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31984L0547

Quarantasettesima direttiva 84/547/CEE della Commissione del 26 ottobre 1984 che modifica gli allegati della direttiva 70/524/CEE del Consiglio relativa agli additivi nell'alimentazione degli animali

Gazzetta ufficiale n. L 297 del 15/11/1984 pag. 0040 - 0043

*****QUARANTASETTESIMA  DIRETTIVA DELLA COMMISSIONE  del 26 ottobre 1984  che modifica gli allegati della direttiva 70/524/CEE del Consiglio relativa agli additivi nell'alimentazione degli animali  (84/547/CEE)  LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,  visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea,  visto la direttiva 70/524/CEE del Consiglio, del 23 novembre 1970, relativa agli additivi nell'alimentazione degli animali (1), modificata da ultimo dalla quarantaseiesima direttiva 84/349/CEE della Commissione (2), in particolare l'articolo 6,  considerando che, a norma della direttiva 70/524/CEE, il contenuto degli allegati deve essere costantemente adeguato all'evoluzione delle conoscenze scientifiche e tecniche;  considerando che alcuni additivi appartenenti rispettivamente ai gruppi dei coccidiostatici e degli agenti leganti, finora ammessi per talune utilizzazioni su scala nazionale, sono stati ampiamente sperimentati; che, sulla base degli studi effettuati e dell'esperienza acquisita questi additivi possono essere autorizzati, per gli usi previsti, in tutta la Comunità;  considerando che l'impiego del coccidiostatico « Miscela di meticlorpindolo/metilbenzoquato », dell'emulsionante « Trioleato di poliossietilene (20) sorbitano » e dell'agente antiagglomerante « Perlite » è stato sperimentato con successo in alcuni Stati membri; che è opportuno autorizzare provvisoriamente l'uso di questi additivi, almeno su scala nazionale, in attesa che vengano ammessi su scala comunitaria;  considerando che lo studio di vari additivi iscritti nell'allegato II, e quindi autorizzabili su scala nazionale, non è ancora completato; che è pertanto necessario prorogarne la scadenza di autorizzazione per un determinato periodo;  considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente degli alimenti per gli animali,  HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:  (1) GU n. L 270 del 14. 12. 1970, pag. 1.  (2) GU n. L 183 dell'11. 7. 1984, pag. 15.  Articolo  1  Gli allegati della direttiva 70/524/CEE sono modificati come segue:  1. All'allegato I:  a) nella parte D « Coccidiostatici e altre sostanza medicamentose » la voce n. E 763 « Lasalocid-sodio » è completata come segue:  1.2.3.4.5.6.7.8 //   //   //   //   //   //   //   //   // « N. CEE  // Additivi  // Denominazione chimica, descrizione  // Specie animale  // Età massima  // Tenore minimo  // Tenore massimo  // Altre disposizioni 1.2.3.4.5.6,7.8 //   //   //  //   //   // ppm dell'alimento completo  // 1.2.3.4.5.6.7.8 //   //   //   //   //   //   //   //   //  //   //   // Pollastre destinate alla produzione di uova  // 16 settimane  // 75  // 125  // - »  //   //   //   //  //   //   //   //  b) nella parte L « Agenti leganti, antiagglomeranti e coagulanti » è aggiunta la voce seguente:  1.2.3.4.5.6.7.8 //   //   //   //   //   //   //   //   // « N. CEE  // Additivi  // Denominazione chimica, descrizione  // Specie animale  // Età massima  // Tenore minimo  // Tenore massimo  // Altre disposizioni 1.2.3.4.5.6,7.8 //   //   //  //   //   // ppm dell'alimento completo  // 1.2.3.4.5.6.7.8 //   //   //   //   //   //   //   //   // E 561  // Vermiculite  // Silicato naturale di magnesio, di alluminio e di ferro, espanso mediante riscaldamento, esente da amianto. Tenore massimo di fluoro: 0,3 %  // Tutte le specie animali  //   //   //   // Tutti gli alimenti »  //   //   //  //   //   //   //   //  2. All'allegato II:  a) nella parte B « Coccidiostatici ed altre sostanze medicamentose », la voce n. 16 « Miscela di meticloropindolo/metilbenzoquato » è completata come segue:  1.2.3.4.5.6.7.8.9 //   //   //   //   //   //   //   //   //  // « N. CEE  // Additivi  // Denominazione chimica, descrizione  // Specie animale  // Età massima  // Tenore minimo  // Tenore massimo  // Altre disposizioni  // Durata dell'autorizzazione 1.2.3.4.5.6,7.8 //   //   //   //   //  // ppm dell'alimento completo  //   //   //   //   //   //  //   //   //   //  1.2.3.4.5.6.7.8.9 //   //   //  // Tacchini  // 12 settimane  // 110  // 110  // Somministrazione vietata almeno 5 giorni prima della macellazione  // 30. 11. 1985 »  //   //   //   //   //   //  //   //   //  b) nella parte C « Emulsionanti, stabilizzanti, addensanti e gelificanti »,  aa) la data del 31 dicembre 1984 che figura nella colonna « Durata dell'autorizzazione » è sostituita dalla data del 30 novembre 1985 per le seguenti voci:  n. 7 Gomma Karaya  n. 8 Esteri parziali di poliglicerolo di acidi grassi di ricino policondensati  n. 12 Monolaurato di poliossietilene (20) sorbitano  n. 13 Monopalmitato di poliossietilene (20) sorbitano n. 14 Monostearato di poliossietilene (20) sorbitano  n. 15 Tristearato di poliossietilene (20) sorbitano  n. 16 Monooleato di poliossietilene (20) sorbitano  n. 17 Stearato di poliossietilene (8)  n. 18 Stearato di poliossietilene (40)  bb) è aggiunta la voce seguente:  1.2.3.4.5.6.7.8.9 //   //   //   //   //   //   //   //   //  // « N. CEE  // Additivi  // Denominazione chimica, descrizione  // Specie animale  // Età massima  // Tenore minimo  // Tenore massimo  // Altre disposizioni  // Durata dell'autorizzazione 1.2.3.4.5.6,7.8 //   //   //   //   //  // ppm dell'alimento completo  //   //   //   //   //   //  //   //   //   //  1.2.3.4.5.6.7.8.9 // 29  //   // Trioleato di poliossietilene (20) sorbitano (sinonimo: polisorbato 85)  // Tutte le specie animali  //   //   //   // Tutti gli alimenti  // 30. 11. 1985 »  //   //   //   //   //   //   //  //   //  c) nella parte D « Agenti conservanti », la data del 30 novembre 1984 che figura nella colonna « Durata dell'autorizzazione » è sostituita dalla data del 30 novembre 1985 per le seguenti voci:  n. 3 Acido cloridrico  n. 4 Acido solforico  n. 5 Formaldeide  n. 16 Nitrito di sodio (E 250)  n. 19 1,2-propandiolo  d) nella parte G « Agenti leganti, antiagglomeranti e coagulanti »:  aa) la data del 30 novembre 1984 che figura nella colonna « Durata dell'autorizzazione » è sostituita dalla data del 30 novembre 1985 per le seguenti voci:  n. 1 Bentonite e montmorillonite  n. 4 Miscele naturali di steatite e di clorite, esenti da amianto, diverse dalla miscela E 554  bb) la data del 30 novembre 1984 che figura nella colonna « Durata dell'autorizzazione » è sostituita dalla data del 30 giugno 1985 per la voce n. 2 « Vermiculite »;  cc) è aggiunta la voce seguente:  1.2.3.4.5.6.7.8.9 //   //   //   //   //   //   //   //   //  // « N. CEE  // Additivi  // Denominazione chimica, descrizione  // Specie animale  // Età massima  // Tenore minimo  // Tenore massimo  // Altre disposizioni  // Durata dell'autorizzazione 1.2.3.4.5.6,7.8 //   //   //   //   //  // ppm dell'alimento completo  //   //   //   //   //   //  //   //   //   //  1.2.3.4.5.6.7.8.9 // 5  // Perlite  // Silicato naturale di sodio e di alluminio, espanso mediante riscaldamento esente da amianto  // Tutte le specie animali  //   //   //   // Tutti gli alimenti  // 30. 11. 1985 »  //  //   //   //   //   //   //   //   //  Articolo  2  Gli Stati membri mettono in vigore le disposizioni legislative, regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alle disposizioni dell'articolo 1, punto 1, entro e non oltre il 30 giugno 1985. Essi ne informano immediatamente la Commissione.  Articolo 3  Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.  Fatto a Bruxelles, il 26 ottobre 1984.  Per la Commissione  Poul DALSAGER  Membro della Commissione


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31999L0027

Direttiva 1999/27/CE della Commissione, del 20 aprile 1999, che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione dell'amprolium, del diclazuril e del carbadox negli alimenti per animali, che modifica le direttive 71/250/CEE e 73/46/CEE e che revoca la direttiva 74/203/CEE (Testo rilevante ai fini del SEE)

Gazzetta ufficiale n. L 118 del 06/05/1999 pag. 0036 - 0052

DIRETTIVA 1999/27/CE DELLA COMMISSIONEdel 20 aprile 1999che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione dell'amprolium, del diclazuril e del carbadox negli alimenti per animali, che modifica le direttive 71/250/CEE e 73/46/CEE e che revoca la direttiva 74/203/CEE(Testo rilevante ai fini del SEE)LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,visto il trattato che istituisce la Comunità europea,vista la direttiva 70/373/CEE del Consiglio, del 20 luglio 1970, relativa all'introduzione di modi di prelievo di campioni e di metodi di analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali(1), modificata da ultimo dall'atto di adesione dell'Austria, della Finlandia e della Svezia, in particolare l'articolo 2,(1) considerando che la direttiva 70/373/CEE prevede che i controlli ufficiali degli alimenti per animali, volti a costatare l'osservanza delle condizioni prescritte in virtù delle disposizioni legislative, regolamentari ed amministrative concernenti la qualità e la composizione degli alimenti per animali, siano effettuati secondo metodi comunitari di prelievo di campioni e di analisi;(2) considerando che la direttiva 70/524/CEE del Consiglio, del 23 novembre 1970, relativa agli additivi nell'alimentazione degli animali(2), modificata da ultimo dal regolamento (CE) n. 45/1999 della Commissione(3), prescrive che il contenuto di amprolium e diclazuril deve essere indicato al momento dell'etichettatura allorché tali sostanze sono aggiunte alle premiscele ed agli alimenti per animali; che l'autorizzazione dell'uso del carbadox come additivo nell'alimentazione animale è stata revocata con il regolamento (CE) n. 2788/98 della Commissione, del 22 dicembre 1998, che modifica la direttiva 70/524/CEE del Consiglio, relativa agli additivi nell'alimentazione degli animali, in ordine alla revoca dell'autorizzazione di taluni fattori di crescita(4), e che è necessaria una sorveglianza ufficiale sull'eventuale impiego illegale delle sostanze proibite;(3) considerando che in vista dei necessari controlli è necessario stabilire metodi comunitari di analisi;(4) considerando che la prima direttiva 71/250/CEE della Commissione, del 15 giugno 1971, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali(5), modificata da ultimo dalla direttiva 98/54/CE(6), stabilisce, fra l'altro, metodi di analisi per la determinazione dell'essenza di senape e della teobromina; che tali metodi non sono più validi per i fini previsti, perché superati dal progresso scientifico e tecnico; che pertanto è opportuno sopprimerli;(5) considerando che la quarta direttiva 73/46/CEE della Commissione, del 5 dicembre 1972, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per animali(7), modificata da ultimo dalla direttiva 98/54/CE, stabilisce, fra l'altro, metodi di analisi per la determinazione del retinolo (vitamina A); che tali metodi non sono più validi per i fini previsti, perché superati dal progresso scientifico e tecnico; che pertanto è opportuno sopprimerli;(6) considerando che la quinta direttiva 74/203/CEE della Commissione, del 25 marzo 1974, che fissa i metodi d'analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali(8), modificata da ultimo dalla direttiva 81/680/CE(9), stabilisce metodi di analisi per la determinazione del contenuto in amido e suoi prodotti di degradazione ad elevato peso molecolare negli alimenti che contengono fettucce, polpe, foglie o colletti essiccati di barbabietole, polpe di patate, lieviti disidratati, prodotti ricchi in inulina o ciccioli, amprolium, etopabato, dinitolmide, nicarbazina e menadione (vitamina K3); che tali metodi non sono più validi per i fini previsti, perché superati dal progresso scientifico e tecnico; che pertanto è opportuno revocare tale direttiva;(7) considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente degli alimenti per gli animali,HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:Articolo 1Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali e delle premiscele, per quanto riguarda il loro contenuto in amprolium, diclazuril e carbadox, siano effettuate secondo i metodi descritti nell'allegato della presente direttiva.Articolo 2La direttiva 71/250/CEE è modificata come segue:1) all'articolo 1, le parole "essenza di senape" e "teobromina" sono soppresse;2) i punti 8 e 13 dell'allegato sono soppressi.Articolo 3La direttiva 73/46/CEE è modificata come segue:1) l'articolo 2 è soppresso;2) l'allegato II è soppresso.Articolo 4La quinta direttiva 74/203/CEE è abrogata.Articolo 5Gli Stati membri mettono in vigore le disposizioni legislative, regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva, non oltre il 31 ottobre 1999. Essi ne informano immediatamente la Commissione.Essi applicano le misure a partire dal 1o novembre 1999.Quando gli Stati membri adottano dette disposizioni, queste contengono un riferimento alla presente direttiva oppure sono corredate di un siffatto riferimento all'atto della loro pubblicazione ufficiale. Le modalità di tale riferimento sono decise dagli Stati membri.Articolo 6La presente direttiva entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.Articolo 7Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.Fatto a Bruxelles, il 20 aprile 1999.Per la CommissioneFranz FISCHLERMembro della Commissione(1) GU L 170 del 3.8.1970, pag. 2.(2) GU L 270 del 14.12.1970, pag. 1.(3) GU L 6 del 12.1.1999, pag. 3.(4) GU L 347 del 23.12.1998, pag. 31.(5) GU L 155 del 12.7.1971, pag. 13.(6) GU L 208 del 24.7.1998, pag. 49.(7) GU L 83 del 30.3.1973, pag. 21.(8) GU L 108 del 22.4.1974, pag. 7.(9) GU L 246 del 29.8.1981, pag. 32.ALLEGATOPARTE ADETERMINAZIONE DELL'AMPROLIUMCloridrato del cloruro di 1-[(4-ammino-2 - propil-5 pirimidinil)metil]-2-picolinio1. Finalità e campo di applicazioneIl presente metodo serve per la determinazione dell'amprolium negli alimenti per animali e nelle premiscele. Il limite di rivelazione è di 1 mg/kg, il limite di determinazione è di 25 mg/kg.2. PrincipioIl campione viene estratto con una miscela metanolo/acqua. Dopo diluizione con una fase mobile e filtrazione per membrana, il contenuto di amprolium viene determinato per cromatografia in fase liquida ad alte prestazioni (HPLC) a scambio cationico, impiegando un rivelatore UV.3. Reattivi3.1. Metanolo3.2. Acetonitrile, qualità per HPLC3.3. Acqua, qualità per HPLC3.4. Soluzione di fosfato monosodico, c = 0,1 mol/1In un matraccio tarato da 1000 ml, sciogliere 13,80 g di fosfato monosodico monoidrato in acqua (3.3), portare a volume con acqua (3.3) e mescolare.3.5. Soluzione di perclorato sodico, c = 1,6 mol/1In un matraccio tarato da 1000 ml, sciogliere 224,74 g di perclorato sodico monoidrato in acqua (3.3), portare a volume con acqua (3.3) e mescolare.3.6. Fase mobile per HPLC (cfr. osservazione 9.l)Miscela di acetonitrile (3.2), soluzione di fosfato monosodico (3.4) e soluzione di perclorato sodico (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Prima dell'impiego, filtrare per filtro a membrana da 0,22 μm (4.3) e degassare la soluzione [ad esempio nel bagno ad ultrasuoni (4.4), per almeno 15 minuti].3.7. Sostanza di riferimento (standard): cloridrato di 1-[(4-ammino-2-propilpirimidin5-il)metil]-2-metil-piridinio (amprolium, E 750), di purezza garantita (cfr. 9.2).3.7.1. Soluzione madre di amprolium, 500 μg/mlIn un matraccio tarato da 100 ml, pesare 50 mg di standard (amprolium, 3.7) con l'approssimazione di 0,1 mg; sciogliere in 80 ml di metanolo (3.l) e collocare per 10 minuti il matraccio in bagno ad ultrasuoni (4.4). Dopo il trattamento ultrasonico raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, portare a volume con acqua e mescolare. A temperatura <=4 °C, la soluzione rimane stabile per un mese.3.7.2. Soluzione intermedia di amprolium, 50 ìg/ml.In un matraccio tarato da 50 ml, pipettare 5,0 ml della soluzione madre (3.7.l), portare a volume col solvente di estrazione (3.8) e mescolare. A temperatura <=4 °C la soluzione rimane stabile per un mese.3.7.3. Soluzioni di taraturaTrasferire 0,5, 1,0 e 2,0 ml della soluzione intermedia (3.7.2) in una serie di matracci tarati da 50 ml. Portare a volume con la fase mobile (3.6) e mescolare. Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 0,5, 1,0 e 2,0 ìg/ml di amprolium. Esse vanno preparate estemporaneamente prima dell'uso.3.8. Solvente di estrazioneMiscela metanolo (3.l)- acqua 2 + 1 (v + v).4. Apparecchiatura4.1. Apparecchiatura HPLC con sistema di iniezione adeguato a volumi da 100 ìl.4.1.1. Colonna per cromatografia in fase liquida, 125 mm x 4 mm, a scambio cationico (riempimento: Nucleosil 10 SA, 10 ìm, od equivalente).4.1.2. Rivelatore UV a lunghezza d'onda variabile, o rivelatore a serie di diodi.4.2. Filtro a membrana in PTFE, da 0,45 ìm.4.3. Filtro a membrana, da 0,22 ìm.4.4. Bagno ad ultrasuoni.4.5. Agitatore meccanico o mescolatore magnetico.5. Modo di operare5.1. Generalità5.1.1. "Bianco"Per poter procedere alla prova di recupero (5.l.2) è necessario disporre di un mangime di riferimento ("bianco"), di tipo simile a quello del campione e da utilizzare come termine di confronto. L'analisi non deve evidenziare la presenza di quantità rivelabili di amprolium o di sostanze capaci di interferire.5.1.2. Prova di recuperoDeve essere eseguita una prova di recupero analizzando il "bianco" addizionato di una quantità di amprolium analoga a quella presente nel campione. Per ottenere una concentrazione di 100 mg/kg, trasferire 10,0 ml della soluzione madre (3.7.l) in una beuta da 250 ml, e concentrare evaporando fino a 0,5 ml circa. Aggiungere 50 g di "bianco", mescolare accuratamente e lasciar riposare per 10 minuti agitando nuovamente varie volte prima di procedere all'estrazione (5.2).Se non fosse disponibile un "bianco" di tipo simile a quello del campione (cfr. 5.1.1), la prova di recupero può essere eseguita col metodo di addizione della sostanza di riferimento. In questo caso, un'aliquota del campione da analizzare viene addizionata di una quantità nota di amprolium, analoga a quella già presente. Quest'aliquota viene analizzata insieme ad una del campione non addizionato, e il recupero può essere calcolato per differenza.5.2. Estrazione5.2.1. Premiscele (contenenti meno dell'1 % di amprolium) ed alimenti per animali.In una beuta da 500 ml, pesare con l'approssimazione di 0,01 g un'adeguata quantità del campione (da 5 a 40 g, secondo il suo contenuto in amprolium), ed aggiungere 200 ml di solvente di estrazione (3.8). Collocare la beuta nel bagno (4.4) e lasciarvela per 15 minuti. Togliere la beuta dal bagno ad ultrasuoni e mantenerla per un'ora sotto agitazione meccanica o magnetica (4.5). Diluire un'aliquota dell'estratto con la fase mobile (3.6) fino a un contenuto di amprolium dell'ordine di 0,5-2 ìg/ml, poi mescolare. Filtrare per filtro a membrana (4.2) da 5 a 10 ml della soluzione diluita. Procedere alla determinazione HPLC (5.3).5.2.2. Premiacele (contenenti fino all'l % di amprolium) ed alimenti per animali.In una beuta da 500 ml, pesare con l'approssimazione di 0,001 g un'adeguata quantità del campione (da 1 a 5 g, secondo il suo contenuto in amprolium) ed aggiungere 200 ml di solvente ed estrazione (3.8). Collocare la beuta nel bagno ad ultrasuoni (4.4) e lasciarvela per 15 minuti. Togliere la beuta dal bagno ad ultrasuoni e mantenerla per un'ora sotto agitazione meccanica o magnetica (4.5). Diluire un'aliquota dell'estratto con la fase mobile (3.6) fino a un contenuto di amprolium dell'ordine di 0,5-2 ìg/ml, poi mescolare. Filtrare per filtro a membrana (4.2) da 5 a 10 ml della soluzione diluita. Procedere alla determinazione HPLC (5.3).5.3. Determinazione HPLC5.3.1. Parametri:Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo di orientamento; è possibile operare in condizioni diverse, purché si ottengano risultati equivalenti.>SPAZIO PER TABELLA>Verificare la stabilità del sistema cromatografico iniettando varie volte la soluzione di taratura (3.7.3) contenente 1,0 μg/ml, fino a costanza dell'altezza delle cuspidi e dei tempi di ritenzione.5.3.2. Curva di taraturaIniettare più volte ciascuna soluzione di taratura (3.7.3) varie volte, e determinare le altezze (le superfici) medie delle cuspidi per ciascuna concentrazione. Tracciare la curva di taratura, riportando in ordinata le altezze (le superfici) medie delle cuspidi delle soluzioni di taratura, e in ascissa le corrispondenti concentrazioni, espresse in μg/ml.5.3.3. Soluzione del campioneIniettare più volte l'estratto del campione (5.2), impiegando lo stesso volume di quello prelevato per le soluzioni di taratura e determinare le altezze (le superfici) medie delle cuspidi dell'amprolium.6. Calcolo dei risultatiPartendo dall'altezza (dalla superficie) media delle cuspidi dell'amprolium nella soluzione del campione, determinare la concentrazione di tale soluzione, espressa in μg/ml, riportandosi alla curva di taratura (5.3.2).Il contenuto w di amprolium nel campione, espresso in mg/kg, è dato dalla seguente formula:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>[mg/kg]dove:V= volume del solvente di estrazione (3.8) in ml, secondo (5.2) (cioè: 200 ml);β= concertazione in amprolium dell'estratto del campione (5.2), espressa in μg/ml;f= fattore di diluizione secondo (5.2);m= massa dell'aliquota esaminata, espressa in g.7. Convalida dei risultati7.1. IdentitàL'identità dell'analita può essere confermata mediante co-cromatografia, oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confrontare gli spettri dell'estratto del campione (5.2) e della soluzione di taratura (3.7.3) contenente 2,0 μg/ml.7.1.1. Co-cromatografiaA un estratto del campione (5.2) viene aggiunto un quantitativo adeguato della soluzione di taratura (3.7.3). Il quantitativo di amprolium aggiunto deve essere analogo a quello di amprolium rilevato nell'estratto del campione.Soltanto l'altezza della cuspide dell'amprolium deve essere aumentata, tenendo conto del quantitativo aggiunto e della diluizione dell'estratto. L'ampiezza della cuspide, a mezza altezza, deve rientrare nel 10 % in più o in meno dell'ampiezza iniziale della cuspide dell'amprolium per l'estratto del campione non addizionato.7.1.2. Rivelazione mediante serie di diodiI risultati vengono valutati secondo i seguenti criteri:a) la lunghezza d'onda di assorbimento massimo degli spettri del campione e dello standard, registrata al vertice della cuspide sul cromatogramma, deve rientrare in un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione. Per la rivelazione mediante serie di diodi essa è generalmente di 2 nm;b) fra 210 e 320 nm, gli spettri del campione e dello standard registrati al vertice della cuspide sul cromatogramma non debbono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 % dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 % dell'assorbanza dello standard dell'analita;c) fra 210 e 320 nm, gli spettri della curva ascendente, del vertice e della curva discendente della cuspide prodotta dall'estratto del campione non devono essere diversi gli uni dagli altri per le parti dello spettro situate fra il 10 % e il 100 % dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 % dell'assorbanza dello spettro del vertice della cuspide.Se uno di questi criteri non è soddisfatto, la presenza dell'analita non è confermata.7.2. RipetibilitàLa differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare:- il 15 %, rispetto al valore più elevato per i contenuti di amprolium compresi fra 25 mg/kg e 500 mg/kg;- 75 mg/kg, per i contenuti di amprolium compresi fra 500 mg/kg e 1000 mg/kg;- il 7,5 %, rispetto al valore più elevato per i contenuti di amprolium superiori a 1000 mg/kg.7.3. RecuperoPer un campione addizionato ("bianco"), il recupero non deve essere inferiore al 90 %.8. Risultati di uno studio collaborativoE' stato organizzato uno studio collaborativo durante il quale sono stati analizzati tre alimenti per pollame (campioni 1-3), un alimento minerale (campione 4) ed una premiscela (campione 5). I risultati dello studio figurano nella seguente tabella:>SPAZIO PER TABELLA>L: numero di laboratorin: numero di valori individualisr: deviazione standard della ripetibilitàCVr: coefficiente di variazione della ripetibilitàsR: deviazione standard della riproducibilitàCVR: coefficiente di variazione della riproducibilità9. Osservazioni9.1. Se il campione contiene tiamina, la relativa cuspide compare nel cromatogramma poco prima di quella dell'amprolium. Secondo questo metodo, l'amprolium e la tiamina debbono essere separati. Se l'amprolium e la tiamina non vengono separati dalla colonna (4.1.1) impiegata col presente metodo, sostituire con metanolo fino al 50 % della porzione di acetonitrile della fase mobile (3.6).9.2. Secondo la farmacopea britannica, lo spettro di una soluzione di amprolium (c= 0,02 mol/l) in acido cloridrico (c= 0,1 mol/l) mostra dei massimi a 246 nm e 262 nm. La densità ottica deve essere di 0,84 a 246 nm e 0,80 a 262 nm.9.3. L'estratto deve essere sempre diluito con la fase mobile, poiché altrimenti il tempo di ritenzione della cuspide dell'amprolium potrebbe spostarsi significativamente per effetto delle variazioni della forza ionica.PARTE BDETERMINAZIONE DEL DICLAZURIL2,6 cloro-alfa-(4-clorofenil)-4-[4,5-diidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2(3H)-yi]benzenacetonitrile1. Finalità e campo di applicazioneIl presente metodo serve per la determinazione del diclazuril negli alimenti per animali e nelle premiscele. Il limite di rivelazione è di 0,1 mg/kg, il limite di determinazione è di 0,5 mg/kg.2. PrincipioDopo aggiunta di uno standard interno, il campione viene estratto con metanolo acidificato. Nel caso degli alimenti, un'aliquota dell'estratto viene purificata su una cartuccia C 18 per estrazione in fase solida. Il diclazuril viene eluito dalla cartuccia con una miscela di metanolo acidificato ed acqua. Dopo evaporazione, il residuo viene ripreso con DMF/acqua. Nel caso delle premiacele, l'estratto viene evaporato ed il residuo viene ripreso con DMF/acqua. Il contenuto di diclazuril viene determinato per cromatografia in fase liquida ad alto rendimento (HPLC), a gradiente ternario e fase invertita, impiegando un rivelatore UV.3. Reattivi3.1. Acqua, qualità per HPLC3.2. Acetato di ammonio3.3. Solfidrato di tetrabutilammonio (TBHS)3.4. Acetonitrile, qualità per HPLC3.5. Metanolo, qualità per HPLC3.6. N, N-dimetilformammide (DMF)3.7. Acido cloridico, p20= 1,19 g/ml3.8. Sostanza di riferimento (standard): (+)-4-clorofenil[2,6-dicloro-4-(2,3,4,5-tetraidro-3,5-dioxo-l,2,4-triazin-2-il)fenil] acetonitrile (diclazuril II-24, E 771), di purezza garantita3.8.1. Soluzione madre di diclazuril, 500 μg/ml.In un matraccio tarato da 50 ml, pesare 25 mg di standard (diclazuril, 3.8) con l'approssimazione di 0,1 mg. Sciogliere in DMF (3.6), portare a volume con DMF (3.6) e mescolare. Avvolgere il matraccio con foglio d'alluminio (od impiegare un matraccio in vetro scuro) e conservare in frigorifero. A temperatura <=4 °C, la soluzione rimane stabile per un mese.3.8.2. Soluzione standard di diclazuril, 50 ìg/mlTrasferire 5,00 ml della soluzione madre (3.8.l) in un matraccio tarato da 50 ml, portare a volume con DMF (3.6) e mescolare. Avvolgere il matraccio con foglio d'alluminio (od impiegare un matraccio in vetro scuro) e conservare in frigorifero. A temperatura <=4 °C, la soluzione rimane stabile per un mese.3.9. Standard interno: 2,6 cloro-alfa-(4-clorofenil)-4-[4,5-diidro-3,5-dioxo-l,2,4-triazin-2(3H)-yi]benzen-acetonitrile, E7713.9.1. Soluzione madre dello standard interno, 500 ìg/ml.In un matraccio tarato da 50 ml, pesare 25 mg dello standard interno (3.9) con l'approssimazione di 0,1 mg. Sciogliere in DMF (3.6), portare a volume con DMF (3.6) e mescolare. Avvolgere il matraccio con foglio d'alluminio (od impiegare un matraccio in vetro scuro) e conservare in frigorifero. A temperatura non superiore a 4 °C, la soluzione rimane stabile per un mese.3.9.2. Soluzione dello standard interno, 50 ìg/mlTrasferire 5,00 ml della soluzione madre dello standard interno (3.9.l) in un matraccio tarato da 50 ml, portare a volume con DMF (3.6) e mescolare. Avvolgere il matraccio con foglio d'alluminio (od impiegare un matraccio in vetro scuro) e conservare in frigorifero. A temperatura non superiore a 4 °C, la soluzione rimane stabile per un mese.3.9.3. Soluzione dello standard interno per le premiscele, p/1000 mg/ml (p = contenuto nominale di diclazuril nella premiscela, in mg/kg)In un matraccio tarato da 100 ml, pesare p/10 mg dello standard interno con l'approssimazione di 0,1 mg, Sciogliere in DMF (3.6) in bagno ad ultrasuoni (4.6), portare a volume con DMF e mescolare. Avvolgere il matraccio con foglio d'alluminio (od impiegare un matraccio in vetro scuro) e conservare in frigorifero. A temperatura <=4 °C, la soluzione rimane stabile per un mese.3.10. Soluzione di taratura, 2 ìg/mlIn un matraccio tarato da 50 ml, pipettare 2,00 ml di soluzione standard di diclazuril (3.8.2) e 2,00 ml di soluzione dello standard interno (3.9.2). Aggiungere 16 ml di DMF (3.6), portare a volume con acqua e mescolare. Questa soluzione deve essere preparata estemporaneamente prima dell'uso.3.11. Cartuccia C18 per estrazione in fase solida (es.: Bond Elut). Misura: 1 cm. Massa sorbente: 100 mg.3.12. Solvente di estrazione: metanolo acidificatoPipettare 5,0 ml di acido cloridrico (3.7) in 1000 ml di metanolo (3.5) e mescolare.3.13. Fase mobile per HPLC.Eluente A: soluzione di acetato di ammonio - solfidrato di tetrabutilammonio.3.13.1. Sciogliere 5 g di acetato d'ammonio (3.2) e 3,4 g di TBHS (3.3) in 1000 ml d'acqua (3.l) e mescolare.3.13.2. Eluente B: acetonitrile (3.4).3.13.3. Eluente C: metanolo (3.5)4. Apparecchiatura4.1. Agitatore meccanico4.2. Apparecchiatura per HPLC a gradiente ternario4.2.1. Colonna per cromatografia in fase liquida, 100 mm x 4,6 mm, con riempimento in Hypersil ODS da 3 ìm, od equivalente4.2.2. Rivelatore UV a lunghezza d'onda variabile, o rivelatore a serie di diodi4.3. Evaporatore rotativo sotto vuoto4.4. Filtro a membrana, 0,45 ìm4.5. Collettore da vuoto4.6. Bagno ad ultrasuoni.5. Modo di operare5.1. Generalità5.1.1. "Bianco"È necessario disporre di un mangime di riferimento ("bianco"), nel quale dev'essere verificata l'assenza del diclazuril e di sostanze capaci di interferire. Il "bianco" deve essere di tipo simile a quello del campione, e la sua analisi non deve evidenziare la presenza di diclazuril o di sostanze capaci di interferire.5.1.2. Prova di recuperoDeve essere eseguita una prova di recupero analizzando il "bianco" addizionato di una quantità di diclazuril analoga a quella presente nel campione. Per ottenere una concentrazione di 1 mg/kg, aggiungere 0,1 ml della soluzione madre (3.8.l) a 50 g di "bianco", mescolare accuratamente e lasciar riposare per 10 minuti, agitando nuovamente varie volte prima di procedere all'estrazione (5.2).Se non fosse disponibile un "bianco" di tipo simile a quello del campione (cfr. 5.1.1), la prova di recupero può essere eseguita col metodo di addizione della sostanza di riferimento. In questo caso, un'aliquota del campione da analizzare viene addizionata di una quantità nota di diclazuril, analoga a quella già presente. Quest'aliquota viene analizzata insieme ad una del campione non addizionato, ed il recupero può essere calcolato per differenza.5.2. Estrazione5.2.1. AlimentiPesare 50 g circa del campione con l'approssimazione di 0,01 g. Trasferire in una beuta da 500 ml, aggiungere 1,00 ml di soluzione dello standard interno (3.9.2) e 200 ml di solvente di estrazione (3.12), poi coprire il recipiente. Mantenere sotto agitazione la miscela per una notte, nell'agitatore (4.l). Lasciar depositare per 10 minuti. Trasferire un'aliquota da 20 ml del surnatante in un adatto contenitore in vetro e diluire con 20 ml d'acqua. Trasferire questa soluzione in una cartuccia di estrazione (3.11) e filtrare sotto vuoto (4.5). Lavare la cartuccia con 25 ml di una miscela di solvente di estrazione (3.12) e d'acqua, 65 + 35 (V + V). Eliminare le frazioni raccolte ed eluire la mescolanza con 25 ml di una miscela di solvente di estrazione (3.12) e d'acqua, 80 + 20 (V + V). Evaporare questa frazione a 60 °C, nell'evaporatore rotativo (4.3), fino a secchezza incipiente. Riprendere il residuo con 1,0 ml di DMF (3.6), aggiungere 1,5 ml d'acqua (3.1) e mescolare. Filtrare per filtro a membrana (4.4). Procedere alla determinazione HPLC (5.3).5.2.2. PremiscelePesare 1 g circa del campione, con l'approssimazione di 0,01 g. Trasferire in una beuta da 500 ml, aggiungere 1,00 ml di soluzione dello standard interno (3.9.3) e 200 ml di solvente di estrazione (3.12), poi coprire il recipiente. Agitare per una notte sull'agitatore (4.1). Lasciare depositare per 10 minuti. Trasferire un'aliquota da 10000/p ml (p = contenuto nominale di diclazuril nella premiscela, espresso in mg/kg) del surnatante in un matraccio a fondo arrotondato di dimensioni convenienti. Evaporare nell'evaporatore rotativo (4.3), sotto pressione ridotta e a 60 °C, fino a secchezza incipiente. Riprendere il residuo con 10,0 ml DMF (3.6), aggiungere 15,0 d'acqua (3.1) e mescolare. Procedere alla determinazione HPLC (5.3).5.3. Determinazione HPLC5.3.1. ParametriLe seguenti condizioni vengono proposte a titolo di orientamento; è possibile operare in condizioni diverse, purché si ottengano risultati equivalenti.>SPAZIO PER TABELLA>Verificare la stabilità del sistema cromatografico iniettando più volte la soluzione di taratura (3.10), contenente 2 μg/ml, fino a costanza dell'altezza delle cuspidi e dei tempi di ritenzione.5.3.2. Soluzione di taraturaIniettare più volte 20 μl della soluzione di taratura (3.10) e determinare l'altezza (la superficie) media delle cuspidi del diclazuril e dello standard interno.5.3.3. Soluzione del campioneIniettare più volte 20 μl della soluzione del campione (5.2.1 o 5.2.2) e determinare l'altezza (la superficie) media delle cuspidi del diclazuril e dello standard interno.6. Calcolo dei risultati6.1. AlimentiIl contenuto w di diclazuril nel campione, espresso in mg/kg, è dato dalla seguente formula:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>[mg/kg]dove:hd,s= altezza (superficie) della cuspide del diclazuril nella soluzione del campione (5.2.1);hi,s= altezza (superficie) della cuspide dello standard interno nella soluzione del campione (5.2.1);hd,c= altezza (superficie) della cuspide del diclazuril nella soluzione di taratura (3.10);hi,c= altezza (superficie) della cuspide dello standard interno nella soluzione di taratura (3.10);βd,c= concentrazione del diclazuril nella soluzione di taratura, μg/ml (3.10);m= massa dell'aliquota analizzata, gV= volume dell'estratto del campione secondo 5.2.1 (cioè: 2,5 ml).6.2. PremisceleIl contenuto w di diclazuril nel campione, espresso in mg/kg, è data dalla seguente formula:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>[mg/kg]dove:hd,c= altezza (superficie) della cuspide del diclazuril nella soluzione di taratura (3.10);hi,c= altezza (superficie) della cuspide dello standard interno nella soluzione di taratura (3.10);hd,s= altezza (superficie) della cuspide del diclazuril nella soluzione del campione (5.2.2);hi,s= altezza (superficie) della cuspide dello standard interno nella soluzione del campione (5.2.2);βd,c= concentrazione del diclazuril nella soluzione di taratura (3.10);m= massa dell'aliquota analizzata, g;V= volume dell'estratto del campione secondo 5.2.2 (cioè: 2,5 ml);p= contenuto nominale di diclazuril nella premiscela, mg/kg.7. Convalida dei risultati7.1. IdentitàL'identità dell'analita può essere confermata mediante co-cromatografia, oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confrontare gli spettri dell'estratto del campione (5.2.1 o 5.2.2) e della soluzione di taratura (3.10).7.1.1. Co-cromatografiaA un estratto del campione (5.2.1 o 5.2.2) viene aggiunto un quantitativo adeguato della soluzione di taratura (3.10). Il quantitativo di diclazuril aggiunto deve essere analogo a quello di diclazuril trovato nell'estratto del campione.Debbono essere aumentate soltanto le altezze delle cuspidi del diclazuril e dello standard interno, tenendo conto dei quantitativi aggiunti e della diluizione dell'estratto. L'ampiezza delle cuspidi, a metà altezza, deve rientrare nel +- 10 % dell'ampiezza iniziale della cuspide del diclazuril o di quella dello standard interno del campione non addizionato.7.1.2. Rivelazione mediante serie di diodiI risultati vengono valutati secondo i seguenti criteri:a) La lunghezza d'onda dell'assorbimento massimo degli spettri del campione e dello standard, registrata al vertice della cuspide sul cromatogramma, deve rientrare in un margine derminato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione. Per la rivelazione mediante serie di diodi, essa è generalmente di +- 2 nm.b) fra 210 e 320 nm, gli spettri del campione e dello standard registrati al vertice della cuspide sul cromatogramma non debbono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 % dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 % dell'assorbanza dello standard dell'analita;c) fra 210 e 320 nm, gli spettri della curva ascendente, del vertice e della curva discendente della cuspide prodotta dall'estratto del campione non debbono essere diversi gli uni dagli altri per le parti dello spettro situate fra il 10 % e il 100 % dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 % dell'assorbanza dello spettro del vertice della cuspide.Se uno di questi criteri non è soddisfatto, la presenza dell'analita non è confermata.7.2. RipetibilitàLa differenza fra i risultati di due determinazioni in parallelo, effettuate sullo stesso campione, non deve superare:- il 30 % rispetto al valore più elevato, per i contenuti di diclazuril compresi fra 0,5 mg/kg e 2,5 mg/kg;- 0,75 mg/kg, per i contenuti di diclazuril compresi fra 2,5 mg/kg e 5 mg/kg;- il 15 % rispetto al valore più elevato, per i contenuti di diclazuril oltre 5 mg/kg.7.3. RecuperoPer un campione addizionato ("bianco"), il recupero non deve essere inferiore all'80 %.8. Risultati di uno studio collaborativoÈ stato organizzato uno studio collaborativo, nel corso del quale 5 campioni sono stati analizzati da 11 laboratori. Questi campioni consistevano di due premiscele; una era mescolata con una matrice organica (O 100) e l'altra con una matrice inorganica (A 100). Il contenuto teorico era di 100 mg diclazuril/kg. I tre mangimi misti per il pollame sono stati preparati da tre diversi produttori (NL) (L1/Z1/K1). Il contenuto teorico era di 1 mg diclazuril/kg. Ai laboratori è stato chiesto di analizzare ciascun campione uno sola volta o in duplicato. (Maggiori informazioni: Journal of AOAC International, Volume 77, n. 6, 1994, p. 1359-1361). I risultati sono riportati nella tabella che segue.>SPAZIO PER TABELLA>L: numero di laboratorin: numero di valori singoliSr: deviazione standard della ripetibilitàCVr: coefficiente di variazione della ripetibilitàSR: deviazione standard della riproducibilitàCVR: coefficiente di variazione della riproducibilità.9. OsservazioniDeve essere dimostrato in precedenza che il responso del diclazuril è lineare in tutto entro il campo di concentrazioni misurate.PARTE CDETERMINAZIONE DEL CARBADOXMetil-3-(2-chinossalinilinmetilene) carbazato-N1,N4-diossido1. Finalità e campo di applicazioneIl presente metodo serve per la determinazione del carbadox negli alimenti per animali, premiscele e preparati. Il limite di rivelazione è di 1 mg/kg. Il limite di determinazione è di 10 mg/kg.2. PrincipioIl campione viene equilibrato con acqua ed estratto con metanolo-acetonitrile. Nel caso degli alimenti, un'aliquota dell'estratto filtrato viene purificata su colonna di ossido di alluminio. Per le premiscele e i preparati, un'aliquota dell'estratto filtrato viene diluita a concentrazione appropriata con acqua, metanolo ed acetonitrile. Il contenuto di carbadox viene determinato per cromatografia in fase liquida ad alte prestazioni, in fase invertita, impiegando un rivelatore UV.3. Reattivi3.1. Metanolo3.2. Acetonitrile, qualità per HPLC3.3. Acido acetico, w = 100 %3.4. Ossido di alluminio: neutro, grado di attività I3.5. Metanolo-acetonitrile 1 + 1 (v + v)Miscelare 500 ml di metanolo (3.l) con 500 ml di acetonitrile (3.2).3.6. Acido acetico, σ = 10 %Diluire con acqua 10 ml di acido acetico (3.3) e portare a 100 ml.3.7. Acetato di sodio, CH3COONa3.8. Acqua, qualità per HPLC3.9. Soluzione tampone all'acetato, c = 0,01 mol/1, pH = 6.0Sciogliere 0,82 grammi di acetato di sodio (3.7) in 700 ml d'acqua (3.8) e regolare il pH a 6,0 con acido acetico (3.6). Trasferire in un matraccio tarato da 1000 ml, portare a volume con acqua (3.8) e mescolare.3.10. Fase mobile per HPLCMescolare 825 ml di soluzione tampone all'acetato (3.9) con 175 ml di acetonitrile (3.2). Filtrare per filtro da 0,22 μm (4.5) e degassare la soluzione (ad esempio trattando ad ultrasuoni per 10 minuti).3.11. Sostanza di riferimento (standard):N1,N4-diossido del metil 3-(2-chinossalinilmetilen) carbazato (carbadox, E 850), di purezza garantita.3.11.1. Soluzione madre di carbadox, 100 μg/ml (cfr. 5, Modo di operare)In un matraccio tarato da 250 ml, pesare 25 mg di carbadox standard con l'approssimazione di 0,1 mg. Sciogliere in metanolo-acetonitrile (3.5) trattando con ultrasuoni (4.7). Dopo il trattamento con ultrasuoni, raffreddare a temperatura ambiente, portare a volume con metanolo-acetonitrile (3.5) e mescolare. Avvolgere il matraccio con foglio d'alluminio od utilizzare vetreria scura e conservare in frigorifero. A temperatura non superiore a 4 °C, questa soluzione si mantiene stabile per un mese3.11.2. Soluzione di taraturaTrasferire 2,0, 5,0, 10,0 e 20,0 ml della soluzione madre (3.11.1) in una serie di matracci tarati da 100 ml. Aggiungere 30 ml d'acqua, portare a volume con metanolo-acetonitrile (3.5) e mescolare. Avvolgere i matracci con foglio d'alluminio. Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 2,0, 5,0, 10,0 e 20,0 μg/ml di carbadox. Le soluzioni di taratura debbono essere preparate estemporaneamente prima dell'uso.Nota:per la determinazione del carbadox negli alimenti contenenti meno di 10 mg/kg si dovranno preparare soluzioni di taratura a concentrazioni inferiori a 2,0 μg/ml.3.12. Miscela acqua [metanolo-acetonitrile] (3.5), 300 + 700 (v + v)Mescolare 300 ml d'acqua con 700 ml della miscela metanolo-acetonitrile (3.5).4. Apparecchiatura4.1. Agitatore da laboratorio o mescolatore magnetico.4.2. Carta da filtro in fibra di vetro (Whatman GF/A od equivalente).4.3. Colonna in vetro (lunghezza: 300-400 mm, diametro interno: 10 mm circa), con setto in vetro sinterizzato e valvola di scarico.Nota:si può anche impiegare una colonna di vetro provvista di rubinetto oppure una colonna di vetro ad estremità affusolata. In questo caso, si deve inserire un piccolo tampone di lana di vetro all'estremità inferiore e pressarlo verso il basso con una bacchetta di vetro.4.4. Apparecchiatura HPLC con sistema di iniezione adeguato a volumi da 20 μl.4.4.1. Colonna per cromatografia in fase liquida: 300 mm x 4 mm, C 18, con riempimento 10 μm o equivalente.4.4.2. Rivelatore UV con regolazione variabile della lunghezza d'onda o rivelatore a serie di diodi, funzionante nell'intervallo 225-400 nm.4.5. Filtro a membrana, 0,22 μm.4.6. Filtro a membrana, 0,45 μm.4.7. Bagno ad ultrasuoni.5. Modo di operareNota:il carbadox è fotosensibile. Effettuare tutte le operazioni in luce attenuata od impiegare vetreria scura od avvolta in foglio d'alluminio.5.1. Generalità5.1.1. "Bianco"Per eseguire la prova di recupero (5.1.2) è necessario disporre di un mangime di riferimento ("bianco"), nel quale dev'essere verificata l'assenza del carbadox e di sostanze capaci di interferire. Il "bianco" deve essere di tipo simile a quello del campione, e la sua analisi non deve evidenziare la presenza di carbadox o di sostanze capaci di interferire.5.1.2. Prova di recuperoDeve essere eseguita una prova di recupero analizzando il "bianco" (5.1.1 ) addizionato di una quantità di carbadox analoga a quella presente nel campione. Per ottenere una concentrazione di 50 mg/kg, introdurre 5,0 ml della soluzione madre (3.11.1) in una beuta da 200 ml. Evaporare la soluzione a 0,5 ml circa, in corrente di azoto. Aggiungere 10 g del "bianco", mescolare ed aspettare 10 minuti prima di passare all'estrazione.Se non fosse disponibile un "bianco" di tipo simile a quello del campione (cfr. 5.1.1), la prova di recupero può essere eseguita col metodo di addizione della sostanza di riferimento. In questo caso, un'aliquota del campione da analizzare viene addizionata di una quantità nota di carbadox, analoga a quella già presente. Quest'aliquota viene analizzata insieme ad una del campione non addizionato, ed il recupero può essere calcolato per differenza.5.2. Estrazione5.2.1. AlimentiPesare 10 gr circa del campione con l'approssimazione di 0,01 g, e trasferirli in una beuta da 200 ml. Aggiungere 15,0 ml d'acqua, mescolare ed equilibrare per 5 minuti. Aggiungere 35,0 ml di metanolo-acetonitrile (3.5), coprire ed agitare per 30 minuti sull'agitatore o col mescolatore magnetico (4.1). Filtrare la soluzione per carta in fibre di vetro (4.2). Conservare questa soluzione per lo stadio della purificazione (5.3).5.2.2. Premiscele (0,1-2,0 %)Pesare 1 g circa del campione non macinato con l'approssimazione di 0,001 g, e trasferirlo in una beuta da 200 ml. Aggiungere 15,0 ml d'acqua, mescolare ed equilibrare per 5 minuti. Aggiungere 35,0 ml di metanolo-acetonitrile (3.5), tappare ed agitare per 30 minuti sull'agitatore o col mescolatore magnetico (4.l). Filtrare la soluzione per carta in fibre di vetro (4.2). Pipettare un'aliquota del filtrato in un matraccio tarato da 50 ml. Aggiungere 15,0 ml d'acqua, portare a volume con metanolo-acetonitrile (3.5) e mescolare. La concentrazione di carbadox nella soluzione finale è circa di 10 μg/ml. Filtrare un'aliquota per filtro da 0,45 μm (4.6). Procedere alla determinazione HPLC (5.4).5.2.3. Preparazioni ( > 2 %)Pesare 0,2 g circa del campione non macinato con l'approssimazione di 0,001 g, e trasferirli in un matraccio da 250 ml. Aggiungere 45,0 ml d'acqua, mescolare ed equilibrare per 5 minuti. Aggiungere 105 ml di metanolo-acetonitrile (3.5), coprire ed omogeneizzare. Sottoporre il campione ad ultrasuoni (4.7) per 15 minuti, poi scuotere od agitare per 15 minuti (4.1). Filtrare la soluzione per carta da filtro in fibre di vetro (4.2). Diluire un'aliquota del filtrato con la miscela acqua-metanolo-acetonitrile (3.12), fino a una concentrazione finale di carbadox dell'ordine di 10-15 μg/ml (per una preparazione al 10 %, il fattore di diluizione è 10). Filtrare un'aliquota per filtro da 0,45 μm (4.6). Procedere alla determinazione HPLC (5.4).5.3. Purificazione5.3.1. Preparazione della colonna di ossido di alluminioPesare 4 g di ossido di alluminio (3.4) e trasferire nella colonna di vetro (4.3).5.3.2. Purificazione del campioneFar passare 15 ml-dell'estratto filtrato (5.2.1) per la colonna di ossido di alluminio ed eliminare i primi due ml di eluato. Raccogliere i successivi 5 ml e filtrare un'aliquota per filtro da 0,45 μm (4.6). Procedere alla determinazione HPLC (5.4).5.4. Determinazione HPLC5.4.1. ParametriLe seguenti condizioni vengono proposte a titolo di orientamento; è possibile operare in condizioni diverse, purché si ottengano risultati equivalenti.>SPAZIO PER TABELLA>Verificare la stabilità del sistema cromatografico iniettando più volte la soluzione di taratura (3.11.2) contenente 5,0 μg/ml, fino a costanza delle altezze (delle superfici) delle cuspidi e dei tempi di ritenzione.5.4.2. Curva di taraturaIniettare più volte ciascuna soluzione di taratura (3.11.2) e determinare le altezze (le superfici) delle cuspidi per ciascuna concentrazione. Tracciare una curva di taratura riportando in ordinata le altezze (le superfici) medie delle cuspidi della soluzione di taratura e in ascissa le corrispondenti concentrazioni, espresse in μg/ml.5.4.3. Soluzione del campioneIniettare più volte l'estratto del campione [(5.3.2) per gli alimenti, (5.2.2) per le premiscele e (5.2.3) per i preparati], e determinare l'altezza (la superficie) media delle cuspidi del carbadox.6. Calcolo dei risultatiPartendo dall'altezza (dalla superficie) media delle cuspidi del carbadox nella soluzione del campione, determinare la concentrazione di tale soluzione in μg/ml riportandosi alla curva di taratura (5.4.2).6.1. AlimentiIl contenuto w (mg/kg) di carbadox nel campione è dato dalla seguente formula:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>[mg/kg]dove:β= concentrazione di carbadox nell'estratto del campione, (5.3.2) μg/kg;V1= volume di estrazione in ml (cioè 50);m= massa dell'aliquota analizzata in g.6.2. Premiscele e preparatiIl contenuto w (mg/kg) di carbadox nel campione è dato dalla seguente formula:>RIFERIMENTO A UN GRAFICO>[mg/kg]dove:β= concentrazione di carbadox nell'estratto del campione, (5.3.2) μg/kg;V2= volume di estrazione in ml (cioè 50 per le premiscele, 150 per i preparati);f= fattore di diluizione secondo 5.2.2 (premiscele) o 5.2.3 (preparati);m= massa dell'aliquota analizzata in g.7. Convalida dei risultati7.1. L'identità dell'analita può essere confermata mediante co-cromatografia, oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confrontare gli spettri dell'estratto del campione e della soluzione di taratura (3.11.2) contenente 10,0 μg/ml.7.1.1. Co-cromatografiaAll'estratto del campione si aggiunge un quantitativo adeguato della soluzione di taratura (3.11.2). Il quantitativo di carbadox aggiunto deve essere analogo a quello di cui è valutata la presenza nell'estratto del campione.Deve essere aumentata soltanto l'altezza della cuspide del carbadox, tenendo conto del quantitativo aggiunto e della diluizione dell'estratto. L'ampiezza della cuspide, a metà della sua altezza massima, deve rientrare nel 10 % circa dell'ampiezza originale.7.1.2. Rivelatore a serie di diodiI risultati vengono valutati secondo i criteri che seguono:a) La lunghezza d'onda di assorbimento massimo degli spettri del campione dello standard, registrata al vertice della cuspide sul cromatogramma, deve essere la stessa entro un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione. Per la rivelazione mediante serie di diodi, essa è generalmente di +- 2 nm.b) Fra 225 e 400 nm, gli spettri del campione e dello standard registrati al vertice della cuspide sul cromatogramma non debbono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 % e il 100 % dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in nessun caso lo scarto osservato fra gli spettri supera il 15 % della densità ottica dello spettro della sommità del picco.c) Tra 225 e 400 nm, gli spettri della curva ascendente, del vertice della curva discendente della cuspide prodotta dall'estratto del campione non debbono essere diversi fra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 % dell'assorbanza relativa. Questo criterio è soddisfatto quando gli stessi massimi sono presenti e quando in tutti i punti osservati la deviazione fra gli spettri non superi il 15 % dell'assorbanza dello spettro al vertice.Se uno di questi criteri non è soddisfatto, la presenza dell'analita non è confermata.7.2. RipetibilitàPer contenuti di 10 mg/kg e superiori, la differenza fra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo stesso campione non deve superare il 15 % rispetto al risultato più alto.7.3. RecuperoPer un campione addizionato (bianco), il recupero non deve essere inferiore al 90 %.8. Risultati di uno studio collaborativoÈ stato organizzato uno studio collaborativo nel quale 8 laboratori hanno analizzato 6 alimenti, 4 premiscele e 3 preparati. Su ciascun campione sono state eseguite analisi in doppio. (Per maggiori informazioni: Journal of the AOAC, Volume 71, 1998, pag. 484-490). I risultati (ad esclusione di quelli fuori campo) sono mostrati qui appresso:L: numero di laboratorin: numero di valori singolisr: deviazione standard della ripetibilitàCVr: coefficiente di variazione della ripetibilitàSR: deviazione standard della riproducibilitàCVR: coefficiente di variazione della riproducibilità.>SPAZIO PER TABELLA>>SPAZIO PER TABELLA>