Svarbus teisinis pranešimas

|

32000L0033

2000 m. balandžio 25 d. Komisijos direktyva 2000/33/EB dvidešimt septintą kartą derinanti su technikos pažanga Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimotekstas svarbus EEE.

Oficialusis leidinys L 136 , 08/06/2000 p. 0090 - 0107 CS.ES skyrius 13 tomas 25 p. 242  - 259 ET.ES skyrius 13 tomas 25 p. 242  - 259 HU.ES skyrius 13 tomas 25 p. 242  - 259 LT.ES skyrius 13 tomas 25 p. 242  - 259 LV.ES skyrius 13 tomas 25 p. 242  - 259 MT.ES skyrius 13 tomas 25 p. 242  - 259 PL.ES skyrius 13 tomas 25 p. 242  - 259 SK.ES skyrius 13 tomas 25 p. 242  - 259 SL.ES skyrius 13 tomas 25 p. 242  - 259

		Komisijos direktyva 2000/33/EB2000 m. balandžio 25 d.dvidešimt septintą kartą derinanti su technikos pažanga Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo [1](tekstas svarbus EEE)EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį,atsižvelgdama į 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo [2] su paskutiniais pakeitimais, padarytais Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 1999/33/EB [3], ypač į jos 28 straipsnį,kadangi:(1) Direktyvos 67/458/EEB V priede nustatyti medžiagų ir preparatų fizikinių cheminių savybių, toksiškumo ir ekotoksiškumo nustatymo metodai. Šį priedą būtina suderinti su technikos pažanga.(2) Pagal 1986 m. lapkričio 24 d. Tarybos direktyvos 86/609/EEB dėl valstybių narių įstatymų ir kitų teisės aktų, susijusių su eksperimentiniais ar kitais mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsauga, suderinimo [4] 7 straipsnio 2 dalį eksperimentas, kuriam naudojami gyvūnai, neatliekamas, jei siekiamo rezultato galima pagrįstai ir praktiškai pasiekti kitu moksliškai tinkamu metodu, kuriam nereikia gyvūnų.(3) Į Direktyvos 67/548/EEB V priedą Komisija ketina įtraukti kai kuriuos alternatyvius tyrimo metodus tam, kad būtų galima ištirti chemines medžiagas nenaudojant gyvūnų, kaip numatyta Direktyvos 67/548/EEB 3 straipsnio 1 dalyje.(4) Šioje direktyvoje numatytos priemonės atitinka Direktyvų dėl techninių kliūčių panaikinimo pavojingų medžiagų ir preparatų prekybos srityje derinimo su technikos pažanga komiteto nuomonę,PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ:1 straipsnisŠios direktyvos I ir II priedų tekstai pridedami prie Direktyvos 67/458/EEB V priedo B dalies.2 straipsnis1. Valstybės narės priima įstatymus ir kitus teisės aktus, kurie, įsigalioję ne vėliau kaip iki 2001 m. spalio 1 d., įgyvendina šią direktyvą. Apie tai jos nedelsdamos praneša Komisijai.Valstybės narės, priimdamos šias nuostatas, daro jose nuorodą į šią direktyvą arba tokia nuoroda daroma jas oficialiai skelbiant. Nuorodos darymo tvarką nustato valstybės narės.2. Valstybės narės pateikia Komisijai šios direktyvos taikymo srityje priimtų nacionalinės teisės aktų pagrindinių nuostatų tekstus bei šios direktyvos ir priimtų nacionalinių nuostatų koreliacijos lentelę.3 straipsnisŠi direktyva įsigalioja trečią dieną po jos paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje.4 straipsnisŠi direktyva skirta valstybėms narėms.Priimta Briuselyje, 2000 m. balandžio 25 d.Komisijos varduMargot WallströmKomisijos narė[1] Priimta iki 26 derinimo.[2] OL 196, 1967 8 16, p. 1.[3] OL L 199, 1999 7 30, p. 57.[4] OL L 358, 1986 12 18, p. 1.--------------------------------------------------I PRIEDAS"B.40. ODOS SUARDYMAS1. METODAS1.1. ĮvadasEuropos alternatyvių tyrimo metodų patvirtinimo centras (ECVAM, Jungtinis tyrimų centras, Europos Komisija) patvirtino, kad du in vitro tyrimo metodai odos suirimui įvertinti — žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos (TEV) nustatymas ir modelinė žmogaus odos sistema yra moksliškai patikimi (1) (2) (3). Europos alternatyvių tyrimo metodų centro atliktas patikrinimas parodė, kad abiem metodais galima patikimai atskirti suardančias odą medžiagas nuo odos nesuardančių medžiagų. Be to, tyrimo aprašas, paremtas modeline žmogaus odos sistema leido teisingai nustatyti odos suardymo laipsnį (R35, arba medžiagos, visiškai suardančios odą ir R34, arba kitos odą suardančios medžiagos) (2). Pateikiami abiejų metodų aprašymai bei procedūros, šių metodų pasirinkimas priklauso nuo specifinių vartotojo poreikių ar turimų privilegijų/pageidavimų.Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalį.1.2. SąvokosOdos suardymas — negrįžtamas odos audinių suardymas tiriamomis cheminėmis medžiagomis.1.3. Etaloninės medžiagosIšsamiai neapibūdintos, bet žr. 1.5.3.4 ir 1.7.2.3.1.4. Tyrimo metodo principas — žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymasTiriamosios medžiagos apie 24 valandas yra inkubuojamos su odos diskų, paimtų iš neskausmingai užmuštų jaunų žiurkių odos, epidermio paviršiais. Odą suardančios medžiagos nustatomos pagal jų sugebėjimą sutrikdyti raginio sluoksnio (stratum corneum) vientisumą bei jo atliekamą skiriamąją (barjerinę) funkciją, kurie matuojami kaip žemiau slenkstinio lygio odos transepitelinės elektrinės varžos sumažėjimas (5 kΩ) (4) (5). Odą sujaudrinančios ir nesujaudrinančios medžiagos paprastai nesumažina transepitelinės elektrinės varžos žemiau slenkstinio lygmens. Tiriant paviršiaus įtempimą didinančius cheminius junginius bei organines medžiagas, kurių pH yra neutralus, tyrime dar galima analizuoti šių medžiagų susijungimą su dažais (apibrėžimą žr. 6 nuorodoje), kad būtų gauta mažiau neteisingų teigiamų duomenų, kurie paprastai gaunami, tiriant šių cheminių tipų medžiagas (2) (7).1.5. Tyrimo metodo — žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymo — aprašymas1.5.1. GyvūnaiOdos diskai paimami iš jaunų (20-23 dienų amžiaus) Wistar ar panašaus inbredinio kamieno žiurkių. Dorsaliniai ir šoniniai plaukai pašalinami žirklutėmis, skirtomis gyvūnams apkirpti. Po to gyvūnai plaunami, gerai juos ištrinant, ir panardinant į antibiotikų (pvz., streptomicino, penicilino, chloramfenikolo ar amfotericino, kurių koncentracijos pakanka bakterijų dauginimuisi sustabdyti) prisotintą tirpalą. Trečią ar ketvirtą dieną po pirmojo plovimo gyvūnai dar kartą plaunami antibiotikų tirpalu ir ne vėliau kaip per 3 dienas yra panaudojami (ruošiant odos preparatus, gyvūnai turi būti ne vyresni kaip 31 dienos amžiaus).1.5.2. Odos diskų paruošimasGyvūnai neskausmingai užmušami. Tada kiekvieno gyvūno oda atskiriama bei nuo jos atsargiai nuskutami pertekliniai riebalai. Oda uždedama ant mėgintuvėlio su politetrafluoretilenu (PTFE) galo taip, kad odos epidermis liestųsi su mėgintuvėlio paviršiumi. Ant mėgintuvėlio galo tvirtai užmaunamas "O" pavidalo guminis žiedas, kad prilaikytų odą, o nereikalingas likutis nukerpamas. Mėgintuvėlio ir "O" pavidalo žiedo matmenys pateikti 1 paveiksle. Paskui "O" pavidalo guminis žiedas žibaline alyva rūpestingai pritvirtinamas prie mėgintuvėlio su PTFE galo. Spyruokliniu gnybtu mėgintuvėlis įtvirtinamas receptorinėje kameroje, pripildytoje (154 mM) magnio sulfato tirpalo (2 paveikslas).1.5.3. Tyrimo procedūra1.5.3.1. Tiriamosios medžiagos panaudojimasSkystos tiriamosios medžiagos (150 μl) mėgintuvėlyje užpilamos ant epidermio paviršiaus (2 paveikslas). Tiriant kietąsias medžiagas, pakankamas kietosios medžiagos kiekis užpilamas ant disko, kad visas epidermio paviršius būtų padengtas kietąja medžiaga. Paskui ant kietosios medžiagos užpilama 150 μl dejonizuoto vandens, ir mėgintuvėliai atsargiai pakratomi. Tiriamosios medžiagos ir odos sąlytis turi būti kaip galima didesnis. Naudojant kai kurias kietąsias medžiagas tai pasiekiama pašildžius mėgintuvėlį iki 30 °C, kad jame esanti medžiaga ištirptų, arba ji sugrūdama, kad virstų granulėmis ar milteliais. Kiekvienai tiriamajai medžiagai naudojami trys odos diskai. Tiriamosios medžiagos inkubuojamos 24 valandas (taip pat žr. 1.5.3.4). Tiriamoji medžiaga pašalinama 30 °C temperatūros vandentiekio vandens srove tol, kol jokia kita medžiaga nebenusiplauna. Sukietėjusios tiriamosios medžiagos iš mėgintuvėlio pašalinamos maždaug 30 °C temperatūros vandens srove.1.5.3.2. Transepitelinės elektrinės varžos matavimaiTransepitelinė elektrinė varža matuojama mažos įtampos kintamosios srovės analizatoriumi (pvz. AIM 401 arba 6401 arba juos atitinkančiais prietaisais). Prieš matuojant elektrinę varžą, sumažinamas odos paviršiaus įtempimas, pridedant pakankamai 70 % etilo alkoholio, kad visas epitelio paviršius būtų padengtas. Po kelių sekundžių etilo alkoholis pašalinamas apvertus mėgintuvėlį, o paskui audinys sudrėkinamas, pripylus (154 mM) magnio sulfato tirpalo. Norint išmatuoti odos disko varžą kΩ/odos diskui, iš abiejų odos disko pusių uždedami analizatoriaus elektrodai (2 paveikslas). Elektrodo matmenys ir jo ilgis žemiau "krokodilo" tipo gnybtų yra parodytas 1 paveiksle. Matuojant varžą, vidinis (storasis) elektrodo gnybtas uždedamas ant politetrafluoretileno pripildyto mėgintuvėlio viršaus, kad pakankama elektrodo atkarpa būtų panardinta į magnio sulfato tirpalą. Išorinis (plonasis) elektrodas įdedamas į receptorinę kamerą taip, kad atsidurtų kameros dugne. Atstumas tarp spyruoklinio gnybto apačios ir mėgintuvėlio, pripildyto politetrafluoretilenu (PTFE) (1 paveikslas), visą laiką turi būti vienodas, nes nuo jo priklauso matuojamos varžos dydis.Atkreipkite dėmesį į tai, kad jei matuojama varža yra didesnė nei 20 kΩ, tai gali būti, kad tiriamoji medžiaga dengia odos disko epiderminį paviršių. Šią medžiagą galima pabandyti pašalinti, pavyzdžiui, pirštine apmautos rankos nykščiu užspausti PTFE mėgintuvėlį ir apie 10 sekundžių jį pakratyti; magnio sulfato tirpalas išpilamas, ir varža vėl matuojama. Matavimas pakartojamas su šviežiai paruoštu magnio sulfato tirpalu.Atliekant transepitelinės elektrinės varžos matavimus, gautų rezultatų vidurkiai laikomi priimtinais, jei vienalaikės teigiamos ir neigiamos kontrolinės vertės neperžengia leistinų metodo dydžių. Toliau pateikiamos siūlomos kontrolinės medžiagos ir priimtini jų varžos svyravimo intervalai, kai taikoma aprašytoji metodika ir naudojami aprašytieji prietaisai:Kontrolė | Medžiaga | Leistinas varžos intervalas kΩ |Teigiama | 10 M HCl (36 %) | 0,5 - 1,0 |Neigiama | Distiliuotas vanduo | 10 - 25 |1.5.3.3. Modifikuota paviršiaus įtempimą didinančių medžiagų ir neutralaus pH organinių junginių tyrimo metodikaJei tiriamųjų medžiagų, paviršiaus įtempimą didinančių medžiagų ar neutralaus pH organinių junginių, transepitelinė elektrinė varža yra 5 kΩ arba mažesnė, tokiu atveju galima tirti dažų skvarbą į audinius. Ši procedūra leidžia nustatyti, ar gauti rezultatai yra teigiami, bet neteisingi (2).1.5.3.3.1. Sulforodamino B dažo panaudojimas ir pašalinimasPo pirminio apdorojimo tiriamąja medžiaga ant kiekvieno odos disko epidermio paviršiaus užpilama 150 μl 10 % sulforodamino B dažo, ištirpinto distiliuotame vandenyje ir palaikoma 2 valandas. Paskui odos diskai apie 10 sekundžių plaunami kambario temperatūros vandentiekio vandeniu, kad bet koks dažo perteklius ar neprisijungęs dažas būtų pašalintas. Kiekvienas odos diskas atsargiai išimamas iš PTFE mėgintuvėlio su politetrafluoretilenu ir įdedamas į indą (pvz., į 20 ml scintiliacinį indą) su 8 ml dejonizuoto vandens. Indai 5 minutes atsargiai kratomi, kad bet koks dažo perteklius ar neprisijungęs dažas būtų pašalintas. Ši plovimo procedūra pakartojama, o paskui odos diskai perkeliami į indus su 5 ml 30 % vandeninio (w/v) natrio dodecilsulfato (SDS) tirpalo ir per naktį inkubuojami 60 °C temperatūroje. Pasibaigus inkubacijai, kiekvienas odos diskas išimamas ir išmetamas, o likęs tirpalas 8 minutes centrifuguojamas 21 °C temperatūroje (santykinė centrifuginė jėga @175). 1 ml supernatanto praskiedžiamas santykiu 1: 5 (v/v) (t. y. 1 ml + 4 ml) 30 % vandeniniu natrio dodecilsulfato tirpalu. Tirpalo optinis tankis (OT) išmatuojamas, bangos ilgiui esant apie 565 nm.1.5.3.3.2. Dažo kiekio apskaičiavimasSulforodamino B dažo kiekis viename odos diske apskaičiuojamas pagal optinio tankio (OT) vertes (sulforodamino B dažo moliarinės ekstinkcijos koeficientas, bangos ilgiui esant 565 nm = 8,7×104, o molekulinei masei - 580). Kiekviename odos diske nustatomas sulforodamino B dažo kiekis, paskui pakartotinai apskaičiuojamas dažo kiekio vidurkis. Susijungimo su dažu duomenų vidurkiai laikomi priimtinais, jei vienalaikės kontrolinės vertės neperžengia leistinų metodo ribų. Siūlomi tokie priimtini dažo kiekio kontrolinėse medžiagose svyravimo intervalai taikant aprašytą metodiką ir naudojant aprašytus prietaisus:Kontrolė | Medžiaga | Dažo kiekio intervalas μg/diske |Teigiama | 10 M HCl (36 %) | 40 - 100 |Neigiama | Distiliuotas vanduo | 15 - 35 |1.5.3.4. Papildoma informacijaTiriamosios medžiagos gali būti panaudojamos odos diskams ir trumpiau (pvz., 2 valandas), jei norima nustatyti labai odą suardančias medžiagas, tačiau, atliekant patikrinamąjį tyrimą, buvo gauti duomenys, rodantys, kad transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodu tiriant keletą cheminių medžiagų, panaudotų odos diskams 2 valandas (2), šių junginių sugebėjimas suardyti odą buvo pervertintas, nors šis metodas leido teisingai nustatyti odą suardančias ir nesuardančias medžiagas po 24 valandas trukusio bandymo.Panaudoto prietaiso savybės ir matmenys bei taikyta eksperimento procedūra gali turėti įtakos duomenims, kurie gaunami, matuojant transepitelinę elektrinę varžą. Medžiagų, suardančių odos audinį, elektrinės varžos aukščiausia riba, lygi 5 kΩ buvo parinkta, panaudojus specialų prietaisą ir pritaikius šio metodo aprašyme nurodytą procedūrą. Iš esmės pakitus tyrimo sąlygoms, gali tikti skirtingos ribinės ir kontrolinė vertės. Todėl tiriant keletą etaloninių standartų, pasirinktų iš cheminių medžiagų, naudojamų, atliekant patikrinamąjį tyrimą, rekomenduojama suderinti metodologiją ir ribinę vertę.1.6. Tyrimo metodo — žmogaus odos modelio — principasTiriamoji medžiaga iki 4 valandų laikoma ant trimačio žmogaus odos modelio, kurį sudaro rekonstruotas epidermis, turintis funkcinį raginį sluoksnį (stratum corneum). Medžiagos, suardančios odą, identifikuojamos pagal jų sugebėjimą per nustatytą inkubavimo laiką sumažinti ląstelių gyvybingumą (pvz., taikant MTT metodą) žemiau nurodytų ribinių lygių. Šis metodas patvirtina hipotezę, kad odą suardančios cheminės medžiagos yra būtent tos, kurios sugeba prasiskverbti pro raginį sluoksnį (difuzijos ar erozijos būdu), yra pakankamai citotoksiškos ir sunaikina apatinių sluoksnių ląsteles.1.7. Tyrimo metodo — žmogaus odos modelio — aprašymas1.7.1. Žmogaus odos modeliaiŽmogaus odos modelius galima gauti iš įvairių šaltinių, tačiau jie privalo atitikti tam tikrus kriterijus. Modelis turi turėti funkcinį raginį sluoksnį, po kuriuo turi būti gyvų ląstelių sluoksnis. Turi būti reikiama barjerinė raginio sluoksnio funkcija. Tai galima parodyti, demonstruojant modelio atsparumą citotoksiškumui, panaudojus ląsteles sunaikinančias medžiagas, kurios normaliomis sąlygomis neprasiskverbia pro raginį sluoksnį. Esant nustatytoms eksperimento sąlygoms, modelis turi rodyti, kad rezultatus galima pakartoti.Modelyje esančios gyvosios ląstelės turi būti pakankamai gyvybingos, kad būtų galima atskirti teigiamas kontrolines medžiagas nuo neigiamų. Ląstelių gyvybingumas (pvz., įvertinamas pagal MTT kiekio sumažėjimą, matuojant optinį tankį) po inkubacijos su neigiama kontroline medžiaga turi atitikti priimtinas konkrečiam modeliui ribas. Panašiai, po inkubacijos su teigiamomis kontrolinėmis medžiagomis, palyginus jas su neigiamomis kontrolinėmis medžiagomis, ląstelių gyvybingumo laipsnis turi neperžengti nustatyto lygio. Svarbiausia įrodyti, kad panaudotas spėjimų modelis atitinka tarptautinį patvirtinimo standartą (2).1.7.2. Tyrimo procedūra1.7.2.1. Tiriamosios medžiagos panaudojimasJei tiriamosios medžiagos yra skystos, jos naudojamos taip, kad padengtų odos paviršių (mažiausiai - 25 μl/cm2). Jei tiriamosios medžiagos yra kietos, jos naudojamos taip, kad padengtų odą, paskui jos sudrėkinamos, kad kuo glaudžiau liestųsi su oda; jei reikia, prieš naudojimą kietosios medžiagos turėtų būti sutrinamos į miltelius. Reikia įrodyti, kad taikomas metodas tinka daugeliui įvairiausiems cheminiams tipams priklausančių medžiagų (2). Pasibaigus medžiagos veikimo laikui, tiriamoji medžiaga turi būti druskos tirpalu kruopščiai nuplauta nuo odos.1.7.2.2. Ląstelių gyvybingumo matavimaiLąstelių gyvybingumui įvertinti gali būti taikomas bet kuris patvirtintas kiekybinis metodas. Dažniausiai taikomas MTT redukcijos metodas, kuriuo įvairios laboratorijos gavo tikslius ir atkartojamus rezultatus (2). Odos diskas 3 valandoms pamerkiamas į 20-28oC temperatūros MTT tirpalą (0,3 mg/ml). Ekstrahuojamas (ekstrakcija tirpikliais) nusėdęs netirpus mėlynos spalvos formazanas ir nustatoma jo koncentracija, matuojant jo optinį tankį, kai bangos ilgis siekia 545-595 nm.1.7.2.3. Papildoma informacijaPanaudotas odos modelis, tikslus medžiagos veikimo laikas, plovimo procedūrų protokolas ir kita turės didžiausią įtaką ląstelių gyvybingumo rezultatams. Rekomenduojama, kad metodologija ir spėjimo modelis būtų kalibruojami, ištiriant keletą etaloninių standartų, atrinktų iš cheminių medžiagų, panaudotų ECVAM tyrimui (3). Labai svarbu, kad pagal tarptautinius standartus šį metodą galima taikyti ir daugelyje laboratorijų, panaudojant daug įvairių cheminių medžiagų. Šis metodas bent jau turėtų atitikti aukščiau aprašytus mokslinio patvirtinimo kriterijus (2), o tokio patvirtinimo tyrimo duomenys privalo būti paskelbti, prieš tai juos recenzavus specialistams, moksliniame žurnale.2. DUOMENYS2.1. Rezultatų apdorojimas2.1.1. Žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos (TEV) nustatymo — metodasTiriamosios medžiagos varžos dydžiai (kΩ), teigiamos bei neigiamos kontrolės ir bet kokios standartinės etaloninės cheminės medžiagos turėtų būti pateiktos lentelėse, kur būtų ir kartojamų mėginių/pakartotinių eksperimentų duomenys, vidurkiai bei nustatyta klasifikacija.2.1.2. Žmogaus odos modelio tyrimasOptinio tankio ir tiriamąja medžiaga bei teigiamomis ir neigiamomis kontrolėmis paveiktų ląstelių procentais išreikšto apskaičiuoto gyvybingumo duomenys ir bet kokios etaloninės nurodytos cheminės medžiagos turėtų būti pateiktos lentelėse, kur būtų ir kartojamų mėginių/pakartotinių eksperimentų duomenys, vidurkiai bei nustatyta klasifikacija.2.2. Įvertinimas ir rezultatų aiškinimas2.2.1. Žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymo — metodasJei tiriamosios medžiagos transepitelinės elektrinės varžos vidurkis yra didesnis nei 5kΩ, tai ji laikoma odos audinio nesuardančia medžiaga. Jei transepitelinės elektrinės varžos vidurkis yra mažesnis nei 5kΩ arba 5kΩ, o tiriamoji medžiaga priklauso paviršiaus įtempimą didinančioms ar neutraliu pH pasižyminčioms organinėms medžiagoms, ji laikoma odos audinį suardančia medžiaga.Su paviršiaus įtempimą didinančiomis ir neutraliu pH pasižyminčiomis organinėmis medžiagomis, kurių transepitelinė elektrinė varža yra mažesnė nei 5kΩ arba 5kΩ, galima atlikti dažo įsiskverbimo tyrimą. Jeigu dažo, įsiskverbusio į odos diską, vidutinis kiekis yra didesnis nei tuo pat metu gautas vidutinis dažo, įsiskverbusio į odos diską, paveiktą 36 % HCl teigiama kontrole, kiekis arba lygus jam, tai tiriamoji medžiaga yra tikrai teigiama ir todėl priklauso odos audinį suardančioms medžiagoms. Jei dažo, įsiskverbusio į odos diską, vidutinis kiekis yra mažesnis nei tuo pat metu gauto dažo, įsiskverbusio į odos diską, paveikto 36 % HCl teigiama kontrole, kiekis, tai tiriamoji medžiaga nėra laikoma teigiama ir priklauso medžiagoms, nesuardančioms odos.2.2.2. Žmogaus odos modelio tyrimasNeigiamos kontrolės optinio tankio reikšmė atspindi šimtaprocentinį ląstelių gyvybingumą, taigi kiekvieno tiriamojo mėginio optinio tankio reikšmės gali būti panaudotos apskaičiuoti gyvybingumo, palyginus su neigiama kontrole, procentais išreikštą reikšmę. Galutinė ląstelių gyvybingumo vertė išreikšta procentais, skirianti odą suardančias medžiagas nuo nesuardančių medžiagų (arba atskirianti vieną nuo kitos skirtingoms klasėms priklausančias odą suardančias medžiagas), turi būti aiškiai apibūdinta spėjimo modelyje prieš patvirtinant metodą, o tolesnis patvirtinimo tyrimas turi įrodyti, kad ši galutinė riba yra tinkama (2).3. ATASKAITATyrimo ataskaitaTyrimo ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija:Tiriamoji medžiaga:- nustatymo data, fizinė prigimtis ir, jei būtina, jos fizinės ir cheminės savybės. Panaši informacija pateikiama, jei naudojamos etaloninės medžiagos.Tyrimo sąlygos:- taikytos procedūros aprašymas,- kiekvienos modifikacijos aprašymas ir pagrindimas.Rezultatai:- lentelėse pateikiami tiriamosios medžiagos, teigiamų bei neigiamų kontrolinių medžiagų ir visų nurodytų standartinių etaloninių medžiagų varžos dydžiai (transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodas) ar ląstelių gyvybingumo, išreikšto procentais, dydžiai (žmogaus odos modelio tyrimas), kartu pateikiant pakartotinių mėginių/kartotinių eksperimentų duomenis bei vidurkius,- bet koks kito pastebėto poveikio aprašymas.Rezultatų aptarimas.Išvados.4. NUORODOS1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views. ATLA 26, p. 275-280.2) Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, p. 483-524.3) Barrat, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, L., Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 121, p. 471-482.4) Oliver, G. J. A., Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test – modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, p. 507-512.5) Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., Basketter, D. A., Whittle, E., Cheesman, M., Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro:results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, p. 191-194.6) Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, p. 709-720.7) Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, p. 219-255.+++++ TIFF +++++1 paveikslas+++++ TIFF +++++2 paveikslas"--------------------------------------------------II PRIEDAS"B.41. FOTOTOKSIŠKUMAS - 3T3 NRU FOTOTOKSIŠKUMO TYRIMAS IN VITRO1. METODAS1.1. ĮvadasFototoksiškumas apibūdinamas kaip toksinė reakcija, kuri atsiranda, kai pirmą kartą oda paveikiama tam tikromis cheminėmis medžiagomis, o po to — šviesa, arba kuri sukeliama panašiai — kai sistemingai veikiama chemine medžiaga, oda yra apšvitinama.3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo in vitro rezultatai leidžia nustatyti tiriamos medžiagos fototoksinį aktyvumą, t. y. ar kokios nors tiriamos medžiagos ultravioletiniais ir matomos šviesos spinduliais gali kelti pavojų.Kadangi toksikologinio tyrimo in vitro tikslas — ištirti fototoksiškumą, odą paveikus cheminėmis medžiagomis ir šviesa, todėl šio tyrimo metu galima identifikuoti fototoksiškus junginius in vivo po to, kai jais sistemingai buvo veikiama oda ir kai jie joje pasiskirsto, taip pat fotodirginančias medžiagas, kurių veikimas pasireiškia joms paveikus konkrečią odos vietą.1992-1997 m. vykdant bendrą Europos Sąjungos ir COLIPA projektą, buvo sukurtas ir patvirtintas 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimas (1) (2) (3), kad būtų rasta patikima alternatyva metodams, taikomiems in vivo. 1996 m vykusiame OECD seminare buvo pasiūlytas nuoseklus fototoksiškumo tyrimas in vitro (4).3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo in vitro duomenys buvo lyginami su ūmiojo fototoksiškumo/fotodirginimo poveikiu žmonėms bei gyvūnams ir buvo pastebėta, kad šis tyrimas leidžia puikiai numatyti tokį poveikį. Šiuo tyrimu nesiekiama numatyti kitokio pobūdžio žalingo poveikio, kuris gali atsirasti, kai odą vienu metu veikia cheminės medžiagos bei šviesa, pvz., fotogenotoksiškumo, fotoalergijos, fotodirginimo ar fotokarcinogenotoksiškumo, nors atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą daugelis šiomis savybėmis pasižyminčių cheminių medžiagų reagavo teigiamai. Be to, šis tyrimas nėra skirtas šviesos fototoksiniam aktyvumui įvertinti.Šiame priede pateikiamas nuoseklusis cheminių medžiagų fototoksiškumo tyrimas.1.2. SąvokosSpinduliuotė: ultravioletinės (UV) ar matomos šviesos, krentančios ant paviršiaus, intensyvumas, išreiškiamas W/m2 arba mW/cm2.Šviesos dozė: ultravioletinės (UV) ar matomos šviesos, krentančios ant paviršiaus, kiekis išreiškiamas džauliais (= W × s) paviršiaus plotui, pvz., J/m2, J/cm2.Ultravioletinės šviesos bangų juostos: CIE (Tarptautinės radiacijos komisijos) rekomenduojami žymėjimai: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm), UVC (100-280 nm). Vartojami ir kiti žymėjimai: skiriamoji riba tarp UVA ir UVB paprastai yra ties 320 nm padala, ir todėl UVA galima padalyti į UV-A1 ir UV-A2, skiriamąją ribą nustačius ties 340 nm padala.Ląstelių gyvybingumas: parametras, rodantis absoliutų ląstelių populiacijos aktyvumą (pvz., vitalinio neutralaus raudonojo dažo susigėrimą į ląstelių lizosomas), kuris priklausomai nuo galutinio išmatuoto dydžio bei tyrimo programos, yra susijęs su bendru ląstelių skaičiumi ir (ar) jų gyvybingumu.Santykinis ląstelių gyvybingumas:ląstelių gyvybingumas, išreikštas palyginus su neigiamais kontroliniais mėginiais (tirpikliais), su kuriais atliekama visa tyrimo procedūra (arba + UV, arba — UV) ir kurie nebuvo paveikti tiriamąja chemine medžiaga.Spėjimų modelis: algoritmas, naudojamas numatant toksiškumo galią, remiantis toksiškumo tyrimo rezultatais. Pasirinkus šį kelią, kai bandoma nustatyti fototoksinį aktyvumą, kai atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, gauti rezultatai būtų panaudoti, numatant fotoksiškumo galią, galima naudotis FSV (fotodirginimo veiksniu) ir VFE (vidutiniu fotoefektu).Fotodirginimo veiksnys (FDV): veiksnys, gaunamas lyginant tarpusavyje dvi vienodai veiksmingas tiriamas cheminės medžiagos citotoksines koncentracijas (EB50), gautas apšvitinus necitotoksine ultravioletinės/matomos šviesos spinduliuote.Vidutinis fotoefektas (VFE): naujas parametras, gautas matematiškai išanalizavus visą dviejų skirtingų koncentracijų kreivių pavidalą, gautą apšvitinus necitotoksine ultravioletine/matoma šviesa.Fototoksiškumas: ūmiai pasireiškiantis toksinis atsakas, kai oda iš pradžių veikiama tam tikromis cheminėmis medžiagomis, o vėliau — šviesa, arba kuris pasireiškia panašiai, kai į odą sistemiškai injekuojama cheminė medžiaga.Fotodirginimas: fototoksiškumo atmaina, naudojama apibūdinant tik tokias fototoksines reakcijas, kurios vyksta odoje, kai cheminės medžiagos ją veikia vietiniu ar oraliniu būdu. Vykstant šioms fototoksinėms reakcijoms, ląstelės suardomos nespecifiniu būdu (ši reakcija panaši į tą, kurią sukelia nudegimas nuo saulės).Fotoalergija: įgytas imunologinis reaktyvumas, kurio nebūna odą veikiant chemine medžiaga pirmą kartą; jį sukelia tik 1-2 savaites trunkanti indukcija.Fotogenotoksiškumas: genotoksinis atsakas, pažeidžiantis ląstelės genomą ir atsiranda tada, kai ląstelės apšvitinamos ultravioletinės/matomos šviesos bangų negenotoksine doze ir negenotoksiniu chemine medžiaga.Fotokarcinogeniškumas: karcinogeniškumas, sukeliamas pakartotinai paveikus chemine medžiaga ir šviesa. Terminas "fotokarcinogenezė" paprastai vartojamas tada, kai cheminė medžiaga suaktyvina vėžio, sukelto ultravioletine spinduliuote, vystymąsi.1.3. Etaloninės medžiagosAtliekant tyrimą, kai norima iš naujo nustatyti 3T3 NRU fototoksiškumą, be teigiamos kontrolinės medžiagos — chlorpromazino, kuri turėtų būti kartu tiriama per kiekvieną naują bandymą, rekomenduojama kaip etalonus naudoti ir keletą cheminių medžiagų, kurios buvo naudojamos atliekant šį tyrimą keliose skirtingose laboratorijose (3) (1) (13).1.4. Pirminis aptarimasNustatyta, kad daugelio tipų cheminės medžiagos sukelia fototoksinį poveikį (5) (6) (7) (8). Vienintelė bendra šių medžiagų ypatybė — gebėjimas absorbuoti saulės šviesos bangų spektre esančią šviesos energiją. Pagal pirmąjį fotochemijos dėsnį (Grotthauso-Draperio dėsnis) tam, kad vyktų fotocheminė reakcija, yra reikalingas pakankamas absorbuotų šviesos kvantų kiekis. Taigi, vadovaujantis šia tyrimo metodika (pagal OECD fototoksiškumo tyrimo rekomendaciją Nr. 101), prieš atliekant biologinį tyrimą siūloma nustatyti tiriamosios medžiagos absorbuojamos ultravioletinės/matomos šviesos spinduliuotės bangų spektrą. Jeigu moliarinės ekstinkcijos/absorbcijos koeficientas yra mažesnis nei 10 litrų × mol— 1× cm— 1, tai tiriamoji medžiaga nepasižymi fototoksiniu aktyvumu ir jos nereikia naudoti atliekant in vitro 3T3 NRU fototosiškumo tyrimą ar kurį nors kitą biologinį tyrimą norint nustatyti žalingą fotocheminį poveikį (priedėlis).1.5. Tyrimo metodo principasBuvo nustatyti keturi mechanizmai, kaip chromoforas (cheminė medžiaga), absorbuodamas šviesą, sukelia fototoksinį atsaką (7). Jie visi sukelia ląstelių pažeidimus. Taigi 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimas in vitro yra grindžiamas cheminės medžiagos citotoksiškumo, kai medžiaga apšvitinama arba neapšvitinama necitotoksine ultravioletinės/matomos šviesos spinduliuotės doze, palyginimu. Šio tyrimo metu citotoksiškumas išreiškiamas nuo koncentracijos priklausomu vitalinio neutralaus raudonojo dažo (NR) susigėrimo į ląstelę susilpnėjimu (9) praėjus 24 valandoms, po to kai ląstelės buvo paveiktos tiriamąja chemine medžiaga bei apšvitintos.Balb/c inbredinio pelių kamieno transformuoto fibroblastų ląstelių linija 3T3 24 valandas kultivuojama in vitro, kad susiformuotų monosluoksniai. Po to į dvi 96 duobučių mikrotitravimo plokšteles, skirtas kiekvienai tiriamajai medžiagai, įpilamos 8 skirtingos tiriamosios medžiagos koncentracijos, ir plokštelės 1 valandą inkubuojamos. Paskui viena mikrotitravimo plokštelė apšvitinama necitotoksine 5J/cm2 ultravioletinės/matomos šviesos spinduliuotės doze, o kita plokštelė tuo metu laikoma tamsoje. Vėliau abiejose plokštelėse esanti terpė pakeičiama kultivavimui skirta terpe, ir po pakartotinio 24 valandų inkubavimo pagal 3 valandas trunkantį neutralaus raudonojo dažo susigėrimą (NRU) į ląsteles nustatomas ląstelių gyvybingumas. Santykinis ląstelių gyvybingumas, išreiškiamas neigiamų kontrolinių mėginių (nepaveiktų nei chemine medžiaga, nei šviesa) procentais, apskaičiuojamas kiekvienai iš 8 tiriamosios medžiagos koncentracijų. Numatant medžiagos fototoksinį aktyvumą, lyginami atsakai į skirtingas medžiagos, apšvitintos ultravioletinės šviesos spinduliuote arba laikytos tamsoje, koncentracijas, kai lygis paprastai būna EB50, t. y. tokios koncentracijos, kuri slopina ląstelių gyvybingumą 50 % tiriamąja medžiaga nepaveiktuose kontroliniuose mėginiuose.1.6. Kokybės kriterijaiLąstelių jautrumas UVA; ankstesnių tyrimų duomenys: ląstelių jautrumas ultravioletinės šviesos spinduliuotei turėtų būti tikrinamas reguliariai. Ląstelės pasėjamos tokiu pat tankiu, kaip ir atliekant 3T3 NRU fototoksiškumą in vitro, kitą dieną lastelės apšvitinamos UVA (1-9 J/cm2) dozėmis, o dar kitą dieną ląstelių gyvybingumas nustatomas, atliekant neutralaus raudonojo dažo susigėrimo į ląsteles (NRU) tyrimą. Ląstelės laikomos atitinkančiomis kokybės kriterijus, jei jų gyvybingumas po apšvitos 5 J/cm2 UVA spinduliuotės doze sudaro ne mažiau kaip 80 % tamsoje laikytų kontrolinių ląstelių gyvybingumo. Esant didžiausios apšvitos UVA dozei (9 J/cm2), ląstelių gyvybingumas turėtų sudaryti ne mažiau kaip 50 % tamsoje laikytų kontrolinių ląstelių gyvybingumo. Šis tikrinimas turėtų būti daromas atliekant kas dešimtą ląstelių persėjimą.Neigiamų kontrolinių mėginių ląstelių jautrumas UVA: šis tyrimas laikomas atitinkančiu kokybės kriterijus, jei neigiamų kontrolinių ląstelių (laikomų Earlo subalansuotame druskų tirpale (EBSS), kuriame yra arba nėra 1 % dimetilsulfoksido (DMSO) ar 1 % etiletanolio (EtOH), atliekant + UVA tyrimą gyvybingumas sudaro ne mažiau kaip 80 % neapšvitintų ląstelių, laikytų tame pačiame tirpale tamsoje (- UVA), gyvybingumo.Neigiamų kontrolinių mėginių ląstelių gyvybingumas: absoliutus optinis tankis (OT540 NRU), išmatuotas NR neigiamų kontrolinių mėginių ląstelių ekstrakte, parodo, ar 1 × 104 ląstelių, pasėtų į vienos mikrotitravimo plokštelės duobutę, skaičius padaugėjo, dukart pailginus tyrimo trukmę. Tyrimas laikomas priimtinu, jei kontrolinių mėginių, nepaveiktų chemine medžiaga, optinio tankio (OT540 NRU) vidurkis yra 3 0,2.Teigiami kontroliniai mėginiai: atliekant kiekvieną 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, tiriamas ir žinomos cheminės medžiagos fototoksinis aktyvumas. Kadangi pagal Europos Sąjungos ir COLIPA bendrą projektą atliekant tyrimo patvirtinimą chlorpromazinas buvo naudojamas kaip teigiama kontrolinė medžiaga, todėl rekomenduojama jį naudoti. Atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, naudojamas chlorpromazinas arba kai pagal standartinį protokolą buvo nustatyti tokie tyrimo priimtinumo kriterijai, kai (+ UVA) bandymo metu chlorpromazino EB50 siekė 0,1-2,0 μg/ml, o (– UVA) bandymo metu — chlorpromazino koncentracija siekė nuo 7,0 iki 90,0 μg/ml. Fotodirginimo veiksnys, t. y. EB50 pokytis, turėtų būti ne mažesnis negu 6.Vietoj chlorpromazino kaip gretutinės teigiamos kontrolinės medžiagos gali būti naudojamos kitos žinomos cheminės medžiagos, pasižyminčios fototoksiniu aktyvumu, bei atitinkančios tiriamos medžiagos klasę ir pasižyminčios tokiomis pat tirpumo savybėmis. Tuo atveju, kaip rodo ankstesnių tyrimų duomenys, kaip tyrimo priimtinumo kriterijus reikėtų tinkamai nustatyti EB50 dydžių intervalus/skalę, fotosudirginimo veiksnį ir vidutinį fotoefektą.1.7. Tyrimo metodo aprašymas1.7.1. Preparatai1.7.1.1. LąstelėsAtliekant tyrimo patvirtinimą, buvo panaudota pelių fibroblastų ląstelių permanentinė linija Balb/c 3T3 (klonas 31), gauta arba iš ATCC, arba iš ECACC, todėl siūloma ją naudoti. Atliekant tyrimą pagal tą pačią metodiką, galima sėkmingai panaudoti kitas ląsteles ar ląstelių linijas, jei jų kultivavimo sąlygos yra pritaikytos specifiniams ląstelių poreikiams, tačiau reikia, kad jos būtų lygiavertės.Reikia nuolat tikrinti, ar ląstelės neužkrėstos mikoplazmomis, ir tik tada, kai tokio patikrinimo rezultatai yra tinkami, ląsteles galima tirti.Juo daugiau ląstelės bus persėjamos, tuo ląstelių jautrumas UVA spinduliuotei gali padidėti, todėl turi būti tiriamos paties mažiausio persėjimo (mažesnio nei 100) Balb/c 3T3 linijos ląstelės. Svarbu patikrinti Balb/c 3T3 linijos ląstelių jautrumą UVA spinduliuotei pagal šioje rekomendacijoje pateiktą kokybės kontrolės procedūrą.1.7.1.2. Terpė ir kultivavimo sąlygosAtliekant įprastinį ląstelių persėjimą bei tyrimo procedūras, reikia naudoti atitinkamą terpę bei paisyti kultivavimo sąlygų. Balb/c 3T3 linijos ląstelės kultivuojamos DMEM terpėje, papildytoje 10 % naujagimių veršelių serumu, 4 mM glutaminu, penicilinu bei streptomicinu drėgnoje atmosferoje, kai aplinkos temperatūra siekia 37 °C, o CO2 kiekis - 7,5 %. Ypač svarbu, kad ląstelių kultivavimo sąlygos užtikrintų tyrimui naudojamų ląstelių ar jų linijų gyvavimo laikotarpiu ląstelinį ciklą.1.7.1.3. Kultūrų paruošimasLąstelės, paimtos iš užšaldytų kamieninių kultūrų, reikiamu tankumu pasėjamos į kultivavimo terpę ir prieš jas panaudojant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrime bent kartą yra persėjamos in vitro.Ląstelės, kurios bus naudojamos fototoksiškumo tyrimui, pasėjamos į kultivavimo terpę tokiu tankiu, kad atskiros ląstelių kolonijos nesusilietų kultivavimo pabaigoje, t. y. tada, kai praėjus 48 valandoms nuo ląstelių pasėjimo yra įvertinamas jų gyvybingumas. Balb/c 3T3 linijos ląstelėms, auginamoms 96 duobučių mikrotitravimo plokštelėje, rekomenduojamas ląstelių tankis vienoje duobutėje yra 1 × 104.Tiriant kiekvieną cheminę medžiagą, ląstelės vienodai pasėjamos į dvi atskiras 96 duobučių mikrotitravimo plokšteles, kurios viso tyrimo metu yra kultivuojamos vienodomis sąlygomis, išskyrus tą laikotarpį, kai ląstelės, kultivuojamos vienoje plokštelėje, apšvitinamos UVA/matomos šviesos spinduliuote, o kitoje plokštelėje — laikomos tamsoje.1.7.1.4. Metabolinė aktyvacijaNors iki šiol vis dar reikalaujama, atliekant tyrimus, kad būtų įvertintas tiriamų medžiagų genotoksinis bei karcinogeninis aktyvumai, naudoti metabolines sistemas, tačiau kai atliekami fototoksikologiniai tyrimai, nėra žinoma jokia cheminė medžiaga, kurią reikėtų transformuoti metaboliniu būdu, kad ji veiktų kaip fototoksinas tiek in vivo, tiek in vitro. Dėl šios priežasties laikomasi nuostatos, kad šiam tyrimui metabolinės aktyvacijos sistema nėra nei būtina, nei moksliškai pateisinama.1.7.1.5. Tiriamoji cheminė medžiaga/preparatasPrieš pat pradedant tyrimą tiriamosios cheminės medžiagos turi būti iš naujo paruošiamos, nebent jų stabilumo tyrimai rodo, kad laikomos jos nepakito. Jei medžiagos gali pradėti greitai irti, apšvietus jas šviesa, gali prireikti jas ruošti raudonoje šviesoje.Tiriamosios cheminės medžiagos turi būti ištirpinamos buferiniuose druskų tirpaluose — Earlo subalansuotame druskų tirpale (EBSS) arba buferiniame fosfatinių druskų tirpale (PBS), kuriuose turi nebūti nei baltymų, nei absorbuojančių šviesą pH indikatorinių spalvų, nes priešingu atveju apšvitos metu nebus išvengta tyrimo klaidų.Tiriamosios cheminės medžiagos, ribotai tirpstančios vandenyje, turi būti maksimaliai (iki 100 %) ištirpinamos atitinkamuose tirpikliuose, kad būtų gauta pageidaujama jų koncentracija ir tada jas būtų galima praskiesti buferiniais druskų tirpalais santykiu 1: 100. Jei naudojamas tirpiklis, visose kultūrose, t. y. neigiamuose kontroliniuose mėginiuose ir visose tiriamosios medžiagos koncentracijose, jo tūris turi būti pastovus - 1 % (v/v).Rekomenduojami tirpikliai yra dimetilsulfoksidas (DMSO) ir etanolis (EtOH). Galima naudoti ir kitus nelabai didelio citotoksiškumo tirpiklius (pvz., acetoną), tačiau prieš naudojimą reikia detaliai ištirti jų specifines savybes, pvz., jų sąveiką su chemine medžiaga, fototoksinio efekto slopinimą bei laisvųjų radikalų surišimą.Jei reikia, tirpumą galima padidinti suplakant ir (ar) suardant ultragarsu ir (ar) kaitinant iki 37 °C temperatūros.1.7.1.6. Apšvita ultravioletiniais spinduliais/parengimasŠviesos šaltinis: tinkamas šviesos šaltinis bei šviesos filtras yra svarbiausi veiksniai, apsprendžiantys fototoksiškumo tyrimą. UVA bei matomos šviesos spinduliuotės bangos ilgio spektrai dažniausiai yra susiję su fotodirginimu tuo tarpu UVB spinduliuotė nėra tokia svarbi ir pasižymi dideliu tiesioginiu citotoksiškumu — bangos ilgio spektrui esant tarp 313 ir 280 nm, UVB citotoksiškumas padidėja net 1000 kartų (11). Parenkant tinkamą šviesos šaltinį, vadovaujamasi tokiais kriterijais, pagal kuriuos kurie reikalaujama, kad pasirinktu laiko tarpu, panaudojus žinomus fotodirgintojus, būtų galima užregistruoti šviesos šaltinio spinduliuotės, kurią absorbuoja tiriamoji cheminė medžiaga, bangos ilgius ir dozę. Be to, bangos ilgiai ir dozė, įskaitant ir šilumos (infraraudonojo bangos ilgio spektre) emisiją, neturi turėti pernelyg neigiamos įtakos tiriamajai sistemai.Manoma, kad saulės šviesą imituojantys prietaisai yra optimaliausias šviesos šaltinis. Juose naudojami tiek ksenoniniai, tiek gyvsidabriu padengti kaitinamieji lankai. Pastarieji pranašesni tuo, kad yra pigesni ir mažiau išspinduliuoja šilumos, tačiau jų išspinduliuojamoji šviesa, artima saulės šviesai, nėra patenkinama. Visi prietaisai, mėgdžiojantys saulės šviesą, išspinduliuoja pakankamai didelius UVB spinduliuotės kiekius, todėl reikia tinkamai filtruoti jų išspinduliuojamą šviesą, kad didelis UVB spinduliuotės citotoksiškumas būtų susilpnintas.Atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, reikia naudoti apšvitos spektrą, neturintį UVB ilgio bangų (UVA/UVB santykis turi būti lygus 1:20). Atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, buvo paskelbti duomenys apie saulės šviesą mėgdžiojančio prietaiso išspinduliuojamos šviesos bangų spektro pasiskirstymą (3).Dozimetrija: prieš kiekvieną fototoksiškumo tyrimą naudojant tinkamą plačiabangį ultravioletinės spinduliuotės registravimo prietaisą, visuomet turi būti pastoviai tikrinamas spinduliuotės intensyvumas. Šis matavimo prietaisas turi būti kalibruojamas šviesos šaltinio atžvilgiu. Ultravioletinės spinduliuotės registravimo prietaisą reikia tikrinti, naudojant kitą standartinį prietaisą, skirtą ultravioletinei spinduliuotei registruoti bei priklausantį tam pačiam tipui ir šviesos šaltinio atžvilgiu kalibruotą tokiu pat būdu. Idealiausia būtų tai, kad šviesos šaltinio išspinduliuotų ir praėjusių pro filtrą bangų spektras bei plačiabangis prietaisas, kalibruotas šviesos šaltinio atžvilgiu ir skirtas ultravioletinei spinduliuotei registruoti būtų atitinkamai išmatuotas bei patikrintas spektriniu radiometru, tačiau su šiuo prietaisu turi dirbti parengti kvalifikuoti asmenys.Atliekant tyrimo patvirtinimą, buvo nustatyta, kad UVA spinduliuotės intensyvumo dozė (5 J/cm2) nėra citotoksiška Balb/c 3T3 linijos ląstelių atžvilgiu bei pakankama, kad cheminės medžiagos, pasižyminčios mažu citotoksiniu aktyvumu, būtų sužadinamos. Kad 5 J/cm2 dozė būtų pasiekta per 50 minučių, spinduliuotės intensyvumas turi siekti 1,666 mW/cm2. Jei naudojama kita ląstelių linija ar kitas šviesos šaltinis, UVA spindulių dozė, kurią išspinduliuoja kitu būdu kalibruotas prietaisas, taikomi kriterijai, kurie neturi neigiamos įtakos ląstelėms ir yra pakankami, kad būtų galima užregistruoti standartinius fototoksinius efektus. Šviesos spinduliuotės trukmė apskaičiuojama pagal tokią formulę:+++++ TIFF +++++1.7.2. Tyrimo sąlygosTiriamosios cheminės medžiagos maksimali koncentracija neturi viršyti 100 μg/ml, kadangi visos cheminės fototoksinės medžiagos nustatomos, kai jų koncentracija yra nedidelė, tuo tarpu koncentracijai didėjant, daugėja teigiamų klaidingų rezultatų (13). Kai tiriamosios cheminės medžiagos koncentracija yra maksimali, jos pH turi atitikti pageidaujamą intervalą (6,5-7,8).Tiriamosios cheminės medžiagos, apšvitintos UVA spinduliuote arba laikomos tamsoje, koncentracijos ribos turi būti tinkamai nustatomos per ankstesnius vykdytus ribų paieškos tyrimus. Koncentracijų serijų riba ir jų skiriamoji riba turi būti taip nustatomos, kad eksperimentiniai duomenys atitiktų atsakus į skirtingas tiriamosios medžiagos koncentracijas. Tam tikslui naudojamos geometrinės koncentracijų serijos (kartu su pastovaus praskiedimo veiksniu).1.7.3. Tyrimo procedūra [1]1.7.3.1. Pirmoji dienaLąstelių suspensija paruošiama terpėje, skirtoje ląstelėms kultivuoti (1 × 105 ląstelių/ml), ir po 100 μl terpės išpilstoma į 96 duobučių mikrotitravimo plokštelės periferines duobutes (vadinamąsias "tuščiąsias" duobutes). Į likusias duobutes išpilstoma po 100 μl paruoštos ląstelių suspensijos (105 ląstelių/ml arba 1 × 104 ląstelių/duobutėje). Kiekvienai tiriamajai cheminei medžiagai paruošiamos 2 mikrotitravimo plokštelės, kurių viena bus apšvitinama UVA spinduliuote ir skirta fotocitotoksiškumo įvertinimui, tuo tarpu kai kita bus laikoma tamsoje ir skirta citotoksiškumui nustatyti.Ląstelės inkubuojamos 24 valandas (atmosferoje, turinčioje 7,5 % CO2, esant 37 °C temperatūrai), kol susidaro pusiau susiliejantis ląstelių monosluoksnis. Šios inkubacijos metu ląstelių gyvybinis ciklas atsigauna, jos prilimpa prie substrato, ir prasideda eksponentinis ląstelių populiacijos didėjimas.1.7.3.2. Antroji dienaPo inkubacijos terpė nupilama nuo ląstelių ir jos du kartus plaunamos įpilant į kiekvieną duobutę po 150 μl EBSS/PBS tirpalo. Po plovimo į kiekvieną duobutę įpilama po 100 μl EBSS/PBS tirpalo, turinčio atitinkamos koncentracijos tiriamosios cheminės medžiagos ar tirpiklio (neigiamosios kontrolės). Tyrimui naudojamos 8 skirtingos tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijos. Ląstelės su tiriamąja chemine medžiaga inkubuojamos tamsoje 1 valandą (atmosferoje, turinčioje 7,5 % CO2, 37 °C).Atliekant fototoksiškumo tyrimą, ląstelės 50 minučių kambario temperatūroje 1,7 mW/cm2 intensyvumo UVA spinduliuote (5 J/cm2) švitinamos per 96 duobučių mikrotitravimo plokštelės dangtelį. Paskui plokštelė džiovinama džiovintuvu, kad po jos dangteliu nesikondensuotų vandens lašeliai. Plokštelės, kurios bus panaudotos citototoksiškumui tirti, 50 minučių laikomos tamsioje dėžėje kambario temperatūroje (laikymo sąlygos, adekvačios plokštelės, naudojamos fototoksiškumo tyrimams, sąlygoms).Tiriamasis tirpalas nupilamas, o ląstelės du kartus plaunamos, įpilant į kiekvieną duobutę po 150 μl EBSS/PBS tirpalo. Vėliau šis tirpalas pakeičiamas terpe, skirta ląstelėms kultivuoti ir plokštelė per naktį inkubuojama atmosferoje, turinčioje 7,5 % CO2, esant 37 °C temperatūrai.1.7.3.3. Trečioji dienaMikroskopinis tyrimasLąstelės analizuojamos faziniu-kontrastiniu mikroskopu. Registruojami morfologiniai ląstelių pokyčiai, atsiradę dėl tiriamosios cheminės medžiagos sukeltų citotoksnių efektų. Šis patikrinimas rekomenduojamas tam, kad būtų išvengta klaidų eksperimento metu, tačiau, tiriant citotoksiškumą ar fototoksiškumą, šie užrašai nėra naudojami.Neutralaus raudonojo (NR) dažo susigėrimo tyrimasLąstelės praplaunamos su 150 μl pašildytu EBSS/PBS tirpalu, vėliau jis atsargiai nusiurbiamas automatine mikropipete. Į kiekvieną duobutę pilama 100 μl NR terpės ir inkubuojama 3 valandas atmosferoje, turinčioje 7,5 % CO2, esant 37 °C temperatūrai.Po inkubacijos NR terpė nupilama, o ląstelės praplaunamos į kiekvieną duobutę įpilant po 150 μl EBSS/PBS tirpalo. Praplovimui skirtas tirpalas nupilamas ir plokštelė visiškai išdžiovinama, centrifuguojant ją apgręžiamuoju būdu.Vėliau į kiekvieną duobutę įpilama po 150 μl NR absorbcinio tirpalo (šviežiai paruošto etilo alkoholio ir acto rūgšties tirpalo).Plokštelė 10 minučių greitai kratoma ant kratytuvo tol, kol NR visiškai difunduoja iš ląstelių ir susidaro homogeniškas tirpalas.NR tirpalo optinis tankis matuojamas spektrofotometru (bangos ilgiui siekiant 540 nm), o duobutės, pripildytos tik terpės, naudojamos kontrolei. Gauti duomenys yra saugomi atitinkamo formato laikmenoje (pvz., ASCII) tam, kad vėliau būtų galima juos analizuoti.2. DUOMENYS2.1. Duomenų kokybė ir kiekybėRemiantis duomenimis turi būti įmanoma atlikti svarbią atsako, gauto UVA (+) ir UVA (–) eksperimentų metu bei priklausomo nuo koncentracijos, analizę. Jei nustatomas citotoksiškumas, tai tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijos intervalas ir atskirų jos koncentracijų susikirtimo taškai pateikiami taip, kad eksperimentiniai duomenys atitiktų kreivę. Dėl to, kad tamsoje laikoma tiriamoji cheminė medžiaga gali būti necitotoksiška iki apibrėžtos koncentracijos (100 μg/ml), bet ypač citotoksiška tada, kai apšvitinama UVA spinduliuote, per abu eksperimento etapus turi būti tiriamas koncentracijos intervalas, šiuo tikslu gali prireikti nubrėžti aiškią skiriamąją ribą tarp atskirų koncentracijos dydžių, kad būtų paisoma adekvačių duomenų kokybei taikomo reikalavimo. Jei abiejų eksperimento etapų (medžiagą švitinant spinduliais arba laikant ją tamsoje) citotoksiškumas nenustatomas, tai užtenka nustatyti skiriamąją ribą tarp atskirų dozių iki pačios didžiausios medžiagos koncentracijos.Nėra reikalaujama pakartoti eksperimentą tam, kad būtų patvirtintas akivaizdus teigiamas rezultatas. Be to nereikia patvirtinti akivaizdžiai neigiamų rezultatų, gaunamų tiriant cheminę medžiagą, kurios koncentracija yra pakankamai didelė. Tokiais atvejais užtenka atlikti vieną pagrindinį eksperimentą ir vieną ar keletą papildomų eksperimentų, kurių metu preliminariai nustatomi koncentracijų intervalai.Tyrimai kartojami, jei taikant spėjimų modelį gaunami labai arti galutinės ribos esantys tarpiniai rezultatai.Jei prireikia atlikti pakartotinį tyrimą, keičiamos eksperimento sąlygos, kurios gali turėti didelės reikšmės, kai norima gauti pageidaujamą rezultatą. Pagrindinė šio tyrimo procedūra — tiriamosios cheminės medžiagos tirpalų paruošimas. Todėl eksperimento sąlygų pakeitimai (papildomas tirpiklis, medžiagos suardymas, sutrinant ją arba veikiant ultragarsu) gali turėti reikšmės kartojant eksperimentą. Priešingu atveju reikia pakeisti inkubacijos prieš apšvitinimą trukmę. Trumpesnė inkubacija svarbi greitai vandenyje suyrančioms cheminėms medžiagoms.2.2. Rezultatų apdorojimasJei yra įmanoma, tai nustatoma tiriamosios medžiagos koncentracija, kuriai esant, ląstelinis NRU inhibuojamas 50 % (EB50). Tai padaroma, tyrimo metu gautus atsako į skirtingas koncentracijas duomenis apdorojant nelinijinės regresijos (pirmiausia — Hill funkcijos arba atitinkamos logistinės regresijos) arba kitomis atitikties procedūromis (14). Prieš panaudojant EB50 tolesniems apskaičiavimams, būtina atitinkamai patikrinti atitikimo kokybę. EB50 gali būti apskaičiuojamas ir grafiniais duomenų atitikties metodais. Šiuo atveju rekomenduojama nubraižyti tikimybės grafiką (x ašis — log; y ašis — tikimybės vienetas arba probitas), kadangi atlikus šią transformaciją, atsako į įvairias koncentracijas funkcija taps linijinė.2.3. Rezultatų įvertinimas (spėjimų modeliai)2.3.1. Spėjimo modelio 1 variantas: fotodirglumo veiksnys (FDV)Atliekant apšvitos UVA (+) ir UVA (–) eksperimentus gaunamos atsako į skirtingas tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijas kreivės, o FDV apskaičiuojamas pagal tokią formulę:+++++ TIFF +++++Jei FDV < 5, tai medžiaga nėra fototoksiška, tuo tarpu jei FDV ≥ 5, medžiaga yra fototoksiška.Jei cheminė medžiaga, tik apšvitinta ultravioletine spinduliuote pasirodo esanti citotoksiška, o laikyta tamsoje — necitotoksiška, tai tokiu atveju neįmanoma apskaičiuoti fotodirglumo veiksnio. Tokiais atvejais, kai atliekamas citotoksiškumo tyrimas, tiriamąją cheminę medžiagą laikant tamsoje, ir nustatomas fotodirglumo veiksnys "> FDV", tai šio veiksnio vertė apskaičiuojama pagal didžiausią tiriamosios medžiagos koncentraciją (Cmax):+++++ TIFF +++++Jei įmanoma apskaičiuoti "> FDV" vertę, tai, paėmus bet kokią šio veiksnio reikšmę, didesnę nei 1, bus galima spėti apie fototoksiškumą būdingą medžiagai.Jei cheminė medžiaga, būdama pačios didžiausios koncentracijos, nepasižymi citotoksiškumu, ir dėl to, kai ji laikoma tamsoje arba apšvitinama ultravioletine spinduliuote, abiem atvejais negalima apskaičiuoti EB50, tai šitai rodo, kad medžiaga nėra fototoksiška. Tokiais atvejais pažymima, kad išmatuotas fotodirglumo veiksnys lygus 1.+++++ TIFF +++++Jei galima gauti tik FDV, lygų 1, tai rodo, jog medžiaga nėra fototoksiška.Kai b ir c atvejais bandoma nustatyti medžiagos fototoksiškumą, reikia ypač atkreipti dėmesį į tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijas, gautas tiriant 3T3 NRU fototoksiškumą in vitro.2.3.2. Spėjimų modelio 2 variantas: vidutinis fotoefektas (VFE)Bandant nustatyti medžiagos fototoksiškumą, galima taikyti ir kitą spėjimų modelio variantą, kuris buvo sukurtas, kai Europos Sąjunga ir COLIPA atliko tyrimo patvirtinimą15 ir vėliau ištyrė cheminių medžiagų, apšvitintų filtruota ultravioletine spinduliuote, fototoksiškumą in vitro, esant "nulinėms sąlygoms" (13). Taikant šį modelį išvengiama fotodirglumo veiksnio modelio apribojimų tais atvejais, kai EB50 neįmanoma apskaičiuoti. Šis modelis remiasi vidutiniu fotoefektu (VFE) — parametru, kuris remiasi absoliučių atsakų į skirtingas tiriamosios medžiagos koncentracijas kreivių lyginimu. Tam, kad VFE modelis būtų pritaikytas, Berlyno Humboldtų universitete buvo sukurta nemokamai įsigyjama speciali kompiuterių programa.2.4. Rezultatų aiškinimasTeigiamas rezultatas, gautas tiriant 3T3 NRU fotoksiškumą in vitro (FDV ≥ 5; VFE ≥ 0,1), rodo, kad tiriamoji cheminė medžiaga yra fototoksiška. Jei šis rezultatas buvo gautas, kai tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijos buvo mažesnės nei 10 μg/ml, tai rodo, kad ši medžiaga gali įgyti fototoksinį aktyvumą, esant įvairioms apšvitinimo sąlygoms in vivo. Jei teigiamas rezultatas gaunamas tada, kai didžiausia tiriamosios cheminės medžiagos koncentracija siekia 100 μg/ml, tai vėliau būtina įvertinti tos medžiagos keliamą žalą arba fototoksinį aktyvumą. Šitai galima atlikti, tiriant cheminės medžiagos įsiskverbimą bei kaupimąsi odos audinyje arba cheminę medžiagą tiriant kitu metodu, patvirtinančiu medžiagos fototoksiškumą (pvz., panaudojant modelinę žmogaus odos sistemą).Neigiamas rezultatas, gautas tiriant 3T3 NRU fototoksiškumą in vitro (FDV < 5 arba VFE < 0,1), rodo, kad tiriamoji cheminė medžiaga nėra fototoksiška žinduolių ląstelėms, kurios buvo kultivuojamos, esant nustatytomis sąlygomis. Tais atvejais, kai tiriamosios cheminės medžiagos didžiausia koncentracija siekė 100 μg/ml, neigiamas rezultatas rodo, kad tiriamoji cheminė medžiaga nėra fototoksiška in vitro, ir neatrodo, kad ji tokia taps in vivo. Tais atvejais, kai naudojant mažesnes tiriamosios medžiagos koncentracijas, buvo gauti identiški atsakai į fototoksinės medžiagos, apšvitintos ultravioletine spinduliuote bei laikytos tamsoje, skirtingas koncentracijas, tai gauti rezultatai bus vienodai aiškinami. Tačiau tuo atveju, jei nebus nustatytas medžiagos fototoksiškumas apšvitinus ją ultravioletine spinduliuote arba laikant tamsoje ir jei tiriamosios medžiagos koncentracijos, kurias apriboja jos tirpumas vandenyje, bus mažesnės nei 100 μg/ml, bus galima suabejoti metodu, kuriuo tiriama ši cheminė medžiaga, ir reikės atlikti tyrimo patvirtinimą (odos audinio modelinė sistema in vitro ar ex vivo arba tyrimas in vitro).3. ATASKAITATyrimo ataskaitaTyrimo ataskaitoje pateikiama tokia informacija:Tiriamoji cheminė medžiaga:- identifikacijos duomenys bei CAS numeris, jeigu jis žinomas,- fizinė prigimtis ir grynumas,- tyrimui svarbios fizikinės ir cheminės savybės,- stabilumas ir fotostabilumas, jei jis žinomas.Tirpiklis:- tirpiklio pasirinkimo pagrindimas,- tiriamosios cheminės medžiagos tirpumas šiame tirpiklyje,- tirpiklio kiekis terpėje (EBSS arba PBS), kuria paveikiama cheminė medžiaga.Ląstelės:- ląstelių tipas ir šaltinis,- ar ląstelėse neaptikta mikoplazmų,- ląstelių persėjimų skaičius, jei jis žinomas,- ląstelių jautrumas ultravioletinei spinduliuotei, nustatytas 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo metu, panaudojant apšvitinančius prietaisus, in vitro.Tyrimo sąlygos a) — inkubacija prieš poveikį ir po jo:- terpės, skirtos kultivavimui, tipas ir sudėtis,- inkubacijos sąlygos (CO2 koncentracija, temperatūra, drėgmė),- inkubacijos trukmė (prieš poveikį ir po jo).Tyrimo sąlygos b) — paveikimas tiriamąja chemine medžiaga:- pagrindimas, kodėl pasirinkta tokia apšvitinamos ultravioletine spinduliuote ir laikomos tamsoje tiriamosios cheminės medžiagos koncentracija,- pagrindimas, kodėl tyrimui pasirinkta didžiausia koncentracija, kai tiriamosios cheminės medžiagos tirpumas terpėje yra ribotas ir medžiaga nėra citotoksiška,- terpės, kurioje buvo paveikiamas tyrimo objektas, buferinių druskų tirpalo tipas ir sudėtis,- poveikio tiriamąja chemine medžiaga trukmė.Tyrimo sąlygos c) — spinduliuotė:- pagrindimas, kodėl pasirinktas tyrimo metu naudotas šviesos šaltinis,- šviesos šaltinio išspinduliuojamų bangų spektrinės charakteristikos,- panaudoto šviesos filtro pralaidumo/absorbcijos charakteristikos,- radiometro charakteristikos bei jo kalibravimo duomenys,- atstumas tarp šviesos šaltinio ir tiriamosios sistemos,- apšvitos UVA spinduliais intensyvumas, esant nustatytam atstumui, išreikštas mW/cm2,- apšvitos ultravioletine ir matoma šviesos spinduliuote trukmė,- UVA spinduliuotės dozė, išreikšta J/cm2,- temperatūra, kuriai esant ląstelių kultūros buvo apšvitinamos ir tuo pačiu metu laikytos tamsoje.Tyrimo sąlygos d) — NRU tyrimas:- NR terpės sudėtis,- NR inkubacijos trukmė,- inkubacijos sąlygos (CO2 koncentracija, temperatūra, drėgmė),- NR išskyrimo sąlygos (išskyrimui panaudota medžiaga, trukmė),- šviesos bangos ilgis, panaudotas spektrofotometriniam NR optinio tankio nustatymui,- antrasis standartinis bangos ilgis (etalonas), jei toks buvo panaudotas,- nulinė spektrofotometro padėtis, jeigu buvo panaudotas.Rezultatai:- ląstelių gyvybingumas, nustatytas kiekvienai tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijai ir išreikštas kontroliniuose mėginiuose esančių ląstelių vidutinio gyvybingumo procentais,- atsakų į skirtingas tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijas kreivės (tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijos ir santykinio ląstelių gyvybingumo santykis), nustatytos vienu metu atlikus medžiagos UVA (+) ir UVA (-) fototoksiškumo tyrimus,- atsakų į skirtingas tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijas kreivėje pateiktų duomenų analizė; jei įmanoma, tai apskaičiuojamas medžiagos EB50, UVA (+) ir EB50 UVA (-),- dviejų atsakų į medžiagos koncentracijas kreivių, gautų, nesant apšvitos UVA ir matomos šviesos spinduliuote, palyginimas arba apskaičiuojant fotodirglumo faktorių (FDF) arba vidutinį fotoefektą (VFE),- fototoksinio aktyvumo klasifikacija,- tyrimo priimtinumo kriterijai a) — gretutiniai neigiami kontroliniai mėginiai:- absoliutus ląstelių, apšvitintų ir neapšvitintų UVA spinduliais, gyvybingumas (NR ekstrakto optinis tankis),- anksčiau atliktų tyrimų metu gauti duomenys apie naudotus neigiamus kontrolinius mėginius, jų vidurkis ir standartinis nukrypimas.- tyrimo priimtinumo kriterijai b) — gretutiniai teigiami kontroliniai mėginiai:- teigiamame kontroliniame mėginyje esančios cheminės medžiagos, apšvitintos UVA spinduliuote (UVA (+)) bei laikytos tamsoje (UVA (-)), EB50 bei FDV,- anksčiau atliktų tyrimų duomenys apie teigiamuose kontroliniuose mėginiuose esančias chemines medžiagas; EB50 UVA (+) ir EB50 UVA (-), vidutinį FDV bei jo standartinį nukrypimą.Rezultatų aptarimas.Išvados.4. NUORODOS1) Spielman, H., Balls, M, Döring, B., Holzhütter, H. G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Moldenauer, F., Moore, L., Pape, W., Phannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W. and Willshaw, A. (1994), EEB/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, p. 793-796.2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, p. 7-8.3) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J., Pechovitch, G., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W. and Brantom, P. (1998), ES/COLIPA "In vitro phototoxicity" validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, p. 305-327.4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods. OECD Publications Office, Paris, 1996.5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology In Vitro 7, p. 95-102.6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3, Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, p. XI–XXXV.7) Spielmann, H., Lovell, W. W., Hölzle, E., Johnson, B. E., Maurer, T., Miranda, M. A., Pape, W. J. W., Sapora, O. and Sladowski, D. (1994). In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, p. 314-348.8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization. The science of photobiology, edited by K. C. Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, p. 79-110.9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, p. 119-124.10) Lambert, L. A., Warner W. G. and Kornhauser, A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, p. 515-530.11) Tyrrell R. M. and Pidoux M. (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, p. 1825-1829.12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure Balb/c 3T3 NRU Photoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the ES/COLIPA project "In Vitro Photoirritation".13) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, p. 679-708.14) Holzhütter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical Modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, p. 127-138.15) Holzhütter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, p. 445-462.""Priedėlis+++++ TIFF +++++"[1] Papildomi duomenys pateikti 12 nuorodoje.--------------------------------------------------


Svarbus teisinis pranešimas

|

32004L0042

2004 m. balandžio 21 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2004/42/EB dėl lakiųjų organinių junginių, susidarančių naudojant organinius tirpiklius tam tikruose dažuose, lakuose ir transporto priemonių pakartotinės apdailos produktuose, išmetamų kiekių ribojimo ir iš dalies keičianti Direktyvą 1999/13/EB

Oficialusis leidinys L 143 , 30/04/2004 p. 0087 - 0096 CS.ES skyrius 15 tomas 08 p. 376  - 385 ET.ES skyrius 15 tomas 08 p. 376  - 385 HU.ES skyrius 15 tomas 08 p. 376  - 385 LT.ES skyrius 15 tomas 08 p. 376  - 385 LV.ES skyrius 15 tomas 08 p. 376  - 385 MT.ES skyrius 15 tomas 08 p. 376  - 385 PL.ES skyrius 15 tomas 08 p. 376  - 385 SK.ES skyrius 15 tomas 08 p. 376  - 385 SL.ES skyrius 15 tomas 08 p. 376  - 385

		Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2004/42/EB2004 m. balandžio 21 d.dėl lakiųjų organinių junginių, susidarančių naudojant organinius tirpiklius tam tikruose dažuose, lakuose ir transporto priemonių pakartotinės apdailos produktuose, išmetamų kiekių ribojimo ir iš dalies keičianti Direktyvą 1999/13/EBEuropos Parlamentas ir Europos Sąjungos Taryba,atsižvelgdami į Europos bendrijos steigimo sutartį, ypač į jos 95 straipsnį,atsižvelgdami į Komisijos pasiūlymą,atsižvelgdami į Europos ekonomikos ir socialinių reikalų komiteto nuomonę [1],Sutarties 251 straipsnyje nustatyta tvarka [2],kadangi:(1) 2001 m. spalio 23 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2001/81/EB dėl tam tikrų atmosferos teršalų išmetimo nacionalinių ribų [3] nustato tam tikrų teršalų, įskaitant lakiuosius organinius junginius (toliau – LOJ), išmetimo nacionalines ribas, kurių pagal Bendrijos integruotąją kovos su rūgštėjimu ir ozonu atmosferos pažemio sluoksnyje strategiją turi būti laikomasi nuo 2010 m., tačiau nenustato tų teršalų išmetimo iš konkrečių šaltinių ribinių verčių.(2) Siekdamos laikytis LOJ išmetimo nacionalinių ribų, valstybės narės turi reguliuoti keletą skirtingų šių teršalų išmetimo šaltinių kategorijų.(3) Ši direktyva papildo nacionalines priemones, skirtas LOJ išmetimo ribų laikymuisi užtikrinti.(4) Nesant Bendrijos nuostatų, valstybių narių teisės aktai, nustatantys LOJ ribines vertes tam tikrų produktų kategorijų sudėtyje, gali skirtis. Dėl šių skirtumų ir tokių teisės aktų nebuvimo kai kuriose valstybėse narėse susidarytų nereikalingos kliūtys prekybai ir būtų iškraipyta konkurencija vidaus rinkoje.(5) Todėl kovai su ozonu atmosferos pažemio sluoksnyje reikia suderinti nacionalinius teisės aktus ir nuostatas, kurie nustato LOJ kiekį šios direktyvos reglamentuojamuose produktuose, kad nebūtų ribojamas laisvas šių produktų judėjimas.(6) Kadangi siūlomos akcijos tikslų, būtent sumažinti išmetamų LOJ kiekį, valstybės narės negali iki galo įgyvendinti, nes vienoje valstybėje narėje išmetami LOJ veikia oro kokybę kitose valstybėse narėse ir todėl dėl siūlomos akcijos masto bei poveikio išmetamų LOJ kiekio mažinimo tikslų geriau siekti Bendrijos lygmeniu, Bendrija gali patvirtinti priemones pagal Sutarties 5 straipsnyje išdėstytą subsidiarumo principą. Laikantis minėtame straipsnyje išdėstyto proporcingumo principo, ši direktyva neviršija būtinųjų priemonių ribų tokiems tikslams pasiekti.(7) Dėl LOJ kiekio, esančio dažuose, lakuose ir transporto priemonių pakartotinės apdailos produktuose, į atmosferą išmetamas didelis kiekis LOJ, kurie prisideda prie troposferos paribio sluoksnyje besiformuojančių vietinių ir tarpvalstybinių fotocheminių oksidantų.(8) Todėl LOJ kiekį dažuose, lakuose ir transporto priemonių pakartotinės apdailos produktuose reikėtų sumažinti tiek, kiek techniškai ir ekonomiškai įmanoma, atsižvelgiant į klimato sąlygas.(9) Aukštas aplinkos apsaugos lygis reikalauja nustatyti ir įgyvendinti LOJ, naudojamų produktų, kuriems taikoma ši direktyva, sudėtyje, ribines vertes.(10) Reikėtų numatyti pereinamąsias priemones produktams, pagamintiems kol įsigalios šios direktyvos reikalavimai.(11) Valstybėms narėms turėtų suteikti atskiras licencijas specialiais tikslais prekiauti ir pirkti griežtai ribotą šia direktyva nustatytų ribinių tirpiklio verčių neatitinkančių produktų kiekį.(12) Ši direktyva papildo Bendrijos nuostatas dėl cheminių medžiagų ir preparatų ženklinimo.(13) Į šios direktyvos taikymo sritį neturi patekti vartotojų ir (arba) dirbančiųjų sveikatos apsauga ir darbo aplinkos apsauga, todėl ši direktyva neturi įtakoti priemonių, kurių valstybės narės imasi šiais tikslais.(14) Sudėties ribinės vertės turi būti kontroliuojamos, kad būtų nustatyta, ar šios direktyvos reglamentuojamuose kiekvienos kategorijos dažuose, lakuose ir transporto priemonių pakartotinės apdailos produktuose esanti LOJ masės koncentracija yra leistinose ribose.(15) Kadangi tam tikrose transporto priemonių pakartotinės apdailos operacijose naudojamuose produktuose esantis LOJ kiekis dabar reglamentuojamas pagal šią direktyvą, 1999 m. kovo 11 d. Tarybos direktyva 1999/13/EB dėl tam tikrų veiklos rūšių ir tam tikrų įrenginių lakiųjų organinių junginių, susidarančių naudojant organinius tirpiklius, emisijos apribojimo [4] turi būti atitinkamai iš dalies pakeista.(16) Nepaisant to, valstybės narės turėtų toliau taikyti arba nustatyti nacionalines priemones, kontroliuojančias transporto priemonių pakartotinės apdailos darbų išmetamus teršalus, įskaitant kelių transporto priemonių arba jų dalių, kaip apibrėžta 1970 m. vasario 6 d. Tarybos direktyvoje 70/156/EEB dėl valstybių narių įstatymų, reglamentuojančių motorinių transporto priemonių ir jų priekabų tipo patvirtinimą, suderinimo [5] padengimą danga, kuris atliekamas kaip transporto priemonės remonto, konservavimo arba apdailos darbų dalis ne jų gamybos įrenginiuose.(17) Ši direktyva neturi būti taikoma produktams, kuriais prekiaujama išskirtinai naudojimui įrenginiuose, leidžiamuose pagal Direktyvą 1999/13/EB, kur išmetamos taršos ribojimo priemonės numato alternatyvius būdus pasiekti bent lygiavertį išmetamo LOJ kiekio sumažinimą.(18) Valstybės narės turi nustatyti taisykles dėl nuobaudų, taikomų už šios direktyvos nuostatų pažeidimus, ir užtikrinti, kad jos būtų įgyvendinamos. Numatytos nuobaudos turi būti veiksmingos, proporcingos ir atgrasančios.(19) Valstybės narės turi teikti Komisijai ataskaitas apie taikant šią direktyvą įgytą patirtį.(20) Dėl LOJ kiekio sumažinimo produktuose, kuriems ši direktyva netaikoma, ir dėl galimybės dar labiau sumažinti jau numatytas LOJ ribines vertes turi būti atlikta analizė.(21) Šiai direktyvai įgyvendinti būtinos priemonės turi būti patvirtintos pagal 1999 m. birželio 28 d. Tarybos sprendimą 1999/468/EB, nustatantį Komisijos naudojimosi jai suteiktais įgyvendinimo įgaliojimais tvarką [6],PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ:1 straipsnisTikslas ir taikymo sritis1. Šios direktyvos tikslas – apriboti bendrą LOJ kiekį tam tikruose dažuose, lakuose ir transporto priemonių pakartotinės apdailos produktuose, kad būtų išvengta ar sumažinta oro tarša dėl LOJ indėlio į troposferos ozono susidarymą.2. Šio straipsnio 1 dalyje nurodytam tikslui pasiekti ši direktyva nustato apytikslius tam tikrų dažų, lakų ir transporto priemonių pakartotinės apdailos produktų techninius aprašus.3. Ši direktyva taikoma I priede išvardytiems produktams.4. Ši direktyva nepažeidžia ir neturi įtakos priemonėms, įskaitant ženklinimo reikalavimus, kurių imtasi nacionaliniu arba Bendrijos lygiu vartotojų ir dirbančiųjų sveikatai ir jų darbo aplinkai apsaugoti.2 straipsnisApibrėžimaiŠioje direktyvoje taikomi tokie apibrėžimai:"Kompetentinga institucija"  tai valdžios institucija ar institucijos arba organizacijos, pagal valstybių narių teisines nuostatas atsakingos už įsipareigojimų, atsirandančių pagal šią direktyvą, vykdymą."Medžiagos"  tai bet kuris kieto, skysto ar dujų pavidalo cheminis elementas ir jo junginiai, natūraliai esantys gamtoje ar gaminami pramonėje."Preparatai"  tai iš dviejų ar daugiau medžiagų sudaryti mišiniai ar tirpalai."Organinis junginys"  tai bet kuris junginys, kuriame yra bent vienas elementas anglies ir vienas ar keli vandenilio, deguonies, sieros, fosforo, silicio, azoto arba halogeno atomai, išskyrus anglies oksidus ir neorganinius karbonatus bei bikarbonatus."Lakusis organinis junginys (LOJ)"  tai bet kuris organinis junginys, kurio pradinė virimo temperatūra išmatuota esant standartiniam101,3 kPa slėgiui yra mažesnė ar lygi 250 °C."LOJ kiekis"  tai lakiųjų organinių junginių masė, išreikšta gramais litre (g/l), paruošto naudoti produkto sudėtyje. Tam tikro produkto lakiųjų organinių junginių masė, kuri džiovinant chemiškai reaguoja, sudarydama dalį dangos, nelaikoma LOJ kiekio dalimi."Organinis tirpiklis"  tai bet kuris LOJ, naudojamas vienas ar drauge su kitais agentais, žaliavoms, produktams ar atliekoms tirpinti ar skiesti arba yra naudojamas kaip valymo agentas, tirpinantis teršalus, arba kaip dispersinė terpė, arba kaip klampumą ar paviršiaus įtemptį koreguojanti medžiaga, arba kaip plastifikatorius ar konservantas."Dengimo medžiaga"  tai bet koks preparatas, įskaitant visus organinius tirpiklius ar preparatus, kuriuose yra organinių tirpiklių, būtinų jo tinkamam naudojimui, naudojamas dekoratyvinę, apsauginę ar kitokią funkcinę paskirtį turinčiai plėvelei paviršiuje sudaryti."Plėvelė"  tai ištisinis sluoksnis, gaunamas padengus pagrindą viena ar keliomis dangomis."Vandenyje tirpios dengimo medžiagos (VDM)"  tai dengimo medžiagos, kurių klampumas koreguojamas naudojant vandenį."Tirpiklinės dengimo medžiagos (TDM)"  tai dengimo medžiagos, kurių klampumas koreguojamas organiniais tirpikliais."Pateikimas į rinką"  tai pateikimas trečiosioms šalims už užmokestį ar be jo. Pagal šią direktyvą įvežimas į Bendrijos muitinės teritoriją laikomas pateikimu į rinką.3 straipsnisReikalavimai1. Valstybės narės užtikrina, kad I priede nurodyti produktai po II priede nurodytų datų būtų pateikiami į rinką jų teritorijoje, tik jei LOJ kiekis juose neviršija II priede nurodytų ribinių verčių ir atitinka 4 straipsnį.Atitikčiai II priede nustatytoms LOJ kiekių ribinėms vertėms įvertinti taikomi III priede nurodyti analizės metodai.I priede nurodytiems produktams, kurie tinka naudoti tik pridėjus tirpiklių ar kitų tirpiklių turinčių komponentų, II priede nurodytos ribinės vertės taikomos LOJ kiekiui, kuris yra paruoštame naudoti produkte.2. Nukrypstant nuo šio straipsnio 1 dalies, valstybės narės netaiko pirmiau nurodytų reikalavimų produktams, parduodamiems išskirtiniam naudojimui užsiimant Direktyvos 1999/13/EB reglamentuojama veikla, vykdoma registruotame ar turinčiame leidimą įrenginyje, kaip nurodyta tos direktyvos 3 ir 4 straipsniuose.3. Pastatams ir senovinėms transporto priemonėms, kurias kompetentingos institucijos patvirtino kaip turinčias ypatingą istorinę ir kultūrinę vertę, restauruoti ir prižiūrėti valstybės narės gali suteikti individualias licencijas parduoti ir pirkti griežtai ribotą kiekį produktų, kurie neatitinka II priede nustatytų LOJ ribinių verčių.4. Į šios direktyvos taikymo sritį patenkantys produktai, kurie yra pagaminti iki II priede nustatytų datų ir neatitinka šio straipsnio 1 dalies reikalavimų, gali būti teikiami į rinką 12 mėnesių laikotarpį po dienos, kurią įsigalioja atitinkamam produktui taikomas reikalavimas.4 straipsnisŽenklinimasValstybės narės užtikrina, kad I priede nurodyti pateikiami į rinką produktai būtų paženklinti. Etiketėje turi būti nurodyta:a) produkto kategorija ir atitinkama LOJ ribinė vertė g/l, kaip nurodyta II priede;b) didžiausias LOJ kiekis paruoštame naudoti produkte g/l.5 straipsnisKompetentinga institucijaValstybės narės paskiria kompetentingą instituciją, atsakingą už šioje direktyvoje nustatytų prievolių vykdymą, ir informuoja apie tai Komisiją ne vėliau kaip iki 2005 m. balandžio 30 d.6 straipsnisMonitoringasValstybės narės parengia monitoringo programą atitikčiai šiai direktyvai tikrinti.7 straipsnisAtaskaitų teikimasValstybės narės praneša monitoringo programos rezultatus ir parodo atitiktį šiai direktyvai bei pagal 3 straipsnio 3 dalį licencijuotų produktų kategorijas ir kiekį. Pirmosios dvi ataskaitos pateikiamos Komisijai, praėjus 18 mėnesių po II priede nustatytų LOJ kiekio ribinių verčių laikymosi pradžios; vėliau ataskaita pateikiama kas penkerius metus. Komisija iš anksto parengia bendrą monitoringo duomenų pateikimo formą 12 straipsnio 2 dalyje nustatyta tvarka. Metiniai duomenys pateikiami Komisijai jos prašymu.8 straipsnisLaisva apyvartaValstybės narės dėl šioje direktyvoje aptariamų priežasčių neturi teisės uždrausti, apriboti ar neleisti pateikti į rinką produktus, kuriems taikoma ši direktyva ir kurie, paruošti naudoti, atitinka šios direktyvos reikalavimus.9 straipsnisPersvarstymasKomisija prašoma pateikti Europos Parlamentui ir Tarybai:1. Ne vėliau kaip 2008 m. ataskaitą apie Direktyvos 2001/81/EB 10 straipsnyje nurodyto persvarstymo rezultatus. Šioje ataskaitoje turi būti nagrinėjama:a) plati taikymo sritis ir galimybės sumažinti LOJ kiekį į šios direktyvos taikymo sritį nepatenkančiuose produktuose, įskaitant dažų ir lakų aerozolius;b) galimas tolesnis (II etapas) LOJ kiekio transporto priemonių pakartotinės apdailos produktuose mažinimas;c) bet koks naujas aspektas, susijęs su II etapo, numatyto dažams ir lakams, taikymo socialiniu ir ekonominiu poveikiu.2. Ne vėliau kaip praėjus 30 mėnesių po II priede nurodytų LOJ kiekio ribinių verčių II etapo įgyvendinimo datos, ataskaitą, kurioje nagrinėjamos 7 straipsnyje nurodytos ataskaitos ir bet kokios dažų, lakų ir transporto priemonių pakartotinės apdailos produktų gamybos technologinės naujovės. Ši ataskaita turi išnagrinėti plačią taikymo sritį ir galimybes dar labiau sumažinti LOJ kiekį šios direktyvos taikymo srities produktuose, įskaitant galimą I priedo 1.1 poskyryje ir II priedo A skyriuje nurodytų d ir e kategorijų vidaus ir išorės darbams skirtų dažų atskyrimą.Kartu su šiomis ataskaitomis, kai taikoma, pateikiami šios direktyvos pakeitimo pasiūlymai.10 straipsnisNuobaudosValstybės narės nustato taisykles dėl nuobaudų, taikomų už nacionalinių nuostatų, priimtų pagal šią direktyvą, pažeidimus ir imasi visų priemonių, būtinų užtikrinti, kad jos būtų įgyvendinamos. Numatytos nuobaudos turi būti veiksmingos, proporcingos ir atgrasančios. Valstybės narės praneša apie šias taisykles ir priemones Komisijai iki 2005 m. spalio 30 d. ir nedelsdamos praneša apie bet kokius vėlesnius su jomis susijusius pakeitimus.11 straipsnisDerinimas su technikos pažangaBet kokius pakeitimus, būtinus suderinti III priedą atsižvelgiant į technikos pažangą, Komisija patvirtina 12 straipsnio 2 dalyje nustatyta tvarka.12 straipsnisKomitetas1. Komisijai padeda Tarybos direktyvos 1999/13/EB 13 straipsniu įsteigtas komitetas (toliau – Komitetas).2. Darant nuorodą į šį straipsnį, taikomi Sprendimo 1999/468/EB 5 ir 7 straipsniai, atsižvelgiant į minėto sprendimo 8 straipsnio nuostatas.Sprendimo 1999/468/EB 5 straipsnio 6 dalyje nustatytas laikotarpis yra trys mėnesiai.3. Komitetas patvirtina savo darbo tvarkos taisykles.13 straipsnisDirektyvos 1999/13/EB pakeitimasDirektyva 1999/13/EB iš dalies pakeičiama taip:1. I priedo skirsnyje "Transporto priemonių pakartotinė apdaila" išbraukiama tokia įtrauka:"— kelių transporto priemonių arba jų dalių, kaip apibrėžta Direktyvoje 70/156/EEB, padengimas danga, kuris atliekamas kaip transporto priemonės remonto, konservavimo arba apdailos darbų dalis ne jų gamybos įrenginiuose, arba".2. Nepaisant šio straipsnio 1 dalies, valstybės narės gali toliau taikyti arba įvesti nacionalines priemones, skirtas dėl transporto priemonių pakartotinės apdailos veiklos, išbrauktos iš Direktyvos 1999/13/EB taikymo srities, išmetamiems teršalams riboti.14 straipsnisPerkėlimas į nacionalinę teisę1. Valstybės narės priima įstatymus ir kitus teisės aktus, kurie, įsigalioję ne vėliau kaip iki 2005 m. spalio 30 d., įgyvendina šią direktyvą, ir nedelsdamos apie tai praneša Komisijai.Valstybės narės, tvirtindamos šias priemones, daro jose nuorodą į šią direktyvą arba tokia nuoroda daroma jas oficialiai skelbiant. Nuorodos darymo tvarką nustato valstybės narės.2. Valstybės narės pateikia Komisijai šios direktyvos taikymo srityje priimtų nacionalinės teisės aktų pagrindinių nuostatų tekstus kartu su lentele, parodančia nacionalinių nuostatų atitikimą Direktyvai.15 straipsnisDirektyvos įsigaliojimasŠi direktyva įsigalioja jos paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje dieną.16 straipsnisAdresataiŠi direktyva skirta valstybėms narėms.Priimta Strasbūre, 2004 m. balandžio 21 d.Europos Parlamento varduPirmininkasP. CoxTarybos varduPirmininkasD. Roche[1] OL C 220, 2003 9 16, p. 43.[2] 2003 m. rugsėjo 25 d. Europos Parlamento nuomonė (dar nepaskelbta Oficialiajame leidinyje), 2004 m. sausio 7 d. Tarybos bendroji pozicija (OL C 79 E, 2004 3 30, p. 1) ir 2004 m. kovo 30 d. Europos Parlamento pozicija (dar nepaskelbta Oficialiajame leidinyje).[3] OL L 309, 2004 11 27, p. 22.[4] OL L 85, 1999 3 29, p. 1. Direktyva su pakeitimais, padarytais Europos Parlamento ir Tarybos reglamentu (EB) Nr. 1882/2003 (OL L 284, 2003 10 31, p. 1).[5] OL L 42, 1970 2 23, p. 1. Direktyva su paskutiniais pakeitimais, padarytais Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2004/3/EB (OL L 49, 2004 2 19, p. 36).[6] OL L 184, 1999 7 17, p. 23.--------------------------------------------------I PRIEDASTAIKYMO SRITIS1. Šioje direktyvoje dažai ir lakai – tai produktai, toliau išvardyti pagal subkategorijas, išskyrus aerozolius. Jie naudojami pastatų, jų apdailos elementų bei detalių ir susijusių konstrukcijų, skirtų dekoratyviniams, funkciniams ir apsauginiams tikslams, padengimui.1.1. Subkategorijos:"vidinių sienų ir lubų matinės dangos"  tai vidaus sienoms ir luboms dengti skirtos dengimo medžiagos, kurių blizgesio laipsnis ≤ 25@60o;"vidinių sienų ir lubų blizgiosios dangos"  tai vidaus sienoms ir luboms dengti skirtos dengimo medžiagos, kurių blizgesio laipsnis > 25@60o;"išorinių sienų mineralinio pagrindo dangos"  tai dengimo medžiagos, skirtos išorinėms mūro, plytinėms ar tinkuotoms sienoms dengti;"vidaus (išorės) apdailos ir plakiravimo dažai medienai, metalui ar plastikui"  tai dengimo medžiagos, skirtos apdailai ir plakiravimui, kurios sudaro nepermatomą plėvelę. Šios dengimo medžiagos skirtos medžio, metalo ar plastiko paviršiui dengti. Šiai kategorijai priklauso gruntai ir tarpinės dangos;"vidaus (išorės) apdailos ir nepermatomi dažai medienai (lazuriniai lakai)"  tai dengimo medžiagos, skirtos dengti apdailos komponentams, ir kurios sudaro permatomą arba pusiau permatomą plėvelę medienai, metalui ar plastikui puošti ir apsaugoti. Šiai grupei i priklauso nepermatomi dažai medienai/lazuriniai. Nepermatomi dažai medienai/lazuriniai – tai dengimo medžiagos, sudarančios nepermatomą plėvelę medienos apdailai ir apsaugai nuo atmosferos veiksnių, priklausančią, kaip apibrėžta EN 927-1, pusiau stabiliajai grupei;"plonasluoksniai (kitaip – labai žemo tuklumo lazuriniai) lakai"  tai lakai, kurių sluoksnio vidutinis storis, matuojant pagal ISO 2808:1997 5A metodą, yra mažesnis kaip 5 μm, kaip nurodyta EN 927–1:1996;"gruntai"  tai izoliuojančias ir (arba) sandarinančias savybes turinčios dengimo medžiagos, skirtos dengti medieną arba sienas ir lubas;"surišimo gruntai"  tai dengimo medžiagos, skirtos laisvoms pagrindo dalelėms susieti arba hidrofobinėms savybėms suteikti ir (arba) apsaugoti medieną nuo mėlynių susidarymo."vienkomponentės dengimo medžiagos"  tai specialiosios dangos plėvelę sudarančios medžiagos. Jos skirtos taikyti ten, kur padengimams reikia specialių eksploatacinių savybių, pvz., kaip gruntas ir baigiamoji danga plastikui, gruntas geležies paviršiams, gruntas reaktyviems metalams, pvz., cinkui ir aliuminiui, antikorozinėms baigiamosioms dangoms, grindų dangoms, įskaitant medines ir betonines grindis, atsparioms grafiti, atsparioms užsiliepsnojimui ir atitinkančioms higienos reikalavimus maisto ar gėrimų pramonėje arba sveikatos paslaugų tarnybose."dvikomponentės dengimo medžiagos"  tai tokios pat paskirties kaip ir vienkomponentės dengimo medžiagos, į kurias prieš naudojimą pridedamas papildomas komponentas (pvz., tretiniai aminai);"daugiaspalvės dengimo medžiagos"  tai dengimo medžiagos, skirtos suteikti dviejų atspalvių ar daugiaspalvį efektą tiesiog po panaudojimo;"specialiosios dekoratyvinės dengimo medžiagos"  tai dengimo medžiagos, skirtos suteikti specialų estetinį įspūdį, dengiant specialiai paruoštus iš anksto nudažytus paviršius arba bazines/pigmentines dangas, kurios vėliau, džiūnant apdorojamos įvairiais įrankiais.2. Pagal šią direktyvą transporto priemonių pakartotinės apdailos produktai – tai produktai, toliau išvardyti pagal subkategorijas. Jie naudojami kelių transporto priemonėms ar jų dalims, kaip apibrėžta Direktyvoje 70/156/EEB, dengti atliekant transporto priemonių remonto, konservavimo ar apdailos darbus ne jų gamybos įrenginiuose2.1. Subkategorijos:"nuėmikliai ir paruošiamieji valikliai" i) paruošiamiesiems produktams priklauso purkštuvų ploviklis (produktas, skirtas purkštuvams ir kitai įrangai valyti), dažų nuėmikliai, riebalų plovikliai (įskaitant antistatinius, skirtus plastikams) ir silikonų plovikliai;ii) "valiklis prieš dengiant" – tai valymo produktas, skirtas paviršiaus teršalams pašalinti ruošiant paviršių arba prieš dengiant jį dengimo medžiaga;"užpildomasis gruntas"  tai labai tiršti mišiniai, skirti giliems paviršiaus nelygumams panaikinti prieš uždedant baigiamąjį gruntą/glaistą;"prieškorozinis gruntas" i) "baigiamasis gruntas/užpildantis glaistas" – tai dengimo medžiaga, uždedama prieš pat dengiant baigiamąją dangą, apsauganti nuo korozijos ir užtikrinanti baigiamosios dangos sankibą, kad susidarytų vientisa paviršiaus danga, užpildanti nedidelius paviršiaus nelygumus;ii) "įprastinis metalo gruntas" – tai dengimo medžiaga, skirta naudoti kaip sankibą gerinantis gruntas, izoliuojanti medžiaga, baigiamasis gruntas, tarpinė danga, plastikų gruntas, prieš padengiant neišdžiūvusią dangą, nešlifuojamieji ir purškiamieji glaistai;iii) "fosfatinis gruntas" – tai dengimo medžiaga, kurioje ne mažiau kaip 0,5 % masės sudaro fosfato rūgštis, ir skirta dengti tiesiai ant grynų (neizoliuotų) metalinių paviršių, apsaugant nuo korozijos ir užtikrinant sankibą; dengimo medžiagos, leidžiančios suvirinti siūles, ir ėsdinantys tirpalai galvaninėms dangoms ir cinkuotiems paviršiams;"viršutinio sluoksnio danga/baigiamoji dengimo medžiaga" i) "bazinė/pigmentinė dengimo medžiaga" – tai pigmentų turinčios dengimo medžiagos, skirtos spalvai ir bet kokiems pageidaujamiems optiniams efektams suteikti, išskyrus dangų sistemos paviršiaus blizgesį ar atsparumą;ii) "skaidrioji dengimo medžiaga" – tai permatoma/prasišviečianti dengimo medžiaga, skirta dangų sistemos galutiniam blizgesiui ir paviršiaus atsparumo savybėms suteikti;"specialioji baigiamoji dengimo medžiaga"  tai dengimo medžiagos, skirtos panaudoti kaip baigiamoji danga, turinti specialių savybių, tokių kaip, pvz., metalo ar perlamutro efektas vienasluoksnėse, didelio atsparumo ryškios spalvos ir skaidriose dangose (pvz., atspari subraižymui ir fluorinta skaidrioji danga), atspindinčioji bazinė/pigmentinė danga, tekstūrinės dangos (pvz., kaltinės dangos), slydimą mažinančios dangos, kėbulo dugną izoliuojanti danga, nuo skeldėjimo saugančios dangos, vidaus apdailos dangos ir aerozoliai--------------------------------------------------II PRIEDASA. DIDŽIAUSIO LOJ KIEKIO DAŽUOSE IR LAKUOSE RIBINĖS VERTĖS| Produkto subkategorija | Tipas | I etapas (g/l ) [1] (nuo 2007 1 1) | II etapas (g/l ) [1] (nuo 2010 1 1) |a | Vidinių sienų ir lubų matinės dangos dengimo medžiagos (blizgesio laipsnis ≤ 25@60o) | VDM | 75 | 30 |TDM | 400 | 30 |b | Vidinių sienų ir lubų blizgiosios dangos dengimo medžiagos (blizgesio laipsnis > 25@60o) | VDM | 150 | 100 |TDM | 400 | 100 |c | Išorinių sienų mineraliniam pagrindui skirtos dangos dengimo medžiagos | VDM | 75 | 40 |TDM | 450 | 430 |d | Vidaus/išorės apdailos ir plakiravimo dažai medienai, plastikui ir metalui | VDM | 150 | 130 |TDM | 400 | 300 |e | Vidaus (išorės) apdailos ir lazuriniai lakai ir medienos beicai, įskaitant nepermatomus medienos (lazurinius) lakus beicus | VDM | 150 | 130 |TDM | 500 | 400 |f | Vidaus ir išorės plonasluoksniai (labai žemos kategorijos tuklumo) lazuriniai lakai | VDM | 150 | 130 |TDM | 700 | 700 |g | Gruntai | VDM | 50 | 30 |TDM | 450 | 350 |h | Surišimo gruntai | VDM | 50 | 30 |TDM | 750 | 750 |i | Vienkomponentės specialiosios dangos dengimo medžiagos | VDM | 140 | 140 |TDM | 600 | 500 |j | Dvikomponentės specialiosios paskirties (pvz., grindų) dangos dengimo medžiagos | VDM | 140 | 140 |TDM | 550 | 500 |k | Daugiaspalvės dangos dengimo medžiagos | VDM | 150 | 100 |TDM | 400 | 100 |l | Dekoratyvinės dangos dengimo medžiagos | VDM | 300 | 200 |TDM | 500 | 200 |B. DIDŽIAUSIO LOJ KIEKIO RIBINĖS VERTĖS TRANSPORTO PRIEMONIŲ PAKARTOTINĖS APDAILOS PRODUKTUOSE| Produkto kategorija | Dengimo medžiagos | LOJ g/l [2] (2007 1 1) |a | Nuėmikliai ir paruošiamieji valikliai | Nuėmiklis | 850 |Valiklis prieš dengiant | 200 |b | Baigiamasis gruntas/užpildantis gruntas | Visų tipų | 250 |c | Prieškorozinis gruntas | Baigiamasis gruntas ir įprastinis (metalo) gruntas | 540 |Fosfatinis gruntas | 780 |d | Viršutinio sluoksnio danga/Baigiamoji danga | Visų tipų | 420 |e | Specialiosios baigiamosios dangos | Visų tipų | 840 |[1] g/l paruoštame naudoti produkte[2] g/l paruoštame naudoti produkte. Išskyrus a kategoriją, bet koks paruoštame naudoti produkte esantis vandens kiekis neįskaičiuojamas.--------------------------------------------------III PRIEDAS3 STRAIPSNIO 1 DALYJE MINIMA METODIKAParametras | Vienetai | Analizė |Metodas | Paskelbimo data |LOJ kiekis | g/l | ISO 11890-2 | 2002 |LOJ kiekis, kai yra reaktyvių skiediklių | g/l | ASTMD 2369 | 2003 |--------------------------------------------------