Svarbus teisinis pranešimas

|

31998L0057

1998 m. liepos 20 d. Tarybos direktyva 98/57/EB dėl Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kontrolės

Oficialusis leidinys L 235 , 21/08/1998 p. 0001 - 0039 CS.ES skyrius 3 tomas 23 p. 375  - 413 ET.ES skyrius 3 tomas 23 p. 375  - 413 HU.ES skyrius 3 tomas 23 p. 375  - 413 LT.ES skyrius 3 tomas 23 p. 375  - 413 LV.ES skyrius 3 tomas 23 p. 375  - 413 MT.ES skyrius 3 tomas 23 p. 375  - 413 PL.ES skyrius 3 tomas 23 p. 375  - 413 SK.ES skyrius 3 tomas 23 p. 375  - 413 SL.ES skyrius 3 tomas 23 p. 375  - 413

		Tarybos direktyva 98/57/EB1998 m. liepos 20 d.dėl Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kontrolėsEUROPOS SĄJUNGOS TARYBA,atsižvelgdama į Europos ekonominės bendrijos steigimo sutartį, ypač į jos 43 straipsnį,atsižvelgdama į Komisijos pasiūlymą [1],atsižvelgdama į Europos Parlamento nuomonę [2],atsižvelgdama į Ekonomikos ir socialinių reikalų komiteto nuomonę [3],kadangi kenksmingas organizmas Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. anksčiau buvo vadinamas Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; kadangi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. tikriausiai taps pripažintu mikroorganizmo pavadinimu; kadangi šioje direktyvoje turėtų būti atsižvelgta į šią mokslo naujovę;kadangi bulvių ir pomidorų auginimas užima svarbią vietą Bendrijos žemės ūkyje; kadangi bulvių ir pomidorų derliui nuolat gresia kenksmingų organizmų pavojus;kadangi apsaugant bulves ir pomidorus nuo tokių kenksmingų organizmų, turėtų būti ne tik išlaikoma ta pati gamybos apimtis, bet ir keliamas žemės ūkio produktyvumas;kadangi apsaugos priemonės, kuriomis siekiama, kad kenksmingi organizmai nepatektų į valstybės narės teritoriją, turėtų tiktai ribotą poveikį, jei tuo pačiu metu ir metodiškai visoje Bendrijoje nebūtų kontroliuojami ir nebūtų užkirstas kelias jiems išplisti;kadangi vienas iš bulvėms ir pomidorams kenksmingų organizmų yra Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., bulvių rudojo puvinio bei bulvių ir pomidorų bakterinio vytulio patogenas; kadangi kai kuriose Bendrijos srityse kilo šio patogeno sukelti puvinio protrūkiai ir dar tebėra nedidelių šios infekcijos židinių;kadangi, bulvių ir pomidorų auginimui Bendrijoje gali kilti didelis pavojus, jei nebus imtasi veiksmingų priemonių dėl šių pasėlių: nustatyta šio organizmo buvimo vieta ir jo pasiskirstymas, sustabdytas jo atsiradimas ir plitimas, o jį aptikus – sustabdytas plitimas ir kontroliuojama, kol bus sunaikintas;kadangi, to siekiant, Bendrijoje turi būti imamasi tam tikrų priemonių; kadangi valstybės narės prireikus turi taip pat turėti galimybę imtis papildomų arba griežtesnių priemonių su sąlyga, kad nebus daroma kliūčių bulvių ir pomidorų produkcijos judėjimui Bendrijoje, išskyrus atvejus, nustatytus 1976 m. gruodžio 21 d. Tarybos direktyvoje 77/93/EEB dėl apsaugos priemonių, skirtų apsisaugoti nuo augalams arba augaliniams produktams kenksmingų organizmų įvežimo į valstybes nares [4]; kadangi apie šias priemones turi būti pranešta kitoms valstybėms narėms ir Komisijai;kadangi imantis priemonių turi būti atsižvelgta į tai, jog nustatant patogeno buvimo vietą reikalinga atlikti sistemingus oficialius tyrimus; kadangi tokie tyrimai turi apimti tikrinimo procedūras ir, jei reikia, bandinių ėmimo ir tyrimo procedūras, žinant, kad esant tam tikroms aplinkos sąlygoms, liga gali išlikti latentinė ir likti nepastebėta tiek augančių bulvių pasėliuose, tiek sandėliuojamuose bulvių gumbuose; kadangi patogeno plitimas augančiame augale nėra pats svarbiausias veiksnys, bet kadangi patogenas gali plisti paviršiniu vandeniu ir per kai kuriuos susijusius laukinius bulvinių šeimos augalus, ir todėl bulvių ir pomidorų pasėlių laistymas užterštu vandeniu kelia šiems pasėliams infekcijos pavojų; kadangi savaime sudygusiuose bulvių ir pomidorų augaluose patogenas gali išlikti ir per žiemą, šie augalai gali tapti infekcijos šaltiniu, plintančiu iš vieno sezono į kitą; kadangi patogenas plinta bulvėms liečiantis su apkrėstomis bulvėmis ir su sodinimo, derliaus nuėmimo ir apdorojimo įrenginiais arba vežimo ir sandėliavimo konteineriais, kurie buvo mikroorganizmo užkrėsti jų ankstesnio sąlyčio su apkrėstomis bulvėmis metu;kadangi patogeno plitimas gali būti sumažintas arba sustabdytas šiuos daiktus išvalius; kadangi bet koks tokio pobūdžio sėklinių bulvių užkrėtimas kelia didelį patogeno išplitimo pavojų; taip pat ir sėklinių bulvių latentinė infekcija kelia didelį patogeno išplitimo pavojų ir viso šito galima išvengti, naudojant sėklines bulves, išaugintas pagal oficialiai pavirtintą programą, pagal kurią sėklinės bulvės buvo patikrintos, ir kuriose infekcijos nebuvo aptikta;kadangi naujausios biologinės ir epidemiologinės žinios apie Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Europos sąlygomis nėra išsamios ir yra numatoma, kad po kelių sezonų pasiūlytas priemones reikės būtinai peržiūrėti; taip pat yra numatoma patobulinti tyrimo procedūras atsižvelgiant į vėlesnius tyrinėjimus ir ypač kreipiant dėmesį į tyrimų metodų jautrumą bei specifiškumą, tam, kad būtų atrinkti ir standartizuoti naudojami geriausi tyrimų metodai;kadangi detalizuojant tokias bendrąsias priemones, taip pat dėl griežtesnių arba papildomų priemonių, kurių valstybės narės imasi tam, kad užkirstų kelią patogeno patekimui į jų teritoriją, pageidautina, kad valstybės narės Augalų sveikatos nuolatiniame komitete (toliau - Komitetas) glaudžiai bendradarbiautų su Komisija,PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ:1 straipsnisŠi direktyva pateikia priemones, kurių valstybės narės turi imtis prieš Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., anksčiau žinomą kaip Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, (toliau - mikroorganizmas) dėl I priedo I skirsnyje išvardytų mikroorganizmo šeimininkų (toliau – augalinės medžiagos sąrašas), siekdamos:a) nustatyti mikroorganizmo buvimo vietą ir jo išplitimą;b) užkirsti kelią jo atsiradimui ir plitimui; irc) aptikus mikroorganizmą, užkirsti kelią jo plitimui ir jį kontroliuoti, siekiant visiško išnaikinimo.2 straipsnis1. Valstybės narės kasmet atlieka sisteminius oficialius patikrinimus ieškant mikroorganizmo ant jų teritorijoje kilusios sąraše pateiktos augalinės medžiagos. Tam, kad būtų nustatyti kiti galimi užkrėtimo šaltiniai, keliantys grėsmę sąraše pateiktos augalinės medžiagos produkcijai, valstybės narės atlieka rizikos įvertinimą, ir, jei to įvertinimo metu mikroorganizmo išplitimo pavojus nenustatomas, sąraše pateiktos augalinės medžiagos gamybos plotuose jos atlieka oficialius tikslinius patikrinimus, ieškant mikroorganizmų ant kitų augalų, nei sąraše pateiktos augalinės medžiagos, įskaitant laukinius bulvinių šeimos mikroorganizmo šeimininkus, taip pat paviršiniame vandenyje, kuris naudojamas laistyti arba purkšti sąraše pateiktas augalines medžiagas, taip pat ir skystose atliekose, pašalinamose iš pramoninio perdirbimo arba pakavimo patalpų, kuriose dirbama su sąraše pateikta augaline medžiaga, ir naudojamos sąraše pateiktos augalinės medžiagos laistymui ar purškimui. Šių tikslinių tyrimų apimtis nustatoma pagal nustatytą rizikos laipsnį. Valstybės narės taip pat gali atlikti oficialius patikrinimus ieškant mikroorganizmo konkrečiose medžiagose, pvz., augimo terpėje, dirvožemyje ir kietose atliekose, kurios pašalinamos iš pramoninio perdirbimo arba pakavimo patalpų.2. Šio straipsnio 1 dalyje numatytais oficialiais patikrinimais tikrinama:a) sąraše pateikta augalinė medžiaga, pagal I priedo II skirsnio 1 punkte nustatytas detales; irb) mikroorganizmo šeimininkai, išskyrus sąraše pateiktą augalinę medžiagą, ir vanduo, įskaitant skystas atliekas, taikant atitinkamus metodus, o prireikus imami bandiniai oficialiems arba oficialiai prižiūrimiems laboratoriniams tyrimams;c) prireikus, kita medžiaga taikant atitinkamus metodus.Kaip apibrėžta Direktyvoje 77/93/EEB, remdamosi pagrįstais moksliniais ir statistiniais principais bei mikroorganizmo biologija ir atsižvelgdamos į toje valstybėje narėje pripažintas konkrečias sąraše pateiktos augalinės medžiagos auginimo sistemas ir, atitinkamai, į kitus mikroorganizmo šeimininkus, atsakingos oficialiosios institucijos smulkiai nustato ir kitas kontrolės procedūras, bandinių skaičių, kilmę, stratifikaciją ir bandinių ėmimo laiką, būtinus atliekant šiuos patikrinimus.3. Apie šio straipsnio 1 dalyje numatytų oficialių patikrinimų detales ir rezultatus kasmet pranešama kitoms valstybėms narėms ir Komisijai, kaip numatyta I priedo II skirsnio nuostatose. Šie pranešimai pateikiami iki birželio 1 d., išskyrus pranešimus apie sėklai paliktas bulves, apie kurias pranešama iki rugsėjo 1 d. Detalės ir rezultatai apie pasėlius yra lyginami su praeitų metų produkcija. Šių pranešimų detalės gali būti pateikiamos Komitetui.4. Toliau pateikta nuostata priimama Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka:- 2 dalies pirmos pastraipos b punkte numatyti atitinkami patikrinimų ir laboratorinio tyrimo metodai.5. Toliau pateiktos nuostatos gali būti priimtos Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka:- 2 dalies pirmos pastraipos c punkte numatyti atitinkami patikrinimų metodai,- 2 dalies antroje pastraipoje numatytos kitos patikrinimų detalės, kad būtų garantuotas užtikrinimo lygių įvairiose valstybėse narėse palyginamumas.3 straipsnisValstybės narės užtikrina, kad apie įtariamą mikroorganizmo išplitimą arba patvirtintą jo buvimą jų teritorijoje bus pranešta šalies atsakingoms oficialiosioms institucijoms.4 straipsnis1. Kiekvienu įtariamo išplitimo atveju valstybės narės/valstybių narių atsakingos oficialiosios institucijos užtikrina oficialų arba oficialiai prižiūrimą laboratorinį tyrimą, atliekamą taikant sąraše pateiktoms augalinėms medžiagoms tinkamą II priede numatytą metodą ir laikantis III priedo I punkto reikalavimų, arba visais kitais atvejais taikant kitą oficialiai patvirtintą metodą, kad būtų patvirtintas arba paneigtas įtariamas išplitimas. Patvirtinus mikroorganizmo išplitimą, taikomi III priedo 2 punkte nustatyti reikalavimai.2. Kol bus patvirtintas arba paneigtas šio straipsnio 1 dalyje minimas įtariamas išplitimas, kiekvienu įtariamo išplitimo atveju, jeigu:i) buvo pastebėti mikroorganizmo sukelti ligos diagnostiniai simptomai arba, atlikus greitos atrankos tyrimą/-us, kaip smulkiai aprašyta II priedo I skirsnio 1 punkte ir II skirsnyje, buvo gautas teigiamas rezultatas; arbaii) atlikus greitos atrankos tyrimą/-us, smulkiai aprašytą II priedo I skirsnio 2 punkte ir III priede, buvo gautas teigiamas rezultatas,valstybės narės atsakingos oficialiosios institucijos savo produkcijos atžvilgiu:a) uždraudžia augalų arba jų gumbų iš visų partijų ar siuntų, iš kurių buvo imami bandiniai, judėjimą, išskyrus tų institucijų kontroliuojamą, ir tik tuo atveju, jei buvo nustatyta, kad nėra pavojaus mikroorganizmui išplisti;b) imasi priemonių nustatyti pirminį įtariamo išplitimo šaltinį;c) pagal įvertintos rizikos laipsnį, taiko reikiamas papildomas atsargumo priemones, ypač dėl sąraše pateiktos augalinės medžiagos auginimo ir dėl sėklinių bulvių siuntų judėjimo, išskyrus a punkte paminėtų bulvių, išaugintų toje vietoje, iš kurios buvo paimti a punkte paminėti bandiniai, siuntas, kad būtų išvengta mikroorganizmo plitimo.3. Tais įtariamo išplitimo atvejais, kai vienai valstybei narei kyla sąraše pateiktos augalinės medžiagos arba paviršinio vandens užkrėtimo pavojus iš kitos/kitų valstybių narių, valstybė narė, kurioje buvo paskelbta apie įtariamą išplitimą, atsižvelgdama į rizikos laipsnį, nedelsdama praneša minėto įtariamo išplitimo detales suinteresuotai valstybei narei/valstybėms narėms, o minėtos valstybės narės atitinkamai bendradarbiauja. Gavusi tokį pranešimą, valstybė narė/valstybės narės imasi atsargumo priemonių, kaip nurodyta 2 dalies c punkte, bei visų kitų atitinkamų veiksmų, kaip nurodyta 1 ir 2 dalyse.4. Toliau pateikta nuostata gali būti priimta Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka:- 2 dalies c punkte numatytos priemonės.5 straipsnis1. Jei oficialus arba oficialiai prižiūrimas laboratorinis tyrimas, atliekamas su sąraše pateikta augaline medžiaga, taikant atitinkamą II priede pateiktą metodą arba, visais kitais atvejais, bet kokį kitą oficialiai pripažintą metodą, patvirtina mikroorganizmo buvimą bandinyje, paimtame pagal šios direktyvos nuostatas, valstybės narės atsakingos oficialiosios institucijos, remdamosis pagrįstais moksliniais principais, mikroorganizmo biologija ir konkrečiomis tokio mikroorganizmo šeimininkų auginimo, realizavimo ir perdirbimo toje valstybėje narėje:a) sąraše pateiktos augalinės medžiagos atveju:i) atlieka tyrimą, siekiantį nustatyti užkrėtimo laipsnį ir pirminį šaltinį/šaltinius pagal IV priede pateiktas nuostatas, toliau tiria, kaip nurodyta 4 straipsnio 1 dalyje, bent jau visas klonavimo požiūriu susijusias sėklinių bulvių atsargas, irii) pripažįsta užkrėstais sąraše pateiktą augalinę medžiagą, siuntą ir (arba) partiją iš kurios buvo paimti bandiniai, bei mechanizmus, transporto priemonę, talpas, laivą, sandėlį ar jų dalis ir visus kitus objektus, įskaitant ir pakavimo medžiagas, kurie lietėsi su sąraše pateikta augaline medžiaga, iš kurios buvo paimti bandiniai; taip pat pripažįsta užkrėstais lauką/laukus, saugomų pasėlių plotą/plotus ir auginimo vietas, kuriose buvo nuimtas sąraše pateiktos augalinės medžiagos derlius ir iš kurių buvo paimti bandiniai; pripažįsta užkrėstais lauką/laukus, vietą/vietas ir, jei reikia, saugomus pasėlių plotus, iš kurių bandiniai buvo paimti augimo metu, iriii) laikantis V priedo 1 punkte išdėstytų nuostatų, nustato apimtį užkrėtimo, kuris galėjo įvykti prieš derliaus nuėmimą ir po jo, auginimo metu, dėl laistymo ir purškimo jungčių arba klonavimo metu dėl sąlyčio su nustatyto užkrėtimo židiniu, iriv) pažymi teritoriją demarkacine linija, remiantis ii punkte aprašytu užkrėtimo nustatymu, iii punkte aprašytu galimo užkrėtimo apimties nustatymu ir galimu mikroorganizmo išplitimu, remiantis V priedo 2 punkto i papunkčio nuostatomis;b) kitų mikroorganizmo šeimininkų pasėlių atveju, išskyrus paminėtuosius a punkte, tais atvejais, jei yra nustatyta, kad sąraše pateiktai augalinei medžiagai kyla pavojus,i) atlieka tyrimą, kaip nurodyta a punkto i papunktyje; irii) pripažįsta užkrėstais mikroorganizmo šeimininkus, iš kurių buvo paimtas bandinys; iriii) nustato sąraše pateiktos augalinės medžiagos galimą užkrėtimą ir pažymi teritoriją demarkacine linija, remiantis a punkto iii ir iv papunkčiai;c) paviršinio vandens (įskaitant skystas atliekas iš pramoninio perdirbimo ir pakavimo patalpų, kuriose yra dirbama su sąraše pateiktomis augalinėmis medžiagomis) ir šalia augančių laukinių bulvinių šeimos mikroorganizmo šeimininkais atveju, jei sąraše pateiktų augalinių medžiagų produkcijai kyla užkrėtimo pavojus laistant, purškiant arba dėl paviršinio vandens patvinimo,i) atlieka paviršinio vandens ir laukinių bulvinių šeimos mikroorganizmo šeimininkų, jei tokių yra, bandinių tyrimus, įskaitant tam tikru nustatytu metu atliekamus oficialius patikrinimus, siekiant nustatyti užkrėtimo laipsnį; irii) pripažįsta užkrėstais paviršinį vandenį, iš kurio buvo paimtas bandinys/bandiniai tyrimui, remiantis i papunktyje minimu tyrimu; iriii) nustato galimą užkrėtimą ir pažymi užkrėstą teritoriją demarkacine linija, remiantis ii papunktyje nurodytu užkrėtimo nustatymu, ir nustato galimą mikroorganizmo išplitimą, atsižvelgiant į V priedo 1 punkto ir V priedo 2 punkto ii papunkčio nuostatas.2. Laikydamosi V priedo 3 punkto nuostatų, valstybės narės nedelsdamos praneša kitoms valstybėms narėms ir Komisijai apie bet kokį užkrėtimą, nustatytą remiantis šio straipsnio 1 dalies a punkto ii papunkčiu ir šio straipsnio 1 dalies c punkto ii papunkčiu, ir apie teritorijos pažymėjimo demarkacine linija detales, remiantis šio straipsnio 1 dalies a punkto iv papunkčiu ir, jei taikytina, šio straipsnio 1 dalies c punkto iii papunkčiu. Šioje straipsnio dalyje minimos pranešimo detalės gali būti pateikiamos Komitetui.Tuo pačiu metu valstybės narės pateikia Komisijai V priedo 4 punkte nustatytą papildomą pranešimą. Šioje pastraipos dalyje minimo pranešimo detalės yra nedelsiant pateikiamos Komiteto nariams.3. Pateikus šio straipsnio 2 dalyje minimą pranešimą ir jame nurodomas detales, kitos pranešime išvardytos valstybės narės numato šio straipsnio 1 dalies a punkto i papunktyje ir, jei taikytina, šio straipsnio 1 dalies c punkto i papunktyje nurodytą tyrimą ir prireikus imasi tolesnių atitinkamų veiksmų, nurodytų šio straipsnio 1 ir 2 dalyse.6 straipsnis1. Valstybės narės nurodo, kad sąraše pateiktos augalinės medžiagos, pripažintos užkrėsta pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto ii papunktį, negalima sodinti ir kad atsakingoms oficialiosioms institucijoms patikrinus ir patvirtinus, jai būtų taikomos VI priedo 1 punkto nuostatos, kad būtų nustatyta, jog organizmo išplitimo pavojaus nėra.2. Valstybės narės nurodo, kad negalima sodinti sąraše pateiktos augalinės medžiagos, kuri, kaip nustatyta, galbūt yra užkrėsta, pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto iii papunktį ir c punkto iii papunktį, įskaitant sąraše pateiktą augalinę medžiagą, kuriai, kaip nustatyta, gresia pavojus ir kuri auginama vietose, kurios apibūdinamos kaip galbūt užkrėstos pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto iii papunktį, ir ji, valstybių narių atsakingosioms valstybinėms institucijoms kontroliuojant, yra atitinkamai panaudojama arba pašalinama, kaip nurodyta VI priedo 2 punkte, kad būtų nustatyta, jog nėra pastebimo organizmo išplitimo pavojaus.3. Valstybės narės nurodo, kad visi mechanizmai, transporto priemonės, talpos, laivai, sandėliai arba jų dalys, ir visi kiti objektai, įskaitant pakavimo medžiagas, pripažinti užkrėstais remiantis 5 straipsnio 1 dalies a punkto ii papunkčiu, arba kuriuos galima laikyti užkrėstais, remiantis 5 straipsnio 1 dalies a punkto iii papunkčiu ir c punkto iii papunkčiu, yra sunaikinami arba išvalomi, taikant atitinkamus metodus, nurodytus VI priedo 3 punkte. Po išvalymo visi šie objektai nebelaikomi užkrėstais.4. Nepažeisdamos priemonių, įgyvendintų pagal šio straipsnio 1, 2 ir 3 dalių nuostatas, valstybės narės nurodo, kad pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto iv papunktį ir c punkto iii papunktį demarkacine linija pažymėtoje teritorijoje būtų įgyvendinamos VI priedo 4.1 ir 4.2 punktuose apibrėžtos priemonės. Smulkesnė informacija apie šias priemones yra kasmet perduodama valstybėms narėms ir Komisijai. Šio pranešimo detalės gali būti pateikiamos Komitetui.7 straipsnis1. Valstybės narės nurodo, kad sėklinės bulvės atitinka Direktyvos 77/93/EEB reikalavimus ir pagal oficialiai patvirtintą programą yra tiesiogiai išauginamos iš bulvinės medžiagos, kuri buvo įsigyta pagal oficialiai patvirtintą programą, ir, atlikus oficialų arba oficialiai prižiūrimą tyrimą taikant II priede pateiktą metodą, nebuvo aptiktas organizmas.Valstybė narė atlieka minėtą tyrimą:a) tais atvejais, kai mikroorganizmas/-ai buvo aptiktas jos pačios auginamose sėklinėse bulvėse,i) tiriant ankstesnes dauginimo stadijas, įskaitant pradinę klonų atranką ir sistemiškai tiriant pagrindinius sėklinių bulvių klonus; arbaii) tais atvejais, kai nustatyta, kad nėra klonų ryšio, tiriant visus pagrindinius sėklinių bulvių klonus arba ankstesnes dauginimo stadijas, įskaitant ir pirminę klonų atranką, irb) kitais atvejais tiriamas kiekvienas augalas, naudojamas pirminei klonų atrankai, arba pagrindinių sėklinių bulvių tipiniai mėginiai arba ankstesnių dauginimo stadijų mėginiai.2. Toliau išvardytos nuostatos gali būti priimtos Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nurodyta tvarka:- išsamios dalies antros pastraipos a punkto taikymo taisyklės,- taisyklės, susijusios su šio straipsnio 1 dalies antros pastraipos b punkte numatytais tipiniais mėginiais.8 straipsnisValstybės narės uždraudžia organizmą laikyti ir jį tvarkyti.9 straipsnisNepažeisdamos Direktyvos 77/93/EEB nuostatų, valstybės narės gali leisti nukrypti nuo šios direktyvos 6 ir 8 straipsniuose nurodytų priemonių, vadovaudamosi Direktyvoje 95/44/EB [5] (išdėstytomis nuostatomis bandymų ar moksliniais tikslais ir dėl darbo su rūšių atranka.10 straipsnisSavo pačių gaminamai produkcijai valstybės narės gali priimti tokias papildomas arba griežtesnes priemones, kurios gali būti reikalingos kovojant su organizmu arba sustabdant jo plitimą, tačiau tokiu atveju jos atitinka Direktyvoje 77/93/EEB pateiktas nuostatas.Išsamios šių priemonių detalės pranešamos kitoms valstybėms narėms ir Komisijai. Šio pranešimo detalės gali būti pateikiamos Komitetui.11 straipsnisŠios direktyvos priedų daliniai pakeitimai, atliktini remiantis mokslo ir technikos naujovėmis, tvirtinami Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka. Komisija, remdamasi įgyta patirtimi, persvarsto II priede nustatytus metodus ir VI priedo 4.1 ir 4.2 punktuose numatytas priemones, ir iki 2002 m. sausio 1 d. pateikia Komitetui pranešimą.12 straipsnis1. Valstybės narės priima įstatymus ir kitus teisės aktus, kurie, įsigalioję nuo 1999 m. rugpjūčio 21 d., įgyvendina šią direktyvą. Apie tai jos nedelsdamos praneša Komisijai.Valstybės narės, priimdamos šias priemones, daro jose nuorodas į šią direktyvą arba tokia nuoroda daroma jas oficialiai skelbiant. Nuorodos darymo tvarką nustato valstybės narės.2. Valstybės narės nedelsdamos pateikia Komisijai šios direktyvos taikymo srityje priimtų pagrindinių nacionalinių įstatymų nuostatų tekstus. Komisija apie tai informuoja kitas valstybes nares.13 straipsnisŠi direktyva įsigalioja jos paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje dieną.14 straipsnisŠi direktyva skirta valstybėms narėms.Priimta Briuselyje, 1998m. liepos 20 d.Tarybos varduPirmininkasW. Molterer[1] OL C 124, 1997 4 21, p.12 ir OL C 108, 1998 4 7, p. 85.[2] OL C 14, 1998 1 19, p. 34.[3] OL C 206, 1997 7 7, p. 57.[4] OL L 26, 1997 1 31, p.20. Direktyva su paskutiniais pakeitimais, padarytais Komisijos direktyva 98/2/EB (OL L 15, 1998 1 21, p. 34).[5] OL L 184, 1995 8 3, p.34. Direktyva su paskutiniais pakeitimais, padarytais Komisijos direktyva 97/46/EB (OL L 204, 1997 7 31, p. 43).--------------------------------------------------I PRIEDASI SKIRSNIS1 straipsnyje minimų Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. šeimininkų sąrašasSolanum tuberosum L. augalai (įskaitant stiebagumbius), išskyrus rūšinę sėklą | bulvės |Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. augalai, išskyrus vaisius ir sėklas | pomidorai |II SKIRSNISPatikrinimai1. 2 straipsnio 2 dalies a punkte minimi oficialūs patikrinimai yra grindžiami mikroorganizmo biologija ir konkrečiomis auginimo sistemomis toje valstybėje narėje ir susideda iš:i) tikrinant bulves,- augančių pasėlių vizualinio patikrinimo tinkamu metu ir (arba) bandinių ėmimo iš sėklinių ir kitų bulvių jų augimo metu arba esančių sandėliuose. Šie bandiniai yra oficialiai arba oficialiai prižiūrint vizualiai patikrinami, perpjaunant stiebagumbius, arba- tikrinant sėklines bulves, ir, jei reikia, kitas bulves, atliekamas oficialus arba oficialiai prižiūrimas laboratorinis tyrimas, taikant II priede nurodytą metodą,ii) tikrinant pomidorus,- tinkamu metu atliekamas vizualinis patikrinimas, bent jau augančių augalų, skirtų atsodinti profesiniam naudojimui.2. Pranešime apie 2 straipsnyje 3 dalyje minimus oficialius patikrinimus yra nurodoma:i) tikrinant bulves,- bendras plotas hektarais, apsodintas sėklinėmis arba kitomis bulvėmis,- stratifikavimas pagal sėklos kategoriją ir paskirtį ir, jei reikia, pagal regioną,- tyrimams paimtų bandinių skaičius ir jų paėmimo laikas,- laukuose atliktų vizualinių patikrinimų skaičius,- stiebagumbių vizualinių patikrinimų (ir bandinio vienetų) skaičius;ii) atliekant patikrinimus, bent jau augančių pomidorų, skirtų atsodinti profesiniam naudojimui, pasėlių,- bendras augalų skaičius,- vizualinių patikrinimų skaičius;iii) tikrinant kitus mikroorganizmo šeimininkus, išskyrus bulves ir pomidorus, tarp jų laukinius bulvinių šeimos mikroorganizmo šeimininkus,- rūšys,- tyrimams paimtų bandinių skaičius ir jų paėmimo laikas,- sritis/upė, iš kurios buvo paimti bandiniai,- analizės metodas;iv) tikrinant vandenį ir skystas atliekas iš pramoninio perdirbimo arba pakavimo patalpų,- tyrimams paimtų bandinių skaičius ir jų paėmimo laikas,- sritis/upė/patalpų vieta, iš kurios buvo paimti bandiniai,- analizės metodas.--------------------------------------------------II PRIEDASTYRIMŲ PLANAS, SKIRTAS RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOZUOTI, NUSTATYTI IR IDENTIFIKUOTITYRIMŲ PLANO TAIKYMO SRITISPateiktame plane apibūdinamos įvairios procedūros, atliekamos:i) diagnozuojant bulvių gumbų rudąjį puvinį ir bulvių bei pomidorų augalų bakterinį vytulį,ii) nustatant Ralstonia solanacearum bakteriją bulvių gumbų mėginiuose,iii) identifikuojant Ralstonia solanacearum.Papildymuose pateikiama smulkesnė informacija apie tai, kaip paruošti tyrimams reikalingas medžiagas, t. y. augimo terpes, buferinius tirpalus, tirpalus, reagentus.TURINYSI SKIRSNIS: | Tyrimų plano taikymas | 9 |1.Bulvių gumbų rudojo puvinio ir bulvių bei pomidorų augalų bakterinio vytulio diagnozavimas | 9 |2.Ralstonia solanacearumnustatymas ir identifikavimas bulvių gumbų mėginiuose | 11 |II SKIRSNIS: | Bulvių gumbų rudojo puvinio ir bulvių ir pomidorų augalų bakterinio vytulio diagnozavimas | 13 |1.Požymiai | 13 |2.Greitos atrankos bandymas (bandymai) | 13 |3.Išskyrimo procedūra | 14 |4.Patvirtinimo bandymas (bandymai) | 14 |III SKIRSNIS: | Ralstonia solanacearum nustatymas ir identifikavimas bulvių gumbų mėginiuose | 17 |1.Mėginio paruošimas tyrimui | 17 |2.Imunofluorescentinis (IF) bandymas | 18 |3.Fermentų jungimosi imuno-sorbentinis patikrinimo bandymas (ELISA) | 20 |4.Polimerazinis grandininės reakcijos bandymas (PCRTM) | 20 |5.Selektyvaus auginimo lėkštelėse bandymas | 22 |6.Biobandymas | 23 |7.Sodrinimo bandymas | 23 |8.Patogeniškumo bandymas | 23 |1 priedėlis | Maitinamoji terpė Ralstonia solanacearum išskyrimui ir auginimui | 24 |2 priedėlis | Medžiagos, naudojamos ruošiant mėginius | 25 |3 priedėlis | Medžiagos, naudojamos atliekant IF bandymą | 26 |4 priedėlis | Užkrėtimo lygio nustatymas taikant IF bandymą | 27 |5 priedėlis | Medžiagos, naudojamos atliekant ELISA bandymą | 28 |6 priedėlis | Medžiagos, naudojamos atliekant PCR bandymą | 29 |7 priedėlis | Medžiagos, naudojamos atliekant selektyvaus auginimo ir sodrinimo bandymą (bandymus) | 29 |Literatūra | 30 |I SKIRSNISTYRIMŲ PLANO TAIKYMAS1. Bulvių gumbų rudojo puvinio bei bulvių ir pomidorų augalų bakterinio vytulio diagnozavimasŠis tyrimas yra taikomas bulvių gumbams su tipiškais arba įtariamais rudojo puvinio požymiais ir bulvių bei pomidorų augalams su tipiškais arba įtariamais bakterinio vytulio požymiais. Jį sudaro greitos atrankos bandymas, patogeno išskyrimas iš užkrėsto apytakinio audinio naudojant diagnostinę terpę ir, gavus teigiamą rezultatą, Ralstonia solanacearum kultūros identifikavimas.+++++ TIFF +++++Struktūrinės diagramos nuorodos:() Požymių apibūdinimas yra pateiktas II.1 skirsnyje.() Greitos atrankos bandymai palengvina spėjamosios diagnozės nustatymą.Atliekami bandymai:- stiebo apytakinio audinio gleivių siūlų susidarymo bandymas (II skirsnio 2 dalis),- Poli-β-hidroksibutirato granulių bandymas (II skirsnio 2 dalis),- IF bandymas (III skirsnio 2 dalis),- ELISA bandymas (III skirsnio 3 dalis),- PCR bandymas (III skirsnio 4 dalis).() Nors patogeno išskyrimas iš tipiškus požymius turinčios augalinės medžiagos persėjimo būdu yra tiesioginis, vėlesnėje infekcijos stadijoje gali nepasisekti išauginti bakterijas. Saprofitinė bakterija, auganti ant sergančio audinio, gali užgožti arba slopinti patogeną išskyrimo terpėje. Jei išskyrimo bandymas yra neigiamas, bet ligos požymiai yra tipiški, išskyrimo bandymą privalu pakartoti, pageidautina naudojant selektyvią terpę.() Patikimai identifikuoti Ralstonia solanacearum grynąją kultūrą galima atliekant bent vieną iš II skirsnio 4.1 dalyje išvardytų bandymų, derinant jį su patogeniškumo bandymu (II skirsnis 4.3 dalis). Padermės charakteristika nėra privaloma, tačiau rekomenduojama kiekvienu nauju atveju.2. Ralstonia solanacearum nustatymas ir identifikavimas bulvių gumbų mėginiuoseŠi procedūra skirta latentiniam užkratui bulvių gumbuose nustatyti vienu arba, pageidautina, keliais nustatymo bandymais; jeigu rezultatai teigiami, atliekamas papildomas patogeno išskyrimo bandymas; tuo atveju, kai išskiriamos tipiškos kolonijos, identifikuojama grynoji Ralstonia solanacearum kultūra.+++++ TIFF +++++Nuorodos į struktūrinę diagramą:() Bandinio dydisStandartinis bandinio dydis yra 200 gumbų. Tačiau bandymas taip pat gali būti atliekamas ir su mažesniu gumbų skaičiumi.() Nustatymo bandymas (bandymai)Vienintelis atliktas bandymas gali būti nepakankamai tikslus ar patikimas Ralstonia solanacearum bakterijai nustatyti bandinyje, todėl rekomenduojama atlikti daugiau nei vieną bandymą, kuris būtų pagrįstas skirtingais biologiniais principais.() Imunofluorescentinis bandymas (IF)IF bandymas yra pasiteisinęs nustatymo bandymas. Jis yra pranašesnis už kitus bandymus, kurie dar nėra pakankamai ištobulinti arba oficialiai patvirtinti. Šis bandymas yra taikomas nustatyti daugelį kitų karantininių bakterijų, pvz., Clivabacter michiganensis subsp. sepedonicus. Pagal šio metodo parametrus, tai yra tikslus bandymas (tikslumo riba 103-104 ląstelių viename mililitre bulvių ekstrakto).Pagrindinis šio bandymo rezultatų patikimumo faktorius yra antiserumo kokybė. Tinkamas yra tik aukšto titro antiserumas (mažiausiai 2000 vienetų žaliame antiserume), ir visus bandymus privalu atlikti naudojant antiseruminį titrą arba vienu praskiedimu mažiau negu titras. Pageidautina taikyti netiesioginį būdą. Tiesioginis būdas gali būti taikomas tuo atveju, jei bandymo tikslumo ir specifiškumo lygis atitinka netiesioginio būdo lygį.IF bandymas yra pranašus specifiniu ląstelių dažymosi ir švytėjimo intensyvumu, kurie ir suteikia informacijos apie reakcijos specifiškumą. Ralstonia solanacearum ląstelių morfologiją turinčių serologiškai giminingų dirvos ir bulvių audinių bakterijų kryžminės reakcijos yra tos pačios. IF bandymas gali būti taikomas kaip vienintelis nustatymo bandymas, nors tais atvejais, kai įtariamos kryžminės reakcijos, turi būti atliekamas papildomas nustatymo bandymas, grindžiamas skirtingais biologiniais principais. Tokiais atvejais labiausiai tinka selektyvaus auginimo bandymas.() Selektyvaus auginimo bandymasNaudojant modifikuotą SMSA terpę ir specifinę tyrimo metodiką – tai tikslus ir selektyvus Ralstonia solanacearum bandymas. Rezultatai gaunami praėjus 3–6 dienoms nuo bandinių paruošimo. Patogenas randamas tiesiogiai kultūroje ir gali būti lengvai nustatomas. Kad būtų išnaudotos visos bandymo galimybės, reikia kruopščiai paruošti stolono prisisegimo vietą gumbe, kad nepatektų kitos bulvių gumbų bakterijos, kurios konkuruoja su Ralstonia solanacearum toje pačioje terpėje ir gali įtakoti patogeno vystymąsi. Kai kurios bakterijų padermės gali prastai augti, kadangi terpės komponentai gali paveikti pagrindinį organizmą. Taip pat reikalaujama rūpestingai atskirti Ralstonia solanacearum nuo kitų bakterijų, kurios gali išsivystyti terpėje. Selektyvus auginimas gali būti naudojamas kaip vienintelis nustatymo bandymas su sąlyga, kad tais atvejais, kai įtariama, jog kitos bakterijos slopina Ralstonia solanacearum augimą ir gaunamas neigiamas tyrimo rezultatas, mėginys tiriamas dar kartą, naudojant skirtingą bandymą, kad būtų galima patvirtinti arba paneigti diagnozę. Tokiais atvejais labiausiai tinka IF bandymas.() ELISA bandymasELISA bandymas paprastai pasižymi mažesniu tikslumu nei IF bandymas (tikslumo riba 104-105 ląstelių viename mililitre bulvių ekstrakto). Bandymas yra pigus ir greitas, tačiau dažniau pasitaiko klaidingai teigiamų (kryžminės reakcijos) ir klaidingai neigiamų rezultatų (bulvių ekstrakte esančių fenolio molekulių slopinimas). Keliami labai dideli reikalavimai antiserumui. ELISA bandymas negali būti naudojamas kaip vienintelis nustatymo bandymas.() PCR bandymasPCR bandymui būdingas didelis tikslumas, nors jį slopina augalų ar gumbų ekstrakto komponentai, lemiantys klaidingai neigiamus rezultatus. Kai kurios bulvių veislės turi daugiau procesą stabdančių medžiagų nei kitos, todėl yra būtina šiuos inhibitorius pašalinti. Slopinimą galima sumažinti skiedžiant, tačiau Ralstonia solanacearum populiacija taip pat atsiskies. Kiekviena bandinio ir bandymo paruošimo pakopa reikalauja didelio kruopštumo, norint išvengti užkrėtimo, kuris lemtų klaidingai teigiamus tyrimo rezultatus. Klaidingai teigiami rezultatai taip pat atsirasti dėl kitų organizmų homologinio atitikimo. Dėl šių priežasčių tiesioginis PCR negali būti taikomas kaip vienintelis nustatymo bandymas.() Sodrinimo bandymasAuginant bulvių ekstrakto pavyzdžius pusiau selektyviame sultinyje, pvz., modifikuotame SMSA sultinyje, yra galimybė padauginti Ralstonia solanacearum bakterijas. Dar svarbiau yra tai, kad jis praskiedžia ELISA ir PCR bandymų inhibitorius. Tokiu būdu IF, ELISA ir PCR bandymais galima nustatyti Ralstonia solanacearum, išaugintą sodrintame sultinyje. Šie sodrinimo bandymai dar nėra kruopščiai išbandyti ir ištyrinėti. Jie įtraukti čia, nes turi geras galimybes. Tačiau dėl praktinės patirties stokos jie negali būti taikomi kaip vieninteliai nustatymo metodai.() BiobandymasBiobandymas yra naudojamas išskirti Ralstonia solanacearum bakteriją iš sergančių bulvių selektyvinio sodrinimo metodu, po to užkrečiant pomidorų ir baklažanų augalus. Kaip nurodo šis metodas, bandymui reikia optimalių auginimo sąlygų. Bakterijos, slopinančios Ralstonia solanacearum augimą SMSA terpėje, greičiausiai neturės šiam bandymui įtakos.() Patvirtinimo bandymas (bandymai)Gryna Ralstonia solanacearum kultūra gali būti identifikuota atlikus bent vieną iš bandymų, išvardytų II skirsnio 4.1 dalyje, derinant jį su patogeniškumo testu (II skirsnis 4.3 dalis). Padermės charakteristika nėra privaloma, tačiau rekomenduotina kiekvienu nauju atveju.II SKIRSNISBulvių gumbų rudojo puvinio bei bulvių ir pomidorų augalų bakterinio vytulio diagnozavimas1. Požymiai1.1. Požymiai bulvėseBulvės augalas. Pirmoji infekcijos stadija – viršutinių augalo lapų vytimas esant aukštai dienos temperatūrai ir atsigavimas naktį. Tačiau labai greitai lapai nuvysta negrįžtamai, ir augalas žūsta. Skersai nupjautų nuvytusių augalų stiebų apytakinis audinys gali paruduoti, ir iš nupjauto paviršiaus išsiskiria arba lengvai gali būti išspaudžiamos į pieną panašios išskyros. Nupjautą stiebą vertikaliai panardinus į vandenį, iš apytakinių pluoštų nusidriekia gleivių siūlai.Bulvės gumbas. Bulvės gumbas turi būti perpjaunamas skersai arti stolonų prisisegimo vietos. Ankstyvajai infekcijos stadijai būdingas apytakinio žiedo išblukimas, spalvai keičiantis nuo blizgančios geltonos iki šviesiai rudos spalvos. Iš apytakinio žiedo po kelių minučių spontaniškai išsiveržia šviesiai kreminės spalvos išskyros. Vėliau apytakinis išblukimas paruduoja, ir nekrozė gali išsiplėsti iki parenchimatinio audinio. Išsivysčiusios ligos stadijose infekcija išsiveržia iš stolonų prisisegimo vietų ir akučių, ir dėl to žievėje gali susidaryti truputį pažeistos duobelės, iš kurių gali sunktis bakterijos, prie kurių prilimpa dirvos dalelės.1.2. Požymiai pomidoruosePomidoro augalas. Pirmasis pastebimas požymis - tai labai silpni pirmieji augalo lapeliai. Palankiomis patogenui aplinkos sąlygomis (dirvos temperatūra apie 25 °C, dirva prisotinta drėgmės), po keleto dienų vyksta epinastija ir vienos augalo pusės arba viso augalo vytimas, ir galiausiai augalas žūsta. Mažiau palankiomis sąlygomis (dirvos temperatūra mažesnė nei 25 °C) ant kamieno gali išsivystyti daug papildomų šaknų. Tuomet ant kamieno atsiranda pastebima gliti juosta, kuri įrodo apytakinės sistemos nekrozę. Perpjovus kamieną, iš išblukusių rudų apytakinių stiebo audinių išsiskiria balti arba gelsvi bakterinio skysčio lašeliai.2. Greitos atrankos bandymaiGreitos atrankos bandymai palengvina spėjamos diagnozės nustatymą. Taikykite vieną ar kelis iš šių bandymų:Stiebo gleivių siūlų susidarymo bandymasRalstonia solanacearum bakterijos buvimą vystančiuose bulvių ir pomidorų stiebuose galima įvertinti atlikus šį paprastą spėjamąjį bandymą:Nupjaukite stiebą truputį virš dirvos paviršiaus. Įmerkite nupjautą stiebą į menzūrą su vandeniu. Netrukus bakterijų gleivių siūlai pradės tekėti iš apytakinių pluoštų. Visoms kitoms bulvių apytakinę infekciją sukeliančioms bakterijoms šis reiškinys nebūdingas.Poli-beta hidroksibutirato (PBH) granulių nustatymasPBH granulės Ralstonia solanacearum bakterijų ląstelėse tampa regimos dažant Nilo mėlynuoju A arba Sudano juoduoju B:Paruoškite ant mikroskopo objektinio stiklelio išskyrų arba suspenduoto audinio tepinėlį, arba kultūros, 48 valandas augintos ant YPGA ar SPA, tepinėlį (1 priedėlis). Paruoškite 2 biotipo/3 rasės padermės teigiamos kontrolės tepinėlius ir, jei manoma, kad tai naudinga, heterologiškos padermės neigiamos kontrolės tepinėlį. Leiskite jiems išdžiūti. Keletą kartų greitai perleiskite apatinį stiklelio paviršių per liepsną, kol tepinėlis užsifiksuos.Nilo mėlynojo bandymas1) Užpilkite fiksuotą tepinėlį 1 % vandeniniu Nilo mėlynojo A tirpalu.10 min. laikykite 55 °C temperatūroje.2) Nupilkite dažantį tirpalą. Nuplaukite, trumpai palaikydami po silpna vandens srovele. Filtriniu popieriumi pašalinkite vandens perteklių.3) Užpilkite tepinėlį 8 % acto rūgštimi.Palaikykite vieną minutę kambario temperatūroje.4) Nuplaukite po silpna vandens srovele. Nusausinkite tepinėlį filtravimo popieriumi.5) Užlašinkite lašą vandens. Uždenkite dengiamąja plokštele.6) Ištirkite nudažytą tepinėlį epifluorescentiniu mikroskopu, kurio bangos ilgis 450 nm, didinamoji galia – 1000 kartų, naudodami imersinį aliejų.Atsiranda ryškiai oranžinis PHB granulių švytėjimas. Taip pat stebėkite įprastinėje šviesoje, kad įsitikintumėte, jog nuosėdos yra ląstelės viduje, ir jog ląstelių morfologija yra būdinga Ralstonia solanacearum bakterijai.Sudano juodojo bandymas1) Užpilkite fiksuotą tepinėlį 0,3 % Sudano juodojo B tirpalu 70 % etanolyje. Palaikykite 10 min. kambario temperatūroje.2) Nupilkite dažantį tirpalą. Trumpai palaikykite po čiaupu. Pašalinkite vandens perteklių. Šalinkite filtravimo popieriumi.3) Tepinėlį trumpam panardinkite į ksilolą. Nusausinkite filtravimo popieriumi.Atsargiai! Ksilolas yra kenksmingas produktas. Dirbkite traukos spintoje.4) Užpilkite tepinėlį 0,5 % (g/ml) vandeniniu safranino tirpalu ir 10 min. palikite kambario temperatūroje.Atsargiai! Safraninas yra kenksmingas produktas. Dirbkite traukos spintoje.5) Nuplaukite po silpna vandens srovele. Nusausinkite tepinėlį filtravimo popieriumi. Uždenkite dengiamąja plokštele.6) Ištirkite nudažytą tepinėlį šviesos mikroskopu, kurio didinamoji galia - 1000 kartų, naudodami išsklaidytą šviesą, imersinį aliejų.PHB granulės Ralstonia solanacearum bakterijos ląstelėje nusidažo mėlynai juoda spalva. Ląstelės sienelė nusidažo rausva spalva.Kiti bandymaiKiti galimi nustatymo bandymai yra IF bandymas (III skirsnio 2 dalis), ELISA bandymas (III skirsnio 3 dalis), ir PCR bandymas (III skirsnio 4 dalis).3. Išskyrimo procedūra3.1. Pašalinkite iš gumbo apytakinio žiedo arba stiebo apytakinio audinio išskyras arba pašviesėjusį audinį. Suspenduokite nedideliame sterilaus distiliuoto vandens kiekyje arba 50 mM fosfatinio buferinio tirpalo. Palikite 5–10 minučių ant stalo.3.2. Paruoškite keletą suspensijos dešimtainių tirpalų, pvz., 1/10 ir 1/100 arba daugiau, kaip atrodo tinkama.3.3. Perkelkite standartinį suspensijos ir tirpalų kiekį ant pagrindinės maitinamosios terpės (NA, YPG ir SPA, 1 priedėlis) ir (arba) ant Kelmano tetrazolio terpės (1 priedėlis) ir (arba) ant SMSA selektyviosios terpės (7 priedėlis). Paskleiskite arba įbrėžkite, naudodami tinkamą sėjimo techniką. Jei naudinga, paruoškite atskiras lėkšteles su kiekviena terpe, kaip teigiamą kontrolę naudodami Ralstonia solanacearum irulentiško 2 biotipo/3 rasės padermės atskiestą suspensiją.3.4. Palaikykite lėkšteles tris dienas 28 °C temperatūroje. Jei augimas vyksta lėtai, auginimą galima pratęsti iki šešių dienų, bet kolonijos, esančios ant SMSA lėkštelių, dažnai pasidaro netipiškos ir žūsta.Ant pagrindinės maitinamosios terpės virulentiška Ralstonia solanacearum sudaro gelsvai baltas, plokščias, netaisyklingas ir takias kolonijas, dažnai su būdingais menturiais.Kelmano tetrazolio terpėje virulentiškos Ralstonia solanacearum tipiškos kolonijos yra kreminės spalvos, plokščios, netaisyklingos ir takios su kraujo spalvos menturiais viduryje. Nevirulentinės Ralstonia solanacearum formos sudaro riebias tamsiai raudonas kolonijas.SMSA terpėje virulentiškos Ralstonia solanacearum tipiškos kolonijos yra pieno baltumo, plokščios, netaisyklingos ir takios, o vidurys – kraujo raudonumo spalvos.Ralstonia solanacearum nevirulentinės formos sudaro mažiau takias kolonijas, kurios visos (ne tik centras) yra nuo rausvos iki raudonos spalvos SMSA terpėje.3.5. Tipiškos morfologijos kolonijas išgryninkite augindami ant pagrindinės maitinamosios terpės. Venkite nuolatinio persėjimo, dėl kurio gali sumažėti bakterijų virulentiškumas.4. Patvirtinimo bandymas (bandymai)4.1. Ralstonia solanacearum identifikavimasNaudodami vieną iš toliau aprašytų būdų, nustatykite gryną Ralstonia solanacearum kultūrą.Maitinamieji ir fermentiniai bandymaiPastaba:Kiekvieno bandymo metu naudokite atitinkamas kontrolines padermes.Toliau išvardintos Ralstonia solanacearum fenotipinės savybės paprastai yra arba jų nėra.Fluorescentinis pigmentas | - |PHB intarpai ląstelėje | + |Oksidacijos/fermentacijos (O/F) bandymas | O+/F- |Katalazė | + |Kovačo oksidazė | + |Nitrato redukcija | + |Citrato panaudojimas | + |Augimas 40 °C temperatūroje | - |Augimas 1 % NaCl tirpale | + |Augimas 2 % NaCl tirpale | - |Arginino dihidrolazė | - |Želatinos suskystinimas | - |Krakmolo hidrolizė | - |Aesulino hidrolizė | - |Levano susidarymas | - |Terpës ir metodai pateikti Lelliott & Stead (1987)IF bandymasIš kultūros ir kontrolinės padermės (padermių) paruoškite 106 ląstelių viename mililitre suspensiją. Paruoškite keletą dvigubai praskiestų antiserumo tirpalų. Taikykite IF procedūrą (III skirsnio 2 dalis). IF bandyme naudojamos kultūros titras turi atitikti teigiamos kontrolės titrą.ELISA bandymasIš kultūros ir kontrolinės padermės (padermių) paruoškite 106 ląstelių viename mililitre suspensiją. Taikykite ELISA procedūrą (III skirsnio 2 dalis). ELISA bandyme naudojamos kultūros koncentracija turi atitikti teigiamos kontrolės koncentraciją.PCR bandymasIš kultūros ir kontrolinės padermės (padermių) paruoškite 106 ląstelių viename mililitre suspensiją. Taikykite PCR procedūrą (III skirsnio 4 dalis). PCR bandyme naudojamos kultūros produktas turi būti to paties dydžio ir sukarpytas tuo pačiu restrikcijos fermentu kaip ir teigiamos kontrolės.Fluorescentinis in-situ hibridizavimas (FISH)Iš kultūros ir kontrolinės padermės (padermių) paruoškite 106 ląstelių viename mililitre suspensiją. Taikykite FISH procedūrą (van Beuningen et al, 1995) su OLI-1 PCR pradmeniu (Seal et al, 1993). Kultūros reakcija turi būti tokia pati kaip ir teigiamos kontrolės.Baltymo atskyrimasDenatūruoti nepažeistų ląstelių baltymai atskiriami poliakrilamido gelio elektroforeze – PAGE (Stead, 1992a).Sočiųjų rūgščių profiliavimas (FAP)Kultūrą ir teigiamos kontrolės padermę 48 valandas auginkite 28 °C temperatūroje ant triptikazės sojos agaro ir taikykite FAP procedūrą (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Kultūros profilis turi atitikti teigiamos kontrolės profilį.4.2. Padermės charakteristikaPadermės charakteristika nėra privaloma, tačiau rekomenduojama kiekvienu nauju atveju, naudojant bent vieną iš šių bandymų:Biotipo nustatymasRalstonia solanacearum bakterija yra skirstoma į biotipus pagal sugebėjimą gaminti rūgštį iš trijų skirtingų heksozės alkoholių ir trijų cukrų (Hayward, 1964 ir 1994):| Biotipai |1 | 2 | 3 | 4 | 5 |—maltozės | - | + | + | - | + |—laktozės | - | + | + | - | + |—celobiozės | - | + | + | - | + |—manitolio | - | - | + | + | + |—sorbitolio | - | - | + | + | - |—dulcitolio | - | - | + | + | - |Panaudojimas: | | | | | |Pagal papildomus bandymus 2 biotipą galima skirstyti į subfenotipus (Hayward, 1994):| 2 biotipas | 2-A biotipas | 2-T biotipas |Trehalozės panaudojimas | - | + | + |Inozitolio panaudojimas | + | - | + |D-ribozės panaudojimas | - | - | + |Pektolitinis aktyvumas | žemas | žemas | aukštas |Rasės nustatymasRasę (Buddenhagen et al., 1962) galima nustatyti remiantis patogeniškumo bandymu, atliekamu su pomidorų, baklažanų ar tabako augalais, ir padidinto jautrumo reakcijos (HR) bandymu, atliekamu su tabako lapais (Lozano ir Sequeira, 1970):| [1]Rasė |1 | 2 | 3 |Reakcija: | | | |—pomidorų augaluose/baklažanų augaluose | vytimas | nėra reakcijos | vytimas |—tabako augaluose | vytimas | nėra reakcijos | nėra reakcijos |—tabako lapuose | nekrozė (48 val.) ir vytimas (7–8 dienos) | HR (12–24 val.) | chlorozė (2–8 dienos) |Rasės nustatymas, atliekant patogeniškumo arba tabako padidinto jautrumo bandymus, nėra visiškai patikimas ir vietoj to gali būti nustatomas pagal tai, koks biotipas užkrečia natūralų augalą-šeimininką.Kultūra gali būti charakterizuojama šiuo būdu:Genomo atspaudaisRalstonia solanacearum komplekso padermės molekulinis suskirstymas gali būti atliekamas:RFLP analizės būdu (restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo nustatymas su DNR pradmenimis) (Cook et al, 1989)Pasikartojančios sekos PCR [REP-, ERIC-& BOX-PCR (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995)].4.3. Patogeniškumo bandymasŠis bandymas skirtas Ralstonia solanacearum diagnozės patvirtinimui ir kultūrų, identifikuotų kaip Ralstonia solanacearum, virulentiškumo įvertinimui.Iš kultūros ir teigiamos kontrolės padermės paruoškite 106 ląstelių 1 mililitre inokuliantą. Paskiepykite 5–10 pomidorų arba baklažanų augalų, pageidautina trečiojoje tikrųjų lapų stadijoje arba vėlesnėje (III skirsnio 6 dalis). Auginkite iki dviejų savaičių 22 °C-28 °C temperatūroje ir kasdien laistydami palaikykite aukštą santykinį drėgnumą. Stebėkite vytimą ir (arba) epinastiją, chlorozę, nykimą.Išskirkite iš augalų su požymiais šiuos dalykus:- 2 cm atstumu nuo paskiepijimo vietos paimkite dalį stiebo audinio nuo kamieno.- Susmulkinkite ir suspenduokite nedideliame sterilaus vandens kiekyje arba 50mM fosfatinio buferinio tirpalo. Tada įdėkite į lėkštelę, palaikykite ir patikrinkite, ar yra tipiškų Ralstonia solanacearum kolonijų.III SKIRSNISRALSTONIA SOLANACEARUM NUSTATYMAS IR IDENTIFIKAVIMAS BULVIŲ GUMBŲ BANDINIUOSEPastaba:Standartinis bandinio dydis yra 200 gumbų. Tačiau bandymą galima atlikti ir su mažesniu gumbų skaičiumi.1. Bandinio paruošimas tyrimuiPastaba:Bulvių ekstrakto nuosėdos, gautos šio bandymo metu, gali būti naudojamos Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus nustatyti.Jei manoma, kad tai naudinga, prieš bandymą atliekamos šios procedūros:i) Iki dviejų savaičių palaikykite bandinį 25–30 °C temperatūroje Ralstonia solanacearum mažos populiacijos dauginimosi paskatinimui.ii) Nuplaukite gumbus po tekančiu vandeniu, naudodami tinkamas dezinfekavimo ir plovimo priemones. Juos sausai nudžiovinkite.1.1. Švariu ir dezinfekuotu skalpeliu arba peiliu, skirtu daržovėms pjaustyti, nulupkite odelę ties gumbo stolono prisijungimo vieta taip, kad pirmiausia būtų matomi apytakiniai audiniai. Iš apytakinio audinio, esančio ties stolono prisitvirtinimo vieta, atsargiai išpjaukite kūgio formos šerdį (3–5 mm diametro). Palikite kuo mažiau neapytakinio audinio. Šitaip paruoškite visus pavyzdžio gumbus.Pastaba:Šiame etape galima atlikti vizualinę gumbų apžiūrą (II skirsnio 1 dalis). Atidėkite ir atskirai ištirkite visus gumbus, kurie turi požymių arba yra labai supuvę (II skirsnis).1.2. Sudėkite bulvių gumbų šerdis į indą. Pageidautina juos nedelsiant paruošti. Jei tai neįmanoma, laikykite juos ten ne ilgiau kaip 24 valandas, o 4 °C temperatūroje – ne ilgiau, kaip 72 valandas.1.3. Paruoškite šerdis, atlikdami vieną iš šių procedūrų:i) Perkelkite šerdis į tinkamą indą.Pripilkite pakankamai maceravimo buferinio tirpalo (2 priedėlis), kad jis apsemtų šerdis.Smulkinkite šerdis Waring Blender arba Ultra Thurrax maišikliuose iki vientisos masės. Venkite per didelės homogenizacijos.15–30 min. leiskite maceravimo buferiniam tirpalui įsigerti.ii) Perkelkite šerdis į tinkamą kolbą.Pripilkite pakankamai maceravimo buferinio tirpalo, kad jis apsemtų šerdis.Patalpinkite kolbą į purtyklę.4 valandas laikykite 20 °-22 °C temperatūroje purtant 50–100 apsisukimų per min. greičiu arba 16–24 valandas – 4 °C temperatūroje.iii) Perkelkite šerdis į stiprų vienkartinį maceravimo maišelį (pvz., į sterilų Stomacher maišelį, kurio matmenys 105 mm X 150 mm).Atsargiai sutraiškykite šerdis tinkamu įrankiu, pvz., plaktuku, iki vientisos masės.Pripilkite pakankamai maceravimo buferinio tirpalo, kad jis apsemtų šerdis.15–30 m. leiskite maceravimo buferiniam tirpalui pastovėti.1.4. Išskirkite bakterijas iš paruoštų šerdžių, atlikdami vieną iš šių procedūrų:i) Atsargiai supilkite pavyzdį (maceratą) į centrifugos mėgintuvėlį, šerdžių liekanas palikdami kolboje arba maišelyje. Jei perpiltas pavyzdys yra drumstas, žemesnėje kaip 10 °C temperatūroje 10 min. sukite centrifugoje ne daugiau kaip 180 g.Žemesnėje kaip 10 °C temperatūroje 15 min. sukite perpiltą pavyzdį arba virš nuosėdų buvusį skystį, nustatydami pirmąją centrifugos padalą ties 7000 g, arba 10 min. – ties 10000 g.Nedrumsdami nuosėdų, išpilkite virš jo esantį skystį.ii) Filtruokite pavyzdį per 40–100 μm dydžio skylutes. Paspartinkite filtravimą, naudodami vakuuminį siurblį.Supilkite filtratą į centrifugos mėgintuvėlį.Išplaukite filtrą maceravimo buferiniu tirpalu.Žemesnėje kaip 10 °C temperatūroje sukite 7000g filtratą 15 min., o 10000g – 10min.Nedrumsdami nuosėdų, išpilkite virš jų esantį skystį.1.5. Nuosėdas užpilkite 1 ml buferiniu tirpalu (2 priedėlis).Padalinkite į dvi lygias dalis ir perkelkite kiekvieną į mikromėgintuvėlį.Bandymui naudokite vieną mėgintuvėlį. Mikromėgintuvėlį tyrimo metu laikykite 4 °C temperatūroje.Įdėkite 10–25 % (ml/ml) sterilaus glicerino į kitą mėgintuvėlį. Pakratykite. Laikykite -18 °C temperatūroje (savaites) arba -70 °C temperatūroje (mėnesius).2. IF bandymasNaudokite Ralstonia solanacearum serumą, pageidautina 3 rasės/2 biotipo. Pagal gamintojo rekomendaciją nustatykite 106 ląstelių mililitre suspensijos titrą iš homogeniškos Ralstonia solanacearum padermės su atitinkamo praskiedimo fluorescentinio izotiocijanato (FITC) konjuguotu tirpalu. Taikant IF metodą naudojamas žalias antiserumas turėtų būti bent 1:2000 titro.Naudokite mikroskopines plokšteles su daugybe langelių, pageidautina su 10 langelių, kurių skersmuo bent 6 mm.Kiekvienoje kontrolinėje plokštelėje atlikite FITC konjuguoto tirpalo kontrolę. Jei kontroliniame FITC pastebima bent viena teigiama ląstelė, bandymas turėtų būti kartojamas naudojant kontrolinį PBS.Paruoškite atskiras teigiamos kontrolės plokšteles su atitinkamo Ralstonia solanacearum atitinkamos rasės/biotipo padermės 106 ląstelių viename mililitre suspensija. Kiekvienam bandymui naudokite vieną plokštelę.2.1. Paruoškite kontrolines plokšteles tokiu būdu:i) Resuspenduotoms nuosėdoms, kuriose yra palyginti mažai krakmolo:Į vienos eilės langelius pipete užlašinkite išmatuotą standartinį resuspenduotų nuosėdų tūrį (15 μl pakanka 6 mm skersmens langeliui, didesniems langeliams padidinkite kiekį). Kita eilė gali būti panaudota kaip dublikatas arba pakartojimui, kaip parodyta 1 diagramoje.ii) Kitoms nuosėdoms:Paruoškite dešimtainius resuspenduotų nuosėdų buferiniame tirpale praskiedimus, būtent 1/10, 1/100 ir 1/1000. Į vienos eilės langelius pipete užlašinkite išmatuotą standartinį tūrį (15 μl pakanka 6 mm skersmens langeliui, didesniems langeliams tūrį padidinkite). Kita eilė gali būti panaudota kaip dublikatas arba pakartojimui, kaip parodyta 2 pav.2.2. Leiskite lašeliams išdžiūti. Užfiksuokite bakterijų ląsteles ant plokštelės kaitindami liepsnoje arba 95 % etanoliu.2.3. IF procedūrai) Atsižvelgdami į 2 skirsnio 1 dalies i punkte nurodytą kontrolinės plokštelės paruošimą:dukart atskieskite antiserumą IF buferiniame tirpale (3 priedėlis):1/4 titro (T/4), 1/2 titro (T/2), titras (T) ir dvigubas (2T) titras.ii) Atsižvelgdami į 2 skirsnio 1 dalies ii punkte nurodytą kontrolinės plokštelės paruošimą:paruoškite darbinį tirpalą IF buferiniame tirpale. Darbinis tirpalas yra optimalaus specifiškumo antiserumo tirpalas ir paprastai sudaro pusę titro.+++++ TIFF +++++1 pavyzdysKontrolinės plokštelės paruošimas pagal 2.1 punkto i papunktį ir 2.3 punkto i papunktį+++++ TIFF +++++2 pavyzdysKontrolinės plokštelės paruošimas pagal 2.1 punkto ii papunktį ir 2.3 punkto ii papunktį2.3.1. Išdėliokite kontrolines plokšteles ant drėgno filtravimo popieriaus.Padenkite plokštelės langelius antiserumo tirpalu (tirpalais). Užpilkite PBS buferinį tirpalą ant FITS langelių. Langelius užpildančio antiserumo tūris turi atitikti ekstrakto tūrį.2.3.2. 30 min. laikykite uždengę kambario temperatūroje.2.3.3. Nukratykite antiserumo lašelius nuo plokštelės ir kruopščiai nuskalaukite plokštelę IF buferiniu tirpalu. 5 minutes plaukite IF buferiniu Tween tirpalu, o po to 5 minutes – IF buferiniu tirpalu (3 priedėlis). Rūpestingai pašalinkite drėgmės perteklių.2.3.4. Išdėliokite plokšteles ant drėgno filtravimo popieriaus. Pripildykite kontrolinės plokštelės langelius ir FITC langelį FITC konjugato tirpalu, naudojamu titrui nustatyti. Langelius užpildančio konjuguoto tirpalo tūris turi atitikti naudojamo antiserumo tūrį.2.3.5. 30 min. laikykite uždengę kambario temperatūroje.2.3.6. Nukratykite nuo plokštelės konjuguoto tirpalo lašelius. Nuskalaukite ir plaukite, kaip nurodyta ankščiau (2.3.3). Rūpestingai pašalinkite drėgmės perteklių.2.3.7. Užlašinkite pipete 5–10 μl 0,1 M fosfatinio glicerino buferinio tirpalo (3 priedėlis) arba panašios sudėties buferinio tirpalo ant kiekvieno langelio ir uždenkite dengiamąja plokštele.2.4. IF bandymo analizavimasIštirkite kontrolines plokšteles po epifluorescentiniu mikroskopu su filtrais, jautriais FITC, naudodami imersinį aliejų ir 500–1000 X. Peržiūrėkite langelius skersai ir išilgai bei pagal perimetrą.Pirmiausia patikrinkite teigiamos kontrolės plokštelę. Ląstelės turi ryškiai švytėti ir būti visiškai nusidažiusios. Pastaba. Jei spalva yra netipinė, tyrimas turi būti pakartotas.Peržiūrėkite kontrolines plokšteles. Pirmiausia stebėkite, ar kontrolinės FITC langeliuose nėra švytinčių ląstelių. Švytinčios ląstelės kontrolinėje FITC rodo nespecifinį konjuguoto tirpalo jungimąsi, autofluorescenciją arba užteršimą. Pastaba. Tai pastebėjus, tyrimas turi būti pakartotas.Plokštelės langeliuose atsiranda Ralstonia solanacearum bakterijai charakteringos morfologijos švytinčios ląstelės. Švytėjimo intensyvumas turi atitikti teigiamos kontrolės padermę tame pačiame antiserumo tirpale. Į ląsteles, kurios nevisiškai nusidažiusios, neturi būti kreipiamas dėmesys, jei tokių ląsteliųjų nėra daug (žr. IF bandymo rezultatų aiškinimą).IF bandymo rezultatų aiškinimasi) Jei ryškiai švytinčių tipiškos morfologijos ląstelių nėra, vadinasi, IF bandymas yra neigiamas.ii) Jei ryškiai švytinčių tipiškos morfologijos ląstelių yra, nustatykite vidutinį ląstelių skaičių mikroskopo lauke ir apskaičiuokite ląstelių skaičių (N) viename mililitre resuspenduotų nuosėdų (4 priedėlis).IF bandyme nustatymo riba laikoma 103 ląstelių populiacija viename mililitre resuspenduotų nuosėdų:- bandiniuose, kuriuose N > 103 ląstelių viename mililitre resuspenduotų nuosėdų, IF bandymas laikomas teigiamas,- bandiniuose, kuriuose N > 103 ląstelių viename mililitre resuspenduotų nuosėdų, IF bandymas gali būti laikomas teigiamu.iii) Jei didelis skaičius (> 105 ląstelių viename mililitre) nevisiškai pilnų arba silpnai švytinčių ląstelių yra matomas antiserumo titre, turi būti atliekamas antras tyrimas:- pagrįstas skirtingu biologiniu principu, arba- kartojamas IF bandymas su antruoju antiserumu arba dešimt kartų praskiestomis nuosėdomis.3. ELISA bandymasPagal Robinson-Smith et al., 1995Naudokite Ralstonia solanacearum antiserumą, pageidautina 3 rasės/2 biotipo. Nustatykite 106 ląstelių viename mililitre suspensijos titrą iš Ralstonia solanacearum homogeniškos padermės.Rekomenduojama naudoti NUNC- Polysorb mikrotitro lėkšteles.Įtraukite teigiamą bulvių ekstrakto kontrolę ir fosfato druskų buferinio tirpalo (PBS) kontrolę.Kaip teigiamą kontrolę naudokite Ralstonia solanacearum atitinkamos rasės/tipo padermės > 106 ląstelių viename mililitre suspensiją. Tirkite tokiu pačiu būdu, kaip ir bandinį (bandinius), tačiau gerai atskirkite nuo bandinių, esančių ant mikrotitro lėkštelės.3.1. Į mikromėgintuvėlį pipete įlašinkite 100–200 μl resuspenduotų nuosėdų.4 minutes kaitinkite 100 °C temperatūroje. Padėkite mikromėgintuvėlį ant ledo.3.2. Įdėkite tokį patį tūrį dvigubo stiprumo karbonatinio dengiamojo buferinio tirpalo (5 priedėlis). Suplakite.3.3. Įdėkite 100 μl mėginio bent į dvi mikrotitro plokštelės akutes. Vieną valandą laikykite 37 °C temperatūroje arba visą naktį 4 °C temperatūroje.3.4. Staigiu judesiu išpilkite mėginį iš akučių. Tris kartus išplaukite akutes PBS-Tween buferiniu tirpalu (5 priedėlis), bent 5 min. palikdami paskutiniojo plovimo buferinį tirpalą akutėse.3.5. Paruoškite tinkamą Ralstonia solanacearum antiserumo tirpalą blokuojančiame buferiniame tirpale (5 priedėlis). Į akutes įpilkite 100 μl praskiesto antiserumo.Valandą laikykite 37 °C temperatūroje.3.6. Staigiu judesiu išpilkite antiserumą iš akučių. Išplaukite akutes kaip nurodyta pirmiau (3.4).3.7. Paruoškite tinkamą šarminės fosfatazės konjuguotą tirpalą blokuojančiame buferiniame tirpale. Į akutes įpilkite 100 μl konjuguoto tirpalo.Valandą laikykite 37 °C temperatūroje.3.8. Greitai pašalinkite konjuguotą tirpalą iš akučių. Išplaukite akutes, kaip nurodyta ankščiau (3.4 ir 3.6).3.9. Paruoškite šarminės fosfatazės substrato tirpalą (5 priedas). 100 μl įpilkite į akutes. Nuo 30 min. iki 1 val. laikykite tamsoje, kambario temperatūroje.3.10. Įvertinkite duomenis esant 409 nm bangos ilgio.ELISA bandymo aiškinimas:ELISA bandymas yra neigiamas, jei pavyzdžio optinis tankis (OT) yra < 2 x neigiamos kontrolės OT.ELISA bandymas yra teigiamas, jei pavyzdžio optinis tankis (OT) yra > 2 x neigiamos kontrolės OT.4. PCR tyrimasPagal Seal et al., 1993Pastaba.Į filtrą įkištos pipetės antgaliai turi būti naudojami visuose bandinio paruošimo etapuose ir atliekant kitas PCR bandymo procedūras.Kaip teigiamą kontrolę, iš Ralstonia solanacearum 3 rasės/2 biotipo paruoškite 106 ląstelių viename mililitre suspensiją. Tirkite tuo pačiu būdu, kaip ir pavyzdį (pavyzdžius).4.1. Į mikromėgintuvėlį pipete įlašinkite 100 μl resuspenduotų nuosėdų.Pasirinktinai galite perkelti 90 μl resuspenduotų nuosėdų į mikromėgintuvėlį su 10 μl 0,5 M NaOH. Sumaišykite vartydami mikromėgintuvėlį.4.2. 4 minutes kaitinkite 100 °C temperatūroje. Padėkite mikromėgintuvėlį ant ledo.4.3. Steriliame distiliuotame arba ypač švariame vandenyje paruoškite bent du dešimtainio praskiedimo tirpalus, pvz., 1/10 ir 1/100, o jei reikia ir daugiau.4.4. Steriliame mėgintuvėlyje paruoškite PCR reakcijos mišinį (6 priedėlis), įdėdami šių komponentų toliau nurodyta eilės tvarka:50 μl tūrio reakcijai:Komponentas | Tūris | Galutinė koncentracija |Sterilus distiliuotas vanduo arba ypač švarus vanduo | 30, 8 µl – 33, 8 µl | |10 x PCR buferinis tirpalas | 5,0 µl | 1 X |d-ATF | 1,0 µl | 0,2 mM |d-CTF | 1,0 µl | 0,2 mM |d-GTF | 1,0 µl | 0,2 mM |d-TTF | 1,0 µl | 0,2 mM |Pradmuo OLI-1 (20 µM) | 2,5 µl | 1 µM |Pradmuo Y-2 (20 µM) | 2,5 µl | 1 µM |Taq polimerai (5U/µM) | 0,2 mM | 1,0 µM |Bendras tūris | 45 µl – 48 µl | |Didesniam reakcijų skaičiui:Apskaičiuokite kiekvieno komponento kiekį reikalaujamam reakcijų skaičiui.Sumaišykite komponentus ir perkelkite 45 μl-48 μl mišinio į sterilius PCR mėgintuvėlius.Laikykite mėgintuvėlius su PCR reakcijos mišiniu ant ledo.25 μl tūrio reakcijai:Atitinkamai sumažinkite komponentus.4.5. PCR amplifikacija4.5.1. Neprivaloma: Centrifuguokite mėgintuvėlius su pakaitintu bandiniu ir teigiama kontrole.Į mėgintuvėlius su PCR reakcijos mišiniu nurodyta tvarka įdėkite 2–5 μl bandinio (bandinių), vandens kontrolės ir teigiamos kontrolės. Mėgintuvėlius patalpinkite į DNR ciklinį termostatą.4.5.2. Vykdykite tokią programą:1 ciklas, susidedantis iš:2 minučių 96 °C temperatūroje : bandinio denatūracija50 ciklų, susidedančių iš:20 sekundžių 94 °C temperatūroje : denatūracija20 sekundžių 68 °C temperatūroje : pradmenų jungimasis30 sekundžių 72 °C temperatūroje : kopijos padauginimas1 ciklas, susidedantis iš:10 minučių 72 °C temperatūroje : tolesnis pagausinimas1 ciklas, susidedantis iš:vi) laikymo 4 °C temperatūrojePastaba.Šie parametrai yra Perkin Elmer 9600 markės. Kitiems cikliniams termostatams gali reikėti mineralinio aliejaus PCR reakcijos mėgintuvėliuose ir (arba) trukmės ii, iii ir iv tarpsnių amplifikacijos procedūroje modifikavimo.4.5.3. Išimkite mėgintuvėlius iš ciklinio termostato. Ištirkite PCR reakcijos produktą. Jei šito negalite padaryti tuoj pat, tačiau galėsite padaryti tą pačią dieną, laikykite mėgintuvėlius 4 °C temperatūroje, jei vėliau – laikykite -18 °C temperatūroje.4.6. PCR produkto analizėPCR fragmentai nustatomi agarozės gelio elektroforeze bei dažant etidžio bromidu.4.6.1. Atsargiai paruoškite tinkamą agarozės gelį, pridėdami karštą agarozę į triacetato elektroforezės (TAE) buferinį tirpalą.4.6.2. Atvėsinkite išsilydžiusią agarozę iki 50–60 °C temperatūros, supilkite į elektroforezės bloką ir įterpkite šukutes. Leiskite tirpalui sukietėti.4.6.3. Išimkite šukutes. Panardinkite gelį į TAE taip, kad buferinis tirpalas jį tik truputį (2–3 mm) apsemtų.4.6.4. Ant paraplėvelės užlašinkite 3 μl buferinio tirpalo lašus. Įdėkite 12 μl PCR produkto iš bet kurio pavyzdžio, teigiamos kontrolės arba vandens kontrolės ir prieš lašindami atsargiai sumaišykite, sutraukdami į pipetės antgalį. Šiuos kiekius galima pakeisti, kad jie atitiktų agarozės gelio skylučių tūrį.4.6.5. Atsargiai prilašinkite gelio skylutes. Bent vieną skylutę užpildykite tinkamu DNR žymeniu.4.6.6. Sujunkite elektros šaltinio laidus ir elektroforezės įrenginį. 5–8 V/cm, kol judėjimo indikatoriaus priekinė dalis pasieks 1 cm iki gelio pabaigos.4.6.7. Išjunkite elektros šaltinį. Atjunkite laidus nuo elektroforezės bloko.Atsargiai išimkite gelį. Pamerkite jį 30–45 min. etidžio bromido tirpale.Pastaba.Dirbdami su etidžio bromidu, naudokitės vienkartinėmis pirštinėmis, nes jis yra stiprus mutagenas!4.6.8. 10–15 min. palaikykite distiliuotame vandenyje, kad nusiplautų dažai.4.6.9. Stebėkite amplifikuotą DNR fragmentą (fragmentus) ultravioletinėje šviesoje. Ralstonia solanacearum bakterijos PCR produktas su pradmenimis OLI-1 ir Y-2 yra 288 bp ilgio. Patikrinkite pavyzdį su DNR žymeniu ir teigiama kontrole.Pastaba.Vandens kontrolė visais atvejais turi būti neigiama. Jei ji teigiama, pakartokite testą.4.6.10. Jeigu duomenis reikia užregistruoti dokumentuose, nufotografuokite gelį.4.6.11. Patvirtinkite amplifikuoto fragmento autentiškumą restrikcijos fermentų analize (RFA).4.7. Restrikcijos fermentų analizė (RFA)4.7.1. 8,5 μl PCR produkto (4.5.3) perkelkite į naują mikromėgintuvėlį. Įdėkite 1 μl 10 x fermentinio buferinio tirpalo ir 0, 5 μl restrikcijos fermento Ava II.4.7.2. Sumaišykite atsargiai sutraukdami į pipetę. Jei lašai pasilieka ant mėgintuvėlio sienelių, pasukite mikrocentrifugą. Valandą laikykite 37 °C temperatūroje.4.7.3. Ištirkite sukarpytą PCR fragmentą agarozės gelio elektroforeze, kaip nurodyta anksčiau (4.6).PCR bandymo rezultatų aiškinimas:PCR bandymas yra neigiamas, jei nerandama charakteringo 288 bp fragmento, ir fragmentas yra nustatomas esant teigiamai Ralstonia solanacearum padermės kontrolei.PCR bandymas yra teigiamas, jei 288 bp fragmentas surandamas, o amplifikuoto fragmento RFA analizė atitinka Ralstonia solanacearum padermės teigiamą kontrolę.5. Selektyvaus auginimo bandymasPagal Elphinstone et al., 19965.1. Atlikite bandymą, naudodami tinkamą tirpalo auginimo lėkštelėse techniką, pvz.:i) Paruoškite bent du dešimtainius tirpalus, būtent, 1/10 ir 1/100 ar daugiau, jei manoma, kad reikia, nuosėdų buferiniame tirpale resuspenduotų nuosėdų. Pipete įlašinkite išmatuotą standartinį kiekį (50–100 μl) resuspenduotų nuosėdų ant kiekvieno tirpalo modifikuotos SMSA selektyvios terpės (7 priedėlis) ir paskleiskite su stikline mentele ant viso terpės paviršiaus.Jei laikote naudinga, iš 10 μl resuspenduotų nuosėdų su kilpele pabrėžkite (štrichais) ant viso terpės paviršiaus. Apdeginkite kilpelę prieš kiekvieną štrichavimą.ii) Perkelkite išmatuotą standartinį kiekį (50–100 μl) resuspenduotų nuosėdų ant kiekvieno tirpalo modifikuotos SMSA selektyvios terpės (7 priedėlis) ir paskleiskite su stikline mentele ant viso terpės paviršiaus. Neapdeginę mentelių, pabrėžkite bent ant dviejų kitų modifikuotų SMSA lėkštelių.5.2. Naudodami tą pačią auginimo lėkštelėse techniką, 106 ląstelių viename mililitre suspensiją iš Ralstonia solanacearum 3 rasės/2 tipo virulentiškos padermės, kaip teigiamą kontrolę, panaudokite ant atskirų modifikuotų SMSA lėkštelių.5.3. Laikykite lėkšteles 28 °C temperatūroje. Pradėkite analizuoti lėkštelių duomenis po trijų dienų. Jeigu jie neigiami, palaikykite dar iki šešių dienų. Virulentiškos Ralstonia solanacearum kolonijos yra pieno spalvos baltumo, plokščios, netaisyklingos ir takios, vidurys kraujo raudonumo ir su vidiniais sluoksniais ar menturiais.5.4. Išgryninkite tipiškos morfologijos kolonijas persėdami ant pagrindinės maitinamosios terpės (1 priedėlis).5.5. Identifikuokite grynas kultūras (II skirsnio 4.1 dalis) ir patvirtinkite Ralstonia solanacearum kultūras patogeniškumo testu (II skirsnio 4.3 dalis).Selektyvaus auginimo bandymo aiškinimasSelektyvaus auginimo bandymas yra neigiamas, jei po šešių dienų atskirtos bakterijų kolonijos yra netipiškos Ralstonia solanacearum, su sąlyga, kad nėra kitų bakterijų kolonijų slopinimo ir kad Ralstonia solanacearum bakterijai būdingos kolonijos rastos teigiamose kontrolėse.Selektyvaus auginimo bandymas yra teigiamas, jei Ralstonia solanacearum būdingos kolonijos yra atskiros.6. BiobandymasPagal Janse, 19886.1. Kiekvienam bandymo pavyzdžiui imkite po 10 pomidorų ir baklažanų augalų sodinukų trečiojoje tikrųjų lapų stadijoje. 24 valandas prieš inokuliaciją bandymui skirtų augalų nelaistykite.6.2. 100 μl resuspenduotų nuosėdų paskirstykite lėkštelėse. Skiepykite į stiebą tarp skilčialapių ir dar vienoje ar keliose vietose.6.3. Tuo pačiu būdu paskiepykite 10 sodinukų 106 ląstelių viename mililitre tirpalu iš Ralstonia solanacearum virulentiškos 2 biotipo/3 rasės padermės kaip teigiama kontrole ir nuosėdų buferiniu tirpalu, kaip neigiama kontrole. Teigiamos kontrolės augalus atskirkite nuo kitų augalų, kad išvengtumėte kryžminio užsikrėtimo.6.4. Auginkite bandymo augalus toliau iki 4 savaičių 22–28 °C temperatūroje ir aukštoje santykinėje drėgmėje, kasdien laistydami. Stebėkite vytimą, epinastiją, chlorozę ir (arba) nykimą.6.5. Atskirkite nuo užkrėstų augalų (II skirsnis). Identifikuokite tipiškos morfologijos grynas kultūras (II skirsnio 4.1 dalis) ir patvirtinkite Ralstonia solanacearum kultūras patogeniškumo testu (II skirsnio 4.3 dalis).6.6. Jei laikote, kad tai naudinga, patikrinkite, ar nėra infekcijos tiriamuose augaluose be infekcijos požymių. 2 cm atstumu virš inokuliacijos taško išpjaukite iš kiekvieno tiriamo augalo stiebo 1 cm dalį. Homogenizuokite audinius maceravimo buferiniame tirpale. Atlikite auginimo lėkštelėse testą. Išpilstykite tirpalą į lėkšteles (3 skirsnio 5.1 dalis). Jei rezultatas teigiamas, identifikuokite tipiškos morfologijos grynas kultūras (II skirsnio 4.1 dalis) ir patvirtinkite Ralstonia solanacearum kultūras patogeniškumo testu (II skirsnio 4.3 dalis).Biobandymo rezultatų aiškinimas:Biobandymas yra neigiamas, jei tiriami augalai nėra užsikrėtę Ralstonia solanacearum ir su sąlyga, kad Ralstonia solanacearum aptinkama teigiamose kontrolėse.Biobandymas yra teigiamas, jei tiriami augalai yra užsikrėtę Ralstonia solanacearum.7. Sodrinimo bandymasPagal Elphinstone et al, 19967.1. 100 μl resuspenduotų nuosėdų įdėkite į tris ml modifikuoto SMSA sultinio (7 priedėlis).7.2. Laikykite 48 valandas, bet kuriuo atveju ne ilgiau kaip 72 valandas, 28 °C temperatūroje, vamzdelio dangtelį pritvirtinę laisvai, kad vėdintųsi.7.3. Sandariai uždarykite dangtelį ir pakratykite. Mėginį paskirstykite IF bandymui (šio skirsnio 2 dalis), ELISA bandymui (šio skirsnio 3 dalis) ir (arba) PCR bandymui (šio skirsnio 4 dalis).8. Patogeniškumo bandymasŽr. II skirsnio 4.3 dalį.[1] 4 rasė (patogeniška ant imbiero ir kitų augalų-šeimininkų) ir 5 rasė (patogeniška tik ant šilkmedžio) neįtrauktos.--------------------------------------------------III PRIEDAS1. Kiekvienu įtariamu užkrėtimo atveju, kurį patvirtino teigiamas atrankos bandymo (bandymų) atsakymas, atlikus jį su sąraše pateikta augaline medžiaga pagal atitinkamą metodą, pateiktą II priede, arba visais kitais atvejais, pritaikius bet kurį kitą oficialiai patvirtintą metodą ir, kol yra laukiama to metodo patvirtinimo arba paneigimo, turėtų būti sulaikyta ir atitinkamai saugoma:- jeigu įmanoma, siunta arba jos dalis (iš kurios buvo paimtas bandinys) originalioje pakuotėje su etikete,- jeigu įmanoma, likusi bandinių dalis,- bet koks likęs ekstraktas ir atrankos bandymui paruoštos papildomos medžiagos, pvz.: imunofluorescentinės kontrolinės plokštelės, ir- visi susiję dokumentai,kol bus užbaigti darbai pagal minėtą metodą.2. Jei organizmo buvimas buvo patvirtintas, turėtų būti sulaikyta ir atitinkamai saugoma:- visa 1 dalyje nurodyta medžiaga, ir- jei įmanoma, ir užkrėsto pomidoro arba baklažano bandinys, paskiepytas gumbo ar augalo ekstraktu, ir- išskirta organizmo kultūra,nors vieną mėnesį po pranešimo, perduodamo pagal 5 straipsnio 2 dalies nuostatas.--------------------------------------------------IV PRIEDAS5 straipsnio 1 dalies a punkto i papunkčio nuostatose nurodyti tyrimai, jei reikalinga, susideda iš:i) auginimo vietų,- kuriose yra arba buvo auginamos bulvės, klonavimo požiūriu susijusios su organizmu užkrėstomis bulvėmis,- kuriose yra arba buvo auginami pomidorai, kilę iš tų pačių šaltinių, kaip ir organizmu užkrėsti pomidorai,- kuriose yra arba buvo auginamos bulvės ir pomidorai, specialiai prižiūrimos dėl įtariamos organizmo infekcijos,- kuriose yra arba buvo auginamos bulvės, klonavimo požiūriu susijusios su bulvėmis, augusiomis organizmu užkrėstose auginimo vietose,- kuriose yra auginamos bulvės ir pomidorai, esantys užkrėstų auginimo vietų kaimynystėje, įskaitant ir tokias šių produktų auginimo vietas, kurios tiesiogiai ar per bendrą tiekėją tarpusavyje dalijasi gamybos įranga ir priemonėmis,- kuriose laistymui ir purškimui naudojami paviršiniai vandenys, gaunami iš tokių šaltinių, kurie buvo patvirtinti arba yra įtariami esantys užkrėsti organizmu,- kuriose laistymui ir purškimui naudojamai paviršiniai vandenys yra imami iš šaltinio, kuriuo taip pat naudojasi ir kitos gamybos vietos, patvirtintos arba įtariamos organizmo užkrėtimu,- kuriose yra arba buvo patvinę paviršiniai vandenys, įtariami arba patvirtinti esą užkrėsti organizmu; irii) laistymui arba purškimui naudojamų paviršinių vandenų, kurie buvo užtvindę organizmu užkrėstą lauką (laukus) arba auginimo vietą (vietas).--------------------------------------------------V PRIEDAS1. 5 straipsnio 1 dalies a punkto iii papunkčio ir 5 straipsnio 1 dalies c punkto iii papunkčio nuostatose minimo galimo užkrėtimo laipsnis nustatomas, jei reikalinga, tiriant:- sąraše pateiktą augalinę medžiagą, auginamą gamybos vietoje, pripažintoje užkrėsta pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto ii papunktį,- sąraše pateiktos augalinės medžiagos gamybos vietą (vietas), kuri pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto ii papunkčio nuostatas yra pripažinta užkrėsta, įskaitant ir tas gamybos vietas, kurios tiesiogiai ar per bendrą tiekėją dalijasi gamybos įrenginiais ir priemonėmis,- ankstesnėje įtraukoje nurodytose gamybos vietose išaugintą sąraše pateiktą augalinę medžiagą, arba buvusią tokioje gamybos vietoje (vietose) tuo metu, kai sąraše pateikta augalinė medžiaga, pripažinta užkrėsta pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto ii papunktį, taip pat buvo tose gamybos vietose, nurodytose pirmojoje įtraukoje,- sandėlius, į kuriuos patenka sąraše pateikta augalinė medžiaga iš aukščiau paminėtų gamybos vietų,- mechanizmus, transporto priemones, talpas ar jų dalis ir visus kitus objektus, įskaitant įpakavimo medžiagą, kurie galėjo liestis su sąraše pateikta augaline medžiaga, pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto iii papunktį pripažinta užkrėsta,- bet kurią sąraše pateiktą augalinę medžiagą, kuri yra laikoma arba lietėsi su bet kuriais įrenginiais arba objektais, išvardytais ankstesnėje įtraukoje, prieš juos išvalant ir dezinfekuojant,- atlikus 5 straipsnio 1 dalies a punkto i papunktyje pateiktus tyrimus ir bandymus, tiriant tuos bulvių gumbus ar augalus, kurie yra susiję seserinio ar motininio klonavimo požiūriu, ir tiriant tuos pomidorų augalus, kurie kilę iš tų pačių šaltinių, kaip ir sąraše pateikta augalinė medžiaga, pripažinta užkrėsta pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto ii papunktį, kuri galėjo būti užkrėsta per kloninį ryšį, nors bandymų rezultatai ieškant organizmo buvo neigiami,- sąraše pateiktos augalinės medžiagos gamybos vietą (vietas), nurodytas ankstesnėje įtraukoje,- sąraše pateiktos augalinės medžiagos gamybos vietas, kurios laistomos ir purškiamos vandeniu, pripažintu užkrėstu pagal 5 straipsnio 1 dalies c punkto ii papunktį,- sąraše pateiktą augalinę medžiagą, išaugintą laukuose, kurie buvo užtvindyti paviršiniais vandenimis, kurie buvo pripažinti užkrėsti organizmu.2. Pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto iv papunktį ir 5 straipsnio 1 dalies c punkto iii papunktį, galimas organizmo išplitimas yra nustatomas tiriant:i) 5 straipsnio 1 dalies a punkto iv papunktyje numatytais atvejais:- kaimynystėje esančias gamybos vietas, kuriose auginama sąraše pateikta augalinė medžiaga,- sėklinių bulvių atsargų bendrą gamybą ir sunaudojimą,- gamybos vietas, kuriose sąraše pateikta augalinė medžiaga laistoma arba purškiama paviršiniais vandenimis tada, kai gresia ar grėsė pavojus, kad paviršiniai vandenys gali nutekėti arba užtvindyti gamybos vietas, kurios pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto ii papunktį yra pripažintos užkrėstomis.ii) tais atvejais, kai pagal 5 straipsnį 1 dalį a punkto ii papunktį paviršiniai vandenys buvo pripažinti užkrėstais:- gamybos vietą (vietas), kurioje auginama sąraše pateikta augalinė medžiaga yra užkrėstų paviršinių vandenų kaimynystėje ar kuriai gresia pavojus būti užtvindytai tuo vandeniu,- bet kokį pavienį vandens telkinį, kaip nors susijusį su pripažintais užkrėstais paviršiniais vandenimis.3. 5 straipsnio 2 dalies pirmoje pastraipoje minimame pranešime nurodomos detalės:- pranešimo apie 4 straipsnyje nurodytą įtariamą užkrėtimą data ir 5 straipsnyje minimo bandinių ėmimo ir organizmo buvimo patvirtinimo datos,- pripažinto užkrėtimo ir paženklintos teritorijos aprašymas.4. 5 straipsnio 2 dalies antrojoje pastraipoje minimame papildomame pranešime nurodomos detalės:- bet kokiai bulvių siuntai arba partijai, pripažintai užkrėsta, sertifikatai nurodyti Direktyvos 77/93/EEB 7 ir 8 straipsnyje, ir prireikus bulvių gamintojų, bendrų sandėlių ir išsiuntimo centrų paso arba registracijos numeris,- bet kokiai pomidorų siuntai arba partijai, pripažintai užkrėsta, sertifikatai nurodyti Direktyvos 77/93/EEB 7 ir 8 straipsnyje, ir paso numeris, atsižvelgiant į Direktyvos 77/93/EEB V priedo A dalies I.2.2 skirsnyje pateiktą sąrašą,- veislės pavadinimas ir sėklinių bulvių atsargų kategorija, ir, jei įmanoma, visais kitais atvejais,- bet kokia kita informacija apie patvirtintą infekcijos protrūkį, kurios gali pareikalauti Komisija.--------------------------------------------------VI PRIEDAS1. Pagal 6 straipsnio 1 dalį, nuostatos yra tokios:- sudeginti arba- panaudoti gyvulių pašarams apdorojus kaitinant, kad žūtų organizmas, arba- giliai užkasti šiukšlių duobėje, iš kurios organizmas negalės patekti į dirbamus žemės plotus arba vandenį, kuris gali būti naudojamas žemės ūkio paskirties žemės laistymui, arba- perdirbti pramoniniu būdu, pristatant atliekas tiesiogiai ir nedelsiant į perdirbimo gamyklą, kurioje įrengti oficialiai patvirtinti perdirbimo įrenginiai, atitinkantys šios direktyvos VII priede pateiktas nuostatas, arba- taikyti kitas priemones su sąlyga, kad buvo nustatyta, jog nėra pastebimo organizmo išplitimo pavojaus; apie tokias priemones turi būti nedelsiant pranešama Komisijai ir kitoms valstybėms narėms.2. 6 straipsnio 2 dalyje nurodytas tinkamas sąraše pateiktos augalinės medžiagos panaudojimas arba pašalinimas, kontroliuojant tos valstybės narės (valstybių narių) atsakingosioms valstybinėms institucijoms ir joms viena kitą atitinkamai informuojant, kad ta kontrolė būtų užtikrinama visą laiką, ir valstybės narės atsakingajai valstybinei institucijai pritariant, jei bulvės pakuojamos arba apdorojamos naudojant atliekų sunaikinimo įrenginius, nurodytus pirmoje ir antroje įtraukose, yra toks:i) bulvių gumbų atveju,- naudoti kaip prekines bulves, skirtas vartojimui ir supakuotas įmonėse, turinčiose atitinkamą atliekų šalinimo įrangą, bei skirtas ir paruoštas tiesioginiam išvežimui ir naudojimui jų neperpakuojant, arba- naudoti kaip prekines bulves, skirtas pramoniniam perdirbimui ir tiesioginiam bei neatidėliotinam pristatymui į perdirbimo gamyklą, turinčią atitinkamus atliekų pašalinimo įrengimus, arba- vartoti ar sunaikinti kokiu nors kitu būdu, kurį turi patvirtinti minėtos atsakingosios oficialios institucijos, su sąlyga, jog nustatyta, kad negresia realus organizmo plitimo pavojus. Apie tokias priemones turi būti nedelsiant pranešama Komisijai ir kitoms valstybėms narėms.ii) kitų augalų dalių atveju, įskaitant stiebą ir lapų liekanas,- sunaikinti arba- panaudoti ar sunaikinti kitu būdu su sąlyga, jog nustatyta, kad negresia realus organizmo plitimo pavojus; apie tokius būdus yra pranešama Komisijai ir kitoms valstybėms narėms.3. 6 straipsnio 3 dalyje minimi atitinkami užkrėstų objektų užkrato išaiškinimo būdai yra jų išvalymas, jei reikia, dezinfekavimas, kad neliktų realaus organizmo plitimo pavojaus. Jie yra taikomi prižiūrint valstybių narių atsakingoms oficialioms institucijoms.4. Priemonės, kurias valstybės narės turi įgyvendinti paženklintoje teritorijoje (teritorijose), nustatytoje pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto iv papunktį ir c punkto iii papunktį ir nurodytos 6 straipsnio 4 dalyje, yra tokios:4.1. Tais atvejais, kai pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto ii papunktį gamybos vietos buvo pripažintos užkrėstomis:a) saugomuose pasėlių plotuose, pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto ii papunktį pripažintuose užkrėstais, arbai) mažiausiai per 4 auginimo metus po užkrėtimo pripažinimo,- imasi priemonių išnaikinti savaime išaugusius bulvių ir pomidorų augalus, taip pat ir kitus organizmo šeimininkus, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles, ir- toliau išvardyti augalai nėra sodinami:- bulvių gumbai ir augalai,- pomidorų augalai ir sėklos,- atsižvelgiant į organizmo biologiją nebus sodinami:- kiti šeimininkai,- Brassica rūšies augalai, kuriuose organizmas gali išlikti,- kultūros, kurios kelia realų organizmo plitimo pavojų;- pirmo bulvių ir pomidorų derliaus sezono metu po laikotarpio, apibūdinto ankstesnėje įtraukoje, ir su sąlyga, kad per paskutinius dvejus auginimo metus prieš sodinant tame lauke nebuvo aptikta savaime augančių bulvių ir pomidorų augalų ir kitų šeimininkų, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles,- bulvių atveju, oficialiai patvirtintos sėklinės bulvės yra sodinamos tik prekinei produkcijai, ir- kaip smulkiai nurodyta 2 straipsnio 1 dalyje, yra atliekamas oficialus tyrimas, įskaitant ir bandymus,- bulvių ir pomidorų derliaus metu, einančiu po ankstesnėje įtraukoje paminėto sezono ir laikantis atitinkamo sėjomainos ciklo, oficialiai patvirtintos sėklinės bulvės yra sodinamos sėklai arba perdirbimui maistui, o bulvės bei pomidorai oficialiai tiriami pagal 2 straipsnio 1 dalies nuostatas, arbaii) per 5 auginimo metus po užkrėtimo pripažinimo,- imamasi priemonių išnaikinti savaime augančius bulvių ir pomidorų augalus, kaip ir kitus organizmo šeimininkus, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles, ir- pirmuosius trejus metus laukas yra ruošiamas ir paliekamas dirvonuoti arba, priklausomai nuo nustatyto pavojaus laipsnio, yra apsėjamas javais arba paverčiamas daugiamete ganykla joje intensyviai ganant arba dažnai ir trumpai ją šienaujant, arba užleidžiamas žole sėklų gamybai, po to dvejus metus apsodinant jį augalais, kurie nėra organizmo šeimininkai, ir kurie nekelia organizmo išlikimo ir išplitimo pavojaus,- pirmo bulvių ir pomidorų derliaus sezono metu, po laikotarpio, apibūdinto ankstesnėje įtraukoje,- oficialiai patvirtintos sėklinės bulvės yra sodinamos arba sėklai, arba prekinei produkcijai,ir atliekamas oficialus tyrimas, įskaitant bandymus, smulkiai nurodytus 2 straipsnio 1 dalyje;b) kituose laukuose:- pirmaisiais auginimo metais po užkrėtimo pripažinimo:- nesodinami jokie bulvių augalai arba gumbai ar kiti organizmo šeimininkai ir imamasi priemonių, kad būtų išnaikinti savaime augantys bulvių ir pomidorų augalai bei kiti šeimininkai, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles, arba- bulvių gumbų atveju, oficialiai patvirtintos sėklinės bulvės gali būti sodinamos tik prekinei produkcijai su sąlyga, kad atsakingosios oficialios institucijos įsitikina, kad savaime augančių bulvių ir pomidorų augalų ir kitų organizmo šeimininkų, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles, pavojus pašalintas. Augantis derlius yra tikrinamas atitinkamu laiku ir savaime augantys bulvių augalai yra tikrinami dėl organizmo buvimo; be to, nuėmus bulvių derlių, tikrinami gumbai;- pirmais auginimo metais po pirmoje įtraukoje nurodyto laikotarpio,- bulvių atveju, tik oficialiai patvirtintos sėklinės bulvės yra sodinamos sėklai arba prekinei produkcijai,- bent antraisiais auginimo metais po pirmoje įtraukoje nurodyto laikotarpio,- bulvių atveju, tik oficialiai patvirtintos sėklinės bulvės arba sėklinės bulvės, išaugintos iš oficialiai patvirtintų sėklinių bulvių, oficialiai kontroliuojant jų augimą, yra sodinamos sėklai arba prekinei produkcijai,- kiekvienais auginimo metais, minėtais ankstesnėse įtraukose, imamasi priemonių išnaikinti savaime augančius bulvių ir pomidorų augalus ir kitus organizmo šeimininkus, įskaitant ir bulvinių šeimos piktžoles, ir atliekamas oficialus tyrimas, smulkiai išdėstytas 2 straipsnio 1 dalyje, o tais atvejais, kai sėklinės bulvės yra sodinamos sėklai, atliekamas gumbų tyrimas;c) iškart po užkrėtimo nustatymo pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto ii papunktį, ir kiekvienais metais, įskaitant ir pirmąjį leistiną bulvių ir pomidorų derlių iš užkrėstais pripažintų laukų, kaip numatyta a punkte:- visi gamybos vietoje esantys mechanizmai ir bulvių laikymo įrenginiai, naudojami bulvių gamyboje, yra išvalomi ir, jei reikalinga, dezinfekuojami, taikant atitinkamus metodus, kaip nurodyta 3 dalyje,- siekiant išvengti organizmo išplitimo, yra įvedama atitinkama laistymo ir purškimo programų kontrolė, įskaitant ir jų uždraudimą;d) saugomo derliaus pasėlio plote, pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto ii papunktį pripažintame užkrėstu, kuriame įmanoma visiškai pakeisti augimo terpę,- nėra sodinami bulvių gumbai ar augalai arba kiti organizmo šeimininkai, įskaitant pomidorų augalus ir sėklas, jei minėtame pasėlio plote nebuvo taikomos oficialiai prižiūrimos priemonės, kuriomis buvo siekiama išnaikinti organizmą ir pašalinti visą šeimininkų medžiagą, įskaitant bent visišką augimo terpės pakeitimą ir išvalymą ir, jei reikia, minėto pasėlio ploto ir visos įrangos dezinfekavimą, ir po viso to atsakingosioms oficialioms institucijoms nepritariant bulvių ir pomidorų gamybai, ir- auginant bulves, jų sėkla yra pasirenkama iš oficialiai sertifikuotų sėklinių bulvių, arba jos auginamos iš minigumbų arba mikroaugalų, išvestų iš patikrintų šaltinių,- siekiant išvengti organizmo plitimo, yra įvedama atitinkama laistymo ir purškimo programų kontrolė, įskaitant ir jų uždraudimą.4.2. Nepažeisdamos 4.1 dalyje smulkiai aprašytų priemonių, paženklintoje teritorijoje valstybės narės:a) nedelsdamos ir bent trejus metus po užkrėtimo paskelbimo:aa) tais atvejais, kai paženklinta teritorija buvo nustatyta pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto iv papunktį,- užtikrina įmonių, auginančių, sandėliuojančių ir prižiūrinčių bulvių gumbus ir pomidorus, o taip pat ir įmonių, naudojančių bulvių ir pomidorų gamybos mechanizmus pagal sutartį, priežiūrą, vykdomą tos šalies atsakingų oficialių institucijų,- reikalauja išvalyti mechanizmus ir sandėlius, o jei reikia, ir dezinfekuoti, taikant atitinkamus metodus tokiose įmonėse, kaip nurodyta 3 dalyje,- reikalauja sėti tik sertifikuotą sėklą arba sėklą, išaugintą oficialiai prižiūrint visus bulvių pasėlius toje teritorijoje, ir nuėmus derlių bandymais patikrinti tas sėklines bulves, kurios buvo užaugintos gamybos vietose, pripažintose galimai užkrėstomis pagal 5 straipsnio 1 dalies a punkto iii papunktį,- visose šioje zonoje esančiose įmonėse nuimtą sėklinių bulvių derlių reikalauja laikyti atskirai nuo prekinei produkcijai skirtų bulvių,- atlieka oficialų tyrimą, apibūdintą 2 straipsnio 1 dalyje.ab) tais atvejais, kai paviršiniai vandenys buvo pripažinti užkrėstais pagal 5 straipsnio 1 dalies c punkto iii papunktį arba laikomi vienu iš galimų organizmo plitimo šaltinių pagal V priedo 2 punktą,- atlieka kasmetinį tyrimą atitinkamu laiku, įskaitant paviršinių vandenų ir atitinkamų bulvinių šeimos šeimininkų bandinių ėmimą susijusiuose vandens šaltiniuose ir tokius bandymus:- su sąraše pateikta augaline medžiaga atlieka pagal atitinkamą metodą, pateiktą II priede, arba- kitais atvejais – pagal bet kurį kitą oficialiai patvirtintą metodą,- įveda oficialų laistymo ir purškimo programų tikrinimą, įskaitant uždraudimą naudoti užterštu pripažintą vandenį, kuriuo laistoma ir purškiama sąraše pateikta augalinė medžiaga ir, jei reikia, kiti šeimininkai, kad būtų sustabdytas organizmo plitimas. Šis draudimas gali būti persvarstytas, remiantis kasmetinio tyrimo rezultatais,- tais atvejais, kai skystos atliekos yra užterštos, pradėti oficialiai tikrinti atliekas, pašalinamas iš pramoninio perdirbimo ir pakavimo patalpų, kuriose tvarkoma sąraše pateikta augalinė medžiaga;b) jei reikia, paruošia visų sėklinių bulvių atsargų pakeitimo per atitinkamą laikotarpį programą.--------------------------------------------------VII PRIEDASOficialiai patvirtinti atliekų apdorojimo įrenginiai, apibūdinti VI priedo 1 dalyje, atitinka toliau pateiktas nuostatas, skirtas išvengti organizmo plitimo pavojaus:i) bulvių ir pomidorų gamybos atliekos (įskaitant atmestas bulves bei jų lupenas ir pomidorus) ir bet kokios kitos kietos bulvių ir pomidorų atliekos yra šalinamos šiais būdais:- arba giliai užkasant šiukšlių duobėje, iš kurios jos negalės patekti į žemės ūkio paskirties žemes arba į vandens šaltinius, kurie gali būti naudojami žemės ūkio paskirties žemės laistymui. Atliekos nuvežamos tiesiai į vietą prižiūrint, kad nebūtų pamestos, arba- sudeginant;ii) skystos perdirbimo atliekos: prieš pašalinant skystas atliekas, savo sudėtyje turinčias kietų dalelių, jos turi būti filtruojamos, kad būtų pašalintos nuosėdos. Tos nuosėdos yra šalinamos i punkte paminėtais būdais.Po to skystos atliekos:- mažiausiai 30 minučių kaitinamos ne mažesnėje kaip 70 °C temperatūroje prieš jas pašalinant, arba- šalinamos kitokiu būdu gavus oficialų leidimą arba oficialiai kontroliuojant, kad nekiltų pavojus, jog atliekos gali patekti į žemės ūkio paskirties žemes ar vandens telkinius, naudojamus žemės ūkio paskirties žemės laistymui. Smulki informacija apie atliekų pašalinimą perduodama kitoms valstybėms narėms ir Komisijai.--------------------------------------------------