,    B = concentração da substância de ensaio no   frasco de ensaio ( mg/l )    A = concentração da substância de ensaio   na solução-mãe ( mg/l )    C = volume final do meio do ensaio no frasco do   ensaio ( ml ) .    Juntar nos frascos de ensaio adequados uma   quantidade suficiente de solução-mãe para   obter a concentração do ensaio , seguindo a   fórmula anterior , e completar com água destilada   até obter 473 ml ( solução-mãe + H2O de   « alta qualidade » ) . Juntar no terceiro   frasco de ensaio utilizado como testemunha e que   não contém a substância de ensaio , 473 ml   de água de « alta qualidade » .    O volume final de cada frasco de ensaio é   então de 3000 ml .    Juntar ao ultimo dos 4 frascos de ensaio , uma   substância de referência a uma concentração   de 20 mg/l .    Começar o ensaio fazendo borbulhar ar isento de   CO2 na solução , a um débito de 50 a 100 ml por   minuto e por frasco de ensaio ( cerca de 1 a 2 bolhas   por segundo ) .    No caso de substâncias de ensaio não solúveis   na água , introduzidas no estado seco nos frascos   de ensaio , melhorar a homogeneização por meio de   um agitador magnético . Para os agentes que formam   espuma , o borbulhar de ar isento de CO2 pode ser   substituído por um arejamento sobre a solução e   agitação por dispositivo magnético .    O CO2 produzido em cada frasco de ensaio reage   com o hidróxido de bário e é precipitado sob   a forma de carbonato de bário ; a quantidade de   CO2 produzida é avaliada por titulação do   Ba(OH)2 residual , com HCl 0,05 N ( 0,05 M ) .   Desligar periodicamente ( todos os 2 ou 3 dias ) o   frasco lavador do CO2 mais próximo do frasco de   ensaio , para efectuar a titulação . Aproximar   os dois frascos e introduzir no final da série   um novo frasco lavador cheio com 100 ml de Ba(OH)2   0,025 N ( 0,0125 M ) recentemente preparado .    Em caso de necessidade efectuar as titulações   ( antes do aparecimento de precipitados de   BaCO3 no segundo frasco ) e aproximadamente de dois em   dois dias durante os dez primeiros dias , e depois   de cinco em cinco dias até ao 28 º dia .    No 27 º dia , medir de novo pH das soluções   contidas nos frascos de ensaio e depois juntar-lhes   1 ml de HCl concentrado por frasco para decompor   os carbonatos . Arejar os frascos durante a noite e   colher amostras de cada um deles para determinar o   carbono orgânico dissolvido . Efectuar a   titulação final no 28 º dia .    Após se terem retirado os frascos lavadores mais   próximos dos frascos de ensaio , titular   100 ml de solução de Ba(OH)2 . O Ba(OH)2   titulado com HCl a 0,05 N ( 0,05 M ) e utilizado   como indicador a fenolftaleína .    Efectuar o ensaio à temperatura ambiente   ( 20 a 25 ° C ) e registar a temperatura durante   o período de ensaio .    Se aparecer um patamar antes do 28 º dia , o ensaio   pode ser considerado como terminado .    Se a degradação tiver começado obviamente   no 28 dia , sem no entanto atingir um patamar ,   considera-se conveniente prosseguir o ensaio durante   mais uma ou duas semanas .    1.6.5 . Determinação do CO2    Podem ser considerados outros processos de medição   da libertação do CO2 , para além da titulação   de retorno do Ba(OH)2 contido nos frascos lavadores .   Tal alteração não afecta em nada o princípio   do ensaio e pode mesmo permitir uma leitura contínua   da taxa de biodegradação à medida que esta evolui .    O primeiro passo do cálculo da quantidade do   CO2 produzida deve fazer intervir um factor de   correcção tendo em conta a produção endógena   do CO2 nos frascos da substância de ensaio .   O frasco testemunha serve de « inóculo testemunha »   permitindo uma correcção tendo em conta o CO2   que é produzido pela respiração endógena   das bactérias . A quantidade de CO2 produzido pela   substância de ensaio é determinada pela diferença   ( em ml do reagente da titulação ) entre o frasco   lavador correspondente ao ensaio e o frasco   lavador correspondente à testemunha .    Quando se utiliza o HCL a 0,05 N ( 0,05 M ) para   a titulação do frasco lavador , cada ml de   HCl titulado corresponde a 1,1 mg de CO2 produzido .    2 . AVALIAÇÃO DOS DADOS    Os resultados das análises são anotados no   boletim junto a seguir ( ver apêndice 1 )   e os valores de biodegradação são calculados   de acordo com as indicações no ponto 1,2 .    As concentrações de CO2 são calculadas com   aproximação a 0,1 mg/l . Os valores de biodegradação   são arredondados para a unidade mais próxima .    O desenrolar do ensaio de degradação é   representado graficamente num diagrama como o que   se junta a título de exemplo ( ver apêndice 2 ) .    Os resultados do ensaio de degradação são   válidos se forem preenchidas as seguintes condições :     - é necessário que , numa mesma série ,   a biodegradação da substância testemunha seja   * 60 % para 28 dias ( se não for este o caso , toda   a série deve ser rejeitada e o ensaio deve ser   recomeçado com um inóculo proveniente de outra   origem ) ,     - é necessário que , durante o ensaio ,   não tenha sido produzida qualquer quantidade   significativa de CO2 nos frascos testemunhas   ( contaminação do meio , do vidro ou do ar ) .   No final do ensaio , a produção total de CO2   não deve exceder 50 mg de CO2 por 3 litros do meio .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório do ensaio conterá , se possível :     - os dados representados de acordo com o boletim   ( ver apêndice 1 ) ,   - o desenrolar do ensaio de degradação   representado num diagrama indicando a fase de   latência , a fase de degradação , o declive   da curva e o intervalo de tempo ( o « intervalo   de tempo » significa um período de 10 dias com   início no dia em que o nível de biodegradação   observado excede , pela primeira vez , 10 % ) ,     - o processo de dispersão das substâncias   não solúveis nas condições do ensaio ,     - a data e o local da recolha dos organismos   utilizados para o ensaio e o tratamento aplicado a esses   organismos antes da inoculação ;     - a gama de temperaturas registadas durante o   ensaio ,     - no caso de contagem de acordo com as indicações   do ponto 1.6.2 ( inoculação ) , o   número de microrganismos que formam colónias   por mililitro ,     - as provas de validade do ensaio ( * 60 %   da degradação em 28 dias nas substâncias   de referência ) .    3.2 . Interpretação dos resultados    Sendo este teste muito rigoroso , a obtenção   dum resultado baixo para a substância estudada   não implica necessariamente que a substância   não seja biodegradável nas condições   ambientes ; esse resultado indica simplesmente   serem necessários outros estudos para o comprovar .    As substâncias químicas de ensaio que apresentam   uma taxa de biodegradação elevada devem ser   consideradas como facilmente biodegradáveis ,   se esta taxa elevada for atingida nos 10 dias a contar   do dia em que a taxa de biodegradação observada   excedeu pela primeira vez 10 % .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS     ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline   301B . Decision of the Council C(81) 30 , Final .     ( 2 ) Gerike , P. , Fisher , W.K. , A correlation   study of Biodegradability determinations with   various chemicals in various tests Ecotoxicology   and Environmental Safety , Vol. 3 , No 2 ,   1979 , p. 159-173 .     ( 3 ) Gerike , P. , Fisher , W.K. , A correlation   study of Biodegradability determinations with various   chemicals in various tests II . Additional results   and conclusions , Ecotoxicology and Environmental   Safety , Vol. 5 , No 1 , 1985 , p. 45-55 .     ( 4 ) Larson , R.J. , Estimation of biodegradation   potential of xenobiotic organic chemicals , Applied   and Environmental Microbiology , Vol. 38 , 1979 ,   p. 1159-1161 .    Apêndice 1    Boletim a utilizar no ensaio Sturm alterado    Experiência n º : ...    Data do início do ensaio : ...    Substância de ensaio , de referência : ...    Concentração teórica do ensaio : ...    Análise do carbono : ...    ThCO2 teórico : ...    Variação das temperaturas durante o ensaio : ...    Produção de CO2 : ...    Dias * CO2 captado em mg * Quantidade cumulativa de   CO2 * % de CO2 teórico *    28 * * * *    Validade : ...     - substância de referência e % de   biodegradação : ...     - evolução total do CO2 nos frascos testemunha : ...    Apêndice 2    Ensaio Sturm alterado : v. JO    Ensaio Sturm alterado : v. JO    C.6 . DEGRADAÇÃO BIÓTICA : ENSAIO EM FRASCO   FECHADO    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    O objectivo deste método é a determinação   da biodegradabilidade das substâncias orgânicas em   meio aquoso , aeróbico , e a uma concentração   de 2 mg/l ( concentração-padrão ) a 10 mg/l .    No estado actual do desenvolvimento , o ensaio é   especialmente adequado para a avaliação da   biodegradabilidade dos compostos solúveis na água .   No entanto , pelo menos em princípio , nada se   opõe ao estudo de compostos voláteis ou   fracamente solúveis na água .    A fórmula empírica da substância de ensaio   deve permitir o cálculo da carência teórica   de oxigénio ( CTO ) : se este valor não   for conhecido , pode utilizar-se como valor de   referência a carência química de oxigénio   ( CQO ) da substância do ensaio ( ver apêndice 1 ) .    O método só é aplicável às substâncias   de ensaio orgânicas que , na concentração   utilizada no ensaio , não inibem as bacterias .   Se a substância não for solúvel na concentração   prevista para o ensaio , será eventualmente necessário   tomar disposições especiais tal como a dispersão   por ultra-sons , a fim de se obter uma dispersão   satisfatória .    As informações relativas às proporções   respectivas dos diferentes componentes da substância   de ensaio facilitarão a interpretação dos   resultados obtidos , nomeadamente quando estes são   baixos .    As informações relativas à toxicidade   das substâncias químicas face às bactérias   podem facilitar a interpretação dos resultados   de valores baixos assim como a escolha das   concentrações de ensaio adequadas .    Este método pode ser utilizado para a determinação   de DBO .    1.2 . Definições e unidades    A carência bioquímica de oxigénio ( CBO ) representa   a diferença do consumo de oxigénio entre uma   testemunha e uma solução de substância de   ensaio nas condições do ensaio . Após divisão   pela concentração ( P/V ) da substância a   ensaiar , o consumo do oxigénio é expresso   em mg DBO/mg de substância .    A degradação define-se como a relação entre   a carência bioquímica de oxigénio e a carência   teórica de oxigénio ( CTO ) ou a carência   química de oxigénio ( CQO ) , expressas em   percentagem .    Nota :    Por vezes , as duas formas de cálculo ( percentagem   de CTO ou percentagem de CQO ) conduzem a resultados   diferentes .     % de biodegradação ( CTO ) = mg 0 2/mg   sunstância de ensaio/CTO × 100    ou     % de biodegradação ( CQO ) = mg 0 2/mg   sunstância de ensaio/mg CQO/mg substância de ensaio   ensaio × 100    CTO = carência teórica de oxigénio   ( cálculo , ver apêndice )    CQO = carência química de oxigénio ,   determinada experimentalmente    1.3 . Substâncias de referência    Convém utilizar produtos químicos de referência   adequados para avaliar a actividade do inóculo .    A anilina , o acetato de sódio ou o benzoato   de sódio ( por exemplo ) podem ser utilizados para   este fim e devem apresentar uma degradação * 60 %   em 28 dias , sem o que o ensaio é considerado como não   válido e deve ser recomeçado com um inóculo   proveniente de outra origem .    1.4 . Princípio do método de ensaio    Dissolver num meio mineral ( solução de   elementos nutritivos minerais ) uma quantidade determinada   da substância de ensaio de modo a obter-se uma   concentração de 2 mg/l . Inocular a solução   com um número restrito de microorganismos   pertencentes a diferentes espécies e manter em   frascos fechados a uma temperatura constante   ( 20 a 21 ° C ) e ao abrigo da luz .    O processo de degradação é seguido por meio   de análises de oxigénio durante 28 dias . O   processo é controlado por meio duma substância   de referência . Efectuar-se-à um ensaio   em paralelo , sem substância de ensaio nem   substância de referência , para a determinação   do consumo testemunha em oxigénio .    Na mesma ocasião , controla-se a substância de   ensaio para verificar os efeitos de inibição   eventuais face ao inóculo .    1.5 . Critérios de qualidade    A reprodutibilidade do método foi estabelecida   aquando do ensaio de intercomparação da CEE e da   OCDE .    1.6 . Descrição do método de ensaio    1.6.1 . Reagentes    1.6.1.1 . Água destilada ou desionizada .    A água destilada ou desionizada não contém   mais de 0,01 mg Cu/l , saturada de ar . O volume   necessário às operações diárias ( por   exemplo 501 ) é mantido à temperatura ambiente ,   próxima dos 20 ° C , e é arejado vigorosamente   durante 20 minutos com a ajuda de ar comprimido .   Geralmente , a água fica pronta após permanecer   20h a 20 ° C . O teor em oxigénio é determinado ,   para controlo , e deve atingir 9,90 mg O2/l a 20 ° C .   Todas as operações de tranferência ou de   enchimento de água saturada de ar devem ser efectuados   por meio de sifão , sem libertação de bolhas .    1.6.1.2 . Solução nutritiva    a ) Soluções-mãe    KH2PO ( diidrogenofosfato de potássio ) : * 8,50 g *    K2HPO4 ( monoidrogenofosfato de potássio ) : * 21,75 g *    Na2HPO4 · 2H2O ( monoidrogenofosfato de   sódio biidratado ) : * 33,30 g *    NH4Cl ( cloreto de amónio ) : * 1,70 g *    dissolver em 1 000 ml de água destilada . * *    O pH deve ser de 7,2 . * *    Mg SO4 · 7H2O ( sulfato de magnésio ,   heptaidratado ) : * 22,50 g *    dissolver em 1 000 ml de água destilada . * *    CaCl2 ( cloreto de cálcio ) : * 27,50 g *    dissolver em 1 000 ml de água destilada . * *    FeCl3 · 6H2O ( cloreto de ferro ( III ) ,   hexaidratado ) : * 0,25 g *    dissolver em 1 000 ml de água destilada ; * *    b ) Meio de ensaio    O meio de ensaio conterá , por litro de água   ( 1.6.1.1 . ) , 1 ml de cada uma das soluções-mãe ,   mencionadas anteriormente .    O pH será igual a 7,2 ± 0,2 .    1.6.1.3 . Substâncias de referência    Anilina ( recentemente destilada ) , acetato de   sódio e benzoato de sódio .    1.6.2 . Aparelhagem    1.6.2.1 . Podem ser utilizados frascos de ensaio   calibrados , com uma capacidade entre 250 a 300 ml , com   rolha de vidro , ou frascos não calibrados de gargalo   estreito , de 250 ml , com rolha de vidro cujo volume   deve ser determinado .    1.6.2.2 . Vários frascos de 2,3 e 5 litros   graduados , para a preparação da experiência   e para o enchimento dos frascos de CBO .    1.6.2.3 . Pipetas com capacidade de 1 a 10 ml .   Ampolas de decantação e papel de filtro   grosseiro . Frascos para a preparação do   inóculo .    1.6.2.4 . Banho-maria para manter os frascos   a uma temperatura constante e ao abrigo da luz .    1.6.3 . Preparação do inóculo    Pode utilizar-se uma das quatro fontes seguintes   como inóculos e a sua validade pode ser controlada   com a ajuda duma substância de referência   ( ponto 1.6.1.3 . ) .    1.6.3.1 . Inóculo à base de terra    100 g de terra de jardim , à qual não foi   recentemente adicionado adubo ( recomenda-se   particularmente a utilização de proveniente   duma estufa mantida a uma temperatura constante   durante todo o ano ) , são postos em suspensão   em 1 l de água potável , não clorada . Após   30 minutos , a suspensão é filtrada por   papel de filtro grosseiro , sendo os dois primeiros   mililitros do filtrado desprezados . O restante   filtrado serve de inóculo ( 1 gota por litro   do volume final ) . O inóculo deve ser preparado   precisamente antes do ensaio . Deve ser arejado   em caso de conservação durante várias horas .   O número de bactérias pode ser determinado por   contagem em gelose nutritiva ou lâminas nutritivas .   Não deve conter mais de 10³ a 10 5 de bactérias/ml   de volume final .    1.6.3.2 . Inóculo proveniente de um efluente   secundário    É conveniente preparar o inóculo utilizando um   efluente secundário ( instalação de lamas   activadas ou leitos bacterianos de tratamento em   especial de águas domésticas ) . O efluente   deve ser arejado no período entre a sua colheita   e a sua utilização . Tendo e vista a   preparação do inóculo , a amostra é filtrada   por papel de filtro grosseiro . Os primeiros 200 ml   são desprezados . O resto do filtrado é   convenientemente arejado até ao momento da   sua utilização . O inóculo deve ser utilizado   no próprio dia .    1.6.3.3 . Inóculo proveniente de uma « lama   activada » de laboratório    Utiliza-se uma efluente proveniente de uma estação   experimental de lamas activadas , equipada com um   poderoso dispositivo de arejamento . A solução   de inoculação é preparada como indicado no   ponto 1.6.3.2 .    1.6.3.4 . Inóculo misto    Misturam-se convenientemente volumes iguais   das três amostras de inoculação   ( pontos 1.6.3.1 . a 1.6.3.3 ) , de modo   a obter o inóculo final .    1.6.4 . Técnica    Todas as manipulações realizadas antes da   incubação são efectuadas a uma temperatura de   cerca de 20 ° C .    Os diferentes lotes de frascos ( ponto 1.6.2.1 . )   são preparados para a determinação do CBO das   substâncias de ensaio e das substâncias de   referência , aquando de séries de experiências   simultâneas ( ver apêndice 2 ) . Se as análises   químicas forem efectuadas simultaneamente , é   necessário preparar um número suficiente de   o controlo do inóculo e da testemunha . Prepara-se-ão   o controlo do inóculo e da testemunha . Preparar-se-ão ,   por exemplo , 7 ou 15 frascos para a substância   submetida aos ensaios de 0 , 5 , 15 e 28 dias ,   após se ter preparado um volume de água suficiente   nos frascos grandes ( ponto 1.6.2.2 . ) .    Estes frascos grandes são primeiro cheios de água   destilada até 1/3 do seu volume com a ajuda de um   tubo flexível ( ponto 1.6.1.1 . ) . Em seguida   introduz-se cada uma das soluções-mãe nutritivas   ( ponto 1.6.1.2 . ) nos frascos até à obtenção   de um volume final e juntam-se as substâncias   de ensaio ou de referência até serem atingidas   as concentrações definitivas de 2 mg/l e por   vezes de 5 mg ou 10 mg/l .    A concentração aproximada de 9 mg de oxigénio   dissolvido por litro de água de diluição a   20 ° C limita a concentração inicial   possível da substância de ensaio a cerca de   2 mg/l , de forma a garantir a manutenção   de uma concentração importante em oxigénio   após a oxidação da substância .    As substâncias de degradabilidade fraca ou as   substâncias com DThO baixo podem ser ensaiadas   paralelamente a concentrações mais elevadas .    A inoculação é realizada por pipeta à   razão de uma gota/l do volume final ; procede-se   do mesmo modo para a testemunha .    Finalmente , a solução será levada ao volume   exigido por meio de um tubo flexível que toque   o fundo do frasco . Daí resultará uma mistura   suficiente da solução . Em seguida , cada   solução assim preparada será vertida imediatamente   em cada lote respectivo de frascos por meio dum   tubo flexível mergulhando até ¾ do frasco   ( não até ao fundo ) .    Além disso , os frascos destinados ao exame   do tempo zero são analisados ou submetidos a um   tratamento que assegure a sua conservação   tendo em vista as análises posteriores ( para   a determinação de O2 , precipitação por   meio do MnCl2 e de NaOH ) .    Os outros frascos preparados paralelamente são   colocados em banho-maria a 20 ° C , ao abrigo   da luz ; serão retirados do banho após 5 ,   15 e 28 dias e analisados .    Cada série é acompanhada duma série completa   de ensaios paralelos para a determinação da   testemunha , do consumo de oxigénio sem   inoculação e da substância de referência .    Controlo de inibição :    É fácil e simples controlar os efeitos   de inibição das substâncias num teste   em frasco fechado :    Série 1 : 2 mg/l dum composto facilmente   biodegradável , por exemplo um álcool gordo   condensado com óxido de etileno numa razão   molecular de 1 : 10 , ou qualquer outra substância   química de controlo .    Série 2 : x mg/l da substância de ensaio   ( x é habitualmente igual a 2 ) .    Série 3 : 2 mg/l de compostos facilmente   biodegradáveis , mais 1 × mg/l da   substância de ensaio .    Se os valores CBO da série 3 forem inferiores   à soma dos valores das séries 1 e 2 , pode considerar-se   que a substância de ensaio não tem efeitos   inibidores face às bactérias nesta concentração .   Este controlo é sempre necessário se uma   degradabilidade negativa ou fraca parecer ilógica   face à estrutura da substância a testar ,   isto é , quando certos índices permitem supor   que esta fraca degradação é provocada por   fenómenos de inibição .    1.6.5 . Determinação do oxigénio dissolvido    A dosagem do oxigénio dissolvido efectua-se   por meio de métodos químicos ou electroquímicos   normalizados reconhecidos no plano internacional   ou nacional .    2 . AVALIAÇÃO DOS DADOS    Os resultados analíticos são registados no   boletim anexo ( ver apêndice 3 ) .    A evolução da degradação é representada   graficamente num diagrama .    Os resultados do teste de degradação são   válidos se forem preenchidas as condições   seguintes :     - na mesma série de ensaios , a substância   de referência revela uma biodegradação * 60 %   para um período de 28 dias . Se tal não se   verificar , toda a série deve ser eliminada ,     - o consumo de oxigénio , sem inoculação ,   não excede 0,3 mg de oxigénio por litro após   5 dias e 0,4 mg de oxigenio por litro após 28 dias ;   a testemunha com inoculação não deve revelar   um consumo > 0,5 mg de oxigénio por litro após   5 dias e 0,6 mg de oxigénio por litro após 15 a 28 dias .    3 . RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório deve conter , se possível :     - os dados registados sob a forma prevista no   boletim ( ver apêndice 3 ) ,     - o desenrolar do ensaio de degradação   representado num diagrama indicando a fase de   latência , a fase de degradação , a inclinação   da curva e o intervalo de tempo ( o « intervalo   de tempo significa , aqui , um período de 10 dias   com início no dia em que o nível de   biodegradação observado excedeu pela primeira   vez 10 % ) ,     - o método utilizado para a determinação de DQO ,     - o método utilizado para a medição do   oxigénio ,     - a justificação e os comentários científicos   relativos a qualquer alteração do processo ou   à eliminação do teste ,     - o processo de dispersão para as substâncias   fracamente solúveis no controlo do ensaio ,     - o controlo de validade do teste .    3.2 . Interpretação dos resultados    Deve ter-se em conta a influência eventual dos   compostos azotados sobre os resultados .    Sendo o ensaio realizado em condições muito   rigorosas , um resultado baixo não significa   necessariamente que o composto testado não seja   biodegradável no meio ambiente , mas indica que será   necessário efectuar estudos suplementares para   a sua confirmação .    As substâncias químicas do ensaio , que se   caracterizam por um consumo elevado de oxigénio neste   ensaio , devem ser consideradas como facilmente   biodegradáveis , quando este nível for atingido   nos 10 dias a contar do dia em que o nível   de biodegradação observado excedeu pela primeira vez   10 % .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    (1) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 301D .   Decision of the Council C(81)30 , Final .    (2) Gerike , P. , Fisher , W.K. , A correlation   study of biodegrability determinations with various   chemicals in various tests , Ecotoxicology and   Environmental Safety , Vol. 3 , No 2 , 1979 , p. 159-173 .    (3) Gerike , P. , Fischer , W.K. , A correlation   study of biodegradability determinations with various   chemicals in various test II . Additional results   and conclusions , Ecotoxicology and Environmental   Safety , Vol. 5 , No 1 , 1981 , p. 45-55 .    Apêndice 1    Calculo da carência bioquímica teórica de   oxigénio ( CTO )    A CTO do composto C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s de   peso molecular PM é calculado pela fórmula seguinte :    CTO NH3 = 16 [ 2c + 1/2(h - cl - 3n) + 3s + 5/2p +   1/2(na - o) ] /PM    Esta fórmula implica que C é   mineralizado em CO2 , H em H2O , P em P2O5 e N a em Na2O .   O halogéneo é eliminado sob a forma de halogeneto de   hidrogénio e o azoto sob forma de amoniaco .    Exemplo :    glucose C6H12O6 , PM = 180    CTO = 16 ( 2 · 6 + 1/2 · 12 - 6 ) /180 = 1,07 mg   O2/mg glucose .    Para os cálculos dos pesos moleculares dos sais ,   excluindo os sais de metais alcalinos , supõe-se que   estes sais foram hidrolisados .    O enxofre , supõe-se oxidado no estado de + 6 .    Exemplo :    n - alquilbenzenesulfonato de sódio , C18H29SO3Na ,   PM = 348    CTO = 16 ( 36 + 29/2 + 3 + 1/2 - 3 ) /348 = 2,34 mg   O2/mg de substância .    No caso de certos compostos contendo azoto , este pode   ser igualmente eliminado sob a forma de amoníaco , de   nitrito ou nitrato segundo as diferentes carências   bioquímicas teóricas de oxigénio .    CTO NO - 2 = 16 [ 2c + 1/2(h - cl) + 3s + 3/2n + 5/2p +   1/2na - o ] /PM    CTO NO - 3 = 16 [ 2c + 1/2(h - cl) + 3s + 5/2n + 5/2p +   1/2na - o ] /PM    Supondo que uma formação total de nitrato foi   observada por análise , por exemplo , no caso de uma   amina secundária : ( C12H25)2 NH , PM = 353    CTO NO - 3 = 16 ( 48 + 51/2 + 5/2 ) /353 = 3,44 mg   O2/mg de substância .    Apêndice    Esquema da repartição dos frascos para ensaio en   frasco fechado : v. JO    Apêndice 3    Degradação biótica : ensaio em frasco fechado   ( boletim )    Laboratório : ...    Director dos estudos : ...    Data de início do ensaio : ... Experiência n º : ...    Substância de ensaio : ...    Composição química : ...    Análise ( método Winkler ou eléctrodo de   oxigénio ) : ...    CTO ou CQO da substância a ensaiar : ... mg O2/mg    Temperatura da água de diluição após   arejamento : ...    Concentração do oxigénio da água após   arejamento , e no início do ensaio : ... mg O2/l    Inóculo : ...    Resultado do ensaio    D t = ... CBO expressa em % de CTO após 28 dias    ou    D t = ... CBO expressa em % de CQO após 28 dias    Validação do resultado    Substância de referência : ...    Resultado : ... CBO expressa em % de CTO após 28 dias    Experiência de referência n º : ...    Observações : ...    Laboratório : ...    Substância de ensaio : ...    Experiência n º : ...    A . Determinações do oxigénio     * Frasco n º * Análises * mg O2 após × dias *     * * * 0 * 5 * 15 * 28 *    Solução nutritiva mineral sem substância a ensaiar e   sem inoculação * Controlo de O2 * c1 * * - * - * - *     * * c2 * * - * - * - *     * Média * m0 = ( c1 + c2 ) /2 * * * * *    Solução nutritiva mineral sem substância a ensaiar   mas com inoculação * 1 * c3 * * * * *     * 2 * c4 * * * * *     * Média em branco * m b = ( c3 + c4 ) /2 * * * * *    Solução nutritiva mineral com substância a   ensaiar e com inoculação * 1 * a1 * * * * *     * 2 * a2 * * * * *     * Média de substância a ensaiar *   m t = ( a1 + a2 ) /2 * * * * *    B . Consumo de O2 ( mg CBO/l ) após × dias    CBO x = ( m o - m b x ) - ( m o - m t x ) (*)    mg CBO/l após × dias    5 * 15 * 28 *     * * *    (*) Esta diferença é importante para o controlo da   validade do ensaio .    C . Avaliação    D t = [ ( mg CBO x/l ) / ( mg S E (**)/l ) ] · 100 ou   CBO x/CQO = [ ( mg CBO x/l ) / ( mg SE/l CQO ) ] · 100     * Após × dias *     * 5 * 15 * 28 *    % CBO/CTO * * * *    % CBO x/CQO * * * *    (**) Substância de ensaio .    Apêndice 4    Ensaio em frasco fechado : v. JO    Ensaio em frasco fechado : v. JO    C . 7 . DEGRADAÇÃO BIÓTICA : ENSAIO MITI ALTERADO    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    O presente método de ensaio tem por objectivo a   medição de biodegradabilidade das substâncias   orgânicas em meio aquoso , por meio de um   respirómetro que indica a demanda bioquímica em   oxigénio .    Convém dispor da fórmula empírica do produto   submetido a ensaio , de modo a que se possa calcular a   carência teórica de oxigénio ( CTO ) ; caso   contrário , pode usar-se a carência química de   oxigénio ( CQO ) . O presente método só é   aplicável às substâncias orgânicas que , na   concentração utilizada para o ensaio :     - têm uma pressão de vapor que se pode desprezar ,     - não inibem as bactérias ,     - não estão em contacto com o absorvente do CO2   e não reagem com ele .    Se a substância a testar não for solúvel na   concentração do ensaio , pode recorrer-se a   processos especiais , como a dispersão por ultra-sons ,   de modo a obter-se uma dispersão suficiente .    Informações sobre a toxicidade da substância   química face ãos microrganismos podem revelar-se   úteis para a interpretação dos resultados que indiquem   uma biodegradação limitada e também para escolher   as concentrações adequadas .    São também úteis para a interpretação dos   resultados obtidos , as informações sobre as   proporções relativas dos principais componentes da   substância ensaiada .    1.2 . Definições e unidades    taxa de degradação = [ ( CBO - B ) / ( CTO ( ou   CQO ) ) ] · 100 %    ou    taxa de degradação = Sb - Sa/Sb × 100 %    em que    CBO = Carência bioquímica de oxigénio   ( experimental ) ( mg ) do produto ensaiado , tal como   é obtido na curva da CBO    B = Consumo de oxigénio ( experimental ) ( mg )   do meio de cultura de base , ao qual o inóculo é   adicionado , tal como se revela sobre a curva da CBO    CTO = Carência teórica de oxigénio para uma   oxidação completa ( teórica ) do produto ensaiado   ( mg )    Sa = Quantidade residual ( experimental ) ( mg ) do   produto ensaiado no final do ensaio de biodegradabilidade    Sb = Quantidade residual ( experimental ) ( mg ) do   produto submetido ao ensaio testemunha , por meio   de água à qual se adicionará unicamente o produto   submetido ao ensaio .    1.3 . Substâncias de referência    A fim de verificar a actividade do inóculo , convém   usar substâncias de referência , tais como a   anilina , o acetato de sódio ou o benzoato de sódio .   Se a taxa de degradação da anilina , calculada após   o consumo de oxigénio , não exceder 40 % após 7 dias   e 65 % após 14 dias , o ensaio é considerado nulo .    Se a degradação no ensaio testemunha ( Sb ) se   revelar importante , o ensaio é igualmente considerado   nulo .    1.4 . Princípio do método    Os produtos a examinar constituem a única fonte   de carbono orgânico no meio e não há adpatação   prévia dos microrganismos aos produtos a ensaiar .    Utiliza-se um aparelho automático para medição   do consumo de oxigénio em circuito fechado ,   ( aparelho de medição da CBO ) . As substâncias   químicas que são objecto de ensaio , colocadas nos   recipientes de ensaio , são inoculadas com   microrganismos . Durante o ensaio , mede-se continuamente   a carência bioquímica de oxigénio , no aparelho   de medição da CBO . Calcula-se a biodegradabilidade a   partir do valor CBO e de uma análise química   complementar , tal como a medição da concentração   do carbono orgânico dissolvido , a concentração   dos produtos residuais , etc .    1.5 . Critérios de qualidade    1.5.1 . Reprodutibilidade    Geralmente boa , nomeadamente para as substâncias   químicas cuja solubilidade na água é superior a   0,1 g/l .    1.5.2 . Sensibilidade    A ) Consumo de oxigénio : limite de detecção = 1 mg   ( oxigénio consumido pelos microrganismos ) ; B )   Análise química : depende da sensibilidade das   técnicas analíticas utilizadas .    1.5.3 . Especificidade    Este método aplica-se a qualquer substância   química não volátil , para a qual   (C)água/(C)ar * 1 . Para os produtos voláteis ,   convém utilizar um « aparelho de medição da CBO   alterado » que consiste no aparelho normal equipado   com tubos capilares ( ver apêndice 1 ) .    1.6 . Descrição do método de ensaio    1.6.1 . Reagentes    1.6.1.1 . A água destilada não deve conter mais   de 10 % do carbono orgânico introduzido pela   substância a ensaiar .   1.6.1.2 . Meio de cultura de base    Retirar 3 ml da solução A , da solução B , da   solução C e da solução D e juntar água para   completar o volume até 1 000 ml ( utilizar em todos os   casos água desionizada ) .    A ) K2HPO4 ( monoidrogenofosfato de potássio ) : *   21,75 g *    KH2PO4 ( diidrogenofosfato de potássio ) : * 8,50 g *    Na2HPO4.12H2O ( monoidrogenofosfato de sódio ,   dodecaidratado ) : * 44,60 g *    NH4Cl ( cloreto de amônio ) : * 1,70 g *    Dissolver e completar o volume até 1 000 ml   com água ( 1.6.1.1 . ) ; * *    B ) MgSO4.7H2O ( sulfato de magnésio ,   heptaidratado ) : * 22,50 g *    Dissolver e completar o volume até 1 000 ml com   água ( 1.6.1.1 . ) ; * *    C ) CaCl2 ( cloreto de cálcio ) : * 27,50 g *    Dissolver e completar o volume até 1 000 ml com   água ( 1.6.1.1 . ) . * *    D ) FeCl3.6H2O [ cloreto de ferro ( III ) ,   hexaidratado ] : * 0,25 g *    Dissolver e completar o volume até 1 000 ml com   água ( 1.6.1.1 . ) . * *    1.6.2 . Aparelhagem    Aparelho de medição do DBO equipado com 6 frascos   de 300 ml de capacidade cada um .    Frascos n º 1 e n º 2 :    300 ml de água desionizada + 30 mg da substância   de ensaio .    Frascos n º 3 e n º 4 :    300 ml do meio de cultura de base + 9 mg de lama   activada ( peso seco ) + 30 mg da substância de   ensaio .    Frasco n º 5 :    300 ml do meio de cultura de base + 9 mg de lama   activada ( peso seco ) + 30 mg de anilina ou outra   substância de referência .    Frasco n º 6 :    300 ml do meio de cultura de base + 9 mg de lama   activada ( peso seco ) .    1.6.3 . Preparação do inóculo    1.6.3.1 . Lama activada    Locais de recolha de amostras de lama : em princípio ,   as amostras são recolhidas pelo menos em 10 locais   diferentes , repartidos por todo o país , principalmente   em zonas em que diferentes substâncias químicas   são susceptíveis de serem utilizadas e rejeitadas   no meio ambiente .    No Japão , por exemplo , a lama activada padrão   do Japanese Chemical Biotesting Centre é constituída   por uma mistura de amostras recolhidas nos seguintes   locais :     - estação de depuração urbana : 3 estações   no Norte , Centro e Sul do Japão ,     - estação de depuração industrial : uma   estação destinada ao tratamento de águas   provenientes de indústrias químicas ,     - rios : três rios situados no norte , centro e sul ,     - lago : um lago situado no Centro do Japão ,     - mares : dois mares interiores no Japão .    Periodicidade dos levantamentos de lama :     - em principio as amostras de lamas devem ser   retiradas quatro vezes por ano , em Março , Junho ,   Setembro e Dezembro .    Método de amostragem das lamas :     - águas de esgoto : colher 1 litro de lama   reciclada na estação de depuração ,     - rios , lagos , pântanos ou mares : colher 1 litro   de terra situada na superfície da praia e em   contacto com a atmosfera .    Preparação :    Colocar as lamas das diversas proveniências num   recipiente , homogeneizar e deixar decantar . Retirar as   matérias flutuantes estranhas e passar o líquido   sobrenadante por papel de filtro n º 2 . Ajustar o   pH do filtrado a 7,0 + 0,1 com hidróxido de sódio   ou ácido fosfórico , depois transferir o filtrado para   um recipiente de incubação e submetê-lo a arejamento .    Cultura :    Após cerca de 30 minutos de arejamento , retirar   cerca de 1/3 do volume total do líquido sobrenadante .   Juntar igual volume de água de esgoto sintética   a 0,1 % ( água de esgoto sintética : dissolver 1 g de   glucose , 1 g de peptona e 1 g de monofosfato de   potássio num litro de água e ajustar o pH a   7,0 ± 1,0 com hidróxido de sódio ) ao resto do   líquido sobrenadante e arejar a mistura de novo .   Repetir todos os dias a operação . A incubação   é feita a 25 ± 20 ° C .    Controlo :    Para o controlo da cultura , verificar as condições   mencionadas a seguir e proceder aos ajustamentos   necessários :     - aspecto do líquido sobrenadante : o líquido   sobrenadante da lama activada deve ter aspecto claro ,     - propriedades de decantação da lama activada :   a lama activada em grossos flocos deve ter boas   propriedades de decantação ,     - estado de formação da lama activada : quando   não se observe o desenvolvimento dos flocos , deve-se   aumentar , quer o volume da água de esgoto   sintética a 0,1 % , quer a frequência de adição   da água de esgoto sintética ,     - o pH do líquido sobrenadante deve ser igual a   7,0 ± 1,0 ,     - temperatura : a temperatura da incubação da   lama activada é de 25 ° ± 2 ° C ,     - grau de arejamento : aquando da substituição   do líquido sobrenadante pela água de esgoto   sintética , a suspensão contida no recipiente de   cultura deve ser suficientemente arejada , de forma a   manter a concentração em oxigénio dissolvido na   solução a um valor superior a 5 mg/l ,     - microflora da lama activada : a observação da   lama activada ao microscópio ( x 100 a x 400 ) , deve   permitir a revelação , além dos flocos , dum certo   número de protozoários de diferentes espécies ,     - mistura de lamas activadas frescas e antigas : a   fim de se conservar a mesma actividade para as lamas   activadas frescas e antigas , o filtrado do líquido   sobrenadante de uma lama activada utilizada para o   ensaio deve ser misturado com igual volume do líquido   sobrenadante de uma lama activada recentemente recolhida ,   após o que a mistura é submetida à incubação ,     - controlo da eficácia da lama activada : verificar   periodicamente , isto é pelo menos uma vez de 3 em 3   meses , a eficácia da lama activada com substâncias   padrão e utilizando o método descrito a seguir . Deve   vigiar-se particularmente o controlo da actividade da   lama antiga aquando da mistura de amostras de lamas   frescas e antigas .    Exemplo de preparação de amostras de lama activada   e tempo de utilização :    Dezembro * Cultura *    Janeiro * Período de utilização *    Fevereiro * Período de utilização *    Março * Mistura , cultura *    Abril * Período de utilização *    Maio * Período de utilização *    Junho * Mistura , cultura *    Julho * Período de utilização *    Agosto * Período de utilização *    Setembro * Mistura , cultura *    Outubro * Período de utilização *    Novembro * Período de utilização *     ( e assim por diante ) .    1.6.4 . Preparação do produto a examinar    Se o produto a examinar não puder ser solubilizado   na água para se obter a concentração exigida para o   ensaio , convém pulverizá-lo tão finamente quanto   possível .    1.6.5 . Adição do produto a examinar e preparação   do ensaio    Preparar os recipientes mencionados a seguir , e levá-los   à temperatura exigida para o ensaio ( ponto 1.6.2 . ) .   1 ) Dois recipientes de ensaio contendo água à qual   se adicionaram 100 mg/l da substância a examinar   ( recipientes 1 e 2 ) .    2 ) Dois recipientes de ensaio contendo o meio de   cultura de base ao qual se adicionarão 100 mg/l da   substância a examinar ; se necessário , ajustar o   pH desta solução para 7 , antes da inoculação   da lama activada ( recipientes 3 e 4 ) .    3 ) Um recipiente de ensaio contendo o meio de cultura   de base ao qual se adicionarão 100 mg/l de anilina ou   de qualquer outra substância de referência   ( recipiente 5 ) .    4 ) Um recipiente de ensaio testemunha contendo   unicamente o meio de cultura de base ( recipiente 6 ) .    1.6.5.1 . Inoculação da lama activada    Juntar o inóculo nos recipientes de ensaio 3 , 4 , 5 e   6 anteriores , de modo a que a concentração de   matérias em suspensão definidas pelas normas   industriais japonesas ( 3 ) , por exemplo , seja igual   a 30 mg/l .    1.6.5.2 . Condições do ensaio    Concentração em produtos a examinar : 100 mg/l .    Concentração das lamas activadas : 30 mg/l .    Temperatura do ensaio : 20 a 25 ° C .    Duração do ensaio : 28 dias .    Efectuar o ensaio às escuras . Verificar diariamente   a temperatura , assim como as alterações da cor do   conteúdo do recipiente de incubação .    Homogeneizar as soluções com agitador mecânico .    1.6.6 . Técnica    A curva de evolução do DB0 é registada   continuamente durante 28 dias ( ver figura ) . Após   28 dias de ensaio , medir o pH e a concentração   dos produtos químicos residuais e intermediários   contidos no recipiente de ensaio .    Figura 1    Curva de CBO da anilina : v. JO    Analisar igualmente os produtos a examinar contidos no   recipiente sem lama activada , de modo a confirmar   se há qualquer alteração do produto examinado   durante o período de ensaio ou qualquer perda do   produto original por evaporação , por evaporação   ou adsorção pelas paredes do recipiente de   ensaio , etc .    1.6.7 . Aparelhos de análise    Se a substância a ensaiar for solúvel na água ,   convém igualmente determinar a quantidade residual de   carbono orgânico total no final do ensaio .    a ) Quando se utiliza um aparelho para determinação   do carbono orgânico total :    Retirar do recipiente de ensaio 10 ml da solução   a examinar e centrifugá-los a 3000 g , durante   5 minutos . Medir em seguida a quantidade residual   de carbono orgânico total no líquido sobrenadante ,   por meio de um aparelho para determinação   do carbono orgânico total ;    b ) Quando se utilizam outros aparelhos :    Extrair a substância a examinar por meio de um   solvente adequado , actuando sobre o conteúdo total do   recipiente de ensaio e , após um pré-tratamento   conveniente , tal como a concentração , determinar a   quantidade residual de substância , por meio   de um instrumento de análise ( cromatografia gasosa ,   espectrometria de massa , espectrofotometria , etc. ) .    Para os produtos voláteis , o banho termostatizado   do aparelho de medição da CBO deve ser arrefecido   para 10 ° C , e mantido a esta temperatura durante   pelo menos 30 minutos , a fim de impedir a   evaporação . Proceder em seguida às análises   a ) e b ) .    2 . AVALIAÇÃO DOS DADOS    2.1 . Expressão dos resultados    Os métodos de cálculo da taxa de degradação   a partir do consumo de oxigénio e a partir dos   resultados de análise directa são definidos   em 1.2 .    2.2 . Avaliação dos resultados    A carência teórica de oxigénio pode ser   calculada como se indica no Apêndice 2 ou   segundo o processo de MITI original :    Elemento : * Forma oxidada : *    C * CO2 *    H * H2O *    N * NO2 *    S * SO2 *    X ( halogéneo ) * X *    3 . APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS    3.1 . Relatório do ensaio    O relatório de ensaio deve conter , se   possível , as seguintes indicações :     - informações sobre os produtos químicos   a examinar : nome , estrutura , peso molecular ,   grau de pureza , natureza das impurezas , propriedades   físico-químicas e identificação da substância ,     - condições do ensaio ,     - inóculos : locais de recolha e concentração   das lamas activadas ,     - substância a examinar : concentração ,     - duração do ensaio ,     - temperatura do ensaio ,     - técnica analítica :    pré-tratamento ,    condições analíticas dos instrumentos ,    eficácia da análise ,    identificação dos produtos intermédios ,     - resultados :    curvas de biodegradação ( controlo da actividade   do inóculo + curva da substância )    DBO ( mg )    B ( mg )    Sa ( mg )    Sb ( mg )    DThO ( mg )    taxa de degradação obtida por determinação   do DB0 ,    taxa de degradação obtida por análise química ,    cromatografias ou espectros dos produtos do ensaio   obtidos e utilizados para a análise , prova   da validade ( ver ponto 1.3 . ) .    3.2 . Interpretação dos resultados    Convém verificar se as substâncias não   contêm azoto susceptível de influenciar os   resultados .    Se a taxa de recuperação de Sb se revelar   da ordem dos 10 % ou inferior , isto põe em   evidência problemas analíticos ou uma hidrólise ,   por exemplo ; em tal caso , convém ser particularmente   prudente na interpretação .    Apesar do rigor do ensaio , um resultado pouco   elevado não significa necessáriamente que   a substância submetida ao ensaio não seja   biodegradável em meio natural , mas indica   que será necessário proceder a outros ensaios   para o provar .    Os produtos a examinar para os quais os resultados   do presente ensaio indiquem um forte consumo de   oxigénio devem ser considerados como fácilmente   biodegradáveis , quando esse nível for atingido no   prazo de 10 dias a contar do dia em que o nível   de biodegradação observado excedeu pela primeira vez   10 % .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    (1) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 301C .   Decision of the Council C(81) 30 , Final .    (2) Biodegradability and bioaccumulation test of   chemical substances ( C-5/98/JAP ) , 1978 .    (3) The chemical substances control law in Japan   ( Chemical Products Safety Division , Basic   Industries Bureau , MITI ) ( C-2/78/JAP ) , 1978 .    (4) The biodegrability and bioaccumulation of new   and existing chemical substances , 5 , 8   ( C-3/78/JAP ) , 1978 .    Apêndice 1    Princípio de funcionamento do aparelho para   medição do consumo de oxigénio em circuito   fechado    A medição do oxigénio consumido pelos   microrganismos pode ser feita por um processo de   análise electroquímica ( colorimetria ) .    Esquema do princípio do aparelho : v. JO    O meio contido no frasco de incubação (1)   é homogeneizado com agitador magnético (2) . À   medida que a reacção progride , o oxigénio   dissolvido no líquido é consumido . O   oxigénio ( O2 ) mantido no frasco de incubação   é dissolvido no líquido e transforma-se em CO2 .    Quando o CO2 é absorvido cal viva (3) , a pressão   parcial do oxigénio no frasco e a pressão total   diminuem .    O abaixamento da pressão é detectado e convertido   em sinal eléctrico pelo manómetro de   electrodo (4) , e este sinal é ampliado pelo   amplificador (5) , para accionar o interruptor (6)   o que provoca o arranque do motor síncrono (8) .    Simultaneamente , sob a acção de uma corrente   de intensidade constante , o oxigénio é produzido por   electrólise a partir de uma solução de cobre em   ácido sulfúrico , contida no frasco de   electrólise (7) . Este oxigénio é enviado   para o frasco de incubação e o restabelecimento   da pressão assim obtido é detectado pelo   manómetro , o que tem por efeito desligar o   circuito e parar o motor electrolítico e   síncrono .    O espaço situado por cima do líquido no frasco   de incubação é mantido a uma pressão de oxigénio   constante e a quantidade de oxigénio é produzida   por electrólise . Sendo esta última quantidade por seu   lado proporcional à duração da electrólise ,   a corrente electrolítica é constante . Por   consequência , o ângulo de rotação do   motor síncrono (9) é transformado em sinal mV   por meio dum potenciómetro de inter fechadura ,   o que se traduz pela indicação da quantidade   de oxigénio consumida no registador (10) .    Apêndice 2    Cálculo da carência bioquímica teórica   de oxigénio ( CTO )    A CTO de um composto C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s   de peso molecular PM é calculada pela fórmula   seguinte :    CTO NH3 = 16 [ 2c + 1/2(h - cl - 3n ) +   3s + 5/2p + 1/2na - o ] /PM    Esta fórmula implica que C é mineralizado   em CO2 , H em H2O , H em H2O , P em P2O5 e Na em   Na2O . O halogéneo é eliminado sob a forma   de halogeneto de hidrogénio e o azoto sob a forma   de amoníaco .    Exemplo :    Glucose C6H12O6 , PM = 180    CTO = 16 ( 2 · 6 + 1/2 · 12 - 6 ) /180 =   1,07 mg O2/mg glucose    Para o cálculo dos pesos moleculares dos sais ,   excluindo os sais de metais alcalinos , supõe-se   que esses sais são hidrolisados . O enxofre , supõe-se   oxidado na forma de + 6 .    Exemplo :    n-Alquilbenzenossulfonato de sódio ,   C18H29SO3Na , PM = 348    CTO = 16 ( 36 + 29/2 + 3 + 1/2 - 3 ) /348 =   2,34 mg O2/mg de substância    No caso de compostos contendo azoto , este pode   ser eliminado sob a forma de amoníaco , de nitrito ou   nitrato segundo as diferentes carências bioquímicas   teóricas de oxigénio .    CTO NO - 2 = 16 [ 2c + 1/2(h - cl) + 3s + 3/2n +   5/2p + 1/2na - o ] /PM    CTO NO - 3 = 16 [ 2c + 1/2(h - cl) + 3s + 5/2n +   5/2p + 1/2na - o ] /PM    Supondo que uma formação total de nitrato foi   observada por análise , por exemplo no caso de uma   anima secundária :    (C12H25)2 NH ; PM = 353 ,    CTO NO - 3 = 16 ( 48 + 51/2 + 5/2 ) /353 =   3,44 mg O2/mg de substância .    Apêndice 3    Degradação biótica : ensaio MITI alterado   ( boletim )    Laboratório : ...    Director dos estudos : ...    Data de início do ensaio : ... Experiência n º : ...    Substância de ensaio : ...    Composição química : ...    Análise : ...    CTO ou CQO da substância a ensaiar : ...    Inóculo : ...    Local de amostragem : ...    Concentração : ...    Resultado do ensaio    ... % degradação = CBO - B/CTO × 100 %   após 28 dias    ou    ... % degradação = CBO - B/CQO × 100 %   após 28 dias    ... % degradação = Sb - Sa/Sb × 100 %   após 28 dias    Validação do resultado    Controlo químico : ...    Resultado : ... % de degradação após 28 dias ...    Experiência de referência n º : ...    Observações ...    Apêndice 4 : v. JO    C.8 DEGRADAÇÃO : CARÊNCIA BIOQUÍMICA DE   OXIGÉNIO    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    O método tem por objectivo medir a carência   bioquímica de oxigénio ( CBO ) das substâncias   orgânicas , sólidas ou líquidas .    Os dados fornecidas por este ensaio incidem sobre os   compostos hidrossolúveis , no entanto , os compostos   voláteis e os de fraca hidrossolubilidade podem também   ser ensaiados , pelo menos em princípio .    O método é aplicável unicamente às substâncias   orgânicas , não inibidoras face às bactérias na   concentração utilizada no ensaio . Se a substância   não é solúvel à concentração do ensaio , podem   ter que ser utilizados processos particulares , tais como   o recurso à dispersão ultra-sonica , a fim de se obter   uma boa dispersão da substância .    Os dados sobre a toxicidade da substância química   podem ser úteis para a interpretação de resultados   pouco esclarecedores e para a escolha de concentrações   de ensaio adequadas .    1.2 . Definição e unidades    A CBO é definida como a massa de oxigénio dissolvida   necessária para assegurar em condições definidas   a oxidação bioquímica dum certo volume de uma   solução da substância submetida ao ensaio .    Os resultados são expressos em gramas de CBO/grama   da substância submetida ao ensaio .    1.3 . Substância de referência    Não podem ainda ser recomendadas substâncias de   referência .    É conveniente a utilização de uma substância   química testemunha , para verificar a actividade do   inóculo .    1.4 . Princípio do método de ensaio    Cultivar com microrganismos e incubar a uma temperatura   ambiente constante , definida , na obscuridade , uma   quantidade pré-determinada de substância , dissolvida   ou dispersa em meio arejado , adequado .    O valor de CBO é determinado pela diferença entre o   teor em oxigénio dissolvido no início e no final do   ensaio . A duração do ensaio é de pelo menos 5 dias   e não excede 28 dias .    Uma testemunha deve ser constituída por um ensaio   paralelo não contendo a substância a submeter a   ensaio .    1.5 . Critérios de qualidade    A determinação da CBO não pode ser considerada   como avaliação segura da biodegrabilidade de uma   substância e constitui apenas um ensaio de selecção .    1.6 . Descrição do método de ensaio    Preparar uma solução ou uma dispersão preliminar   da substância , a fim de se obter uma concentração   de CBO compatível com o método utilizado . A CBO é   então determinada por aplicação de método   normalizado , nacional , adequado , mas de preferência   seguindo por um método internacional , que ainda está   por definir .    2 . AVALIAÇÃO DOS DADOS    A CBO da solução preliminar é calculada segundo   um método normalizado escolhido e convertido em gramas   de CBO por grama de substância de ensaio .    3 . APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS    Deve ser indicado o método utilizado .    A carência bioquímica de oxigénio deve ser a   média de pelo menos três medições válidas .    Todos os dados e observações importantes que ajudem   a interpretação dos resultados devem ser referidos ,   nomeadamente no que diz respeito às impurezas ,   estado físico , efeitos tóxicos e composição   da substância , susceptíveis de afectar os resultados .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Lista de métodos-padrão , por exemplo :    NF T 90-103 : Determination of the Biochemical   Oxygen Demand    NBN 407 : Biochemical Oxygen Demand    NEN 3235 5.4 : Bepaling van het biochemish   zuurstofverbruik ( BZV ) . ]    The Determination of biochemical Oxygen Demand , 1981   ( Methods for the examination of Water and Associated   Materials , HMSO , London ) .    C.9 . DEGRADAÇÃO : CARÊNCIA QUÍMICA DE   OXIGÉNIO    1 . MÉTODO    1.1 . Introdução    O método tem por objectivo a medição da carência   química de oxigénio ( CQO ) das substâncias   orgânicas sólidas ou líquidas , por aplicação   de qualquer técnica normalizada , nas condições   laboratoriais determinadas .    Os dados disponíveis sobre a fórmula da substância   facilitarão a realização deste ensaio e também   a interpretação dos resultados obtidos ( por   exemplo , sais de halogéneo , sais ferrosos de compostos   orgânicos , compostos organo-clorados ) .    1.2 . Definições e medidas    A carência química de oxigénio é a medição   da oxidabilidade duma substância , definida como a   quantidade de oxigénio dum reagente oxidante , consumida   pela substância em condições laboratoriais   determinadas .    O resultado é expresso em gramas de CQO por grama   da substância de ensaio .    1.3 . Substâncias de referência    Não é exigida a utilização de substâncias de   referência em todos os casos em que se analisa uma nova   substância . Aquelas substâncias devem permitir   aferir periodicamente o método e facilitar a   comparação dos resultados em caso de aplicação   de métodos diferentes .    1.4 . Princípios do método de ensaio    Uma quantidade determinada de substância a ensaiar ,   dissolvida ou dispersa na água , é oxidada pelo   dicromato de potássio em presença de ácido   sulfórico concentrado ( sendo o catalisador sulfato de   prata ) , a quente e sob refluxo durante 2 horas . O   dicromato residual é determinado por titulação com   solução padrão de sulfato ferroso II e amónio .    No caso das substâncias conterem cloro , juntar   sulfato mercórico para atenuar a interferência dos   cloretos .    1.5 . Critérios de qualidade    Em virtude das condições arbitárias de   determinação da CQO , este deve ser considerado mais   como um « indicador Redox » que como uma avaliação   da substância orgânica .    Os cloretos podem interferir durante este ensaio ;   outras substâncias minerais redutoras ou oxidantes   podem igualmente influenciar a determinação da CQO .    Certos compostos cíclicos não são totalmente   oxidados neste ensaio .    1.6 . Descrição do método de ensaio    Preparar uma solução ou uma dispersão preliminar   da substância para se chegar a um valor de CQO de   250 a 600 mg/l .    Observação :    No caso de substâncias pouco solúveis ou não   dispersáveis , pesar uma quantidade de substância   finamente pulverizada ou no estado líquido ,   correspondendo a cerca de 5 mg de CQO , e introduzi-la   no aparelho da experiência com adição de água .    Determinar em seguida o DQO por aplicação de qualquer   método nacional normalizado , adequado , enquanto   se espera pela publicação de um método normalizado   internacional , ao qual se dará então preferência .    2 . AVALIAÇÃO DOS DADOS    Calcular a CQO no frasco experimental , seguindo o   método normalizado escolhido , e converter em gramas   de CQO por grama da substância de ensaio .    3 . APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS    Deve ser indicado o método de referência utilizado .    A carência química de oxigénio será a média   de pelo menos três medições . Serão referidos todos   os dados e observações que apresentem interesse para   a interpretação dos resultados , nomeadamente sobre   impurezas , estado físico e propriedades específicas   da substância ( se conhecidas ) susceptíveis de   afectar os resultados .    Mencionar o sulfato mercúrico , caso este tenha sido   utilizado para reduzir a interferência dos cloretos .   4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS    Exemplos de métodos normalizados :    NBN T 91-201 * Determination of the Chemical Oxygen   Demand . *    ISBN O 11 7512494 * Chemical Oxygen Demand ( dichromate   value ) of polluted and waste waters . *    NF T 90-101 * Détermination de la demande chimique   en oxygène . *    DS 217 = Water Analysis * Determination of the   Chemical Oxygen Demand . *    DIN 38409 - H - 41 * Determination of the Chemical   Oxygen Demand ( COD ) within the range above 15 m/l *    NEN 3235 5.3 . * Bepaling van het chemisch   zuurstofverbruik . *    ISO DP 6060 * Water Quality : Chemical Oxygen Demand   Dichromate Methods . *    C.10 . DEGRADAÇÃO ABIÓTICA : HIDRÓLISE EM   FUNÇÃO DO pH    1 . MÉTODO    Este método baseia-se no que está descrito nas   « linhas directivas » da OCDE (1) .    1.1 . Introdução    A hidrólise é uma reacção química importante   no controlo da degradação abiótica . Esta   reacção é particularmente importante para as   substâncias pouco biodegradáveis , e pode influenciar   a persistência duma substância no meio ambiente .    A maior parte das reacções de hidrólise são   de pseudo-primeira-ordem e , por isso , os   « tempos de semivida » são independentes   da concentração . Isso permite , habitualmente ,   extrapolar os resultados obtidos com as concentrações   de laboratório , para as condições do meio ambiente .    Além disso , foram citados (2) vários exemplos ,   mostrando um acordo satisfatório entre os resultados   encontrados na água pura e na água natural , e isto   para vários tipos de produtos químicos .    É útil , para a realização deste ensaio ,   dispôr-se de dados preliminares sobre a tensão de   vapor da substância .    Este método só é aplicável às substâncias   sólidas . As impurezas vão , em geral , influenciar   os resultados .    O comportamento hidrolítico das substâncias químicas   deve ser estudado para valores do pH habitualmente   encontrados no meio ambiente ( pH de 4 a 9 ) .    1.2 . Definições e unidades    A hidrólise refere-se à reacção de um produto   químico RX com a água . Esta reacção pode ser   representada por uma troca característica do radical X   com OH :    RX + HOH * ROH + HX [ 1 ]    A velocidade à qual a concentração de RX   decresce é dada pela relação :    Velocidade = K. [ H20 ] · [ RX ] [ 2 ]    Como a água está em grande excesso em relação   à substância química , este tipo de reacção é   habitualmente descrito como sendo uma reacção de   « pseudo » -primeira ordem , durante a qual a   constante de velocidade observada é dada pela   relação :    K obs. = K. [ H2O ] [ 3 ]    Esta constante pode ser determinada para um dado valor   de pH e para uma temperatura T , utilizando a expressão   seguinte :    K obs. = 2,303/t · log C o/C t [ 4 ]    em que ,    t = tempo    C o = concentração da substância no tempo O    C t = concentração da substância no tempo t    2,303 = factor de conversão entre os logaritmos   nepérianos e os de base 10 .    As concentrações são expressas em g/l ou mole/l .    A unidade da constante K obs. é o (tempo)-1 .    O « tempo de semivida » t1/2 é definido como o   tempo necessário para reduzir em 50 % a concentração   da substancia química a testar , isto é :    C t = 1/2 . Co [ 5 ]    A partir das expressões [ 4 ] e [ 5 ] ,   demonstra-se que :    t1/2 = 0,693/K obs [ 6 ]    1.3 . Substâncias de referência    Não é necessário utilizar substâncias de   referência sempre que se estuda uma nova   substância . Elas servirão essencialmente para   controlar periodicamente a eficácia do método e para   permitir a comparação dos resultados obtidos quando   é utilizado outro método .    O ácido acetilsalicílico ( Aspirina ) e o tiofosfato   de 0,0-dietil 0-2-isopropil-4-metil-6-pirimidilo   ( Dimpilato e Diazinão ) , foram utilizados como   referências . (1)    1.4 . Princípio do método    A substância é dissolvida na água a uma baixa   concentração ; o pH e a temperatura são controlados .    A diminuição da concentração da substância   durante o tempo seguida por qualquer processo analítico   adequado .    Os logaritmos das concentrações da substância no   decurso do tempo são registados num gráfico , e , se   nele aparecer uma recta , a constante de velocidade de   primeira ordem pode ser obtida pelo declive desta recta   ( ver ponto 2 ) .    Quando não é possível determinar de imediato uma   constante de velocidade para uma dada temperatura , é   normalmente possível fazer a estimativa do valor desta   constante , por meio de relação de Arrhenius , que dá   a dependência da constante de velocidade em relação   à temperatura .    Do gráfico linear do logaritimo da constante de   velocidade , tal como é determinada à temperatura   adequada , em função do inverso da temperatura   absoluta ( k ) , é possível extrapolar o valor da   constante de velocidade que não foi obtido no primeiro   caso .    1.5 . Critério de qualidade    A referência (2) refere que medições da constante   de velocidade de hidrólise para 13 classes de   estruturas orgânicas podem ser de grande precisão .    A repetibilidade depende em particular do controlo do   valor do pH , da concentração em oxigénio   dissolvido e pode ser influenciada pela presença de   microrganismos .    1.6 . Descrição do método    1.6.1 . Reagentes    1.6.1.1 . Soluções-tampão    O teste é efectuado a três valores do pH : 4,0 , 7,0   e 9,0 .    Com esta finalidade , as soluções-tampão devem ser   preparadas utilizando reagentes químicos pró-análise   e água destilada ou desionizada estéril .    No apêndice são apresentados alguns exemplos de   soluções-tampões .    A solução-tampão utilizada pode influenciar a   velocidade de hidrólise ; se tal acontecer , deve ser   utilizada outra solução-tampão . O uso de tampões   borato ou acetato é recomendado na referência (2)   em lugar dos fosfatos .    Se o pH das soluções-tampões for desconhecido para a   temperatura do ensaio , deve então ser determinado com um   aparelho para medir o pH calibrado à temperatura escolhida   e com uma precisão de ± 0,1 unidade de pH .    1.6.1.2 . Soluções do ensaio    A substância de ensaio deve ser dissolvida num tampão   escolhido e a concentração não deve exceder 0,01 M   ou metade da concentração da saturação .    A utilização de solventes orgânicos miscíveis na   água só é recomendada para substâncias de fraca   solubilidade na água . A quantidade do solvente deve   ser inferior a 1 % e não deve interferir com o   processo hidrolítico .    1.6.2 . Aparelhagem    Devem ser utilizados frascos de vidro com rolha   esmerilada , mas deve-se evitar a utilização de gordura   no esmeril .    Se a substância ou o tampão forem voláteis , ou   o ensaio for conduzido a temperaturas elevadas ,   devem preferir-se tubos selados ou fechados que são   cheios tão completamente quanto possível .    1.6.3 . Método analítico    O método analítico dependerá da natureza da   substância a ensaiar e será suficientemente sensível e   específico para determinar uma diminuição de 10 % da   concentração inicial .    O método deve ser específico para permitir a   determinação da substância de ensaio nas   concentrações utilizadas durante o ensaio , e pode   consistir na combinação de alguns métodos   analíticos adequados .    1.6.4 . Condições do ensaio    Os ensaios serão realizados utilizando um equipamento   com controlo da temperatura ou um banho à temperatura   constante estabelecida a ± 0,5 ° C da temperatura   escolhida . A temperatura será mantida e medida a   ± 0,1 ° C . Devem ser evitadas as interferências   fotolíticas por meios adequados .    Devem ser tomadas todas as precauções para   eliminar o oxigénio dissolvido ( por exemplo , fazendo   borbulhar azoto ou argon durante 5 minutos antes de   preparar as soluções ) .    1.6.5 . Processo do ensaio    1.6.5.1 . Teste preliminar    Deve ser feito , para todas as substâncias , um   ensaio preliminar a 50 ° C ± 0,5 ° C , com 3   valores do pH : 4,0 , 7,0 e 9,0 .    Realiza-se um número de medições suficientes , de   forma a poder fazer-se uma estimativa se , para cada   valor do pH e a 50 ° C o tempo de semivida ( t1/2 ) é   inferior a 24 h ou se se observa menos de 10 % da   hidrólise após 5 dias . [ Pode estimar-se que estes   valores correspodem respectivamente a tempos de semivida   inferiores a 1 dia ou superiores a 1 ano em condições   mais representativas que o meio ambiente ( 25 ° C ) ] .    Se o teste preliminar demonstrar que 50 % ou mais da   substância de ensaio foi hidrolizada em 24 h a 50 ° C   ou que menos de 10 % foi hidrolizada após 5 dias para   cada valor de pH ( 4 , 7 e 9 ) , é inútil prosseguir os   ensaios .    Noutros casos , e para os valores do pH para os quais   estas condições não foram satisfeitas , deve ser   efectuado o ensaio n º 1 .    1.6.5.2 . Ensaio n º 1    O ensaio n º 1 é conduzido a uma temperatura , de   preferência a 50 ° C ± 0,5 ° C , se possível em   condições estéreis e com os valores do pH para os quais   os ensaios preliminares mostraram a necessidade de ensaios   suplementares .    Um número suficiente de amostras ( não menos de 4 )   devem ser escolhidos a fim de cobrir um intervalo de 20 a   70 % de hidrólise para a determinação do comportamento   de pseudo-primeira ordem com os valores de pH específicos .    Para cada valor do pH para o qual o ensaio n º 1 foi   efectuado , é determinada a ordem da reacção .    Estimativa da constante de velocidade a 25 ° C :    A decisão duma escolha sobre o processo experimental   depende da possibilidade de se concluir do ensaio n º 1   se a reacção é ou não de pseudo-primeira ordem .    Se não for possível determinar com exactidão durante   o ensaio n º 1 se a reacção é de pseudo-primeira   ordem , as experiências devem prosseguir , tal como foram   descritas para o ensaio n º 2 .    Se a determinação da pseudo-primeira ordem do ensaio   n º 1 for de confiança , as experiências devem   prosseguir segundo a descrição do ensaio n º 3   [ ou melhor , é possível , em certas   circunstâncias , calcular a constante de velocidade a   25 ° C , com base nas constantes determinadas a 50 ° C ,   calculadas utilizando os resultados do ensaio n º 1   ( ponto 3.2 ) ] .    1.6.5.3 . Ensaio n º 2    Este ensaio é efectuado para cada valor do pH , para o   qual foi provado no ensaio n º 1 que era necessário   prosseguir as experiências :     - quer a uma temperatura , escolhida e inferior   a 40 ° C ,     - quer a duas temperaturas , acima de 50 ° C ,   afastadas entre si pelo menos 10 ° C .    Para cada valor de pH e temperatura para os quais o   ensaio n º 2 é efectuado , são medidos pelo menos seis   pontos espaçados de forma adequadas de tal modo que as   percentagens de hidrólise se situem no intervalo   de 20 a 70 % .    Para cada valor de pH e temperatura , é efectuada uma   dupla determinação . Quando o ensaio n º 2 é   realizado a duas temperaturas acima de 50 ° C , a dupla   determinação é de preferência efectuada à mais   baixa das duas temperaturas .    Para cada valor de pH e temperatura para os quais o   ensaio n º 2 é efectuado , será dada uma estimativa   gráfica do tempo de semivida ( t1/2 ) , desde que tal   seja possível .    1.6.5.4 . Ensaio n º 3    Este ensaio é efectuado para cada valor do pH   para o qual os resultados do ensaio n º 1 mostraram a   necessidade de o realizar :     - quer a uma temperatura , escolhida e inferior   a 40 ° C ,     - ou a duas temperaturas acima de 50 ° C , distanciadas   entre si de pelo menos 10 ° C    Para cada valor de pH e temperatura para os quais o ensaio   n º 3 é efectuado , são escolhidos 3 pontos de   determinação : o primeiro no tempo 0 e segundo e   terceiro quando as percentagens de hidrólise são   superiores a 30 % ; a constante K obs. e t1/2 devem ser   calculadas .    2 . DADOS    No caso de um comportamento de pseudo-primeira ordem os   valores de K obs. para cada valor de pH e de temperatura dos   ensaios , podem ser obtidos do gráfico dos logaritimos   das concentrações em função do tempo , utilizando   a expressão :    K obs = - declive × 2,303    Além disso t1/2 pode ser calculado pela equação   [ 6 ] .    Quando adequado , fazer a estimativa de K 25 ° C   por aplicação da equação de Arrhenius .    No caso em que o comportamento não é de   pseudo-primeira ordem , ver o ponto 3.1 .    3 . RELATÃRIO DO ENSAIO    3.1.1 . O relatório do ensaio deve , se possível ,   conter as seguintes informações :     - especificações da substância ensaiada ,     - qualquer resultado obtido com substâncias de   referência ,     - o princípio e a descrição completa do método   analítico utilizado ,     - para cada ensaio : as temperaturas , o valor do pH , a   composição do tampão e o quadro dos pontos   experimentais concentrações/tempo ,     - no caso das reacções de pseudo-primeira ordem , os   valores de K obs , de t1/2 e respectivos métodos de   cálculo ,     - no caso de uma reacção que não é de   pseudo-primeira ordem , estabelecer o gráfico dos   logarítmos das concentrações em função dos   tempos ,     - qualquer informação e observação   necessárias para as interpretações dos resultados .    3.2 . Interpretação dos resultados    É por vezes possível calcular valores aceitáveis   da constante de velocidade ( a 25 ° C ) da substância   de ensaio , na condição dos valores da energia de   activação para os homólogos da substância química   já existirem e desde que possa ser razoavelmente   estabelecido que a energía de activação da   substância de ensaio é da mesma ordem de grandeza .    4 . REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS     ( 1 ) OCDE , Paris , 1981 , Test guideline 111 -   Décision du Conseil C(81)30 F .     ( 2 ) OCDE , Paris , 1981 , Test guideline 111 -   Décision du Conseil C(81)30 F - référence ( 2 ) .    Apêndice    Misturas tampão    A . CLARK E LUBS    Os valores do pH indicados a seguir foram calculados a   partir de medições potenciais utilizando as   equações padrão de Soerensen ( 1909 ) .    Os valores reais do pH são superiores a estes em   0,04 unidades .    Composição * pH *    Hidrogenoftalato de potássio 0,1 M + HCl 0,1 N a   20 ° C * *    2,63 ml HCl 0,1 N + 50 ml ftalato , completar até   100 ml * 3,8 *    Hidrogenoftalato de potássio 0,1 M + NaOH 0,1 N a   20 ° C * *    0,40 ml NaOH 0,1 N + 50 ml de ftalato , completar até   100 ml * 4,0 *    3,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml de ftalato , completar até   100 ml * 4,2 *    Fosfato monopotássico 0,1 M + NaOH 0,1 N a 20 ° C * *    23,45 ml NaOH 0,1 N + 50 ml de fosfato , completar até   100 ml * 6,8 *    29,63 ml NaOH 0,1 N + 50 ml de fosfato , completar até   100 ml * 7,0 *    35,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml de fosfato , completar até   100 ml * 7,2 *    H3BO3 0,1 M em KCl 0,1 M + NaOH 0,1 N a 20 ° C * *    16,30 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico , completar   até 100 ml * 8,8 *    21,30 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico , completar   até 100 ml * 9,0 *    26,70 ml NaOH 0,1 N + 50 ml ácido bórico ,   completar até 100 ml * 9,2 *    B . KOLTHOFF E VLEESCHOUWER    Composição * pH *    Citrato monopotássico 0,1 M e NaOH 0,1 N a 18 ° C   ( juntar um cristal minúsculo de timol ou alguns   miligramas de iodeto mercúrico para evitar o crescimento   de bolor ) * *    2,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml de citrato , completar até   100 ml * 3,8 *    9,00 ml NaOH 0,1 N + 50 ml de citrato , completar até   100 ml * 4,0 *    16,30 ml NaOH 0,1 N + 50 ml de citrato , completar até   100 ml * 4,2 *    C . SOERENSEN    0,05 M borax + 0,1 N HCl    Composição * pH *    ml de borato de sódio * ml HCl * Soerensen 18 ° C *   Walbum *     * * * 10 ° C * 40 ° C * 70 ° C *    8,0 * 2,0 * 8,91 * 8,96 * 8,77 * 8,59 *    8,5 * 1,5 * 9,01 * 9,06 * 8,86 * 8,67 *    9,0 * 1,0 * 9,09 * 9,14 * 8,94 * 8,74 *    9,5 * 0,5 * 9,17 * 9,22 * 9,01 * 8,80 *    10,0 * 0,0 * 9,24 * 9,30 * 9,08 * 8,86 *    0,05 M borax + 0,1 N NaOH    Composição * pH *    ml de borato de sódio * ml NaOH * Soerensen 18 ° C *   Walbum *     * * * 10 ° C * 40 ° C * 70 ° C *    10,0 * 0,0 * 9,24 * 9,30 * 9,08 * 8,86 *    9,0 * 1,0 * 9,36 * 9,42 * 9,18 * 8,94 *    8,0 * 2,0 * 9,50 * 9,57 * 9,30 * 9,02 *    7,0 * 3,0 * 9,68 * 9,76 * 9,44 * 9,12