Avis juridique important

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32000L0033

Directive 2000/33/CE de la Commission du 25 avril 2000 portant vingt-septième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE.)

Journal officiel n° L 136 du 08/06/2000 p. 0090 - 0107

Directive 2000/33/CE de la Commissiondu 25 avril 2000portant vingt-septième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses(1)(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,vu le traité instituant la Communauté européenne,vu la directive 67/548/CEE du Conseil du 27 juin 1967 concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses(2), modifiée en dernier lieu par la directive 1999/33/CE du Parlement européen et du Conseil(3), et notamment son article 28,considérant ce qui suit:(1) L'annexe V de la directive 67/548/CEE définit les méthodes permettant de déterminer les propriétés physico-chimiques, la toxicité et l'écotoxicité des substances et préparations. L'adaptation au progrès technique de cette annexe est nécessaire.(2) L'article 7, paragraphe 2, de la directive 86/609/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives des États membres relatives à la protection des animaux utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques(4) dispose "qu'il ne sera pas effectué d'expérience s'il existe une possibilité raisonnable et pratique d'avoir recours à une autre méthode scientifiquement acceptable et n'impliquant pas l'utilisation d'un animal pour obtenir le résultat recherché".(3) La Commission entend introduire à l'annexe V de la directive 67/548/CEE des méthodes d'essais de remplacement qui ne nécessitent pas d'utiliser un animal afin que ces méthodes soient disponibles pour tester les substances chimiques aux termes de l'article 3, paragraphe 1, de la directive 67/548/CEE.(4) Les mesures prévues par la présente directive sont conformes à l'avis du comité pour l'adaptation au progrès technique des directives visant à l'élimination des entraves techniques aux échanges dans le secteur des substances et préparations dangereuses,A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:Article premierLes textes des annexes I et II de la présente directive sont ajoutés à la partie B de l'annexe V de la directive 67/548/CEE.Article 21. Les États membres mettent en vigueur les dispositions législatives, réglementaires et administratives nécessaires pour se conformer à la présente directive au plus tard le 1er octobre 2001. Ils en informent immédiatement la Commission.Lorsque les États membres adoptent ces dispositions, celles-ci contiennent une référence à la présente directive ou sont accompagnées d'une telle référence lors de leur publication officielle. Les modalités de cette référence sont adoptées par les États membres.2. Les États membres communiquent à la Commission les principales dispositions législatives de droit national qu'ils adoptent dans le domaine concerné par la présente directive et un tableau de correspondance entre la présente directive et les dispositions nationales adoptées.Article 3La présente directive entre en vigueur le troisième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes.Article 4Les États membres sont destinataires de la présente directive.Fait à Bruxelles, le 25 avril 2000.Par la CommissionMargot WallströmMembre de la Commission(1) Adoptée avant la vingt sixième adaptation.(2) JO 196 du 16.8.1967, p. 1.(3) JO L 199 du 30.7.1999, p. 57.(4) JO L 358 du 18.12.1986, p. 1.ANNEXE I"B.40. CORROSION CUTANÉE1. MÉTHODE1.1. IntroductionLe Centre européen pour la validation de méthodes alternatives (CEVMA ou ECVAM) du Centre commun de recherche de la Commission européenne a reconnu la validité scientifique de deux essais in vitro de corrosivité cutanée, l'essai de résistance électrique transcutanée (RET) sur peau de rat et un essai utilisant un modèle de peau humaine (1) (2) (3). L'étude de validation du CEVMA a montré que les deux essais permettent de faire la distinction de manière fiable entre substances corrosives et non corrosives pour la peau. En outre, le protocole d'essai basé sur un modèle de peau humaine a permis de faire une distinction correcte entre les différents degrés de corrosivité (effet corrosif sévère pour la peau, R35, et effet corrosif pour la peau, R34) (2). La description et le mode opératoire sont présentés pour chacun des deux essais; le choix de l'essai dépend des exigences et préférences de l'utilisateur.Voir aussi l'introduction générale de la partie B.1.2. DéfinitionsCorrosion cutanée: la survenue de lésions irréversibles de la peau après l'application d'un matériel d'essai.1.3. Substances de référenceAucune substance de référence n'est spécifiée, mais voir les points 1.5.3.4 et 1.7.2.3.1.4. Principe de la méthode d'essai - Essai RET sur peau de ratLe matériel d'essai est appliqué pour une durée n'excédant pas 24 heures sur la surface épidermique de disques de peau prélevés sur la peau de jeunes rats humainement sacrifiés. Les matières corrosives sont identifiées sur la base de leur capacité de provoquer la perte de l'intégrité du stratum corneum normal et de la fonction de barrière, cette perte étant mesurée comme une diminution de la RET de base jusqu'à un niveau situé en dessous d'une valeur seuil (5 kΩ) (4) (5). Les substances irritantes ou non irritantes ne font pas baisser la RET en dessous de ce seuil. Pour les substances tensio-actives et les substances organiques neutres, une étape de fixation d'un colorant peut être incluse dans la procédure d'essai [pour la définition, voir la référence (6)] afin de réduire le nombre de faux positifs obtenus spécifiquement avec ces types de substances chimiques (2) (7).1.5. Description de la méthode d'essai - Essai RET sur peau de rat1.5.1. AnimauxIl est nécessaire d'utiliser de jeunes (20-23 jours) rats (Wistar ou souche comparable) pour la préparation des disques de peau. Les poils du dos et des flancs sont coupés soigneusement à l'aide d'une tondeuse pour petits animaux. Les animaux sont ensuite nettoyés soigneusement avec un linge humide, la zone tondue étant plongée dans une solution antibiotique (contenant, par exemple, de la streptomycine, de la pénicilline, du chloramphénicol et de l'amphotéricine à des concentrations efficaces pour inhiber la croissance bactérienne). Les animaux sont lavés une nouvelle fois avec des antibiotiques le troisième et le quatrième jour après le premier lavage, et doivent ensuite être utilisés dans un délai de 3 jours (pour la préparation de la peau, les animaux ne doivent pas être âgés de plus de 31 jours).1.5.2. Préparation des disques cutanésLes animaux sont sacrifiés humainement. On prélève la peau dorsale de chaque animal et on la débarrasse soigneusement du tissu adipeux en excès. La peau est placée sur l'extrémité d'un tube PTFE (polytétrafluoroéthylène) en veillant à ce que la surface épidermique soit en contact avec le tube. Après avoir monté à force un joint torique en caoutchouc sur l'extrémité du tube pour maintenir la peau en place, on coupe le tissu excédentaire. Les dimensions du tube et du joint torique sont indiquées à la figure 1. Le joint torique en caoutchouc est ensuite soigneusement fixé de manière étanche à l'extrémité du tube PTFE à l'aide de vaseline. Le tube est introduit dans une chambre réceptrice contenant une solution de sulfate de magnésium (154 mM) dans lequel il est maintenu par une pince à ressort (figure 2).1.5.3. Mode opératoire1.5.3.1. Application du matériel d'essaiDes substances d'essai liquides (150 µl) sont appliquées sur la surface épidermique à l'intérieur du tube (figure 2). Pour l'essai de substance solides, une quantité suffisante du solide est appliquée sur le disque de peau pour que la totalité de la surface de l'épiderme soit couverte. Après avoir ajouté de l'eau désionisée (150 µl), on agite le tube doucement. Le contact entre les substances d'essai et la peau doit être maximal. Dans le cas de certains solides, ceci peut être obtenu en chauffant à 30 °C pour dissoudre la substance d'essai ou en la broyant pour obtenir des grains ou une poudre.On utilise trois disques de peau pour chaque substance d'essai. Celle-ci est appliquée pendant 24 heures (voir aussi le point 1.5.3.4), puis éliminée par lavage avec un jet d'eau courante à 30 °C. L'élimination des substances d'essai qui se sont solidifiées dans le tube peut être facilitée par un lavage avec un jet d'eau tiède à 30 °C.1.5.3.2. Mesures de la RETLa RET est mesurée à l'aide d'un pont de mesure en courant alternatif basse tension (par exemple AIM 401 ou 6401, ou équivalent). Avant la mesure de la résistance électrique, on réduit la tension de surface de la peau en ajoutant un volume suffisant d'éthanol à 70 % pour couvrir l'épiderme. Après quelques secondes, on enlève l'éthanol en renversant le tube, puis on hydrate le tissu par l'addition de 3 ml d'une solution de sulfate de magnésium (154 mM). Les électrodes du pont de mesure sont placées de part et d'autre du disque cutané pour prendre la mesure de la résistance en kΩ/disque cutané (figure 2). Les dimensions des électrodes et la longueur d'électrode en dessous des pinces crocodiles sont indiquées à la figure 1. La pince maintenant l'électrode intérieure (épaisse) repose sur la partie supérieure du tube PTFE pendant la mesure de la résistance, afin que la longueur d'électrode immergée dans la solution de sulfate de magnésium reste constante. L'électrode extérieure (fine) est introduite dans la chambre réceptrice de telle manière qu'elle repose sur le fond de celle-ci. La distance entre la partie inférieure de la pince à ressort et la partie inférieure du tube PTFE est maintenue constante (figure 1), cette distance influençant la valeur de résistance obtenue.Il convient de noter que si la valeur de résistance mesurée est supérieure à 20 kΩ, ceci peut être dû au fait que de la substance d'essai recouvre la surface épidérmique du disque de peau. On peut essayer d'y remédier, par exemple en fermant de façon étanche le tube PTFE avec le pouce revêtu d'un gant et en l'agitant pendant 10 secondes environ; on élimine ensuite la solution de sulfate de magnésium et on répète la mesure de la résistance avec une nouvelle solution de sulfate de magnésium.Les valeurs moyennes de la RET sont acceptées à condition que les valeurs des contrôles positifs et négatifs effectués parallèlement se situent dans les fourchettes acceptables pour la méthode. Les substances de contrôle proposées et leur fourchette acceptable pour la méthodologie et l'appareillage décrits sont les suivantes:>TABLE>1.5.3.3. Mode opératoire modifié pour substances tensio-actives et substances organiques neutresSi les valeurs RET de substances d'essai qui sont des substances tensio-actives ou des substances organiques neutres sont inférieures ou égales à 5 kΩ, on peut évaluer la pénétration d'un colorant dans les tissus. Cette procédure déterminera si les résultats sont des faux positifs (2).1.5.3.3.1. Application et élimination du colorant sulforhodamine BAprès traitement initial avec la substance d'essai, 150 µl d'une dilution à 10 % (p/v) de sulforhodamine B dans de l'eau distillée sont appliqués sur la surface épidermique de chaque disque de peau pendant 2 heures. Les disques de peau sont lavés ensuite avec un jet d'eau courante à la température ambiante pendant environ 10 secondes pour éliminer le colorant excédentaire/non fixé. Chaque disque de peau est soigneusement enlevé du tube PTFE et placé dans un flacon (par exemple un flacon à scintillation en verre de 20 ml) contenant de l'eau désionisée (8 ml). Les flacons sont agités doucement pendant 5 minutes pour éliminer complètement tout colorant excédentaire/non fixé. Après avoir répété cette opération de rinçage, on enlève les disques de peau et on les place dans des flacons contenant 5 ml de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 30 % (p/v) dans de l'eau distillée, puis on les incube pendant une nuit à 60 °C. Après incubation, chaque disque de peau est enlevé et jeté et la solution restante est centrifugée pendant 8 minutes à 21 °C (force centrifuge relative [sim     ] 175). Un échantillon de 1 ml de surnageant est ensuite dilué dans un rapport de 1 à 5 (v/v) [soit 1 ml + 4 ml] avec du SDS à 30 % (p/v) dans de l'eau distillée. La densité optique (DO) de la solution est mesurée à environ 565 nm.1.5.3.3.2. Calcul de la teneur en colorantLa teneur de chaque disque en sulforhodamine B est calculée sur la base des valeurs de DO (coefficient d'extinction molaire de la sulforhodamine B à 565 nm = 8,7 × 104; poids moléculaire = 580). La teneur en sulforhodamine B est déterminée pour chaque disque de peau et on calcule ensuite une teneur moyenne en colorant pour les essais répétés. Les valeurs moyennes de la fixation du colorant sont acceptées à condition que les valeurs des contrôles effectués parallèlement se situent dans la fourchette acceptable pour la méthode. Les fourchettes acceptables de teneur en colorant pour les substances de contrôle proposées pour la méthodologie et l'appareillage décrits sont les suivantes:>TABLE>1.5.3.4. Informations complémentairesLes substances d'essai peuvent aussi être appliquées sur les disques cutanés pendant des durées plus courtes (2 heures, par exemple) pour identifier les substances fortement corrosives. Cependant, dans l'étude de validation, on a constaté que l'essai RET surestimait le potentiel corrosif de plusieurs substances chimiques après leur application pendant 2 heures (2), alors qu'il assurait une identification correcte des substances corrosives et non corrosives après une application de 24 heures.Les propriétés et les dimensions de l'appareillage et le mode opératoire utilisés peuvent influencer les valeurs de la RET obtenues. Le seuil de corrosivité a été fixé à 5 kΩ sur la base de données obtenues avec l'appareillage et le mode opératoire spécifiques décrits dans cette méthode. Des valeurs de seuil et de contrôle différentes seront éventuellement nécessaires en cas de changement important des conditions d'essai. Par conséquent, il est recommandé d'étalonner la méthodologie et la valeur seuil de résistance en testant une série de substances standard de reférence choisies parmi les substances chimiques utilisées dans l'étude de validation (3).1.6. Principe de la méthode d'essai - Essai sur modèle de peau humaineLe matériel d'essai est appliqué localement pendant 4 heures sur un modèle tridimensionnel de peau humaine comprenant un épiderme reconstitué avec un stratum corneum fonctionnel. Les matières corrosives sont identifiées sur la base de leur aptitude à réduire la viabilité cellulaire [déterminée, par exemple, à l'aide de l'essai de réduction du MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl) tetrazolium bromide] en dessous de valeurs seuils définies pour des périodes d'exposition déterminées. Le principe de l'essai concorde avec l'hypothèse selon laquelle les substances chimiques corrosives sont capables de pénétrer dans le stratum corneum (par diffusion ou érosion) et sont suffisamment cytotoxiques pour provoquer la mort cellulaire dans les couches cellulaires sous-jacentes.1.7. Description de la méthode d'essai - Essai sur modèle de peau humaine1.7.1. Modèles de peau humaineLes modèles de peau humaine peuvent provenir de diverses sources mais doivent remplir certains critères. Le modèle doit avoir un stratum corneum fonctionnel avec une couche sous-jacente de cellules vivantes. La fonction de barrière du stratum corneum doit être suffisante, ce qui peut être mis en évidence en démontrant la résistance du modèle à la cytotoxicité après l'application de substances connues pour leur cytotoxicité cellulaire mais qui ne traversent normalement pas le stratum corneum. Le modèle doit donner des résultats reproductibles dans des conditions expérimentales définies.La viabilité des cellules vivantes dans le modèle doit être suffisante pour qu'il soit possible de faire la distinction entre les substances de contrôle positives et négatives. La viabilité cellulaire (par exemple, mesurée par le niveau de réduction du MTT, c'est-à-dire une valeur de DO) après l'exposition à la substance de contrôle négative doit se situer dans des limites acceptables pour le modèle en question. De même, les valeurs de viabilité cellulaire avec la substance de contrôle positive (par rapport à celles du contrôle négatif) doivent se situer dans des limites déterminées. Le plus important est que le modèle prédictif utilisé doit être conforme aux normes de validation internationales (2).1.7.2. Mode opératoire1.7.2.1. Application du matériel d'essaiPour les substances liquides, il faut appliquer une quantité suffisante de substance d'essai pour couvrir la surface cutanée (25 µl/cm2 au minimum). Pour les substances solides, il faut appliquer une quantité suffisante de substance d'essai pour couvrir la peau et ensuite l'humidifier pour assurer un bon contact avec la peau; si nécessaire, les substances solides doivent être réduites en poudre avant leur application. La méthode d'application doit convenir à un large éventail de substances chimiques (2). À la fin de la période d'exposition, le matériel d'essai doit être enlevé soigneusement de la surface cutanée avec une solution saline.1.7.2.2. Mesures de la viabilité cellulaireLa viabilité des cellules peut être mesurée à l'aide de toute méthode quantitative validée. La méthode la plus fréquemment utilisée est la réduction du MTT, dont on a constaté l'exactitude et la reproductibilité des résultats dans différents laboratoires (2). Le disque de peau est placé dans une solution de MTT de 0,3 mg/ml à 20-28 °C pendant 3 heures. Après extraction du précipité bleu de formazan (extraction par solvant), on mesure la concentration de formazan en déterminant la DO à une longueur d'onde de 545 à 595 nm.1.7.2.3. Informations complémentairesLe modèle de peau utilisé ainsi que le protocole exact de la durée d'exposition et des procédures de lavage, etc. auront une grande influence sur les résultats des mesures de la viabilité cellulaire. Il est recommandé d'étalonner la méthodologie et le modèle prédictif en testant une série de substances standard de référence choisies parmi les substances chimiques utilisées dans l'étude de validation du CEVMA ou ECVAM (3). Il est essentiel de démontrer que la méthode utilisée est reproductible dans un même laboratoire et entre laboratoires pour un large éventail de substances chimiques, conformément aux normes internationales. La méthode doit au moins satisfaire aux critères de validité scientifique définis précédemment (2) et les résultats de cette étude de validation doivent être publiés dans une revue scientifique faisant appel à l'évaluation par des experts (peer-reviewed).2. DONNÉES2.1. Traitement des résultats2.1.1. Essai de RET sur peau de ratLes valeurs de résistance (kΩ) pour le matériel d'essai, les contrôles positifs et négatifs ainsi que toute substance chimique standard de référence sont présentées sous forme de tableau, y compris les données des essais répétés/répliqués, les valeurs moyennes et la classification qui en découle.2.1.2. Essai sur modèle de peau humaineLes valeurs de DO et les pourcentages calculés de viabilité cellulaire pour le matériel d'essai, les contrôles positifs et négatifs ainsi que toute substance chimique standard de référence sont présentés sous forme de tableau, y compris les données des essais répétés, les valeurs moyennes et la classification qui en est déduite.2.2. Évaluation et interprétation des résultats2.2.1. Essai de RET sur peau de ratSi la valeur moyenne de la RET obtenue pour la substance d'essai est supérieure à 5 kΩ, cette substance n'est pas corrosive. Si la valeur RET est inférieure ou égale à 5 kΩ et la substance d'essai n'est pas une substance tensio-active ou une substance organique neutre, cette substance est corrosive.Dans le cas des substances tensio-actives ou des substances organiques neutres dont la valeur de la RET est inférieure ou égale à 5 kΩ, on peut évaluer la pénétration d'un colorant. Si la teneur moyenne en colorant du disque est supérieure ou égale à la teneur moyenne en colorant du disque du contrôle positif (HCl à 36 %) obtenue parallèlement, la substance d'essai est un vrai positif et est donc corrosive. Si la teneur moyenne en colorant du disque est inférieure à la teneur moyenne en colorant du disque du contrôle positif (HCl à 36 %) obtenue parallèlement, la substance d'essai est un faux positif et donc non corrosive.2.2.2. Essai sur modèle de peau humaineLa valeur de la DO du contrôle négatif représente une viabilité cellulaire de 100 %; par conséquent, la valeur de la DO obtenue pour chaque échantillon d'essai peut être utilisée pour calculer un pourcentage de viabilité par rapport au contrôle négatif. La valeur seuil du pourcentage de viabilité cellulaire qui établit la distinction entre les matières corrosives et les matières non corrosives (ou entre différentes classes de substances corrosives) doit être clairement définie dans le modèle prédictif avant la validation de la méthode et l'étude de validation doit ensuite montrer que la valeur seuil est appropriée (2).3. RAPPORTSRapport d'essaiLe rapport d'essai doit contenir au moins les informations suivantes:Substance d'essai:- données d'identification, nature physique et, si nécessaire, propriétés physicochimiques. Le cas échéant, des informations analogues doivent être fournies pour les substances de référence.Conditions d'essai:- détails du mode opératoire,- description et justification de toute modification.Résultats:- présentation sous forme de tableau des valeurs des résistances (essai de RET) ou des pourcentages de viabilité cellulaire (essai sur modèle de peau humaine) pour le matériel d'essai, les contrôles positifs et négatifs ainsi que toute substance chimique standard de référence, y compris les données des essais répétés/répliqués et les valeurs moyennes,- description de tout autre effet observé.Discussion des résultatsConclusions4. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES(1) ECVAM (1998), ECVAM News &  Views, ATLA 26, S. 275-280.(2) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H-G. &  Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, S. 483-524.(3) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P. &  Worth, A.P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, p. 471-482.(4) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A. &  Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test - modifications and validation, Food &  Chemical Toxicology 24, p. 507-512.(5) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J. &  Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, p. 191-194.(6) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J. &  Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, p. 709-720.(7) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P. &  Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, p. 219-255.Figure 1>PIC FILE= "L_2000136FR.009601.TIF">Figure 2>PIC FILE= "L_2000136FR.009701.TIF">"ANNEXE II"B.41. PHOTOTOXICITÉ - ESSAI DE PHOTOTOXICITÉ IN VITRO 3T3 NRU1. MÉTHODE1.1. IntroductionLa phototoxicité est définie comme une réaction toxique déclenchée par une première exposition de la peau à certains produits chimiques, suivie d'une exposition à la lumière, ou bien par l'irradiation de la peau après administration d'un produit chimique par voie systémique.Les informations fournies par le test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU permettent de déterminer le potentiel phototoxique d'une substance d'essai, c'est-à-dire les dangers qu'elle est susceptible de présenter (ou son absence de dangers) en cas d'exposition au rayonnement UV et à la lumière visible.Dans la mesure où la finalité toxicologique du test in vitro est de déterminer la photocytotoxicité induite par l'action combinée d'un produit chimique et de la lumière, les composés qui se révèlent phototoxiques in vivo après administration systémique et diffusion dans la peau, ainsi que les composés qui ont une action photo-irritante après application topique sur la peau peuvent être détectés par ce test.Le test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU a été élaboré et validé dans le cadre d'un projet conjoint UE/COLIPA entre 1992 et 1997 (1) (2) (3), visant à trouver une méthode in vitro valable pour remplacer les divers tests in vivo utilisés. En 1996, l'OCDE avait recommandé, à l'issue d'un groupe de travail, une approche séquentielle in vitro pour l'évaluation de la toxicité (4).Les résultats du test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU ont été comparés aux effets de phototoxicité/photo-irritation aiguë in vivo chez les animaux et chez les humains, et le test s'est révélé extrêmement fiable pour la prévision de ces effets. Le test n'est pas conçu pour prévoir d'autres effets nocifs susceptibles de résulter de l'action combinée d'un produit chimique et de la lumière, tels que la photogénotoxicité, la photo-allergie, et la photocancérogénicité, mais de nombreux produits chimiques qui possèdent des propriétés spécifiques donneront des résultats positifs au test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU. Par ailleurs, le test ne permet pas non plus d'évaluer le pouvoir phototoxique.L'appendice propose une approche séquentielle pour les essais visant à déterminer la phototoxicité des produits chimiques.1.2. DéfinitionsIrradiance: l'intensité du rayonnement ultraviolet (UV) ou visible incident sur une surface, mesurée en W/m2 ou en mW/cm2.Dose de lumière: la quantité (= intensité × temps) de rayonnement ultraviolet (UV) ou visible incident sur une surface, exprimée en Joules (= W × s) par unité de surface, par exemple, J/m2 ou J/cm2.Bandes de longueurs d'ondes de la lumière UV: Les désignations recommandées par la CIE (Commission internationale de l'éclairage) sont: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) et UVC (100-280 nm). D'autres désignations sont également utilisées: la limite entre UVB et UVA est souvent placée à 320 nm, et les UVA peuvent être subdivisés en UV-A1 et UV-A2 avec une limite à environ 340 nm.Viabilité cellulaire: paramètre mesurant l'activité totale d'une population cellulaire (par exemple, absorption du colorant vital rouge neutre dans les lysosomes cellulaires), qui, en fonction de l'effet mesuré et du type de test utilisé, correspond au nombre total et/ou à la vitalité des cellules.Viabilité cellulaire relative: viabilité cellulaire exprimée par rapport aux témoins négatifs (solvant) qui ont été prélevés tout ou long de la procédure (soit + UV soit - UV), mais non traités par un produit chimique.Modèle prédictif: algorithme utilisé pour transformer les résultats d'un test de toxicité en une prévision du potentiel toxique. Dans les présentes lignes directrices d'essai, le PIF et le MPE peuvent être utilisés pour transformer les résultats du test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU en une prévision du potentiel phototoxique.PIF (Photo Irritation Factor - Facteur de photo-irritation): facteur obtenu en comparant deux concentrations cytotoxiques efficaces (EC50) de la substance chimique d'essai, obtenues en présence (+ UV) et en absence (- UV) d'une irradiation non cytotoxique par un rayonnement UVA/visible.MPE (Mean Photo Effect - Photo-effet moyen): nouvelle mesure dérivée d'une analyse mathématique du tracé complet de deux courbes concentration-réponse obtenues avec (+ UV) ou sans (- UV) irradiation non cytotoxique par un rayonnement UVA/visible.Phototoxicité: réaction toxique aiguë apparaissant après une première exposition de la peau à certains produits chimiques et exposition subséquente à la lumière, ou déclenchée par l'irradiation de la peau après administration systémique d'un produit chimique.Photo-irritation: terme désignant une sous-catégorie de 'phototoxicité', utilisé pour décrire uniquement les réactions phototoxiques qui se manifestent au niveau de la peau après exposition (par voie topique ou orale) à des produits chimiques. Ces réactions phototoxiques entraînent toujours des dommages cellulaires non spécifiques (réactions de type coup de soleil).Photo-allergie: réactivité immunologique acquise qui ne se manifeste pas lors de la première exposition à la lumière et au produit chimique et nécessite une période d'induction d'une ou de deux semaines avant que la réactivité cutanée puisse être mise en évidence.Photogénotoxicité: réaction génotoxique observée pour un paramètre génétique, qui apparaît après exposition des cellules à une dose non génotoxique de lumière UV/visible et à un produit chimique non génotoxique.Photocancérogénicité: cancérogénicité induite par une exposition répétée à la lumière et à un produit chimique. Le terme 'photococancérogénicité' s'emploie lorsque l'effet tumorigène induit par les UV est accentué par l'exposition à un produit chimique.1.3. Substances de référenceOutre la substance chimique chlorpromazine servant de témoin positif qui doit être testée concurremment dans chaque cas, il est recommandé d'utiliser comme substances de référence pour le test de phototoxicité 3T3 NRU un sous-ensemble des produits chimiques utilisés pour ce test lors des essais interlaboratoires (1) (3) (13).1.4. Remarques initialesDes effets phototoxiques ont été signalés pour de nombreux types de produits chimiques (5) (6) (7) (8). Le seul point commun entre ces derniers est leur capacité à absorber l'énergie lumineuse dans le domaine de la lumière solaire. D'après la première loi de photochimie (loi de Grotthaus-Draper) la photoréaction nécessite l'absorption d'un nombre suffisant de quanta de lumière. Aussi convient-il, avant d'envisager un essai biologique selon les présentes lignes directrices, de déterminer le spectre d'absorption UV/lumière visible du produit chimique à tester (par exemple, suivant les lignes directrices d'essai 101 de l'OCDE). Si le coefficient d'extinction/d'absorbance molaire est inférieur à 10 litre × mol-1 × cm-1, le produit chimique n'a pas de potentiel photoréactif et il est inutile de le soumettre au test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU ou à tout autre test biologique visant à détecter des effets photochimiques indésirables (appendice).1.5. Principe de la méthode d'essaiQuatre mécanismes ont été mis en évidence pour expliquer comment l'absorption de lumière par un chromophore (chimique) peut entraîner une réaction phototoxique (7). Tous ces mécanismes entraînent des dommages cellulaires. Par conséquent, le test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU repose sur la comparaison de la cytotoxicité d'un produit chimique avec et sans exposition à une dose non cytotoxique d'UVA/lumière visible. Dans ce test, la cytotoxicité est exprimée comme la diminution, en fonction de la concentration, de la fixation du colorant vital rouge neutre [Neutral Red - NR (9)] 24 heures après traitement par le produit chimique à tester et irradiation.Des cellules Balb/c 3T3 sont maintenues en culture pendant 24 h jusqu'à obtention de monocouches. Pour chaque produit chimique à tester, deux plaques à 96 puits sont alors préincubées pendant 1 h avec huit concentrations distinctes du produit chimique. Ensuite, l'une des deux plaques est exposée à une dose d'UVA/lumière visible non cytotoxique de 5 J/cm2 UVA (expérience + UV), tandis que l'autre plaque est maintenue à l'obscurité (expérience - UV). Dans les deux plaques, le milieu de traitement est ensuite remplacé par un milieu de culture et, après une nouvelle période d'incubation de 24 h, la viabilité cellulaire est déterminée par le test de fixation du rouge neutre (Neutral Red Uptake - NRU) pendant 3 h. La viabilité cellulaire relative, exprimée sous forme d'un pourcentage des témoins négatifs non traités, est calculée pour chacune des huit concentrations d'essai. Afin de prévoir le potentiel phototoxique, les réponses aux concentrations obtenues en présence (+ UV) et en absence (- UV) d'irradiation sont comparées, généralement au niveau EC50, c'est-à-dire la concentration inhibant la viabilité cellulaire de 50 % par rapport aux témoins non traités.1.6. Critères de qualitéSensibilité des cellules aux UVA, données historiques: la sensibilité des cellules aux UVA doit être régulièrement contrôlée. Les cellules sont mises en culture à la densité utilisée dans le test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU; elles sont irradiées le jour suivant par des doses d'UVA allant de 1 à 9 J/cm2, et la viabilité cellulaire est déterminée un jour plus tard à l'aide du test NRU. Les cellules répondent aux critères de qualité si leur viabilité après irradiation par 5 J/cm2 UVA est supérieure ou égale à 80 % de la viabilité des témoins maintenus à l'obscurité. À la dose la plus forte de 9 J/cm2 UVA, la viabilité doit être au moins égale à 50 % de celle des témoins conservés à l'obscurité. Ce contrôle doit être répété tous les 10 passages de cellules environ.Sensibilité aux UVA des cellules constituant les témoins négatifs, dans le test en cours: le test répond aux critères de qualité si les témoins négatifs [cellules dans une solution saline équilibrée de Earl - Earl's Balanced Salt Solution (EBSS)] avec ou sans 1 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) ou 1 % d'éthanol (EtOH) dans l'expérience + UVA ont une viabilité supérieure ou égale à 80 % de celle des cellules non irradiées dans le même solvant dans l'expérience menée en parallèle dans l'obscurité (- UVA).Viabilité des témoins négatifs: la densité optique absolue (OD540 NRU), mesurée dans l'extrait NR des témoins négatifs indique si les 1 × 104 cellules mises en culture par puits se sont développées avec un temps de doublement normal pendant les deux jours d'essai. Un test répond aux critères d'acceptation si la densité optique moyenne OD540 NRU des témoins non traités est >= 0,2.Témoin positif: pour chaque test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU réalisé, un produit chimique phototoxique connu doit être testé concurremment. La chlorpromazine (CPZ) a été utilisée comme témoin positif dans l'étude de validation UE/COLIPA et est donc recommandée. Dans le cas de la CPZ testée selon le protocole standard dans le test in vitro 3T3 NRU, les critères d'acceptation suivants ont été définis: CPZ irradiée (+ UVA): EC50 = 0,1 à 2,0 µg/ml, CPZ non irradiée (- UVA): EC50 = 7,0 à 90,0 µg/ml. Le facteur de photo-irritation (PIF), c'est-à-dire la variation de l'EC50 doit être d'au moins 6.À la place de la CPZ, d'autres produits chimiques phototoxiques connus, convenant à la classe chimique ou aux caractéristiques de solubilité du produit chimique à tester, peuvent aussi être utilisés en tant que témoins positifs parallèles. Dans ce cas, en fonction des données historiques, les intervalles de valeurs de la EC50 et le PIF ou le MPE (Mean Photo Effect - photo-effet moyen) doivent être correctement définis en tant que critères d'acceptation du test.1.7. Description de la méthode d'essai1.7.1. Préparations1.7.1.1. CellulesUne lignée permanente de cellules de fibroblaste de souris - Balb/c 3T3, clone 31 - provenant de ATCC (American Type Culture Collection) ou de ECACC (European Collection of Cell Cultures) a été utilisée dans l'étude de validation et est donc recommandée. D'autres cellules ou lignées cellulaires peuvent aussi donner de bons résultats avec le même protocole d'essai si les conditions de culture sont adaptées aux besoins spécifiques des cellules; il convient toutefois d'en démontrer l'équivalence.Les cellules doivent être régulièrement controlées pour vérifier l'absence de contamination par des mycoplasmes, et ne doivent être utilisées que si les résultats du contrôle sont satisfaisants.Dans la mesure où la sensibilité aux UVA des cellules peut augmenter avec le nombre de passages, il convient d'utiliser des cellules Balb/c 3T3 ayant subi le moins de passages possibles, de préférence moins de 100. Il importe de contrôler régulièrement la sensibilité aux UVA des cellules Balb/c 3T3 selon la procédure de contrôle de la qualité décrite dans les présentes lignes directrices.1.7.1.2. Milieux et conditions de cultureDes milieux de culture et des conditions d'incubation appropriés doivent être utilisés pour le passage systématique des cellules et pendant la procédure d'essai. Pour les cellules Balb/c 3T3, le milieu de culture est du DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) enrichi avec 10 % de sérum de veau nouveau-né, 4 mM de glutamine, de pénicilline et de streptomycine, et incubé à 37 °C en atmosphère humidifiée/7,5 % CO2. Il est particulièrement important que les conditions de culture cellulaire permettent de maintenir la durée du cycle cellulaire dans les limites normales pour les cellules ou la lignée cellulaire utilisées.1.7.1.3. Préparation des culturesDes cellules provenant de cultures mères congelées sont mises en culture à une densité appropriée dans le milieu de culture, et sont repiquées au moins une fois avant d'être utilisées pour le test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU.Pour le test de phototoxicité, le milieu de culture est ensemencé avec une densité de cellules telle que les cultures n'arrivent pas à confluence avant la fin de l'essai, c'est-à-dire au moment où la viabilité cellulaire est déterminée, 48 h après la mise en culture des cellules. Pour les cellules Balb/c 3T3 cultivées sur des plaques à 96 puits, la densité cellulaire recommandée est de 1 × 104 cellules par puits.Pour chaque produit chimique testé, les cellules sont mises en culture de manière identique sur deux plaques à 96 puits distinctes, qui sont utilisées en même temps pendant toute la procédure d'essai, dans les mêmes conditions de culture, sauf pendant la période où l'une des plaques est irradiée (+ UVA/lumière visible) et l'autre maintenue à l'obscurité (- UVA/lumière visible).1.7.1.4. Activation métaboliqueAlors que l'utilisation de systèmes d'activation métabolique est nécessaire en règle générale pour tous les tests in vitro de prédiction du potentiel génotoxique ou cancérogène, dans le cas de la phototoxicologie, on ne connaît pas jusqu'à présent de produit chimique qui nécessite une transformation métabolique pour agir comme une phototoxine in vivo ou in vitro. Par conséquent, il ne paraît pas utile ni scientifiquement fondé de réaliser le présent test en présence d'un système d'activation métabolique.1.7.1.5. Produit chimique à tester/PréparationLes produits chimiques à tester doivent être fraîchement préparés juste avant utilisation, à moins que les données de stabilité ne démontrent qu'ils sont conservables. Une préparation en lumière rouge peut s'avérer nécessaire lorsqu'une photodégradation rapide est probable.Les produits chimiques à tester doivent être dissous dans des solutions salines tamponnées, par exemple, solution saline équilibrée de Earl (Earl's Balanced Salt Solution - EBSS) ou solution saline tamponnée au phosphate (Phosphate Buffered Saline - PBS), qui doivent être exemptes de constituants protéiques et d'indicateurs pH colorés qui absorbent la lumière, afin d'éviter les interférences lors de l'irradiation.Les produits chimiques ayant une solubilité limitée dans l'eau doivent être dissous dans des solvants appropriés à 100 fois la concentration finale souhaitée, puis dilués à raison de 1:100 avec la solution saline tamponnée. Si un solvant est utilisé, il doit être présent au volume constant de 1 % (v/v) dans toutes les cultures, c'est-à-dire dans les témoins négatifs et dans toutes les concentrations du produit chimique à tester.Les solvants recommandés sont le diméthylsulfoxyde (DMSO) et l'éthanol (EtOH). D'autres solvants de faible cytotoxicité (par exemple, l'acétone) peuvent convenir, mais leurs propriétés spécifiques doivent être évaluées avec soin, notamment les possibilités de réaction avec le produit chimique à tester, l'atténuation de l'effet phototoxique, ou les propriétés de fixation des radicaux.Si nécessaire, on pourra recourir à un mélangeur Vortex et/ou à la sonication et/ou à un chauffage à 37 °C pour faciliter la solubilisation.1.7.1.6. Irradiation UV/PréparationSource de lumière: le choix d'une source de lumière et d'un filtrage appropriés est le facteur déterminant dans les essais de phototoxicité. Les domaines des UVA et de la lumière visible sont généralement associés à une photosensibilisation (7) (10), tandis que les UVB sont moins importants de ce point de vue, étant directement très cytotoxiques avec une cytotoxicité qui augmente d'un facteur 1000 entre 313 et 280 nm (11). Parmi les critères présidant au choix de la source de lumière appropriée, il est essentiel que la source de lumière émette des longueurs d'onde absorbées par le produit chimique à tester et que la dose de lumière (pouvant être obtenue dans un délai raisonnable) soit suffisante pour détecter les substances photosensibilisantes connues. En outre, les longueurs d'onde et les doses employées ne doivent pas trop endommager le système d'essai, notamment en ce qui concerne l'émission de chaleur (domaine infrarouge).La lumière solaire simulée par les simulateurs solaires est considérée comme la source de lumière optimale. Les simulateurs solaires utilisent des arcs au xénon ainsi que des arcs au mercure (dopé) ou des arcs aux halogénures de métaux. Ces derniers ont l'avantage d'émettre moins de chaleur et d'être moins chers, mais ils ne reproduisent pas parfaitement la lumière solaire. Dans la mesure où tous les simulateurs solaires émettent d'importantes quantités d'UVB, ils doivent être équipés de filtres adéquats pour atténuer les longueurs d'onde UVB hautement cytotoxiques.Pour l'essai de phototoxicité in vitro 3T3 NRU, il convient d'utiliser un spectre d'irradiance pratiquement exempt d'UVB (UVA:UVB [sim     ] 1:20). Un exemple de distribution de l'irradiance spectrale du simulateur solaire équipé de filtres, qui a été utilisé dans l'étude de validation du test in vitro 3T3 NRU, a été publié (3).Dosimétrie: l'intensité de lumière (irradiance) doit être régulièrement contrôlée avant chaque test de phototoxicité à l'aide d'un radiomètre UV à large bande approprié qui doit avoir été étalonné en fonction de la source. La performance du radiomètre UV doit être contrôlée. À cet effet, on recommande l'utilisation d'un second radiomètre UV de référence, du même type et étalonné de la même façon. Dans l'idéal, à intervalles plus grands, il conviendrait d'utiliser un spectroradiomètre pour mesurer l'irradiance spectrale de la source filtrée et pour vérifier l'étalonnage du radiomètre UV à large bande, mais l'utilisation de tels instruments exige des opérateurs dûment qualifiés.L'étude de validation a établi qu'une dose de 5 J/cm2 (UVA) était non cytotoxique pour les cellules Balb/c 3T3 et suffisamment puissante pour exciter même les produits chimiques faiblement phototoxiques. Pour obtenir 5 J/cm2 dans un délai de 50 min, l'irradiance doit être réglée à 1,666 mW/cm2. En cas d'utilisation d'une autre lignée cellulaire ou d'une source de lumière différente, il peut s'avérer nécessaire d'ajuster la dose d'UVA en respectant le critère selon lequel cette dose ne doit pas être nocive pour les cellules tout en étant suffisante pour détecter les phototoxines standard. La durée de l'exposition à la lumière se calcule de la façon suivante:>PIC FILE= "L_2000136FR.010101.EPS">1.7.2. Conditions d'essaiLa concentration maximale du produit chimique à tester ne doit pas dépasser 100 µg/ml, puisque tous les produits chimiques phototoxiques ont été détectés à des concentrations plus faibles, et qu'à des concentrations plus élevées, l'incidence des faux positifs augmente (surprédiction) (13). Le pH de la plus forte concentration du produit chimique à tester doit être satisfaisant (pH entre 6,5 et 7,8).Les plages de concentrations du produit chimique testé en présence (+ UVA) et en absence (- UVA) de lumière doivent être déterminées de manière adéquate lors d'expériences préalables. La plage et les intervalles d'une série de concentrations doivent être ajustées de telle façon que les courbes concentration-réponse soient suffisamment confirmées par les données expérimentales. Il convient de recourir à une progression géométrique des concentrations (avec un facteur de dilution constant).1.7.3. Mode opératoire(1)1.7.3.1. Premier jourPréparer une suspension cellulaire de 1 × 105 cellules/ml dans le milieu de culture, et verser 100 µl de milieu de culture seul dans les puits périphériques d'une plaque de microtitrage à 96 puits (= essais à blanc). Dans les puits restants, verser 100 µl de la suspension cellulaire de 1 × 105 cellules/ml (= 1 × 104 cellules/puits). Pour chaque produit chimique à tester, préparer deux plaques: une pour la détermination de la cytotoxicité (- UVA) et l'autre, pour la détermination de la phototoxicité (+ UVA).Incuber les cellules pendant 24 h (7,5 % CO2, 37 °C) jusqu'à obtention d'une monocouche semi-confluente. Cette période d'incubation permet la récupération et l'adhérence des cellules, et leur croissance exponentielle.1.7.3.2. Deuxième jourAprès incubation, décanter le milieu de culture pour séparer les cellules et laver deux fois avec 150 µl de EBSS/PBS par puits. Ajouter 100 µl de EBSS/PBS contenant la concentration appropriée du produit chimique à tester ou uniquement du solvant (témoin négatif). Appliquer 8 concentrations distinctes du produit chimique à tester. Incuber les cellules avec le produit chimique à tester dans l'obscurité pendant 60 minutes (7,5 % CO2, 37 °C).Pour réaliser la partie (+ UVA) de l'essai, irradier les cellules à température ambiante pendant 50 minutes à travers le couvercle de la plaque à 96 puits par une dose d'UVA de 1,7 mW/cm2 (= 5 J/cm2). Ventiler avec un ventilateur pour éviter la condensation d'H2O sous le couvercle. Conserver les plaques répliques (- UVA) à température ambiante dans une boîte sombre pendant 50 min (= durée de l'exposition aux UVA).Décanter la solution d'essai et laver deux fois avec 150 µl de EBSS/PBS. Remplacer le EBSS/PBS par le milieu de culture et incuber (7,5 % CO2, 37 °C) jusqu'au lendemain (18-22 h).1.7.3.3. Troisième jourÉvaluation microscopiqueExaminer les cellules au microscope à contraste de phase. Noter les changements morphologiques des cellules dus aux effets cytotoxiques du produit chimique testé. Ce contrôle est recommandé pour exclure les erreurs expérimentales, mais les observations ne sont pas utilisées pour l'évaluation de la cytotoxicité ou de la phototoxicité.Test de fixation du rouge neutreLaver les cellules avec 150 µl de EBSS/PBS préchauffé. Éliminer la solution de lavage en tapotant légèrement. Ajouter 100 µl de milieu NR et incuber à 37 °C en atmosphère humidifiée/7,5 % CO2, pendant 3 h.Après incubation, éliminer le milieu NR et laver les cellules avec 150 µl de EBSS/PBS. Décanter et absorber complètement le EBSS/PBS (facultatif: centrifuger la plaque retournée).Ajouter exactement 150 µl de solution de désorption du NR (solution d'éthanol/acide acétique fraîchement préparé).Passer rapidement la plaque de microtitrage à l'agitateur pendant 10 minutes, jusqu'à ce que le NR soit extrait des cellules et ait formé une solution homogène.Mesurer la densité optique de l'extrait de NR à 540 nm dans un spectrophotomètre en utilisant les essais à blanc comme référence. Sauvegarder les données dans un format de fichier approprié (par exemple, ASCII) en vue d'une analyse ultérieure.2. DONNÉES2.1. Qualité et quantité des donnéesLes données doivent permettre une analyse significative des courbes concentration-réponse obtenues avec et sans irradiation UVA/lumière visible. Si on constate une cytotoxicité, il y a lieu d'ajuster à la fois la gamme des concentrations et l'intervalle entre chaque concentration, afin qu'il y ait concordance entre la courbe et les données expérimentales. Étant donné qu'un produit chimique peut ne pas être cytotoxique jusqu'à la concentration limite définie de 100 µg/ml dans l'expérience à l'obscurité (- UVA), mais être très cytotoxique lorsqu'il est irradié (+ UVA), il peut s'avérer utile de faire différer de plusieurs ordres de grandeur les gammes de concentrations à tester dans les deux parties de l'expérience, afin de satisfaire à l'exigence de qualité des données. Si aucune cytotoxicité n'est constatée dans les deux parties de l'expérience (- UVA et + UVA), il suffit de réaliser l'essai avec un grand intervalle entre chaque dose jusqu'à la concentration maximale.Il n'est pas nécessaire de procéder à une contre-expérience pour vérifier un résultat clairement positif. Il n'est pas non plus nécessaire de vérifier les résultats clairement négatifs, à condition que le produit chimique ait été testé à des concentrations suffisamment élevées. Dans de tels cas, une expérience principale, étayée par une ou plusieurs expériences préliminaires de détermination des gammes de concentrations, est suffisante.Les tests qui donnent des résultats limites, proches du seuil critique du modèle prédictif, doivent être vérifiés par une contre-expérience.Si une contre-expérience s'avère nécessaire, il peut être utile de faire varier les conditions expérimentales afin d'obtenir un résultat bien net. Une des variables clés dans ce test est la préparation des solutions du produit chimique à tester. Aussi la variation de ces conditions (cosolvant, pulvérisation, sonication) peut-elle être essentielle dans la répétition d'un test. Une autre possibilité est de faire varier le temps de préincubation. Une réduction de cette durée peut présenter un intérêt pour les produits chimiques instables dans l'eau.2.2. Traitement des résultatsSi possible, on cherchera à déterminer la concentration du produit chimique à tester qui entraîne une inhibition de 50 % de la fixation du rouge neutre par les cellules (EC50). Cela peut se faire en appliquant n'importe quelle méthode de régression non linéaire appropriée (de préférence une fonction de Hill ou une régression logistique) aux données de réponse aux concentrations, ou en utilisant d'autres méthodes d'ajustement (14). Avant d'utiliser une EC50 pour la suite des calculs, il convient de vérifier comme il se doit la qualité de l'ajustement. Une autre solution consiste à utiliser des méthodes d'ajustement graphique pour calculer l'EC50. Dans ce cas, il est recommandé d'utiliser du papier semi-logarithmique (axe des x: log, axe des y: probit) car très souvent, la fonction concentration-réponse devient pratiquement linéaire après cette transformation.2.3. Évaluation des résultats (modèles prédictifs)2.3.1. Modèle prédictif, version 1: facteur de photo-irritation (PIF)Si, tant en présence (+ UVA) qu'en absence (- UVA) de lumière, on obtient des courbes concentration-réponse complètes, on calcule un facteur de photo-irritation (PIF) à l'aide de la formule suivante:>PIC FILE= "L_2000136FR.010301.EPS">Un PIF <  5 indique une absence de potentiel phototoxique, alors qu'un PIF >= 5 indique un potentiel phototoxique.Si un produit chimique est cytotoxique uniquement en présence de lumière (+ UVA) et n'est pas cytotoxique dans les conditions - UVA, il n'est pas possible de calculer le PIF, bien que ce résultat indique un potentiel phototoxique. Dans un tel cas, on peut calculer un ' > PIF' si le test de cytotoxicité (-UV) est réalisé jusqu'à la concentration d'essai la plus élevée (Cmax); c'est cette dernière valeur qui est utilisée pour calculer le ' > PIF':>PIC FILE= "L_2000136FR.010302.EPS">Si l'on ne peut obtenir qu'un ' > PIF', alors toute valeur  > 1 indique un potentiel phototoxique.Si l'on ne peut calculer ni la EC50 (- UV) ni la EC50 (+ UV) parce que le produit chimique ne fait preuve d'aucune cytotoxicité jusqu'à la concentration d'essai la plus forte, cela démontre une absence de potentiel phototoxique. Dans ce cas, on utilise un 'PIF = *1' théorique pour caractériser ce résultat.>PIC FILE= "L_2000136FR.010303.EPS">Si l'on ne peut obtenir qu'un 'PIF = *1', cela signifie qu'il n'y a pas de potentiel phototoxique.Dans les cas (b) et (c), les concentrations atteintes dans le test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU doivent être soigneusement prises en considération lors de la détermination du potentiel phototoxique.2.3.2. Modèle prédictif, version 2: photo-effet moyen (MPE)À titre de variante, on peut utiliser une nouvelle version du modèle de prédiction du potentiel phototoxique, qui a été mise au point à partir des données de l'étude de validation UE/COLIPA (15) et testée en aveugle dans une étude subséquente portant sur la phototoxicité in vitro des substances chimiques utilisées comme filtres UV (13). Ce modèle permet de s'affranchir des limites inhérentes au modèle PIF dans les cas où l'on ne peut obtenir une EC50. Ce modèle utilise le photo-effet moyen ['Mean Photo Effect' (MPE)] qui est une mesure basée sur une comparaison des courbes concentration-réponse complètes. Pour utiliser le modèle MPE, l'université Humboldt (Berlin, Allemagne) a mis au point un logiciel spécial qui peut être obtenu gratuitement.2.4. Interprétation des résultatsUn résultat positif au test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU (PIF >= 5 ou MPE >= 0,1) indique que la substance testée a un potentiel phototoxique. Si ce résultat est obtenu à des concentrations inférieures à 10 µg/ml, le produit chimique est aussi susceptible d'agir comme une phototoxine dans diverses conditions d'exposition in vivo. Si un résultat positif n'est obtenu qu'à la concentration d'essai maximale de 100 µg/ml, d'autres investigations peuvent s'avérer nécessaires pour évaluer les risques ou le pouvoir phototoxique. Il peut s'agir notamment d'étudier la pénétration et l'absorption cutanées ou l'éventuelle accumulation du produit chimique dans la peau, ou de soumettre le produit à un autre type de test pour confirmer les résultats, en utilisant par exemple un modèle de peau humaine in vitro.Un résultat négatif au test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU (PIF <  5 ou MPE <  0,1) indique que la substance testée ne s'est pas révélée phototoxique pour les cellules de mammifère en culture dans les conditions utilisées. Dans les cas où le produit chimique a pu être testé jusqu'à la concentration maximale de 100 µg/ml, un résultat négatif indique que le produit chimique n'a pas de potentiel phototoxique et qu'une phototoxicité in vivo peut être considérée comme improbable. Dans les cas où l'on a obtenu des réponses toxiques identiques (EC50 + UV et EC50- UV) à des concentrations plus faibles, l'interprétation des résultats sera la même. En revanche, si aucune toxicité n'a été mise en évidence (+ UV et - UV) et si la solubilité du produit dans l'eau a limité les concentrations à des valeurs inférieures à 100 µg/ml, il faut peut-être s'interroger sur l'adéquation du système d'essai pour la substance à tester, et envisager un test de confirmation (par exemple, un test sur un modèle de peau in vitro ou ex vivo, ou bien un test in vivo).3. COMMUNICATION DES RÉSULTATSRapport d'essaiLe rapport d'essai doit comporter les informations suivantes:Produit chimique à tester:- données d'identification et n° CAS si connu,- nature physique et pureté,- propriétés physicochimiques importantes pour la réalisation de l'étude,- stabilité et photostabilité si connues.Solvant:- justification du choix du solvant,- solubilité du produit chimique à tester dans ce solvant,- pourcentage de solvant présent dans le milieu de traitement (EBSS ou PBS).Cellules:- type et provenance des cellules,- absence de mycoplasmes,- nombre de passages cellulaires, si connu,- sensibilité des cellules aux UVA, déterminée avec l'équipement d'irradiation utilisé dans le test de phototoxicité in vitro 3T3 NRU.Conditions d'essai (a); incubation avant et après traitement:- type et composition du milieu de culture,- conditions d'incubation (concentration de CO2, température, humidité),- durée de l'incubation (avant traitement et après traitement).Conditions d'essai (b); traitement par le produit chimique:- justification des concentrations du produit chimique utilisées en présence et en absence de rayonnement UV/lumière visible,- en cas de solubilité limitée du produit chimique et d'absence de cytotoxicité, justification de la concentration maximale utilisée,- type et composition du milieu de traitement (solution saline tamponnée),- durée du traitement chimique.Conditions d'essai (c); irradiation:- justification de la source de lumière utilisée,- caractéristiques d'irradiance spectrale de la source de lumière,- caractéristiques de transmission/absorption du (des) filtre(s) utilisé(s),- caractéristiques du radiomètre et modalités d'étalonnage,- distance entre la source de lumière et le système d'essai,- irradiance UVA à cette distance, exprimée en mW/cm2,- durée de l'exposition UV/lumière visible,- dose d'UVA (irradiance × temps), exprimée en J/cm2,- température appliquée aux cultures cellulaires durant l'irradiation et aux cultures cellulaires maintenues concurremment dans l'obscurité.Conditions d'essai (d); test NRU:- composition du milieu NR,- durée de l'incubation dans NR,- conditions d'incubation (concentration de CO2, température, humidité),- conditions d'extraction du NR (agent d'extraction, durée),- longueur d'ondes utilisée pour la lecture spectrophotométrique de la densité optique du NR,- seconde longueur d'ondes (référence), le cas échéant,- contenu de l'échantillon destiné à l'essai à blanc du spectrophotomètre, le cas échéant.Résultats:- viabilité cellulaire obtenue pour chaque concentration du produit chimique à tester, exprimée en % de la viabilité moyenne des témoins,- courbes concentration-réponse (concentration du produit chimique - viabilité cellulaire relative) obtenues dans les expériences + UVA et - UVA parallèles,- analyse des données fournies par les courbes concentration-réponse: si possible, calcul/détermination des EC50 (+ UVA) et EC50 (- UVA),- comparaison des deux courbes concentration-réponse obtenues en présence et en absence de rayonnement UVA/lumière visible, soit par le calcul du facteur de photo-irritation (PIF), soit par le calcul du photo-effet moyen (MPE),- classification du potentiel phototoxique,- critères d'acceptation de l'essai (a), témoin négatif simultané:- viabilité absolue (densité optique de l'extrait de NR) des cellules irradiées et des cellules non irradiées,- données historiques sur le témoin négatif, écart moyen et écart type,critères d'acceptation de l'essai (b), témoin positif simultané:- EC50 (+ UVA) et EC50 (- UVA) et PIF du produit chimique témoin positif,- données historiques sur le produit chimique témoin positif: EC50 (+ UVA) et EC50 (- UVA) et PIF, écart moyen et écart type.Discussion des résultatsConclusions4. RÉFÉRENCES(1) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer, F., Moore, L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, p. 793-796.(2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, p. 7-8.(3) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pechovitch, G., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA 'In vitro phototoxicity' validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, p. 305-327.(4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996.(5) Lovell, W.W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology in Vitro 7, p. 95-102.(6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, p. XI-XXXV.(7) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, p. 314-348.(8) Spikes, J.D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, p. 79-110.(9) Borenfreund, E. and Puerner, J.A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, p. 119-124.(10) Lambert L. A, Warner W.G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor &  Francis, Washington DC, 5th Edition, p. 515-530.(11) Tyrrell R.M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, p. 1825-1829.(12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project 'In Vitro Photoirritation'.(13) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, p. 679-708.(14) Holzhütter, H.G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, p. 127-138.(15) Holzhütter, H.G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, p. 445-462.Appendice>PIC FILE= "L_2000136FR.010702.TIF">"(1) Des détails supplémentaires sont donnés par la référence (12).


Avis juridique important

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32004L0042

Directive 2004/42/CE du Parlement européen et du Conseil du 21 avril 2004 relative à la réduction des émissions de composés organiques volatils dues à l'utilisation de solvants organiques dans certains vernis et peintures et dans les produits de retouche de véhicules, et modifiant la directive 1999/13/CE

Journal officiel n° L 143 du 30/04/2004 p. 0087 - 0096

Directive 2004/42/CE du Parlement européen et du Conseildu 21 avril 2004relative à la réduction des émissions de composés organiques volatils dues à l'utilisation de solvants organiques dans certains vernis et peintures et dans les produits de retouche de véhicules, et modifiant la directive 1999/13/CELE PARLEMENT EUROPÉEN ET LE CONSEIL DE L'UNION EUROPÉENNE,vu le traité instituant la Communauté européenne, et notamment son article 95,vu la proposition de la Commission,vu l'avis du Comité économique et social européen(1),statuant conformément à la procédure prévue à l'article 251 du traité(2),considérant ce qui suit:(1) La directive 2001/81/CE du Parlement européen et du Conseil du 23 octobre 2001 fixant des plafonds d'émission nationaux pour certains polluants atmosphériques(3) fixe des plafonds d'émission nationaux pour certains polluants, dont les composés organiques volatils (ci-après dénommés "COV"), applicables à partir de 2010, dans le cadre de la stratégie communautaire intégrée de lutte contre l'acidification et la formation d'ozone au sol, mais cette directive ne prévoit pas de valeurs limites pour les émissions de ces substances polluantes provenant de sources spécifiques.(2) Afin d'atteindre le plafond national d'émission de COV, les États membres doivent viser un certain nombre de catégories différentes de sources d'émissions.(3) La présente directive complète les mesures prises au niveau national pour assurer le respect du plafond d'émission de COV.(4) En l'absence de dispositions communautaires, les législations des États membres qui fixent des valeurs limites pour les COV présents dans certaines catégories de produits peuvent diverger. Ces disparités, ainsi que l'absence de législation en la matière dans certains États membres, sont susceptibles d'entraver inutilement les échanges et de fausser la concurrence sur le marché intérieur.(5) Il y a donc lieu d'harmoniser les dispositions législatives et réglementaires nationales qui, aux fins de la lutte contre la formation d'ozone au sol, fixent des valeurs limites pour les COV présents dans les produits relevant de la présente directive, de manière à ce qu'elles ne restreignent pas la libre circulation de ces produits.(6) Étant donné que l'objectif de l'action envisagée, à savoir la réduction des émissions de COV, ne peut pas être réalisé de manière suffisante par les États membres car les émissions de COV d'un État membre nuisent à la qualité de l'air dans d'autres États membres, et peut donc, en raison des dimensions ou des effets de l'action envisagée, être mieux réalisé au niveau communautaire, la Communauté peut prendre des mesures, conformément au principe de subsidiarité consacré à l'article 5 du traité. Conformément au principe de proportionnalité tel qu'énoncé audit article, la présente directive n'excède pas ce qui est nécessaire pour atteindre cet objectif.(7) Du fait de leur teneur en COV, les peintures, les vernis et les produits de retouche de véhicules dégagent dans l'air de grandes quantités de COV, qui contribuent, localement et par delà les frontières, à la formation d'oxydants photochimiques dans la couche limite de la troposphère.(8) La teneur en COV de certains vernis et peintures ainsi que de certains produits de retouche de véhicules devrait donc être réduite autant qu'il est techniquement et économiquement possible de le faire, compte tenu des conditions climatiques.(9) Un niveau élevé de protection de l'environnement nécessite la fixation et le respect de teneurs maximales en COV présents dans les produits relevant de la présente directive.(10) Il faudrait prévoir des mesures transitoires pour les produits fabriqués avant l'entrée en vigueur des prescriptions de la présente directive.(11) Les États membres devraient pouvoir accorder des licences individuelles pour la vente et l'achat, à des fins spécifiques et dans des quantités strictement limitées, de produits qui ne respectent pas les valeurs limites pour les solvants fixées par la présente directive.(12) La présente directive complète les dispositions communautaires relatives à l'étiquetage des substances et des préparations chimiques.(13) La protection de la santé des consommateurs et/ou des travailleurs et la protection de l'environnement de travail ne devraient pas relever du champ d'application de la présente directive et les mesures prises par les États membres à cette fin ne devraient donc pas être affectées par la présente directive.(14) Un contrôle des teneurs maximales est nécessaire pour vérifier si les concentrations massiques des COV présents dans chaque catégorie de peintures, de vernis et de produits de retouche de véhicules relevant de la présente directive respectent les limites autorisées.(15) La teneur en COV de produits utilisés pour certaines activités de retouche de véhicules étant désormais régie par la présente directive, il convient de modifier en conséquence la directive 1999/13/CE du Conseil du 11 mars 1999 relative à la réduction des émissions de composés organiques volatils dues à l'utilisation de solvants organiques dans certaines activités et installations(4).(16) Les États membres devraient toutefois pouvoir maintenir ou instaurer des mesures nationales afin de contrôler les émissions provenant d'activités de retouche de véhicules qui consistent en des opérations de revêtement de surface sur un véhicule routier au sens de la directive 70/156/CEE du Conseil du 6 février 1970 concernant le rapprochement des législations des États membres relatives à la réception des véhicules à moteur et de leurs remorques(5) ou sur une partie d'un tel véhicule, se déroulant hors des installations de fabrication, dans le cadre de la réparation, de la préservation ou de la décoration du véhicule.(17) La présente directive ne devrait pas s'appliquer aux produits vendus pour être utilisés exclusivement dans des installations autorisées conformément à la directive 1999/13/CE, dans lesquelles des mesures de limitation des émissions permettent par d'autres moyens d'obtenir une réduction au moins équivalente des émissions de COV.(18) Les États membres devraient définir le régime des sanctions applicables en cas d'infraction aux dispositions de la présente directive et veiller à leur application. Ces sanctions devraient être efficaces, proportionnées et dissuasives.(19) Il convient que les États membres fassent rapport à la Commission sur l'expérience acquise dans le cadre de l'application de la présente directive.(20) Il convient de procéder à une évaluation tant des moyens qui permettraient de réduire la teneur en COV des produits ne relevant pas de la présente directive que de la possibilité de réduire encore davantage les valeurs limites pour les COV qui sont déjà prévues.(21) Il y a lieu d'arrêter les mesures nécessaires pour la mise en oeuvre de la présente directive en conformité avec la décision 1999/468/CE du Conseil du 28 juin 1999 fixant les modalités de l'exercice des compétences d'exécution conférées à la Commission(6),ONT ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:Article premierObjectif et champ d'application1. La présente directive vise à limiter la teneur totale en composés organiques volatils (COV) de certains vernis et peintures et des produits de retouche de véhicules, en vue de prévenir ou de réduire la pollution atmosphérique résultant de l'incidence des COV sur la formation d'ozone troposphérique.2. Pour atteindre l'objectif énoncé au paragraphe 1, la présente directive harmonise les spécifications techniques applicables à certains vernis et peintures et aux produits de retouche de véhicules.3. La présente directive s'applique aux produits définis à l'annexe I.4. La présente directive ne porte pas atteinte ni préjudice aux mesures, y compris les exigences en matière d'étiquetage, prises au niveau communautaire ou national pour protéger la santé des consommateurs et des travailleurs et leur environnement de travail.Article 2DéfinitionsAux fins de la présente directive, on entend par:1. "autorité compétente", la ou les autorités ou les organismes chargés, en vertu de la législation des États membres, de s'acquitter des obligations découlant de la présente directive;2. "substances", tout élément chimique et ses composés, tels qu'ils se présentent à l'état naturel ou tels qu'ils sont produits par l'industrie, que ce soit sous forme solide, liquide ou gazeuse;3. "préparation", un mélange ou une solution se composant de deux substances ou plus;4. "composé organique", tout composé contenant au moins l'élément de carbone et un ou plusieurs des éléments suivants: hydrogène, oxygène, soufre, phosphore, silicium, azote, ou un halogène, à l'exception des oxydes de carbone et des carbonates et bicarbonates inorganiques;5. "composé organique volatil (COV)", tout composé organique dont le point d'ébullition initial, mesuré à la pression standard de 101,3 kPa, est inférieur ou égal à 250 °C;6. "teneur en COV", la masse de composés organiques volatils, exprimée en grammes/litre (g/l) dans la formulation du produit prêt à l'emploi. La masse de composés organiques volatils dans un produit donné, qui subissent une réaction chimique au séchage pour former le revêtement, n'est pas considérée comme faisant partie de la teneur en COV;7. "solvant organique", tout COV utilisé seul ou en association avec d'autres agents pour dissoudre ou diluer des matières premières, des produits ou des déchets, ou utilisé comme agent de nettoyage pour dissoudre des salissures ou comme dispersant, correcteur de viscosité, correcteur de tension superficielle, plastifiant ou agent protecteur;8. "revêtement", toute préparation, y compris tous les solvants organiques ou préparations contenant des solvants organiques nécessaires pour une application adéquate, utilisée pour obtenir un film ayant un effet décoratif, un effet protecteur ou tout autre effet fonctionnel sur une surface;9. "film", couche continue résultant d'une ou plusieurs applications de produit sur un support;10. "revêtements en phase aqueuse (PA)", les revêtements dont la viscosité est rectifiée par adjonction d'eau;11. "revêtements en phase solvant (PS)", les revêtements dont la viscosité est rectifiée par adjonction de solvant organique;12. "mettre sur le marché", rendre un produit disponible pour des tiers, à titre onéreux ou non. Toute importation sur le territoire douanier de la Communauté est assimilée à une mise sur le marché aux fins de la présente directive.Article 3Exigences1. Les États membres veillent à ce que les produits définis à l'annexe I ne soient mis sur le marché de leur territoire respectif à compter des dates prévues à l'annexe II que si leur teneur en COV n'excède pas les valeurs limites spécifiées dans l'annexe II et s'ils sont conformes aux prescriptions de l'article 4.Le respect des valeurs limites spécifiées à l'annexe II pour la teneur en COV est vérifié à l'aide des méthodes analytiques mentionnées à l'annexe III.Pour les produits définis à l'annexe I auxquels des solvants ou d'autres composants contenant des solvants doivent être ajoutés pour que le produit soit prêt à l'emploi, les valeurs limites indiquées à l'annexe II s'appliquent à la teneur en COV du produit prêt à l'emploi.2. Par dérogation au paragraphe 1, les États membres exemptent du respect des exigences susmentionnées les produits vendus pour être utilisés exclusivement dans le cadre d'une activité visée par la directive 1999/13/CE et exercée dans une installation ayant fait l'objet d'un enregistrement ou d'une autorisation conformément aux articles 3 et 4 de ladite directive.3. Aux fins de la restauration et de l'entretien des bâtiments et des véhicules d'époque dont les autorités compétentes estiment qu'ils ont une valeur historique et culturelle particulière, les États membres peuvent accorder des licences individuelles pour la vente et l'achat, dans des quantités strictement limitées, de produits qui ne respectent pas les valeurs limites spécifiées à l'annexe II pour la teneur en COV.4. Les produits relevant du champ d'application de la présente directive dont il est démontré qu'ils ont été fabriqués avant les dates spécifiées à l'annexe II et qui ne respectent pas les exigences du paragraphe 1 peuvent être mis sur le marché pendant 12 mois après la date d'entrée en vigueur de l'exigence qui s'applique au produit concerné.Article 4ÉtiquetageLes États membres veillent à ce que les produits définis à l'annexe I soient munis d'une étiquette lors de leur mise sur le marché. L'étiquette indique:a) la sous-catégorie du produit et les valeurs limites pertinentes pour la teneur en COV, exprimées en g/l, visées à l'annexe II;b) la teneur maximale en COV du produit prêt à l'emploi, exprimée en g/l.Article 5Autorité compétenteLes États membres désignent une autorité compétente chargée de veiller au respect des obligations imposées par la présente directive et en informent la Commission au plus tard le 30 avril 2005.Article 6SurveillanceLes États membres établissent un programme de surveillance afin de vérifier le respect de la présente directive.Article 7RapportsLes États membres rendent compte des résultats du programme de surveillance, afin d'attester du respect de la présente directive, ainsi que des catégories et des quantités de produits pour lesquels une licence a été accordée au titre de l'article 3, paragraphe 3. Les deux premiers rapports sont soumis à la Commission dix-huit mois après les dates fixées pour se conformer aux teneurs maximales en COV indiquées à l'annexe II; un rapport sera ensuite transmis à intervalles de cinq ans. La Commission élabore au préalable un modèle commun pour la présentation des données de surveillance, conformément à la procédure visée à l'article 12, paragraphe 2. Les données annuelles sont transmises à la Commission sur sa demande.Article 8Libre circulationLes États membres ne peuvent, pour les raisons prévues par la présente directive, interdire, restreindre ou empêcher la mise sur le marché de produits qui relèvent du champ d'application de la présente directive et qui, lorsqu'ils sont prêts à l'emploi, sont conformes à ses exigences.Article 9RéexamenLa Commission est invitée à présenter au Parlement européen et au Conseil:1. en 2008 au plus tard, un rapport fondé sur les résultats de la révision visée à l'article 10 de la directive 2001/81/CE. Ce rapport examine:a) le large éventail des possibilités de réduction de la teneur en COV de produits ne relevant pas du champ d'application de la présente directive, y compris les aérosols pour les vernis et peintures;b) l'introduction éventuelle d'une nouvelle phase de réduction de la teneur en COV (phase II) pour les produits de retouche de véhicules;c) tout élément nouveau ayant trait à l'impact socio-économique de la mise en oeuvre de la phase II, comme prévu pour les vernis et peintures.2. Au plus tard trente mois après la date prévue pour l'application des valeurs limites concernant la teneur en COV fixées à l'annexe II, phase II, un rapport tenant compte, en particulier, des rapports visés à l'article 7 et de toute évolution technologique en matière de fabrication de peintures, de vernis et de produits de retouche de véhicules. Ce rapport examine le large éventail des possibilités de réduction supplémentaire de la teneur en COV de produits relevant du champ d'application de la présente directive, y compris une éventuelle distinction entre les peintures pour l'intérieur et les peintures pour l'extérieur dans les sous-catégories d) et e) visées à l'annexe I, point 1.1, et à l'annexe II, section A.Ces rapports sont assortis, le cas échéant, de propositions visant à modifier la présente directive.Article 10SanctionsLes États membres déterminent le régime des sanctions applicables en cas d'infraction aux dispositions nationales adoptées en vertu de la présente directive, et prennent les mesures nécessaires pour en garantir l'application. Ces sanctions doivent être efficaces, proportionnées et dissuasives. Les États membres notifient ce régime et ces mesures à la Commission au plus tard le 30 octobre 2005, et l'informent dans les meilleurs délais de toute modification ultérieure de ces sanctions.Article 11Adaptation au progrès techniqueToutes les modifications nécessaires pour adapter l'annexe III au progrès technique sont adoptées par la Commission conformément à la procédure visée à l'article 12, paragraphe 2.Article 12Comité1. La Commission est assistée par le comité institué par l'article 13 de la directive 1999/13/CE du Conseil, ci-après dénommé "comité".2. Dans le cas où il est fait référence au présent paragraphe, les articles 5 et 7 de la décision 1999/468/CE s'appliquent, dans le respect des dispositions de l'article 8 de celle-ci.La période prévue à l'article 5, paragraphe 6, de la décision 1999/468/CE est fixée à trois mois.3. Le comité adopte son règlement intérieur.Article 13Modification de la directive 1999/13/CE1. La directive 1999/13/CE est modifiée comme suit:À l'annexe I, dans la rubrique "Retouche de véhicules", le tiret suivant est supprimé:"- le revêtement de surface sur un véhicule routier au sens de la directive 70/156/CEE ou sur une partie d'un tel véhicule, se déroulant hors des installations de fabrication, dans le cadre de la réparation, de la préservation ou de la décoration du véhicule;".2. Nonobstant le paragraphe 1, les États membres peuvent maintenir ou introduire des mesures nationales visant à contrôler les émissions provenant d'activités de retouche de véhicules retirées du champ d'application de la directive 1999/13/CE.Article 14Transposition1. Les États membres mettent en vigueur les dispositions législatives, réglementaires et administratives nécessaires pour se conformer à la présente directive le 30 octobre 2005 au plus tard. Ils en informent immédiatement la Commission.Lorsque les États membres adoptent ces dispositions, celles-ci contiennent une référence à la présente directive ou sont accompagnées d'une telle référence lors de leur publication officielle. Les modalités de cette référence sont arrêtées par les États membres.2. Les États membres communiquent à la Commission le texte des dispositions de droit interne qu'ils adoptent dans le domaine régi par la présente directive, ainsi qu'un tableau de correspondance entre les dispositions de la présente directive et les dispositions nationales adoptées.Article 15Entrée en vigueurLa présente directive entre en vigueur le jour de sa publication au Journal officiel de l'Union européenne.Article 16DestinatairesLes États membres sont destinataires de la présente directive.Fait à Strasbourg, le 21 avril 2004.Par le Parlement européenLe présidentP. CoxPar le ConseilLe présidentD. Roche(1) JO C 220 du 16.9.2003, p. 43.(2) Avis du Parlement européen du 25 septembre 2003 (non encore paru au Journal officiel), position commune du Conseil du 7 janvier 2004 (JO C 79 E du 30.3.2004, p. 1) et position du Parlement européen du 30 mars 2004 (non encore parue au Journal officiel).(3) JO L 309 du 27.11.2001, p. 22.(4) JO L 85 du 29.3.1999, p. 1. Directive modifiée par le règlement (CE) n° 1882/2003 du Parlement européen et du Conseil (JO L 284 du 31.10.2003, p. 1).(5) JO L 42 du 23.2.1970, p. 1. Directive modifiée en dernier lieu par la directive 2004/3/CE du Parlement européen et du Conseil (JO L 49 du 19.2.2004, p. 36).(6) JO L 184 du 17.7.1999, p. 23.ANNEXE ICHAMP D'APPLICATION1. Aux fins de la présente directive, les peintures et vernis désignent les produits énumérés dans les sous-catégories ci-après, à l'exclusion des aérosols. Il s'agit de revêtements appliqués sur les bâtiments, leurs menuiseries de finition et garnitures et les structures associées à des fins décoratives, fonctionnelles et de protection.1.1. Sous-catégoriesa) "revêtements mats pour murs intérieurs et plafonds" désigne des revêtements destinés à être appliqués sur des murs intérieurs et des plafonds, et qui ont un brillant <= 25@60°.b) "revêtements brillants pour murs intérieurs et plafonds" désigne des revêtements destinés à être appliqués sur des murs intérieurs et des plafonds, et qui ont un brillant  > 25@60°.c) "revêtements pour murs extérieurs, supports minéraux" désigne des revêtements destinés à être appliqués sur des murs extérieurs de maçonnerie, de briques ou de stuc.d) "peintures intérieur/extérieur pour finitions et bardages sur bois, métal ou plastique" désigne les revêtements destinés à être appliqués sur les menuiseries de finition et les bardages dans le but d'obtenir un film opaque. Ces revêtements peuvent être appliqués sur des supports en bois, en métal ou en plastique. Cette sous-catégorie comprend les sous-couches et les revêtements intermédiaires.e) "vernis et lasures intérieur/extérieur pour finitions" désigne les revêtements destinés à être appliqués sur les menuiseries de finition afin d'obtenir un film transparent ou semi-transparent à des fins décoratives ou protectrices sur le bois, le métal ou le plastique. Cette sous-catégorie comprend les lasures opaques. Les lasures opaques désignent des revêtements qui forment un film opaque pour la décoration et la protection du bois contre les intempéries, telles que définies par la norme EN 927-1, catégorie semi-stable.f) "lasures non filmogènes" désigne des lasures qui, en conformité avec la norme EN 927-1:1996, donnent un film d'épaisseur moyenne inférieure à 5 µm, déterminée selon la méthode 5 A de la norme ISO 2808:1997.g) "impressions" désigne les revêtements à fonction durcissante et/ou isolante, destinés à être utilisés sur le bois ou sur les murs et plafonds.h) "impressions fixatrices" désigne les revêtements destinés à stabiliser les particules de support libres ou à conférer des propriétés hydrophobes et/ou à protéger le bois contre le bleuissement.i) "revêtements monocomposants à fonction spéciale" désigne les revêtements spéciaux à base de matériau filmogène. Ils sont destinés aux applications appelées à remplir une fonction spéciale, par exemple, en tant que couche primaire ou couche de finition pour les plastiques, couche primaire pour les supports ferreux ou pour les métaux réactifs comme le zinc et l'aluminium, finition antirouille, revêtement de sol y compris pour sols en bois ou en ciment, revêtement antigraffiti, revêtement retardateur de flamme ou revêtement conforme aux normes d'hygiène dans l'industrie agro-alimentaire ou dans le secteur de la santé.j) "revêtements bicomposants à fonction spéciale" désigne des revêtements destinés aux mêmes usages que les précédents, avec un second composant (par exemple, des amines tertiaires) ajouté avant application.k) "revêtements multicolores" désigne les revêtements permettant d'obtenir directement, dès la première application, un effet bi- ou multicolore.l) "revêtements à effets décoratifs" désigne des revêtements conçus pour obtenir des effets esthétiques spéciaux sur des supports pré-peints spécialement préparés ou sur des couches de base, et travaillés ensuite avec divers outils durant la phase de séchage.2. Aux fins de la présente directive, "produits de retouche de véhicules" désigne les produits énumérés dans les sous-catégories définies ci-dessous. Ils sont utilisés pour les opérations de revêtement de surface sur un véhicule routier au sens de la directive 70/156/CEE ou sur une partie d'un tel véhicule, se déroulant hors des installations de fabrication, dans le cadre de la réparation, de la préservation ou de la décoration du véhicule.2.1. Sous-catégoriesa) "produits préparatoires et de nettoyage" désigne les produits destinés à éliminer, par action mécanique ou chimique, les revêtements anciens et la rouille ou à permettre l'accrochage des nouveaux revêtements.i) Les produits préparatoires incluent le nettoyant pour pistolet (produit destiné à nettoyer les pistolets pulvérisateurs et autres équipements); les décapants pour peintures, les dégraissants (y compris de type antistatique pour le plastique) et les produits de désiliconage.ii) "pré-nettoyant" désigne un produit de nettoyage destiné à éliminer les contaminations de la surface à peindre, lors de la préparation et avant l'application des enduits.b) "bouche-pores et mastic pour carrosserie/produits de rebouchage" désigne des composés épais destinés à être pulvérisés ou appliqués au couteau, afin de reboucher les imperfections profondes de la surface, avant application du système de peinture.c) "primaire" désigne tout revêtement destiné à être appliqué sur le métal nu ou sur des finitions existantes pour assurer une protection contre la corrosion avant application d'un primaire surfaceur.i) "primaire surfaceur" désigne tout revêtement destiné à être appliqué avant la couche de finition pour assurer la résistance à la corrosion et l'adhérence de la couche de finition; il permet également d'obtenir une surface uniforme en rebouchant les petites imperfections de surface.ii) "primaires divers pour métaux" désigne les revêtements destinés à être appliqués en tant que couche primaire, tels que les promoteurs d'adhérence, les produits d'étanchéité, les surfaceurs, les sous-couches, les primaires pour plastique, les mastics humide sur humide non ponçables et les mastics à pulvériser.iii) "peinture primaire réactive" désigne les revêtements contenant au moins 0,5 % en poids d'acide phosphorique, destinés à être appliqués directement sur des surfaces métalliques nues pour assurer la résistance à la corrosion et une bonne adhérence; les revêtements utilisés comme primaires soudables; et les mordants en solution pour les surfaces en métal galvanisé et zinc.d) "finition" désigne tout revêtement pigmenté destiné à être appliqué soit en une seule couche, soit en plusieurs couches pour conférer le brillant et la durabilité souhaités; englobe tous les produits concernés tels que les couches de base et les vernis:i) "base" désigne un revêtement pigmenté destiné à conférer la couleur et l'effet optique désirés, mais pas le brillant ni la résistance de surface du revêtement.ii) "vernis" désigne un revêtement incolore destiné à conférer le brillant final et les propriétés de résistance du revêtement.e) "finitions spéciales" désigne des revêtements destinés à être appliqués en tant que couche de finition conférant des propriétés spéciales telles qu'un effet métallisé ou nacré en une seule couche, en tant qu'enduit lustré haute performance de couleur unie ou transparent (par exemple, vernis anti-rayures fluorés), couche de base réfléchissante, couche de finition à effets de texture (par exemple martelage), revêtement antidérapant, revêtement d'étanchéité pour dessous de carrosserie, revêtement résistant aux chocs, finitions intérieures; et aérosols.ANNEXE II>TABLE>>TABLE>ANNEXE IIIMÉTHODES VISÉES À L'ARTICLE 3, PARAGRAPHE 1>TABLE>