title: Directive 2005/57/CE de la Commission du 21 septembre 2005 modifiant la directive 91/414/CEE du Conseil en vue d'y inscrire les substances actives MCPA et MCPB   (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

text:
               22.9.2005

               FR

               Journal officiel de l'Union européenne

               L 246/14

      DIRECTIVE 2005/57/CE DE LA COMMISSION

   du 21 septembre 2005
   modifiant la directive 91/414/CEE du Conseil en vue d'y inscrire les substances actives MCPA et MCPB
   (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)
   LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,
   vu le traité instituant la Communauté européenne,
   vu la directive 91/414/CEE du Conseil du 15 juillet 1991 concernant la mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques (1), et notamment son article 6, paragraphe 1,
   considérant ce qui suit:

               (1)

               Le règlement (CEE) no 3600/92 de la Commission du 11 décembre 1992 établissant les modalités de mise en œuvre de la première phase du programme de travail visé à l'article 8, paragraphe 2, de la directive 91/414/CEE du Conseil concernant la mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques (2) établit une liste de substances actives à évaluer en vue de leur éventuelle inscription à l'annexe I de la directive 91/414/CEE. Cette liste comprend le MCPA et le MCPB.

               (2)

               Les effets de ces substances actives sur la santé humaine et l'environnement ont été évalués conformément aux dispositions du règlement (CEE) no 3600/92 pour une série d'utilisations proposées par les auteurs des notifications. Par le règlement (CE) no 933/94 de la Commission du 27 avril 1994 établissant la liste de substances actives des produits phytopharmaceutiques et désignant l’État membre rapporteur pour l'application du règlement (CEE) no 3600/92 (3), l'Italie a été désignée comme État membre rapporteur. L'Italie a présenté à la Commission, le 5 avril 2001 et le 19 décembre 2001, les rapports d'évaluation et les recommandations, conformément à l'article 7, paragraphe 1, point c), du règlement (CEE) no 3600/92.

               (3)

               Les rapports d'évaluation ont été examinés par les États membres et la Commission dans le cadre du comité permanent de la chaîne alimentaire et de la santé animale. Les examens ont été achevés le 15 avril 2005 sous la forme des rapports d'examen du MCPA et du MCPB par la Commission.

               (4)

               Les examens du MCPA et du MCPB n’ont révélé aucun problème en suspens devant être étudié par le comité scientifique des plantes ou l’Autorité européenne de sécurité des aliments (AESA), qui a repris le rôle dudit comité.

               (5)

               Les différents examens effectués ont montré que les produits phytopharmaceutiques contenant du MCPA ou du MCPB devraient satisfaire, en règle générale, aux exigences énoncées à l'article 5, paragraphe 1, points a) et b), de la directive 91/414/CEE, notamment en ce qui concerne les utilisations examinées et décrites dans les rapports d'examen de la Commission. Il convient donc d'inscrire ces substances actives à l'annexe I, afin de garantir que dans tous les États membres, les autorisations de produits phytopharmaceutiques contenant ces substances actives pourront être accordées conformément aux dispositions de la directive.

               (6)

               Il convient de prévoir un délai raisonnable, avant l'inscription d'une substance active à l'annexe I, pour permettre aux États membres et aux parties intéressées de se préparer aux nouvelles exigences qui en découleront.

               (7)

               Sans préjudice des obligations prévues par la directive 91/414/CEE en cas d'inscription d'une substance active à l'annexe I, les États membres doivent disposer d'un délai de six mois après l'inscription pour réexaminer les autorisations existantes des produits phytopharmaceutiques contenant du MCPA ou du MCPB, afin de garantir le respect des dispositions de la directive 91/414/CEE, notamment de son article 13 et des conditions applicables fixées à l'annexe I. Selon les cas, les États membres doivent modifier, remplacer ou retirer les autorisations existantes, conformément aux dispositions de la directive 91/414/CEE. Il y a lieu de déroger au délai précité et de prévoir un délai plus long pour la présentation et l'évaluation du dossier complet, visé à l'annexe III, de chaque produit phytopharmaceutique pour chaque utilisation envisagée, conformément aux principes uniformes énoncés dans la directive 91/414/CEE.

               (8)

               L'expérience acquise lors des inscriptions précédentes à l'annexe I de la directive 91/414/CEE de substances actives évaluées dans le cadre du règlement (CEE) no 3600/92 a montré que des difficultés peuvent surgir de l'interprétation des devoirs des détenteurs d'autorisations existantes en ce qui concerne l'accès aux données. Il paraît dès lors nécessaire, si l'on veut éviter toute nouvelle difficulté, de préciser les devoirs des États membres, notamment le devoir de vérifier que le détenteur d'une autorisation démontre avoir accès à un dossier satisfaisant aux exigences de l'annexe II de ladite directive. Toutefois, cette précision n'impose pas de nouvelles obligations aux États membres ou aux détenteurs d'autorisations par rapport aux directives qui ont été adoptées jusqu'ici pour modifier l'annexe I.

               (9)

               Il y a donc lieu de modifier en conséquence la directive 91/414/CEE.

               (10)

               Les mesures prévues par la présente directive sont conformes à l'avis du comité permanent de la chaîne alimentaire et de la santé animale,

         A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:
   Article premier
   L'annexe I de la directive 91/414/CEE est modifiée conformément à l'annexe de la présente directive.
   Article 2
   Les États membres adoptent et publient, au plus tard le 31 octobre 2006, les dispositions législatives, réglementaires et administratives nécessaires pour se conformer à la présente directive. Ils communiquent immédiatement à la Commission le texte de ces dispositions ainsi qu'un tableau de correspondance entre ces dispositions et la présente directive.
   Ils appliquent ces dispositions à compter du 1er novembre 2006.
   Lorsque les États membres adoptent ces dispositions, celles-ci contiennent une référence à la présente directive ou sont accompagnées d'une telle référence lors de leur publication officielle. Les modalités de cette référence sont arrêtées par les États membres.
   Article 3
   1.   S’il y a lieu, les États membres modifient ou retirent, conformément aux dispositions de la directive 91/414/CEE, avant le 31 octobre 2006, les autorisations existantes de produits phytopharmaceutiques contenant du MCPA ou du MCPB en tant que substances actives. Pour cette date, ils vérifient notamment si les conditions de l'annexe I de ladite directive concernant le MCPA et le MCPB sont respectées, à l'exception de celles de la partie B des inscriptions concernant ces substances actives, et si le détenteur de l'autorisation possède un dossier, ou a accès à un dossier, satisfaisant aux exigences de l'annexe II de ladite directive conformément aux conditions de l'article 13.
   2.   Par dérogation au paragraphe 1, tout produit phytopharmaceutique autorisé contenant du MCPA ou du MCPB, en tant que substance active unique ou associée à d'autres substances actives, toutes inscrites à l'annexe I de la directive 91/414/CEE, fait l'objet, au plus tard le 30 avril 2006, d'une réévaluation par les États membres, conformément aux principes uniformes prévus à l'annexe VI de la directive 91/414/CEE, sur la base d'un dossier satisfaisant aux exigences de l'annexe III de ladite directive et tenant compte de la partie B des inscriptions à l'annexe I de ladite directive concernant le MCPA et le MCPB. En fonction de cette évaluation, les États membres déterminent si le produit remplit les conditions énoncées à l'article 4, paragraphe 1, points b), c), d) et e), de la directive 91/414/CEE.
   Ayant déterminé le respect de ces conditions, les États membres:

               a)

               dans le cas des produits contenant du MCPA ou du MCPB en tant que substance active unique, modifient ou retirent l'autorisation, s'il y a lieu, le 30 avril 2010 au plus tard; ou

               b)

               dans le cas des produits contenant du MCPA ou du MCPB associé à d'autres substances actives, modifient ou retirent l'autorisation, s'il y a lieu, le 30 avril 2010 ou à la date fixée pour procéder à cette modification ou à ce retrait dans la ou les directive(s) respective(s) ayant ajouté la ou les substance(s) considérée(s) à l'annexe I de la directive 91/414/CEE, si cette dernière date est postérieure.

         Article 4
   La présente directive entre en vigueur le 1er mai 2006.
   Article 5
   Les États membres sont destinataires de la présente directive.

      Fait à Bruxelles, le 21 septembre 2005.

            Par la Commission

         Markos KYPRIANOU

            Membre de la Commission

      (1)  JO L 230 du 19.8.1991, p. 1. Directive modifiée en dernier lieu par le règlement (CE) no 396/2005 du Parlement européen et du Conseil (JO L 70 du 16.3.2005, p. 1).

      (2)  JO L 366 du 15.12.1992, p. 10. Règlement modifié en dernier lieu par le règlement (CE) no 2266/2000 (JO L 259 du 13.10.2000, p. 10).

      (3)  JO L 107 du 28.4.1994, p. 8. Règlement modifié en dernier lieu par le règlement (CE) no 2230/95 (JO L 225 du 22.9.1995, p. 1).

      ANNEXE
      Substance active à ajouter à la fin du tableau figurant à l'annexe I de la directive 91/414/CEE:

                     No

                     Nom commun
                     Numéros d'identification

                     Dénomination de l'UICPA

                     Pureté (1)

                     Entrée en vigueur

                     Expiration de l'inscription

                     Dispositions spécifiques

                     «108

                     MCPA
                     No CAS 94-74-6
                     No CIMAP 2

                     Acide 4-4-chloro-o-tolyloxyacétique

                     ≥ 930 g/kg

                     1er mai 2006

                     30 avril 2016

                     PARTIE A
                     Seules les utilisations en tant qu'herbicide peuvent être autorisées
                     PARTIE B
                     Pour la mise en œuvre des principes uniformes prévus à l'annexe VI, il sera tenu compte des conclusions du rapport d'examen sur le MCPA, notamment de ses annexes I et II, telles que mises au point par le comité permanent de la chaîne alimentaire et de la santé animale le 15 avril 2005
                     Les États membres doivent accorder une attention particulière à la possibilité de contamination des eaux souterraines lorsque la substance active est appliquée dans des régions sensibles du point de vue du sol et/ou des conditions climatiques. Les conditions d’agrément doivent comprendre, le cas échéant, des mesures visant à atténuer les risques
                     Les États membres doivent accorder une attention particulière à la protection des organismes aquatiques et veiller à ce que les conditions d’agrément comprennent, le cas échéant, des mesures visant à atténuer les risques, comme la mise en place de zones tampons

                     109

                     MCPB
                     No CAS 94-81-5
                     No CIMAP 50

                     Acide 4-(4-chloro-o-tolyloxy)butyrique

                     ≥ 920 g/kg

                     1er mai 2006

                     30 avril 2016

                     PARTIE A
                     Seules les utilisations en tant qu'herbicide peuvent être autorisées
                     PARTIE B
                     Pour la mise en œuvre des principes uniformes prévus à l'annexe VI, il sera tenu compte des conclusions du rapport d'examen sur le MCPB, notamment de ses annexes I et II, telles que mises au point par le comité permanent de la chaîne alimentaire et de la santé animale le 15 avril 2005
                     Les États membres doivent accorder une attention particulière à la possibilité de contamination des eaux souterraines, lorsque la substance active est appliquée dans des régions sensibles du point de vue du sol et/ou des conditions climatiques. Les conditions d’agrément doivent comprendre, le cas échéant, des mesures visant à atténuer les risques
                     Les États membres doivent accorder une attention particulière à la protection des organismes aquatiques et veiller à ce que les conditions d’agrément comprennent, le cas échéant, des mesures visant à atténuer les risques, comme la mise en place de zones tampons»

         (1)  Des précisions concernant l'identité et les spécifications des substances actives sont fournies dans les rapports d'examen.


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31985L0347

Directive 85/347/CEE du Conseil du 8 juillet 1985 modifiant la directive 68/297/CEE concernant l'uniformisation des dispositions relatives à l'admission en franchise du carburant contenu dans les réservoirs des véhicules automobiles utilitaires

Journal officiel n° L 183 du 16/07/1985 p. 0022 - 0023 édition spéciale finnoise: chapitre 9 tome 1 p. 0124  édition spéciale espagnole: chapitre 07 tome 4 p. 0003  édition spéciale suédoise: chapitre 9 tome 1 p. 0124  édition spéciale portugaise: chapitre 07 tome 4 p. 0003

*****DIRECTIVE  DU CONSEIL  du 8 juillet 1985  modifiant la directive 68/297/CEE concernant l'uniformisation des dispositions relatives à l'admission en franchise du carburant contenu dans les réservoirs des véhicules automobiles utilitaires  (85/347/CEE)  LE CONSEIL DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,  vu le traité instituant la Communauté économique européenne, et notamment ses articles 75 et 99,  vu la proposition de la Commission (1),  vu l'avis de l'Assemblée (2),  vu l'avis du Comité économique et social (3),  considérant que la directive 68/297/CEE (4), modifiée par la directive 83/127/CEE (5), a fixé la quantité minimale de carburant contenue dans les réservoirs des véhicules automobiles utilitaires qui doit être admise en franchise aux frontières intérieures de la Communauté;  considérant que, en vue de faciliter le passage de ces frontières, il convient dans un premier stade d'augmenter ladite quantité pour les véhicules aptes et destinés aux transports de personnes; qu'il convient que le Conseil décide ultérieurement de l'augmentation applicable aux véhicules aptes et destinés aux transports de marchandises;  considérant qu'il y a lieu de préciser la notion de « réservoirs normaux »,  A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:  Article premier  La directive 68/297/CEE est modifiée comme suit.  1) L'article 1er est remplacé par le texte suivant:  « Article premier  Les États membres procèdent, conformément à la présente directive, à l'uniformisation des dispositions relatives à l'admission en franchise du carburant contenu dans les réservoirs normaux des véhicules automobiles utilitaires traversant des frontières communes entre les États membres. »  2) L'article 2 est remplacé par le texte suivant:  « Article 2  Au sens de la présente directive, on entend par:  - véhicule automobile utilitaire, tout véhicule routier à moteur qui, d'après son type de construction et son équipement, est apte et destiné aux transports, avec ou sans rémunération:  a) de plus de neuf personnes, y compris le conducteur;  b) de marchandises,  - « réservoirs normaux », les réservoirs fixés à demeure par le constructeur sur tous les véhicules automobiles du même type que le véhicule concerné et dont l'agencement permanent permet l'utilisation directe du carburant, tant pour la traction du véhicule que, le cas échéant, pour le fonctionnement des systèmes de réfrigération.  Sont également considérés comme réservoirs normaux les réservoirs à gaz adaptés sur des véhicules à moteur qui permettent l'utilisation directe du gaz comme carburant. »  3) À l'article 3, le paragraphe 1 est remplacé par le texte suivant:  « 1. Les États admettent en franchise les quantités suivantes de carburant contenues dans les réservoirs normaux des véhicules automobiles utilitaires:  a) 200 litres par véhicule et par voyage dans le cas de véhicules aptes et destinés aux transports, avec ou sans rémunération, de marchandises;  b) 600 litres par véhicule et par voyage dans le cas de véhicules aptes et destinés aux transports, avec ou sans rémunération, de plus de neuf personnes, y compris le conducteur.  Le Conseil, statuant selon les procédures prévues par le traité en la matière, décidera, sur proposition de la Commission, avant le 1er juillet 1986, de l'augmentation de la quantité de carburant admise en franchise et contenue dans les réservoirs normaux des véhicules visés au premier alinéa point a). »  4) L'article 5 est supprimé.  Article 2  Les États membres prennent les mesures nécessaires pour se conformer à la présente directive au plus tard le 1er octobre 1985. Ils en informent immédiatement la Commission.  Article 3  Les États membres sont destinataires de la présente directive.  Fait à Bruxelles, le 8 juillet 1985.  Par le Conseil  Le président  J. SANTER  (1) JO no C 95 du 6. 4. 1984, p. 4.  (2) JO no C 172 du 2. 7. 1984, p. 15.  (3) JO no C 248 du 17. 9. 1984, p. 13.  (4) JO no L 175 du 23. 7. 1968, p. 15.  (5) JO no L 91 du 9. 4. 1983, p. 28.


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31972L0199

Troisième directive 72/199/CEE de la Commission, du 27 avril 1972, portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux

Journal officiel n° L 123 du 29/05/1972 p. 0006 - 0034 édition spéciale finnoise: chapitre 3 tome 4 p. 0184  édition spéciale danoise: série III chapitre 1966-1972 p. 0071  édition spéciale suédoise: chapitre 3 tome 4 p. 0184  édition spéciale anglaise: série III chapitre 1966-1972 p. 0074  édition spéciale grecque: chapitre 03 tome 8 p. 0007  édition spéciale espagnole: chapitre 03 tome 6 p. 0008  édition spéciale portugaise: chapitre 03 tome 6 p. 0008

TROISIÈME DIRECTIVE DE LA COMMISSION  du 27 avril 1972  portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux  (72/199/CEE)  LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,  vu le traité instituant la Communauté économique européenne,  vu la directive du Conseil, du 20 juillet 1970, concernant l'introduction de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux (1), et notamment son article 2,  considérant que la directive susvisée prévoit que les contrôles officiels des aliments des animaux pour constater si les conditions prescrites en vertu des dispositions législatives, réglementaires ou administratives concernant la qualité et la composition des aliments des animaux sont respectées, sont effectués selon des modes de prélèvement d'échantillons et des méthodes d'analyse communautaires;  considérant que les directives nº 71/250/CEE et nº 71/393/CEE de la Commission, du 15 juin 1971 (2) et du 18 novembre 1971 (3), ont déjà fixé un certain nombre de méthodes d'analyse communautaires ; que, compte tenu de l'état d'avancement des travaux effectués depuis lors, il convient d'arrêter une troisième série de méthodes;  considérant que les mesures prévues dans la présente directive sont conformes à l'avis du Comité permanent des aliments des animaux,  A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:    Article premier Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles officiels des aliments des animaux en ce qui concerne leurs teneurs en amidon, protéines brutes, protéines brutes solubilisables par la pepsine et l'acide chlorhydrique et en gossypol libre et total ainsi que l'activité de la pepsine, sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe I de la présente directive.  Les dispositions générales figurant à la partie 1 (introduction) de l'annexe de la première directive nº 71/250/CEE de la Commission, du 15 juin 1971, portant fixation de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux sont applicables aux méthodes décrites à l'annexe I de la présente directive.   Article 2 Les États membres prescrivent que les analyses pour les contrôles officiels des aliments des animaux en vue de la détection et de l'identification des antibiotiques du groupe des tétracyclines ainsi qu'en ce qui concerne les teneurs des aliments en chlortétracycline, oxytétracycline, tétracycline, oléandomycine, tylosine, virginiamycine sont effectuées selon les méthodes décrites à l'annexe II de la présente directive.  Les dispositions générales figurant à la partie 1 (introduction) de l'annexe de la première directive nº 71/250/CEE de la Commission du 15 juin 1971, à l'exception de la partie concernant la préparation de l'échantillon à analyser, sont applicables aux méthodes décrites à l'annexe II de la présente directive.   Article 3 Les États membres mettent en vigueur, le 1er juillet 1973 au plus tard, les dispositions législatives, réglementaires ou administratives nécessaires pour se conformer aux dispositions de la présente directive. Ils en informent immédiatement la Commission.   Article 4 Les États membres sont destinataires de la présente directive.     Fait à Bruxelles, le 27 avril 1972.  Par la Commission  Le président  S.L. MANSHOLT  (1)JO nº L 170 du 3.8.1970, p. 2. (2)JO nº L 155 du 12.7.1971, p. 13. (3)JO nº L 279 du 20.12.1971, p. 7.     ANNEXE I  1. DOSAGE DE L'AMIDON - Méthode polarimétrique -    1. Objet et domaine d'application  La méthode permet de déterminer la teneur en amidon et en produits de dégradation à haut poids moléculaire de l'amidon des aliments des animaux, à l'exception de ceux qui contiennent des cossettes, des pulpes, des feuilles ou des collets séchés de betteraves, des pulpes de pommes de terre, des levures déshydratées, des produits riches en inuline (par exemple, cossettes et farine de topinambours) ou des cretons.   2. Principe  La méthode comprend une double détermination. Dans la première, l'échantillon est traité à chaud par l'acide chlorhydrique dilué. Après défécation et filtration, on mesure par polarimétrie le pouvoir rotatoire de la solution.  Dans la seconde, l'échantillon est extrait par l'éthanol à 40 %. Après acidification du filtrat par l'acide chlorhydrique, défécation et filtration, on mesure le pouvoir rotatoire dans les mêmes conditions que lors de la première détermination.  La différence entre les deux multipliée par un facteur connu donne la teneur en amidon de l'échantillon.   3. Réactifs   3.1 Acide chlorhydrique à 25 % (p/p), d : 1,126.   3.2 Acide chlorhydrique à 1,128 % (p/v).  La concentration doit être vérifiée par titration à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium 0,1 N en présence de rouge de méthyle à 0,1 % (p/v) dans l'éthanol à 94 % (v/v). 10 ml = 30,94 ml de NaOH 0,1 N.   3.3 Solution de Carrez I : Dissoudre dans l'eau 21,9 g d'acétate de zinc Zn (CH3COO)2  7 2H2O et 3 g d'acide acétique glacial. Compléter à 100 ml avec de l'eau.   3.4 Solution de Carrez II : Dissoudre dans l'eau 10,6 g de ferrocyanure de potassium K4[Fe(CN)6]  7 3H20. Compléter à 100 ml avec de l'eau.   3.5 Éthanol à 40 % (v/v), d : 0,948 à 20 ºC.    4 Appareillage   4.1 Erlenmeyer de 250 ml à rodage normalisé, avec réfrigérant à reflux.   4.2 Polarimètre ou saccharimètre.    5. Mode opératoire   5.1 Préparation de l'échantillon  Broyer l'échantillon de façon qu'il passe en totalité au travers d'un tamis à mailles rondes de 0,5 mm de diamètre.   5.2 Détermination du pouvoir rotatoire total (P ou S) (v. observation 7.1)  Peser, à 1 mg près, 2,5 g de l'échantillon broyé et les introduire dans un ballon jaugé de 100 ml. Ajouter 25 ml d'acide chlorhydrique (3.2), agiter pour obtenir une bonne répartition de la prise d'essai et ajouter à nouveau 25 ml d'acide chlorhydrique (3.2). Plonger le ballon dans un bain d'eau bouillante et, durant les 3 premières minutes qui suivent, agiter énergiquement et régulièrement pour éviter la formation d'agglomérats. La quantité d'eau du bain doit être suffisante pour permettre de maintenir le bain en ébullition lorsque le ballon y est plongé. Celui-ci ne peut être retiré du bain au cours de l'agitation. Après 15 minutes exactement, retirer le ballon du bain, y ajouter 30 ml d'eau froide et refroidir immédiatement jusqu'à 20 ºC.  Ajouter 5 ml de solution de Carrez I (3.3) et agiter pendant une minute. Ajouter ensuite 5 ml de solution de Carrez II (3.4) et agiter à nouveau pendant une minute. Compléter au volume avec de l'eau, homogénéiser et filtrer. Si le filtrat n'est pas parfaitement limpide (ce qui est peu fréquent), recommencer l'analyse en utilisant une plus grande quantité des solutions de Carrez I et II, par exemple 10 ml.   Mesurer ensuite le pouvoir rotatoire de la solution dans un tube de 200 mm au polarimètre ou au saccharimètre   5.3 Détermination du pouvoir rotatoire (P' ou S') des substances solubles dans l'éthanol à 40 %  Peser, à 1 mg près, 5 g de l'échantillon, les introduire dans un ballon jaugé de 100 ml et ajouter 80 ml environ d'éthanol (3.5) (v. observation 7.2). Laisser le ballon en attente durant 1 h à la température ambiante ; au cours de ce laps de temps, procéder 6 fois à une agitation énergique de façon que la prise d'essai soit bien mélangée à l'éthanol. Porter ensuite au volume avec de l'éthanol (3.5), homogénéiser et filtrer.  Introduire à la pipette 50 ml du filtrat (= 2,5 g de l'échantillon) dans un erlenmeyer de 250 ml, ajouter 2,1 ml d'acide chlorhydrique (3.1) et agiter énergiquement. Ajuster un réfrigérant à reflux à l'erlenmeyer et plonger celui-ci dans un bain d'eau bouillante. Après 15 minutes exactement, retirer l'erlenmeyer du bain, transvaser son contenu dans un ballon jaugé de 100 ml, en rinçant avec un peu d'eau froide, et refroidir jusqu'à 20 ºC. Déféquer ensuite à l'aide des solutions de Carrez I (3.3) et II (3.4), compléter au volume avec de l'eau, homogénéiser, filtrer et mesurer le pouvoir rotatoire comme indiqué en 5.2, deuxième et troisième alinéas.    6. Calcul des résultats  La teneur en amidon pour cent d'échantillon est calculée comme suit:   6.1 Mesures effectuées au polarimètre >PIC FILE= "T0004345">   + 185,9º: amidon de riz  + 195,4º: amidon de pommes de terre  + 184,6º: amidon de maïs  + 182,7º: amidon de froment  + 181,5º: amidon d'orge  + 181,3º: amidon d'avoine  + 184,0º: autres types d'amidons, ainsi que mélanges d'amidons des aliments composés   6.2 Mesures effectuées au saccharimètre >PIC FILE= "T0004346">     6.3 Répétabilité  La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser 0,4 en valeur absolue pour les teneurs en amidon inférieures à 40 % 1,1 % en valeur relative pour les teneurs en amidon égales ou supérieures à 40 %.    7. Observations   7.1 Lorsque l'échantillon contient plus de 6 % de carbonates, calculés en carbonate de calcium, ceux-ci doivent être détruits par un traitement à l'aide d'une quantité exactement appropriée d'acide sulfurique dilué, avant la détermination du pouvoir rotatoire total.   7.2 Dans le cas des produits à forte teneur en lactose, tels que les poudres de lactosérum ou de lait écrémé, procéder comme suit après l'addition des 80 ml d'éthanol (3.5). Ajuster au ballon un réfrigérant à reflux, plonger le ballon durant 30 minutes dans un bain d'eau à 50 ºC. Laisser ensuite refroidir et poursuivre l'analyse comme indiqué en 5.3.      2. DOSAGE DES PROTÉINES BRUTES      1. Objet et domaine d'application  La méthode permet de déterminer conventionnellement la teneur en protéines brutes des aliments des animaux à partir de la teneur en azote, dosée selon Kjeldahl.       2. Principe  L'échantillon est minéralisé par voie humide. La solution acide est alcalinisée par une solution d'hydroxyde de sodium. L'ammoniac libéré est entraîné par distillation et recueilli dans une quantité déterminée d'acide sulfurique dont l'excès est titré par une solution d'hydroxyde de sodium.       3. Réactifs   3.1 Sulfate de potassium p.a.   3.2 Catalyseur : oxyde cuivrique CuO p.a., ou sulfate cuivrique cristallisé CuSO4  7 5H2O p.a., ou mercure, ou oxyde mercurique HgO p.a.   3.3 Zinc p.a., en granulés.   3.4 Acide sulfurique p.a., d : 1,84   3.5 Acide sulfurique 0,1 N.   3.6 Acide sulfurique 0,5 N.   3.7 Indicateur au rouge de méthyle : dissoudre 300 mg de rouge de méthyle dans 100 ml d'éthanol à 95-96 % (v/v).   3.8 Solution à 40 % (p/v) d'hydroxyde de sodium.   3.9 Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 N.    3.10 Solution d'hydroxyde de sodium 0,25 N.   3.11. Solution saturée de sulfure de sodium p.a.   3.12 Solution à 8 % (p/v) de thiosulfate de sodium, Na2S2O3  7 5H2O p.a.    3.13 Pierre ponce en grains, lavée à l'acide chlorhydrique et calcinée.    4. Appareillage  Appareils à minéraliser et distiller selon Kjedahl (v. observation 7.1).        5. Mode opératoire   5.1 Minéralisation  Peser, à 1 mg près, 1 g de l'échantillon et introduire la prise d'essai dans le ballon de l'appareil à minéraliser. Ajouter 10 g de sulfate de potassium (3.1), une quantité appropriée de catalyseur (3.2) (0,3 à 0,4 g d'oxyde cuivrique ou 0,9 à 1,2 g de sulfate cuivrique ou une goutte de mercure ou 0,6 à 0,7 g d'oxyde mercurique), 25 ml d'acide sulfurique (3.4) et quelques granulés de pierre ponce (3.13). Homogénéiser. Chauffer le ballon d'abord avec modération et en agitant de temps en temps jusqu'à carbonisation de la masse et disparition de l'écume ; ensuite plus intensément jusqu'à ébullition régulière du liquide. Éviter la surchauffe des parois et l'adhérence de particules organiques. Lorsque la solution apparaît limpide et incolore (vert clair en présence de catalyseur à base de cuivre), maintenir l'ébullition durant 1 h encore. Laisser ensuite refroidir.   5.2 Distillation  Ajouter 250 à 350 ml d'eau, avec précaution et tout en agitant pour dissoudre complètement les sulfates ; laisser refroidir.  Ajouter ensuite quelques granulés de zinc (3.3).  Introduire dans le flacon collecteur de l'appareil à distiller 25 ml exactement mesurés d'acide sulfurique 0,1 N (3.5) ou 0,5 N (3.6), selon la teneur présumée en azote (v. observation 7.2) et quelques gouttes d'indicateur au rouge de méthyle (3.7).  Connecter le ballon au réfrigérant de l'appareil à distiller et plonger l'extrémité de ce dernier sur une hauteur de 1 cm au moins dans le liquide du flacon collecteur (v. observation 7.3). Introduire lentement dans le ballon par l'entonnoir à robinet 100 ml de solution à 40 % d'hydroxyde de sodium (3.8). Si l'on a utilisé un catalyseur à base de mercure, introduire en outre dans le ballon soit 10 ml de solution de sulfure de sodium (3.11), soit 25 ml de solution de thiosulfate de sodium (3.12).  Chauffer le ballon de façon à distiller 150 ml environ de liquide en 30 minutes. Après ce laps de temps, vérifier la neutralité du distillat qui s'écoule au moyen de papier de tournesol. Si la réaction est alcaline, poursuivre la distillation. Arrêter celle-ci lorsque le distillat apparaît neutre au papier de tournesol. Au cours de la distillation, remuer de temps en temps le contenu du flacon collecteur et surveiller sa coloration. Si celle-ci vire au jaune, ajouter immédiatement un volume exactement mesuré d'acide sulfurique 0,1 N (3.5) ou 0,5 N (3.6).   5.3 Titration  Titrer dans le flacon collecteur l'excès d'acide sulfurique par la solution d'hydroxyde de sodium 0,1 N (3.9) ou 0,25 N (3.10), selon la normalité de l'acide sulfurique utilisé, jusqu'à virage de la coloration au jaune clair. 5.4 Contrôle de la méthode  Pour contrôler que les réactifs sont exempts d'azote, effectuer un essai à blanc (distillation et titration), en l'absence d'échantillon à analyser. Pour contrôler l'exactitude de la méthode, effectuer l'analyse (minéralisation, distillation et titration) sur 1,5 à 2,0 g d'acétanilide p.a. (P.F. 114 ºC ; % N : 10,36) en présence de 1 g de saccharose, exempt d'azote ; 1 g d'acétanilide consomme 14,80 ml d'acide sulfurique 0,5 N.   6. Calcul des résultats  Déterminer le volume d'acide sulfurique consommé, 1 ml d'acide sulfurique 0,1 N correspond à 1,4 mg d'azote. Multiplier la quantité d'azote par le facteur 6,25. Exprimer le résultat en pour cent de l'échantillon.  Répétabilité  La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser:    - 0,2 en valeur absolue pour les teneurs en protéines brutes inférieures à 20 %;       - 1,0 % en valeur relative pour les teneurs comprises entre 20 et 40 %;       - 0,4 en valeur absolue pour les teneurs supérieures à 40 %.           7. Observations   7.1 Certains appareils, qui exigent un transvasement entre minéralisation et distillation, peuvent être utilisés. Dans ce cas, le transvasement doit être effectué sans perte.   7.2 Pour les produits pauvres en matières azotées, le volume d'acide sulfurique 0,1 N à introduire dans le flacon collecteur peut être réduit, si nécessaire, à 10 ou 15 ml et complété à 25 ml par de l'eau.   7.3 Si le ballon de l'appareil à distiller n'est pas muni d'un entonnoir à robinet, ajouter la solution d'hydroxyde de sodium immédiatement avant de connecter le ballon au réfrigérant et en laissant couler le liquide lentement le long des parois de façon à éviter qu'il se mélange à la solution acide.     3. DOSAGE DES PROTÉINES BRUTES SOLUBILISÉES PAR LA PEPSINE ET L'ACIDE CHLORHYDRIQUE       1. Objet et domaine d'application  La méthode permet de déterminer la fraction des protéines brutes solubilisées par la pepsine et l'acide chlorhydrique dans des conditions déterminées. Elle est applicable à tous les aliments.       2. Principe  L'échantillon est soumis à un traitement de 48 h à 40 ºC par une solution chlorhydrique de pepsine. La suspension est filtrée et la teneur en azote du filtrat est déterminée selon la méthode décrite pour le dosage des protéines brutes.       3. Réactifs   3.1 Acide chlorhydrique, d : 1,125   3.2 Acide chlorhydrique 0,075 N.   3.3 Pepsine à 2,0 U/mg ; cette activité est définie et doit être contrôlée selon la méthode faisant l'objet de la partie 4 de la présente annexe.   3.4 Solution fraîchement préparée à environ 0,02 % (p/v) de pepsine dans l'acide chlorhydrique (3.2) ; activité : 400 U/l.   3.5 Émulsion d'antimousse (silicone par exemple).   3.6 Tous les réactifs indiqués sous le point 3 de la méthode de dosage des protéines brutes.        4. Appareillage   4.1 Bain d'eau ou étuve à incubation, réglé à 40 ºC ± 1 ºC.   4.2 Appareils à minéraliser et à distiller selon Kjeldahl.        5. Mode opératoire   5.1 Mise en solution (v. observation 7.2)  Peser, à 1 mg près, 2 g de l'échantillon. Introduire la prise d'essai dans un ballon jaugé de 500 ml et ajouter 450 ml de solution chlorhydrique de pepsine (3.4) préalablement portée à 40 ºC. Agiter de façon à éviter la formation d'agglomérats. Vérifier que le pH de la suspension est inférieur à 1,7. Porter le ballon dans le bain d'eau ou l'étuve à incubation (4.1) et l'y maintenir durant 48 h. Agiter après 8, 24 et 32 h. Après 48 h, ajouter 15 ml d'acide chlorhydrique (3.1), refroidir jusqu'à 20 ºC, compléter au volume avec de l'eau et filtrer.   5.2 Minéralisation  Prélever 250 ml du filtrat et les introduire dans le ballon de l'appareil à distiller (4.2). Ajouter les réactifs nécessaires à la minéralisation comme indiqué dans la méthode de dosage des protéines brutes, au point 5.1, deuxième phrase.   Homogénéiser et chauffer à ébullition. S'il y a formation de mousse, ajouter quelques gouttes d'émulsion d'antimousse (3.5). Maintenir une ébullition vive jusqu'à évaporation presque complète de l'eau. Éliminer les dernières traces d'eau avec précaution, en réduisant l'intensité du chauffage. Lorsque la solution apparaît limpide et incolore (vert clair en présence de catalyseur à base de cuivre), poursuivre l'ébullition durant 1 h encore. Laisser ensuite refroidir.   5.3 Distillation et titration  Procéder comme indiqué dans la méthode de dosage des protéines brutes, points 5.2 et 5.3.   5.4 Essai à blanc  Effectuer un essai à blanc en appliquant le mode opératoire en l'absence d'échantillon à analyser.        6. Calcul des résultats  Déduire le volume d'acide sulfurique consommé par l'essai à blanc de celui consommé par la prise d'essai. 1 ml d'acide sulfurique 0,1 N correspond à 1,4 mg d'azote.  Multiplier la quantité d'azote par le facteur 6,25. Exprimer le résultat en pour cent de l'échantillon.  Répétabilité  La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser:      - 0,4 en valeur absolue, pour les teneurs inférieures à 20 %;           - 2,0 %, en valeur relative, pour les teneurs comprises entre 20 et 40 %;           - 0,8, en valeur absolue, pour les teneurs supérieures à 40 %.                 7. Observations   7.1 Les valeurs obtenues par la présente méthode n'ont pas de lien direct avec la digestibilité in vivo.   7.2 Les produits dont la teneur en matières grasses dépasse 10 % doivent être préalablement dégraissés par extraction à l'éther de pétrole (éb. 40-60 ºC).      4. DÉTERMINATION DE L'ACTIVITÉ DE LA PEPSINE      1. Objet et domaine d'application  La méthode permet de contrôler l'activité de la pepsine utilisée pour le dosage des protéines brutes solubilisées par la pepsine et l'acide chlorhydrique.       2. Principe  L'hémoglobine est traitée dans des conditions définies par la pepsine en milieu chlorhydrique. La fraction non hydrolysée des protéines est précipitée par l'acide trichloracétique. Le filtrat est additionné d'hydroxyde de sodium et du réactif selon Folin-Ciocalteu. La densité optique de cette solution est mesurée à 750 nm et la quantité de tyrosine qui y correspond est lue sur une courbe d'étalonnage.  Définition : L'unité de pepsine est définie comme étant la quantité de cette enzyme qui libère, par minute, dans les conditions de la méthode, une quantité de groupements hydroxyaryl dont la coloration par le réactif selon Folin-Ciocalteu a une densité optique correspondant à celle d'une ¶mole de tyrosine, dans les mêmes conditions.        3. Réactifs   3.1 Acide chlorhydrique 0,2 N.   3.2 Acide chlorhydrique 0,06 N.   3.3 Acide chlorhydrique 0,025 N.   3.4 Solution à 5 % (p/v) d'acide trichloracétique.   3.5 Solution d'hydroxyde de sodium 0,5 N.   3.6 Réactif selon Folin-Ciocalteu. Introduire 100 g de tungstate de sodium (Na2WO4  7 2H2O), 25 g de molybdate de sodium (Na2MoO4  7 2H2O) et 700 ml d'eau dans un ballon à fond rond de 2 l à rodage normalisé. Ajouter 50 ml d'acide phosphorique (d : 1,71) et 100 ml d'acide chlorhydrique concentré (d : 1,19), ajuster au ballon un réfrigérant à reflux, chauffer à ébullition et maintenir la solution en ébullition douce durant 10 h. Laisser refroidir, détacher le réfrigérant à reflux, ajouter 175 g de sulfate de lithium (Li2SO4  7 2H2O), 50 ml d'eau et 1 ml de brome. Faire bouillir durant 15 minutes pour éliminer l'excès de brome.  Laisser refroidir, transvaser la solution dans un ballon jauge de 1 l, compléter au volume avec de l'eau, homogénéiser et filtrer. Il ne peut subsister de coloration verdâtre. Avant l'emploi, diluer 1 volume du réactif par 2 volumes d'eau.   3.7 Solution d'hémoglobine : Peser une quantité d'hémoglobine, substrat protéique d'après Anson, (2 g environ) correspondant à 354 mg d'azote (1) et l'introduire dans un ballon de 200 ml à rodage normalisé. Ajouter quelques ml d'acide chlorhydrique (3.2), relier le ballon à la pompe à vide et agiter jusqu'à dissolution complète de l'hémoglobine. Couper le vide et ajouter tout en agitant de l'acide chlorhydrique (3.2) pour compléter à 100 ml. Préparer immédiatement avant l'emploi.   3.8 Solution étalon de tyrosine : Dissoudre 181,2 mg de tyrosine dans l'acide chlorhydrique (3.1) et compléter à 1 l avec le même acide (solution mère). Prélever 20,0 ml et diluer à 100 ml par l'acide chlorhydrique (3.1). 1 ml de cette solution contient 0,2 ¶mole de tyrosine.        4. Appareillage   4.1 Bain d'eau, réglé à 25 ºC ± 0,1 ºC par l'ultrathermostat.   4.2 Spectrophotomètre.   4.3 Chronomètre, précision : 1 seconde.   4.4 pH-mètre.        5. Mode opératoire   5.1 Préparation de la solution (v. observation 7.1)  Dissoudre 150 mg de pepsine dans 100 ml d'acide chlorhydrique (3.2). Prélever à la pipette 2 ml de la solution, les introduire dans un ballon jaugé de 50 ml et compléter au volume par de l'acide chlorhydrique (3.3). Le pH, contrôlé au pH-mètre, doit être de 1,6 ± 0,1 Plonger le ballon dans le bain d'eau (4.1).   5.2 Hydrolyse  Introduire à la pipette dans un tube à essai 5,0 ml de solution d'hémoglobine (3.7), porter à 25 ºC dans le bain d'eau (4.1), ajouter 1,0 ml de la solution de pepsine obtenue en 5.1 et mélanger à l'aide d'une tige de verre, épaissie à une extrémité, par environ 10 mouvements de va-et-vient. Maintenir le tube à essai dans le bain d'eau à 25 ºC durant 10 minutes exactement, comptées à partir de l'addition de la solution de pepsine (la durée et la température doivent être parfaitement respectées). Ajouter ensuite 10,0 ml de solution d'acide trichloracétique (3.4), préalablement portée à 25 ºC, homogénéiser et filtrer sur un filtre sec.   5.3 Développement de la coloration et mesure de la densité optique  Prélever à la pipette 5,0 ml du filtrat, les introduire dans un erlenmeyer de 50 ml, ajouter 10,0 ml de solution d'hydroxyde de sodium (3.5) et, en agitant constamment, 3,0 ml du réactif dilué de Folin-Ciocalteu (3.6). Après 5 à 10 minutes, déterminer la densité optique de la solution au spectrophotomètre à 750 nm dans des cuvettes de 1 cm d'épaisseur, par comparaison avec de l'eau.  (1)Déterminer la teneur en azote par un semi-microkjeldahl (teneur théorique : 17,7 % d'azote).    5.4 Essai à blanc  Pour chaque détermination, procéder à un essai à blanc comme indiqué ci-après.  Introduire à la pipette dans un tube à essai 5,0 ml de solution d'hémoglobine (3.7), porter à 25 ºC dans le bain d'eau (4.1), ajouter 10,0 ml de solution d'acide trichloracétique (3.4) préalablement portée à 25 ºC, homogénéiser et ajouter ensuite 1,0 ml de la solution de pepsine obtenue en 5.1. Mélanger à l'aide d'une tige de verre et maintenir le tube à essai 10 minutes exactement dans le bain d'eau (4.1) à 25 ºC. Homogénéiser et filtrer sur un filtre sec. Poursuivre le mode opératoire comme indiqué en 5.3.   5.5 Courbe d'étalonnage  Introduire dans des erlenmeyers de 50 ml des volumes de 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 et 5,0 ml de solution étalon de tyrosine (3.8), correspondant respectivement à des quantités de tyrosine de 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 et 1,0 ¶moles. Compléter la série par un témoin exempt de tyrosine. Porter les volumes à 5,0 ml à l'aide d'acide chlorhydrique (3.1). Ajouter 10,0 ml de solution d'hydroxyde de sodium (3.5) et, en agitant constamment, 3,0 ml du réactif dilué de Folin-Ciocalteu (3.6). Mesurer la densité optique comme indiqué en 5.3, dernière phrase. Tracer la courbe d'étalonnage en portant les densités optiques en regard des quantités de tyrosine.        6. Calcul des résultats  Lire sur la courbe d'étalonnage la quantité de tyrosine, en ¶mole, correspondant à la densité optique de la solution colorée, corrigée de l'essai à blanc.  L'activité de la pepsine, en ¶mole de tyrosine, par mg et par minute, à 25 ºC, est donnée par la formule: >PIC FILE= "T0004348">   dans laquelle:  a = quantité de tyrosine, en ¶mole, lue sur la courbe d'étalonnage;  p = poids en mg de la quantité de pepsine ajoutée en 5.2.       7. Observations   7.1 La quantité de pepsine à mettre en solution doit être choisie de façon à obtenir, lors de la mesure photométrique finale, une densité optique de 0,35 ± 0,035.   7.2 Deux unités par mg obtenues par la présente méthode correspondent à : 3,64 milliunités Anson/mg (¶mole de tyrosine/mg min à 35,5 ºC) ou  36 400 unités commerciales/g (¶mole de tyrosine/g en 10 min à 35,5 ºC).     5. DOSAGE DU GOSSYPOL LIBRE ET TOTAL      1. Objet et domaine d'application  La méthode permet de doser le gossypol libre, le gossypol total et les substances chimiquement apparentées dans les graines, les farines et les tourteaux de coton ainsi que dans les aliments composés qui en contiennent. La limite inférieure du dosage est de 20 ppm.       2. Principe  Le gossypol est extrait en présence de 3-amino-l-propanol, soit par un mélange d'isopropanol et d'hexane pour le dosage du gossypol libre, soit par la diméthylformamide pour le dosage du gossypol total. Le gossypol est transformé au moyen d'aniline en gossypol-dianiline, dont la densité optique est mesurée à 440 nm.        3. Réactifs   3.1 Mélange isopropanol-hexane : mélanger 60 parts en volume d'isopropanol p.a. à 40 parts en volume d'hexane normal.   3.2 Solvant A : porter dans un ballon jaugé de 1 l, 500 ml environ du mélange isopropanolhexane (3.1), 2 ml de 3-amino-l-propanol, 8 ml d'acide acétique glacial et 50 ml d'eau. Compléter au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Ce réactif est stable durant une semaine.   3.3 Solvant B : porter à la pipette dans un ballon jaugé de 100 ml, 2 ml de 3-amino-l-propanol et 10 ml d'acide acétique glacial. Refroidir à la température ambiante et compléter au volume par la N,N-diméthylformamide. Ce réactif est stable durant une semaine.   3.4 Aniline p.a. : si la densité optique de l'essai à blanc excède 0,022, distiller l'aniline sur poudre de zinc en éliminant les première et dernière fractions de 10 % du distillat. En flacon bouché de verre brun et au réfrigérateur, ce réactif se conserve plusieurs mois.   3.5 Solution étalon A de gossypol : Porter dans un ballon jaugé de 250 ml, 27,9 mg d'acétate de gossypol. Dissoudre et compléter au volume par le solvant A (3.2). Introduire à la pipette 50 ml de cette solution dans un ballon jaugé de 250 ml et compléter au volume par le solvant A. La concentration en gossypol de cette solution est de 0,02 mg/ml. Laisser reposer durant 1 h à la température ambiante, avant l'emploi.   3.6 Solution étalon B de gossypol : Porter dans un ballon jaugé de 50 ml, 27,9 mg d'acétate de gossypol. Dissoudre et compléter au volume par le solvant B (3.3). La concentration en gossypol de cette solution est de 0,5 mg/ml.  Conservées à l'abri de la lumière, les solutions étalon A et B de gossypol sont stables durant 24 h.        4. Appareillage   4.1 Mélangeur (culbuteur) : environ 35 retournements par minute.   4.2 Spectrophotomètre.        5. Mode opératoire   5.1 Prise d'essai  La prise d'essai est en rapport avec la teneur présumée en gossypol de l'échantillon. Il est préférable d'opérer sur une petite prise d'essai et sur une partie aliquote du filtrat relativement importante, de façon à obtenir une quantité de gossypol suffisante pour effectuer une mesure photométrique précise. Pour le dosage du gossypol libre dans les graines, les farines et les tourteaux de coton, la prise d'essai ne doit pas excéder 1 g ; pour les aliments composés elle pourra atteindre 5 g. Une partie aliquote de 10 ml de filtrat convient dans la plupart des cas ; elle devra contenir de 50 à 100 ¶g de gossypol. Pour le dosage du gossypol total, la prise d'essai pourra varier de 0,5 à 5 g afin qu'une partie aliquote de 2 ml de filtrat contienne de 40 à 200 ¶g de gossypol.  L'analyse doit être effectuée à une température ambiante proche de 20 ºC.   5.2 Dosage du gossypol libre  Introduire la prise d'essai dans un ballon à col rodé de 250 ml, dont le fond est recouvert de verre pilé. Ajouter à la pipette 50 ml de solvant A (3.2), boucher le ballon et mélanger durant 1 h dans le culbuteur. Filtrer sur filtre sec et recueillir le filtrat dans un petit ballon à col rodé. Au cours de la filtration, recouvrir l'entonnoir d'un verre de montre. Introduire à la pipette respectivement dans deux ballons jaugés de 25 ml (A et B) des parties aliquotes identiques de filtrat contenant de 50 à 100 ¶g de gossypol. Compléter éventuellement le volume à 10 ml à l'aide du solvant A (3.2). Compléter ensuite au volume le contenu du ballon (A) par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Cette solution sera utilisée comme solution de référence pour la mesure de la solution de l'échantillon.  Introduire à la pipette 10 ml du solvant A (3.2) respectivement dans deux autres ballons jaugés de 25 ml (C et D). Compléter au volume le contenu du ballon (C) par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Cette solution sera utilisée comme solution de référence pour la mesure de la solution de l'essai à blanc.  Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) respectivement dans les ballons (D) et (B). Chauffer durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante pour développer la coloration. Refroidir à la température ambiante, compléter au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer durant 1 h.   Déterminer au spectrophotomètre à 440 nm, dans des cuvettes en verre de 1 cm, la densité optique de la solution de l'essai à blanc (D) par comparaison avec la solution de référence (C) et la densité optique de la solution de l'échantillon (B) par comparaison avec la solution de référence (A).  Soustraire la densité optique de la solution de l'essai à blanc de celle de la solution de l'échantillon (= densité optique corrigée). Calculer à partir de cette valeur la teneur en gossypol libre comme indiqué en 6.   5.3 Dosage du gossypol total  Introduire une prise d'essai contenant de 1 à 5 mg de gossypol dans un ballon jaugé de 50 ml et ajouter 10 ml de solvant B (3.3). Préparer simultanément un essai à blanc, en introduisant 10 ml de solvant B (3.3), dans un autre ballon jaugé de 50 ml. Chauffer les 2 ballons durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante. Refroidir à la température ambiante et compléter le contenu de chaque ballon au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Homogénéiser et laisser déposer pendant 10 à 15 minutes, filtrer ensuite et recueillir les filtrats dans des ballons à col rodé.  Porter à la pipette 2 ml du filtrat de l'échantillon respectivement dans deux ballons jaugés de 25 ml et 2 ml du filtrat de l'essai à blanc respectivement dans deux autres ballons de 25 ml. Prélever un ballon de chaque série et compléter les contenus respectifs à 25 ml par le mélange isopropanol-hexane (3.1). Ces solutions seront utilisées comme solutions de référence.  Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) respectivement dans les deux autres ballons. Chauffer durant 30 minutes sur bain d'eau bouillante pour développer la coloration. Refroidir à la température ambiante, compléter à 25 ml par le mélange isopropanol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer durant 1 h.  Déterminer la densité optique comme indiqué en 5.2 pour le gossypol libre. Calculer à partir de cette valeur la teneur en gossypol total comme indiqué en 6.        6. Calcul des résultats  Le calcul des résultats peut se faire soit à partir de la densité optique spécifique (6.1), soit en se référant à une courbe d'étalonnage (6.2).   6.1 A partir de la densité optique spécifique >PIC FILE= "T0004349">   dans laquelle: E = densité optique corrigée, déterminée comme indiqué en 5.2,  p = prise d'essai en g,  a = partie aliquote du filtrat en ml.   6.2 A partir d'une courbe d'étalonnage   6.2.1 Gossypol libre  Préparer 2 séries de 5 ballons jaugés de 25 ml. Dans chaque série, introduire à la pipette dans les ballons des volumes respectifs de 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 et 10,0 ml de la solution étalon A de gossypol (3.5). Compléter les volumes à 10 ml à l'aide du solvant A (3.2). Compléter chaque série par un témoin constitué d'un ballon jaugé de 25 ml contenant uniquement 10 ml de solvant A (3.2).   Compléter à 25 ml le volume des ballons de la première série (y compris le témoin) par le mélange isopropanol-hexane (3.1) (série de référence).  Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) dans chaque ballon de la seconde série (y compris le témoin). Chauffer durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante pour développer la coloration. Refroidir à la température ambiante, compléter au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer durant 1 h (série étalon).  Déterminer dans les conditions indiquées en 5.2 la densité optique des solutions de la série étalon par comparaison avec les solutions correspondantes de la série de référence. Tracer graphiquement la courbe d'étalonnage en portant les densités optiques en regard des quantités de gossypol (en ¶g).   6.2.2 Gossypol total  Préparer 6 ballons jaugés de 50 ml. Introduire dans le premier ballon 10 ml de solvant B (3.3) et dans les autres respectivement 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 et 10,0 ml de la solution étalon B de gossypol (3.6). Compléter le contenu de chaque ballon à 10 ml à l'aide du solvant B (3.3). Chauffer durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante. Refroidir à la température ambiante, compléter au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1) et homogénéiser.  Introduire 2,0 ml de ces solutions respectivement dans deux séries de 6 ballons jaugés de 25 ml. Compléter à 25 ml le contenu des ballons de la première série par le mélange isopropanol-hexane (3.1) (série de référence).  Ajouter 2 ml d'aniline (3.4) dans chaque ballon de la seconde série. Chauffer durant 30 minutes sur un bain d'eau bouillante. Refroidir à la température ambiante, compléter au volume par le mélange isopropanol-hexane (3.1), homogénéiser et laisser reposer durant 1 h (série étalon).  Déterminer dans les conditions indiquées en 5.2 la densité optique des solutions de la série étalon par comparaison avec les solutions correspondantes de la série de référence. Tracer graphiquement la courbe d'étalonnage en portant les densités optiques en regard des quantités de gossypol (en ¶g).   6.3 Répétabilité  La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur un même échantillon ne doit pas dépasser:    - 15 %, en valeur relative, pour les teneurs en gossypol inférieures à 500 ppm,       - 75 ppm, en valeur absolue, pour les teneurs comprises entre 500 et 750 ppm,       - 10 %, en valeur relative, pour les teneurs supérieures à 750 ppm.             ANNEXE II  1. DÉTECTION ET IDENTIFICATION DES ANTIBIOTIQUES DU GROUPE DES TÉTRACYCLINES    1. Objet et domaine d'application  La méthode permet de déceler et d'identifier les antibiotiques du groupe des tétracyclines dans les aliments qui en contiennent au moins 0,1 ppm, les concentrats et les prémélanges.   2. Principe  L'échantillon est soumis à l'extraction par un mélange de méthanol et d'acide chlorhydrique. L'extrait est chromatographié sur papier par voie ascendante comparativement à des solutions de référence. Les antibiotiques sont décelés et identifiés par comparaison de leurs valeurs Rf avec celles des substances étalon, soit par fluorescence en lumière UV (fortes teneurs en antibiotiques), soit par bioautographie sur milieu gélosé inoculé avec B. cereus.   3. Réactifs et milieu de culture    >PIC FILE= "T9000556">   3.5 Mélange méthanol pur/acide chlorhydrique (d : 1,19) : 98/2 en volume.   3.6 Acide chlorhydrique 0,1 N.   3.7 Ammoniaque, d : 0,91.   3.8 Substances étalon : chlortétracycline, oxytétracycline, tétracycline dont l'activité est exprimée en chlorhydrate.   3.9 Microorganisme : B. cereus ATCC nº 11.778  Entretien de la souche, préparation de la suspension de spores et inoculation du milieu de culture : appliquer les prescriptions 3.1 et 3.2 de la méthode de dosage de la chlortétracycline, de l'oxytétracycline et de la tétracycline, par diffusion sur gélose, faisant l'objet de la partie 2 de la présente annexe.      3.10 Milieu de culture (1)   >PIC FILE= "T9000558">    3.11 Solution à 0,1 % (p/v) de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium et 5 % (p/v) de glucose.          4. Appareillage   4.1 Appareillage pour chromatographie ascendante sur papier (hauteur du papier : 25 cm). Papiers Schleicher et Schüll 2040 b ou 2043 b, ou équivalents.   4.2 Centrifugeuse.   4.3 Étuve à incubation, réglée à 30 ºC.   4.4 Lampe UV pour détection de la fluorescence.   4.5 Plaques de verre de 20 × 30 cm environ, permettant le montage d'une boîte plate pour la bioautographie.   5. Solutions étalon   5.1 Solutions-mère  Préparer, à partir des substances étalon (3.8) et à l'aide d'acide chlorhydrique (3.6), des solutions dont la concentration correspond respectivement à 500 ¶g de chlortétracycline-HCl, d'oxytétracycline-HCl et de tétracycline-HCl par ml.   5.2 Solutions de référence pour la détection en lumière UV  Diluer les solutions (5.1) par le tampon phosphate (3.2) pour obtenir des solutions dont la concentration correspond à 100 ¶g de chlortétracycline-HCl, d'oxytétracycline-HCl et de tétracycline-HCl par ml.   5.3 Solutions de référence pour la détection par bioautographie  Diluer les solutions (5.1) par le tampon phosphate (3.2) pour obtenir des solutions dont la concentration correspond à 5 ¶g de chlortétracycline-HCl, d'oxytétracycline-HCl et de tétracycline-HCl par ml.   6. Extraction  Lorsque la teneur présumée en antibiotique est inférieure à 10 ppm, on peut utiliser soit l'échantillon homogénéisé, soit la fraction la plus fine séparée par tamisage, étant donné que les antibiotiques se trouvent de préférence dans cette fraction.  Mettre l'échantillon en suspension dans le mélange (3.5) et centrifuger. Recueillir le liquide surnageant pour l'utiliser tel quel ou le diluer, si nécessaire, par le mélange (3.5) pour obtenir des concentrations en antibiotique de 100 ¶g (6.1) et 5 ¶g (6.2) environ par ml.   7. Détection et identification   7.1 Chromatographie  Plonger le papier dans la solution tampon, pH 3,5 (3.1). Éliminer l'excès de liquide en comprimant le papier entre des feuilles de papier filtre sec. Déposer ensuite sur le papier des  (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé  volumes de 0,01 ml des solutions de référence (5.2 et 5.3) et de l'extrait (6.1 et 6.2). Pour obtenir une bonne séparation, la teneur appropriée en humidité du papier est déterminante ; le cas échéant, laisser sécher légèrement.  Développer par chromatographie ascendante. Utiliser l'éluant I (3.3) pour la détection par bioautographie, l'éluant II (3.4) pour la détection en lumière UV. Lorsque le front de solvant atteint 15 à 20 cm de haut (environ 1 h 30), interrompre la chromatographie et sécher le papier.   7.2 Détection en lumière UV  Lorsque la teneur en antibiotique est supérieure à 1 ¶g/cm2, on perçoit des taches fluorescentes jaune or par irradiation sous la lampe UV (4.4) après traitement du chromatogramme par des vapeurs ammoniacales (3.7).   7.3 Détection par bioautographie  Verser le milieu de culture (3.10), préalablement inoculé par B. cereus (3.9), sur des plaques de verre (4.5) et poser le papier sur le milieu de culture. Après 5 minutes de contact, détacher le papier et poser celui-ci sur un autre endroit du milieu de culture, où il sera maintenu durant la période d'incubation. Incuber ensuite durant une nuit à l'étuve à 30 ºC. La présence d'un antibiotique du groupe des tétracyclines se marque par des zones d'inhibition claires dans le milieu de culture trouble.  Pour fixer le chromatogramme, on vaporise la solution (3.11) sur le papier, après incubation.   7.4 Identification  Les valeurs Rf relatives des antibiotiques du groupe des tétracyclines sont données ci-après. Ces valeurs peuvent varier légèrement selon la qualité du papier et sa teneur en humidité.   >PIC FILE= "T9000559">   Les composés «épi» ont une activité antibiotique inférieure à celle des composés normaux.   2. DOSAGE DE LA CHLORTÉTRACYCLINE, DE L'OXYTÉTRACYCLINE ET DE LA TÉTRACYCLINE   A. PAR DIFFUSION SUR GÉLOSE       1. Objet et domaine d'application  La méthode permet de doser la chlortétracycline (CTC), l'oxytétracycline (OTC) et la tétracycline (TC) dans les aliments, les concentrats et les prélémanges. La limite inférieure du dosage est de 5 ppm. Les teneurs inférieures à 5 ppm peuvent être estimées par interpolation graphique.           2. Principe  Pour les teneurs égales ou inférieures à 50 ppm, l'échantillon est soumis à l'extraction par la formamide diluée. Pour les teneurs supérieures à 50 ppm, il est soumis à l'extraction par un mélange d'acétone, d'eau et d'acide chlorhydrique pour le dosage de la CTC et par un mélange de méthanol et d'acide chlorhydrique pour le dosage de l'OTC et de la TC.  Les extraits sont ensuite dilués et leur activité antibiotique est déterminée par la mesure de la diffusion de la CTC, de l'OTC ou de la TC dans un milieu gélosé ensemencé avec B. cereus. La diffusion est indiquée par la formation de zones d'inhibition en présence du microorganisme. Le diamètre de ces zones est directement proportionnel au logarithme de la concentration de l'antibiotique.    3. Microorganisme : B. cereus ATCC nº 11.778   3.1 Entretien de la souche  Inoculer B. cereus sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de culture (4.1), exempt de bleu de méthylène et d'acide borique. Incuber durant une nuit à 30 ºC environ. Conserver la culture en réfrigérateur et repiquer tous les 14 jours sur gélose inclinée.   3.2 Préparation de la suspension de spores  Récolter les germes d'un tube de gélose inclinée (3.1) à l'aide de 2 à 3 ml de sérum physiologique (4.5). Ensemencer avec cette suspension un flacon de Roux contenant 300 ml du milieu de culture (4.1), exempt de bleu de méthylène et d'acide borique, dont la concentration en gélose est de 3 à 4 %. Incuber 3 à 5 jours à 28-30 ºC, récolter ensuite les spores dans 15 ml d'éthanol (4.6), après avoir vérifié la sporulation sous le microscope, et homogénéiser. Cette suspension peut être conservée en réfrigérateur durant 5 mois au moins.  Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu de base du dosage (4.1), déterminer la quantité d'inoculum permettant d'obtenir pour les différentes concentrations d'antibiotique utilisées, des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient encore nettes. Cette quantité est généralement de 0,2 à 0,3 ml/1000 ml. L'inoculation du milieu de culture se fait entre 50 et 60 ºC.        4. Milieux de culture et réactifs   4.1 Milieu de base du dosage (1)   >PIC FILE= "T9000560">    4.5 Sérum physiologique stérile   4.6 Éthanol à 20 % (v/v)   4.7 Acide chlorhydrique 0,1 N  (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé.    4.8 Formamide à 70 % (v/v) : préparer fraîchement avant l'emploi et ajuster le pH 4,5 à l'aide d'acide sulfurique 2 N environ.   4.9 Mélange acétone pur/eau/acide chlorhydrique (d : 1,19) : 65/33/2 en volume.   4.10 Mélange méthanol pur/acide chlorhydrique (d : 1,19) : 98/2 en volume.   4.11 Substances étalon : CTC, OTC, TC dont l'activité est exprimée en chlorhydrate.        5. Solutions étalon   5.1 Chlortétracycline  Préparer, à partir de la substance étalon (4.11) et à l'aide d'acide chlorhydrique (4.7), une solution-mère dont la concentration correspond à 500 ¶g de chlortétracycline-HCl par ml Cette solution se conserve une semaine en réfrigérateur.  A partir de cette solution-mère, préparer une solution étalon de travail S8 dont la concentration correspond à 0,2 ¶g de chlortétracycline-HCl par ml. La dilution est faite à l'aide du tampon phosphate, pH 5,5 dilué à 1/10 (4.3), additionné de 0,01 % de noir amido (1).  Préparer ensuite par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du tampon (4.3), les concentrations suivantes:  S4 0,1 ¶g/ml  S2 0,05 ¶g/ml  S1 0,025 ¶g/ml   5.2 Oxytétracycline  En procédant comme indiqué en 5.1, préparer, à partir d'une solution-mère dont la concentration correspond à 400 ¶g d'oxytétracycline-HCl par ml, une solution étalon de travail S8 à 1,6 ¶g d'oxytétracycline-HCl par ml et les concentrations suivantes:  S4 0,8 ¶g/ml  S2 0,4 ¶g/ml  S1 0,2 ¶g/ml   5.2 Tétracycline  En procédant comme indiqué en 5.1, préparer, à partir d'une solution-mère dont la concentration correspond à 500 ¶g de tétracycline-HCl par ml, une solution étalon de travail S8 à 1,0 ¶g de tétracycline-HCl par ml et les concentrations suivantes:  S4 0,5 ¶g/ml  S2 0,25 ¶g/ml  S1 0,125 ¶g/ml        6. Extraction   6.1 Teneurs égales ou inférieures à 50 ppm  Traiter la prise d'essai par la formamide (4.8), selon les indications données dans le tableau ci-dessous. Agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Diluer immédiatement après à l'aide du tampon phosphate (4.3), selon les indications données dans le tableau ci-dessous, pour obtenir la concentration U8. La concentration en formamide de cette solution ne doit pas dépasser 40 %. Centrifuger ou laisser décanter de manière à obtenir une solution limpide.  Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du tampon phosphate (4.3).  (1)Le noir amido sert à caractériser les zones d'inhibition des solutions étalon (anneaux bleus).   >PIC FILE= "T0004350">    6.2 Teneurs supérieures à 50 ppm   6.2.1 Chlortétracycline  Traiter, selon la teneur présumée en antibiotique de l'échantillon ou sa garantie de fabrication, une prise d'essai de 2 à 10 g par 20 fois son volume de mélange (4.9). Agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Vérifier que le pH reste inférieur à 3 au cours de l'extraction ; si nécessaire, ajuster à pH 3 (pour les composés minéraux, à l'aide d'acide acétique à 10 %). Prélever une partie aliquote de l'extrait et ajuster le pH à 5,5 à l'aide du tampon phosphate, pH 8 (4.4) en présence de vert de bromocrésol (virage du jaune au bleu). Diluer à l'aide du tampon phosphate, pH 5,5 dilué à 1/10 (4.3) pour obtenir la concentration U8 (v.6.1).  Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du tampon phosphate (4.3).   6.2.2 Oxytétracycline et tétracycline  Procéder comme indiqué en 6.2.1 en remplaçant le mélange (4.9) par le mélange (4.10).        7. Modalités du dosage   7.1 Inoculation du milieu de culture  Inoculer à 50-60 ºC le milieu de base du dosage (4.1) par la suspension de spores (3.2).   7.2 Préparation des boîtes  La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les 4 concentrations de la solution étalon (S8, S4, S2, S1) et les 4 concentrations de l'extrait (U8, U4, U2, U1). Chaque boîte doit recevoir nécessairement les 4 concentrations de l'étalon et de l'extrait.  A cet effet, choisir les dimensions des boîtes de telle sorte qu'on puisse pratiquer dans le milieu gélosé au moins 8 cavités de 10 à 13 mm de diamètre. Calculer la quantité de milieu de culture inoculé (7.1) à utiliser de façon à obtenir un recouvrement uniforme de 2 mm environ d'épaisseur. Il est préférable d'utiliser comme boîtes des plaques de verre planes munies d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique parfaitement plan de 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur.  Introduire à la pipette dans les cavités des quantités exactement mesurées de solution d'antibiotique comprises entre 0,10 et 0,15 ml, selon le diamètre.  Pour chaque échantillon, faire au moins 4 répétitions de diffusion avec chaque concentration, de sorte que chaque dosage fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibition.    7.3 Incubation  Incuber les boîtes durant 18 h environ à 28-30 ºC.   6. Évaluation  Mesurer le diamètre des zones d'inhibition, de préférence par projection. Inscrire les mesures sur papier semi-logarithmique, en portant le logarithme des concentrations en regard des diamètres des zones d'inhibition. Tracer les droites de la solution étalon et de l'extrait. En l'absence d'interférences, les deux droites doivent être parallèles.  Le logarithme de l'activité relative est calculé par la formule suivante: >PIC FILE= "T0004351">   Activité réelle = activité présumée × activité relative.   9. Répétabilité  La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 %, en valeur relative.   B. PAR TURBIDIMÉTRIE      1. Objet et domaine d'application  La méthode permet de doser la chlortétracycline (CTC), l'oxytétracycline (OTC) et la tétracycline (TC) aux concentrations supérieures à 1 g/kg, dans la mesure où aucune autre substance n'interfère en donnant lieu à des extraits troubles. Cette méthode est plus rapide que la méthode par diffusion sur gélose.       2. Principe  L'échantillon est soumis à l'extraction par un mélange d'acétone, d'eau et d'acide chlorhydrique pour le dosage de la CTC et par un mélange de méthanol et d'acide chlorhydrique pour le dosage de l'OTC et de la TC.  Les extraits sont ensuite dilués et leur effet antibiotique est déterminé par la mesure de la transmission lumineuse d'un milieu de culture ensemencé avec Staphylococcus aureus et additionné de l'antibiotique. La transmission lumineuse est fonction de la concentration de l'antibiotique.       3. Microorganisme : Staphylococcus aureus K 141 (1)   3.1 Entretien de la souche  Inoculer S. aureus sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de culture (4.1), additionné de 1,5 à 3 % de gélose (selon la qualité). Incuber durant une nuit à 37 ºC. Conserver la culture en réfrigérateur et repiquer toutes les 4 semaines sur gélose inclinée. Préparer simultanément des sous-cultures pour l'usage de laboratoire.   3.2 Préparation de l'inoculum  24 h avant son utilisation, repiquer une sous-culture sur gélose inclinée et incuber durant une nuit à 37 ºC. Mettre en suspension la totalité de la culture d'un tube de gélose dans 2 ml environ du milieu de base (4.1) et transvaser ensuite la suspension dans des conditions stériles dans 100 ml environ du même milieu de base (4.1). Incuber au bain d'eau à 37 ºC, jusqu'à ce que la croissance de la souche entre dans sa phase logarithmique (1 h 30 à 2 h).  (1)Cette souche, isolée par la LUFA à Kiel, accuse une croissance plus rapide que S. aureus ATCC 6538 P.       4. Milieux de culture et réactifs   4.1 Milieu de base du dosage (1)   >PIC FILE= "T9000561">    4.3 Acide chlorhydrique 0,1 N   4.4 Mélange acétone pur/eau/acide chlorhydrique (d : 1,19) : 65/33/2 en volume.   4.5 Mélange méthanol pur/acide chlorhydrique (d : 1,19) : 98/2 en volume.   4.6 Solution à 10 % environ (p/v) de formaldéhyde.   4.7 Substances étalon : OTC, OTC, TC dont l'activité est exprimée en chlorhydrate.      5. Solution étalon  Préparer, à partir de la substance étalon (4.7) et à l'aide d'acide chlorhydrique (4.3) une solution-mère dont la concentration correspond à 400 à 500 ¶g de CTC-HCl, OTC-HCl ou TC-HCl par ml. Cette solution se conserve une semaine en réfrigérateur.       6. Extraction   6.1 Chlortétracycline  Introduire dans un ballon jaugé de 200 ou 250 ml une prise d'essai de 1 à 2 g. Ajouter 100 ml environ du mélange (4.4) et agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Compléter au volume par le tampon phosphate, pH 4,5 (4.2). Homogénéiser et laisser déposer.   6.2 Oxytétracycline et tétracycline  Introduire dans un ballon jaugé de 200 ou 250 ml une prise d'essai de 1 à 2 g. Ajouter 100 ml environ du mélange (4.5) et agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Compléter au volume par le tampon phosphate, pH 4,5 (4.2). Homogénéiser et laisser déposer.      7. Modalités du dosage   7.1 Préparation de séries étalon et de l'extrait  Diluer de façon appropriée à l'aide du tampon phosphate, pH 4,5 (4.2) la solution étalon (5) et l'extrait (6) de manière à obtenir une série de concentrations qui permette d'établir, pour chaque dosage, une courbe d'étalonnage et l'interpolation sur cette courbe d'au moins deux valeurs relatives à l'extrait. Les dilutions doivent être choisies en fonction des conditions de croissance de la souche, qui peuvent varier d'un laboratoire à l'autre. On procède généralement comme suit:  (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé.    7.1.1 Chlortétracycline  Diluer la solution étalon (5) à l'aide du tampon phosphate (4.2) pour obtenir une solution étalon de travail dont la concentration corresponde à 0,2 ¶g de CTC-HCl par ml. Préparer ensuite à l'aide du tampon phosphate (4.2), comme indiqué ci-après et dans des tubes destinés au dosage, 6 dilutions avec une répétition de chaque dilution. >PIC FILE= "T0004352">   Diluer l'extrait (6.1) à l'aide du tampon phosphate (4.2) pour obtenir une concentration présumée en CTC-HCl de 0,12 ¶g/ml. Introduire 1 ml de cette solution dans 2 tubes et 0,75 ml (= 0,09 ¶g) dans 2 autres tubes. Compléter le volume des 2 derniers tubes à 1 ml par le tampon phosphate (4.2).   7.1.2 Oxytétracycline et tétracycline  Diluer la solution étalon (5) à l'aide du tampon phosphate (4.2) pour obtenir une solution étalon de travail dont la concentration corresponde à 0,6 ¶g d'OTC-HCl ou de TC-HCl par ml. Préparer ensuite à l'aide du tampon phosphate (4.2) comme indiqué ci-après et dans des tubes destinés au dosage, 7 dilutions avec une répétition de chaque dilution. >PIC FILE= "T0004353">   Diluer l'extrait (6.2) par le tampon phosphate (4.2) pour obtenir une concentration présumée en OTC-HCl ou TC-HCL de 0,48 ¶g/ml. Introduire 1 ml de cette solution dans 2 tubes et 0,5 ml (= 0,24 ¶g) dans 2 autres tubes. Compléter le volume des 2 derniers tubes à 1 ml par le tampon phosphate (4.2).   7.2 Inoculation du milieu de culture  Inoculer le milieu de base du dosage (4.1) par l'inoculum (3.2) de manière à obtenir au photomètre à 590 nm une transmission lumineuse de 85 % dans une cuvette de 5 cm ou de 92 % dans une cuvette de 2 cm, l'appareil étant réglé à 100 % de transmission sur le milieu de base (4.1) non inoculé.   7.3 Ensemencement  Introduire dans chaque tube (7.1.1 ou 7.1.2) 9 ml du milieu de culture inoculé (7.2). Le remplissage des tubes doit se faire proprement, mais pas nécessairement dans des conditions stériles.   7.4 Incubation  L'incubation doit se faire obligatoirement dans un bain d'eau dont la température est maintenue homogène à 37 ºC ± 0,1 ºC par agitation. Le temps d'incubation doit être choisi de manière à pouvoir tracer des courbes de transmission dont la pente est appropriée à des mesures précises (généralement 2 h 30 à 3 h). Bloquer ensuite la croissance en injectant rapidement 1 ml de solution de formaldéhyde (4.6) dans chaque tube.    7.5 Mesure de la croissance  Mesurer les transmissions au photomètre à 590 nm, en réglant l'appareil à 100 % de transmission sur la solution étalon la plus limpide (correspondant à la teneur la plus élevée en antibiotique). En raison des faibles différences de turbidité présentées par les différents tubes, il est recommandé d'utiliser des cuvettes de 2 cm au moins et, de préférence, de 5 cm.      8. Calcul des résultats  Tracer graphiquement la courbe d'étalonnage sur papier millimétré en portant les transmissions photométriques en regard des concentrations en antibiotique. Interpoler sur la courbe les transmissions relatives à l'extrait. Calculer la teneur en antibiotique de l'échantillon.       9. Répétabilité  La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 %, en valeur relative.    3. DOSAGE DE L'OLÉANDOMYCINE - par diffusion sur gélose -        1. Objet et domaine d'application  La méthode permet de doser l'oléandomycine dans les aliments, les concentrats et les prémélanges, même en présence de tétracyclines. La limite inférieure du dosage est de 0,5 ppm.           2. Principe  L'échantillon est soumis à l'extraction par une solution méthanolique diluée de tris (hydroxyméthyl) aminométhane. Après centrifugation, l'extrait est dilué et son activité antibiotique est déterminée par la mesure de la diffusion de l'oléandomycine dans un milieu gélosé ensemencé avec B. cereus. La diffusion est indiquée par la formation de zones d'inhibition en présence du microorganisme. Le diamètre de ces zones est directement proportionnel au logarithme de la concentration de l'antibiotique.           3. Microorganisme : B. cereus K 250 TR (1) (résistant aux tétracyclines)   3.1 Entretien de la souche  Inoculer B. cereus sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de culture (4.1) et additionnée de 100 ¶g d'oxytétracycline par 5 ml. Incuber durant une nuit à 30 ºC environ. Conserver la culture en réfrigérateur et repiquer toutes les 4 semaines sur gélose inclinée.   3.2 Préparation de la suspension de spores  Récolter les germes d'un tube de gélose inclinée (3.1) à l'aide de 3 ml environ du sérum physiologique (4.3). Ensemencer avec cette suspension un flacon de Roux contenant 300 ml du milieu de culture (4.1) dont la concentration en gélose est de 3 à 4 %. Incuber 3 à 5 jours à 28-30 ºC, récolter ensuite les spores dans 15 ml d'éthanol (4.4), après avoir vérifié la sporulation sous le microscope, et homogénéiser. Cette suspension peut être conservée en réfrigérateur durant 5 mois au moins.  Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu de base du dosage (4.2), déterminer la quantité d'inoculum permettant d'obtenir pour les différentes concentrations d'oléandomycine utilisées, des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient encore nettes. Cette quantité est généralement de 0,1 à 0,2 ml/1000 ml. L'inoculation du milieu de culture se fait à 60 ºC.  (1)Souche isolée par la LUFA à Kiel.         4. Milieux de culture et réactifs   4.1 Milieu d'entretien de la souche (1)   >PIC FILE= "T9000562">    4.2 Milieu de base du dosage (1)  Milieu (4.1) ajusté à pH 8,8   4.3 Sérum physiologique stérile   4.4 Éthanol à 20 % (v/v)   4.5 Méthanol, pur   4.6 Solution à 0,5 % (p/v) de tris (hydroxyméthyl) amino-méthane p.a.   4.7 Solution d'extraction   >PIC FILE= "T9000563">    4.8 Substance étalon : oléandomycine d'activité connue.        5. Solution étalon  Dissoudre de la substance étalon (4.8) dans 5 ml de méthanol (4.5) et diluer par la solution (4.6) pour obtenir une concentration en oléandomycine de 100 ¶g/ml.  A partir de cette solution-mère, préparer en diluant par la solution (4.6) une solution étalon de travail S8 contenant 0,1 ¶g d'oléandomycine par ml. Préparer ensuite par dilutions successives (1 + 1) à l'aide de la solution (4.6) les concentrations suivantes:  S4 0,05 ¶g/ml  S2 0,025 ¶g/ml  S1 0,0125 ¶g/ml           6. Extraction  Prélever, selon la teneur présumée en oléandomycine de l'échantillon, une prise d'essai de 2 à 10 g, ajouter 100 ml de la solution (4.7) et agiter durant 30 minutes sur table à secousses.  Centrifuger, prélever une partie aliquote de l'extrait et diluer par la solution (4.6) pour obtenir une concentration présumée en oléandomycine de 0,1 ¶g/ml (= U8). Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 par dilutions successives (1 + 1) à l'aide de la solution (4.6).  (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé.            7. Modalités du dosage   7.1 Inoculation du milieu de culture  Inoculer à 60 ºC le milieu de base du dosage (4.2) par la suspension de spores (3.2).   7.2 Préparation des boîtes  La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les 4 concentrations de la solution étalon (S8, S4, S2, S1) et les 4 concentrations de l'extrait (U8, U4, U2, U1. Chaque boîte doit recevoir nécessairement les 4 concentrations de l'étalon et de l'extrait.  A cet effet, choisir les dimensions des boîtes de telle sorte qu'on puisse pratiquer dans le milieu gélosé au moins 8 cavités de 10 à 13 mm de diamètre. Calculer la quantité du milieu de culture inoculé (7.1) à utiliser de façon à obtenir un recouvrement uniforme de 2 mm environ d'épaisseur. Il est préférable d'utiliser comme boîtes des plaques de verre planes munies d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique parfaitement plan de 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur.  Introduire à la pipette dans les cavités des quantités exactement mesurées de solution d'antibiotique comprises entre 0,10 et 0,15 ml, selon le diamètre.  Pour chaque échantillon, faire au moins 4 répétitions de diffusion avec chaque concentration, de sorte que chaque dosage fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibition.   7.3 Incubation  Incuber les boîtes durant 18 h environ à 28-30 ºC.        8. Évaluation  Mesurer le diamètre des zones d'inhibition, de préférence, par projection. Inscrire les mesures sur papier semi-logarithmique, en portant le logarithme des concentrations en regard des diamètres des zones d'inhibition. Tracer les droites de la solution étalon et de l'extrait. En l'absence d'interférences, les deux droites doivent être parallèles.  Le logarithme de l'activité relative est calculé par la formule suivante: >PIC FILE= "T0004354">   Activité réelle = activité présumée × activité relative.           9. Répétabilité La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 % m, en valeur relative.    4. DOSAGE DE LA TYLOSINE - par diffusion sur gélose -        1. Objet et domaine d'application  La méthode permet de doser la tylosine dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 2 ppm.           2. Principe  L'échantillon est traité par une solution tampon phosphate à pH 8, préalablement portée à 80 ºC, et soumis ensuite à l'extraction par le méthanol. Après centrifugation, l'extrait est dilué et son activité antibiotique est déterminée par la mesure de la diffusion de la tylosine dans un milieu gélosé ensemencé avec Sarcina lutea. La diffusion est indiquée par la formation de zones d'inhibition en présence du microorganisme. Le diamètre de ces zones est directement proportionnel au logarithme de la concentration de l'antibiotique.            3. Microorganisme : Sarcina lutea ATCC nº 9341   3.1 Entretien de la souche  Inoculer Sarcina lutea sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de culture (4.1), ajusté à pH 7,0. Incuber durant une nuit à 35 ºC environ. Conserver la culture en réfrigérateur et repiquer tous les mois sur gélose inclinée.   3.2 Préparation de la suspension de germes  Récolter les germes d'un tube de gélose inclinée (3.1) de préparation récente, par 2 à 3 ml de sérum physiologique (4.4). Ensemencer avec cette suspension un flacon de Roux contenant 250 ml du milieu de culture (4.1), ajusté à pH 7,0. Incuber durant 24 h à 35 ºC, récolter les germes à l'aide de 25 ml de sérum physiologique (4.4). Homogénéiser et diluer cette suspension pour obtenir une transmission lumineuse de 75 % environ à 650 nm.  Conservée en réfrigérateur, cette suspension est utilisable durant une semaine.  Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu de base du dosage (4.1), déterminer la quantité d'inocolum permettant d'obtenir pour les différentes concentrations de tylosine utilisée des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient encore nettes. L'inoculation du milieu de culture se fait à 48-50 ºC.        4. Milieux de culture et réactifs   4.1 Milieu de base du dosage (1)   >PIC FILE= "T9000564">    4.4 Sérum physiologique stérile   4.5 Méthanol, pur   4.6 Méthanol à 10 % (v/v)   4.7 Mélange tampon phosphate (4.2)/méthanol pur : 60/40 en volume.   4.8 Substance étalon : tylosine connue.  (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats pour être utilisé.         5. Solutions étalon  Sécher la substance étalon (4.8) durant 3 h à 60 ºC dans une étuve à vide (5 mm de mercure). Peser 10 à 50 mg dans un ballon jaugé, les dissoudre dans 5 ml de méthanol (4.5) et diluer la solution par le tampon phosphate, pH 7 (4.3) pour obtenir une concentration en tylosine-base de 1000 ¶g/ml.  A partir de cette solution-mère, préparer en diluant par le mélange (4.7) une solution étalon de travail S8 contenant 2 ¶g de tylosine-base par ml.  Préparer ensuite par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du mélange (4.7), les concentrations suivantes:  S4 1 ¶g/ml  S2 0,5 ¶g/ml  S1 0,25 ¶g/ml           6. Extraction  Prélever pour les concentrats une prise d'essai de 10 g ; pour les prémélanges et les aliments une prise d'essai de 20 g. Ajouter 60 ml de tampon phosphate, pH 8 (4.2), préalablement portés à 80 ºC, et homogénéiser durant 2 minutes (appareil ménager, Ultra-turrax, etc.).  Laisser ensuite reposer 10 minutes, ajouter 40 ml de méthanol (4.5) et homogénéiser durant 5 minutes. Centrifuger, prélever une partie aliquote de l'extrait et diluer par le mélange (4.7) pour obtenir une concentration présumée en tylosine de 2 ¶g/ml (= U8). Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du mélange (4.7).  Pour les teneurs inférieures à 10 ppm, évaporer l'extrait à sec dans un évaporateur rotatif à 35 ºC et reprendre le résidu par du méthanol à 40 % (4.6).           7. Modalités du dosage   7.1 Inoculation du milieu de culture  Inoculer à 48-50 ºC le milieu de base du dosage (4.1), ajusté à pH 8,0, par la suspension de germes (3.2).   7.2 Préparation des boîtes  La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les 4 concentrations de la solution étalon (S8, S4, S2, S1) et les 4 concentrations de l'extrait (U8, U4, U2, U1). Chaque boîte doit recevoir nécessairement les 4 concentrations de l'étalon et de l'extrait.  A cet effet, choisir les dimensions des boîtes de telle sorte qu'on puisse pratiquer dans le milieu gélosé au moins 8 cavités de 10 à 13 mm de diamètre. Calculer la quantité du milieu de culture inoculé (7.1) à utiliser de façon à obtenir un recouvrement uniforme de 2 mm environ d'épaisseur. Il est préférable d'utiliser comme boîtes des plaques de verre planes munies d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique parfaitement plan de 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur.  Introduire à la pipette dans les cavités des quantités exactement mesurées de solution d'antibiotique comprise entre 0,10 et 0,15 ml, selon le diamètre.  Pour chaque échantillon, faire au moins 4 répétitions de diffusion avec chaque concentration, de sorte que chaque dosage fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibition.   7.3 Incubation  Incuber les boîtes durant une nuit à 35-37 ºC.        8. Évaluation  Mesurer le diamètre des zones d'inhibition, de préférence, par projection. Inscrire les mesures sur papier semi-logarithmique, en portant le logarithme des concentrations en regard des diamètres de zones d'inhibition. Tracer les droites de la solution étalon et de l'extrait. En l'absence d'interférences, les deux droites doivent être parallèles.  Le logarithme de l'activité relative est calculé par la formule suivante: >PIC FILE= "T0004355">   Activité réelle = activité présumée × activité relative.            9. Répétabilité  La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 %, en valeur relative.    5. DOSAGE DE LA VIRGINIAMYCINE - par diffusion sur gélose -        1. Objet et domaine d'application  La méthode permet de doser la virginiamycine dans les aliments, les concentrats et les prémélanges. La limite inférieure du dosage est de 2 ppm.           2. Principe L'échantillon est soumis à l'extraction par une solution méthanolique de Tween 80. Après centrifugation ou filtration, l'extrait est dilué et son activité antibiotique est déterminée par la mesure de la diffusion de la virginiamycine dans un milieu gélosé ensemencé avec Sarcina lutea La diffusion est indiquée par la formation de zones d'inhibition en présence du microorganisme. Le diamètre de ces zones est directement proportionnel au logarithme de la contration de l'antibiotique.           3. Microorganisme : Sarcina lutea ATCC nº 9341   3.1 Entreprise de la souche  Inoculer S. lutea sur gélose inclinée en tube constituée par le milieu de culture (4.1). Incuber durant une nuit à 35 ºC environ. Conserver la culture en réfrigérateur et repiquer tous les 14 jours sur gélose inclinée.   3.2 Préparation de la suspension de germes  Récolter les germes d'un tube de gélose inclinée (3.1), de préparation récente, par 2 à 3 ml de sérum physiologique (4.3). Ensemencer avec cette suspension un flacon de Roux contenant 250 ml du milieu de culture (4.1). Incuber durant 24 h à 35 ºC, récolter les germes à l'aide de 25 ml de sérum physiologique (4.3). Homogénéiser et diluer cette suspension pour obtenir une transmission lumineuse de 75 % environ à 650 nm. Conservée en réfrigérateur, cette suspension est utilisable durant une semaine.  Par des essais préliminaires sur plaques avec le milieu de base du dosage (4.1), déterminer la quantité d'inoculum permettant d'obtenir pour les différentes concentrations de virginiamycine utilisées des zones d'inhibition aussi étendues que possible et qui soient encore nettes. L'inoculation du milieu de culture se fait à 48-50 ºC.        4. Milieux de culture et réactifs   4.1 Milieu de base du dosage (1)   >PIC FILE= "T9000565">  (1)Tout milieu de culture commercial de composition analogue et donnant les mêmes résultats peut être utilisé.   >PIC FILE= "T9000566">    4.3 Sérum physiologique stérile   4.4 Méthanol, pur   4.5 Mélange tampon phosphate (4.2)/méthanol pur : 80/20 en volume.   4.6 Solution méthanolique à 0,5 % (p/v) de Tween 80.   4.7 Substance étalon : virginiamycine d'activité connue.        5. Solution étalon  Préparer une solution méthanolique de substance étalon (4.7) à 800 ¶g de virginiamycine par ml. A partir de cette solution-mère, préparer en diluant par le mélange (4.5) une solution étalon de travail S8 contenant 1 ¶g de virginiamycine par ml. Préparer ensuite par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du mélange (4.5), les concentrations suivantes:  S4 0,5 ¶g/ml  S2 0,25 ¶g/ml  S1 0,125 ¶g/ml           6. Extraction   6.1 Produits dont la teneur en virginiamycine est égale ou inférieure à 50 ppm  Prélever une prise d'essai de 10 à 20 g, ajouter 100 ml de la solution (4.6) et agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Centrifuger ou filtrer, prélever 20 ml de la solution limpide et les évaporer à sec dans un évaporateur rotatif. Reprendre le résidu par 20 ml ou plus du mélange (4.5) pour obtenir une concentration présumée en virginiamycine de 1 ¶g/ml (= U8). Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 par dilutions successives (1 + 1) à l'aide du mélange (4.5).   6.2 Produits dont la teneur en virginiamycine est supérieure à 50 ppm  Prélever une prise d'essai de 1 à 10 g, ajouter 100 ml de la solution (4.6) et agiter durant 30 minutes sur table à secousses. Centrifuger ou filtrer et diluer ensuite par le mélange (4.5) pour obtenir une concentration présumée en virginiamycine de 1 ¶g/ml (= U8). Préparer ensuite les concentrations U4, U2 et U1 comme indiqué en 6.1.        7. Modalités de dosage   7.1 Inoculation du milieu de culture  Inoculer à 48-50 ºC le milieu de base du dosage (4.1) par la suspension de germes (3.2).   7.2 Préparation des boîtes  La diffusion sur gélose s'effectue dans des boîtes avec les 4 concentrations de la solution étalon (S8, S4, S2, S1) et les 4 concentrations de l'extrait (U8, U4, U2, U1). Chaque boîte doit recevoir nécessairement les 4 concentrations de l'étalon et de l'extrait.  A cet effet, choisir les dimensions des boîtes de telle sorte qu'on puisse pratiquer dans le milieu gélosé au moins 8 cavités de 10 à 13 mm de diamètre. Calculer la quantité du milieu de culture inoculé (7.1) à utiliser, de façon à obtenir un recouvrement uniforme de 2 mm environ d'épaisseur. Il est préférable d'utiliser comme boîtes des plaques de verre planes munies d'un anneau d'aluminium ou de matière plastique parfaitement plan de 200 mm de diamètre et 20 mm de hauteur.   Introduire à la pipette dans les cavités des quantités exactement mesurées de solution d'antibiotique comprises entre 0,10 et 0,15 ml, selon le diamètre.  Pour chaque échantillon, faire au moins 4 répétitions de diffusion avec chaque concentration, de sorte que chaque dosage fasse l'objet d'une évaluation de 32 zones d'inhibition.   7.3 Incubation  Incuber les boîtes durant 18 h environ à 28-30 ºC.        8. Évaluation  Mesurer le diamètre des zones d'inhibition, de préférence, par projection. Inscrire les mesures sur papier semi-logarithmique, en portant le logarithme des concentrations en regard des diamètres des zones d'inhibition. Tracer les droites de la solution étalon et de l'extrait. En l'absence d'interférences, les deux droites doivent être parallèles.  Le logarithme de l'activité relative est calculé par la formule suivante: >PIC FILE= "T0004356">   Activité réelle = activité présumée × activité relative.           9. Répétabilité  La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles effectuées sur le même échantillon ne doit pas dépasser 10 %, en valeur relative.