Avviż Legali Importanti

|

32000L0033

Id-Direttiva tal-Kummissjoni 2000/33/KE tal-25 ta' April 2000 li tadatta għall-progress tekniku għas-sebgħa u għoxrin darba d-Direttiva 67/548/KEE rigward l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-disposizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta' sustanzi perikolużi (Test b'rilevanza għaż-ŻEE)

Official Journal L 136 , 08/06/2000 P. 0090 - 0107 CS.ES Chapter 13 Volume 25 P. 242  - 259 ET.ES Chapter 13 Volume 25 P. 242  - 259 HU.ES Chapter 13 Volume 25 P. 242  - 259 LT.ES Chapter 13 Volume 25 P. 242  - 259 LV.ES Chapter 13 Volume 25 P. 242  - 259 MT.ES Chapter 13 Volume 25 P. 242  - 259 PL.ES Chapter 13 Volume 25 P. 242  - 259 SK.ES Chapter 13 Volume 25 P. 242  - 259 SL.ES Chapter 13 Volume 25 P. 242  - 259

		Id-Direttiva tal-Kummissjoni 2000/33/KEtal-25 ta' April 2000li tadatta għall-progress tekniku għas-sebgħa u għoxrin darba d-Direttiva 67/548/KEE rigward l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-disposizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta' sustanzi perikolużi [1](Test b'rilevanza għaż-ŻEE)IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ,Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea,Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE tas-27 ta' Ġunju 1967 rigward l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-disposizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta' sustanzi perikolużi [2], kif l-aħħar emendata bid-Direttiva tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 1999/33/KE [3], u partikolarment l-Artikolu 28 tagħha,Billi:(1) L-Anness V tad-Direttiva 67/548/KEE jippreskrivi l-metodi għad-determinazzjoni tal-propjetajiet fiżiko-kimiċi, tossiċità u ekotossiċità tas-sustanzi u preparazzjonijiet. Huwa meħtieġ li dak l-Anness ikun addattat għall-progress tekniku.(2) Skond l-Artikolu 7(2) tad-Direttiva tal-Kunsill 86/609/KEE ta' l-24 ta' Novembru 1986 fuq l-approssimazzjoni tal-liġijiet, ir-regolamenti u d-disposizzjonijiet amministrattivi ta' l-Istati Membri dwar il-protezzjoni ta' annimali użati għall-finijiet sperimentali u xjentifiċi oħra [4], m'għandux isir esperiment li jinvolvi l-użu ta' annimali jekk metodu xjentifikament sodisfaċenti ieħor biex jinkiseb ir-riżultat imfittex huwa disponibbli raġonevolment u b'mod prattikabbli.(3) Il-Kummissjoni fi ħsieba tintroduċi fl-Anness V tad-Direttiva 67/548/KEE ċerti metodi ta' testjar alternattivi li ma jinvolvux l-użu ta' annimali, sabiex tagħmilhom disponibbli għall-ittestjar ta' kimiċi skond l-Artikolu 3(1) tad-Direttiva 67/548/KEE.(4) Il-miżuri previsti f'din id-Direttiva huma skond l-opinjoni tal-Kumitat għall-Addattament mal-Progress Tekniku tad-Direttivi dwar it-Tneħħija ta' l-Ostakoli Tekniċi Għall-Kummerċ f'Sustanzi u Preparazzjonijiet Perikolużi,ADOTTAT DIN ID-DIRETTIVA:Artikolu 1It-testi fl-Annessi I u II għal din id-Direttiva huma miżjuda mal-Parti B ta' l-Anness V tad-Direttiva 67/548/KEE.Artikolu 21. L-Istati Membri għandhom idaħħlu fis-seħħ il-liġijiet, ir-regolamenti u d-disposizzjonijiet amministrattivi meħtieġa sabiex jikkonformaw ma' din id-Direttiva mhux iktar tard mill-1 ta' Ottubru 2001. Għandhom jgħarrfu lill-Kummissjoni b'dan minnufih.Meta l-Istati Membri jadottaw dawn id-disposizzjonijiet, dawn għandhom ikollhom riferenza għal din id-Direttiva jew għandhom ikunu akkumpanjati b'din ir-riferenza fl-okkażjoni tal-pubblikazzjoni uffiċjali tagħhom. L-Istati Membri għandhom jistabbilixxu kif għandha ssir din ir-riferenza.2. L-Istati Membri għandhom jikkomunikaw lill-Kummissjoni d-disposizzjonijiet ewlenin tal-liġi nazzjonali li huma jadottaw fil-qasam kopert b'din id-Direttiva u tabella ta' korrelazzjoni bejn din id-Direttiva u d-disposizzjonijiet nazzjonali adottati.Artikolu 3Din id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fit-tielet jum wara l-pubblikazzjoni tagħha fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej.Artikolu 4Din id-Direttiva hija indirizzata lill-Istati Membri.Magħmula fi Brussel, fil-25 ta' April 2000.Għall-KummissjoniMargot WallströmMembru tal-Kummissjoni[1] Adottata qabel is-26 addattament.[2] ĠU C 196, tas-16.8.1967, pġ. 1.[3] ĠU L 199, tat-30.7.1999, pġ. 57.[4] ĠU L 358, tat-18.12.1986, pġ. 1.--------------------------------------------------ANNESS I"B.40. KORRUŻJONI TAL-ĠILDA1. METODU1.1. IntroduzzjoniŻewġ provi in vitro għall-korrużività tal-ġilda, il-prova tar-resistenza transkutanea elettrika tal-ġilda tal-far u prova li tuża mudell ta' ġilda tal-bniedem, ġew approvati bħala xjentifikament validi miċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM, Ċentru ta' Riċerka Konġunta, Kummissjoni Ewropea) (1) (2) (3). L-istudju ta' validazzjoni ECVAM wera li ż-żewġ provi kienu jistgħu jiddiskriminaw b'mod affidabbli bejn korrużivi tal-ġilda u dawk li m'humiex. Barra dan, il-protokoll tal-prova bbażat fuq mudell tal-ġilda tal-bniedem ippermetta distinzjoni korretta bejn gradi ta' effetti korrużivi (korrożivi tal-ġilda severi magħrufa, R35, u korrużivi oħra tal-ġilda, R34) (2). Qed jingħataw id-deskrizzjoni u l-proċeduri għaż-żewġ provi; l-għażla ta' liema prova tintuża tiddependi fuq ħtiġiet speċifiċi u l-preferenzi ta' l-utent.Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali, Parti B.1.2. DefinizzjonijietKorrużjoni tal-ġilda: Il-produzzjoni ta' ħsara irriversibbli fit-tessut fil-ġilda wara l-applikazzjoni ta' materjal ta' prova.1.3. Sustanzi ta' ReferenzaXejn speċifikat, imma ara l-punti 1.5.3.4 u 1.7.2.3.1.4. Prinċipju tal-metodu tal-prova – ġilda tal-far prova TERIl-materjal tal-prova huwa applikat sa 24 siegħa lill-uċuħ epidermiċi ta' diski tal-ġilda meħuda mill-ġlud ta' firien għadhom żgħar maqtula umanament. Materjali korrużivi huma identifikati bl-abbiltà tagħhom li jipproduċu telf ta' funzjoni ta' l-integrità normali ta' l-istrat korneju u l-funzjoni protettiva, li huwa mkejjel bħala tnaqqis fit-TER inerenti taħt livell tal-limitu (5 k Ω)(4)(5). Materjali irritanti u mhux irritanti ma jnaqqsux it-TER taħt il-livell tal-limitu. Pass fejn jintrabat il-kulur jista' jkun inkorporat fil-proċedra tal-prova għall-aġenti tensioattivi u organiċi newtri (għad-definizzjoni ara r-referenza (6)) biex jitnaqqas in-numru ta' riżultati pożittivi foloz miksuba speċifikatament ma' dawn it-tipi kimiċi (2) (7).1.5. Deskrizzjoni tal-metodu tal-prova – prova TER tal-ġilda tal-far1.5.1. AnnimaliFirien għadhom żgħar (20-23 jum) (razza Wistar jew simili) huma meħtieġa għall-preparazzjoni ta' diski tal-ġilda. Is-suf tad-dahar u tal-ġnub jitneħħa b'attenzjoni bi klippers ta' l-annimali żgħar. L-annimali huma mbagħad maħsula billi jintmesħu b'attenzjoni, waqt li ż-żona titniżżel f'soluzzjoni antibiotika (li jkollha, per eżempju, streptomycin, peniċillina, chloramphenicol u amphotericin f'konċentrazzjonijiet effettivi biex jinibixxu li tikber il-batterja). L-annimali jerġgħu jinħaslu bl-antibiotiċi fit-tielet jew ir-raba' jum wara l-ewwel ħasla, u jintużaw fi tlett ijiem (l-annimali m'għandhomx ikunu akbar minn 31 jum għall-preparazzjoni tal-ġilda).1.5.2. Preparparazzjoni tad-diski tal-ġildaL-annimali jinqatlu umanament. Il-ġilda tad-dahar ta' kull annimal hija mbagħad imneħħija u mnaddfa minn xaħam żejjed billi jitneħħa b'attenzjoni mill-ġilda. Il-ġilda titpoġġa fuq it-tarf ta' tubu tal-polytetrafluoroethylene (PTFE), waqt li jkun żgurat li l-wiċċ epidermiku huwa f'kuntatt mat-tubu. "O" ring tal-gomma jitpoġġa ssikkat fuq it-tarf tat-tubu biex iżomm il-ġilda fil-post u t-tessut fl-eċċess jitneħħa. Id-dimensjonijiet tat-tubu u ta' l-"O" ring jidhru fil-Figura 1. L-"O" ring tal-gomma huwa mbagħad issiġġillat b'attenzjoni fit-taf tat-tubu PTFE b'ġeli tal-pitrolju. It-tubu jintrifed bi klipp bil-molla ġewwa kamra tar-reċipjent li jkollha soluzzjoni tas-sulfat tal-manjeżju (154 mM) (Figura 2).1.5.3. Proċedura tal-prova1.5.3.1. Applikazzjoni tal-materjal tal-provaSustanzi tal-prova likwidi (150 μl) jiġu applikati lill-wiċċ epidermiku ġewwa t-tubu (Figura 2). Meta jkunu ppruvati materjali solidi, jiġi applikat ammont biżżejjed tas-solidu lid-diska biex ikun żgurat li l-wiċċ sħiħ ta' l-epidermidi jitgħatta. Ilma dejonizzat (150 μl) huwa mbagħad miżjud fuq is-solidu u t-tubi huma mċaqalqa bil-mod. Is-sustanzi tal-prova għandhom ikollhom il-kuntatt massimu mal-ġilda. Għal xi solidi dan jista' jintlaħaq bit-tisħin sa 30°Ċ biex tinħall is-sustanza tal-prova, jew bit-tħin biex ikun prodott materjal granulari jew trab.Tliet diski tal-ġilda jintużaw għal kull sustanza tal-prova. Is-sustanzi tal-prova huma applikati għall-24 siegħa (ara ukoll 1.5.3.4). Is-sustanza tal-prova hija mneħħija bil-ħasil b'ġett ta' ilma mill-vit sa 30°Ċ sakemm ma jkunx jista' jitneħħa materjal ieħor. It-tneħħija ta' sustanzi tal-prova li ssolidifikaw fit-tubu tista' tkun faċilitata bil-ħasil b'ġett tal-misħun bejn wieħed u ieħor 30°Ċ.1.5.3.2. Miżuri TERIt-TER huwa mkejjel bl-użu ta' vultaġġ baxx, databridge ta' kurrent alternat (eż AIM 401 jew 6401, jew ekwivalenti). Qabel ma titkejjel ir-resistenza elettrika, it-tensjoni tal-wiċċ tal-ġilda titnaqqas billi jiżdied volum biżżejjed ta' 70 % etanol biex ikopri l-epidermidi. Wara ftit sekondi l-etanol huwa mneħħi billi jinqaleb it-tubu, u mbagħad it-tessut huwa idradat biż-żieda ta' 3ml soluzzjoni tas-sulfat tal-manjeżju (154 mM). L-elettrodi tad-databridge jitqiegħdu f'kull ġenb tad-diska tal-ġilda biex jittieħed il-kejl tar-resistenza kΩ/disk tal-ġilda (Figura 2). Id-dimensjonijiet ta' l-elettrodu u t-tul ta' l-elettrodu espost taħt il-crocodile clips jidhru fil-Figura 1. Il-klipp ta' ġewwa (oħxon) ta' l-elettrodu jitqiegħed fuq il-wiċċ tat-tubu PTFE matul il-kejl tar-resistenza, biex ikun żgurat li tul konsistenti ta' l-elettrodu huwa mdaħħal fis-soluzzjoni tas-sulfat tal-manjeżju. L-elettrodu ta' barra (irqiq) huwa mqiegħed ġewwa l-kamra riċeventi biex isserraħ fuq il-qiegħ. Id-distanza bejn il-qiegħ tal-klipp bil-molla u l-qiegħ tat-tubu PTFE jinżamm bħala kostanti (Figura 1), billi din id-distanza taffettwa l-valur tar-resistenza miksuba.Innota li jekk il-valur tar-resistenza mkejla huwa akbar minn 20 kΩ dan jista' jkun minħabba li s-sustanza tal-prova tiksi l-wiċċ epidermiku tad-diska tal-ġilda. It-tneħħija ta' din il-kisja tista' tkun ippruvata, per eżempju, bl-issiġillar tat-tubu PTFE b'behem gwantat imċaqlaq għal madwar 10 sekondi; is-soluzzjoni tas-sulfat tal-manjeżju titneħħa u l-kejl tar-resistenza tiġi ripetuta b'sulfat tal-manjeżju ġdid.Ir-riżultati TER medji huma aċċettati bil-kondizzjoni li valuri tal-kontroll pożittivi u negattivi jaqgħu fil-meded aċċettabbli għall-metodu. Is-sustanzi tal-kontroll issuġġeriti u l-meded ta' resistenża assoċjati aċċettabbli għall-metodoloġija u l-apparat deskritt huma:Kontroll | Sustanza | Medda ta' resistenza (KΩ) |Pożittiv | 10 M aċtu idrokloriku (36 %) | 0,5-1,0 |Negattiv | Ilma distillat | 10-25 |1.5.3.3. Proċedura modifikata għall-agenti tensioattivi u organiċi newtriJekk il-valuri TER tas-sustanzi tal-prova li huma jew aġenti tensioattivi u organiċi newtri huma anqas minn jew daqs 5 kΩ tista' ssir valutazzjoni ta' kemm ippenetra l-kulur fuq it-tessuti. Din il-proċedura għandha tiddetermina jekk ir-riżultati huma pożittivi foloz (2).1.5.3.3.1. Applikazzjoni tal-kulur Sulforhodamine B u tneħħijaWara t-trattament tal-bidu bis-sustanza tal-prova, 150 μl ta 10 % (w/v) hija applikata dilwizzjoni ta' kulur sulforhodamine B f'ilma distillat lill-wiċċ epidermiku ta' kull diska tal-ġilda għal sagħtejn. Id-diski tal-ġilda huma mbagħad maħsula b'ġett ta' l-ilma sat-temperatura ambjentali għal madwar 10 sekondi biex jitneħħa l-kulur fl-eċċess/li ma jkunx qabad. Kull diska tal-ġilda titneħħa b'attenzjoni mit-tubu PTFE u titpoġġa f'kunjett (eż kunjett tal-ħġieġ xintillanti) li jkollu ilma dejonizzat (8 ml). Il-kunjetti jitħawdu bil-mod għall-5 minuti biex jitneħħa l-kulur fl-eċċess/li ma jkunx qabad. Il-proċedura tat-tlaħliħ hija mbagħad imtennija, u wara dan id-diski tal-ġilda jitneħħew u jitpoġġew f'kunjetti li jkollhom 5 ml ta' 30 (w/v) sulfat tas-sodju dodecyl (SDS) fl-ilma distillat u huma inkubati mal-lejl f'60° Ċ. Wara l-inkubazzjoni, kull diska tal-ġilda titneħħa u titwarrab u s-soluzzjoni li jifdal hija ċentrifugata għal 8 minuti f'21° Ċ (forza ċentrifuga ġsim ħ 175). Kampjun ta' 1 ml tas-supernatant huwa mbagħad mħallat 1 f'5 (v/v) (jiġifieri 1 ml + 4 ml) ma' 30 % (w/v) SDS f'ilma distillat. Id-densità ottika (OD) tas-soluzzjoni hija mkejla f'madwar 565 nm),1.5.3.3.2. Kalkolu tal-kontenut tal-kulurIl-kontenut tal-kulur sulforhodamine B kull diska huwa kkalkolat mill-valuri OD (koeffiċjent molari kulur sulforhodamine B f'565 nm = 8,7 7 × 104; piż molekolari = 580). Il-kontentut tal-kulur sulforhodamine B huwa ddeterminat għal kull diska tal-ġilda u kontenut tal-kulur medju huwa mbagħad ikkalkolat għar-replikati. Ir-riżultati tal-kulur medji huma aċċettati bil-kondizzjoni li valuri tal-kontroll konkorrenti jaqgħu fil-meded aċċettabbli għall-metodu. Il-meded tal-kontenut tal-kulur suġġeriti aċċettabbli għas-sustanzi ta' kontroll għall-metodoloġija u l-apparat deskritt huma:Kontroll | Sustanza | Medda tal-kontenut tal-kulur (μg/diska) |Pożittiv | 10 M aċtu idrokloriku (36 %) | 40-100 |Negattiv | Ilma distillat | 15-35 |1.5.3.4. Informazzjoni addizzjonaliSustanzi tal-prova jistgħu jkunu applikati wkoll lid-diski tal-ġilda għall-perjodi aqsar (eż sagħtejn) biex ikunu identifikati dawk il-materjali li huma korrużivi severament. Iżda, fl-istudju ta' validazzjoni, il-prova TER instabet li stmat iżżejjed il-potenzjal korrużiv ta' diversi kimiċi tal-prova wara l-applikazzjoni tagħhom lid-diski tal-ġilda għal sagħtejn (2), għalkemm ippermettiet l-identifikazzjoni korretta tal-korrużivi u dawk li m'humiex wara applikazzjoni ta' 24 siegħa.Il-proprjetajiet u d-dimensjonijiet ta' l-apparat tal-prova u l-proċedura sperimentali użata tista' tinfluwenza l-valuri TER miksuba. Il-limitu korrużiv 5 k Ω kien żviluppat minn data miksuba b'apparat speċifiku u l-proċedura deskitta f'dan il-metodu. Valuri differenti tal-limitu u tal-kontroll jistgħu japplikaw jekk il-kondizzjonijiet tal-prova jitbiddlu b'mod sinifikanti. Għalhekk, huwa rakkomandat li l-metodoloġija u l-valur tal-limitu tr-resistenza huma kalibrati billi jkunu pruvati serje ta' standards magħżula mill-kimiċi użati fl-istudju tal-validazzjoni (3).1.6. Prinċipju tal-metodu tal-prova – prova tal-mudell tal-ġilda tal-bniedemIl-materjal ta' prova huwa applikat topikament sa mhux iżjed minn 4 siegħat lill-mudell tal-ġilda tri-dimensjonali, li jikkomprendi epidermini rikostruwita bi strat korneju funzjonali. Materjali korrużivi huma identifikati bl-abbiltà tagħhom li jipproduċu tnaqqis fil-vitalità taċ-ċellula (kif determinat, per eżempju, bl-użu tal-prova ta' tnaqqis MTT) taħt il-livelli tal-limitu definiti f'perjodi speċifikati ta' espożizzjoni. Il-prinċipju tal-prova huwa skond l-ipotesi li kimiċi li huma korrużivi huma dawk li jistgħu jippenetraw l-istrat korneju (bid-diffużjoni jew l-erożjoni) u huma biżżejjed ċitotossiċi biex jikkawżaw il-mewt taċ-ċelloli fis-saffi taċ-ċelloli ta' taħt.1.7. Deskrizzjoni tal-metodu tal-prova – prova tal-mudell tal-ġilda tal-bniedem1.7.1. Mudelli tal-ġilda tal-bniedemIl-mudelli tal-ġilda tal-bniedem jistgħu jiġu minn diversi sorsi, imma għandhom iħarsu ċerti kriterji. Il-mudell għandu jkollu strat korneju funzjonali b'saff taħt ta' ċelloli ħajjin. Il-funzjoni protettiva ta' l-istrat korneju għandha tkun adegwata. Dan jista' jintwera billi tkun spjegata r-resistenza tal-mudell għaċ-ċitotossiċità wara l-applikazzjoni tas-sustanzi li huma magħrufa li huma ċitotossiċi għaċ-ċelloli, imma li normalment jgħaddu mill-istrat korneju. Il-mudell għandu jintwera li jagħti riżultati riproduċibbli taħt kondizzjonijiet sperimentali definiti.Il-vitalità ta' ċelloli ħajjin fil-mudell għandha tkun għolja biżżejjed li tiddiskrimina sewwa bejn is-sustanzi ta' kontroll pożittivi u negattivi. Il-vitalità taċ-ċellula (per eżempju, kif imkejla bl-ammont ta' tnaqqis MTT, jiġifieri valur OD) wara l-espożizzjoni għal sustanzi ta' kontroll negattivi għandhom jaqgħu f'limiti aċċettabbli għall-mudell partikolari. Similment, il-valuri tal-vitalità taċ-ċellola mas-sustanza tal-kontroll pożittiv (fir-rigward ta' dawk għall-kontroll negattiv) għandhom jaqgħu fil-limiti speċifiċi. Aktar importanti, il-mudell ta' tbassir użat għandu jintwera li jħares l-istandard ta' validazzjoni internazzjonali (2).1.7.2. Proċedura tal-prova1.7.2.1. Applikazzjoni tal-materjal tal-provaGħall-materjali likwidi, għandha tkun applikata sustanza tal-prova suffiċjenti biex tgħatti l-wiċċ tal-ġilda (minimu ta' 25 μl/ċm2). Għall-materjali solidi, għandha tkun applikata sustanza tal-prova suffiċjenti mal-ġilda, imbagħad għandha tixxarrab biex tiżgura kuntatt tajjeb mal-ġilda; fejn xieraq, is-solidi għandhom jintaħnu fi trab qabel l-applikazzjoni. Il-metodu ta' applikazzjoni għandu jintwera li jkun biżżejjed għal firxa kbira ta' tipi kimiċi (2). Fit-tmiem tal-perjodu ta' l-espożizzjoni, il-materjal tal-prova għandu jkun maħsul b'attenzjoni mill-wiċċ tal-ġilda b'soluzzjoni salina.1.7.2.2. Kejl tal-vitalità taċ-ċellulaKull metodu kwantitattiv, validat jista' jintuża biex ikejjel il-vitalità taċ-ċellula. Il-prova użata l-aktar spiss hija tnaqqis MTT, li ntweriet li tagħti riżultati preċiżi u riproduċibbli f'diversi laboratorji (2). Id-diska tal-ġilda hija mpoġġija f'soluzzjoni MTT ta' 0,3 mg/ml f'20-28°Ċ għal tliet siegħat Il-prodott preċipitat ikħal formazan huwa mbagħad estratt (estrazzjoni tas-solvent) u l-konċentrazzjoni tal-formazan hija mkejla bid-determinazzjoni ta' l-OD f'wavelength bejn 545 u 595 nm.1.7.2.3. Informazzjoni addizzjonaliIl-mudell tal-ġilda użat, u l-protokoll eżatt tal-ħin ta' l-espożizzjoni u l-proċeduri ta' ħasil, eċċ. għandhom ikollhom impatt maġġuri fuq ir-riżultati tal-vitalità taċ-ċellola. Huwa rakkomandat li l-metodoloġija u l-mudell ta' tbassir huma kalibrati bil-prova ta' serje ta' standards ta' referenza magħżula mill-kimiċi użati fl-istadju tal-validazzjoni tal-ECVAM (3). Huwa kritiku li l-metodu użat intwera li huwa riproduċibbli ġewwa u bejn laboratorji għal firxa kbira ta' kimiċi, skond l-istandards internazzjonali. Bħala minimu, il-metodu għandu jħares il-kriterji għall-validità xjentifika definiti qabel (2), u r-riżultati ta' dan l-istudju ta' validazzjoni għandu jkun ippubblikat f'ġurnal xjentifiku rivedut qalb pari.2. DATA2.1. Trattament tar-riżultati2.1.1. Prova TER fuq il-ġilda tal-farValuri ta' resistenza (kΩ) għall-materjal tal-prova, kontrolli pożittivi u negattivi, u kull kimika standard ta' referenza għandhom ikunu rapportati f'forma tabulata, inkluż data għall-esperimenti replikati/ripetuti, valuri medji u l-klassifikazzjoni derivata.2.1.2. Mudelli tal-ġilda tal-bniedemValuri OD u data tal-perċentwal kalkolat fuq il-vitalità taċ-ċellula għall-materjal tal-prova, kontrolli pożittivi u negattivi, u kull kimika standard ta' referenza għandhom ikunu rapportati f'forma tabulata, inkluż data għall-esperimenti replikati/ripeturi, valuri medji u l-klassifikazzjoni derivata.2.2. Valutazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati2.2.1. Prova TER fuq il-ġilda tal-farJekk il-valur medju TER miksub għas-sustanza tal-prova huwa akbar minn 5 kΩ mela mhux korrużiva. Jekk il-valur TER huwa anqas minn jew ugwali għal 5 kΩ u s-sustanza tal-prova mhux surfactant jew organiku newtru, mela hija korrużiva.Għas-surfactants jew organiċi newtri li jagħtu valuri TER anqas minn jew daqs 5 kΩ tista' ssir il-penetrazzjoni tal-kulur. Jekk il-kontenut tal-kulur medju tad-diska huwa akbar minn jew daqs il-kontenut medju tad-diska tas-36 % HCI kontroll pożittiv miksub konkorrentement, mela s-sustanza tal-prova hija pożittiva vera u għalhekk korrużiva. Jekk il-kontenut medju tal-kulur tad-diska huwa anqas mill-kontenut medju tad-diska tas-36 % HCI kontroll pożittiv miksub konkorrentement, mela s-sustanza tal-prova hija pożittiva falza u għalhekk mhux korrużiva.2.2.2. Prova tal-mudell tal-ġilda tal-bniedemIl-valur OD ta' kontroll negattiv jirrappreżenta 100 % tal-vitalità taċ-ċellola; għalhekk, il-valuri OD miksuba għal kull kampjun tal-prova jista' jintuża biex ikun kalkolat il-perċentwal tal-vitalità relattiva għall-kontroll negattiv. Il-perċentwal kritiku tal-valur tal-vitalità taċ-ċellola jiddistingwi materjali tal-prova korrużivi minn dawk li m'humiex (jew jiddiskrimina bejn klassijiet differenti korrużivi) għandu jkun definit b'mod ċar fil-mudell ta' tbassir qabel ma l-metodu ikun validat, u l-istudju ta' validazzjoni sussegwenti għandu juri li l-valur kritiku huwa xieraq (2).3. RAPPORTAĠĠRapport tal-provaIr-rapport tal-prova għandu mill-inqas ikollha t-tagħrif li ġej:Sustanza tal-prova:- data ta' identifikazzjoni, natura fiżika u, meta rilevanti, propjetajiet fizikokimiċi. Informazzjoni simili għandha tkun ipprovduta għall-sustanzi ta' referenza, jekk użati.Kondizzjonijiet tal-prova:- dettalji tal-proċedura tal-prova użata,- deskrizzjoni u ġustifikazzjoni ta' kull modifika.Riżultati:- tabulazzjoni ta' valuri ta' resistenza (prova TER) jew valuri tal-perċentwal tal-vitalità taċ-ċellola (prova tal-mudell tal-ġilda tal-bniedem) għall-materjal tal-prova, kontrolli pożittivi u negattivi u kull kimika ta' riferenza standard, inkluż data għal sperimenti replikati/ripetuti u valuri medji,- deskrizzjoni ta' kull effett ieħor osservat.Diskussjoni tar-riżultati:Konklużjonijiet.4. RIFERENZI(1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, pp. 275-280.(2) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.(3) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P. & Worth, A.P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, pp. 471-482.(4) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test - modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, pp. 507-512.(5) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, pp. 191-194.(6) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, pp. 709-720.(7) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. Ir-rapport u r-rakkomandazzjonijiet tal-workshop ECVAM 6, ATLA 23, pp. 219-255.+++++ TIFF +++++Figure 1+++++ TIFF +++++Figure 2"--------------------------------------------------ANNESS II"B.41. FOTOTOSSIĊITÀ – PROVA IN VITRO 3T3 NRU TAL PROVA TAT-TOSSIĊITÀ1. METODU1.1. IntroduzzjoniIl-fototossiċità hija definita bħala rispons tossiku li jiġi wara l-ewwel espożizzjoni tal-ġilda ma' ċerti kimiċi u l-espożizzjoni sussegwenti għad-dawl, jew hija indotta similment bl-irradjazzjoni tal-ġilda wara l-amministrazzjoni sistemika ta' kimika.Informazzjoni miġjuba mill-prova ta' tossiċità in vitro 3T3 NRU isservi biex tidentifika l-potenzjal fototossiku ta' sustanza tal-prova, jiġifieri l-eżistenza jew in-nuqqas ta' perikoli possibbli li x'aktarx jinqalgħu minn sustanza ta' prova flimkien ma' l-espożizzjoni għall-UV u dawl visibbli.Billi l-punt finali tossikoloġiku tal-prova in vitro hija d-determinazzjoni tal-fototossiċità, indotta bl-azzjoni kombinata ta' kimika u d-dawl, komposti li huma fototossiċi in vivo wara l-applikazzjoni sistemika u d-distribuzzjoni mal-ġilda, kif ukoll komposti li jaġixxu bħala fotoirritanti wara applikazzjoni topika mal-ġilda, jista' jkun identifikat bil-prova.Il-prova in vitro 3T3 NRU kienet żviluppata u validata f'proġett konġunt EU/COLIPA mill-1992-1997 (1) (2) (3), biex tkun stabbilita alternattiva valida in vitro għad-diversi provi in vivo użati. Fl-1996 workshop ta' l-OECD irrakkomanda prova sekwenzjali in vitro għall-valutazzjoni tal-fototossiċità (4).Riżultati mill-prova ta' fototossiċità in vitro 3T3 NRU meta paragunati ma' effetti akuti in vivo ta' fototossiċità/fotoirritazzjoni fl-annimali u l-bnedmin, u l-prova ntweriet li tagħti tbassir eċċellenti għal dawn l-effetti. Il-prova mhux imfassla li tbassar effetti oħra ħżiena li jistgħu jinqalgħu mill-azzjoni maqgħuda ta' kimika u dawl, eż fotoġenotossiċità, fotoallerġija, u fotokanċeroġeniċità, għalkemm ħafna kimiki li juru dawn il-proprjetajiet speċifiċi għandhom jirreaġixxu pożittivament fil-prova ta' fototossiċità 3T3 NRU in vitro. Barra dan, il-prova mhix iddisinjata biex tippermetti stima tal-qawwa fototossika.Approċċ sekwenzjali għall-prova fototossika tal-kimiċi huwa provdut fl-Appendiċi.1.2. DefinizzjonijietIrradjament: l-intensità ta' dawl ultravjola (UV) jew visibbli li jaqa' fuq wiċċ, imkejjel f'W/m2 jew mW/cm2.Doża ta' dawl: il-kwantità (= intensità ħin) ta' radjazzjoni ultravjola (UV) jew viżibbli li jaqa' fuq wiċċ, espress f'Joules (= Wx s) kull erja tal-wiċċ, eż UJ/m2 jew Jċm2.Wavebands tad-dawl UV: l-indikazzjonijiet rakkomandati mill-CIE (Commission Internationale de L'Eclairage) huma: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) u UVC (100-280 nm). Indikazzjonijiet oħra huma użati wkoll: id-diviżjoni bejn UVB u UVA titpoġġa ta' spiss f'320nm, u l-UVA tista' tiqasam f'UV-A1 u UV-A2 b'diviżjoni magħmula f'320 nm.Vitalità taċ-ċellola parametru li jkejjel l-attività totali ta' popolazzjoni taċ-ċelloli (eż. teħid tal-kulur vitali aħmar newtru fil-lisożomi ċellulari) li, waqt li jiddependi fuq il-punt tat-tmiem mkejjel u d-disinn tal-prova użata, jikkorrelata man-numru totali u/jew il-vitalità taċ-ċelloli.Vitalità relattiva taċ-ċellola vitalità espressa fir-rigward ta' kontrolli negattivi (solventi) li għaddew matul il-proċedura sħiħa tal-prova (jew + UV jew – UV), imma mhux trattati b'kimika ta' prova.Mudell ta' tbassir: algoritmu użat biex ikunu trasformati r-riżultati tal-prova tat-tossiċità f'tbassir tal-potenzjal tossiku. Fil-linja ta' gwida preżenti tal-prova, PIF u MPE jistgħu jintużaw għat-trasformazzjoni tar-riżultati tal-prova ta' fototossiċità in vitro 3T3 NRU fi tbassir ta' potenzjal fototossiku.PIF (fattur ta' irritazzjoni tad-dawl) fattur ġenerat billi jkunu paragonati żewġ konċentrazzjonijiet ċitotossiċi ugwalment effettivi (EC50) tal-prova kimika miksuba fin-nuqqas (-UV) u fil-presenza (+ UV) ta' irradjazzjoni mhux ċitotossika bid-dawl UVA/vis.MPE (effett medju tad-dawl) miżura ġdida misluta minn analiżi matematika tal-forma kompleta ta' żewġ kurvi ta' risposta ta' konċentrazzjoni miksuba fin-nuqqas (-UV) u fil-preżenza (+ UV) ta' irradjazzjoni mhux ċitotossika bid-dawl UVA/vis.Fototossiċità: Il-fototossiċità hija definita bħala rispons tossiku li jiġi wara l-ewwel espożizzjoni tal-ġilda għal ċerti kimiċi u l-espożizzjoni sussegwenti għad-dawl, jew hija indotta similment bl-irradjazzjoni tal-ġilda wara l-amministrazzjoni sistemika ta' kimika.Fotoirritazzjoni subspeċi tal-kelma "fototossiċità", li hija użata biex tiddeskrivi biss dawk ir-reazzjonijiet fototossiċi li huma prodotti fil-ġilda wara l-espożizzjoni għall-kimiċi (topikament jew oralment). Dawn ir-reazzjonijiet fototossiċi jwasslu għall-ħsara mhux speċifika taċ-ċellola (reazzjonijiet bħal ħruq mix-xemx).Fotoallerġija: reattività immunoloġika miksuba, li ma sseħħx fl-ewwel trattament bil-kimika u d-dawl, u għandha bżonn ta' perjodu ta' induzzjoni ta' ġimgħa jew ġimgħatejn qabel ma tidher ir-reattività tal-ġilda.Fotoġenotossiċità: risposta ġenotossika osservata b'punt finali ġenetiku, li tiġri wara l-espożizzjoni taċ-ċelloli għal doża mhux ġenotossika ta' dawl UV/viżibbli u kimika mhux ġenotossika.Fotokanċerinoġeniċità: kanċeroġeniċità indotta bl-applikazzjoni ripetuta ta' dawl u kimika. Il-kliem "foto ko-kanċeroġeniċità", huwa użat jekk it-tumoriġenesi indotta bl-UV tiżdied b'kimika.1.3. Sustanzi ta' riferenzaMinbarra l-kimika ta' kontroll pożittiv chlorpromazine li għandha tkun ipprovata konkorrentement f'kull prova, biex tkun stabbilita l-prova ta' fototossiċità 3T3 NRU huwa rakkomandat li jintużaw bħala kimiċi ta' referenza subsett mill-kimiċi użati fil-provi tal-laboratorju bil-prova preżenti (1) (3) (13).1.4. Konsiderazzjonijiet inizjaliĦafna tipi ta' kimiċi ġew irrapportati li jinduċu effetti fototossiċi (5) (6) (7) (8). L-unika karatteristika komuni hija l-abbiltà tagħhom li jassorbu l-enerġija fir-reġjun tad-dawl tax-xemx. Skond l-ewwel liġi tal-fotokimika (liġi Grotthaus-Draper) il-fotoreazzjoni teħtieġ assorbiment biżżejjed ta' kwanta tad-dawl. Għalhekk, qabel ma tkun kkunsidrata l-prova bijoloġika skond il-linja ta' gwida preżenti tal-prova, għandu jkun determinat l-ispettru ta' l-assorbiment UV/vis tal-kimika tal-prova (eż. skond il-Prova Linja ta' Gwida OECD 101). Jekk il-koeffiċjent ta' l-estinzjoni/assorbiment huwa anqas minn 10 litri × mol-1 × ċm-1, il-kimika ma għandha l-ebda potenzjal fotoreattiv u m'għandhiex għalfejn tkun provata fil-prova tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU jew kull prova bijoloġika oħra għall-effetti ħżiena fotokimiċi (Appendiċi).1.5. Prinċipju tal-metodu tal-provaErba' mekkaniżmi ġew identifikati li bihom l-assorbiment tad-dawl b'kromofor (kimiku) jista' jirriżulta f'risposta fototossika (7). Kollha kemm huma jirriżultaw fi ħsara fiċ-ċellola. Għalhekk, il-prova ta' fototossiċità in vitro 3T3 NRU hija bbażata fuq paragun ta' ċitotossiċità ta' kimika meta ppruvata fil-presenza u fl-assenza ta' espożizzjoni għal doża mhux ċitotossika ta' dawl UVA/vis. Iċ-ċitotossiċità ta' din il-prova hija espressa bħala konċentrazzjoni li tiddependi fuq it-tnaqqis ta' l-assorbiment tal-kulur vitali aħmar newtrali (NR) (9) 24 siegħa wara t-trattament mal-kimika tal-prova u l-irradjazzjoni.Ċelloli Balb/c 3T3 huma mantenuti fil-kultura għall 24 siegħa għall-formazzjoni tal-monostrati Żewġ 96-well plates kull test kimiku huwa mbagħad preinkubat b'tmien konċentrazzjonijiet differenti għal kimika għal 1 s. Imbagħad waħda miż-żewġ pjanċi hija esposta għal doża ta' dawl UVA/vis mhix ċitotossika ta' 5 J/ċm2 UVA (speriment + UV), waqt li l-pjanċa l-oħra tinżamm fid-dlam (speriment -UV). Fiż-żewġ pjanċi, il-mezz ta' trattament huwa mbagħad mibdul b'mezz ta' kultura u wara 24 s oħra ta' inkubazzjoni, tkun determinta l-vitalità taċ-ċellola bl-uptake newtrali ta' l-aħmar (NRU) għal 3 s. Il-vitalità relattiva taċ-ċellola, espressa bħala perċentwal tal-kontrolli negattivi mhux trattati, hija kkalkolata għal kull wieħed mit-tmien konċentrazzjonijiet tal-prova. Biex jitbassar il-potenzjal fototossiku, ir-risposti tal-konċentrazzjoni miksuba fil-preżenza ta' (+ UV) u fin-nuqqas (-UV) ta' irradjazzjoni huma paragunati, is-soltu fil-livell EC50, jiġifieri fil-konċentrazzjoni ta' l-inibizzjoni tal-vitalità taċ-ċellola b'50 % cf ta' kontrolli mhux trattati.1.6. Kriterji ta' kwalitàSensittività UVA taċ-ċelloli, data storika: ċelloli għandhom ikunu verifikati regolarment għas-sensittività ta' l-UVA. Iċ-ċelloli huma miżrugħa fid-densità użata fil-prova tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU, irradjata l-ġurnata ta' wara b'dożi UVA minn 1-9 J/cm2, u l-vitalità taċ-ċellola hija ddeterminata jum wara bl-użu tal-prova NRU. Iċ-ċelloli jilħqu l-kriterju tal-kwalità, jekk il-vitalità tagħhom wara l-irradjazzjoni b'5 J/cm2 UVA mhux anqas minn 80 % tal-vitalità tal-kontrolli fid-dlam. Fl-ogħla doża UVA ta' 9J/cm2, il-vitalità m'għandhiex tkun anqas minn 50 % ta' dak ta' kontrolli fid-dlam. Din il-verifika għandha tkun ripetuta ma' kull għaxar (10) passaġġi taċ-ċelloli.Sensittività UVA taċ-ċelloli ta' kontroll negattiv, prova kurrenti: il-prova tissodisfa l-kriterji ta' kwalità jekk il-kontrolli negattivi (ċelloli fis-soluzjoni bilanċjata Earl (EBSS) b'1 % dimethylsulfoxide (DMSO) jew mingħajrha jew 1 % etanol (EtOH)) fl-esperiment + UVA juru vitalità ta' mhux anqas minn 80 % ta' dak ta' ċelloli mhux irradjati fl-istess solvent ta' l-esperiment konkorrenti fid-dlam (-UVA).Vitalità ta' kontrolli negattivi: id-densità assoluta ottika (OD540 NRU) mkejla fl-estratt NR tal-kontrolli negattivi tindika jekk il-1 × 104 ċelloli miżrugħa kull bir ikunu kibru biż-żmien normali irduppjat matul il-jumejn ta' prova. Prova tilħaq il-kriterji ta' aċċettazzjoni jekk il-medja OD540 NRU ta' kontrolli mhux trattati hi > = 0,2.Kontroll pożittiv: kimika magħrufa fototossika għandha tkun pruvata flimkien ma kull prova ta' fototossiċità in vitro 3T3 NRU. Il-chlorpromazine (CPZ) intużat bħala kontroll pożittiv fl-istudju ta' validazzjoni EU/COLIPA u għalhekk hija rakkomandata. Għal CPZ eżaminata bil-protokoll standard fil-prova ta' fototossiċità in vitro 3T3 NRU, kienu definiti l-kriterji ta' l-aċċettazzjoni tal-prova li ġejjin: CPZ irradjata (+ UVA): EC50 = 0,1 to 2,0 μg/ml, CPZ mhux irradjata (- UVA): EC50 = 7,0 to 90,0 μg/ml. Il-fattur ta' foto irradjazzjoni (PIF), jiġifieri l-ispostament ta' EC50 għandu jkun ta' l-anqas 6.Kimiki oħra fototossiċi magħrufa, xierqa għall-klassi kimika jew karatteristiċi ta' solubbilità tal-kimika tal-prova li qed tkun valutata, jistgħu jintużaw bħala l-kontrolli pożittivi konkorrenti, minflok CPZ. F'dan il-każ, ibbażat fuq id-data storiċi, il-meded tal-valuri EC50 u PIF jew MPE (effett tad-dawl medju) għandhom ikunu definiti b'mod xieraq bħala kriterji ta' aċċettazzjoni għall-prova.1.7. Deskrizzjoni tal-metodu tal-prova1.7.1. Preparazzjonijiet1.7.1.1. ĊelloliLinja permanenti ta' ċelloli fibroblastiċi tal-ġurdien - Balb/c 3T3, klonu 31 – jew minn ATCC jew minn ECACC intużat fl-istudju ta' validazzjoni, u huwa għalhekk rakkomandat. Ċelloli oħra jew linji taċ-ċelloli jistgħu jintużaw b'suċċess ma' l-istess protokoll tal-prova, jekk il-kondizzjonijiet tal-kultura huma addattati għall-bżonnijiet speċifiċi taċ-ċelloli, imma trid tintwera l-ekwivalenza.Iċ-ċelloli għandhom ikunu vverifikati regolarment għan-nuqqas ta' kontaminazzjoni mikroplasma u għandha tintuża biss jekk ir-riżultati ta' din il-verifika kienu sodisfaċenti.Billi s-sensittività UVA taċ-ċelloli tista' tiżdied b'numru ta' passaġġi, celloli Balb/c 3T3 ta' l-iżgħar numru li jista' jinkiseb ta' passaġġ għandhom jintużaw, l-aħjar anqas minn 100. Huwa importanti li s-sensittività UVA taċ-ċelloli Balb/c 33T3 hija vverifikata regolarment skond il-proċedura tal-kontroll ta' kwalità deskritta f'din il-gwida.1.7.1.2. Kondizzjonijiet tal-mezzi u tal-kulturaGħandhom jintużaw għall-passaġġ taċ-ċellola ta' rutina u l-proċedura tal-prova kondizzjonijiet xierqa tal-mezzi tal-kultura u ta' inkubazzjoni. Għal ċelloli BalB/c 3T3, dawn huma miżjuda b'DMEM b'10 % ta' seru ta' għoġol għadu jitwieled, 4nM glutamina, peniċillina u steptomycin; u inkubazzjoni umidifikata f'37 °C/7,5 % CO2. Huwa partikolarment importanti li l-kondizzjonijiet tal-kultura taċ-ċelloli jiżguraw żmien taċ-ċiklu taċ-ċellola fil-medda normali storika taċ-ċelloli jew linja ta' ċelloli użati.1.7.1.3. Preparazzjonijiet tal-kulturiĊelloli minn kulturi ta' stokk iffriżat huma miżrugħa fil-mezz tal-kultura fid-densità xierqa u subkoltivati ta' l-anqas darba qabel ma jintużaw fil-prova in vitro 3T3 NRU ta' fototossiċità.Għall-prova ta' fototossiċità jinżergħu ċelloli fil-mezz tal-kultura f'densità tali li l-kulturi ma jilħqux il-konfluwenza fi tmiem il-prova, jiġifieri meta l-vitalità taċ-ċellola hija determinata 48 s wara li jinżergħu ċ-ċelloli. Għal ċelloli Balb/c 3T3 imkabbra f'96-well plates, 1 × 104 ċellola kull bir hija d-densità rakkomandata taċ-ċellola.Għal kull kimika ta' prova, ċelloli miżrugħa identikament f'żewġ 96-well plates separati, li huma mbagħad meħuda konkorrentement fil-proċedura sħiħa tal-prova taħt kondizzjonijiet tal-kultura identiċi, ħlief għall-perjodu taż-żmien meta waħda mill-pjanċi hija irradjata (+ UVA/vis) u l-oħra tinżamm fid-dlam (-UVA/vis).1.7.1.4. Attivazzjoni metabolikaBilli l-użu ta' sistemi metabolizzanti hija ħtieġa ġenerali għall-provi kollha in vitro għat-tbassir tal-potenzjal ġenotossiku u karċinoġeniku, s'issa, fil-każ ta fototossikoloġija, l-ebda kimika m'hija magħrufa li għaliha tenħtieġ it-trasformazzjoni metabolika għall-kimika biex taġixxi bħala fototossina in vivo jew in vitro. Għalhekk, mhux mitqies la meħtieġ u lanqas xjentifikament ġustifikat għall-prova preżenti li ssir b'sistema metabolika ta' attivazzjoni.1.7.1.5. Kimika tal-prova/preparazzjoniKimiki tal-prova għandhom ikunu ppreparati friski minnufih qabel l-użu, sakemm id-data ta' stabbiltà turi l-aċċettabbiltà tal-ħażna. Il-preparazzjoni taħt dawl aħmar jista' jenħtieġ meta x'aktar tista' tiġri malajr il-fotodegradazzjoni.Il-kimiki tal-prova għandhom jiddewbu f'soluzzjonijiet tal-melħ buffered, eż soluzzjoni bilanċjata Earl, (EBSS) jew phosphate buffered saline (PBS), li, biex ma jkunx hemm interferenza waqt l-irradjazzjoni, għandha tkun ħielsa minn komponenti tal-proteina u kuluri ta' indikatur ph li jassorbu d-dawl.Kimiki tal-prova ta' solubbiltà limitata fl-ilma għandhom jiddewbu f'solventi xierqa fil-konċentrazzjoni finali mixtieqa għal 100 darba u mbagħad dilwita 1:100 bis-soluzzjoni tal-melħ buffered. Jekk jintuża solvent għandu jkun preżenti f'volum kostanti ta' 1 % (v/v) fil-kulturi kollha, jiġifieri fil-kontrolli negattivi kif ukoll fil-konċentrazzjonijiet kollha tal-kimika tal-prova.Id-dimethylsulphoxide (DMSO) u l-etanol (EtOH) huma s-solventi rakkomandati. Jistgħu jkunu xierqa solventi oħra ta' tossiċità baxxa (eż acetone), imma għandhom ikunu valutati bir-reqqa għal proprjetajiet speċifiċi, eż reazzjoni mal-kimika tal-prova, l-estinzjoni ta' l-effett fototossiku, u l-proprjetajiet tal-qabda tar-radikali.Jistgħu jintużaw taħlit tal-vortex u/jew sonikazzjoni u/jew tisħin sa 37 °Ċ, jekk meħtieġ, biex tgħin is-solubilizzazzjoni.1.7.1.6. Irradjazzjoni/Preprazzjoni UVSors tad-dawl: l-għażla ta' sors tad-dawl xieraq u filtru xieraq huwa l-aktar fattur xieraq fil-prova ta' tossiċità. Reġjuni UVA u visibbli huma solitament assoċjati mal-fotosensitizzazzjoni (7) (10), waqt li UVB hija ta' anqas rilevanza u hija direttament ċitotossika ħafna, u żżid iċ-ċitotossiċità tagħha 1000 darba minn 313 sa 280 nm (11). Il-kriterji għall-għazla ta' sors ta' dawl xieraq għandhom jinkludu l-ħtieġa essenzjali li s-sors tad-dawl jemetti wavelengths assorbiti mit-test kimiku u li d-doża tad-dawl (li tista' tintlaħaq fi żmien raġonevoli) għandha tkun biżżejjed għal kxif ta' fotosensibilizzanti magħrufa. Barra dan, il-wavelengths u d-dożi użati m'għandhomx ikunu ta' ħsara żejda għas-sistema tal-prova, li tinkludi l-emissjoni ta' sħana (reġjun infra aħmar).Is-simulazzjoni tad-dawl tax-xemx b'simulaturi solari hija kkunsidrata l-aħjar sors tad-dawl. Kemm Xenon arcs u (doped) mercury-metal halide huma użati fis-simulaturi solari. Ta' l-aħħar għandhom il-vantaġġ li jemettu anqas sħana u li huma orħos, imma t-tqabbil tagħhom mad-dawl tax-xemx mhux perfett. Billi s-simulaturi kollha solari jemettu kwantitajiet sinifikanti ta' UVB, għandhom ikunu ffiltrati kif xieraq biex itaffu il-wavelengths UVB ċitotossiċi ħafna.Għandu jintuża għall-prova ta' fototossiċità in vitro 3T3 NRU spettru ta' irradjazzjoni prattikament battal minn UVB (UVA:UVB ġsim ħ 1:20). Kien ippubblikat eżempju tat-tqassim ta' l-irradjazzjoni spettrali tas-simulatur solari ffiltrat użat fl-istudju ta' validazzjoni tal-prova tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU (3).Dożimetrija: l-intensità tad-dawl (l-irradjazzjoni) għandha tkun ivverifikata regolarment qabel kull prova ta' fotossiċità, bl-użu ta' meter broadband UV xieraq. Il-UV meter għandu jkun ikkalibrat mas-sors. Il-funzjonament tal-UV-meter għandu jkun ivverifikat, u għal dan l-iskop, huwa rakkomandat l-użu tat-tieni UV meter ta' referenza ta' l-istess tip u l-istess kalibratura. Idealment, f'intervalli akbar, spettroradjometru għandu jintuża biex ikejjel l-irradjazzjoni spettrali tas-sors ta' dawl filtrat u biex tkun ivverifikata l-kalibrazzjoni tal-broadband UV-meter, imma dawn l-istrumenti jeħtieġu l-intervent ta' persuni speċjalizzati.Doża ta' 5 J/cm2(UVA) kienet stabbilita fl-istudju ta' validazzjoni li mhux ċitotossika għaċ-ċelloli Balb/c 3T3 u biżżejjed qawwija biex teċita anki kimiċi fototossiċi dgħajfin. Biex jintlaħaq 5J/cm2 f'perjodu ta' 50 min, l-irradjazzjoni għandha tkun aġġustata sa 1, 666 mW/cm2. Jekk jintużaw linja ta' ċelloli jew sors ta' dawl differenti, id-doża UVA jista' jkollha bżonn ta' adattament ħafif, bl-użu tal-kriterji li m'humiex ta' ħsara għaċ-ċelloli u biżżejjed biex jikxfu fototossini standard. Iż-żmien ta' l-espożizzjoni tad-dawl huwa kkalkolat b'dan il-mod:+++++ TIFF +++++1.7.2. Kondizzjonijiet tal-provaIl-konċentrazzjoni massima ta' kimika tal-prova m'għandhiex taqbeż 100μg/ml, billi l-kimiċi fototossiċi kienu rilevati f'konċentrazzjonijiet aktar baxxi, billi f'konċentrazzjonijiet ogħla tiżdied l-inċidenza ta' pożittivi foloz (tbassir żejjed). Il-pH ta' l-ogħla konċentrazzjoni tal-kimika tal-prova għandu jkun il-medda ph sodisfaċenti: 6,5 - 7,8).Il-meded ta' konċentrazzjonijiet ta' kimika eżaminata fil-preżenza (+ UVA) u fin-nuqqas ta' (- UVA) ta' dawl għandhom ikunu stabbiliti b'mod adegwat f'esperimenti ta' qabel magħmula apposta għalhekk. Il-medda u l-interċett ta' serje ta' konċentrazzjoni għandhom ikunu aġġustati b'tali mod li l-kurvi ta' konċentrazzjoni-rispons huma mseddqa biżżejjed bid-data sperimentali. Jeħtieġ li jintużaw serje ta' konċentrazzjoni ġeometrika (b'fattur kostanti ta' dilwizzjoni).1.7.3. Proċedura tal-prova [1]1.7.3.1. L-ewwel ġurnataIpprepara sospensjoni ta' ċellola ta' 1 × 1055 ċelloli/ml f'mezz ta' kultura u u ferra' 100 μl tal-mezz tal-kultura biss fil-bjar żgħar periferiċi ta' pjanċa ta' 96-well għall-mikrotitolazzjoni tal-kultura tat-tessut (= vojta). Fil-bjar żgħar li jifdal, ferra' 100 μl ta' sospensjoni ta' ċellola ta' 1 × 105 ċelloli/ml (= 1 × 104 ċelloli/bir). Għal kull kimika tal-prova, ipprepara żewġ pjanċi: waħda biex tistabbilixxi ċ-ċitotossiċità (-UVA), u l-oħra biex tkun stabbilita l-fototossiċità (+ UVA).Inkuba ċ-ċelloli għal 24 s (7,5 % CO2, 37 °Ċ) sakemm jiffurmaw monostrat semikonfluwenti. Dan il-perjodu ta' inkubazzjoni jippermetti għall-irkupru taċ-ċelloli u l-aderenza, għat-tkabbir esponenzjali.1.7.3.2. It-tieni jumWara l-inkubazzjoni, ferra' l-mezz tal-kultura miċ-ċelloli u aħsel darbtejn 150 μl EBSS/PBS kull bir. Żid 100 μl ta' EBSS/PBS li jkollhom konċentrazzjoni xierqa tal-kimika tal-prova jew solvent biss (kontroll negattiv). Applika 8 konċentrazzjonijiet differenti tal-kimika tal-prova. Inkuba ċ-ċelloli b'kimika tal-prova fid-dlam għal 60 minuta (7,5 % CO2, 37 °C).Biex issir il-parti (+ UVA) tal-prova, irradja ċ-ċelloli f'temperatura ambjentali ta' 50 minuta permezz ta' l-għatu tal-pjanċa 96-well b'1,7 mW/ċm2 UVA (= 5 J/ċm2). Ivventila b'fann biex ma' tħallix il-kondensazzjoni taħt l-għatu. Żomm platti dduplikati (-UVA) f'temperatura ta' l-ambjent f'kaxxa mudlama għal 50 minuta (= UVA ħin ta' espożizzjoni).Ferra' s-soluzzjoni tal-prova u aħsel darbtejn b'150 μl EBSS/PBS. Ibdel EBSS/PBS b'mezz ta' kultura u inkuba (7,5 % CO2, 37 °C) matul il-lejl (18-22 h).1.7.3.3. It-tielet ġurnataValutazzjoni mikroskopikaEżamina ċ-ċelloli taħt mikroskopju bil-kuntrast tal-fażi. Irrekordja bidliet fil-morfoloġija taċ-ċelloli minħabba l-effetti ċitotossiċi tal-kimika tal-prova. Din il-verifika hija rakkomandata, biex teskludi l-iżbalji sperimentali, imma dawn ir-rekords m'humiex użati għall-valutazzjoni taċ-ċitotossiċità jew tal-fototossiċità.Prova ta' l-assorbiment ta' l-aħmar newtraliAħsel iċ-ċelloli b'150 μl imsaħħan minn qabel EBSS/PBS. Neħħi s-soluzzjoni tal-ħasil bit-taptip ġentili. Żid 100 μl NR mezz u inkuba f'37 °Ċ, f'atmosfera umidifikata ta' 7,5 % CO2, għal 3 h.Wara l-inkubazzjoni, ferra' l-mezz NR, u aħsel iċ-ċelloli b'150 μl EBSS/PBS. Ferra' u bblottja għal kollox EBSS/PBS. iċ-ċentrifugazzjoni bil-pjanċa bil-maqlub hija fakoltattiva.Żid eżattament 150 μl NR soluzzjoni ta' estinzjoni (etanol/aċtu aċetiku ppreparati friski)Ċaqlaq malajr il-pjanċa tal-mikrotitolazzjoni għal 10 min, sakemm l-NR ikun estratt miċ-ċelloli u ffurmat soluzzjoni omoġenea.Kejjel id-densità ottika ta' l-estratt NR f'540 nm f'spettrofotometru, bl-użu ta' vojt bħala riferenza. Issejvja d-data f'format tal-fajl xieraq (eż. ASCII) għall-analiżi sussegwenti.2. DATA2.1. Kwalità u kwantità ta' dataId-data għandhom jippermettu analiżi sinifikattiva tal-konċentrazzjoni-rispons miksub fil-preżenza u fin-nuqqas ta' l-UVA/vis irradjazzjoni. Jekk tinsab iċ-ċitotossiċità, kemm il-medda ta' konċentrazzjoni u l-interċett ta' konċentrazzjonijiet individwali għandhom ikunu ffissati b'mod biex tippermetti li tidħol kurva għad-data sperimentali. Minħabba l-fatt li kimika ta' prova tista' ma tkunx ċitotossika sal-limitu definit tal-konċentrazzjoni ta' 100 μg/ml fl-esperiment fid-dlam (- UVA), imma tossika ħafna meta rradjata (+ UVA), il-meded tal-konċentrazzjoni li għandhom ikunu ppruvati fiż-żewġ partijiet ta' l-esperiment jistgħu jkunu differenti b'ordni ta' kobor biex iħarsu l-ħtieġa ta' data ta' kwalità adegwata. Jekk ma tinstab l-ebda citotossiċità fiż-żewġ partijiet ta' l-esperiment (-UVA u + UVA), hija biżżejjed prova b'interċett kbir bejn id-dożi singoli sa l-ogħla konċentrazzjoni.M'hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' riżultat ċar posittiv billi l-esperment ikun ripetut. Barra dan, riżultati ċari pożittivi m'għandhomx għalfejn ikunu vverifikati, sakemm il-kimika tal-prova kienet ippruvata f'konċentrazzjonijiet ogħlja biżżejjed. F'dawn il-każijiet, huwa biżżejjed esperiment wieħed ewlieni, appoġġjat minn esperiment preliminari tad-definizzjoni tal-medda.Provi li taw riżultati li bilkemm jintgħarfu wieħed minn ieħor qrib il-linja ta' demarkazzjoni tal-mudell ta' tbassir għandhom ikunu ripetuti għall-verifika.Jekk jitqies meħtieġ li l-provi għandhom ikunu mtennija, għalhekk il-varjazzjoni tal-kondizzjonijiet sperimentali jistgħu jkunu importanti biex jintlaħaq riżultat ċar. Varjabbli fundamentali f'din il-prova hija l-preparazzjoni ta' soluzzjonijiet tal-kimika tal-prova. Għalhekk, il-varjazzjoni ta' dawn il-kondizzjonijiet (ko-solvent, triturazzjoni u sonikazzjoni) jistgħu jkunu l-aktar rilevanti ripetizzjoni tal-prova. Alternattivament, tista' tkun ikkunsidrata l-varjazzjoni taż-żmien ta' l-inkubazzjoni ta' qabel l-irradjazzjoni. Jista' jkun rilevanti żmien aqsar għall-kimiċi li m'humiex stabbli fl-ilma.2.2. Trattament tar-riżultatiMeta possibbli, tkun iddeterminata l-konċentrazzjoni ta' kimika tal-prova li tirrifletti 50 % inibizzjoni ta' l-NRU (EC50) ċellulari. Dan jista' jsir billi tkun applikata kull proċedura xierqa ta' regressjoni mhux lineari (preferibbilment funzjoni Hill jew regressjoni loġistika) lid-data ta' konċentrazzjoni-rispons, jew bl-użu ta' proċeduri oħra xierqa. Qabel ma tintuża EC50 għall-kalkoli oħra, hemm bżonn li tkun ivverifikata b'mod xieraq il-kwalità ta' l-addattament. Alternattivament, jistgħu jkunu użati metodi ta' addattament għar-rappreżentazzjoni grafika biex ikun ikkalkolat EC50. F'dan il-każ, l-użu tal-karta tal-probabbiltà huwa rakkomandat (skala-x: log, skala-y: probit), billi f'ħafna każijiet il-funzjoni tar-rispons tal-konċentrazzjoni ssir kważi lineari wara din it-trasformazzjoni.2.3. Valutazzjoni tar-riżultati (mudelli ta' tbassir)2.3.1. Mudell ta' tbassir verżjoni 1: Fattur ta' irritazzjoni tad-dawl (PIF)Jekk kemm, fil-preżenza (+ UVA) u fin-nuqqas (-UV) tad-dawl, jinkisbu kurvi ta' rispons ta' konċentrazzjoni kompleti, fattur ta' irritazzjoni tad-dawl (PIF) huwa ikkalkolat permezz tal-formula li ġejja:+++++ TIFF +++++PIF<5, ma jbassar l-ebda potenzjal fototossiku, waqt li PIF>= 5 ibassar potenzjal fototossiku.Jekk kimika hija ċitotossika biss + UVA u mhix ċitotossika meta ppruvata –UVA, il-PIF ma jistax ikun ikkalkolat, għalkemm dan huwa r-riżultat li jindika l-potenzjal fototossiku. F'dawn il-każijiet, ">PIF" jista' jkun ikkalkolat jekk il-prova ta' ċitotossiċità titwettaq sa l-għola konċentrazzjoni (Cmax) u dan il-valur huwa użat għall-kalkolu tal- ">PIF";+++++ TIFF +++++Jekk ">PIF" jista' jinkiseb, mela kull valur >1 ibassar il-potenzjal fototossiku.Jekk kemm EC50 (- UV) u EC50 (+ UV) ma jistgħux ikunu kkalkolati minħabba l-fatt li kimika ma turix xi ċitotossiċità sa l-ogħla konċentrazzjoni, din ma tindika l-ebda potenzjal fototossiku. F'dawn il-każijiet, "PIF = *1" formali huwa użat biex jikkaratterizza r-riżultat;+++++ TIFF +++++Jekk ">PIF = *1" biss jista' jinkiseb, dan ma jbassar l-ebda potenzjal fototossiku.Fil-każijiet (b) u (ċ), għandhom ikunu kkunsidrati bir-reqqa l-konċentrazzjonijiet miksuba fil-prova ta' tossiċità in vitro 3T3 NRU meta jkun qed jitbassar il-potenzjal fototossiku.2.3.2. Mudell ta' tbassir verżjoni 2: Effett medju tad-dawl MPEAlternattivament, verżjoni ġdida tal-mudell għat-tbassir tal-potenzjal fototossiku tista' tkun applikat, li kien żviluppat bl-użu tad-data ta' l-istudju tal-validazzjoni EU/COLIPA(15) u ppruvat taħt kondizzjonijiet fl-għama fi studju sussegwenti fuq il-fototossicità in vitro tas-sustanzi kimiki bil-filtru UV. Dan il-mudell jegħleb il-limitazzjoni tal-mudell PIF f'kazijiet fejn EC50 ma jistax jinkiseb. Il-mudell juża "l-effett medju tad-dawl" (MPE), miżura li hija bbażata fuq paragun ta' kurvi ta' rispons ta' konċentrazzjoni sħiħa. Għall-applikazzjoni tal-mudell MPE, ġie żviluppat software tal-kompjuter speċjali fl-Università ta' Humboldt (Berlin), li jista' jinkiseb b'xejn.2.4. Interpretazzjoni tar-riżultatiRiżultat pożittiv fil-prova ta' tossiċità in vitro 3T3 NRU (PIF > = 5 or MPE > = 0,1) jindika li s-sustanza tal-prova għandha potenzjal fototossiku. Jekk dan ir-riżultat jinkiseb f'konċentrazzjonijiet anqas minn 10 μg/ml, il-kimika tal-prova x'aktarx taġixxi bħala fototossina wkoll taħt kondizzjonijiet varji ta' espożizzjoni in vitro. Jekk riżultat pożittiv jinkiseb biss fl-ogħla konċentrazzjoni tal-prova ta' 100 μg/ml, konsiderazzjonijniet oħra jistgħu jkunu meħtieġa għall-valutazzjoni tal-perikolu jew potenza fototossika. Dawn jistgħu jinkludu data fuq il-penetrazzjoni, assorbiment u akkumulu possibbli tal-kimika fil-ġilda, jew l-ittestjar tal-kimika fi prova konfermatorja alternattiva, eż, l-użu ta' mudell tal-bniedem in vitro.Riżultat negattiv mill-prova ta' tossiċità in vitro 3T3 NRU (PIF<5 jew MPE <0,1) jindika li s-sustanza tal-prova ma kinitx fototossika għaċ-ċelloli mammiferi kkultivati taħt il-kondizzjonijiet użati. F'każijiet meta l-kimika tista' tkun ippruvata sa l-ogħla konċentrazzjoni ta' 100 μg/ml, riżultat negattiv jindika li l-kimika m'għandha l-ebda potenzjal fototossiku, u l-fototossiċità in vivo tista' tkun ikkunsidrata remota. F'każijiet meta r-rispons identiku ta' konċentrazzjoni u tossiċità (EC50 + UV and EC50- UV) nkiseb f'konċentrazzjonijiet aktar baxxi, l-interpretazzjoni tad-data tkun l-istess. Diversament, jekk ma tintwera l-ebda tossiċità (+ UV and - UV) u jekk is-solubbiltà fl-ilma tillimita l-konċentrazzjonijiet għal valuri ta' inqas minn 100 μg/ml, allura l-kompatibbiltà tas-sustanza tal-prova fil-prova tista' titpoġġa fid-dubbju u għandhom ikunu kkunsidrati provi konfermatorji (eż. l-użu ta' mudell tal-ġilda in vitro, jew mudell tal-ġilda ex vivo jew prova in vivo).3. RAPPURTAĠĠIr-rapport tal-provaIr-rapport tal-prova għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:Kimika tal-prova:- data ta' identifikazzjoni u No SAK, jekk magħruf,- natura fiżika u purezza,- proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti għall-esekuzzjoni ta' l-istudju,- stabbiltà u fotostabbiltà, jekk magħrufa.Solvent:- ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent,- solubbiltà tal-kimika tal-prova f'dan is-solvent,- perċentwal ta' solvent preżenti fil-mezz tat-trattament (EBSS jew PBS).Ċelloli- tip u sors taċ-ċelloli,- nuqqas ta' mikroplasma,- numru ta' passaġġi taċ-ċellola, jekk magħrufa,- is-sensittività UVA taċ-ċelloli, determinata bit-tagħmir ta' irradjazzjoni, użat fil-prova ta' tossiċità in vitro 3T3 NRU.Kondizzjonijiet tal-prova (a) – inkubazzjoni qabel u wara t-trattament:- tip u kompożizzjoni tal-mezz tal-kultura,- kondizzjonijiet ta' inkubazzjoni (konċentrazzjoni CO2, temperatura, umidità).- tul ta' l-inkubazzjoni (qabel it-trattament, wara t-trattament).Kondizzjonijiet tal-prova (b) – trattament bil-kimika:- kriterji għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet tal-kimiċi tal-prova użati kemm fil-preżenza u fin-nuqqas ta' l-irradjazzjoni UV/vis,- fil-każ ta' solubbiltà limitata tal-kimika tal-prova u n-nuqqas ta' ċitotossiċità, ir-raġunijiet għall-ogħla konċentrazzjoni ppruvata,- tip u kompożizzjoni tal-mezz tat-trattament (soluzzjoni tal-melħ buffered),- tul tat-trattament kimiku.Kondizzjonijet tal-prova (ċ) – irradjazzjoni:- raġuni għall-għażla tas-sors tad-dawl użat,- karatteristiċi ta' irradjazzjoni spettrali tas-sors tad-dawl,- karatterisitiċi ta' trasmissjoni/assorbiment tal-filtru(i) użat,- karatteristiċi tar-radjometru u dettalji fuq il-kalibrazzjoni tiegħu,- distanza tas-sors tad-dawl mis-sistema tal-prova,- Irradjazzjoni UVA f'din id-distanza, espressa f'mW/cm2,- tul ta' l-espożizzjoni tad-dawl UV/vis,- doża UVA (irradjazzjoni - żmien), espressa f'J/cm2,- temperatura użata għall-kulturi taċ-ċelloli matul l-irradjazzjoni, u għall-kulturi ta' ċelloli miżmuma flimkien fid-dlam.Kondizzjonijiet tal-prova (d) – prova NRU:- kompożizzjoni tal-mezz NRU,- tul ta' l-inkubazzjoni NR,- kondizzjonijiet ta' inkubazzjoni (konċentrazzjoni CO2, temperatura, umdità),- kondizzjonijiet ta' l-estrazzjoni NR (estraent, tul),- wavelength użat għall-qari spettrofotometriku tad-densità ottika NR,- it-tieni wavelength (referenza), jekk użat,- kontenut tal-vojt spettrofotometriku, jekk użat.Riżultati:- vitalità taċ-ċelloli miksuba f'kull konċentrazzjoni tal-kimika tal-prova, imfissra f'perċentwal tal-medja tal-vitalità tal-kontrolli,- kurvi ta' konċentrazzjoni-rispons, (konċentrazzjoni kimika tal-prova u vitalità relattiva taċ-ċellola), miksubin f'esperimenti konkorrenti + UVA u –UVA,- analiżi tad-data tal-kurvi tal-konċentrazzjoni ta' rispons: jekk possibbli, komputazzjoni/kalkolu ta' EC50 (+ UVA) u EC50 (-UVA),- paragun taż-żewġ kurvi ta' konċentrazzjoni respons, miksuba fil-preżenza u fin-nuqqas ta' l-irradjazzjoni UVA/vis, jew bil-kalkolu tal-fattur ta' fotoirritazzjoni (PIF), jew bil-kalkolu ta' l-effett medju tad-dawl (MPE),- klassifikazzjoni tal-potenzjal fototossiku,- kriterji(u) ta' l-aċċettazzjoni tal-prova – kontroll negattiv konkorrenti:- vitalità assoluta (densità ottika ta' l-estratt NR) ta' ċelloli irradjati u mhux irradjati,- data storika ta' kontroll negattiv, devjazzjoni medja u standard.- kriterji (b) ta' l-aċċettazzjoni tal-prova – kontroll pożittiv konkorrenti:- EC50 (+ UVA) u EC50 (- UVA) u PIF tal-kimika ta' kontroll pożittiv,- data storika ta' kimika ta' kontroll pożittiv: EC50 (+ UVA) u EC50 (- UVA) u PIF, devjazzjoni medja u standard.Diskussjoni tar-riżultati.Konklużjonijiet.4. RIFERENZI(1) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer, F., Moore, L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W. and Willshaw, A. (1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, pp. 793-796.(2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, pp. 7-8.(3) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pechovitch, G., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA "In vitro phototoxicity" validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, pp. 305-327.(4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996.(5) Lovell, W.W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology in Vitro 7, pp. 95-102.(6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, pp. XI-XXXV.(7) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, pp. 314-348.(8) Spikes, J.D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, pp. 79-110.(9) Borenfreund, E. and Puerner, J.A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, pp. 119-124.(10) Lambert L. A, Warner W.G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, pp. 515-530.(11) Tyrrell R.M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, pp. 1825-1829.(12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project "In Vitro Photoirritation".(13) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, pp. 679-708.(14) Holzhütter, H.G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, pp. 127-138.(15) Holzhütter, H.G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, pp. 445-462.""Appendix+++++ TIFF +++++"[1] Dettalji oħra jistgħu jinstabu fir-riferenza 12.--------------------------------------------------


Avviż Legali Importanti

|

32004L0042

Id-Direttiva 2004/42/CE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tal-21 ta' April 2004 dwar il-limitazzjonijiet ta' emissjonijiet ta' komposizzjonijiet organiċi volatili minħabba l-użu ta' solventi f'ċertu żebgħa u lostri u prodotti ta' lostru mil-ġdid ta' vetturi u li jemenda id-Direttiva 1999/13/EC

Official Journal L 143 , 30/04/2004 P. 0087 - 0096 CS.ES Chapter 15 Volume 08 P. 376  - 385 ET.ES Chapter 15 Volume 08 P. 376  - 385 HU.ES Chapter 15 Volume 08 P. 376  - 385 LT.ES Chapter 15 Volume 08 P. 376  - 385 LV.ES Chapter 15 Volume 08 P. 376  - 385 MT.ES Chapter 15 Volume 08 P. 376  - 385 PL.ES Chapter 15 Volume 08 P. 376  - 385 SK.ES Chapter 15 Volume 08 P. 376  - 385 SL.ES Chapter 15 Volume 08 P. 376  - 385

		Id-Direttiva 2004/42/CE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsilltal-21 ta' April 2004dwar il-limitazzjonijiet ta' emissjonijiet ta' komposizzjonijiet organiĊi volatili minħabba l-uŻu ta' solventi f'Ċertu ŻebgĦa u lostri u prodotti ta' lostru mil-Ġdid ta' vetturi u li jemenda id-Direttiva 1999/13/ECIL-PARLAMENT EWROPEW U L-KUNSILL TA' L-UNJONI EWROPEAWara li kkunsidraw it-Trattat li jistabilixxi l-Komunità Ewropea, u b'mod partikolari l-Artikolu 95 tiegħu,Wara li kkunsidraw l-proposta mill-Kummissjoni,Wara li kkunsidraw l-Opinjoni tal-Kumitat Ekonomiku u Soċjali Ewropew [1],Jaġġixxu skond il-proċeduri stabbiliti fl-Artikolu 251 tat-Trattat [2],Billi:(1) Id-Direttiva 2001/81/EC tal-Parlament Ewropew u l-Kunsill tat-23 ta' Ottubru 2001 dwar l-ogħla limiti nazzjonali ta' emissjoni għal ċertu pollutanti atmosferiċi [3] tiffissa l-ogħla limiti għal emizzjonijiet ta' ċertu pollutanti, inkluż komposizzjonijiet organiċi volatili (hawnhekk iżjed 'il quddiem: "VOCs"), li jridu jintlaħqu sal-2010 bħala parti mill-istrateġija integrata tal-Komunità biex tikkumbatti l-aċidifikazzjoni u l-ożonu mal-livell ta' l-art, imma ma tinkludix valuri ta' limitu ta' emissjonijiet għal dawk il-pollutanti minn egħjun speċifiċi.(2) Sabiex jikkonformaw mal-limiti nazzjonali għal emissjonijiet ta' VOCs, l-Istati Membri jridu jimmiraw għal numru ta' kategoriji differenti ta' egħjun ta' dawn l-.(3) Din id-Direttivi tikkumplimenta miżuri meħudin f'livell nazzjonali sabiex tiżgura konformità ma' l-ogħla livell ta' emissjonijet ta' VOCs.(4) Fl-assenza ta' dispożizzjonijiet tal-Komunità, leġislazzjoni fl-Istati Membri biex jimponu valuri ta' limitu għal VOCs f'ċertu kategoriji ta' prodotti jistgħu jvarjaw. Disparitajiet ta' din ix-xorta, flimkien ma' l-assenza ta' leġislazzjoni ta' din ix-xorta f'xi wħud mill-Istati Membri, jista' jkun responsabbli għal kreazzjoni ta' ostakli bla bżonn għan-negozju u ta' distorsjoni tal-kompetizzjoni fi ħdan is-suq intern.(5) Għaldaqstant, liġijiet nazzjonali u dispożizzjonijiet li, għall-għanijiet li jikkumbattu l-ożonu fil-livell ta' l-art, jistabilixxu valuri ta' limitu għal kontenut ta' VOCs fil-prodotti koperti minn din id-Direttiva, jeħtieġu li jkunu armonizzati sabiex ikun żgurat li ma jirristrinġux il-moviment liberu ta' dawn il-prodotti.(6) Peress illi l-għanijiet ta' l-azzjoni proposta, jiġifieri it-tnaqqis ta' emissjonijiet ta' VOCs, ma jistax jintlaħaq b'mod suffiċjenti mill-Istati Membri, għax l-emissjonijiet ta' VOCs fi Stat Membru wieħed jaffetwaw il-kwalità ta' l-arja fi Stati Membri oħra u għalhekk tnaqqis ta' emissjonijiet ta' VOCs, b'raġuni ta' l-iskala u effetti ta' l-azzjoni, jistgħu jintlaħqu aħjar fuq livell ta' Komunità, il-Komunità tista' taddotta miżuri, skond il-prinċipju ta' sussidjarjetà kif inhu miktub fl-Artikolu 5 tat-Trattat. Skond il-prinċipju ta' proporzjonalità, kif inhu miktub f'dak l-Artikolu, din id-Direttiva ma tmurx oltre dak li huwa neċessarju biex jintlaħaq dan il-għan.(7) Il-kontenut ta' VOC fiż-żebgħa, lostri u prodotti ta' lostru mil-ġdid tal-vetturi jagħtu lok għal emissjonijiet sinjifikanti fl-arja, li jikkontribwixxu għal formazzjoni lokali u transkonfinarji ta' sustanzi fotokimiċi li jossidaw fis-saff tat-tarf tat-troposfera.(8) Il-kontenut ta' VOC f'ċertu żebgħa u lostri u prodotti ta' lostru mil-ġdid tal-vetturi għandhom għalhekk jiġu mnaqqsa kemm hu teknikament u ekonomikament possibbli meta wieħed jikkunsidra il-kondizzjonijiet klimatiċi.(9) Livell għoli ta' protezzjoni ambjentali jirrikjedi l-iffissar u s-seħħ ta' valuri ta' limitu għal kontenut ta' VOCs użati fi prodotti koperti minn din id-Direttiva.(10) Għandu jsir proviżjoni għal miżuri transitorji għal prodotti magħmulin qabel ma jidħlu fis-seħħ il-kondizzjonijiet meħtieġa minn din id-Direttiva.(11) L-Istati Membri għandhom ikunu jistgħu jagħtu liċenzi individwali għal bejgħ u xiri għal skopijiet speċifiċi ta' prodotti fi kwantitajiet strettament limitati li ma jkunux skond il-valuri ta' limiti ta' solventi hekk kif inhu stabbilit b'din id-Direttiva.(12) Din id-Direttiva tikkomplimenta il-provisjonijet tal-Komunità dwar it-tikkettjar ta' sustanzi u preparazzjonijiet kimikali.(13) Il-ħarsien tas-saħħa tal-konsumaturi u/jew ħaddiema u l-protetzjoni ta' l-ambjent tax-xogħol m'għandux jaqa' taħt l-iskop ta' din id-Direttiva, u għaldaqstant miżuri meħuda minn L-Istati Membri għal dawn l-għanijiet ma għandhomx ikunu affettwati b'din id-Direttiva.(14) Valuri ta' limitu tal-kontenut iridu jkunu sorveljati sabiex jiġi determinat jekk il-konċentrazzjonijiet ta' masses ta' VOCs li jinstabu f'kull kategorija ta'żebgħa, lostri u prodotti ta' lostru mil-ġdid tal-vetturi koperti minn din id-Direttiva jaqgħux fil-limiti permessi.(15) Minħabba li l-kontenut ta' VOC fi prodotti użati għal ċertu attivitajiet ta' lostru mil-ġdid tal-vetturi issa huma regulati taħt din id-Direttiva, Direttiva tal-Kunsill 1999/13/EC tal-11 ta' Marzu 1999 dwar il-limitazzjoni ta' emissjonijiet ta' komposizzjonijiet organiċi volatili dovuti għal użu ta' solventi f'ċertu attivitajiet u stallazzjonijiet [4] għandha tiġi emendatha għal din ir-raġuni.(16) L-Istati Membri għandhom, madankollu, jkunu jistgħu jżommu jew jintroduċu miżuri nazzjonali għal kontroll ta' emissjonijiet minn attiviatjiet ta' lostru mil-ġdid ta' vetturi li jinvolvu il-kisi ta' vetturi tat-triq kif definiti fid-Direttiva tal-Kunsill 70/156/KEE tas-6 ta' Frar 1970 dwar l-approssimazzjoni tal-liġijiet ta' l-Istati Membri li jirrelataw ma' type approval' ta' vetturi bil-mutur u l-karrijiet tagħhom [5], jew parti minnhom, li jsiru bħala parti ta' tiswija ta' vettura, konservazzjoni u dekorazzjoni barra minn stallazzjonijiet ta' manifattura.(17) Din id-Direttiva ma ghandhiex tapplika għal prodotti mibjugħin għal użu esklussiv fi stallazzjonijiet awtorizzati skond id-Direttiva 1999/13/EC fejn il-miżuri ta' limitu ta' emissjonijiet jipprovdu mezzi alternattivi biex jintlaħaq tnaqqis li hu għal inqas ekwivalenti ta' emissjonijiet ta' VOC.(18) L-Istati Membri għandhom jiffissaw regoli dwar il-penali applikabbli għal ksur tal-provedimenti ta' din id-Direttiva u biex jiżguraw li dawn jiġu implimentati. Dawn il-penali għandhom ikunu effettivi, proporzjonati u dissważivi.(19) L-Istati Membri għandhom jirraportaw lil Kummissjoni dwar l-esperjenza li jiksbu mill-applikazzjoni ta' din id-Direttiva.(20) Għandha ssir reviżjoni kemm ta' l-għan għat-tnaqqis tal-kontentu ta' VOC fil-prodotti barra mill-iskop ta' din id-Direttiva kif ukoll tal-possibilta li jitnaqqsu aktar il-valuri ta' limitu ta' VOC previsti.(21) Il-miżuri meħtieġa sabiex tiġi implimentatha din id-Direttiva għandhom jiġu adottati skond id-Deċiżjoni tal-Kunsill 1999/468/KE tat-28 ta' Ġunju 1999 li tistabbilixxi l-proċeduri sabiex jiġu eżerċitati l-poteri ta' implimentazzjoni kkonferiti fuq il-Kummissjoni [6],ADOTTAW DIN ID-DIRETIVA:Artikolu 1Skop u Ambitu1. L-Iskop ta' din id-Direttiva hija li tillimita il-kontenut totali ta' VOCs f'ċertu żebgħa u lostri u prodotti li jillostraw il-vetturi mil-ġdid sabiex ma jitħalliex jew jitnaqqas it-tniġġis ta' l-arja bħala riżultat tal-kontribuzzjoni ta' VOCs għal formazzjoni ta' ożonu troposferiku.2. Sabiex jintlaħqu l-għanijiet elenkati fil-paragrafu 1, din id-Direttiv tapprossima l-ispeċifikazzjonjiet tekniċi għal ċertu żebgħa u lostri u prodotti li jillostraw vetturi mil-ġdid.3. Din id-Direttiva għandha tgħodd għal prodotti elenkati fl-Anness I.4. Din id-Direttiva ma tippreġudikax u ma taffetwax miżuri, inklużi ħtieġijiet ta' tikkettjar, meħudin fuq livell ta' Komunità jew nazzjonali biex jipproteġu saħħet il-konsumaturi u tal-ħaddiema u l-ambjent tax-xogħol tagħhom.Artikolu 2TifsirGħall-finijiet ta' din id-Direttiva għandhom japplikaw id-definizzjonijiet li ġejjin:"L-awtorità kompetenti"  tfisser l-awtorità jew awtoritajiet responsabbli taħt il-proviżjonijiet legali ta' l-Istati Membri sabiex iwettqu l-obbligazzjonijet li joriġinaw minn din id-Direttiva;"Sustanzi"  tfisser kwalunkwe element kimiku u l-komposizzjonijiet tiegħu, kif jinstabu fl-istat naturali tagħhom jew kif inhuma prodotti mill-industrija, sew fil-forma solida jew likwida jew li tixbaħ il-gass;"Preparazzjoni"  tfisser taħlita jew soluzzjoni komposta minn żewġ sustanzi jew aktar;"Komposizzjoni organika"  tfisser kwalunkwe komposizzjoni li fiha jkun jinstab ta' lanqas l-element karbonju u element wieħed jew aktar ta' idroġenu, ossiġnu, kubrit, fosfru, silicon, nitroġenu jew aloġenu, bl-eċċezzjoni ta' ossidi tal-karbonju u karbonati inorganicċi u bikarbonati;"Komposizzjonijiet organiċi volatili"  tfisser kwalunkwe komposizzjoni organika li tiftaħ tagħli fuq temperatura ta' anqas minn jew ekwivalenti għal 250 °C meta mkejjel bi pressjoni standarda ta' 101,3 kPa;"Kontenut ta' VOC"  tfisser il-massa ta' komposizzjonijiet organiċi volatili, miktubin fi grammi/litru (g/l) fil-formulazzjoni tal-prodott meta jkun fil-kondizzjoni tiegħu magħmul u lest. Il-massa ta' komposizzjonijiet organiċi volatili fi prodott speċifiku li jagħmlu reazzjoni kemikali waqt it-tnixxif sabiex jifforma parti mil-kisi ma għandux jitqies bħala parti mill-kontenut ta' VOC;"Solvent organiku"  jfisser kwalunkwe VOC li huwa użat waħdu jew flimkien ma' aġenti oħra biex iħollu jew jiddilwaw materja prima, prodotti, jew materjal ta' skart, jew li huwa użat bħala aġent tat-tindif biex iħoll kontaminaturi, jew bħala medja ta' tixrid, jew bħala aġġustatur ta' viskożità, jew bħala aġġustatur tat-tensjoni tal-wiġġ, jew biex jaħdem il-plastik, jew bħala preservattiv;"Kisi"  tfisser kwalunkwe preparazzjoni, inklużi is-solventi organiċi kollha jew preparazzjonijiet li fihom ikunu jinsabu solventi organiċi meħtieġa għall-applikazzjoni korretta tagħhom, li huwa użat biex jipprovdi rita b'effett dekorattiv, protettiv jew xi effett funzjonali ieħor fuq wiċċ;"Rita"  tfisser saff kontinwu li jirriżulta mill-applikazzjoni ta' kisja waħda jew aktar fuq sottostrata;"Kisi li jinġarru bl-ilma (WB)"  tfisser kisi li jkollu l-vikożità tiegħu aġġustat bl-użu ta' l-ilma;"Kisi li jinġarr b'solventi (SB)"  tfisser kisi li jkollu l-vikożità tiegħu aġġustat bl-użu ta' solventi organiċi;"Mqiegħed fis-suq"  tfisser li tqiegħed għad-dispożizzjoni ta' terzi persuni, kemm għal bdil ta' ħlas jew le. Importazzjoni lejn it-teritorju tal-Komunità ser ikun mifhum li jkun tqiegħed fis-suq għall-iskopijiet ta' din id-Direttiva.Artikolu 3Rekwiżiti1. L-Istati Membri għandhom jiżguraw illi l-prodotti elenkati fl-Anness I huma mqiegħda fis-suq fit-teritorju tagħhom wara d-dati stabbiliti fl-Anness II biss jekk ikollhom kontenut ta' VOC li ma jeċċedix il-valuri ta' limitu stabbiliti fl-Anness II u li jikkonformaw ma' l-Artikolu 4.Sabiex ikun stabbilit il-konformità mal-valuri ta' limitu stabbiliti fl-Anness II, għandhom jintużaw il-metodi analitiki li msemmija fl-Anness III.Għal prodotti elenkati fl-Anness I li magħhom ikunu ġew miżjuda solventi jew komposizzjonijiet oħrajn li fihom ikun jinsabu solventi sabiex il-prodott ikun magħmul u lest, il-valuri ta' limitu fl-Anness II għandhom japplikaw għal kontenut ta' VOC fil-prodott fil-kondizzjoni tiegħu magħmul u lest.2. Bħala deroga minn paragrafu 1, l-Istati Membri għandhom jeżentaw milli jikkonformu mar-rekwiżiti msemmija hawn fuq prodotti mibjugħin għal użu ekslussiv f'attività koperta mid-Direttiva 1999/13/EC liemha attività issir fi stallazzjoni reġistrata jew awtorizzata skond l-Arikoli 3 u 4 ta' dik id-Direttiva.3. Għall-iskopijiet ta' restorazzjoni jew manutenzjoni ta' bini u vetturi klassiċi li huma innominati mill-awtoritajiet kompetenti bħala li huma ta' valur storiku jew kulturali partikolari, Stati Membri jistgħu jagħtu liċenzi individwali għal bejgħ u xiri f'kwantitajiet strettament limitati ta' prodotti li ma jikkonformawx mal-valuri ta' limitu ta' VOC hekk kif inhu stabbilit fl-Anness II.4. Prodotti li jaqgħu taħt l-iskop ta' din id-Direttiv li jintwerew li kienu magħmulin qabel id-dati stabbiliti fl-Anness II u li ma jaderixxux mar-rekwiżiti ta' paragrafu 1 jistgħu jitqiegħdu fis-suq għal perjodu ta' tnax-il xahar wara d-data li fiha ir-rekwiżit li japplika għal prodott imsemmi tidħol fis-seħħ.Artikolu 4TikkettjarL-Istati Membri għandhom jiżguraw illi l-prodotti elenkati fl-Anness I ikollhom tikketta meta jkunu mqiegħdha fis-suq. It-tikketta għandha tindika:(a) is-sottokategorija tal-prodottt u il-valur ta' limitu ta' VOC relevanti f'g/l skond ir-referenza li hemm fl-Anness II;(b) il-kontenut massimu ta' VOC fi g/l tal-prodott f'kondizzjoni magħmul u lest.Artikolu 5L-awtorità lokali kompetentiL-Istati Membri għandhom jinnominaw awtorità kompetenti li tkun responsabbli biex taderixxi ma' l-obbligi stabbiliti f'din id-Direttiva, u għandha tinforma lill-Kummissjoni dwar dan mhux aktar tard mit-30 t'April 2005.Artikolu 6SorveljarL-Istati Membri għandhom iniedu programm ta' sorveljanza għall-iskop li jivverifika il-konformità ma' din id-Direttiva.Artikolu 7RapportarL-Istati Membri għandhom jirraportaw ir-riżultati tal-program ta' sorveljanza sabiex juru konformità ma' din id-Direttiva u l-kategoriji u kwantitajiet ta' prodotti liċenzati skond l-Artikolu 3(3). L-ewwel żewġ rapporti għandhom jingħataw lill-Kummissjoni 18-il xahar wara d-dati ta' konformità mal-valuri ta' limitu tal-kontenut ta' VOC stabbiliti fl-Anness II; sussegwentament rapport għandu jingħata kull ħames snin. Il-Kummisjoni ser tiżviluppa format komuni minn qabel għas-sottomissjoni tad-data ta' sorveljanza skond il-proċeduri stabbiliti fl-Artikolu 12(2). Data ta' kull sena trid titqiegħed għad-dispożizzjoni tal-Kummisjoni meta tintalab.Artikolu 8Ċirkolazzjoni liberaL-Istati Membri m'għandhomx, fuq il-bażi ttrattat minn din id-Direttiva, jipprojbixxu, jirrestrinġu jew jimpedixxu it-tqegħid fis-suq ta' prodotti li jaqgħu taħt l-iskop ta' din id-Direttiva li, fil-kondizzjoni tagħhom magħmula u lesta, jikkkonformaw mar-rekwiżiti ta' din id-Direttiva.Artikolu 9ReviżjoniIl-Kummissjoni hija mistiedna biex tagħti lill-Parlament Ewropew u lill-Kunsill:1. sa mhux aktar tard mis-sena 2008, rapport ibbażat fuq ir-riżultati tar-reviżjoni msemmija fl-Artikolu 10 tad-Direttiva 2001/81/EC. Dan ir-rapport għandu jeżamina:(a) l-iskop wiesa u l-potenzal biex isir tnaqqis fil-kontenut ta' VOC fi prodotti barra mill-iskop ta' din id-Direttiva inklużi aerosoli għal żebgħa u lostri;(b) il-possibiltà ta' l-introduzzjoni ta' aktar tnaqqis (fażi II) fil-kontenut ta' VOC fi prodotti ta' lostru mill-ġdid ta' vetturi;(ċ) kwalunkwe element ġdid konness ma' l-impatt soċjo-ekonomiku ta' l-applikazzjoni ta' fażi II kif inhu previst għal żebgħa u lostri;2. mhux aktar tard minn 30 xahar wara d-data ta' implimentazzjoni tal-valuri ta' limitu għal kontenut ta' VOC fl-Anness II fażi II, rapport li jikkunsidra, partikolarment, ir-rapporti msemmija fl-Artikolu 7 u ta' kwalunkwe żviluppi teknoloġiċi fil-manifattura taż-żebħa, lostri u prodotti li jillostraw vetturi mil-ġdid. Dan ir-rapport għandu jeżamina l-iskop wies u l-potenzal li jsir aktar tnaqqis fil-kontenut ta' VOC fi prodotti fl-iskop ta' din id-Direttiva, inkluż il-possibiltà ta' distinzjoni bejn żebgħ li tintużha għal ġewwa u għal barra f'sottokategoriji (d) u (e) ta' l-Anness1, punt 1.1. u l-Anness II, taqsima A.Dawn ir-rapporti għandhom ikunu akkumpanjati, jekk ikun xieraq, bi proposti biex jemendu din id-Direttiva.Artikolu 10Il-PenaliL-Istati Membri għandhom jiffissaw ir-regoli dwar penali applikabbli għal ksur tal-provedimenti nazzjonali addottati skond din id-Direttiva u ser jieħdu miżuri neċessarji biex jiżguraw li dawn jiġu implimentati. Il-penali previsti għandhom ikunu effettivi, proporzjonati u dissważivi. L-Istati Membri għandhom javżaw lill-Kummissjoni dwar dawn ir-regoli u miżuri mhux aktar tard mit-30 t'Ottubru 2005, u għandhom javżawha mingħajr dewmin dwar kwalunkwe emenda sussegwenti li taffetwhom.Artikolu 11Adattamenti għal progress teknikuKwalunkwe emendi neċessarji sabiex jiġi addattat l-Anness III sabiex jitqies progress tekniku għandu jiġi addottat mill-Kummissjoni skond il-proċedura msemmijha fl-Artikolu 12(2).Artikolu 12Kumitat1. Il-Kummissjoni ser tkun assistitha mill-kumitat stabbilit skond l-Artikolu 13 tad-Direttiva tal-Kunsill 1999/13/EC, hawnhekk iżjed "il quddiem imsejjaħ" il-Kumitat '.2. Fejn hemm referenza għal dan il-paragrafu l-Artikoli 5 u 7 tad-Deċiżjoni 1999/468/EC għandhom jgħoddu, wara li jikkunsidraw id-dispożizzjonijiet ta' l-Artikolu 8 tiegħu.Il-perjodu taż-żmien stabbilit fl-Artikolu 5(6) tad-Deċiżjoni 1999/468/KE għandu jiġi ffissat għal tliet xhur.3. Il-Kumitat għandu jadotta r-regoli tal-proċedura tiegħu.Artikolu 13Emenda tad-Direttiva 1999/13/EC1. Id-Direttiva 1999/13/KE hija hawnhekk emendata kif ġej:fl-Anness I, fit-taqsima msemmija "Lostri mil-ġdid ta' vetturi", l-inċiż li ġej għandu jiġi mħassar:"— il-kisi ta' vetturi tat-triq hekk kif inhu definit fid-Direttiva 70/156/KEE, jew parti minnhom, meta jsir bħala parti mit-tiswija ta' vettura, konservazzjoni jew dekorazzjoni barra minn stallazzjonijiet ta' manifattura, jew '."2. Minkejja paragrafu 1, L-Istati Membri jistgħu jżommu jew jintroduċu miżuri ta' kontroll ta' emissjonijiet minn attivitajiet ta' lostru mil-ġdid ta' vetturi mħassra mill-iskop tad-Direttiva 1999/13/EC.Artikolu 14Transposizzjoni1. L-Istati Membri għandhom idaħħlu fis-seħħ il-liġijiet, regolazzjonijiet u disposizzjonijet amministrattivi neċessarji biex jikkonformaw ma din id-Direttiva sa mhux aktar tard mit-30 t'Ottubru 2005, u għandhom javżaw lill-Kummisjoni ta' dan minnufih.Meta l-Istati Membri jadottaw dawn id-dispożizzjonijiet, dawn għandhom ikollhom referenza għal din id-Direttiva jew ikunu supplimentati b'din ir-referenza fl-okkażjoni tal-pubblikazzjoni uffiċjali tagħhom. L-Istati Membri għandhom jistabbilixxu kif għandha tkun magħmula din ir-referenza.2. L-Istati Membri għandhom jgħarrfu lill-Kummissjoni bit-test tad-dispożizzjonijiet tal-liġi nazzjonali li jaddottaw fil-qasam kopert minn din id-Direttiva, flimkien ma' tabella li turi kif id-dispożizzjonijiet ta' din id-Direttiva jikkorrispondu mad-dispożizzjonijiet nazzjonali addottati.Artikolu 15Dħul fis-seħħ tad-DirettivaDin id-Direttiva għandha tidħol fis-seħħ fil-jum tal-pubblikazzjoni tagħha fil-Ġurnal Uffiċjali ta' l-Unjoni Ewropea.Artikolu 16DestinatarjiDin id-Direttiva hi ndirizzata lill-Istati Membri.Magħmul ġo Strasbourg, 21 t'April 2004.Għall-Parlament EwropewIl-PresidentP. CoxGħall-KunsillIl-PresidentD. Roche[1] ĠU C 220, 16.09.03, p. 43.[2] Opinjoni tal-Parlament Ewropew tal-25 ta' Settembru 2003 (għadu mhux ippubblikat fil-Ġurnal Uffiċjali), Pożizzjoni Komuni tal-Kunsill tas-7 ta' Jannar 2004 (ĠU C 79 E, 30.3200,p.1) u l-Pożizzjoni tal-Parlament Ewropew tat-30 ta' Marzu 2004 (għadu mhux ippubblikat fil-Ġurnal Uffiċjali).[3] ĠU L 309, 27.11.01, p. 22.[4] ĠU L 85, tad-29.3.1999, p. 1. Id-Direttiva kif emendate bir-Regolazzjoni (KE) Nru 1882/2003 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (ĠU L 284, tal-31.10.2003, p. 1).[5] ĠU L 42, tat-23.2.1970, p. 1. Id-Direttiva kif emendata l-aħħar bid-Direttiva 2004/3/EC tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (ĠU L 49, tad-19.2.2004, p. 36).[6] ĠU L 184, 17.07.99, p. 23.--------------------------------------------------L-ANNESS ISKOP1. Għall-għanijiet ta' din id-Direttiva,żebgħa u lostri tfisser prodotti elenkati fis-sottokategoriji hawn taħt, eskluż areosoli. Dawn huma kisi li huma applikati fuq il-bini, it-tiżjin u tgħammir tagħhom, u strutturi assoċjati għal skopijiet dekorattivi, funzjonali u prottetivi.1.1. Sottokategoriji:"kisjiet matti għal ħitan interni u soqfa"  tfisser kisjiet iddiżinjati għal applikazzjoni fuq ħitan ta' ġewwa u sofqa bi grad ta' tleqqija < = 25@60o."kisjiet li jleqqu għal ħitan interni u soqfa"  tfisser kisjiet iddiżinjati għal applikazzjoni fuq ħitan ta' ġewwa u soqfa bi grad ta' tleqqija > 25@60o."kisjiet għal ħitan esterni ta' sustrat minerali"  tfisser kisjiet iddiżinjati għal applikazzjoni fuq ħitan ta' barra tal-ġebel, briks jew stokk;"dekorazzjoni interna/esterna u kisi minn barra għal injam; metal jew plastik"  tfisser kisjiet li jiproduċu rita opâka u huma ddiżinjati għal użu fuq dekorazzjoni u kisi minn barra.Dawn il-kisjiet huma ddiżinjati għal sustrat ta' l-injam, metal jew plastik. Din is-sottokategorija tinkludi żebgħa li tintuża għal passati ta' taħt u kisjiet intermedjari;"lostri ta' dekorazzjoni interna/esterna u kulur għall-injam"  tfisser kisjiet iddiżinjati għal applikazzjoni fuq dekorazzjoni li tipproduċi rita trasparenti jew semi-trasparenti għal dekorazzjoni u protezzjoni ta' injam, metal u plastik. Din is-sottokategorija tinkludi kuluri opâki għall-injam. Kuluri opâki għall-injam tfisser kisjiet li jipproduċi rita opâka għad-dekorazzjoni u protezzjoni ta' l-injam, kontra l-azzjoni tat-temp, hekk kif definit f'EN 927-1, fi ħdan il-kategorija semi-stabbli;"kuluri għal injam b'binja minima"  tfisser kuluri għall-injam li, skond EN 927-1:1996, għandhom ħxuna medja ta' anqas minn 5 μm meta jiġi ttestjat skond ISO 2808: 1997, metodu 5A;"żebgħa ta' l-ewwel passata"  tfisser kisjiet bi proprjetajiet ta' siġillar u/jew imblokkar iddiżinjati għal użu fuq l-injam jew ħitan u soqfa;"żebgħa ta' l-ewwel passata li tissolidifika"  tfisser kisjiet iddiżinjati sabiex jistabillizzaw partikoli sfużi ta' sustrat jew jagħddi proprjetatiet idrofobiki u/jew jipproteġu l-injam kontra tebgħa kaħlija;"kisjiet bi prestazzjoni ta'pakkett wieħed"  tfisser kisjiet bi prestazzjoni bbażatha fuq materjal li jifforma rita. Dawn huma ddiżinjati għal applikazzjonijiet li jinħtieġielhom prestazzjoni speċjali, bħalma huma l-ewwel passata żebgħa u l-aħħar passata żebgħa fuq il-plastik, kisja ta' l-ewwel passata żebgħa għal sustrati li fihom il-ħadid, kisja żebgħa ta' l-ewwel passata għal metalli reattivi bħalma huma iż-żingu u l-aluminju, lostri ta' kontra il-korrużjoni, kisjiet ta' l-art, inklużi għal artijiet ta' l-injam u siment, reżistenza kontra l-graffiti, li jżomm in-nar lura, stândardi ta' iġjene fl-industrija ta' l-ikel u xorb jew fis-servizzi tas-saħħa;"kisjiet bi prestazzjoni ta' żewġ pakketti"  tfisser kisjiet bl-istess użu bħal kisjiet ta' prestazzjoni ta' pakkett wieħed, imma b'komponent ieħor (eż. ammini terzjarji) miżjud qabel l-applikazzjoni;"kisjiet b'ħafna kuluri"  tfisser kisjiet iddiżinjati biex jagħtu effett ta' żewġ kuluri jew ta' ħafna kuluri, direttament ma' l-ewwel applikazzjoni;"kisjiet b'effetti dekorattivi"  tfisser kisjiet iddiżinjati biex jagħtu effetti estetiċi speċjali fuq sustrati jew kisjiet ta' taħt miżbugħin apposta u sessegwentament ittrattati b'diversi għodda matul il-perjodu ta' tnixxif.2. Għall-iskop ta' din id-Direttiva, "prodotti li jillostraw vetturi mil-ġdid" tfisser prodotti elenkati fis-sottokategoriji hawn taħt. Dawn huma użati għal kisi ta' vetturi tat-triq kif definiti fid-Direttiva 70/156/KEE:, jew parti minnhom, liemha xogħol ikun magħmul bħala parti minn tiswija ta' vetturi, konservazzjoni jew dekorazzjoni barra minn stallazzjonijiet ta' manifattura.2.1. Sottokategorija:"preparatorji u tindif" (i) prodotti preparatorji jinkludu likwidu għat-tlaħliħ ta' l-azzarin (prodott iddiżinjat biex inaddfu apparat li jraxxax iż-żebgħa u apparat ieħor), apparat li jqaxxar iż-żebgħa, apparat li jneħħi ix-xaħam (inkluż tipi ta' kontra l-istatika għal plastik) u neħħejja tas-silikone;(ii) "naddâf minn qabel" tfisser prodott tat-tindif iddiżinjat għat-tneħħija ta' kontaminazzjoni tal-wiċċ waqt il-preparazzjoni għal u qabel l-applikazzjoni ta' materjal tal-kisi;"Mili tal-bôdi/waqqafa"  tfisser komposizzjonijiet li għandhom massa akbar minn normal iddiżinjati biex ikunu applikati sabiex jimlew imperfezzjonijiet fondi tal-wiċċ qabel l-applikazzjoni tal-kisi tal-wiċċ/milli;"żebgħa ta' l-ewwel passata" (i) "kisi tal-wiċċ/milli" tfisser kisja ddiżinjata biex tkun applikatha eżatt qabel l-applikazzjoni tal-passata ta' fuq għall-għan li tireżisti l-korrużjoni, biex jiżgura adeżjoni tal-passata ta' fuq, u biex tippromwovi l-formazzjoni ta' lostru tal-wiċċ uniformi billi jimla mperfezzjonijiet żgħar fil-wiċċ;(ii) "żebgħa ta' l-ewwel passata għal użu ġenerali fuq il-metall" tfisser kisja ddiżinjatha għal applikazzjoni bħala żebgħa ta' l-ewwel passata, bħalma huma promoturi ta' adeżjoni, siġillanti, kisi tal-wiċċ, passati ta' taħt, żebgħa ta' l-ewwel passata għal użu fuq il-plastik, mxarrab fuq mxarrab, milli mingħajr ramel u apparat li jraxxax biex jimla;(iii) "żebgħa ta' l-ewwel passata għat-taħsil" tfisser kisjiet li fihom ikun jinstab mhux anqas minn 0,5 % bil-piż ta' l-aċidu fosforu ddiżinjat biex ikun applikat direttament fuq uċuh tal-metall għerjin biex jipprovdi reżistenza kontra l-korrużjoni u adeżjoni; kisjiet użati bħala żebgħa ta' l-ewwel passata li jista' jiġi ssaldjat; u bħala soluzzjonijiet niggieża għal uċuh galvanizzati u taż-żingu;"passata ta' fuq" (i) "kisjiet ta' taħt" tfisser kwalunkwe kisjiet pigmentati ddiżinjati sabiex jipprovdu kulur ukwalunkwe effeti ottiċi mixtieqa, imma mhux it-tleqqija jew reżistenza tal-wiċċ tas-sistema tal-kisi;(ii) "kisja trasparenti" tfisser kisja trasparenti ddiżinjata sabiex tipprovdi it-tleqqija aħħarija u proprjetajiet ta' reżistenza tas-sistema tal-kisi;"lostri speċjali"  tfisser kisjiet iddiżinjati għal applikazzjoni bħala passati tal-wiċċ li jeħtieġu proprjetajiet speċjali, bħalma huma effetti metallicċi jew tal-perla, f'saff wieħed, kulur solidu ta' prestazzjoni għolja u kisjiet trasparenti (eż. kontra t-tibrix u kisja trasparenti miżjud bil-fluworin, passata ta' taħt riflettiva, lostri li m'humiex lixxi (eż. martell), kontra ż-żlieq, kolla ta' taħt il-bòdi, kisjiet kontra t-tixlif, lostri interni; u aerosoli.--------------------------------------------------L-ANNESS IIA. VALURI TA’ LIMITU GĦAL KONTENUT MASSIMU TA’ VOC GĦAL ŻEBGĦA U LOSTRI| Sottokategoriji ta’ Prodotti | Tip | Fażi I (g/l [1]) (minn 1.1.2007) | Fażi II (g/l [1]) (minn 1.1.2010) |a | Ħitan matti interni u soqfa (Tleqqija <25@60o) | WB | 75 | 30 |SB | 400 | 30 |b | Ħitan ileqqu interni u soqfa (Tleqqija >25@60o) | WB | 150 | 100 |SB | 400 | 100 |c | Ħitan esterni ta' sustrat minerali | WB | 75 | 40 |SB | 450 | 430 |d | Żebgħa ta' tiżjin intern/estern u kisi minn barra għal injam u metal | WB | 150 | 130 |SB | 400 | 300 |e | Lostri ta' tiżjin u kulur ta' l-injam interni/esterni inkluż kuluri opâk igħalinjam | WB | 150 | 130 |SB | 500 | 400 |f | Kuluri interni u esterni għal injam b'binja minima | WB | 150 | 130 |SB | 700 | 700 |g | Żebgħa ta' l-ewwel passata | WB | 50 | 30 |SB | 450 | 350 |h | Żebgħa ta' l-ewwel passata li tissolidifika | WB | 50 | 30 |SB | 750 | 750 |i | Kisjiet bi prestazzjoni ta' pakkett wieħed | WB | 140 | 140 |SB | 600 | 500 |j | Kisjiet bi prestazzjoni reattiva ta' żewġ pakketti għal użu aħħari speċifikat bħalma huma l-artijiet | WB | 140 | 140 |SB | 550 | 500 |k | Kisjiet bb'ħafna kuluri | WB | 150 | 100 |SB | 400 | 100 |l | Kisjiet b'effetti dekorattivi | WB | 300 | 200 |SB | 500 | 200 |B. VALURI TA' LIMITU GĦAL KONTENUT MASSIMU TA' VOC GĦAL PRODOTTI TA' LOSTRU MILL-ĠDID TAL-VETTURI| Sottokategorija tal-Prodott | Kisjiet | VOC g/l [2] (1.1.2007) |a | Preparatorji u tindif | Preparatorji | 850 |Naddâf minn qabel | 200 |b | Mili tal-bôdi/waqqafa | Tipi kollha | 250 |c | Żebgħa ta' l-ewwel passata | Kisi tal-wiċċ u żebgħa ta' l-ewel passata ġenerali (metal) | 540 |Żebgħa ta' l-ewwel passata għat-taħsil | 780 |d | Passata ta' fuq | Tipi kollha | 420 |e | Lostri speċjali | All types | 840 |[1] g/l magħmul u lest[2] g/l tal-prodott magħmul u lest. Ħlief għal sottokategorija (a) kwalunkwe kontenut ta’ ilma għandu jiġi skontat.--------------------------------------------------ANNEX IIIMETODI MSEMMIJIN FL-ARTIKOLU 3.1Il-Parametru | L-Unità | Test |Metodu | Data ta’ publikazzjoni |Kontenut ta’ OC | g/l | ISO 11890-2 | 2002 |Kontenut ta’ OC fejn hemm preżenza ta’ OC fejn hemm preżenza ta’ dilwenti reattivi | g/l | ASTMD 2369 | 2003 |--------------------------------------------------