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32000L0033

Direttiva 2000/33/CE della Commissione, del 25 aprile 2000, recante ventisettesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva 67/548/CEE del Consiglio concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative relative alla classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura delle sostanze pericolose (Testo rilevante ai fini del SEE.)

Gazzetta ufficiale n. L 136 del 08/06/2000 pag. 0090 - 0107

Direttiva 2000/33/CE della Commissionedel 25 aprile 2000recante ventisettesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva 67/548/CEE del Consiglio concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative relative alla classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura delle sostanze pericolose(1)(Testo rilevante ai fini del SEE)LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,visto il trattato che istituisce la Comunità europea,vista la direttiva 67/548/CEE del Consiglio, del 27 giugno 1967, concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative relative alla classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura delle sostanze pericolose(2), modificata da ultimo dalla direttiva 1999/33/CE(3) del Parlamento europeo e del Consiglio, in particolare l'articolo 28,considerando quanto segue:(1) L'allegato V della direttiva 67/548/CEE definisce i metodi di determinazione delle proprietà fisico-chimiche, della tossicità ed ecotossicità di sostanze e preparati. È necessario adeguare al progresso tecnico tale allegato.(2) L'articolo 7, paragrafo 2, della direttiva 86/609/CEE(4) concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative degli Stati membri relative alla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici stabilisce che si eviterà di eseguire un esperimento qualora per ottenere il risultato ricercato sia ragionevolmente e praticamente applicabile un altro metodo, scientificamente valido, che non implichi l'impiego di animali.(3) La Commissione intende introdurre all'allegato V della direttiva 67/548/CEE metodi di prova alternativi che non comportino l'impiego di animali per la sperimentazione di sostanze chimiche ai sensi dell'articolo 3, paragrafo 1, della direttiva 67/548/CEE.(4) Il disposto della presente direttiva è conforme al parere del comitato per l'adeguamento al progresso tecnico delle direttive volte all'eliminazione degli ostacoli tecnici agli scambi nel settore delle sostanze e dei preparati pericolosi,HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:Articolo 1I testi degli allegati I e II della presente direttiva sono aggiunti all'allegato V, parte B, della direttiva 67/548/CEE.Articolo 21. Gli Stati membri attuano le disposizioni legislative, regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva entro il 1o ottobre 2001. Essi ne informano immediatamente la Commissione.Quando gli Stati membri adottano tali disposizioni, queste contengono un riferimento alla presente direttiva o sono corredate di un siffatto riferimento all'atto della pubblicazione ufficiale. Le modalità del riferimento sono decise dagli Stati membri.2. Gli Stati membri informano la Commissione delle principali disposizioni nazionali che essi adottano nel settore disciplinato dalla presente direttiva e trasmettono una tabella che indichi le correlazioni tra la presente direttiva e tali disposizioni.Articolo 3La presente direttiva entra in vigore il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.Articolo 4Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.Fatto a Bruxelles, il 25 aprile 2000.Per la CommissioneMargot WallströmMembro della Commissione(1) Adottata prima del ventiseiesimo adeguamento.(2) GU 196 del 16.8.1967, pag. 1.(3) GU L 199 del 30.7.1999, pag. 57.(4) GU L 358 del 18.12.1986, pag. 1.ALLEGATO I"B.40. CORROSIONE CUTANEA1. METODO1.1. IntroduzioneIl Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi (CECMA) del Centro comune di ricerca della Commissione europea ha confermato la validità scientifica di due saggi in vitro per determinare la corrosività cutanea di determinate sostanze. Trattasi del saggio di resistenza elettrica transcutanea della pelle di ratto (TER, transcutaneous electrical resistance) e di un saggio che utilizza un modello di cute umana (1) (2) (3). Lo studio di convalida del CECMA ha dimostrato che entrambi i metodi consentono di distinguere adeguatamente le sostanze che notoriamente sono corrosive per la pelle da quelle non corrosive. Inoltre, il protocollo del saggio che utilizza un modello di cute umana consente di distinguere i diversi gradi degli effetti corrosivi (agenti noti per essere estremamente corrosivi, R35 e altri agenti corrosivi, R34) (2). Di entrambi i saggi sono fornite la descrizione e le procedure. La scelta del saggio da utilizzare è dettata dai requisiti specifici e dalle preferenze dell'utilizzatore.Cfr. anche la parte B nell'introduzione generale.1.2. Definizionicorrosione cutanea: produzione di danni irreversibili al tessuto cutaneo a seguito dell'applicazione di un materiale da saggiare.1.3. Sostanze di riferimentoNessuna specifica, ma cfr. i punti 1.5.3.4 e 1.7.2.3.1.4. Principio del metodo di saggio - Saggio di resistenza elettrica transcutanea della pelle di rattoIl materiale di saggio è applicato per un massimo di 24 ore alle superfici epidermiche di lembi di cute di forma circolare (dischi) ottenuti dal mantello di giovani ratti sacrificati in maniera non cruenta. I materiali corrosivi sono identificati in base alla loro capacità di intaccare la normale integrità dello strato corneo e della sua funzione protettiva in termini di riduzione della normale resistenza elettrica transcutanea (TER) al di sotto di un determinato livello soglia (5 kΩ) (4) (5). I materiali irritanti e non irritanti non riducono la TER al di sotto del livello soglia. Il saggio può comprendere anche una valutazione della capacità di legame con colorante per saggiare i surfactanti e le sostanze organiche neutre [per una definizione cfr. la voce bibliografica (6)] allo scopo di ridurre il numero dei risultati di falso positivo ottenuti specificatamente con questi tipi di sostanze chimiche (2) (7).1.5. Descrizione del metodo di saggio - Saggio di resistenza elettrica transcutanea della pelle di ratto1.5.1. AnimaliPer la preparazione dei dischi cutanei vengono utilizzati giovani ratti (ratti Wistar o un ceppo equivalente di 20-23 giorni). Con un'apposita tosatrice viene rimosso il pelo della parte dorsale e laterale dell'animale. L'animale viene quindi accuratamente strofinato e lavato lungo il dorso e i fianchi tenendo la parte tosata immersa in una soluzione antibiotica (contenente per esempio streptomicina, penicillina, cloramfenicolo e anfotericina in concentrazioni tali da inibire la proliferazione dei batteri). Dopo 3-4 giorni si procede ad un ulteriore lavaggio con antibiotici. Gli animali così trattati devono essere utilizzati entro tre giorni al massimo (per la produzione dei preparati cutanei gli animali non devono aver superato il 31o giorno di vita).1.5.2. Preparazione dei lembi cutaneiGli animali vengono sacrificati con un metodo non cruento. Si procede quindi alla rimozione della parte dorsale della cute e all'accurata eliminazione di tutto il grasso in eccesso. Il lembo cutaneo così ottenuto viene posizionato sull'estremità di una provetta in PTFE (politetrafluoroetilene) in modo che la superficie epidermica sia a contatto con la provetta, viene quindi fissato all'estremità della provetta mediante una ghiera inserita a pressione ed infine vengono eliminati gli orli di pelle debordante. La figura 1 indica le dimensioni della provetta e della ghiera. Infine la ghiera viene accuratamente saldata all'estremità della provetta mediante gelatina di petrolio. La provetta viene fissata mediante una pinza a molla e quindi introdotta in un recipiente contenente una soluzione di magnesio solfato (154mM) (figura 2).1.5.3. Procedura1.5.3.1. Applicazione del materiale di saggioLe sostanze da saggiare in forma liquida (150µl) vengono applicate alla superficie epidermica all'interno della provetta (figura 2). Per il saggio di materiali solidi la sostanza è applicata in quantità sufficiente al disco cutaneo in modo da coprire l'intera superficie dell'epidermide. Si aggiunge acqua deionizzata (150µl) sulla parte superiore del materiale solido ed infine si agita lievemente la provetta. Le sostanze da saggiare dovrebbero entrare in contatto con la cute il più possibile. A tale scopo, nel caso di alcuni materiali solidi occorre procedere a fusione della sostanza da saggiare innalzando la temperatura ad un massimo di 30 °C, oppure macinando la sostanza fino a produrne un granulato o una polvere.Per ciascuna sostanza da saggiare vengono utilizzati tre dischi cutanei. L'applicazione dura 24 ore (cfr. anche 1.5.3.4). La sostanza viene quindi completamente rimossa mediante lavaggio sotto un getto di acqua corrente ad una temperatura di 30 °C al massimo. Per facilitare l'eliminazione delle sostanze da saggiare che si sono solidificate all'interno della provetta si procede a lavaggio sotto acqua corrente a 30 °C circa.1.5.3.2. Misurazione della TERLa TER viene misurata utilizzando un ponte dati a corrente alternata a basso voltaggio (ad esempio AIM 401 oppure 6401 o equivalente). Prima di misurare la resistenza elettrica viene ridotta la tensione di superficie della cute aggiungendo etanolo al 70 % in quantità tale da coprire l'intera epidermide. Dopo alcuni secondi si procede alla rimozione dell'etanolo mediante inversione della provetta e in seguito all'idratazione del tessuto per mezzo di una soluzione di 3ml di magnesio solfato (154mM). Per misurare la resistenza in kΩ/disco si posizionano gli elettrodi del ponte dati su entrambi i lati del disco (figura 2). La figura 1 mostra le dimensioni degli elettrodi e la lunghezza della parte dell'elettrodo che rimane al di sotto delle pinze a coccodrillo. Nel corso della misurazione la molletta di fissaggio dell'elettrodo interno (il più spesso) viene collocata sull'estremità superiore della provetta affinché una buona parte dell'elettrodo rimanga immersa nella soluzione di magnesio solfato. L'elettrodo esterno (più sottile) è collocato all'interno del recipiente in modo tale che rimanga sul fondo. La distanza tra il lato inferiore della molletta di fissaggio e il fondo della provetta deve essere mantenuta costante (figura 1) poiché influisce sui valori della resistenza elettrica.Va osservato che qualora il valore di resistenza superi i 20 kΩ, ciò potrebbe dipendere dal fatto che la sostanza ha formato un manto di rivestimento sulla superficie epidermica del disco cutaneo. Il rivestimento può essere rimosso ad esempio sigillando la provetta col pollice rivestito da un guanto e scuotendola per circa 10 secondi. Si procede dunque all'eliminazione della soluzione di magnesio solfato e si ripete la misurazione della resistenza con una nuova soluzione.La media dei risultati dei valori riferiti alla TER viene accettata a condizione che i valori concomitanti positivi e negativi rientrino nel margine (range) accettabile per il metodo. Le sostanze di controllo da saggiare e i relativi valori minimi e massimi di resistenza accettabili per il metodo e le apparecchiature descritte sono i seguenti:>SPAZIO PER TABELLA>1.5.3.3. Procedura specifica per tensioattivi e sostanze organiche neutreSe i valori della TER di sostanze di saggio che rientrano nelle categorie dei tensioattivi o delle sostanze organiche neutre sono inferiori o pari a 5 kΩ, si può procedere ad una valutazione della penetrazione del colorante nel tessuto. Tale procedura consente di stabilire se si tratta di risultati falso positivi (2).1.5.3.3.1. Applicazione e rimozione del colorante solforodamina BDopo il trattamento iniziale con la sostanza di saggio viene applicata alla superficie dell'epidermide di ciascun disco cutaneo una soluzione di 150 µl al 10 % (p/v) di solforodamina B diluita in acqua distillata per un periodo di 2 ore. I dischi cutanei vengono quindi lavati sotto un getto di acqua corrente a temperatura ambiente per circa 10 secondi al fine di eliminare completamente il colorante. Ogni disco cutaneo viene quindi rimosso cautamente dalla provetta e collocato in una fiala (ad esempio una fiala di scintillazione in vetro da 20 ml) contenente acqua deionizzata (8 ml). Le fiale vengono poi agitate leggermente per 5 minuti per eliminare completamente il colorante. Questa procedura di risciacquo viene ripetuta per procedere quindi alla rimozione dei dischi cutanei che vengono successivamente collocati in fiale contenenti 5 ml di una sostanza al 30 % (p/v) di sodio dodecil solfato (SDS) diluita in acqua distillata. Le fiale vengono quindi incubate per tutta la notte ad una temperatura di 60 °C. Dopo il periodo di incubazione ogni singolo disco cutaneo viene rimosso ed eliminato e la soluzione rimanente viene quindi centrifugata per 8 minuti ad una temperatura di 21 °C (forza centrifuga relativa [sim     ] 175). Si preleva quindi un campione di 1 ml del supernatante che viene diluito in parte 1 a 5 (p/v) [ovvero 1 ml + 4 ml] in una soluzione di SDS al 30 % (p/v) in acqua distillata. La densità ottica (DO) della soluzione viene misurata a circa 565 nm.1.5.3.3.2. Calcolo del tenore del colorantePer ogni disco cutaneo si calcola il tenore del colorante solforodamina B in base ai valori della DO (coefficiente di estinzione molare della solforodamina B a 565 nm = 8,7 × 104; peso molecolare = 580). Per ciascun disco cutaneo si stabilisce il tenore del colorante e si calcola la media del tenore per i replicati. I valori medi della colorazione sono accettati a condizione che i valori di controllo concomitanti rientrino nel range accettabile per il metodo. Il range del tenore del colorante ritenuto accettabile per le sostanze di controllo in base alla metodologia e alle apparecchiature descritte sono:>SPAZIO PER TABELLA>1.5.3.4. Ulteriori datiLe sostanze da saggiare possono essere applicate ai dischi cutanei anche per periodi più brevi (ad esempio 2 ore) per identificare i materiali che sono estremamente corrosivi. Tuttavia nello studio di convalida è emerso che il saggio TER stimava in eccesso il potenziale corrosivo di una serie di sostanze chimiche da saggiare applicate ai dischi cutanei per 2 ore (2), sebbene consentisse di identificare correttamente le sostanze corrosive e quelle non corrosive dopo un'applicazione di 24 ore.Le proprietà e le dimensioni delle apparecchiature e della procedura sperimentale utilizzata possono influire sui valori TER. La soglia di corrosività di 5 kΩ è stata stabilita sulla base di dati ottenuti con le apparecchiature specifiche e le procedure descritte nel presente metodo. Se le condizioni di saggio vengono modificate in maniera significativa è probabile che si debbano applicare soglie e valori di controllo diversi. Di conseguenza si raccomanda di calibrare la metodologia e i valori soglia di resistenza saggiando una serie di sostanze standard di riferimento scelte tra quelle utilizzate nel primo studio di convalida (3).1.6. Principio del metodo di saggio - Saggio del modello di cute umanaIl materiale da saggiare viene applicato localmente ad un modello tridimensionale di cute umana per un massimo di 4 ore; tale modello comprende uno strato epidermico ricostruito in cui è presente anche uno strato corneo funzionale. I materiali corrosivi vengono identificati in base alla loro capacità di ridurre la vitalità delle cellule (ad esempio come nel caso del saggio di riduzione MTT) al di sotto di determinati livelli soglia per periodi di esposizione specifici. Il principio del saggio è basato sull'ipotesi che le sostanze chimiche corrosive sono in grado di penetrare lo strato corneo (per diffusione o erosione) e che la loro citotossicità è tale da provocare la necrosi degli strati cellulari sottostanti.1.7. Descrizione del metodo di saggio - Saggio del modello di cute umana1.7.1. Modelli di cute umanaI modelli di cute umana possono provenire da varie fonti, ma devono comunque soddisfare determinati criteri. Il modello di cute deve avere uno strato corneo funzionale e uno strato sottostante di cellule viventi. Lo strato corneo deve essere in grado di svolgere la sua funzione di barriera in modo adeguato. La sua funzionalità può essere appurata dimostrando la capacità di resistenza del modello di cute alla citotossicità mediante applicazione di sostanze notoriamente citotossiche per le cellule ma normalmente non in grado di attraversare la barriera dello strato corneo. Il modello deve poter fornire risultati riproducibili in condizioni sperimentali ben definite.La vitalità delle cellule viventi nel modello cutaneo deve esser tale da consentire un'adeguata discriminazione tra le sostanze di controllo positive e negative. La vitalità cellulare (ad esempio misurata mediante la quantità di riduzione MTT, ovvero un valore della DO) dopo esposizione ad una sostanza di controllo negativa deve rientrare in limiti accettabili per il modello specificatamente utilizzato. Analogamente i valori della vitalità cellulare in riferimento alla sostanza di controllo positiva (correlati a quelli della sostanza di controllo negativa) devono rientrare in limiti specifici. È essenziale che il modello predittivo utilizzato rispetti gli standard di convalida internazionali (2).1.7.2. Procedura1.7.2.1. Applicazione del materiale di saggioNei saggi di materiali liquidi occorre applicare la sostanza da saggiare in quantità tale da coprire la superficie cutanea (almeno 25 µl/cm2). Nei saggi di materiali solidi si applica la sostanza da saggiare in quantità sufficiente da coprire la cute, quindi la si inumidisce per garantire un contatto ottimale con la cute. Eventualmente le sostanze solide devono essere polverizzate prima dell'applicazione. Il metodo di applicazione deve risultare adeguato per un'ampia gamma di tipi di sostanze chimiche (2). Al termine del periodo di esposizione il materiale da saggiare deve essere accuratamente rimosso dalla superficie cutanea mediante una soluzione salina.1.7.2.2. Misurazione della vitalità cellularePer misurare la vitalità cellulare è possibile utilizzare qualsiasi metodo quantitativo convalidato. Il saggio generalmente più utilizzato è la riduzione MTT che in numerosi laboratori ha fornito risultati accurati e riproducibili (2). Il disco di cute viene collocato in una soluzione MTT di 0,3 mg/ml ad una temperatura di 20-28 °C per 3 ore. Viene quindi estratto il prodotto precipitato blu formazan (estrazione per solvente) e misurata la concentrazione del formazan determinando la DO ad una lunghezza d'onda compresa fra 545 e 595 nm.1.7.2.3. Ulteriori datiIl modello cutaneo utilizzato e il protocollo preciso dei tempi di esposizione e delle procedure di lavaggio, ecc. incidono notevolmente sui dati della vitalità cellulare. Si raccomanda pertanto di calibrare la metodologia e il modello predittivo mediante analisi di una serie di standard scelti tra una gamma di sostanze chimiche utilizzate nello studio di convalida del CECMA (3). Il metodo utilizzato deve risultare riproducibile sia all'interno di un laboratorio che tra laboratori per numerose sostanze chimiche in base a standard internazionali. Come minimo il metodo dovrebbe soddisfare il criterio della validità scientifica definito in precedenza (2) e i risultati dello studio di convalida devono essere stati pubblicati in una rivista scientifica dotata di comitato di revisione.2. DATI2.1. Elaborazione dei risultati2.1.1. Saggio TER della pelle di rattoI valori della resistenza (kΩ) del materiale di saggio, i controlli positivi e negativi e tutte le sostanze chimiche standard di riferimento dovrebbero essere riportati in una tabella contenente i dati relativi agli esperimenti di replicazione/ripetizione, i valori medi e le classificazioni ottenute.2.1.2. Saggio del modello di cute umanaI valori della DO e i dati sulla vitalità cellulare calcolati in percentuale e relativi al materiale di saggio, i controlli positivi e negativi e tutte le sostanze chimiche standard di riferimento dovrebbero essere riportati in una tabella contenente i dati relativi agli esperimenti di replicazione/ripetizione, i valori medi e le classificazioni ottenute.2.2. Valutazione e interpretazione dei risultati2.2.1. Saggio TER della pelle di rattoSe il valore medio della TER ottenuto per la sostanza di saggio supera i 5 kΩ, la sostanza non è corrosiva. Se tale valore è inferiore o pari a 5 kΩ e la sostanza da saggiare non è un surfactante o un organico neutro allora è corrosiva.Per i surfactanti o le sostanze organiche neutre i cui valori TER sono inferiori o pari a 5 kΩ è possibile procedere ad una valutazione della penetrazione del colorante. Se il tenore medio del colorante sul disco cutaneo è superiore o pari al valore medio del tenore del colorante riferito alla sostanza di controllo positiva al 36 % di HCl ottenuto in concomitanza, allora la sostanza di saggio è un vero positivo ed è dunque corrosiva. Se il tenore medio è inferiore al tenore medio della sostanza di controllo positiva al 36 % di HCl ottenuta in concomitanza, allora la sostanza di saggio è un falso positivo e non è corrosiva.2.2.2. Saggio del modello di cute umanaIl valore della DO del controllo negativo rappresenta il 100 % della vitalità cellulare, di conseguenza i valori DO ottenuti per ciascun campione da saggiare possono essere utilizzati per calcolare una percentuale di vitalità del controllo negativo. La percentuale critica della vitalità cellulare che differenzia i materiali di saggio corrosivi da quelli non corrosivi (o che distingue tra diverse classi di corrosività) deve essere chiaramente definita nel modello predittivo prima della convalida del metodo e il successivo studio di convalida deve dimostrare che tale valore critico è adeguato (cfr. riferimento bibliografico 2).3. RELAZIONERelazione sul saggioLa relazione concernente l'intero saggio deve contenere almeno le seguenti informazioni:Sostanza di saggio:- dati inerenti l'identificazione, la natura fisica ed eventualmente le proprietà fisico-chimiche. Questi dati dovrebbero essere forniti anche per le sostanze di riferimento, se utilizzate.Condizioni di saggio:- descrizione dettagliata della procedura utilizzata;- descrizione e motivazione di eventuali modifiche.Risultati:- presentazione in forma tabulare dei valori della resistenza (saggio TER) o dei valori della vitalità cellulare (saggio del modello di cute umana) espressi in percentuale per il materiale di saggio, i controlli positivi e negativi e qualsiasi altra sostanza chimica standard di riferimento, inclusi i dati relativi agli esperimenti di replicazione/ripetizione e le medie;- descrizione di qualunque altro effetto osservato.Discussione dei risultatiConclusioni4. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI(1) ECVAM (1998), ECVAM News &  Views, ATLA 26, pagg. 275-280.(2) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H-G. &  Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, pagg. 483-524.(3) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P. &  Worth, A.P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, pagg. 471-482.(4) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A. &  Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test - modifications and validation, Food &  Chemical Toxicology 24, pagg. 507-512.(5) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J. &  Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, pagg. 191-194.(6) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J. &  Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, pagg. 709-720.(7) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P. &  Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, pagg. 219-255.Figura 1>PIC FILE= "L_2000136IT.009601.TIF">Figura 2>PIC FILE= "L_2000136IT.009701.TIF">"ALLEGATO II"B.41. FOTOTOSSICITÀ - SAGGIO DI FOTOTOSSICITÀ IN VITRO 3T3 NRU1. METODO1.1. IntroduzionePer fototossicità si intende la risposta tossica che si manifesta dopo esposizione primaria della cute ad alcune sostanze chimiche e successiva esposizione alla luce, o che è indotta analogamente da irradiazione della cute dopo somministrazione sistemica di una sostanza chimica.I dati ottenuti mediante il saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU consentono di identificare il potenziale fototossico di una sostanza di prova, e cioè la presenza o l'assenza di eventuali rischi connessi alla sostanza di prova in associazione ad esposizione ai raggi UV e alla luce visibile.Poiché l''endpoint' tossicologico del saggio in vitro è la determinazione della fotocitotossicità indotta dall'azione combinata di una sostanza chimica e della luce, il saggio permette di identificare i composti che sono fototossici in vivo dopo applicazione sistemica e distribuzione sulla cute e i composti con effetto fotoirritante dopo applicazione locale alla cute.Il saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU è stato sviluppato e validato nell'ambito di un progetto congiunto UE/COLIPA durante il periodo 1992-1997 (1) (2) (3), allo scopo di definire una valida alternativa in vitro ai vari saggi in vivo normalmente utilizzati. Nel 1996 un workshop dell'OCSE ha raccomandato l'uso di saggio sequenziali in vitro per la valutazione della fototossicità (4).I risultati del saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU sono stati confrontati con gli effetti di fototossicità acuta/fotoirritazione in vivo in animali e soggetti umani, dimostrando così l'eccellente predittività del saggio per tali effetti. Il saggio non è progettato per prevedere altri effetti indesiderati che potrebbero derivare dall'azione combinata di una sostanza chimica e della luce, come ad esempio la fotogenotossicità, la fotoallergia e la fotocarcinogenicità, sebbene molte sostanze chimiche che presentano queste specifiche proprietà reagiscano positivamente al saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU. Inoltre, il saggio non è progettato per consentire una valutazione del potere fototossico.Nell'appendice è descritto un sistema sequenziale per l'esecuzione di prove di fototossicità su sostanze chimiche.1.2. DefinizioniIrradiamento: l'intensità della luce ultravioletta (UV) o visibile incidente su una superficie, misurata in W/m2 o mW/cm2.Dose di luce: la quantità (= intensità × tempo) di radiazione ultravioletta (UV) o visibile incidente su una superficie, espressa in joule (= W × s) per area di superficie, ovvero J/m2 o J/cm2.Bande di frequenza d'onda della luce UV: i valori raccomandati dalla CIE (Commission Internationale de l'Éclairage) sono: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) e UVC (100-280 nm). Sono in uso, inoltre, altri valori: spesso la distinzione fra UVB e UVA viene posta a 320 nm e gli UVA possono essere suddivisi in UV-A1 e UV-A2, con una distinzione posta a circa 340 nm.Vitalità cellulare: parametro che misura l'attività totale di una popolazione di cellule (ad esempio la captazione del colorante vitale rosso neutro nei lisosomi cellulari) che, in funzione dell''endpoint' misurato e del tipo di saggio impiegato, è correlato al numero totale e/o alla vitalità delle cellule.Vitalità cellulare relativa: vitalità cellulare espressa in relazione a controlli negativi (solventi) che sono stati sottoposti al saggio completo (+ UV o - UV) senza trattamento con una sostanza chimica di prova.Modello di predittività: algoritmo impiegato per trasformare i risultati di un saggio di tossicità in dati predittivi del potenziale tossico. In base alle linee guida per l'esecuzione del saggio è possibile utilizzare il PIF e l'MPE per la trasformazione dei risultati del saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU in dati predittivi del potenziale fototossico.PIF (Photo Irritation Factor): fattore ottenuto paragonando due concentrazioni di pari citotossicità (EC50) della sostanza chimica di prova in assenza (- UV) e in presenza (+ UV) di una irradiazione non citotossica con luce UVA/visibile.MPE (Mean Photo Effect): recente misura derivata dall'analisi matematica della forma completa di due curve di concentrazione-risposta ottenuta in assenza (- UV) e in presenza (+ UV) di una irradiazione non citotossica con luce UVA/visibile.Fototossicità: risposta tossica acuta che si manifesta dopo esposizione primaria della cute ad alcune sostanze chimiche e successiva esposizione alla luce, o che è indotta analogamente da irradiazione della cute dopo somministrazione sistemica di una sostanza chimica.Fotoirritazione: sottospecie del termine 'fototossicità' impiegato per descrivere solo le reazioni fototossiche prodotte sulla cute dopo esposizione a sostanze chimiche (somministrate per via topica o orale). Tali reazioni fototossiche causano sempre danni cellulari non specifici (reazioni analoghe all'eritema solare).Fotoallergia: reattività immunologica acquisita che non si verifica al primo trattamento con una sostanza chimica e successiva esposizione alla luce, ma che necessita di un periodo di induzione di una o due settimane prima che sia possibile dimostrare la reattività cutanea.Fotogenotossicità: risposta genotossica osservata con un 'endpoint' genetico, che si manifesta dopo esposizione delle cellule a una dose di luce UV/visibile e a una sostanza chimica non genotossica.Fotocarcinogenicità: carcinogenicità indotta dalla ripetuta applicazione di luce e di una sostanza chimica. Si utilizza il termine 'foto-co-carcinogenesi' quando la cancerogenesi indotta dagli UV viene aumentata da una sostanza chimica.1.3. Sostanze di riferimentoOltre alla sostanza chimica di controllo positivo clorpromazina, che andrebbe saggiata simultaneamente in tutti i saggi, per effettuare il saggio di fototossicità 3T3 NRU si raccomanda di impiegare come sostanze chimiche di riferimento un sottogruppo delle sostanze utilizzate nelle analisi interlaboratorio per il presente saggio (1) (3) (13).1.4. Considerazioni inizialiÈ noto che molti tipi di sostanze chimiche inducono effetti fototossici (5) (6) (7) (8). L'unica caratteristica che hanno in comune è la capacità di assorbire l'energia luminosa nello spettro della luce solare. In base alla prima legge della fotochimica (legge di Grotthaus-Draper), la fotoreazione richiede un assorbimento sufficiente di quanti di luce. Pertanto, prima di effettuare la prova biologica in base alle linee guida qui descritte, è necessario determinare uno spettro di assorbimento della luce UV/visibile per la sostanza chimica di prova (ad esempio, in base alle linee guida dell'OCSE: OECD Test Guideline 101). Se il coefficiente di estinzione/assorbimento molare è inferiore a 10 litri × mol-1 × cm-1, la sostanza chimica non ha alcun potenziale fotoreattivo e non occorre sottoporla al saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU, né ad altre prove biologiche atte a determinare effetti fotochimici indesiderati (appendice).1.5. Principio del metodo utilizzatoSono stati identificati quattro meccanismi in base ai quali l'assorbimento della luce da parte di un cromoforo (chimico) può provocare una risposta fototossica (7). Tutti e quattro i meccanismi provocano lesioni cellulari. Pertanto, il saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU è basato sul confronto della citotossicità di una sostanza chimica saggiata con e senza esposizione a una dose non citotossica di luce UVA/visibile. In questo saggio, la citotossicità viene espressa come riduzione, dipendente dalla concentrazione, della captazione del colorante vitale rosso neutro [NR, (9)] 24 ore dopo il trattamento con la sostanza chimica di prova e l'irradiazione.Dapprima si preparano cellule Balb/c 3T3 che vengono mantenute in coltura per 24 ore per permettere la formazione di monostrati. Quindi, per ogni sostanza chimica di prova, vengono preincubate due piastre a 96 pozzetti con otto diverse concentrazioni della sostanza chimica per 1 ora. Una delle due piastre viene poi esposta a una dose non citotossica di luce UVA/visibile di 5 J/cm2 UVA (esperimento + UV), mentre l'altra piastra viene mantenuta nell'oscurità (esperimento - UV). In entrambe le piastre, il terreno di trattamento viene poi sostituito con il terreno di coltura e, dopo altre 24 ore di incubazione, si determina la vitalità cellulare tramite captazione del rosso neutro (Neutral Red Uptake, NRU) per 3 ore. Per ognuna delle otto concentrazioni di prova viene dunque calcolata la vitalità cellulare relativa, espressa come percentuale dei controlli negativi non trattati. Per prevedere il potenziale fototossico vengono confrontate le risposte di concentrazione ottenute in presenza (+ UV) e in assenza (- UV) di irradiazione, generalmente al livello EC50, cioè alla concentrazione che inibisce la vitalità cellulare del 50 % rispetto ai controlli non trattati.1.6. Criteri di qualitàSensibilità delle cellule agli UVA; dati storici: Ad intervalli regolari occorre controllare la sensibilità delle cellule agli UVA. Le cellule vengono seminate alla stessa densità utilizzata nel saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU; il giorno successivo vengono irradiate con dosi di UVA da 1 a 9 J/cm2, e il giorno ancora successivo si determina la vitalità cellulare tramite saggio di NRU. Le cellule soddisfano i requisiti di qualità se la loro vitalità, dopo irradiazione con 5 J/cm2 di UVA, non è inferiore all'80 % della vitalità dei controlli mantenuti nell'oscurità. Alla dose massima di UVA (9 J/cm2), la vitalità non deve essere inferiore al 50 % rispetto a quella dei controlli mantenuti nell'oscurità. Questo controllo va ripetuto all'incirca ogni dieci passaggi di cellule.Sensibilità agli UVA delle cellule di controllo negativo; saggio in oggetto: Il saggio soddisfa i criteri di qualità se i controlli negativi [cellule in soluzione salina isotonica di Earl (EBSS) con o senza l'1 % di dimetilsolfossido (DMSO) o l'1 % di etanolo (EtOH) nell'esperimento + UVA] mostrano una vitalità non inferiore all'80 % di quella delle cellule non irradiate nello stesso solvente del corrispondente esperimento in oscurità (- UVA).Vitalità dei controlli negativi: La densità ottica assoluta (OD540 NRU) misurata nell'estratto di rosso neutro dei controlli negativi indica se le cellule (1 × 104) seminate in ogni pozzetto siano cresciute con un tempo di raddoppiamento normale durante i due giorni della prova. Il saggio soddisfa i criteri di accettazione se la OD540 NRU media dei controlli non trattati è >= 0,2.Controllo positivo: Contemporaneamente al saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU, si saggia una sostanza chimica notoriamente fototossica. Si raccomanda l'uso di clorpromazina (CPZ), poiché tale sostanza è stata impiegata come controllo positivo nello studio di validazione UE/COLIPA. Per la CPZ saggiata con il protocollo standard nel saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU, sono stati definiti i seguenti criteri di accettazione: CPZ irradiata (+ UVA): EC50 = da 0,1 a 2,0 µg/ml; CPZ non irradiata (- UVA): EC50 = da 7,0 a 90,0 µg/ml. Il PIF, cioè lo spostamento di EC50, deve essere almeno pari a 6.Come controlli positivi concomitanti, al posto della CPZ possono essere impiegate altre sostanze chimiche notoriamente fototossiche, corrispondenti alla classe chimica o alle caratteristiche di solubilità della sostanza chimica di prova. In questo caso, sulla base dei dati storici, occorre definire adeguatamente l'intervallo di EC50 e del PIF o MPE come criterio di accettazione del saggio.1.7. Descrizione del metodo utilizzato1.7.1. Preparazioni1.7.1.1. CelluleNello studio di validazione è stata usata una linea cellulare permanente di fibroblasti di topo - Balb/c 3T3, clone 31 - proveniente dall'ATCC o dall'ECACC. Se ne raccomanda pertanto l'uso in ogni saggio. Applicando lo stesso protocollo, si possono utilizzare con eguale efficacia anche altre cellule o linee cellulari se le condizioni della coltura vengono adattate alle esigenze specifiche delle cellule; tuttavia, è necessario dimostrare l'equivalenza.È necessario verificare con regolarità che le cellule non siano contaminate da micoplasmi; le cellule vanno utilizzate solo se i risultati dei controlli sono soddisfacenti.Poiché la sensibilità delle cellule agli UVA può aumentare con il numero di passaggi, vanno impiegate cellule Balb/c 3T3 del numero più basso ottenibile di passaggi, preferibilmente inferiore a 100. È importante che la sensibilità delle cellule Balb/c 3T3 agli UVA venga controllata regolarmente seguendo la procedura di controllo della qualità descritta in queste linee guida.1.7.1.2. Condizioni dei mezzi e della colturaPer il passaggio di routine delle cellule e durante il saggio è necessario utilizzare mezzi di coltura e condizioni di incubazione adeguati. Nel caso delle cellule Balb/c 3T3, occorre integrarle con DMEM al 10 % di siero di vitello neonato, 4 mM di glutamina, penicillina e streptomicina, nonché incubazione umidificata a 37 °C /7,5 % di CO2. È particolarmente importante che le condizioni della coltura cellulare assicurino un tempo di ciclo cellulare compreso nel normale range storico delle cellule o della linea cellulare utilizzate.1.7.1.3. Preparazione delle coltureLe cellule ottenute da colture base congelate vengono seminate nel terreno di coltura alla densità adeguata e poste in sottocoltura almeno una volta prima di essere utilizzate per il saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU.Per il saggio di fototossicità occorre seminare le cellule nel terreno di coltura ad una densità tale che impedisca alle colture di raggiungere la confluenza prima della fine, cioè quando viene determinata la vitalità cellulare 48 ore dopo la semina. Per le cellule Balb/c 3T3 coltivate in piastre a 96 pozzetti la densità raccomandata è di 1 × 104 cellule per pozzetto.Per ogni sostanza chimica di prova si seminano cellule in maniera identica in due diverse piastre a 96 pozzetti, che vengono poi sottoposte simultaneamente all'intera procedura in condizioni colturali identiche, salvo il periodo di tempo in cui una delle piastre viene irradiata (+ UVA/visibile) mentre l'altra viene tenuta nell'oscurità (- UVA/visibile).1.7.1.4. Attivazione metabolicaMentre l'uso di sistemi metabolizzanti è un requisito generale di tutte le prove in vitro per la previsione della genotossicità e del potenziale carcinogenico, finora, nel caso della fototossicologia, non si conosce alcuna sostanza chimica che necessita della trasformazione metabolica per agire da fototossina in vivo o in vitro. Pertanto non si ritiene necessario, né scientificamente giustificato, svolgere questo saggio con un sistema di attivazione metabolica.1.7.1.5. Sostanza chimica di prova/PreparazioneLe sostanze chimiche di prova devono essere preparate di fresco immediatamente prima dell'uso, a meno che la conservazione risulti accettabile in base ai dati relativi alla stabilità. Quando è probabile che si verifichi una rapida fotodegradazione, può essere necessaria la preparazione sotto luce rossa.Le sostanze chimiche di prova vanno dissolte in soluzioni saline tampone, come la soluzione isotonica di Earl (EBSS) o la soluzione salina tampone fosfato (PBS) che, per evitare interferenze durante l'irradiazione, devono essere prive di componenti proteiche e colori indicatori di pH che assorbono la luce.Le sostanze chimiche di prova scarsamente solubili in acqua devono essere dissolte in solventi adeguati, ad una concentrazione pari a 100 volte la concentrazione finale desiderata e poi diluite in 1:100 con la soluzione tampone. Eventuali solventi devono essere presenti a un volume costante dell'1 % (v/v) in tutte le colture, e cioè sia nei controlli negativi che in tutte le concentrazioni della sostanza chimica di prova.I solventi raccomandati sono il dimetilsolfossido (DMSO) e l'etanolo (EtOH). Possono essere adatti anche altri solventi a bassa citotossicità (come l'acetone), ma è necessario valutarne attentamente le proprietà specifiche, quali la reazione con la sostanza chimica di prova, l'estinzione dell'effetto fototossico, le proprietà di cattura dei radicali.Se necessario, si può procedere a miscelazione tramite vortex e/o sonicazione e/o riscaldamento fino a 37 °C per favorire la solubilizzazione.1.7.1.6. Irradiazione UV/PreparazioneFonte di luce: la scelta di una fonte di luce e di un filtro adeguati è il fattore più importante ai fini di un corretto saggio della fototossicità. Gli spettri di UVA e della luce visibile si associano generalmente a fotosensibilizzazione (7) (10), mentre gli UVB sono meno rilevanti perché fortemente citotossici in via diretta, visto che la loro citotossicità aumenta di 1000 volte da 313 a 280 nm (11). Per scegliere una fonte luminosa adeguata valgono, tra l'altro, i seguenti criteri essenziali: la fonte di luce deve emettere lunghezze d'onda assorbite dalla sostanza chimica di prova e la dose di luce (ottenibile in tempi ragionevoli) deve essere sufficiente per individuare i fotosensibilizzanti noti. Inoltre, le lunghezze d'onda e le dosi utilizzate non devono essere eccessivamente nocive per il sistema, che comporta anche emissione di calore (regione dell'infrarosso).La fonte di luce ottimale è la simulazione della luce del sole con simulatori solari. Nei simulatori solari si usano sia gli archi allo xeno che gli archi di mercurio e ad alogenuri metallici (drogati). Questi ultimi presentano il vantaggio di emettere meno calore e di essere meno costosi, ma la loro corrispondenza con la luce solare non è perfetta. Poiché tutti i simulatori solari emettono quantità significative di UVB, vanno muniti di filtri adeguati per attenuare le lunghezze d'onda UVB altamente citotossiche.Per il saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU è necessario usare uno spettro di irradiamento praticamente privo di UVB (UVA:UVB [sim     ] 1:20). È stato pubblicato un esempio della distribuzione dell'irradiamento spettrale del simulatore solare con filtro impiegato nello studio di validazione del saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU (3).Dosimetria: Prima di effettuare il saggio di fototossicità occorre controllare regolarmente l'intensità della luce (irradiamento) mediante opportuno misuratore UV a banda larga. Il misuratore UV deve essere stato calibrato sulla fonte. È necessario controllare la funzionalità del misuratore UV e, a tale scopo, si raccomanda di impiegare un secondo misuratore UV di riferimento, dello stesso tipo e con identica calibrazione. L'ideale sarebbe che, a intervalli di tempo più lunghi, con uno spettroradiometro si misurasse l'irradiamento spettrale della fonte di luce filtrata e si controllasse la calibrazione del misuratore UV a banda larga; tali strumenti richiedono tuttavia l'intervento di personale specializzato.Lo studio di validazione ha stabilito che una dose di 5 J/cm2 (UVA) non è citotossica per le cellule Balb/c 3T3 ed è sufficientemente potente per eccitare anche le sostanze chimiche a bassa fototossicità. Allo scopo di ottenere una dose di 5 J/cm2 entro 50 minuti, l'irradiamento deve essere regolato a 1,666 mW/cm2. Se si utilizzano un'altra linea cellulare o una diversa fonte di luce, potrebbe essere necessario adattare leggermente la dose di UVA, a condizione che non sia nociva per le cellule e che sia sufficiente per individuare le fototossine standard. Il tempo di esposizione alla luce si calcola come segue:>PIC FILE= "L_2000136IT.010101.EPS">1.7.2. Condizioni di esecuzione del saggioLa concentrazione massima della sostanza chimica di prova non deve superare i 100 µg/ml, poiché la fototossicità di tutte le sostanze chimiche è stata rilevata a concentrazioni inferiori, mentre a concentrazioni maggiori aumenta l'incidenza dei falsi positivi (previsioni sovrastimate) (13). Il pH della concentrazione più alta della sostanza chimica di prova deve essere soddisfacente (range del pH: 6,5-7,8).Gli intervalli delle concentrazioni di una sostanza chimica sottoposta a prova in presenza (+ UVA) e in assenza (- UVA) di luce vanno determinati in modo adeguato in precedenti esperimenti espressamente effettuati a tale scopo. Occorre adeguare l'intervallo e l'intercetta di una serie di concentrazioni in modo che le curve concentrazione-risposta siano sufficientemente corroborate da dati sperimentali. È necessario utilizzare le serie di concentrazioni geometriche (con un fattore di diluizione costante).1.7.3. Procedura del saggio(1)1.7.3.1. Primo giornoPreparare una sospensione di cellule di 1 × 105 cellule/ml nel terreno di coltura e versare 100 µL di terreno di coltura solo nei pozzetti periferici di una piastra per microtitolazione di coltura tissutale a 96 pozzetti (= bianchi). Nei restanti pozzetti versare 100 µL di una sospensione cellulare di 1 × 105 cellule/ml (= 1 × 104 cellule/pozzetto). Per ciascuna sostanza chimica di prova preparare due piastre: una per determinare la citotossicità (- UVA) e l'altra per determinare la fotocitotossicità (+ UVA).Incubare le cellule per 24 ore (7,5 % di CO2, 37 °C) finché formano un monostrato semiconfluente. Questo periodo di incubazione tiene conto del recupero e dell'aderenza delle cellule, nonché della crescita esponenziale.1.7.3.2. Secondo giornoDopo l'incubazione, far decantare il terreno di coltura dalle cellule e lavare due volte con 150 µL di EBSS/PBS per pozzetto. Aggiungere 100 µL di EBSS/PBS contenente la concentrazione corretta della sostanza chimica di prova o solo solvente (controllo negativo). Utilizzare 8 diverse concentrazioni della sostanza chimica di prova. Incubare le cellule con la sostanza chimica di prova nell'oscurità per 60 minuti (7,5 % di CO2, 37 °C).Per eseguire la parte + UVA del saggio, irradiare le cellule a temperatura ambiente per 50 minuti attraverso il coperchio della piastra con 1,7 mW/cm2 di UVA (= 5 J/cm2). Ventilare con una ventola per evitare la condensazione di H2O sotto il coperchio. Mantenere le altre piastre (- UVA) a temperatura ambiente in una scatola scura per 50 minuti (= tempo di esposizione agli UVA).Far decantare la soluzione di prova e lavare due volte con 150 µL di EBSS/PBS. Sostituire l'EBSS/PBS con terreno di coltura e incubare (7,5 % di CO2, 37 °C) per una notte (18-22 ore).1.7.3.3. Terzo giornoEsame al microscopioEsaminare le cellule con un microscopio a contrasto di fase. Registrare i cambiamenti morfologici delle cellule dovuti agli effetti citotossici della sostanza chimica di prova. Si raccomanda questo controllo per escludere errori sperimentali, sebbene questi dati non vengano utilizzati per la valutazione della citotossicità o della fototossicità.Prova della captazione del rosso neutroLavare le cellule con 150 uL di EBSS/PBS preriscaldata. Rimuovere la soluzione di lavaggio con lievi colpetti. Aggiungere 100 µl di terreno al rosso neutro e incubare a 37 °C in atmosfera umidificata al 7,5 % di CO2 per 3 ore.Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno al rosso neutro e lavare le cellule con 150 µL di EBSS/PBS. Far decantare e asciugare totalmente l'EBSS/PBS. (Centrifugare a piastra rovesciata è opzionale).Aggiungere esattamente 150 µL di soluzione di estinzione di rosso neutro (etanolo/acido acetico preparati di fresco).Scuotere rapidamente la piastra di microtitolazione con un agitatore per 10 minuti fino ad estrazione del rosso neutro dalle cellule e formazione di una soluzione omogenea.Misurare la densità ottica dell'estratto di rosso neutro a 540 nm con uno spettrofotometro, utilizzando i bianchi come riferimento. Salvare i dati nel formato di file adeguato (ad esempio ASCII) per le analisi successive.2. DATI2.1. Qualità e quantità dei datiI dati devono permettere un'analisi significativa della concentrazione-risposta ottenuta in presenza e in assenza di irradiazione UVA/visibile. Se si rileva citotossicità, è necessario fissare sia il range della concentrazione che l'intervallo delle singole concentrazioni in modo da adattare una curva ai dati sperimentali. Poiché una sostanza chimica di prova potrebbe non essere citotossica fino alla concentrazione limite definita di 100 µg/ml nell'esperimento in oscurità (- UVA), ma altamente citotossica in caso di irradiazione (+ UVA), potrebbe essere necessario che i range della concentrazione da saggiare differiscano per ordine di grandezza per garantire un'adeguata qualità dei dati. Se non si rileva citotossicità in nessuna delle due parti dell'esperimento (- UVA e + UVA), è sufficiente effettuare il saggio con un maggiore intervallo fra dosi singole fino alla concentrazione più elevata.Non occorre verificare i risultati chiaramente positivi ripetendo l'esperimento. Non occorre neppure verificare i risultati chiaramente negativi, purché la sostanza chimica di prova sia stata saggiata a concentrazioni sufficientemente alte. In tali casi è sufficiente un esperimento principale, sostenuto da uno o più esperimenti preliminari di definizione dei range.I saggi che hanno dato risultati borderline vicini alla linea di demarcazione del modello di predittività vanno ripetuti per verifica.Se si ritiene necessario ripetere il saggio, potrebbe essere importante variare le condizioni sperimentali allo scopo di ottenere un risultato chiaro. Una variabile fondamentale di questo saggio è la preparazione delle soluzioni della sostanza chimica di prova. Pertanto, la variazione di tali condizioni (co-solvente, triturazione, sonicazione) può essere di enorme importanza nel saggio di ripetizione. Alternativamente si può prendere in considerazione l'ipotesi di variare il tempo di incubazione pre-irradiazione. Un tempo più breve può essere determinante per le sostanze chimiche instabili in acqua.2.2. Trattamento dei risultatiOve possibile, si determina la concentrazione di una sostanza chimica di prova che riflette una inibizione del 50 % dell'NRU cellulare (EC50). A tale scopo si applica una qualunque procedura di regressione non lineare (preferibilmente una funzione di Hill o la regressione logistica) ai dati concentrazione-risposta, oppure si utilizzano altre procedure di adeguamento (14). Prima di utilizzare una EC50 per ulteriori calcoli occorre controllare in modo adeguato la qualità dell'adattamento alla rappresentazione grafica. Alternativamente possono essere impiegati metodi di adattamento alla rappresentazione grafica per calcolare l'EC50. In questo caso si raccomanda l'uso di carte di probabilità (scala x: log, scala y: probit), poiché in molti casi la funzione concentrazione-risposta diventerà quasi lineare dopo questa trasformazione.2.3. Valutazione dei risultati (modelli di predittività)2.3.1. Modello di predittività versione 1: PIFSe si ottengono curve concentrazione-risposta complete sia in presenza (+ UVA) che in assenza (- UVA) di luce, il fattore di fotoirritazione (PIF) si calcola tramite la formula seguente:>PIC FILE= "L_2000136IT.010301.EPS">Un PIF <  5 non predice alcun potenziale fototossico, mentre un PIF >= 5 predice un potenziale fototossico.Se una sostanza chimica è citotossica solo + UVA e non è citotossica al saggio - UVA, non è possibile calcolare il PIF, sebbene si tratti di un risultato che indica un potenziale fototossico. In tali casi è possibile calcolare un ' > PIF' se il saggio di citotossicità (- UV) viene eseguito fino alla concentrazione di prova più elevata (Cmax) e tale valore viene usato per calcolare il ' > PIF':>PIC FILE= "L_2000136IT.010302.EPS">Se è possibile ottenere solo un ' > PIF', qualunque valore  > 1 predice un potenziale fototossico.Se non è possibile calcolare né l'EC50 (- UV) né l'EC50 (+ UV) a causa del fatto che una sostanza chimica non risulta essere citotossica fino alla più alta concentrazione di prova, questo indica l'assenza di potenziale fototossico. In tali casi per caratterizzare il risultato si utilizza un formale 'PIF = *1'>PIC FILE= "L_2000136IT.010303.EPS">Se è possibile ottenere solo un 'PIF = *1', ciò non predice alcun potenziale fototossico.Nei casi (b) e (c), ai fini della predittività del potenziale fototossico è necessario tenere in debita considerazione le concentrazioni ottenute al saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU.2.3.2. Modello di predittività versione 2: MPEAlternativamente è possibile applicare una nuova versione del modello per prevedere il potenziale fototossico, sviluppata in base ai dati dello studio di validazione UE/COLIPA (15) e saggiata in cieco in un successivo studio sulla fototossicità in vitro delle sostanze chimiche a filtro UV (13). Tale modello sopperisce ai limiti del modello PIF nei casi in cui è impossibile ottenere un'EC50. Il modello utilizza il 'Mean Photo Effect' (MPE), una misura basata sul confronto delle curve complete concentrazione-risposta. Per l'applicazione del modello MPE la Humboldt Universität di Berlino ha sviluppato un software disponibile gratuitamente.2.4. Interpretazione dei risultatiUn risultato positivo al saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU (PIF >= 5 o MPE >= 0,1) indica che la sostanza di prova ha un potenziale fototossico. Se si ottiene tale risultato a concentrazioni inferiori a 10 µg/ml, è altresì probabile che la sostanza chimica di prova si comporti da fototossina in varie condizioni di esposizione in vivo. Se si ottiene un risultato positivo solo alla concentrazione di prova più elevata (100 µg/mL), possono essere necessarie ulteriori considerazioni per la valutazione del rischio o del potere fototossico, quali dati sulla penetrazione, l'assorbimento e il possibile accumulo della sostanza chimica nella cute, oppure l'analisi della sostanza in un saggio alternativo di conferma, ad esempio impiegando un modello di cute umana in vitro.Un risultato negativo al saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRU (PIF <  5 o MPE <  0,1) indica che la sostanza di prova non è fototossica per le cellule di mammifero in coltura nelle condizioni di saggio. Nei casi in cui è stato possibile provare la sostanza chimica fino alla concentrazione più elevata (100 µg/ml) un risultato negativo indica che tale sostanza non ha potenziale fototossico e la fototossicità in vivo può essere considerata improbabile. Nei casi in cui si ottengano identiche risposte tossicità-concentrazione (EC50 + UV e EC50 - UV) a concentrazioni inferiori, l'interpretazione dei dati sarebbe la stessa. Diversamente, se non viene dimostrata tossicità (+ UV e - UV) e se la solubilità in acqua limita le concentrazioni a valori inferiori a 100 µg/ml, allora può essere messa in dubbio la compatibilità della sostanza di prova con il saggio e va presa in considerazione l'idea di eseguire prove di conferma (ad esempio usando un modello di cute in vitro o un modello di cute ex vivo o un saggio in vivo).3. RELAZIONERelazione sul saggio effettuatoLa relazione sul saggio deve contenere le seguenti informazioni:Sostanza chimica di prova:- dati di identificazione e numero CAS, se noto- caratteristiche fisiche e purezza- proprietà fisicochimiche rilevanti per l'esecuzione dello studio- stabilità e fotostabilità, se noteSolvente:- motivazione della scelta del solvente- solubilità della sostanza chimica di prova in questo solvente- percentuale di solvente presente nel terreno di trattamento (EBSS o PBS)Cellule:- tipo e origine- assenza di micoplasmi- numero di passaggi delle cellule, se noto- sensibilità delle cellule agli UVA, determinata con gli strumenti per irradiazione usati nel saggio di fototossicità in vitro 3T3 NRUCondizioni di esecuzione del saggio (a) - incubazione prima e dopo il trattamento:- tipo e composizione del terreno di coltura- condizioni di incubazione (concentrazione di CO2, temperatura, umidità)- durata dell'incubazione (pre-trattamento, post-trattamento)Condizioni di esecuzione del saggio (b) - trattamento con la sostanza chimica:- criteri di scelta delle concentrazioni della sostanza chimica di prova usata sia in presenza che in assenza di irradiazione UV/visibile- in caso di solubilità limitata della sostanza chimica di prova e assenza di citotossicità, motivi della scelta di una concentrazione più elevata- tipo e composizione del terreno di trattamento (soluzione salina tampone)- durata del trattamento chimicoCondizioni di esecuzione del saggio (c) - irradiazione:- motivo della scelta della fonte di luce utilizzata nel saggio- caratteristiche di irradiamento spettrale della fonte di luce- caratteristiche di trasmissione/assorbimento del/i filtro/i usato/i- caratteristiche del radiometro e particolari sulla sua calibrazione- distanza della fonte di luce dal sistema di prova- irradiamento UVA a tale distanza, espresso in mW/cm2- durata dell'esposizione alla luce UV/visibile- dose UVA (irradiamento × tempo), espressa in J/cm2- temperatura delle colture cellulari durante l'irradiazione e delle colture cellulari mantenute in oscuritàCondizioni di esecuzione del saggio (d) - prova NRU- composizione del terreno al rosso neutro- durata dell'incubazione nel rosso neutro- condizioni di incubazione (concentrazione di CO2, temperatura, umidità)- condizioni di estrazione del rosso neutro (estraente, durata)- lunghezza d'onda usata per la lettura spettrofotometrica della densità ottica del rosso neutro- seconda lunghezza d'onda (riferimento), se utilizzata- contenuto del bianco spettrofotometrico, se utilizzatoRisultati- vitalità cellulare ottenuta a ciascuna concentrazione della sostanza chimica di prova, espressa in vitalità percentuale media dei controlli- curve concentrazione-risposta (concentrazione della sostanza chimica di prova vs. vitalità cellulare relativa), ottenuta negli esperimenti simultanei + UVA e - UVA- analisi dei dati delle curve concentrazione-risposta: se possibile, computo/calcolo dell'EC50 (+ UVA) e dell'EC50 (- UVA)- confronto delle due curve concentrazione-risposta ottenute in presenza e in assenza dell'irradiazione UVA/visibile, o tramite calcolo del PIF, o tramite calcolo dell'MPE- classificazione del potenziale fototossico- criteri di accettazione del saggio (a) - controllo negativo simultaneo:- vitalità assoluta (densità ottica dell'estratto di rosso neutro) delle cellule irradiate e non irradiate- dati storici del controllo negativo, deviazione media e standard- criteri di accettazione del saggio (b) - controllo positivo simultaneo:- EC50 (+ UVA) e EC50 (- UVA) e PIF della sostanza chimica di controllo positiva- dati storici riguardanti la sostanza chimica di controllo positiva: EC50 (+ UVA) e EC50 (- UVA) e PIF, deviazione media e standardDiscussione dei risultatiConclusioni4. BIBLIOGRAFIA(1) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer, F., Moore, L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, pagg. 793-796.(2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, pagg. 7-8.(3) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pechovitch, G., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA 'In vitro phototoxicity' validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, pagg. 305-327.(4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996.(5) Lovell, W.W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology in Vitro 7, pagg. 95-102.(6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, pagg. XI-XXXV.(7) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, pagg. 314-348.(8) Spikes, J.D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, pagg. 79-110.(9) Borenfreund, E. and Puerner, J.A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, pagg. 119-124.(10) Lambert L. A, Warner W.G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor &  Francis, Washington DC, 5th Edition, pagg. 515-530.(11) Tyrrell R.M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, pagg. 1825-1829.(12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project 'In Vitro Photoirritation'.(13) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, pagg. 679-708.(14) Holzhütter, H.G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, pagg. 127-138.(15) Holzhütter, H.G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, pagg. 445-462.Appendice>PIC FILE= "L_2000136IT.010702.TIF">"(1) Per ulteriori dettagli, cfr. il riferimento bibliografico (12).


Avis juridique important

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32004L0042

Direttiva 2004/42/CE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 21 aprile 2004, relativa alla limitazione delle emissioni di composti organici volatili dovute all'uso di solventi organici in talune pitture e vernici e in taluni prodotti per carrozzeria e recante modifica della direttiva 1999/13/CE

Gazzetta ufficiale n. L 143 del 30/04/2004 pag. 0087 - 0096

Direttiva 2004/42/CE del Parlamento europeo e del Consigliodel 21 aprile 2004relativa alla limitazione delle emissioni di composti organici volatili dovute all'uso di solventi organici in talune pitture e vernici e in taluni prodotti per carrozzeria e recante modifica della direttiva 1999/13/CEIL PARLAMENTO EUROPEO E IL CONSIGLIO DELL'UNIONE EUROPEA,visto il trattato che istituisce la Comunità europea, in particolare l'articolo 95,vista la proposta della Commissione,visto il parere del Comitato economico e sociale europeo(1),deliberando secondo la procedura di cui all'articolo 251 del trattato(2),considerando quanto segue:(1) La direttiva 2001/81/CE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 23 ottobre 2001, relativa ai limiti nazionali di emissione di alcuni inquinanti atmosferici(3), stabilisce i limiti nazionali di emissione di alcuni inquinanti, compresi i composti organici volatili (in seguito denominati "COV"), da conseguire entro il 2010 nel quadro della strategia comunitaria integrata per combattere l'acidificazione e l'ozono troposferico, ma non prevede valori limite per le emissioni di questi inquinanti da fonti specifiche.(2) Per rispettare i limiti nazionali di emissione di COV gli Stati membri devono agire su differenti categorie di fonti di tali emissioni.(3) La presente direttiva integra le misure adottate a livello nazionale per assicurare il rispetto dei limiti di emissione di COV.(4) In mancanza di disposizioni comunitarie, le legislazioni degli Stati membri che prevedono valori limite di COV per alcune categorie di prodotti possono differire. Tali divergenze, unitamente alla mancanza di una siffatta legislazione in alcuni Stati membri, potrebbero creare inutili ostacoli agli scambi e distorsioni della concorrenza nell'ambito del mercato interno.(5) È pertanto necessario armonizzare le leggi e le disposizioni nazionali che, al fine di combattere la formazione di ozono troposferico, fissano valori limite per il contenuto di COV nei prodotti contemplati dalla presente direttiva per garantire che non limitino la libera circolazione di tali prodotti.(6) Poiché lo scopo dell'azione proposta, vale a dire la riduzione delle emissioni di COV, non può essere realizzato in misura sufficiente dagli Stati membri, in quanto le emissioni di COV in uno Stato membro influenzano la qualità dell'aria negli altri Stati membri, e può dunque, a causa delle dimensioni e degli effetti dell'azione, essere realizzato meglio a livello comunitario, la Comunità può adottare misure in base al principio di sussidiarietà sancito dall'articolo 5 del trattato. La presente direttiva si limita a quanto è necessario per conseguire tale scopo in ottemperanza al principio di proporzionalità enunciato nello stesso articolo.(7) Il contenuto di COV di pitture, vernici e prodotti per carrozzeria determina emissioni significative di COV nell'atmosfera, che contribuiscono alla formazione a livello locale e transfrontaliero di ossidanti fotochimici nello strato limite della troposfera.(8) Il contenuto di COV di talune pitture e vernici e di taluni prodotti per carrozzeria dovrebbe essere ridotto, per quanto tecnicamente ed economicamente possibile, tenendo conto delle condizioni climatiche.(9) Per garantire un elevato livello di tutela dell'ambiente è necessario stabilire e rispettare un contenuto massimo di COV per i prodotti contemplati dalla presente direttiva.(10) È opportuno prevedere misure transitorie per i prodotti fabbricati prima dell'entrata in vigore delle prescrizioni della presente direttiva.(11) Gli Stati membri dovrebbero essere in grado di rilasciare licenze individuali per la vendita e l'acquisto a fini specifici di quantità strettamente limitate di prodotti non conformi ai valori limite di solventi stabiliti dalla presente direttiva.(12) La presente direttiva integra le disposizioni comunitarie in materia di etichettatura di sostanze e preparati chimici.(13) La protezione della salute dei consumatori e/o dei lavoratori e la protezione dell'ambiente di lavoro non dovrebbe rientrare nell'ambito di applicazione della presente direttiva e, pertanto, quest'ultima non dovrebbe influire sulle misure adottate a tal fine dagli Stati membri.(14) È necessario monitorare il contenuto massimo di COV per stabilire se le concentrazioni di COV riscontrate in ciascuna categoria di pitture, vernici e prodotti per carrozzeria previste dalla presente direttiva rientrano nei limiti consentiti.(15) Dato che il contenuto di COV dei prodotti utilizzati per taluni lavori di carrozzeria è ora regolamentato dalla presente direttiva, occorrerebbe pertanto modificare la direttiva 1999/13/CE del Consiglio, dell'11 marzo 1999, sulla limitazione delle emissioni di composti organici volatili dovute all'uso di solventi organici in talune attività e in taluni impianti(4).(16) Gli Stati membri dovrebbero tuttavia poter mantenere o introdurre misure nazionali per il controllo delle emissioni derivanti da attività di carrozzeria di veicoli riguardanti il rivestimento dei veicoli stradali come definiti nella direttiva 70/156/CEE del Consiglio, del 6 febbraio 1970, concernente il ravvicinamento delle legislazioni degli Stati membri relative all'omologazione dei veicoli a motore e dei loro rimorchi(5), o parti di essi, eseguito a fini di riparazione, manutenzione o decorazione al di fuori degli stabilimenti di produzione.(17) La presente direttiva non dovrebbe applicarsi ai prodotti venduti per uso esclusivo in stabilimenti autorizzati ai sensi della direttiva 1999/13/CE in cui le misure di riduzione delle emissioni prevedono mezzi alternativi per raggiungere livelli almeno equivalenti di riduzione delle emissioni di COV.(18) Gli Stati membri dovrebbero fissare norme relative alle sanzioni applicabili in caso di violazione delle disposizioni della presente direttiva ed assicurarne l'applicazione. Tali sanzioni dovrebbero essere effettive, proporzionate e dissuasive.(19) Gli Stati membri dovrebbero riferire alla Commissione in merito all'esperienza maturata nell'applicazione della presente direttiva.(20) Dovrebbe essere effettuata una revisione per ridurre il contenuto di COV di prodotti che esulano dall'ambito di applicazione della presente direttiva ed eventualmente per ridurre ulteriormente i valori limite di COV già previsti.(21) Le misure necessarie per l'attuazione della presente direttiva sono adottate secondo la decisione 1999/468/CE del Consiglio, del 28 giugno 1999, recante modalità per l'esercizio delle competenze di esecuzione conferite alla Commissione(6),HANNO ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:Articolo 1Finalità e ambito di applicazione1. La presente direttiva mira a limitare il contenuto totale di COV in talune pitture e vernici e in taluni prodotti per carrozzeria allo scopo di prevenire o ridurre l'inquinamento atmosferico derivante dal contributo dei COV alla formazione di ozono troposferico.2. Al fine di conseguire l'obiettivo di cui al paragrafo 1, la presente direttiva armonizza le specifiche tecniche di talune pitture e vernici e di taluni prodotti per carrozzeria.3. La presente direttiva si applica ai prodotti di cui all'allegato I.4. La presente direttiva non pregiudica né altera le misure, compresi gli obblighi in materia di etichettatura, adottate a livello comunitario o nazionale per proteggere la salute dei consumatori e dei lavoratori e il loro ambiente di lavoro.Articolo 2DefinizioniAi fini della presente direttiva si intende per:1. "autorità competente", la o le autorità o gli organismi responsabili, in base alle disposizioni legislative degli Stati membri, dell'adempimento degli obblighi derivanti dalla presente direttiva;2. "sostanze", qualsiasi elemento chimico e i suoi composti, quali si presentano allo stato naturale o prodotti dall'industria, in forma solida, liquida o gassosa;3. "preparato", qualsiasi miscela o soluzione composta di due o più sostanze;4. "composto organico", qualsiasi composto contenente almeno l'elemento carbonio e uno o più degli elementi seguenti: idrogeno, ossigeno, zolfo, fosforo, silicio, azoto od un alogeno, ad eccezione degli ossidi di carbonio e dei carbonati e bicarbonati inorganici;5. "composto organico volatile (COV)", qualsiasi composto organico avente un punto di ebollizione iniziale pari o inferiore a 250°C misurato ad una pressione standard di 101,3 kPa;6. "contenuto di COV", la massa di composti organici volatili espressa in grammi/litro (g/l), nella formulazione del prodotto pronto all'uso. Non è considerata parte del contenuto di COV la massa di composti organici volatili presente in un dato prodotto che in fase di essiccamento reagisce chimicamente formando parte del rivestimento;7. "solvente organico", qualsiasi COV usato da solo o in combinazione con altri agenti, per dissolvere o diluire materie prime, prodotti o materiali di rifiuto, o usato come agente di pulizia per dissolvere contaminanti, o come mezzo di dispersione, correttore di viscosità, correttore di tensione superficiale, plastificante o conservante;8. "rivestimento", qualsiasi preparato, compresi tutti i solventi organici o i preparati contenenti solventi organici necessari per una corretta applicazione, usato per ottenere una pellicola con effetto decorativo, protettivo o altro effetto funzionale su una determinata superficie;9. "pellicola", uno strato continuo risultante dall'applicazione su un supporto di uno o più rivestimenti;10. "rivestimenti a base acquosa (BA)", i rivestimenti la cui viscosità è regolata mediante l'uso di acqua;11. "rivestimenti a base solvente (BS)", i rivestimenti la cui viscosità è regolata mediante l'uso di solventi organici;12. "immissione sul mercato", la messa a disposizione di terzi, dietro pagamento o meno. L'importazione nel territorio doganale comunitario viene considerata come immissione sul mercato ai sensi della presente direttiva.Articolo 3Requisiti1. Gli Stati membri provvedono affinché i prodotti di cui all'allegato I siano immessi sul mercato nel loro territorio a partire dalle date stabilite nell'allegato II solo se hanno un contenuto di COV non superiore ai valori limite fissati nell'allegato II e se sono conformi all'articolo 4.Per determinare la conformità ai valori di contenuto massimo di COV di cui all'allegato II, si impiegano i metodi analitici di cui all'allegato III.Per i prodotti di cui all'allegato I a cui devono essere aggiunti solventi o altri componenti contenenti solventi affinché siano pronti all'uso, i valori limite di cui all'allegato II si applicano al contenuto di COV del prodotto pronto all'uso.2. In deroga al paragrafo 1, gli Stati membri esentano dall'osservanza dei suddetti requisiti i prodotti venduti per l'uso esclusivo in un'attività contemplata dalla direttiva 1999/13/CE e svolta in un impianto registrato o autorizzato a norma degli articoli 3 e 4 di detta direttiva.3. Ai fini del restauro e della manutenzione di edifici e di veicoli d'epoca designati da autorità competenti come aventi particolare valore storico e culturale, gli Stati membri possono concedere singole autorizzazioni alla vendita e all'acquisto in quantità rigorosamente limitate di prodotti non conformi ai valori limite di COV stabiliti nell'allegato II.4. I prodotti rientranti nell'ambito di applicazione della presente direttiva che risultano essere stati prodotti anteriormente alle date stabilite nell'allegato II e che non soddisfano i requisiti del paragrafo 1 possono essere immessi sul mercato per un periodo di 12 mesi successivo alla data di entrata in vigore del requisito che si applica al prodotto in questione.Articolo 4EtichettaturaGli Stati membri provvedono affinché al momento dell'immissione sul mercato i prodotti di cui all'allegato I siano muniti di un'etichetta. L'etichetta indica:a) la sottocategoria del prodotto e il pertinente valore limite di COV espresso in g/l di cui all'allegato II;b) il contenuto massimo di COV espresso in g/l del prodotto pronto all'uso.Articolo 5Autorità competenteGli Stati membri designano l'autorità competente responsabile dell'adempimento degli obblighi previsti dalla presente direttiva e ne informano la Commissione entro 30 aprile 2005.Articolo 6MonitoraggioGli Stati membri stabiliscono un programma di monitoraggio allo scopo di verificare il rispetto delle disposizioni della presente direttiva.Articolo 7Comunicazione dei datiGli Stati membri comunicano i risultati del programma di monitoraggio, al fine di dimostrare il rispetto delle disposizioni della presente direttiva, e le categorie e i quantitativi di prodotti autorizzati a norma dell'articolo 3, paragrafo 3. Le due prime relazioni sono trasmesse alla Commissione 18 mesi dopo le date entro le quali occorre conformarsi ai valori di contenuto massimo di COV di cui all'allegato II; successivamente una relazione è trasmessa ogni cinque anni. La Commissione elabora preventivamente un formato comune per la trasmissione dei dati del monitoraggio secondo la procedura di cui all'articolo 12, paragrafo 2. I dati sono trasmessi con frequenza annuale alla Commissione su sua richiesta.Articolo 8Libera circolazioneGli Stati membri non possono, a motivo del fatto che sono trattati nella presente direttiva, vietare, limitare o impedire l'immissione sul mercato di prodotti che rientrano nell'ambito d'applicazione della presente direttiva i quali, pronti all'uso, sono conformi alle prescrizioni della presente direttiva.Articolo 9RevisioneLa Commissione è invitata a presentare al Parlamento europeo e al Consiglio:1. entro il 2008, una relazione basata sui risultati della revisione di cui all'articolo 10 della direttiva 2001/81/CE. Tale relazione esamina:a) il margine d'intervento e il potenziale per riduzioni del contenuto di COV nei prodotti che non rientrano nell'ambito di applicazione della presente direttiva, compresi gli aerosol per pitture e vernici;b) l'eventuale introduzione di una ulteriore riduzione del contenuto di COV (fase II) per i prodotti per carrozzeria;c) gli eventuali nuovi elementi relativi all'impatto socio-economico dell'attuazione della fase II per quanto riguarda pitture e vernici.2. Entro 30 mesi dalla data di applicazione dei valori limite di contenuto di COV di cui all'allegato II, fase II, una relazione che tenga conto, in particolare, delle relazioni di cui all'articolo 7 e di tutti gli sviluppi tecnologici nella fabbricazione di pitture, vernici e prodotti per carrozzeria. Tale relazione esamina il margine d'intervento e il potenziale per un'ulteriore riduzione del contenuto di COV nei prodotti contemplati dalla presente direttiva, compresa l'eventuale distinzione tra pitture usate per interni e per esterni delle sottocategorie d) e e) dell'allegato I, punto 1.1 e dell'allegato II, sezione A.Ove opportuno, le relazioni sono corredate di proposte di modifica della presente direttiva.Articolo 10SanzioniGli Stati membri fissano le norme relative alle sanzioni applicabili in caso di violazione delle disposizioni nazionali adottate ai sensi della presente direttiva e adottano le misure necessarie per garantirne l'applicazione. Le sanzioni devono essere effettive, proporzionate e dissuasive. Gli Stati membri notificano tali norme e misure alla Commissione entro 30 ottobre 2005 e le comunicano tempestivamente ogni successiva modifica.Articolo 11Adeguamento al progresso tecnicoLe eventuali modifiche necessarie per adeguare l'allegato III al progresso tecnico sono adottate dalla Commissione secondo la procedura di cui all'articolo 12, paragrafo 2.Articolo 12Comitato1. La Commissione è assistita dal comitato istituito dall'articolo 13 della direttiva 1999/13/CE del Consiglio, in seguito denominato "il comitato".2. Nei casi in cui è fatto riferimento al presente paragrafo, si applicano gli articoli 5 e 7 della decisione 1999/468/CE, tenendo conto delle disposizioni dell'articolo 8 della stessa.Il periodo di cui all'articolo 5, paragrafo 6 della decisione 1999/468/CE è fissato a tre mesi.3. Il comitato adotta il proprio regolamento interno.Articolo 13Modifica della direttiva 1999/13/CE1. La direttiva 1999/13/CE è così modificata:all'allegato I, nella sezione "Finitura di veicoli", è soppresso il seguente trattino:"- il rivestimento dei veicoli stradali come definiti nella direttiva 70/156/CEE, o parti di essi, eseguito a fini di riparazione, manutenzione o decorazione al di fuori degli stabilimenti di produzione, o".2. Nonostante il paragrafo 1, gli Stati membri possono mantenere o inserire misure nazionali per il controllo delle emissioni dovute ad attività di finitura di veicoli soppresse dall'ambito di applicazione della direttiva 1999/13/CE.Articolo 14Recepimento1. Gli Stati membri mettono in vigore le disposizioni legislative, regolamentari ed amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva entro 30 ottobre 2005. Essi ne informano immediatamente la Commissione.Quando gli Stati membri adottano tali disposizioni, queste contengono un riferimento alla presente direttiva o sono corredate di un siffatto riferimento all'atto della pubblicazione ufficiale. Le modalità di tale riferimento sono decise dagli Stati membri.2. Gli Stati membri trasmettono alla Commissione il testo delle disposizioni di diritto interno che essi adottano nel settore disciplinato dalla presente direttiva, nonché una tabella di corrispondenza tra le disposizioni della presente direttiva e le disposizioni nazionali adottate.Articolo 15Entrata in vigore della direttivaLa presente direttiva entra in vigore il giorno della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'Unione europea.Articolo 16DestinatariGli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.Fatto a Strasburgo, addì 21 aprile 2004.Per il Parlamento europeoIl PresidenteP. CoxPer il ConsiglioIl PresidenteD. Roche(1) GU C 220 del 16.9.2003, pag. 43.(2) Parere del Parlamento europeo del 25 settembre 2003 (non ancora pubblicato nella Gazzetta ufficiale), posizione comune del Consiglio del 7 gennaio 2004 (GU C 79 E del 30.3.2004, pag. 1) e posizione del Parlamento europeo del 30 marzo 2004 (non ancora pubblicata nella Gazzetta ufficiale).(3) GU L 309 del 27.11.2001, pag. 22.(4) GU L 85 del 29.3.1999, pag. 1. Direttiva modificata dal regolamento (CE) n. 1882/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio (GU L 284 del 31.10.2003, pag. 1).(5) GU L 42 del 23.2.1970, pag. 1. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2004/3/CE del Parlamento europeo e del Consiglio (GU L 49 del 19.2.2004, pag. 36).(6) GU L 184 del 17.7.1999, pag. 23.ALLEGATO IAMBITO DI APPLICAZIONE1. Ai fini della presente direttiva per pitture e vernici si intendono i prodotti appartenenti alle sottocategorie di seguito elencate, esclusi gli aerosol. Si tratta di rivestimenti applicati a scopo decorativo, funzionale e protettivo su manufatti edilizi e rispettive finiture e impianti e strutture connesse.1.1. Sottocategorie:a) "pitture opache per interni per pareti e soffitti": rivestimenti per interni destinati ad essere applicati su pareti e soffitti, con grado di brillantezza (gloss) <= 25@60°;b) "pitture lucide per interni per pareti e soffitti": rivestimenti per interni destinati ad essere applicati su pareti e soffitti, con grado di brillantezza (gloss)  > 25@60°;c) "pitture per pareti esterne di supporto minerale": rivestimenti destinati ad essere applicati su pareti esterne in muratura, mattoni o stucco;d) "pitture per finiture e tamponature da interni/esterni per legno, metallo o plastica": rivestimenti che formano una pellicola opaca, destinati ad essere applicati su finiture e tamponature. Si tratta di prodotti concepiti per i supporti di legno, di metallo o di plastica. Questa sottocategoria comprende i sottofondi e i rivestimenti intermedi;e) "vernici e impregnanti per legno per finiture interne/esterne": rivestimenti che formano una pellicola trasparente o semiopaca, destinati ad essere applicati sulle finiture di legno, metallo e plastica a fini decorativi e protettivi. Questa sottocategoria comprende gli "impregnanti opachi per legno": rivestimenti che formano una pellicola opaca utilizzati a fini di decorazione e protezione del legno dagli agenti atmosferici, secondo la definizione contenuta nella norma EN 927-1 (categoria semistabile);f) "impregnanti non filmogeni per legno": impregnanti per legno che, secondo la norma EN 927-1:1996, hanno uno spessore medio inferiore a 5µm, misurato secondo il metodo 5A della norma ISO 2808:1997;g) "primer": rivestimenti con proprietà sigillanti e/o isolanti destinati ad essere utilizzati sul legno o su pareti e soffitti;h) "primer fissanti": rivestimenti destinati a stabilizzare le particelle incoerenti del supporto o a conferire proprietà idrorepellenti e/o a proteggere il legno dall'azzurratura;i) "pitture monocomponenti ad alte prestazioni": rivestimenti ad alte prestazioni a base di materiali filmogeni, concepiti per applicazioni che richiedono particolari prestazioni (ad es. strato di fondo e strato di finitura per plastica, strato di fondo per supporti ferrosi o per metalli reattivi come lo zinco e l'alluminio, finiture anticorrosione, rivestimenti per pavimenti, compresi i pavimenti in legno e cemento, resistenza ai graffiti, resistenza alla fiamma e rispetto delle norme igieniche nell'industria alimentare e delle bevande o nelle strutture sanitarie);j) "pitture bicomponenti ad alte prestazioni": rivestimenti destinati agli stessi usi dei monocomponenti, ma con l'aggiunta di un secondo componente (ad es. ammine terziarie) prima dell'applicazione;k) "pitture multicolori": rivestimenti impiegati per ottenere un effetto bicolore o multicolore direttamente dalla prima applicazione;l) "pitture per effetti decorativi": rivestimenti impiegati per ottenere particolari effetti estetici su supporti appositamente preverniciati o su basi, e successivamente trattati con vari strumenti durante la fase di essiccazione.2. Ai fini della presente direttiva, per prodotti per carrozzeria si intendono i prodotti elencati nelle sottocategorie di seguito elencate. Essi sono usati per il rivestimento dei veicoli stradali come definiti nella direttiva 70/156/CEE, o parti di essi, eseguito a fini di riparazione, manutenzione o decorazione al di fuori degli stabilimenti di produzione.2.1. Sottocategorie:a) "prodotti preparatori e di pulizia": prodotti destinati ad eliminare, con azione meccanica o chimica, i vecchi rivestimenti e la ruggine o a fornire una base per l'applicazione di nuovi rivestimenti;i) i prodotti preparatori comprendono detergenti per la pulitura delle pistole a spruzzo ed altre apparecchiature, sverniciatori, sgrassanti (compresi gli sgrassanti antistatici per la plastica) e prodotti per eliminare il silicone;ii) "predetergente": prodotto detergente per la rimozione di contaminanti dalla superficie durante la preparazione e prima dell'applicazione di prodotti vernicianti;b) "Stucco/mastice": composti densi destinati ad essere applicati per riempire profonde imperfezioni della superficie prima di applicare il fondo (surfacer);c) "primer": qualsiasi tipo di rivestimento destinato ad essere applicato sul metallo nudo o su finiture esistenti, per assicurare una protezione contro la corrosione prima dell'applicazione di un fondo;i) "fondo (surfacer)": rivestimento da usare immediatamente prima dello strato di finitura allo scopo di assicurare la resistenza alla corrosione, l'adesione dello strato di finitura, e ottenere la formazione di una superficie uniforme riempiendo le piccole imperfezioni della superficie stessa;ii) "primer universali per metalli": rivestimenti destinati ad essere applicati come prima mano, quali promotori di adesione, isolanti, fondi, sottofondi, primer per plastica, fondi riempitivi bagnato su bagnato non carteggiabili e fondi riempitivi a spruzzo;iii) "primer fosfatante (wash primer)": rivestimenti contenenti almeno lo 0,5 % in peso di acido fosforico e destinati ad essere applicati direttamente sulle superfici metalliche nude per assicurare resistenza alla corrosione e adesione; rivestimenti usati come primer saldabili; e soluzioni mordenti per superfici galvanizzate e zincate;d) "strato di finitura (topcoat)": rivestimento pigmentato destinato ad essere applicato in un solo strato o in più strati per conferire brillantezza e durata. Comprende tutti i prodotti di finitura, come le basi e le vernici trasparenti:i) "base (base coating)": rivestimento contenente pigmenti che serve a conferire al sistema di verniciatura il colore e qualsiasi effetto ottico desiderato, ma non la brillantezza o la resistenza della superficie;ii) "vernice trasparente (clear coating)": rivestimento trasparente che conferisce al sistema di verniciatura la brillantezza finale e le proprietà di resistenza richieste;e) "finiture speciali": rivestimenti destinati ad essere applicati come finiture per conferire proprietà speciali, come effetti metallici o perlati in un unico strato, strati di colore uniforme o trasparenti ad alte prestazioni (ad es. vernici trasparenti antigraffio e fluorurate), basi riflettenti, effetti testurizzati (ad es. effetto martellato), rivestimenti antiscivolo, sigillanti per carrozzeria, rivestimenti antisasso, finiture interne; e aerosol.ALLEGATO II>SPAZIO PER TABELLA>>SPAZIO PER TABELLA>ALLEGATO IIIMETODI DI CUI ALL'ARTICOLO 3, PARAGRAFO 1>SPAZIO PER TABELLA>