Fontos jogi nyilatkozat

|

32000L0045

A Bizottság 2000/45/EK irányelve (2000. július 6.) a takarmányokban található A-vitamin, E-vitamin és triptofán meghatározására szolgáló közösségi analitikai módszerek létrehozásárólEGT vonatkozású szöveg

Hivatalos Lap L 174 , 13/07/2000 o. 0032 - 0050 CS.ES fejezet 3 kötet 30 o. 12  - 30 ET.ES fejezet 3 kötet 30 o. 12  - 30 HU.ES fejezet 3 kötet 30 o. 12  - 30 LT.ES fejezet 3 kötet 30 o. 12  - 30 LV.ES fejezet 3 kötet 30 o. 12  - 30 MT.ES fejezet 3 kötet 30 o. 12  - 30 PL.ES fejezet 3 kötet 30 o. 12  - 30 SK.ES fejezet 3 kötet 30 o. 12  - 30 SL.ES fejezet 3 kötet 30 o. 12  - 30

		A Bizottság 2000/45/EK irányelve(2000. július 6.)a takarmányokban található A-vitamin, E-vitamin és triptofán meghatározására szolgáló közösségi analitikai módszerek létrehozásáról(EGT vonatkozású szöveg)AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA,tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre,tekintettel a legutóbb Ausztria, Finnország és Svédország csatlakozási okmányával [1] módosított, a takarmányok hatósági ellenőrzésénél alkalmazandó közösségi mintavételi és analitikai módszerek bevezetéséről szóló, 1970. július 20-i 70/373/EGK tanácsi irányelvre [2] és különösen annak 2. cikkére,mivel:(1) A 70/373/EGK irányelv előírja, hogy a takarmányok hatósági ellenőrzését, amelynek célja a takarmányok minőségére és összetételére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezésekből eredő követelmények betartásának ellenőrzése, közösségi mintavételi és analitikai módszerek alkalmazásával kell végrehajtani.(2) A legutóbb az 1999. november 17-i 2439/1999/EK bizottsági rendelettel módosított [3], a takarmány-adalékanyagokról szóló, 1970. november 23-i 70/524/EGK tanácsi irányelv [4] előírja, hogy az A- és E-vitamin-tartalmat fel kell tüntetni a címkézésen, amennyiben az említett anyagokat előkeverékekhez vagy takarmányokhoz adják hozzá.(3) A legutóbb a 2000/16/EK bizottsági irányelvvel [5] módosított, az összetett takarmány forgalmazásáról szóló, 1979. április 2-i 79/373/EGK tanácsi irányelv [6] és a legutóbb a 96/25/EK irányelvvel [7] módosított, a különleges táplálkozási célra szánt takarmányokról szóló, 1993. szeptember 13-i 93/74/EGK [8] tanácsi irányelv előírja, hogy az aminosavakat fel kell tüntetni a takarmányok címkézésén.(4) Az említett anyagok ellenőrzésére közösségi analitikai módszereket kell meghatározni.(5) Az ebben az irányelvben előírt intézkedések összhangban vannak a Takarmányok Állandó Bizottsága véleményével,ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET:1. cikkA tagállamoknak előírják, hogy a takarmányok és az előkeverékek A-vitamin-, E-vitamin- és triptofán-tartalmának hatósági ellenőrzése céljából végzett analitikai vizsgálatokat az ezen irányelv mellékletében meghatározott módszerrel kell végrehajtani.2. cikkA tagállamok legkésőbb 2000. augusztus 31-ig hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot.Az intézkedéseket 2000. szeptember 1-jétől alkalmazzák.Amikor a tagállamok elfogadják ezeket az intézkedéseket, azokban hivatkozni kell erre az irányelvre, vagy azokhoz hivatalos kihirdetésük alkalmával ilyen hivatkozást kell fűzni. A hivatkozás módját a tagállamok határozzák meg.3. cikkEz az irányelv az Európai Közösségek Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő 20. napon lép hatályba.4. cikkEnnek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.Kelt Brüsszelben, 2000. július 6-án.a Bizottság részérőlDavid Byrnea Bizottság tagja[1] HL C 241., 1994.8.29., 1. o.[2] HL L 170., 1970.8.3., 2. o.[3] HL L 297., 1999.11.18., 8. o.[4] HL L 270., 1970.12.14., 1. o.[5] HL L 105., 2000.5.3., 36. o.[6] HL L 86., 1979.4.6., 30. o.[7] HL L 125., 1996.5.23., 35. o.[8] HL L 237., 1993.9.22., 23. o.--------------------------------------------------MELLÉKLETA. RÉSZ AZ A-VITAMIN MEGHATÁROZÁSA1. Cél és alkalmazási területEz a módszer a takarmányok és az előkeverékek A-vitamin-(retinol)-tartalmának meghatározására szolgál. Az A-vitamin magában foglalja az ezzel a módszerrel meghatározásra kerülő all-trans-retinyl alkoholt és annak cisz izomerjeit. Az A-vitamin-tartalmat nemzetközi egység (NE)/kg-ban fejezzük ki. Egy NE 0,300 μg all-trans-A-vitamin-alkohol, 0,344 μg all-trans-A-vitamin-acetát vagy 0,550 μg all-trans-A-vitamin-palmitát aktivitásának felel meg.A meghatározás határértéke 2000 NE A-vitamin/kg.2. Vizsgálati alapelvA mintát etanolos kálium-hidroxid oldattal hidrolizáljuk, és az A-vitamint petroléterrel extraháljuk. Az oldószert bepárlással eltávolítjuk, a maradékot metanolban oldjuk, és – szükség esetén – a kívánt koncentrációra hígítjuk. Az A-vitamin-tartalmat fordított fázisú, nagynyomású folyadék-kromatográfiával (RP-HPLC) határozzuk meg, UV- vagy fluoreszcens detektor alkalmazásával. A kromatográfiás paramétereket úgy válasszuk meg, hogy az all-trans-A-vitamin-alkohol és annak cisz izomérjei ne váljanak szét.3. Reagensek3.1. Etanol, σ = 96 %3.2. Petroléter, forrásponttartomány: 40–60 °C3.3. Metil-alkohol3.4. Kálium-hidroxid-oldat, β = 50 g/100 ml3.5. Nátrium-aszkorbát-oldat, β = 10 g/100 ml (lásd Észrevételek 7.7. pont)3.6. Nátrium-szulfid, Na2S · x H2O (x = 7–9)3.6.1. Nátrium-szulfid-oldat, c = 0,5 mol/l glicerinben, β = 120 g/l (x = 9-nél) (lásd Észrevételek 7.8. pont)3.7. Fenolftaleinoldat, β = 2 g/100 ml etanolban (3.1.)3.8. 2-propanol3.9. Mozgó fázis a HPLC-hez: metil-alkohol (3.3.) és víz keveréke, pl. 980 + 20 (v + v). A pontos arányt az alkalmazott oszlop tulajdonságai határozzák meg.3.10. Nitrogén, oxigénmentes3.11. All-trans-A-vitamin-acetát, fokozott tisztaságú, igazolt aktivitású, pl. 2,80 × 106 NE/g3.11.1. All-trans-A-vitamin-acetát törzsoldat: mérjünk be 0,1 mg pontossággal 50 mg A-vitamin acetátot (3.11.) egy 100 ml-es mérőlombikba. Oldjuk fel 2-propanolban (3.8.), majd töltsük fel jelig ugyanazzal az oldószerrel. Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 1400 NE A-vitamin/ml. A pontos A-vitamin-tartalmat az 5.6.3.1. pont szerint kell meghatározni.3.12. All-trans-A-vitamin-palmitát, fokozott tisztaságú, igazolt aktivitású, pl. 1,80 × 106 NE/g3.12.1. All-trans-A-vitamin-palmitát törzsoldat: mérjünk be 0,1 mg pontossággal 80 mg A-vitamin-acetátot (3.12.) egy 100 ml-es mérőlombikba. Oldjuk fel 2-propanolban (3.8.), majd töltsük fel jelig ugyanazzal az oldószerrel. Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 1400 NE A-vitamin/ml. A pontos A-vitamin-tartalmat az 5.6.3.2. pont szerint kell meghatározni.3.13. 2,6-Di-terc-butil-4-metilfenol (BHT) (lásd Észrevételek 7.5. pont)4. Eszközök4.1. Rotációs vákuumbepárló4.2. Sötétített üvegedények4.2.1. 500 ml-es, lapos fenekű vagy Erlenmeyer-lombikok, csiszolt üvegnyakkal4.2.2. Csiszolt üvegdugós, vékony nyakú 10, 25, 100 és 500 ml-es mérőlombikok4.2.3. Kónikus, 1000 ml-es választótölcsérek, csiszolt üvegdugókkal4.2.4. 250 ml-es, körte alakú lombikok, csiszolt üvegnyakkal4.3. Allihn-féle hűtő, köpeny hossza 300 mm, csiszolt üvegcsatlakozóval, adapteres gázadagoló csővel4.4. Redős szűrőpapír a fázisok szétválasztásához, 185 mm átmérőjű (pl. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)4.5. HPLC berendezés, befecskendező rendszerrel4.5.1. Folyadék-kromatográfiás oszlop, 250 mm × 4 mm, C18, 5 vagy 10 μm töltet, vagy azzal egyenértékű (teljesítménykritérium: az alkalmazott HPLC paraméterek mellett az összes retinol-izomer csak egyetlen csúcsot adjon)4.5.2. Állítható hullámhosszúságú UV- vagy fluoreszcens detektor,4.6. Spektrofotométer 10 mm-es kvarcküvettákkal4.7. Vízfürdő, mágneses keverővel4.8. Extraháló készülék (lásd 1. ábra), amely az alábbiakból áll:4.8.1. 1l térfogatú üveghenger, csiszolt üvegnyakkal és -dugóval4.8.2. Oldalirányú bevezetőcsővel és állítható, a feltét közepén áthaladó csővel ellátott, csiszolt üvegből készült feltét. Az állítható csőnek U-alakú alsó véggel, az ellenkező oldalon pedig fúvókával kell rendelkeznie, hogy a hengerben levő felső folyadékréteg átvihető legyen a választótölcsérbe.5. A vizsgálat módjaMegjegyzés:Az A-vitamin fényre (UV) és oxidációra érzékeny. Minden műveletet fénytől elzárva (sötét üvegedényekben vagy alumíniumfóliába tekert üvegedényekben), és oxigén kizárásával (nitrogénáramban) kell végezni. Az extrahálás során a folyadék feletti levegőt nitrogénnel kell eltávolítani (a dugó időszakonkénti meglazításával kerüljük el a túlzottan nagy nyomás kialakulását).5.1. A minta előkészítéseÜgyelve a hőképződés elkerülésére, őröljük a mintát annyira, hogy az áthaladjon egy 1 mm-es szemnagyságú szitán. Az őrlést közvetlenül a súlymérés és a szappanosítás előtt kell végezni, különben A-vitamin-veszteség léphet fel.5.2. SzappanosításAz A-vitamin-tartalomtól függően mérjünk be 0,01 g pontossággal 2–25 g mintát egy 500 ml-es, lapos fenekű vagy Erlenmeyer-lombikba (4.2.1.). Keverés közben adjunk hozzá egymást követően 130 ml etanolt (3.1.), körülbelül 100 mg BHT-t (3.13.), 2 ml nátrium-aszkorbát-oldatot (3.5.) és 2 ml nátrium-szulfid-oldatot (3.6.). Illesszünk a lombikhoz hűtőt (4.3.), és merítsük mágneses keverővel felszerelt vízfürdőbe (4.7.). Hevítsük forrásig a lombik tartalmát, majd hagyjuk visszacsepegni öt percig. Ezután a hűtőn (4.3.) át adjunk hozzá 25 ml kálium-hidroxid-oldatot (3.4.), és hagyjuk visszacsepegni újabb 25 percig, lassú nitrogénáramban történő keverés közben. Ezt követően kb. 20 ml vízzel öblítsük a hűtőt, és hűtsük le a lombik tartalmát szobahőmérsékletűre.5.3. Extrahálás250 ml vízzel történő átöblítéssel dekantáljuk a szappanosítási oldatot teljes mennyiségében egy 1000 ml-es választótölcsérbe (4.2.3.) vagy az extraháló készülékbe (4.8.). Öblítsük a szappanosításhoz használt lombikot egymást követően 25 ml etanollal (3.1.) és 100 ml petroléterrel (3.2.), majd az öblítő oldószereket töltsük a választótölcsérbe vagy az extraháló készülékbe. Az egyesített oldatokban a víz és az etanol aránya körülbelül 2:1 legyen. Rázassuk erőteljesen két percig, majd két percen át hagyjuk ülepedni.5.3.1. Extrahálás választótölcsérrel (4.2.3.)Amikor a rétegek már elkülönültek (lásd Észrevételek 7.3. pont), vigyük át a petroléterréteget egy másik választótölcsérbe (4.2.3.). Az extrahálást ismételjük meg kétszer 100 ml petroléterrel (3.2.), kétszer pedig 50 ml petroléterrel (3.2.).Az egyesített kivonatokat a választótölcsérben mossuk kétszer 100-100 ml vízadaggal, lassú keverés közben (az emulzióképződés megakadályozása céljából), majd többszöri rázatás közben további 100 ml-es vízadagokkal egészen addig, amíg a víz, fenolftaleinoldat (3.7.) hozzáadását követően színtelen nem marad (négyszeri mosás rendszerint elegendő). A szuszpendált víz eltávolítása céljából, a mosott kivonatot szűrjük át a fázisok elkülönítésére szolgáló száraz, redős szűrőpapíron (4.4.) egy 500 ml-es mérőlombikba (4.2.2.). A választótölcsért és a szűrőt öblítsük 50 ml petroléterrel (3.2.), töltsük fel jelig petroléterrel (3.2.), és a tartalmát alaposan keverjük össze.5.3.2. Extrahálás extraháló készülékkel (4.8.)Amikor a rétegek szétváltak (lásd Észrevételek 7.3. pont), helyezzük az üveghenger (4.8.1.) dugója helyére a csiszolt üvegfeltétet (4.8.2.), és helyezzük az állítható cső U-alakú, alsó végét úgy, hogy az éppen a rétegek találkozási felülete felett legyen. Egy nitrogénvezetékből nyomást gyakorolva az oldalcsőre, vigyük át a felső petroléterréteget egy 1000 ml-es választótölcsérbe (4.2.3.). Mérjünk 100 ml petrolétert (3.2.) az üveghengerbe, zárjuk le, és alaposan rázzuk össze. Engedjük szétválni a rétegeket, majd a felső réteget vigyük át a választótölcsérbe az előbbiekben ismertetett módon. Ismételjük meg az extrahálási műveletet további 100 ml petroléterrel (3.2.), majd kétszer 50 ml petroléterrel (3.2.), és vigyük át a petroléterrétegeket a választótölcsérbe.Mossuk az egyesített petroléterkivonatokat az 5.3.1. pontban leírt módon, majd folytassuk a műveletet az ott leírtak szerint5.4. A mintaoldat elkészítése a HPLC-hezPipettázzuk a petroléteroldat aliquot részét (5.3.1. vagy 5.3.2.) egy 250 ml-es, körte alakú lombikba (4.2.4.). Az oldószert pároljuk még éppen nedves állapotúra a rotációs bepárlókészüléken (4.1.), csökkentett nyomáson legfeljebb 40 °C-os vízfürdőben. Nitrogén (3.10.) bejuttatásával állítsuk vissza az atmoszferikus nyomást, és vegyük le a lombikot a rotációs bepárlókészülékről. Nitrogén beáramoltatásával (3.10.) távolítsuk el a maradék oldószert, és a maradékot azonnal oldjuk fel ismert térfogatú (10–100 ml) metil-alkoholban (3.3.) (az A-vitamin koncentrációjának 5 NE/ml és 30 NE/ml között kell lennie).5.5. Meghatározás HPLC-velAz A-vitamin elválasztása fordított fázisú C18 oszlopon (4.5.1.) történik, koncentrációját pedig UV detektor (325 nm) vagy fluoreszcens detektor (gerjesztés: 325 nm, emisszió: 475 nm) (4.5.2.) segítségével mérjük.Fecskendezzünk be az 5.4. lépés szerint nyert metil-alkoholos oldatból egy aliquot részt (pl. 20 μl), és eluáljuk a mozgó fázissal (3.9.). Ugyanabból a mintaoldatból többszöri befecskendezés után számítsuk ki a mintaoldathoz tartozó átlagos csúcsmagasságot (területet), valamint a kalibráló oldatból (5.6.2.) többszöri befecskendezés után számítsuk ki a kalibráló oldathoz tartozó átlagos csúcsmagasságokat (területeket).HPLC paraméterekA következő paraméterek útmutatásul szolgálnak; ettől eltérő paraméterek is alkalmazhatók, feltéve hogy egyenértékű eredményeket adnak.Folyadék-kromatográfiás oszlop (4.5.1.): | 250 mm × 4 mm, C18, 5 vagy 10 μm töltet, vagy azzal egyenértékű |Mozgó fázis (3.9.): | Metil-alkohol (3.3.) és víz keveréke, pl. 980 + 20 (v + v) |Áramlási sebesség: | 1–2 ml/perc |Detektor (4.5.2.): | UV detektor (325 nm) vagy fluoreszcens detektor (gerjesztés: 325 nm/emisszió: 475 nm) |5.6. Kalibrálás5.6.1. A standard munkaoldatok elkészítésePipettázzunk az A-vitamin-acetát törzsoldatból (3.11.1.) 20 ml-t vagy az A-vitamin-palmitát törzsoldatból (3.12.1.) 20 ml-t egy 500 ml-es, lapos fenekű vagy Erlenmeyer-lombikba (4.2.1.), és hidrolizáljuk az 5.2. pontban leírt módon, de BHT hozzáadása nélkül. Ezt követően extraháljuk petroléterrel (3.2.) az 5.3. pont szerint, és töltsük fel 500 ml-re petroléterrel (3.2.). Ebből a kivonatból 100 ml-t pároljunk még éppen nedves állapotig a rotációs bepárlókészüléken (lásd 5.4.), nitrogén áramoltatással távolítsuk el a maradék oldószert (3.10.), majd oldjuk a maradékot 10,0 ml metil-alkoholban (3.3.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 560 NE A-vitamin/ml. A pontos A-vitamin-tartalmat az 5.6.3.3. pont szerint kell meghatározni. A standard munkaoldatot felhasználás előtt frissen kell elkészíteni.Ebből a standard munkaoldatból 2,0 ml-t pipettázzunk egy 20 ml-es mérőlombikba, majd töltsük azt fel jelig metil-alkohollal (3.3.), és keverjük össze. E hígított standard munkaoldat névleges koncentrációja 56 NE A-vitamin/ml.5.6.2. A kalibráló oldatok és a kalibrációs görbe elkészítéseA hígított standard munkaoldatból vigyünk át 1,0, 2,0, 5,0 és 10,0 ml-t 20 ml-es mérőlombikokba, töltsük fel a lombikokat jelig metil-alkohollal (3.3.), és keverjük össze a tartalmukat. Ezeknek az oldatoknak a névleges koncentrációja 2,8, 5,6, 14,0, és 28,0 NE A-vitamin/ml.Minden kalibráló oldatból fecskendezzünk be 20 μl-t több alkalommal, és határozzuk meg az átlagos csúcsmagasságokat (területeket). Figyelembe véve az UV ellenőrzés (5.6.3.3.) eredményeit, az átlagos csúcsmagasságokat (területeket) használva szerkesszük meg a kalibrációs görbét.5.6.3. A standard oldatok UV hitelesítése5.6.3.1. A-vitamin-acetát törzsoldatPipettázzunk az A-vitamin-acetát törzsoldatból (3.11.1.) 2,0 ml-t egy 50 ml-es mérőlombikba (4.2.2.), és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 56 NE A-vitamin/ml. Ebből a hígított A-vitamin-acetát oldatból pipettázzunk 3,0 ml-t egy 25 ml-es mérőlombikba, és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 6,72 NE A-vitamin/ml. Mérjük meg ennek az oldatnak az UV spektrumát spektrofotométeren (4.6.) 2-propanollal (3.8.) szemben, 300 nm és 400 nm között. Az extinkció maximális értékének 325 nm és 327 nm között kell lennie.Az A-vitamin-tartalom kiszámítása:+++++ TIFF +++++5.6.3.2. A-vitamin-palmitát törzsoldatPipettázzunk az A-vitamin-palmitát törzsoldatból (3.12.1.) 2,0 ml-t egy 50 ml-es mérőlombikba (4.2.2.), és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 56 NE A-vitamin/ml. Ebből a hígított A-vitamin-palmitát oldatból pipettázzunk 3,0 ml-t egy 25 ml-es mérőlombikba, és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 6,72 NE A-vitamin/ml. Mérjük meg ennek az oldatnak az UV spektrumát spektrofotométeren (4.6.) 2-propanollal (3.8.) szemben, 300 nm és 400 nm között. Az extinkció maximális értékének 325 nm és 327 nm között kell lennie.Az A-vitamin-tartalom kiszámítása:+++++ TIFF +++++5.6.3.3. A-vitamin standard munkaoldatPipettázzunk az 5.6.1. pont szerint elkészített, hígítatlan A-vitamin standard munkaoldatból 3,0 ml-t egy 50 ml-es mérőlombikba (4.2.2.), és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ebből az oldatból pipettázzunk 5,0 ml-t egy 25 ml-es mérőlombikba, és a lombikot töltsük fel jelig 2-propanollal (3.8.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 6,72 NE A-vitamin/ml. Mérjük meg ennek az oldatnak az UV spektrumát spektrofotométeren (4.6.) 2-propanollal (3.8.) szemben, 300 nm és 400 nm között. Az extinkció maximális értékének 325 nm és 327 nm között kell lennie.Az A-vitamin-tartalom kiszámítása:+++++ TIFF +++++6. Az eredmények kiszámításaA mintaoldat A-vitamin csúcsainak átlagos magasságából (területéből) határozzuk meg a mintaoldat koncentrációját NE/ml-ben, a kalibrációs görbét (5.6.2.) használva.Az A-vitamin-tartalmat (w) NE/kg mintában a következő képlet adja:w =500 . β . V. 1000V. mahol:β = a mintaoldat (5.4.) A-vitamin-koncentrációja, NE/ml-benV1 = a mintaoldat (5.4.) térfogata, ml-benV2 = az 5.4. szerint vett aliquot rész térfogata, ml-benm = a vizsgálati mennyiség tömege, g-ban7. Észrevételek7.1. Alacsony A-vitamin-koncentrációjú minták esetében a HPLC meghatározáshoz hasznos lehet két szappanosítás (kimért mennyiség: 25 g) petroléterkivonatait egy mintaoldatban egyesíteni.7.2. Az analizáláshoz bemért minta nem tartalmazhat 2 g-nál több zsírt.7.3. Ha a fázisok nem válnak szét, adjunk az elegyhez körülbelül 10 ml etanolt (3.1.) az emulzió megbontása céljából.7.4. Tőkehalmájolaj és más tiszta zsírok esetében a szappanosítási időt 45–60 percre kell meghosszabbítani.7.5. BHT helyett hidrokinon is használható.7.6. Normálfázisú oszlop használata esetén a retinol-izomerek szétválaszthatók.7.7. Nátrium-aszkorbát-oldat helyett mintegy 150 mg aszkorbinsav is használható.7.8. Nátrium-szulfid-oldat helyett mintegy 50 mg EDTA is használható.8. IsmételhetőségUgyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg a magasabb érték 15 %-át.9. Kollaboratív vizsgálat eredményei [1]L : a laboratóriumok száman : az egyedi értékek számasr : az ismételhetőség szórásasR : a reprodukálhatóság szórásar : ismételhetőségR : reprodukálhatóságCVr : az ismételhetőség variációs koefficienseCVR : a reprodukálhatóság variációs koefficiense| Előkeverék | Takarmány előkeverék | Ásványi koncentrátum | Fehérje- takarmány | Malactáp |L | 13 | 12 | 13 | 12 | 13 |n | 48 | 45 | 47 | 46 | 49 |átlag [NE/kg] | 17,02 ×106 | 1,21 ×106 | 537100 | 151800 | 18070 |sr [NE/kg] | 0,51 ×106 | 0,039 ×106 | 22080 | 12280 | 682 |r [NE/kg] | 1,43 ×106 | 0,109 ×106 | 61824 | 34384 | 1910 |CVr [ %] | 3,0 | 3,5 | 4,1 | 8,1 | 3,8 |sR [NE/kg] | 1,36 ×106 | 0,069 ×106 | 46300 | 23060 | 3614 |R [NE/kg] | 3,81 ×106 | 0,193 ×106 | 129640 | 64568 | 10119 |CVR [ %] | 8,0 | 6,2 | 8,6 | 15 | 20 |+++++ TIFF +++++B. RÉSZ AZ E-VITAMIN MEGHATÁROZÁSA1. Cél és alkalmazási területEz a módszer a takarmányokban és az előkeverékekben lévő E-vitamin meghatározására szolgál. Az E-vitamin-tartalmat mg DL-α-tokoferol-acetát/kg-ban fejezzük ki. Egy mg DL-α-tokoferol-acetát 0,91 mg DL-α-tokoferolnak (E-vitaminnak) felel meg.A meghatározás határértéke 2 mg E-vitamin/kg.2. Vizsgálati alapelvA mintát etanolos kálium-hidroxid oldattal hidrolizáljuk, és az E-vitamint petroléterrel extraháljuk. Az oldószert bepárlással eltávolítjuk, a maradékot pedig metil-alkoholban oldjuk, és – szükség esetén – a kívánt koncentrációra hígítjuk. Az E-vitamin-tartalmat fordított fázisú, nagynyomású folyadék-kromatográfiával (RP-HPLC) határozzuk meg, fluoreszcens vagy UV detektor alkalmazásával.3. Reagensek3.1. Etanol, σ = 96 %3.2. Petroléter, forrásponttartomány: 40–60 °C3.3. Metil-alkohol3.4. Kálium-hidroxid-oldat, β = 50 g/100 ml3.5. Nátrium-aszkorbát-oldat, β = 10 g/100 ml (lásd Észrevételek 7.7. pont)3.6. Nátrium-szulfid, Na2S · x H2O (x = 7–9)3.6.1. Nátrium-szulfid-oldat, c = 0,5 mol/l glicerinben, β = 120 g/l (x = 9-nél) (lásd Észrevételek 7.8. pont)3.7. Fenolftalein oldat, β = 2 g/100 ml etanolban (3.1.)3.8. Mozgó fázis a HPLC-hez: metil-alkohol (3.3.) és víz keveréke, pl. 980 + 20 (v + v). A pontos arányt az alkalmazott oszlop tulajdonságai határozzák meg.3.9. Nitrogén, oxigénmentes3.10. DL-α-tokoferol-acetát, fokozottan tiszta, igazolt aktivitású3.10.1. DL-α-tokoferol-acetát törzsoldat: mérjünk be 0,1 mg-os pontossággal 100 mg DL-α-tokoferol-acetátot (3.10.) egy 100 ml-es mérőlombikba. Oldjuk fel etanolban (3.1.), majd töltsük fel jelig ugyanezzel az oldószerrel. Ebből az oldatból 1 ml 1 mg DL-α-tokoferol-acetátot tartalmaz. (Az UV ellenőrzést lásd az 5.6.1.3. pontban; a stabilizálást lásd Észrevételek 7.4. pont).3.11. DL-α-tokoferol, fokozottan tiszta, igazolt aktivitású3.11.1. Mérjünk be 0,1 mg-os pontossággal 100 mg DL-α-tokoferolt (3.10.) egy 100 ml-es mérőlombikba. Oldjuk fel etanolban (3.1.), majd töltsük fel jelig ugyanezzel az oldószerrel. Ebből az oldatból 1 ml 1 mg DL-α-tokoferolt tartalmaz. (Az UV ellenőrzést lásd az 5.6.2.3. pontban; a stabilizálást lásd Észrevételek 7.4. pont).3.12. 2,6-Di-terc-butil-4-metilfenol (BHT) (lásd Észrevételek 7.5. pont)4. Eszközök4.1. Rotációs vákuumbepárló4.2. Sötétített üvegedények4.2.1. 500 ml-es, lapos fenekű vagy Erlenmeyer-lombikok csiszolt üvegnyakkal4.2.2. Csiszolt üvegdugós, vékony nyakú 10, 25, 100 és 500 ml-es mérőlombikok4.2.3. Kónikus, 1000 ml-es választótölcsérek csiszolt üvegdugókkal4.2.4. 250 ml-es, körte alakú lombikok csiszolt üvegnyakkal4.3. Allihn-féle hűtő, köpeny hossza 300 mm, csiszolt üvegcsatlakozóval, adapteres gázadagolócsővel4.4. Redős szűrőpapír a fázisok szétválasztásához, 185 mm átmérőjű (pl. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)4.5. HPLC berendezés befecskendező rendszerrel4.5.1. Folyadék-kromatográfiás oszlop, 250 mm × 4 mm, C18, 5 vagy 10 μm töltet, vagy azzal egyenértékű4.5.2. Állítható hullámhosszúságú, fluoreszcens- vagy UV detektor,4.6. Spektrofotométer 10 mm-es kvarcküvettákkal4.7. Vízfürdő mágneses keverővel4.8. Extraháló készülék (lásd az 1. ábrát), amely a következőkből áll:4.8.1. 1 l térfogatú üveghenger, csiszolt üvegnyakkal és -dugóval4.8.2. Oldalirányú bevezetőcsővel és állítható, középen áthaladó csővel felszerelt csiszolatos üvegbetét. Az állítható cső alsó vége U-alakú, az ellenkező oldalon pedig kivezető nyílás legyen, hogy a hengerben levő felső folyadékréteg átvihető legyen egy választótölcsérbe.5. A vizsgálat módjaMegjegyzés:Az E-vitamin fényre (UV) és oxidációra érzékeny. Minden műveletet fénytől elzárva (sötét üvegedényeket vagy alumíniumfóliába tekert üvegedényeket használva) és oxigén kizárásával (nitrogénáramban) kell elvégezni. Az extrahálás során a folyadék feletti levegőt nitrogénnel kell eltávolítani (a dugó időszakonkénti meglazításával kerüljük el a túlzottan nagy nyomás kialakulását).5.1. A minta elkészítéseÜgyelve a hőképződés elkerülésére, őröljük meg a mintát annyira, hogy az áthaladjon egy 1 mm-es szemnagyságú szitán. Az őrlést közvetlenül a súlymérés és a szappanosítás előtt kell végezni, különben E-vitamin-veszteség léphet fel.5.2. SzappanosításAz E-vitamin-tartalomtól függően mérjünk be 0,01 g pontossággal 2–25 g mintát egy 500 ml-es, lapos fenekű vagy Erlenmeyer-lombikba (4.2.1.). Keverés közben adjunk hozzá egymást követően 130 ml etanolt (3.1.), körülbelül 100 mg BHT-t (3.12.), 2 ml nátrium-aszkorbát-oldatot (3.5.) és 2 ml nátrium-szulfid oldatot (3.6.). Illesszük a lombikhoz a hűtőt (4.3.), és merítsük a mágneses keverővel felszerelt vízfürdőbe (4.7.). Hevítsük forrásig, majd hagyjuk visszacsepegni öt percig. Ezután a hűtőn keresztül (4.3.) adjunk hozzá 25 ml kálium-hidroxid-oldatot (3.4.), és hagyjuk visszacsepegni újabb 25 percig, lassú nitrogénáramban történő keverés közben. Ezt követően, kb. 20 ml vízzel öblítsük a hűtőt, és hűtsük le a lombik tartalmát szobahőmérsékletűre.5.3. Extrahálás250 ml vízzel történő átöblítéssel dekantáljuk a szappanosítási oldatot egy 1000 ml-es választótölcsérbe (4.2.3.) vagy az extraháló készülékbe (4.8.). Öblítsük a szappanosításhoz használt lombikot egymást követően 25 ml etanollal (3.1.) és 100 ml petroléterrel (3.2.), majd vigyük át az öblítő oldószereket a választótölcsérbe vagy az extraháló készülékbe. Az egyesített oldatban a víz és az etanol aránya körülbelül 2:1 legyen. Az oldatot rázassuk erőteljesen két percig, majd két percen át hagyjuk ülepedni.5.3.1. Extrahálás választótölcsérrel (4.2.3.)A rétegek szétválása után (lásd Észrevételek 7.3. pont), vigyük át a petroléterréteget egy másik választótölcsérbe (4.2.3.). Az extrahálást ismételjük meg kétszer 100 ml petroléterrel (3.2.), kétszer pedig 50 ml petroléterrel (3.2.).Az egyesített kivonatokat a választótölcsérben mossuk kétszer 100–100 ml vízadaggal lassú keverés közben (az emulzióképződés elkerülése céljából), majd többszöri rázatás közben további 100 ml-es vízadagokkal egészen addig, amíg a víz, fenolftaleinoldat (3.7.) hozzáadását követően színtelen nem marad (négyszeri mosás rendszerint elegendő). A mosott kivonatot szűrjük át a fázisok elkülönítésére szolgáló száraz, redős szűrőpapíron (4.4.) egy 500 ml-es mérőlombikba (4.2.2.) a szuszpendált víz eltávolítása céljából. A választótölcsért és a szűrőt öblítsük 50 ml petroléterrel (3.2.), töltsük fel jelig petroléterrel (3.2.), és a tartalmát alaposan keverjük össze.5.3.2. Extrahálás extraháló készülékkel (4.8.)A rétegek szétválása után (lásd Észrevételek 7.3. pont), helyezzük az üveghenger (4.8.1.) dugója helyére a csiszolatos üvegbetétet (4.8.2.), és helyezzük az állítható cső U-alakú alsó végét úgy, hogy az éppen a rétegek találkozási felülete felett legyen. Az oldalirányú csőre gyakorolt nitrogénnyomás segítségével vigyük át a felső petroléterréteget egy 1000 ml-es választótölcsérbe (4.2.3.). Mérjünk 100 ml petrolétert (3.2.) az üveghengerbe, helyezzük vissza a dugót, és alaposan rázzuk össze. Hagyjuk szétválni a rétegeket, majd a felső réteget vigyük át a választótölcsérbe az előbbiekben ismertetett módon. Ismételjük meg az extrahálást további 100 ml petroléterrel (3.2.), majd kétszer 50 ml petroléterrel (3.2.), és vigyük át a petroléterrétegeket a választótölcsérbe.Mossuk az egyesített petroléterkivonatokat az 5.3.1. pontban leírt módon, majd folytassuk a műveletet az ott leírtak szerint.5.4. A mintaoldat elkészítése a HPLC-hezPipettázzuk a petroléter oldat aliquot részét (5.3.1. vagy 5.3.2.) egy 250 ml-es, körte alakú lombikba (4.2.4.). Az oldószert pároljuk még éppen nedves állapotúra a rotációs bepárlókészüléken (4.1.), csökkentett nyomáson, legfeljebb 40 °C-os vízfürdőben. Nitrogén (3.9.) bejuttatásával állítsuk vissza az atmoszferikus nyomást, és vegyük le a lombikot a rotációs bepárlókészülékről. Nitrogénáram (3.9.) segítségével távolítsuk el a maradék oldószert, és a maradékot azonnal oldjuk fel ismert térfogatú (10–100 ml) metil-alkoholban (3.3.) (a DL-α-tokoferol koncentrációjának 5 μg/ml és 30 μg/ml között kell lennie).5.5. Meghatározás HPLC-velAz E-vitamin elválasztása fordított fázisú C18 oszlopon (4.5.1.) történik, koncentrációját fluoreszcens detektor (gerjesztés: 295 nm, emisszió: 330 nm) vagy UV detektor (292 nm) (4.5.2.) segítségével mérjük.Fecskendezzünk be az 5.4. pont szerinti metil-alkoholos oldatból egy aliquot részt (pl. 20 μl), és mossuk a mozgó fázissal (3.8.). Ugyanabból a mintaoldatból többször befecskendezve számítsuk ki a mintaoldathoz tartozó átlagos csúcsmagasságokat (területeket), valamint a kalibráló oldatokból (5.6.2.) többször befecskendezve a kalibráló oldatokhoz tartozó átlagos csúcsmagasságokat (területeket).HPLC paraméterekA következő paraméterek útmutatásul szolgálnak; más paraméterek is alkalmazhatók, feltéve hogy egyenértékű eredményeket adnak.Folyadék-kromatográfiás oszlop (4.5.1.): | 250 mm × 4 mm, C18, 5 vagy 10 μm töltet, vagy azzal egyenértékű |Mozgó fázis (3.8.): | Metil-alkohol (3.3.) és víz keveréke, pl. 980 + 20 (v + v) |Áramlási sebesség: | 1–2 ml/perc |Detektor (4.5.2.): | Fluoreszcens detektor (gerjesztés: 295 nm/emisszió: 330 nm) vagy UV detektor (292 nm) |5.6. Kalibrálás (DL-α-tokoferol-acetát vagy DL-α-tokoferol)5.6.1. DL-α-tokoferol-acetát standard5.6.1.1. A standard munkaoldat elkészítésePipettázzunk a DL-α-tokoferol-acetát törzsoldatból (3.10.1.) 25 ml-t egy 500 ml-es, lapos fenekű vagy Erlenmeyer-lombikba (4.2.1.), és hidrolizáljuk az 5.2. pontban leírt módon. Ezt követően extraháljuk petroléterrel (3.2.) az 5.3. pont szerint, és töltsük fel 500 ml-re petroléterrel. Ebből a kivonatból 25 ml-t pároljunk még éppen nedves állapotúra a rotációs bepárlókészüléken (lásd 5.4.), távolítsuk el a maradék oldószert nitrogénárammal (3.9.), majd oldjuk a maradékot 25,0 ml metil-alkoholban (3.3.). Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 45,5 μg DL-α-tokoferol/ml, ami egyenértékű 50 μg DL-α-tokoferol-acetát/ml-rel. A standard munkaoldatot felhasználás előtt frissen kell elkészíteni.5.6.1.2. A kalibráló oldatok és a kalibrációs görbe elkészítéseA standard munkaoldatból vigyünk át 1,0, 2,0, 4,0 és 10,0 ml-t 20 ml-es mérőlombikokba, töltsük fel a lombikokat jelig metil-alkohollal (3.3.), és keverjük össze a tartalmukat. Ezeknek az oldatoknak a névleges koncentrációja 2,5, 5,0, 10,0 és 25,0 μg/ml DL-α-tokoferol-acetát, azaz 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml és 22,8 μg/ml DL-α-tokoferol.Fecskendezzünk többször 20 μl-t a kalibráló oldatok mindegyikéből, és határozzuk meg az átlagos csúcsmagasságokat (területeket). Az átlagos csúcsmagasságokat (területek) használva készítsük el a kalibrációs görbét.5.6.1.3 A DL-α-tokoferol-acetát törzsoldat (3.10.1.) UV hitelesítéseEtanollal hígítsuk a DL-α-tokoferol-acetát törzsoldat (3.10.1.) 5,0 ml-ét 25,0 ml-re, majd mérjük meg ennek az oldatnak az UV spektrumát spektrofotométeren (4.6.) etanollal (3.1.) szemben, 250 nm és 320 nm között.Az abszorbancia maximális értéke 284 nm kell, hogy legyen:+++++ TIFF +++++Ennél a hígításnál 0,84 és 0,88 közötti extinkciós értéket kell kapni.5.6.2. DL-α-tokoferol standard5.6.2.1. A munkastandard-oldatok készítésePipettázzunk a DL-α-tokoferol törzsoldatból (3.11.1.) 2,0 ml-t egy 50 ml-es mérőlombikba, oldjuk fel metil-alkoholban (3.3.), és töltsük fel jelig metil-alkohollal. Ennek az oldatnak a névleges koncentrációja 40 μg DL-α-tokoferol/ml, ami egyenértékű 44,0 μg DL-α-tokoferol-acetát/ml-rel. A standard munkaoldatot felhasználás előtt frissen kell készíteni.5.6.2.2. A kalibráló oldatok és a kalibrációs görbe elkészítéseA standard munkaoldatból vigyünk át 1,0, 2,0, 4,0 és 10,0 ml-t 20 ml-es mérő-lombikokba, töltsük fel a lombikokat jelig metil-alkohollal (3.3.), és keverjük össze a tartalmukat. Ezeknek az oldatoknak a névleges koncentrációja 2,0, 4,0, 8,0 és 20,0 μg/ml DL-α-tokoferol, azaz 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml és 22,0 μg/ml DL-α-tokoferol-acetát.Fecskendezzünk többször 20 μl-t a kalibráló oldatok mindegyikéből, és határozzuk meg az átlagos csúcsmagasságokat (területeket). Az átlagos csúcsmagasságokat (területeket) használva készítsük el a kalibrációs görbét.5.6.2.3. A DL-α-tokoferol törzsoldat (3.11.1.) UV hitelesítéseEtanollal hígítsuk a DL-α-tokoferol törzsoldat (3.11.1.) 2,0 ml-ét 25,0 ml-re, majd mérjük meg ennek az oldatnak az UV spektrumát spektrofotométeren (4.6.) etanollal (3.1.) szemben, 250 nm és 320 nm között. Az abszorbancia maximális értéke 292 nm kell, hogy legyen:+++++ TIFF +++++Ennél a hígításnál 0,6-os extinkciós értéket kell kapni.6. Az eredmények kiszámításaA mintaoldat E-vitamin-csúcsainak átlagos magasságából (területéből) a kalibrációs görbét (5.6.1.2. vagy 5.6.2.2.) használva határozzuk meg a mintaoldat koncentrációját μg/ml-ben (a-tokoferol-acetátban számolva).Az E-vitamin-tartalmat (w) mg/kg mintában kifejezve a következő képlet adja:+++++ TIFF +++++ahol:β = a mintaoldat (5.4.) E-vitamin-koncentrációja, μg/ml-benV1 = a mintaoldat (5.4.) térfogata, ml-benV2 = az 5.4. szerint vett aliquot rész térfogata, ml-benm = a vizsgálati mennyiség tömege, g-ban7. Észrevételek7.1. Alacsony E-vitamin-koncentrációjú minták esetében a HPLC meghatározáshoz hasznos lehet a két szappanosítás petroléterkivonatait (kimért mennyiség: 25 g) egy mintaoldattá egyesíteni.7.2. Az analizálandó minta nem tartalmazhat 2 g-nál több zsírt.7.3. Ha a fázisok szétválása nem történik meg, adjunk kb. 10 ml etanolt (3.1.) az emulzió megbontása céljából.7.4. A DL-α-tokoferol-acetát- vagy DL-α-tokoferol-oldat 5.6.1.3., illetve 5.6.2.3. szerinti spektrofotometriás mérése után adjunk kb. 10 mg BHT-t (3.12.) az oldathoz (3.10.1. vagy 3.10.2.), és tartsuk az oldatot hűtőszekrényben (a tárolási időtartam legfeljebb négy hét).7.5. BHT helyett hidrokinon is használható.7.6. Normálfázisú oszlopot használva lehetséges az α-, β-, χ- és δ-tokoferol elválasztása.7.7. Nátrium-aszkorbát-oldat helyett 150 mg körüli aszkorbinsav is használható.7.8. Nátrium-szulfid-oldat helyett 50 mg körüli EDTA is használható.8. IsmételhetőségUgyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg a magasabb érték 15 %-át.9. Kollaborációs vizsgálat eredményei [2]L : a laboratóriumok száman : az egyedi értékek számasr : az ismételhetőség szórásasR : a reprodukálhatóság szórásar : ismételhetőségR : reprodukálhatóságCVr : az ismételhetőség variációs koefficienseCVR : a reprodukálhatóság variációs koefficiense| Előkeverék | Takarmány előkeverék | Ásványi koncentrátum | Fehérje- takarmány | Malactáp |L | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |n | 48 | 48 | 48 | 48 | 48 |átlag [mg/kg] | 17380 | 1187 | 926 | 315 | 61,3 |sr [mg/kg] | 384 | 45,3 | 25,2 | 13,0 | 2,3 |r [mg/kg] | 1075 | 126,8 | 70,6 | 36,4 | 6,4 |CVr [ %] | 2,2 | 3,8 | 2,7 | 4,1 | 3,8 |sR [mg/kg] | 830 | 65,0 | 55,5 | 18,9 | 7,8 |R [mg/kg] | 2324 | 182,0 | 155,4 | 52,9 | 21,8 |CVR [ %] | 4,8 | 5,5 | 6,0 | 6,0 | 12,7 |+++++ TIFF +++++C. RÉSZ A TRIPTOFÁN MEGHATÁROZÁSA1. Cél és alkalmazási területA módszer a takarmányokban található összes és a szabad triptofán meghatározására szolgál. Nem különbözteti meg a D- és az L-formákat.2. Vizsgálati alapelvAz összes triptofán meghatározásához a mintát alkalikus körülmények között, telített bárium-hidroxid-oldattal hidrolizáljuk, majd 110 °C-ra hevítjük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 20 órán át. Hidrolízis után belső standardot adunk hozzá.A szabad triptofán meghatározásához a mintát enyhén savas körülmények között extraháljuk belső standard jelenlétében.A hidrolizátumban vagy a kivonatban található triptofánt és a belső standardot HPLC-módszerrel, fluoreszcens detektálással határozzuk meg.3. Reagensek3.1. Bideszt vagy azzal egyenértékű minőségű vizet kell használni (konduktivitás < 10 μS/cm).3.2. Standard anyag: vákuumban, foszfor-pentoxid felett szárított triptofán (tisztaság/tartalom ≥ 99 %)3.3. Belső standard anyag: vákuumban, foszfor-pentoxid felett szárított α-metil-triptofán (tisztaság/tartalom ≥ 99 %)3.4. Bárium-hidroxid oktahidrát (BaCO3 képződésének elkerülése érdekében ügyelnünk kell arra, hogy a Ba(OH)2 · 8 H2O-t ne tegyük ki túlzott mértékben levegő hatásának, mert ez zavarhatja a meghatározást) (lásd Észrevételek 9.3. pont).3.5. Nátrium-hidroxid3.6. Ortofoszforsav, w = 85 %3.7. Sósav, ρ20 = 1,19 g/ml3.8. Metil-alkohol, HPLC tisztaságú3.9. Petroléter, forrásponttartomány 40–60 °C3.10. Nátrium-hidroxid-oldat, c = 1 mol/l:Oldjunk fel 40,0 g NaOH-t (3.5.) vízben, és vízzel (3.1.) töltsük fel 1 l-re.3.11. Sósav, c = 6 mol/l:Vegyünk 492 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 l-re.3.12. Sósav, c = 1 mol/l:Vegyünk 82 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 l-re.3.13. Sósav, c = 0,1 mol/l:Vegyünk 8,2 ml HCl-t (3.7.), és vízzel töltsük fel 1 l-re.3.14. Ortofoszforsav, c = 0,5 mol/l:Vegyünk 34 ml ortofoszforsavat (3.6.), és vízzel (3.1.) töltsük fel 1 l-re.3.15. Triptofán (3.2.) koncentrált oldata, c = 2,50 μmol/ml:Egy 500 ml-es mérőlombikban oldjunk fel 0,2553 g triptofánt (3.2.) sósavban (3.13.), majd az oldatot töltsük fel jelig sósavval (3.13.). Tároljuk –18 °C-on maximum négy hétig.3.16. Koncentrált belső standard oldat, c = 2,50 μmol/ml:Egy 500 ml-es mérőlombikban oldjunk fel 0,2728 g triptofánt (3.3.) sósavban (3.13.), majd az oldatot töltsük fel jelig sósavval (3.13.). Tároljuk –18 °C-on maximum négy hétig.3.17. A triptofán kalibráló standard oldata és a belső standard:Vegyünk 2,00 ml-t a triptofán koncentrált oldatából (3.15.) és 2,00 ml-t a koncentrált belső standard (α-metil-triptofán) oldatból (3.16.). Oldjuk fel vízben (3.1.) és metil-alkoholban (3.8.) a kész hidrolizátuméval körülbelül azonos térfogatra és körülbelül azonos metil-alkohol koncentrációra (10–30 %).Az oldatot felhasználás előtt frissen kell elkészíteni.Készítés során közvetlen napfényhatástól óvjuk.3.18. Ecetsav3.19. 1,1,1-triklór-2-metil-2-propanol3.20. Etanolamin > 98 %3.21. 1 g 1,1,1-triklór-2-metil-2-propanol (3.19.) 100 ml metil-alkoholban készített oldata (3.8)3.22. Mozgó fázis a HPLC-hez: 3,00 g ecetsav (3.18.) + 900 ml víz (3.1.) + 1,1,1-triklór-2-metil-2-propanol (3.19.) metil-alkoholban (3.8.) készített oldatának (3.21.) 50,0 ml-e (1 g/100 ml). A pH-t állítsuk 5,00-re etanolaminnal (3.20.). Az oldatot vízzel (3.1.) töltsük fel 1000 ml-re.4. Eszközök4.1. HPLC készülék spektrofluorometriás detektorral4.2. Folyadékkromatográfiás oszlop, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm töltet, vagy azzal egyenértékű oszlop4.3. pH-mérő4.4. Polipropilén lombik, 125 ml térfogatú, széles nyakkal és csavaros zárókupakkal4.5. Membránszűrő, 0,45 μm4.6. Autokláv, 110 (±2) °C, 1,4 (±0,1) bar4.7. Mechanikus rázógép vagy mágneses keverő4.8. Kémcsőkeverő (vortex)5. A vizsgálat módja5.1. A minták elkészítéseŐröljük meg a mintát annyira, hogy az áthaladjon egy 0,5 mm-es szemméretű szitán. Őrlés előtt a nagy nedvességtartalmú mintákat vagy légszáraz állapotba kell hozni 50 °C-nál nem magasabb hőmérsékleten, vagy liofilizálni kell azokat. A nagy zsírtartalmú mintákat őrlés előtt petroléterrel (3.9.) extrahálni kell.5.2. A szabad triptofán (kivonat) meghatározása1 mg-os pontossággal mérjünk be az elkészített mintából (5.1.) megfelelő mennyiséget (1–5 g) egy Erlenmeyer-lombikba. Adjunk hozzá 100,0 ml sósavat, k = 0,1 mol/l (3.13.) és 5,00 ml koncentrált belső standard oldatot (3.16.). Rázzuk vagy keverjük 60 percen át mechanikus rázógépen vagy mágneses keverőn (4.7.). Engedjük a zagyot leülepedni, majd pipettázzunk a felülúszó oldatból 10,0 ml-t főzőpohárba. Adjunk hozzá 5 ml ortofoszforsavat, k = 0,5 mol/l (3.14.). Nátrium-hidroxiddal, k = 1,0 mol/l (3.10.) állítsuk a pH-t 3,0-ra. Adjunk hozzá annyi metil-alkoholt (3.8.), hogy a végtérfogatra számított metil-alkohol-koncentráció 10 és 30 % között legyen. Vigyük át megfelelő űrtartalmú mérőlombikba, és vízzel hígítsuk a kromatográfiához szükséges térfogatra (körülbelül a kalibráló standard oldat (3.17.) térfogatával megegyező térfogatra).A HPLC oszlopra való felvitel előtt szűrjük át az oldat néhány ml-ét 0,45 μm-es membránszűrőn (4.5.). A kromatográfiát az 5.4. bekezdés szerint végezzük.A standard oldatot és a kivonatokat óvjuk a közvetlen napfényhatástól. Ha a kivonatokat nem lehet a készítés napján analizálni, azok 5 °C-on legfeljebb három napig tárolhatók.5.3. Az összes triptofán (hidrolizátum) meghatározásaAz elkészített mintából (5.1.) mérjünk be 0,2 mg-os pontossággal 0,1–1 g-ot a polipropilén lombikba (4.4.). A kimért mintamennyiség nitrogéntartalmának kb. 10 mg-nak kell lennie. Adjunk hozzá 8,4 g bárium-hidroxid-oktahidrátot (3.4.) és 10 ml vizet. Keverjük össze kémcsőkeverővel (4.8.) vagy mágneses keverőn (4.7.). A teflon-bevonatú mágnest hagyjuk a keverékben. Mossuk le 4 ml vízzel az edény falát. Helyezzük rá a csavaros zárókupakot, és lazán zárjuk le a lombikot. Helyezzük autoklávba (4.6.) forró vízzel és gőzzel 30–60 percre. Zárjuk be az autoklávot, és indítsuk el 110 (±2) °C hőmérsékleten 20 órán át.Az autokláv kinyitása előtt csökkentsük a hőmérsékletet kevéssel 100 °C alá. A Ba(OH)2 · 8 H2O kikristályosodásának elkerülése érdekében adjunk a meleg keverékhez 30 ml, szobahőmérsékletű vizet. Óvatosan rázzuk vagy keverjük össze. Adjunk hozzá 2,00 ml koncentrált belső standard (α-metil-triptofán) oldatot (3.16.). Hűtsük az edényeket víz- vagy jégfürdőben 15 percen át.Ezután adjunk hozzá 5 ml ortofoszforsavat, k = 0,5 mol/l (3.14.). Tartsuk az edényt a hűtőfürdőben, és keverés közben semlegesítsük az oldatot sósavval, k = 6 mol/l (3.11.), majd állítsuk a pH-t 3,0-ra sósavval, k = 1 mol/l (3.12.). Adjunk hozzá annyi metil-alkoholt, hogy a végtérfogatra számított metil-alkohol-koncentráció 10 és 30 % között legyen. Vigyük át megfelelő űrtartalmú mérőlombikba, és vízzel hígítsuk a kromatográfiához szükséges térfogatra (például 100 ml-re). Ügyeljünk, hogy a metil-alkohol hozzáadása ne okozzon kicsapódást.A HPLC oszlopra való felvitel előtt szűrjük át az oldat néhány ml-ét 0,45 μm-es membránszűrőn (4.5.). A kromatográfiát az 5.4. bekezdés szerint végezzük.A standard oldatot és a kivonatokat óvjuk a közvetlen napfényhatástól. Ha a kivonatokat nem lehet a készítés napján analizálni, azok 5 °C-on legfeljebb három napig tárolhatók.5.4. Meghatározás HPLC-velAz izokratikus elúcióra vonatkozó következő paraméterek útmutatásul szolgálnak; más paraméterek is alkalmazhatók, feltéve hogy azok egyenértékű eredményeket adnak (lásd még Észrevételek 9.1. és 9.2. pont).Folyadék-kromatográfiás oszlop (4.2.): | 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm töltet, vagy azzal egyenértékű oszlop |Oszlophőmérséklet: | szobahőmérséklet |Mozgó fázis (3.22.): | 3,00 g ecetsav (3.18.) + 900 ml víz (3.1.) + az 1,1,1-triklór-2-metil-2-propanol (3.19.) metil-alkohollal (3.8.) készült oldatának (3.21.) (1 g/100 ml) 50,0 ml-e. A pH-t etanolaminnal (3.20.) állítsuk 5,00-re. Vízzel (3.1.) töltsük fel 1000 ml-re. |Áramlási sebesség: | 1 ml/perc |Teljes futtatási idő: | körülbelül 34 perc |Kimutatási hullámhossz: | gerjesztés: 280 nm, emisszió: 356 nm |Befecskendezett mennyiség: | 20 μl |6. Az eredmények kiszámítása+++++ TIFF +++++A = a belső standard, standard kalibráló oldat (3.17.) csúcsterületeB = a triptofán, kivonat (5.2.) vagy hidrolizátum (5.3.), csúcsterületeC = a kalibráló oldathoz (3.17.) hozzáadott koncentrált triptofánoldat (3.15.) térfogata, ml-ben (2 ml)D = a kalibráló oldathoz (3.17.) hozzáadott koncentrált triptofánoldat (3.15.) koncentrációja, μmol/ml-ben (= 2,50)E = az extrahálásnál (5.2.) (= 5,00 ml) vagy a hidrolizátumhoz (5.2.) (= 2,00 ml) hozzáadott, koncentrált belső standard oldat (3.16.) térfogata, ml-benF = a belső standard, kivonat (5.2.) vagy hidrolizátum (5.3.), csúcsterületeG = a triptofán, standard kalibráló oldat (3.17.) csúcsterületeH = a standard kalibráló oldathoz (3.17.) hozzáadott, koncentrált belső standard oldat (3.16.) térfogata, ml-ben (= 2,00 ml)W = a minta tömege, g-ban (szárított és/vagy zsírtalanított minta esetében az eredeti súlyra korrigált)MW = a triptofán molekulatömege (= 204,23)7. IsmételhetőségUgyanazon a mintán végzett két párhuzamos meghatározás eredményének különbsége nem haladhatja meg a magasabb érték 10 %-át.8. Kollaborációs vizsgálat eredményeiKözösségi kollaborációs vizsgálatra került sor (negyedik körvizsgálat), amelynek során három mintát vizsgáltak meg a hidrolízis módszerének hitelesítése céljából, 12 laboratóriumban. Mindegyik mintát többször (5) analizáltak. Az eredményeket a következő táblázat tartalmazza:L : eredményeket beküldő laboratóriumok száman : a (Cochran által Dixon-szélsőértékpróbával azonosított) szélsőértékek kizárását követően megmaradt egyedi értékek számasr : az ismételhetőség szórásasR : a reprodukálhatóság szórásar : ismételhetőségR : reprodukálhatóságCVr : az ismételhetőség variációs koefficiense, %CVR : a reprodukálhatóság variációs koefficiense, %| 1. minta Sertéstáp | 2. minta L-triptofánnal kiegészített sertéstáp | 3. minta Takarmánykoncentrátum sertések számára |L | 12 | 12 | 12 |n | 50 | 55 | 50 |Átlag [g/kg] | 2,42 | 3,40 | 4,22 |sr [g/kg] | 0,05 | 0,05 | 0,08 |r [g/kg] | 0,14 | 0,14 | 0,22 |CVr [ %] | 1,9 | 1,6 | 1,9 |sR [g/kg] | 0,15 | 0,20 | 0,09 |R [g/kg] | 0,42 | 0,56 | 0,25 |CVR [ %] | 6,3 | 6,0 | 2,2 |Egy másik közösségi kollaborációs vizsgálatot is végeztek (harmadik körvizsgálat), amelynek során két mintát vizsgáltak meg a szabad triptofán kivonására használt módszer hitelesítése céljából, 13 laboratóriumban. Mindegyik mintát többször (5) analizáltak. Az eredményeket a következő táblázat tartalmazza:L : eredményeket beküldő laboratóriumok száman : a (Cochran által Dixon-szélsőértékpróbával azonosított) szélsőértékek kizárását követően megmaradt egyedi értékek számasr : az ismételhetőség szórásasR : a reprodukálhatóság szórásar : ismételhetőségR : reprodukálhatóságCVr : az ismételhetőség variációs koefficiense, %CVR : a reprodukálhatóság variációs koefficiense, %| 4. minta Búza és szója keveréke | 5. minta Búza és szója keveréke (= 4. minta), hozzáadott triptofánnal (0,457 g/kg) |L | 12 | 12 |n | 55 | 60 |Átlag [g/kg] | 0,391 | 0,931 |sr [g/kg] | 0,005 | 0,012 |r [g/kg] | 0,014 | 0,034 |CVr [ %] | 1,34 | 1,34 |sR [g/kg] | 0,018 | 0,048 |R [g/kg] | 0,050 | 0,134 |CVR [ %] | 4,71 | 5,11 |Egy további közösségi körvizsgálatot is végeztek, amelynek során négy mintát vizsgáltak meg a triptofán hidrolízisére használt módszer hitelesítése céljából, hét laboratóriumban. Az eredmények az alábbi táblázatban szerepelnek. Mindegyik mintát többször (5) analizáltak.L : eredményeket beküldő laboratóriumok száman : a (Cochran által Dixon-szélsőértékpróbával azonosított) szélsőértékek kizárását követően megmaradt egyedi értékek számasr : az ismételhetőség szórásasR : a reprodukálhatóság szórásar : ismételhetőségR : reprodukálhatóságCVr : az ismételhetőség variációs koefficiense, %CVR : a reprodukálhatóság variációs koefficiense, %| 1. minta Sertéstakarmány-keverék (CRM 117) | 2. minta Alacsony zsírtartalmú halliszt (CRM 118) | 3. minta Szójaliszt (CRM 119) | 4. minta Fölözött tejpor (CRM 120) |L | 7 | 7 | 7 | 7 |n | 25 | 30 | 30 | 30 |Átlag [g/kg] | 2,064 | 8,801 | 6,882 | 5,236 |sr [g/kg] | 0,021 | 0,101 | 0,089 | 0,040 |r [g/kg] | 0,059 | 0,283 | 0,249 | 0,112 |CVr [ %] | 1,04 | 1,15 | 1,30 | 0,76 |sR [g/kg] | 0,031 | 0,413 | 0,283 | 0,221 |R [g/kg] | 0,087 | 1,156 | 0,792 | 0,619 |CVR [ %] | 1,48 | 4,69 | 4,11 | 4,22 |9. Észrevételek9.1. Speciális kromatográfiás paraméterek alkalmazása a triptofán és az α-metil-triptofán jobb elválasztását teheti lehetővé.Izokratikus elúció, majd grádiens oszlopon történő tisztítás:Folyadékkromatográfiás oszlop: | 125 mm × 4 mm, C18, 5 μmtöltet, vagy azzal egyenértékű oszlop |Oszlophőmérséklet: | 32 °C |Mozgó fázis: | A: 0,01 mol/l KH2PO4/metil-alkohol, 95 + 5 (V + V). B: Metil-alkohol |Grádiens program: | 0 perc | 100 % A | 0 % B |15 perc | 100 % A | 0 % B |17 perc | 60 % A | 40 % B |19 perc | 60 % A | 40 % B |21 perc | 100 % A | 0 % B |33 perc | 100 % A | 0 % B |Áramlási sebesség: | 1,2 ml/perc |Teljes futtatási idő: | körülbelül 33 perc |9.2. A kromatográfia a HPLC típusától és az oszloptöltetként alkalmazott anyagtól függően változik. A választott rendszernek képesnek kell lennie a triptofán és a belső standard alapvonalon történő elválasztására. Fontos továbbá, hogy a bomlástermékek jól elváljanak a triptofántól és a belső standardtól. A belső standard nélküli hidrolizátumokat is futtatni kell a belső standard alatti alapvonal szennyezettségének ellenőrzése céljából. Fontos, hogy a futtatási idő elég hosszú legyen az összes bomlástermék eluálásához, mert különben a későn eluálódó csúcsok zavarhatják a későbbi kromatográfiás futtatásokat.A kromatográfiás rendszernek a működési tartományban lineáris választ kell adnia. A lineáris választ a belső standard állandó (a normális) koncentrációjával és a triptofán változó koncentrációival kell mérni. Fontos, hogy mind a triptofán-, mind a belső standard csúcsok nagysága a HPLC/fluoreszcens rendszer lineáris tartományába essen. Ha a triptofán- és/vagy a belső standard csúcs(ok) túl kicsi(k) vagy túl nagy(ok), az analízist meg kell ismételni más mintamérettel és/vagy más végtérfogattal.9.3. Bárium-hidroxidÁllás hatására a bárium-hidroxid egyre nehezebben oldódik. Ennek következtében a HPLC meghatározáshoz használt oldat zavaros lesz, ami alacsony triptofánértékeket eredményezhet.[1] A vizsgálatot a Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) takarmány-munkacsoportja végezte.[2] A vizsgálatot a Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) takarmány-munkacsoportja végezte.--------------------------------------------------


title: A Tanács irányelve (1981. december 14.) a szerzett jogok tekintetében az orvosi, általános ápolói, fogorvosi és állatorvosi oklevelek, bizonyítványok és a képesítés megszerzéséről szóló egyéb tanúsítványok kölcsönös elismeréséről szóló 75/362/EGK, 77/452/EGK, 78/686/EGK, és 78/1026/EGK irányelvek kiegészítéséről

text:
Fontos jogi nyilatkozat

|

31981L1057

Hivatalos Lap L 385 , 31/12/1981 o. 0025 - 0026 finn különkiadás fejezet 16 kötet 1 o. 0050  spanyol különkiadás fejezet 06 kötet 2 o. 0126  svéd különkiadás fejezet 16 kötet 1 o. 0050  portugál különkiadás fejezet 06 kötet 2 o. 0126

		A Tanács irányelve(1981. december 14.)a szerzett jogok tekintetében az orvosi, általános ápolói, fogorvosi és állatorvosi oklevelek, bizonyítványok és a képesítés megszerzéséről szóló egyéb tanúsítványok kölcsönös elismeréséről szóló 75/362/EGK, 77/452/EGK, 78/686/EGK, és 78/1026/EGK irányelvek kiegészítéséről(81/1057/EGK)AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK TANÁCSA,tekintettel az Európai Gazdasági Közösséget létrehozó szerződésre és különösen annak 49., 57. és 66. cikkére,tekintettel a Bizottság javaslatára [1],tekintettel az Európai Parlament véleményére [2],tekintettel a Gazdasági és Szociális Bizottság véleményére [3],mivel az orvosi, általános ápolói, fogorvosi és állatorvosi oklevelek, bizonyítványok és a képesítés megszerzéséről szóló egyéb tanúsítványok kölcsönös elismeréséről, illetve a letelepedés és szolgáltatásnyújtás szabadságának tényleges gyakorlását elősegítő intézkedésekről szóló 75/362/EGK [4], 77/452/EGK [5], 78/686/EGK [6] és 78/1026/EGK [7] irányelvekben a szerzett jogokkal kapcsolatos rendelkezés a tagállamok által az említett irányelvek végrehajtása előtt kibocsátott orvosi, általános ápolói, fogorvosi és állatorvosi oklevelekre, bizonyítványokra és a képesítés megszerzéséről szóló egyéb tanúsítványokra vonatkozik;mivel ezek a rendelkezések ezért nem szabályozzák kifejezetten azokat az okleveleket, bizonyítványokat és a képesítés megszerzéséről szóló egyéb tanúsítványokat, amelyek olyan, a 75/363/EGK [8], 77/453/EGK [9], 78/687/EGK [10] és 78/1027/EGK [11] irányelvekben előírt minimális képzési követelményeket nem teljesítő képzések tanúsítványai, amennyiben e képzést az említett irányelvek végrehajtását követően fejezték be, de a végrehajtás előtt kezdték meg;mivel ezt a hiányosságot orvosolni kell,ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET:1. cikkA 75/362/EGK irányelv 9. cikke (1) és (2) bekezdése, a 77/452/EGK irányelv 4. cikke, a 78/686/EGK irányelv 7. cikke (1) és (2) bekezdése és a 78/1026/EGK irányelv 4. cikke vonatkozik azokra az oklevelekre, bizonyítványokra és a képesítés megszerzéséről szóló egyéb tanúsítványokra, amelyek olyan képzés bizonyítékai, amelyek nem teljesítik a 75/363/EGK irányelv 1., 2., 3., 4. és 5. cikkében, a 77/453/EGK irányelv 1. cikkében, a 78/687/EGK irányelv 1., 2 és 3. cikkében és a 78/1027/EGK irányelv 1. cikkében előírt minimális képzési követelményeket, és amelyeket ezeknek az irányelveknek a végrehajtása után fejeztek be, de az említett végrehajtás előtt kezdtek meg.2. cikkA tagállamok elfogadják azokat az intézkedéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek 1982. június 30. előtt megfeleljenek.3. cikkEnnek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei.Kelt Brüsszelben, 1981. december 14-én.a Tanács részérőlaz elnökG. Howe[1] HL C 121., 1981.5.23., 3. o.[2] HL C 172., 1981.7.13., 114. o.[3] HL C 185., 1981.7.27., 7. o.[4] HL L 167., 1975.6.30., 1. o.[5] HL L 176., 1977.7.15., 1. o.[6] HL L 233., 1978.8.24., 1. o.[7] HL L 362., 1978.12.23., 1. o.[8] HL L 167., 1975.6.30., 14. o.[9] HL L 176., 1977.7.15., 8. o.[10] HL L 233., 1978.8.24., 10. o.[11] HL L 362., 1978.12.23., 7. o.--------------------------------------------------