Avis juridique important

|

31999L0063

Neuvoston direktiivi 1999/63/EY, annettu 21 päivänä kesäkuuta 1999, Euroopan yhteisön kansallisten varustamoyhdistysten keskusjärjestön (ECSA) ja Euroopan unionin kuljetusalojen ammattiliiton (FST) tekemästä, merenkulkijoiden työajan järjestämistä koskevasta sopimuksesta - Liite: Eurooppalainen sopimus merenkulkijoiden työajan järjestämisestä

Virallinen lehti nro L 167 , 02/07/1999 s. 0033 - 0037

NEUVOSTON DIREKTIIVI 1999/63/EY,annettu 21 päivänä kesäkuuta 1999,Euroopan yhteisön kansallisten varustamoyhdistysten keskusjärjestön (ECSA) ja Euroopan unionin kuljetusalojen ammattiliiton (FST) tekemästä, merenkulkijoiden työajan järjestämistä koskevasta sopimuksestaEUROOPAN UNIONIN NEUVOSTO, jokaottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen ja erityisesti sen 139 artiklan 2 kohdan,ottaa huomioon komission ehdotuksen,sekä katsoo, että(1) Euroopan yhteisön perustamissopimuksen, sellaisena kuin se on muutettuna Maastrichtin sopimuksella, liitteenä olevaan, sosiaalipolitiikasta tehtyyn pöytäkirjaan (N:o 14) liitetyn sosiaalipolitiikkaa koskevan sopimuksen määräykset on Amsterdamin sopimuksen voimaantulon seurauksena sisällytetty Euroopan yhteisön perustamissopimuksen 136-139 artiklaan,(2) työmarkkinaosapuolet voivat perustamissopimuksen 139 artiklan 2 kohdan mukaisesti pyytää yhteisesti, että yhteisön tasolla tehdyt sopimukset pannaan täytäntöön neuvoston komission ehdotuksesta tekemällä päätöksellä,(3) neuvosto on antanut 23 päivänä marraskuuta 1993 direktiivin 93/104/EY tietyistä työajan järjestämistä koskevista näkökohdista(1); meriliikenne oli yksi direktiivin soveltamisalan ulkopuolelle jätetyistä toimialoista,(4) olisi otettava huomioon asiaan liittyvät Kansainvälisen työjärjestön työajan järjestämistä koskevat yleissopimukset, mukaan lukien erityisesti ne, jotka koskevat merenkulkijoiden työaikaa,(5) komissio on sosiaalipolitiikkaa koskevan sopimuksen 3 artiklan 2 kohdan mukaisesti kuullut työmarkkinaosapuolia direktiivin 93/104/EY soveltamisalan ulkopuolisia toimialoja koskevista mahdollisista yhteisön toiminnan suuntaviivoista,(6) komissio arvioi tämän kuulemisen perusteella, että yhteisön toiminta alalla on suotavaa, ja on kuullut suunnitellun ehdotuksen sisällöstä työmarkkinaosapuolia uudelleen yhteisön tasolla sosiaalipolitiikkaa koskevan sopimuksen 3 artiklan 3 kohdan mukaisesti,(7) Euroopan yhteisön kansallisten varustamoyhdistysten keskusjärjestö (ECSA) ja Euroopan unionin kuljetusalojen ammattiliitto (FST) ovat ilmoittaneet komissiolle halustaan ryhtyä neuvotteluihin sosiaalipolitiikkaa koskevan sopimuksen 4 artiklan mukaisesti,(8) mainitut järjestöt tekivät 30 päivänä syyskuuta 1998 sopimuksen merenkulkijoiden työajasta; sopimuksessa pyydetään yhteisesti, että komissio panisi sopimuksen täytäntöön neuvoston komission ehdotuksesta tekemällä päätöksellä sosiaalipolitiikkaa koskevan sopimuksen 4 artiklan 2 kohdan mukaisesti,(9) neuvosto antoi 6 päivänä joulukuuta 1994 päätöslauselman(2) tietyistä Euroopan unionin sosiaalipolitiikan näkymistä, jotka koskevat unionin taloudellisen ja sosiaalisen lähentymisen edistämistä, jossa se kehotti työmarkkinaosapuolia hyödyntämään sopimuksentekomahdollisuuksia, koska työmarkkinaosapuolet ovat lähellä yhteiskunnallista todellisuutta ja ongelmia,(10) sopimusta sovelletaan kaikilla sekä julkisessa että yksityisessä omistuksessa olevilla, jonkin jäsenvaltion alueella rekisteröidyillä ja tavallisesti kaupallista merenkulkua harjoittavilla merialuksilla työskenteleviin merenkulkijoihin,(11) tämän sopimuksen täytäntöönpanon asianmukainen oikeudellinen väline on perustamissopimuksen 249 artiklan mukainen direktiivi; sen vuoksi se sitoo jäsenvaltioita saavutettavaan tulokseen nähden, mutta jättää kansallisten viranomaisten valittavaksi muodon ja keinot,(12) perustamissopimuksen 5 artiklassa määriteltyjen toissijaisuusperiaatteen ja suhteellisuusperiaatteen mukaisesti jäsenvaltiot eivät pysty toteuttamaan riittävällä tavalla tämän direktiivin tavoitteita, vaan ne voidaan toteuttaa paremmin yhteisön tasolla; tässä direktiivissä ei ylitetä sitä, mikä on tarpeen kyseisten tavoitteiden saavuttamiseksi,(13) tässä sopimuksessa käytettyjen käsitteiden osalta, joita ei ole siinä erityisesti määritelty, tässä direktiivissä jätetään jäsenvaltioiden tehtäväksi määritellä nämä käsitteet kansallisen lainsäädännön ja käytännön mukaisesti, kuten on tehty muissakin sosiaalipolitiikan alan direktiiveissä, joissa käytetään vastaavanlaisia käsitteitä, edellyttäen, että kyseiset määritelmät ovat sopimuksen sisällön mukaisia,(14) komissio on laatinut direktiiviehdotuksensa yhteisön tason työmarkkinaosapuolten vuoropuhelun mukauttamisesta ja edistämisestä 20 päivänä toukokuuta 1998 antamansa tiedonannon mukaisesti, ottaen huomioon allekirjoittaneiden osapuolten edustavuuden ja sopimuksen lausekkeiden lainmukaisuuden,(15) komissio on ilmoittanut asiasta Euroopan parlamentille sekä talous- ja sosiaalikomitealle sosiaalipolitiikkaa koskevan sopimuksen täytäntöönpanosta 14 päivänä joulukuuta 1993 antamansa tiedonannon mukaisesti lähettämällä niille direktiiviehdotuksen tekstin, jonka liitteenä on kyseinen sopimus, ja(16) sopimuksen täytäntöönpanolla edistetään perustamissopimuksen 136 artiklassa tarkoitettujen tavoitteiden toteuttamista,ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:1 artiklaTämän direktiivin tarkoituksena on panna täytäntöön merenkulkualan työmarkkinaosapuolia edustavien järjestöjen (ECSA ja FST) välillä 30 päivänä syyskuuta 1998 tehty, liitteenä oleva sopimus merenkulkijoiden työajan järjestämisestä.2 artiklaVähimmäisvaatimukset1. Jäsenvaltiot voivat pitää voimassa tai antaa säännöksiä, jotka ovat edullisempia kuin tässä direktiivissä säädetyt.2. Tämän direktiivin täytäntöönpano ei ole missään tapauksessa riittävä peruste työntekijöiden suojelun yleisen tason alentamiselle direktiivin soveltamisalalla. Se ei rajoita jäsenvaltioiden ja/tai työmarkkinaosapuolten oikeutta antaa muuttuvien olosuhteiden perusteella lakeihin, asetuksiin tai sopimuksiin perustuvia säännöksiä tai määräyksiä, jotka ovat erilaisia kuin ne säännökset tai määräykset, jotka ovat voimassa direktiivin antamishetkellä, edellyttäen että tässä direktiivissä säädettyjä vähimmäisvaatimuksia noudatetaan.3 artiklaSaattaminen osaksi kansallista lainsäädäntöä1. Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 30 päivänä kesäkuuta 2002 tai varmistettava, että työmarkkinaosapuolet ovat kyseiseen päivään mennessä ottaneet käyttöön tarvittavat toimenpiteet sopimusteitse, jolloin jäsenvaltioiden on toteutettava tarvittavat toimenpiteet, joiden avulla ne voivat jatkuvasti taata tässä direktiivissä säädettyjen tulosten saavuttamisen. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä.2. Jäsenvaltioiden antamissa 1 kohdan mukaisissa säännöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään.4 artiklaOsoitusTämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.Tehty Luxemburgissa 21 päivänä kesäkuuta 1999.Neuvoston puolestaL. SCHOMERUSPuheenjohtaja(1) EYVL L 307, 13.12.1993, s. 18.(2) EYVL C 368, 23.12.1994, s. 6.LIITEEUROOPPALAINEN SOPIMUSmerenkulkijoiden työajan järjestämisestäAllekirjoittajaosapuolet, jotka ottavat huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen liitteenä olevaan sosiaalipolitiikkaa koskevaan pöytäkirjaan liitetyn, sosiaalipolitiikkaa koskevan sopimuksen ja erityisesti sen 3 artiklan 4 kohdan ja 4 artiklan 2 kohdan, sekä katsovat, että sosiaalipolitiikkaa koskevan sopimuksen 4 artiklan 2 kohdassa määrätään, että yhteisön tasolla tehdyt sopimukset voidaan allekirjoittaneiden osapuolten yhteisestä pyynnöstä panna täytäntöön neuvoston komission ehdotuksesta tekemällä päätöksellä, jaallekirjoittajaosapuolet esittävät tällaisen pyynnön,OVAT SOPINEET SEURAAVAA:1 lauseke1. Sopimusta sovelletaan kaikilla sekä julkisessa että yksityisessä omistuksessa olevilla, jonkin jäsenvaltion alueella rekisteröidyillä ja tavallisesti kaupalliseen merenkulkuun käytettävillä merialuksilla työskenteleviin merenkulkijoihin. Tässä sopimuksessa aluksen, joka on kahden valtion rekisterissä, katsotaan olevan rekisteröity sen valtion alueella, jonka lipun alla se purjehtii.2. Jos on epäilystä siitä, pidetäänkö alusta merialuksena tai kaupalliseen merenkulkuun käytettävänä aluksena tämän sopimuksen merkityksessä, asiasta päättää jäsenvaltion toimivaltainen viranomainen. Asianomaisia varustamojen ja merenkulkijoiden järjestöjä olisi kuultava asiasta.2 lausekeTässä sopimuksessa tarkoitetaana) "työajalla" aikaa, jonka merenkulkijan edellytetään työskentelevän aluksen hyväksi;b) "lepoajalla" työajan ulkopuolista aikaa; lyhyet tauot eivät sisälly tähän käsitteeseen;c) "merenkulkijalla" henkilöä, joka työskentelee missä tahansa ominaisuudessa sellaisella merialuksella, johon tätä sopimusta sovelletaan;d) "varustamolla" aluksen omistajaa tai mitä tahansa muuta organisaatiota tai henkilöä, kuten hoitoyhtiötä tai ilman miehistöä rahdatun aluksen rahdinottajaa, joka varustamon puolesta on ottanut vastatakseen aluksen käytöstä ja joka näin tehdessään on sitoutunut vastaamaan kaikista tähän liittyvistä velvollisuuksista ja vastuista.3 lausekeSopimuksen 5 lausekkeessa asetetuissa rajoissa on määrättävä joko enimmäistyöajasta, joka ei saa ylittyä tiettynä ajanjaksona, tai vähimmäislepoajasta, joka on myönnettävä tiettynä ajanjaksona.4 lausekeMerenkulkijoiden tavanomainen työaika perustuu periaatteessa kahdeksan tunnin työpäivään siten, että viikossa on yksi lepopäivä ja yleiset vapaapäivät ovat lepopäiviä, tämän kuitenkaan rajoittamatta 5 lausekkeen soveltamista. Jäsenvaltioilla voi olla menettelyjä sellaisen työehtosopimuksen sallimiseksi tai rekisteröimiseksi, jossa määrätään merenkulkijoiden tavanomaisesta työajasta vähintään näitä määräyksiä vastaavin ehdoin.5 lauseke1. Työ- tai lepoaika rajataan joko seuraavasti:a) enimmäistyöaika, joka ei saa olla enemmän kuini) 14 tuntia 24 tunnin aikana eikäii) 72 tuntia seitsemän päivän aikana;tai seuraavasti:b) vähimmäislepoaika, joka ei saa olla vähemmän kuini) 10 tuntia 24 tunnin aikana eikäii) 77 tuntia seitsemän päivän aikana.2. Lepoaika voidaan jakaa enintään kahdeksi jaksoksi, joista toisen on oltava vähintään kuusi tuntia, eikä peräkkäisten lepoaikojen välinen aika saa olla enempää kuin 14 tuntia.3. Katselmukset, palo- ja pelastusveneharjoitukset sekä kansallisissa laeissa ja asetuksissa ja kansainvälisissä oikeudellisissa asiakirjoissa säädetyt harjoitukset on toteutettava siten, että lepoaikoja häiritään mahdollisimman vähän eikä aiheuteta väsymystä.4. Jos merenkulkijan on oltava valmiina toimintaan esimerkiksi silloin, kun konehuoneessa ei ole valvontaa, hänen on saatava riittävä korvaava lepoaika, jos säännönmukainen lepoaika häiriytyy työhönkutsun vuoksi.5. Edellä mainitun 3 ja 4 kohdan osalta, jos työehtosopimusta tai välitystuomioistuimen päätöstä ei ole tai jos toimivaltainen viranomainen päättää sopimuksen tai päätöksen määräysten olevan riittämättömiä, toimivaltaisen viranomaisen tehtävänä on päättää näistä määräyksistä, jotta varmistetaan asianomaisten merenkulkijoiden saavan riittävästi lepoa.6. Ottaen työntekijöiden terveyden ja turvallisuuden suojelua koskevat yleiset periaatteet huomioon jäsenvaltioilla voi olla kansallisia lakeja, asetuksia tai menettelyjä, joiden mukaisesti toimivaltainen viranomainen voi hyväksyä tai rekisteröidä työehtosopimuksia, joissa sallitaan poikkeuksia 1 ja 2 kohdan rajoituksiin. Tällaisissa poikkeuksissa on mahdollisuuksien mukaan noudatettava asetettuja normeja, mutta niissä voidaan ottaa huomioon tiheämmin toistuvat tai pidemmät vapaat jaksot tai korvaavan vapaan myöntäminen vahtia pitäville merenkulkijoille tai lyhyitä matkoja tekevillä aluksilla työskenteleville merenkulkijoille.7. Helppopääsyiseen paikkaan on kiinnitettävä aluksen työaikajärjestelyt esittävä taulukko, jossa kerrotaan jokaisesta työtehtävästä ainakin:a) meri- ja satamapalvelun työvuorojen aikataulut; jab) jäsenvaltioissa voimassa olevissa laeissa, asetuksissa tai työehtosopimuksissa edellytetty enimmäistyöaika tai vähimmäislepoaika.8. Edellä 7 kohdassa tarkoitettu taulukko on laadittava vakiomuodossa aluksen työkielellä tai kielillä sekä englanniksi.6 lausekeAlle 18-vuotiaat merenkulkijat eivät saa työskennellä yöaikaan. Tässä lausekkeessa "yöajalla" tarkoitetaan vähintään yhdeksän peräkkäisen tunnin ajanjaksoa, johon sisältyy ajanjakso keskiyöstä kello viiteen aamulla. Tätä määräystä ei tarvitse soveltaa, jos se haittaa voimassa olevien ohjelmien ja aikataulujen mukaista nuorten 16-18-vuotiaiden merenkulkijoiden käynnissä olevaa koulutusta.7 lauseke1. Aluksen päälliköllä on oikeus vaatia merenkulkijaa tekemään ne tarvittavat työtunnit, joita aluksen, aluksella olevien ihmisten tai lastin välitön turvallisuus tai muiden merihädässä olevien alusten tai ihmisten auttaminen edellyttää.2. Aluksen päällikkö voi 1 kohdan mukaisesti keskeyttää työ- tai lepoaikataulun noudattamisen ja vaatia merenkulkijaa tekemään ne työtunnit, joita tarvitaan kunnes tilanne on palautunut normaaliksi.3. Tilanteen palauduttua normaaliksi ja heti, kun se on toteutettavissa, päällikön on varmistettava, että aikataulun mukaisena lepoaikanaan työskennelleille merenkulkijoille myönnetään riittävä lepoaika.8 lauseke1. Merenkulkijoiden päivittäisistä työajoista tai heidän päivittäisistä lepoajoistaan on pidettävä kirjaa, jotta voidaan seurata 5 lausekkeessa esitettyjen määräysten noudattamista. Merenkulkijan on saatava itseensä liittyvistä tiedoista jäljennös, jonka päällikkö tai hänen valtuuttamansa henkilö sekä merenkulkija vahvistavat kirjallisesti.2. Näiden tietojen merkitsemiseksi muistiin aluksella on määrättävä menettelyt, joissa määritellään myös se, kuinka usein tiedot on merkittävä muistiin. Siitä, missä muodossa merenkulkijoiden työaikaa tai heidän lepoaikaansa koskevat tiedot merkitään, on päätettävä ottaen huomioon käytettävissä olevat kansainväliset ohjeet. Tiedot on merkittävä muistiin 5 lausekkeen 8 kohdassa määrätyllä kielellä tai siinä määrätyillä kielillä.3. Tähän sopimukseen liittyvän kansallisen lainsäädännön säännöksistä ja asiaan liittyvistä työehtosopimuksista on oltava aluksella jäljennös paikassa, jossa se on helposti miehistön saatavilla.9 lausekeEdellä 8 lausekkeessa tarkoitetut tiedot on tarkastettava ja vahvistettava sopivin väliajoin työaikoja tai lepoaikoja koskevien, tämän sopimuksen täytäntöönpanoon liittyvien määräysten noudattamisen valvomiseksi.10 lauseke1. Miehitystasoa määrättäessä, hyväksyttäessä tai tarkistettaessa on riittävän levon varmistamiseksi ja väsymyksen rajoittamiseksi vältettävä mahdollisuuksien mukaan ylimääräisiä työtunteja tai pidettävä niiden määrä mahdollisimman pienenä.2. Jos muistiin merkityistä tiedoista tai muista seikoista käy ilmi työaikoja tai lepoaikoja koskevien määräysten rikkominen, on toteutettava toimenpiteitä, joihin kuuluu tarvittaessa aluksen miehityksen tarkistaminen, jotta vältetään määräysten rikkominen tulevaisuudessa.3. Kaikilla tämän sopimuksen piiriin kuuluvilla aluksilla on oltava riittävä, turvallinen ja tehokas miehitys turvallisen miehityksen vähimmäismääräyksiä koskevan asiakirjan tai toimivaltaisen viranomaisen myöntämän vastaavan asiakirjan mukaisesti.11 lausekeAluksella ei saa työskennellä alle 16-vuotiaita henkilöitä.12 lausekeVarustamon on järjestettävä päällikölle tarvittavat voimavarat, jotta tästä sopimuksesta aiheutuvia velvoitteita voidaan noudattaa, aluksen asianmukaiseen miehitykseen liittyvät velvoitteet mukaan luettuina. Päällikön on toteutettava kaikki tarvittavat toimenpiteet sen varmistamiseksi, että tästä sopimuksesta aiheutuvia merenkulkijoiden työ- ja lepoaikoja koskevia vaatimuksia noudatetaan.13 lauseke1. Kaikilla merenkulkijoilla on oltava todistus siitä, että he pystyvät tekemään sitä työtä, jota heidän on tarkoitus merellä tehdä.Terveystarkastuksen luonteesta ja lääkärintodistukseen sisällytettävistä tiedoista on kuultava asianomaisia varustamojen ja merenkulkijoiden järjestöjä.Kaikkien merenkulkijoiden on käytävä säännöllisesti terveystarkastuksissa. Vahdinpitäjät, joilla on lääkäriltä saatu todistus yötyöstä aiheutuvista terveysongelmista, on siirrettävä mahdollisuuksien mukaan heille sopivaan päivätyöhön.2. Edellä 1 kohdassa tarkoitetun terveystarkastuksen on oltava ilmainen, ja lääkärillä on sitä koskeva vaitiolovelvollisuus. Tällaiset terveystarkastukset voidaan tehdä kansallisen terveydenhoitojärjestelmän piirissä.14 lausekeVarustamojen on toimitettava vahdinpitäjiä ja muita yöaikaan työskenteleviä henkilöitä koskevia tietoja kansallisille toimivaltaisille viranomaisille näiden pyynnöstä.15 lausekeMerenkulkijoiden terveyttä ja turvallisuutta on suojeltava heidän työnsä luonteen mukaisesti. Päivä- ja yöaikaan työskentelevien merenkulkijoiden turvallisuuden ja terveyden osalta on oltava käytettävissä yhtäläiset suojelu- ja ennaltaehkäisypalvelut tai -mahdollisuudet.16 lausekeKaikilla merenkulkijoilla on oikeus vähintään neljän viikon palkalliseen vuosilomaan tai alle vuoden mittaisten työskentelykausien osalta osaan siitä kansallisessa lainsäädännössä säädettyjen tai kansallisten käytäntöjen mukaisten vuosiloman ansaitsemista ja myöntämistä koskevien edellytysten mukaisesti.Paikallista vähimmäisvuosilomaa ei voida korvata sen sijasta annettavalla rahamäärällä, paitsi työsuhteen päättyessä.Brysselissä 30 päivänä syyskuuta 1998.Euroopan unionin kuljetusalojen ammattiliitto (FTS)Euroopan yhteisön kansallisten varustamoyhdistysten keskusjärjestö (ECSA)


title: Komission direktiivi 2011/9/EU, annettu 1 päivänä helmikuuta 2011 , neuvoston direktiivin 91/414/ETY muuttamisesta dodiinin sisällyttämiseksi siihen tehoaineena ja päätöksen 2008/934/EY muuttamisesta  ETA:n kannalta merkityksellinen teksti

text:
               2.2.2011

               FI

               Euroopan unionin virallinen lehti

               L 28/36

         KOMISSION DIREKTIIVI 2011/9/EU,
   annettu 1 päivänä helmikuuta 2011,
   neuvoston direktiivin 91/414/ETY muuttamisesta dodiinin sisällyttämiseksi siihen tehoaineena ja päätöksen 2008/934/EY muuttamisesta
   (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)
   EUROOPAN KOMISSIO, joka
   ottaa huomioon Euroopan unionin toiminnasta tehdyn sopimuksen,
   ottaa huomioon kasvinsuojeluaineiden markkinoille saattamisesta 15 päivänä heinäkuuta 1991 annetun neuvoston direktiivin 91/414/ETY (1) ja erityisesti sen 6 artiklan 1 kohdan,
   sekä katsoo seuraavaa:

               (1)

               Komission asetuksissa (EY) N:o 451/2000 (2) ja (EY) N:o 1490/2002 (3) vahvistetaan direktiivin 91/414/ETY 8 artiklan 2 kohdassa tarkoitetun työohjelman kolmannen vaiheen täytäntöönpanoa koskevat yksityiskohtaiset säännöt sekä luettelo tehoaineista niiden arviointia ja mahdollista direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I sisällyttämistä varten. Luettelossa oli mukana dodiini.

               (2)

               Ilmoittaja peruutti tekemänsä ilmoituksen tehoaineen lisäämiseksi direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I kahden kuukauden kuluessa arviointikertomusluonnoksen vastaanottamisesta asetuksen (EY) N:o 1490/2002 11 e artiklan mukaisesti. Tämän vuoksi eräiden tehoaineiden sisällyttämättä jättämisestä neuvoston direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I ja näitä tehoaineita sisältäville kasvinsuojeluaineille annettujen lupien peruuttamisesta 5 päivänä joulukuuta 2008 tehdyssä komission päätöksessä 2008/934/EY (4) säädettiin, ettei dodiinia sisällytetä liitteeseen.

               (3)

               Alkuperäinen ilmoittaja, jäljempänä ”hakija”, toimitti direktiivin 91/414/ETY 6 artiklan 2 kohdan mukaisesti uuden hakemuksen, jossa se pyysi nopeutetun menettelyn soveltamista, josta säädetään yksityiskohtaisista säännöistä neuvoston direktiivin 91/414/ETY soveltamiseksi siltä osin kuin on kyse direktiivin 8 artiklan 2 kohdassa tarkoitettuun työohjelmaan kuuluneiden mutta direktiivin liitteeseen I sisällyttämättömien tehoaineiden tavanomaisesta ja nopeutetusta arviointimenettelystä 17 päivänä tammikuuta 2008 annetun komission asetuksen (EY) N:o 33/2008 (5) 14–19 artiklassa.

               (4)

               Hakemus toimitettiin Portugalille, joka oli nimetty esitteleväksi jäsenvaltioksi asetuksella (EY) N:o 451/2000. Nopeutetun menettelyn määräaikaa noudatettiin. Tehoaineen määritelmä ja sallitut käyttötarkoitukset ovat samat kuin ne, joista oli kyse päätöksessä 2008/934/EY. Hakemus on myös asetuksen (EY) N:o 33/2008 15 artiklassa säädettyjen muiden sisältöä ja menettelyjä koskevien vaatimusten mukainen.

               (5)

               Portugali arvioi hakijan toimittamat lisätiedot ja laati lisäkertomuksen. Se toimitti kertomuksen Euroopan elintarviketurvallisuusviranomaiselle, jäljempänä ”elintarviketurvallisuusviranomainen”, ja komissiolle 14 päivänä elokuuta 2009. Elintarviketurvallisuusviranomainen toimitti lisäkertomuksen hakijalle ja muille jäsenvaltioille kommentoitavaksi ja toimitti saamansa huomautukset edelleen komissiolle. Elintarviketurvallisuusviranomainen esitti 28 päivänä toukokuuta 2010 asetuksen (EY) N:o 33/2008 20 artiklan 1 kohdan mukaisesti ja komission pyynnöstä dodiinia koskevat päätelmänsä komissiolle (6). Jäsenvaltiot ja komissio tarkastelivat arviointikertomusluonnosta, lisäkertomusta ja elintarviketurvallisuusviranomaisen päätelmiä elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevässä pysyvässä komiteassa, ja dodiinia koskeva komission tarkastelukertomus saatiin valmiiksi 23 päivänä marraskuuta 2010.

               (6)

               Eri tutkimuksista on käynyt ilmi, että dodiinia sisältävien kasvinsuojeluaineiden voidaan yleisesti olettaa täyttävän direktiivin 91/414/ETY 5 artiklan 1 kohdan a ja b alakohdassa säädetyt edellytykset erityisesti tutkittujen ja komission tarkastelukertomuksessa lueteltujen käyttötarkoitusten osalta. Näin ollen on aiheellista sisällyttää dodiini liitteeseen I sen varmistamiseksi, että tätä tehoainetta sisältäviä kasvinsuojeluaineita koskevien lupien myöntäminen voidaan järjestää kaikissa jäsenvaltioissa kyseisessä direktiivissä säädetyllä tavalla.

               (7)

               Rajoittamatta tämän päätelmän soveltamista on kuitenkin aiheellista hankkia lisätietoja tietyistä seikoista. Direktiivin 91/414/ETY 6 artiklan 1 kohdassa säädetään, että tehoaineen sisällyttämiselle liitteeseen I voidaan asettaa ehtoja. Tämän vuoksi on aiheellista edellyttää, että hakija toimittaa lisätietoja, jotta voidaan vahvistaa linnuille ja nisäkkäille aiheutuvan pitkän aikavälin riskin arviointi ja riskien arviointi luonnon pintavesistöissä, joissa tärkeitä metaboliitteja on mahdollisesti muodostunut.

               (8)

               Kohtuullinen määräaika on tarpeen ennen tehoaineen sisällyttämistä liitteeseen I, jotta jäsenvaltiot ja asianomaiset osapuolet voivat valmistautua sisällyttämisestä johtuviin uusiin vaatimuksiin.

               (9)

               Ilman, että tehoaineen sisällyttämisellä liitteeseen I rajoitettaisiin direktiivin 91/414/ETY velvoitteiden soveltamista, jäsenvaltioilla olisi sisällyttämisen jälkeen oltava kuusi kuukautta aikaa tarkistaa nykyiset dodiinia sisältävien kasvinsuojeluaineiden luvat sen varmistamiseksi, että direktiivissä 91/414/ETY ja erityisesti sen 13 artiklassa säädetyt vaatimukset ja liitteessä I vahvistetut ehdot täyttyvät. Jäsenvaltioiden olisi direktiivin 91/414/ETY säännösten mukaisesti tapauksen mukaan muutettava voimassa olevia lupia taikka korvattava tai peruutettava ne. Edellä esitetystä määräajasta poiketen olisi säädettävä pidemmästä määräajasta kutakin kasvinsuojeluainetta ja kutakin aiottua käyttötarkoitusta koskevan täydellisen, liitteen III mukaisen asiakirja-aineiston jättämistä ja arviointia varten direktiivissä 91/414/ETY säädettyjen yhtenäisten periaatteiden mukaisesti.

               (10)

               Kasvinsuojeluaineiden markkinoille saattamisesta annetun neuvoston direktiivin 91/414/ETY 8 artiklan 2 kohdassa tarkoitetun työohjelman ensimmäisen vaiheen täytäntöönpanoa koskevista yksityiskohtaisista säännöistä 11 päivänä joulukuuta 1992 annetun komission asetuksen (ETY) N:o 3600/92 (7) puitteissa arvioitujen tehoaineiden sisällyttämisestä direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I saatu kokemus on osoittanut, että tietojen saantiin liittyviä voimassa olevien lupien haltijoiden velvollisuuksia voi olla vaikea tulkita. Uusien vaikeuksien välttämiseksi näyttääkin olevan tarpeen selkeyttää jäsenvaltioiden velvollisuuksia ja erityisesti velvollisuutta tarkistaa, että luvanhaltija osoittaa, että kyseisen direktiivin liitteen II vaatimukset täyttävä asiakirja-aineisto on saatavilla. Tällä selvennyksellä ei kuitenkaan pidä asettaa jäsenvaltioille tai luvanhaltijoille uusia velvoitteita verrattuna direktiiveihin, joita on tähän mennessä annettu liitteen I muuttamiseksi.

               (11)

               Sen vuoksi on aiheellista muuttaa direktiiviä 91/414/ETY.

               (12)

               Päätöksessä 2008/934/EY säädetään dodiinin sisällyttämättä jättämisestä ja kyseistä tehoainetta sisältävien kasvinsuojeluaineiden lupien peruuttamisesta viimeistään 31 päivänä joulukuuta 2011. On tarpeen poistaa dodiinia koskeva rivi kyseisen päätöksen liitteestä.

               (13)

               Sen vuoksi olisi muutettava päätöstä 2008/934/EY.

               (14)

               Tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevän pysyvän komitean lausunnon mukaiset,

         ON HYVÄKSYNYT TÄMÄN DIREKTIIVIN:
   1 artikla
   Muutetaan direktiivin 91/414/ETY liite I tämän direktiivin liitteen mukaisesti.
   2 artikla
   Poistetaan päätöksen 2008/934/EY liitteestä dodiinia koskeva rivi.
   3 artikla
   Jäsenvaltioiden on annettava ja julkaistava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset viimeistään 30 päivänä marraskuuta 2011. Niiden on viipymättä toimitettava komissiolle kirjallisina nämä säännökset sekä kyseisiä säännöksiä ja tätä direktiiviä koskeva vastaavuustaulukko.
   Jäsenvaltioiden on sovellettava näitä säännöksiä 1 päivästä joulukuuta 2011.
   Näissä jäsenvaltioiden antamissa säädöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään.
   4 artikla
   1.   Jäsenvaltioiden on direktiivin 91/414/ETY mukaisesti tarvittaessa muutettava tai peruutettava dodiinia tehoaineena sisältävien kasvinsuojeluaineiden voimassa olevat luvat viimeistään 30 päivänä marraskuuta 2011.
   Jäsenvaltioiden on kyseiseen päivämäärään mennessä erityisesti tarkistettava, että dodiinia koskevat mainitun direktiivin liitteen I edellytykset täyttyvät, kyseistä tehoainetta koskevan tekstin B osassa mainittuja edellytyksiä lukuun ottamatta, ja että luvanhaltijalla tai luvanhaltijan saatavilla on mainitun direktiivin liitteen II vaatimukset täyttävä asiakirja-aineisto mainitun direktiivin 13 artiklan edellytysten mukaisesti.
   2.   Poiketen siitä, mitä 1 kohdassa säädetään, jäsenvaltioiden on arvioitava uudelleen kaikki sallitut kasvinsuojeluaineet, jotka sisältävät dodiinia joko ainoana tehoaineena tai yhtenä monista tehoaineista, jotka kaikki on viimeistään 31 päivänä toukokuuta 2011 sisällytetty direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I; arviointi on suoritettava direktiivin 91/414/ETY liitteessä VI säädettyjen yhtenäisten periaatteiden mukaisesti, mainitun direktiivin liitteessä III vahvistetut vaatimukset täyttävän asiakirja-aineiston perusteella ja ottaen huomioon dodiinia koskevan, mainitun direktiivin liitteessä I olevan tekstin B osa. Jäsenvaltioiden on kyseisen arvioinnin perusteella määritettävä, täyttääkö tuote direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan b, c, d ja e alakohdassa vahvistetut edellytykset.
   Määrittämisen jälkeen jäsenvaltioiden on

               a)

               niiden tuotteiden osalta, jotka sisältävät dodiinia ainoana tehoaineena, tarvittaessa muutettava lupaa tai peruutettava se viimeistään 31 päivänä toukokuuta 2015; tai

               b)

               niiden tuotteiden osalta, jotka sisältävät dodiinia yhtenä monista tehoaineista, tarvittaessa muutettava lupaa tai peruutettava se viimeistään 31 päivänä toukokuuta 2015 taikka siinä direktiivissä tai niissä direktiiveissä, joilla kyseinen aine tai aineet lisätään direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I, tällaista muuttamista tai peruuttamista varten vahvistettuna ajankohtana sen mukaan, kumpi ajankohta on myöhäisempi.

         5 artikla
   Tämä direktiivi tulee voimaan 1 päivänä kesäkuuta 2011.
   6 artikla
   Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

      Tehty Brysselissä 1 päivänä helmikuuta 2011.

            Komission puolesta

         José Manuel BARROSO

            Puheenjohtaja

      (1)  EYVL L 230, 19.8.1991, s. 1.

      (2)  EYVL L 55, 29.2.2000, s. 25.

      (3)  EYVL L 224, 21.8.2002, s. 23.

      (4)  EUVL L 333, 11.12.2008, s. 11.

      (5)  EUVL L 15, 18.1.2008, s. 5.

      (6)  European Food Safety Authority; Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance dodine. EFSA Journal 2010; 8(6):1631. [54 pp.]. doi:10.2903/j.efsa.2010.1631. Saatavilla osoitteessa www.efsa.europa.eu.

      (7)  EYVL L 366, 15.12.1992, s. 10.

      LIITE
      Lisätään direktiivin 91/414/ETY liitteessä I olevan taulukon loppuun seuraavat tiedot:

                     Nro

                     Nimi, tunnistenumero

                     IUPAC-nimi

                     Puhtaus (1)

                     Voimaantulo

                     Sisällyttämisen päättymispäivä

                     Erityissäännökset

                     ”326

                     Dodiini
                     CAS-numero: 2439-10-3

                     CIPAC-numero: 101

                     1-dodekyyliguanidinium-asetaatti

                     ≥ 950 g/kg

                     1. kesäkuuta 2011

                     31. toukokuuta 2021

                     A   OSA
                     Lupa voidaan myöntää ainoastaan sienitautien torjunta-aineena käyttöä varten.
                     B   OSA
                     Liitteessä VI vahvistettujen yhtenäisten periaatteiden täytäntöönpanemiseksi on otettava huomioon elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevässä pysyvässä komiteassa 23. marraskuuta 2010 valmiiksi saadun dodiinia koskevan tarkastelukertomuksen päätelmät ja erityisesti sen lisäykset I ja II.
                     Kokonaisarvioinnissa jäsenvaltioiden on kiinnitettävä erityistä huomiota

                                 a)

                                 linnuille ja nisäkkäille mahdollisesti aiheutuvaan pitkän aikavälin riskiin;

                                 b)

                                 vesieliöille aiheutuvaan riskiin, ja varmistettava, että käyttöedellytyksiin kuuluu riittäviä riskinhallintatoimenpiteitä;

                                 c)

                                 pellon ulkopuolella muille kuin kohdekasveille aiheutuvaan riskiin, ja varmistettava, että käyttöedellytyksiin kuuluu riittäviä riskinhallintatoimenpiteitä;

                                 d)

                                 jäämätasojen seurantaan siemenhedelmissä.

                           Asianomaisten jäsenvaltioiden on edellytettävä vahvistavien tietojen toimittamista

                                 a)

                                 linnuille ja nisäkkäille aiheutuvan pitkän aikavälin riskin arvioinnista;

                                 b)

                                 riskien arvioinnista luonnon pintavesistöissä, joissa tärkeitä metaboliitteja on mahdollisesti muodostunut.

                           Asianomaisten jäsenvaltioiden on varmistettava, että hakija toimittaa nämä vahvistavat tiedot komissiolle viimeistään 31. toukokuuta 2013.”

         (1)  Lisätietoja tehoaineen tunnistuksesta ja määritelmästä annetaan sitä koskevassa tarkastelukertomuksessa.


Avis juridique important

|

32002L0018

Komission direktiivi 2002/18/EY, annettu 22 päivänä helmikuuta 2002, kasvinsuojeluaineiden markkinoille saattamisesta annetun neuvoston direktiivin 91/414/ETY liitteen I muuttamisesta tehoaineen isoproturoni sisällyttämiseksi siihen

Virallinen lehti nro L 055 , 26/02/2002 s. 0029 - 0032

Komission direktiivi 2002/18/EY,annettu 22 päivänä helmikuuta 2002,kasvinsuojeluaineiden markkinoille saattamisesta annetun neuvoston direktiivin 91/414/ETY liitteen I muuttamisesta tehoaineen isoproturoni sisällyttämiseksi siihenEUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, jokaottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,ottaa huomioon kasvinsuojeluaineiden markkinoille saattamisesta 15 päivänä heinäkuuta 1991 annetun neuvoston direktiivin 91/414/ETY(1), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2001/103/EY(2), ja erityisesti sen 6 artiklan 1 kohdan,sekä katsoo seuraavaa:(1) Kasvinsuojeluaineiden markkinoille saattamisesta annetun neuvoston direktiivin 91/414/ETY 8 artiklan 2 kohdassa tarkoitetun työohjelman ensimmäisen vaiheen täytäntöönpanoa koskevista yksityiskohtaisista säännöistä 11 päivänä joulukuuta 1992 annetussa komission asetuksessa (ETY) N:o 3600/92(3), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 2266/2000(4), säädetään arvioitavien kasvinsuojeluaineiden tehoaineiden luettelon laatimisesta tehoaineiden sisällyttämiseksi mahdollisesti direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I. Kyseinen luettelo sisältyy kasvinsuojeluaineiden tehoaineiden luettelon vahvistamisesta ja esittelijöinä toimivien jäsenvaltioiden nimeämisestä asetuksen (ETY) N:o 3600/92 soveltamiseksi 27 päivänä huhtikuuta 1994 annettuun komission asetukseen (EY) N:o 933/94(5), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 2230/95(6), ja se sisältää isoproturonin.(2) Isoproturonin vaikutukset ihmisten terveyteen ja ympäristöön on arvioitu asetuksen (ETY) N:o 3600/92 säännösten mukaisesti ilmoittajien ehdottamien käyttötarkoitusten osalta. Asetuksen (EY) N:o 933/94 mukaisesti Saksa nimettiin esitteleväksi jäsenvaltioksi. Esittelevä jäsenvaltio toimitti komissiolle asetuksen (ETY) N:o 3600/92 7 artiklan 1 kohdan c alakohdan mukaisesti 30 päivänä heinäkuuta 1999 asiaa koskevat arviointikertomukset ja suositukset.(3) Jäsenvaltiot ja komissio ovat tarkastelleet arviointikertomusta pysyvässä kasvinsuojelukomiteassa. Tarkastelu on saatettu päätökseen 7 päivänä joulukuuta 2001 komission tarkastelukertomuksella isoproturonista.(4) Tarkastelussa ei paljastunut avoimia kysymyksiä tai huolenaiheita, jotka olisivat edellyttäneet kasveja käsittelevän tiedekomitean kuulemista.(5) Eri tutkimuksista on käynyt ilmi, että kyseistä tehoainetta sisältävien kasvinsuojeluaineiden voidaan yleisesti olettaa täyttävän direktiivin 91/414/ETY 5 artiklan 1 kohdan a ja b alakohdassa säädetyt edellytykset erityisesti tutkittujen ja komission tarkastelukertomuksessa lueteltujen käyttötarkoitusten osalta. Näin ollen on aiheellista sisällyttää kyseinen tehoaine kyseisen direktiivin liitteeseen I sen varmistamiseksi, että kaikissa jäsenvaltioissa kyseisiä tehoaineita sisältäviä kasvinsuojeluaineita koskevien lupien myöntäminen voidaan järjestää direktiivissä 91/414/ETY säädetyllä tavalla.(6) Olisi vahvistettava isoproturonin sisällyttämistä direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I seuraava määräaika, jonka kuluessa jäsenvaltioiden on tarvittaessa myönnettävä, muutettava tai peruutettava tätä tehoainetta sisältäviä kasvinsuojeluaineita koskevat luvat. Erityisesti edellytetään, että kasvinsuojeluaineita koskevat luvat myönnetään ainoastaan tehoaineen liitteeseen I sisällyttämiseen liittyvien edellytysten ja direktiivissä säädettyjen yhtenäisten periaatteiden mukaisesti säädetyt tietovaatimukset täyttävien asiakirjojen perusteella.(7) Komission tarkastelukertomus on välttämätön, jotta jäsenvaltiot voivat asianmukaisesti panna täytäntöön direktiivissä 91/414/ETY säädettyjen yhtenäisten periaatteiden monet osat. Tästä syystä on aiheellista säätää, että jäsenvaltioiden on pidettävä lopullinen tarkastelukertomus, luottamuksellisia tietoja lukuun ottamatta, asianomaisten osapuolten saatavilla tai saatettava se näiden käyttöön. Jos on tarpeen saattaa tarkastelukertomus ajan tasalle teknisen ja tieteellisen kehityksen huomioon ottamiseksi, myös edellytykset, jotka koskevat kyseisen tehoaineen sisällyttämistä direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I, on muutettava kyseisen direktiivin mukaisesti.(8) Kohtuullinen määräaika on tarpeen ennen tehoaineen sisällyttämistä liitteeseen I, jotta jäsenvaltiot ja asianomaiset osapuolet voivat valmistautua sisällyttämisestä seuraaviin uusiin vaatimuksiin. Lisäksi kohtuullinen määräaika on tarpeen sisällyttämisen jälkeen, jotta jäsenvaltiot voivat panna direktiivin 91/414/ETY säännökset täytäntöön isoproturonia sisältävien kasvinsuojeluaineiden osalta. Jäsenvaltioiden on erityisesti muutettava tämän määräajan kuluessa voimassa olevia lupia tai myönnettävä tarvittaessa uusia lupia direktiivin 91/414/ETY säännösten mukaisesti. Olisi säädettävä pidemmästä määräajasta kutakin kasvinsuojeluainetta koskevan täydellisen asiakirja-aineiston jättämiseksi ja arvioimiseksi direktiivissä 91/414/ETY säädettyjen yhtenäisten periaatteiden mukaisesti. Yhtenäisten periaatteiden perusteella tapahtuva kokonaisarviointi voidaan useita tehoaineita sisältävien kasvinsuojeluaineiden osalta kuitenkin suorittaa vasta sen jälkeen, kun kaikki asianomaiset tehoaineet on sisällytetty direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I.(9) Tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän kasvinsuojelukomitean lausunnon mukaiset,ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:1 artiklaMuutetaan direktiivin 91/414/ETY liite I tämän direktiivin liitteen mukaisesti.2 artiklaJäsenvaltioiden on pidettävä asianomaisten osapuolten saatavilla isoproturonia koskeva tarkastelukertomus, direktiivin 91/414/ETY 14 artiklassa tarkoitettuja luottamuksellisia tietoja lukuun ottamatta, tai saatettava se erityisestä pyynnöstä näiden käyttöön.3 artikla1. Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 30 päivänä kesäkuuta 2003. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä.Jäsenvaltioiden on erityisesti direktiivin 91/414/ETY mukaisesti tarvittaessa muutettava tai peruutettava isoproturonia tehoaineenaan sisältäviä kasvinsuojeluaineita koskevat voimassa olevat luvat tähän määräpäivään mennessä.Näissä jäsenvaltioiden antamissa säädöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään.2. Kun on kyse isoproturonia ainoana tehoaineenaan sisältävistä kasvinsuojeluaineista, direktiivin 91/414/ETY liitteen III vaatimukset täyttävän asiakirja-aineiston perusteella kyseisen direktiivin liitteessä VI säädettyjen yhtenäisten periaatteiden mukaisesti tehtävän arvioinnin ja päätöksenteon osalta lupien muuttamista tai peruuttamista koskeva määräaika on 1 päivä tammikuuta 2007.3. Isoproturonia ja jotain muuta direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I kuuluvaa tehoainetta sisältävien kasvinsuojeluaineiden osalta lupien muuttamista tai peruuttamista koskeva määräaika päättyy neljä vuotta direktiivin 91/414/ETY liitettä I muuttaneen direktiivin voimaantulon jälkeen, jolla viimeinen näistä aineista sisällytetään siihen.4 artiklaTämä direktiivi tulee voimaan 1 päivänä tammikuuta 2003.5 artiklaTämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.Tehty Brysselissä 22 päivänä helmikuuta 2002.Komission puolestaDavid ByrneKomission jäsen(1) EYVL L 230, 19.8.1991, s. 1.(2) EYVL L 313, 30.11.2001, s. 37.(3) EYVL L 366, 15.12.1992, s. 10.(4) EYVL L 259, 13.10.2000, s. 27.(5) EYVL L 107, 28.4.1994, s. 8.(6) EYVL L 225, 22.9.1995, s. 1.LIITEDirektiivin 91/414/ETY liitteessä I olevan taulukon loppuun sisällytettävät tiedot ""(1) Lisätietoja tehoaineen tunnistuksesta ja määritelmästä annetaan sitä koskevassa tarkastelukertomuksessa.


Avis juridique important

|

32000L0033

Komission direktiivi 2000/33/EY, annettu 25 päivänä huhtikuuta 2000, vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen kahdennenkymmenennenseitsemännen kerran (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti.)

Virallinen lehti nro L 136 , 08/06/2000 s. 0090 - 0107

Komission direktiivi 2000/33/EY,annettu 25 päivänä huhtikuuta 2000,vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen kahdennenkymmenennenseitsemännen kerran(1)(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, jokaottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,ottaa huomioon vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä 27 päivänä kesäkuuta 1967 annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY(2), sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivillä 1999/33/EY(3), ja erityisesti sen 28 artiklan,sekä katsoo seuraavaa:(1) Direktiivin 67/548/ETY liitteessä V säädetään menetelmistä aineiden ja valmisteiden fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien, toksisuuden ja ekotoksisuuden määrittämiseksi. Kyseinen liite on mukautettava tekniikan kehitykseen.(2) Kokeisiin ja muihin tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelua koskevien jäsenvaltioiden lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä 24 päivänä lokakuuta 1986 annetun neuvoston direktiivin 86/609/ETY(4) 7 artiklan 2 kohdan säännösten mukaan "koetta ei saa suorittaa, jos tavoitellun tuloksen saavuttamiseksi on mahdollista soveltaa jotakin toista tieteellisesti luotettavaa menetelmää, joka ei edellytä eläimen käyttöä".(3) Komissio aikoo lisätä direktiivin 67/548/ETY liitteeseen V uusia vaihtoehtoisia koemenetelmiä, joihin ei sisälly eläinten käyttöä, jotta sellaisia menetelmiä voitaisiin käyttää direktiivin 67/548/ETY 3 artiklan 1 kohdassa tarkoitettujen kemiallisten aineiden testaukseen.(4) Tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat vaarallisten aineiden ja valmisteiden kaupan teknisten esteiden poistamiseksi annettujen direktiivien mukauttamista tekniikan kehitykseen käsittelevän komitean lausunnon mukaiset,ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:1 artiklaLisätään tämän direktiivin liitteen I ja II teksti direktiivin 67/548/ETY liitteessä V olevaan B osaan.2 artikla1. Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaan viimeistään 1. lokakuuta 2001. Niiden on ilmoitettava tästä komissiolle viipymättä.Näissä jäsenvaltioiden antamissa säädöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten tällaiset viittaukset tehdään.2. Jäsenvaltioiden on toimitettava komissiolle tässä direktiivissä tarkoitetuista kysymyksistä antamansa keskeiset kansalliset säännökset ja vastaavuustaulukko tämän direktiivin säännöksistä ja antamistaan kansallisista säännöksistä.3 artiklaTämä direktiivi tulee voimaan kolmantena päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä.4 artiklaTämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.Tehty Brysselissä 25 päivänä huhtikuuta 2000.Komission puolestaMargot WallströmKomission jäsen(1) Annettu ennen 26:tta mukauttamista.(2) EYVL 196, 16.8.1967, s. 1.(3) EYVL L 199, 30.7.1999, s. 57.(4) EYVL L 358, 18.12.1986, s. 1.LIITE I"B.40. IHOSYÖVYTTÄVYYS1 MENETELMÄ1.1 JohdantoEuroopan vaihtoehtoisten menetelmien validointikeskus (ECVAM, Euroopan komission Yhteinen tutkimuskeskus) on validoinut tieteellisesti kaksi in vitro ihosyövyttävyystestiä, rotan ihon sähkövastusmäärityksen (transcutaneous electrical resistance, TER) ja ihmisihomallitestin (1) (2) (3). ECVAMin validointitutkimuksessa osoitettiin, etta molemmilla testeillä voidaan erottaa luotettavasti tunnetut ihoa syövyttävät kemikaalit ja sellaiset kemikaalit, jotka eivät syövytä ihoa. Lisäksi ihmisihomalliin perustuvalla tutkimuksella voitiin erottaa eriasteinen ihosyövyttävyys (ihoa voimakkaasti syövyttävät aineet, R35, ja ihoa syövyttävät aineet, R34) (2). Seuraavassa esitetään molemmat testit ja niiden suoritusmenetelmät. Käytättävä testi valitaan käyttäjän erityisvaatimusten ja mahdollisuuksien mukaan.Ks. myös osan B Yleisjohdanto.1.2 BegriffsbestimmungIhosyövyttävyys (ihokorroosio): palautumattoman kudosvaurion ilmeneminen ihossa testiaineen aplikaation jälkeen.1.3 VertailuaineetVertailuaineita ei täsmennetä. Ks. kuitenkin kohdat 1.5.3.4 ja 1.7.2.3.1.4 Testimenetelmän periaate - rotan ihon sähkövastusmääritysTestiainetta aplikoidaan enintään 24 tunnin ajan inhimillisellä tavalla lopetetuista nuorista rotista otettujen ihonäytteiden orvaskesipinnalle. Aineen katsotaan olevan syövyttävä, jos se rikkoo marraskeden ja tuhoaa sen suojavaikutuksen, mikä mitataan ihon suhkövastuksen pienenemisenä tietyn raja-arvon (5 kΩ) alapuolelle (4) (5). Ärsyttävät ja ei-ärsyttävät aineet eivät pienennä ihon sähkövastusta raja-arvon alapuolelle. Pinta-aktiivisia aineita ja neutraaleja orgaanisia aineita (ks. määritelmä viitteessä 6) tutkittaessa testimenetelmään voidaan lisätä väriaineensitomisvaihe, jolla voidaan vähentää erityisesti kyseisen tyyppisillä kemikaaleilla saatujen väärien positiivisten tulosten määrää (2) (7).1.5 Testimenetelmän kuvaus - rotan ihon sähkövastusmääritys1.5.1 EläimetIhonäytteiden valmistusta varten tarvitaan nuoria (20-23 päivän ikäisiä) rottia (Wistar tai vastaava kanta). Selästa ja kyljistä ajetaan karvat tarkasti pienillä eläinten karvaleikkureilla. Eläimet pestään pyyhkimällä huolellisesti, ja näytteenottoaluetta käsitellään runsaalla määrällä antibioottiliuosta (jossa on bakteerikasvua tehokkaasti estävät pitoisuudet esim. streptomysiiniä, penisilliiniä, kloramfenikolia ja amfoterisiiniä). Eläimet pestäänn jälleen antibioottiliuoksella kolmantena tai neljäntenä päivänä ensimmäisen pesun jälkeen ja käytetään kokeisiin kolmen päivän sisällä (eläimet eivät saa olla 31 päivää vanhempia ihonäytteitä otettaessa).1.5.2 Ihonäytteiden valmistusEläimet lopetetaan inhimillisesti. Kunkin eläimen selkänahka poistetaan ja nahasta kuoritaan ylimääräinen rasva huolellisesti. Nahka asetetaan polytetrafluoroeteeni-(PTFE) putken toisen pään yli siten, etta orvaskesipinta on kosketuksissa putken kanssa. Nahkanäyte kiristetään paikalleen kumisella O-renkaalla, ja liika nahka leikataan pois. Kuvassa 1 esitetään putken ja O-renkaan mitat. O-rengas tiivistetään huolellisesti PTFE-putken päähan vaseliinilla. Putki kiinnitetään jousipidikkeellä koeastian sisälle, jossa on magnesiumsulfaattiliuosta (154 mM) (Kuva 2).1.5.3 Testin suoritus1.5.3.1 Testiaineen aplikoiminenNestemäiset testiaineet (150 µl) aplikoidaan putken sisäpuolella olevalle orvaskesipinnalle (Kuva 2). Kun testataan kiinteitä aineita, ainetta on pantava näytepalan päälle riittävä määrä, että se peittää koko orvaskesipinnan. Kiinteän aineen päälle lisätään sitten deionisoitua vettä (150 µl) ja putkia ravistellaan varovasti. Testiaineiden on oltava mahdollisimman hyvin kosketuksissa ihon kanssa. Joitakin kiinteitä aineita voidaan tämän saavuttamiseksi lämmittää aina 30 °C:een testiaineen sulattamiseksi tai jauhaa rakeiseen tai jauhemaiseen muotoon.Kutakin testiainetta varten käytetään kolme ihonäytettä. Testiaineita aplikoidaan 24 tunnin ajaksi (ks. myös 1.5.3.4). Testiaine poistetaan pesemällä vesihanan alla enintään 30 °C:n lämpötilassa, kunnes ainetta ei enää irtoa. Jos testiaineet ovat jähmettyneet putkessa, niiden irtoamista voi auttaa noin 30 °C:n lämminvesisuihkulla.1.5.3.2 Ihon sähkövastusmittausIhon sähkövastus mitataan matalajännitevaihtovirtasillalla (esim. AIM 401 tai 6401 tai vastaava). Ennen sähkövastuksen mittausta ihon pintajännitystä pienennetään lisäämällä putkeen 70-prosenttista etanolia riittävästi orvaskeden peittämiseksi. Etanoli poistetaan muutaman sekunnin kuluttua kääntämällä putki ylösalaisin, ja kudos hydratoidaan lisäämällä 3 ml magnesiumsulfaattiliuosta (154 mM). Mittaussillan elektrodit asetetaan ihonäytteen molemmille puolille vastuksen mittaamiseksi kilo-ohmeina (kΩ) ihonäytettä kohti (Kuva 2). Elektrodien mitat ja hauenleukapidikkeen alapuolella olevan elektrodin pituus esitetään kuvassa 1. Sisemmän (paksun) elektrodin pidike pidetään mittauksen aikana PTFE-putken päällä sen varmistamiseksi, että sama pituusmäärä elektrodia on upotettuna magnesiumsulfaattiliuokseen. Ulompi (ohut) elektrodi asetetaan koeastian sisälle siten, että se lepää astian pohjalla. Jousipidikkeen pohjan ja PTFE-putken pohjan välinen etäisyys pidetään vakiona (Kuva 1), koska tämä etäisyys vaikuttaa mitattavaan vastuksen arvoon.Jos mitattu vastuksen arvo on yli 20 kΩ, se voi johtua siitä, että testiaine kyllästää ihonäytteen orvaskesipinnan. Tätä kerrosta voidaan yrittää poistaa esim. sulkemalla PTFE-putki peukalolla (hansikas kädessä) ja ravistelemalla putkea noin 10 sekuntia; magnesiumsulfaattiliuos heitetään pois ja vastusmittaus toistetaan tuoreen magnesiumsulfaattiliuoksen kanssa.Ihon sähkövastusmittausten keskiarvot hyväksytään, jos samaan aikaan mitatut positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden arvot ovat tälle menetelmälle määritellyissä hyväksyttävissä rajoissa. Suositellut kontrolliaineet ja niiden hyväksyttävät vastusalueet käytettäessä tätä menetelmää ja näitä laitteita ovat:>TAULUKON PAIKKA>1.5.3.3 Muunnettu menetelmä pinta-aktiivisille aineille ja neutraaleille orgaanisille aineilleJos testiaineet ovat pinta-aktiivisia aineita tai neutraaleja orgaanisia aineita ja niillä saatavat ihon sähkövastusarvot ovat enintään 5 kΩ, voidaan määrittää väriaineen tunkeutuminen kudokseen. Siten selvitetään, ovatko tulokset vääriä positiivisia (2).1.5.3.3.1 Sulforodamiini B -väriaineen aplikaatio ja poistaminenKun ihoa on ensin käsitelty testiaineella, kunkin ihonäytteen orvaskesipinnalle aplikoidaan 2 tunniksi 150 µl 10-prosenttista (paino/tilavuus) sulforodamiini B -liuosta tislatussa vedessä. Ihonäytteitä pestään sen jälkeen vesihanan alla huoneenlämpötilassa n. 10 sekuntia liian tai sitoutumattoman väriaineen poistamiseksi. Ihonäytteet poistetaan varovasti PTFE-putkista ja pannaan pulloon (esim. 20 ml:n lasinen tuikelaskentapullo), jossa on deionisoitua vettä (8 ml). Pulloja ravistellaan varovasti 5 minuuttia mahdollisen liian tai sitoutumattoman väriaineen poistamiseksi. Huuhtelu toistetaan. Ihonäytteet otetaan pulloista, pannaan toisiin pulloihin, joissa on 5 ml 30-prosenttista (paino/tilavuus) natriumdodekyylisulfaattia (SDS) tislatussa vedessä ja inkuboidaan yli yön 60 °C:ssa. Inkubaation jälkeen ihonäytteet otetaan pulloista ja heitetään pois. Jäljellä olevaa liuosta sentrifugoidaan 8 minuuttia 21 °C:ssa (suhteellinen keskipakoisvoima [sim     ] 175). Supernatantista otetaan 1 ml:n näyte, joka laimennetaan 1:5:een (tilavuus/tilavuus) [ts. 1 ml + 4 ml] 30-prosenttisella (paino/tilavuus) SDS:llä tislatussa vedessä. Liuoksen optinen tiheys (OD) mitataan aallonpituudella (noin) 565 nm.1.5.3.3.2 Väriaineen pitoisuuden laskeminenSulforodamiini B -väriaineen pitoisuus ihonäytteessä lasketaan OD-arvoista (sulforodamiini B:n molaarinen ekstinktiokerroin aallonpituudella 565 nm = 8,7 × 104; molekyylipaino = 580). Sulforodamiini B-pitoisuus määritetään kullekin ihonäytteelle, ja rinnakkaismäärityksille lasketaan keskiarvo. Väriaineen sitoutumiskokeen keskiarvotulokset hyväksytään, jos samaan aikaan tehtyjen kontrolliaineiden määritysten tulokset ovat tälle menetelmälle määritellyissä hyväksyttävissä rajoissa. Suositellut kontrolliaineiden hyväksyttävät väriainepitoisuusalueet käytettäessä tätä menetelmää ja näitä laitteita ovat:>TAULUKON PAIKKA>1.5.3.4 LisätietojaTestiaineet voidaan myös aplikoida ihonäytteille lyhyemmäksi ajaksi (esim. 2 tunniksi), jos halutaan selvittää, mitkä aineet ovat erittäin syövyttäviä. Validointitutkimuksessa havaittiin kuitenkin, että ihon sähkövastuskoe, jonka avulla voitiin erottaa oikein syövyttävät ja ei-syövyttävät aineet 24 tunnin aplikaation jälkeen, yliarvioi useiden testikemikaalien syövyttävyyden, kun niitä aplikoitiin ihonäytteille 2 tunniksi (2).Testauslaitteiden ominaisuudet ja mitat sekä koemenetelmä voivat vaikuttaa saatuihin ihon sähkövastusarvoihin. Viiden kΩ:n syövyttävyysraja saatiin tässä ohjeessa selostetuilla erityislaitteilla ja -menetelmällä saatujen tulosten perusteella. Jos testiolosuhteita muutetaan merkittävästi, voi olla tarpeen käyttää eri raja- ja kontrolliarvoja. Siksi suositellaan, että menetelmä ja vastuksen raja-arvo kalibroidaan testaamalla sarja vertailustandardeja, jotka on valittu validointitutkimuksessa käytettyjen kemikaalien joukosta (3).1.6 Testimenetelmän periaate - ihmisihomallimääritysTestiainetta aplikoidaan enintään 4 tunniksi kolmiulotteiseen ihmisihomalliin, jossa on rekonstruoitu orvaskesi ja toimiva marraskesi. Syövyttäviksi aineiksi katsotaan aineet, jotka vähentävät solujen elävyyden (määritettynä esim. MTT-pelkistyskokeella) määriteltyjen raja-arvojen alapuolelle tiettyjen altistusaikojen jälkeen. Määritys perustuu olettamukseen, että syövyttävät kemikaalit pystyvät tunkeutumaan marrasketeen (diffundoitumalla tai eroosion seurauksena) ja ovat niin myrkyllisiä soluille, että aiheuttavat solukuolemaa alla olevissa solukerroksissa.1.7 Testimenetelmän kuvaus -ihmisihomallimääritys1.7.1 IhmisihomallitIhmisihomallit voivat olla peräisin eri lähteistä, mutta niiden on täytettävä tietyt vaatimukset. Mallissa on oltava toimiva marraskesi, jonka alla on kerros eläviä soluja. Marraskeden suojaavan vaikutuksen on oltava riittävä. Tämä voidaan osoittaa toteamalla, että sellaisten aineiden aplikointi, joiden tiedetään olevan myrkyllisiä soluille mutta jotka eivät normaalisti tunkeudu marraskeden läpi, ei aiheuta sytotoksisia vaikutuksia ihomalliin. On osoitettava, että mallilla saadaan toistettavia tuloksia määrätyissä koeolosuhteissa.Mallin elävien solujen elinkelpoisuuden on oltava riittävä positiivisten ja negatiivisten kontrolliaineiden erottamiseen. Kun malli altistetaan negatiiviselle kontrolliaineelle, solujen elinkelpoisuuden (mitattuna esim. MTT:n pelkistyksen avulla eli OD-arvona) on oltava kyseiselle mallille hyväksyttyjen rajojen sisällä. Samoin positiiviselle kontrolliaineelle altistettujen solujen elävyyden (verrattuna negatiivisen kontrollin arvoihin) on oltava määritellyissä rajoissa. Tärkeintä on, että käytetyn ennustemallin osoitetaan täyttävän kansainväliset validointivaatimukset (2).1.7.2 Testin suoritus1.7.2.1 Testiaineen aplikoiminenNestemäistä testiainetta aplikoidaan määrä, mikä peittää ihonpinnan (vähintään 25 µl/cm2). Kiinteää testiainetta aplikoidaan määrä, mikä peittää ihonpinnan, ja ainetta pitäisi kostuttaa, jotta se olisi hyvin kosketuksissa ihoon. Tarvittaessa kiinteät aineet on jauhettava aplikointia varten. On osoitettava, että aplikaatiomenetelmä sopii monenlaisille kemikaalityypeille (2). Altistuksen päättyessä testiaine pestään huolellisesti ihon pinnalta suolaliuoksella.1.7.2.2 Sulujen elinkykyisyysmittauksetSolujen elävyyden määrittämiseksi voidaan käyttää mitä tahansa kvantitatiivista ja validoitua menetelmää. Tavallisin määritysmenetelmä on MTT:n pelkistys, jonka on osoitettu antavan tarkkoja ja toistettavia tuloksia eri laboratorioissa (2). Ihonäyte pannaan MTT-liuokseen, 0,3 mg/ml, 20-28 °C:n lämpötilassa 3 tunniksi. Saostunut sininen formatsaani uutetaan (liuotinuutolla), ja formatsaanipitoisuus määritetään mittaamalla OD aallonpituudella 545-595 nm.1.7.2.3 LisätietojaKäytetty ihomalli sekä altistusajat ja pesuohjelmat vaikuttavat huomattavasti solujen elävyyteen. Menetelmä ja ennustemalli on suositeltavaa kalibroida testaamalla sarja vertailustandardeja, jotka on valittu ECVAMin validointitutkimuksessa käytettyjen kemikaalien joukosta (3). On tärkeää, että käytetyn menetelmän on osoitettu olevan toistettava laboratorioissa ja niiden välillä useille kemikaaleille kansainvälisten standardien mukaisesti. Menetelmän on vähintäänkin täytettävä tieteelliselle validiteetille aiemmin määritellyt vaatimukset (2), ja tällaisen validointitutkimuksen tulokset on julkaistava referee-käytäntöä noudattavassa tieteellisessä aikakauslehdessä.2. MITTAUSTULOKSET2.1 Tulosten käsittely2.1.1 Rotan ihon sähkövastusmääritysTestiaineiden, positiivisten ja negatiivisten kontrollien ja mahdollisten vakiovertailukemikaalien vastusarvot (kΩ) olisi esitettävä taulukkomuodossa, ja myös tulokset rinnakkaiskokeista tai toistetuista kokeista, keskiarvot ja tuloksena johdettu luokitus olisi esitettävä.2.1.2 IhmisihomallimääritysTestiaineiden, positiivisten ja negatiivisten kontrollien ja mahdollisten standardien vakiovertailukemikaalien OD-arvot ja lasketut prosentuaaliset solujen elävyydet olisi esitettävä taulukkomuodossa, ja myös tulokset rinnakkaiskokeista tai toistetuista kokeista, keskiarvot ja tuloksena johdettu luokitus olisi esitettävä.2.2 Tulosten arviointi ja tulkinta2.2.1 Rotan ihon sähkövastusmääritysJos testiaineelle saatu ihon sähkövastusarvo on yli 5 kΩ, aine ei ole syövyttävä. Jos testiaineelle saatu ihon sähkövastusarvo on enintään 5 kΩ, eikä testiaine ole pinta-aktiivinen aine tai neutraali orgaaninen aine, testiaine on syövyttävä.Jos pinta-aktiivinen aine tai neutraali orgaaninen aine antaa enintään 5 kΩ:n ihon sähkövastusarvoja, aineelle voidaan tehdä väriaineen tunkeutumiskoe. Jos ihonäytteen sisältämän väriaineen keskipitoisuus on vähintään sama kuin samanaikaisesti määritetyn positiivisen kontrollin (36 % HCl) aiheuttama ihonäytteen sisältämän väriaineen keskipitoisuus, testiaine on oikeasti positiivinen ja siis syövyttävä. Jos ihonäytteen sisältämän väriaineen keskipitoisuus on pienempi kuin samanaikaisesti määritetyn positiivisen kontrollin (36 % HCl) aiheuttama ihonäytteen sisältämän väriaineen keskipitoisuus, testiaine on väärä positiivinen, eikä siis ole syövyttävä.2.2.2 IhmisihomallimääritysNegatiivisen kontrollin OD-arvo edustaa 100 % solujen elävyyttä. Siksi kullekin testinäytteelle saaduista OD-arvoista voidaan laskea solujen elinkykyisyys prosentteina negatiivisesta kontrollista. Prosentuaalinen solujen elävyyden raja-arvo, jolla erotetaan syövyttävät testiaineet ei-syövyttävistä (tai eri syövyttävyysluokat), on määriteltävä selvästi ennustemallissa ennen menetelmän validointia, ja sen jälkeen tehtävässä validointitutkimuksessa on osoitettava, että erottava raja-arvo on asianmukainen (2).3. TULOSTEN ILMOITTAMINENTestiraporttiTestiraportissa on esitettävä vähintään seuraavat tiedot:Testiaine:- tunnistetiedot, fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikokemialliset ominaisuudet. Nämä tiedot on esitettävä myös mahdollisesti käytetyistä vertailuaineista.Testiolosuhteet:- käytetty testimenetelmä yksityiskohtaisesti- mahdolliset muutokset ja niiden perustelut.Tulokset:- taulukoidaan vastusarvot (ihon sähkövastuskokeesta) tai prosentuaalinen solujen elävyys (ihmisihomallimäärityksestä) testiaineelle, positiiviselle ja negatiiviselle kontrollille ja mahdollisille vertailukemikaaleille sekä tulokset rinnakkaiskokeista tai toistetuista kokeista ja keskiarvot,- kuvataan mahdolliset muut havaitut vaikutukset.Tulosten tarkastelu.Päätelmät.4. VIITTEET(1) ECVAM (1998), ECVAM News &  Views, ATLA 26, s. 275-280.(2) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H-G. &  Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, s. 483-524.(3) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P. &  Worth, A.P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, s. 471-482.(4) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A. &  Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test - modifications and validation, Food &  Chemical Toxicology 24, s. 507-512.(5) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J. &  Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, s. 191-194.(6) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J. &  Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, s. 709-720.(7) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P. &  Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, s. 219-255.Kuva 1>PIC FILE= "L_2000136FI.009601.TIF">Kuva 2>PIC FILE= "L_2000136FI.009701.TIF">"LIITE II"B.41 VALOMYRKYLLISYYS - IN VITRO 3T3 NRU - VALOMYRKYLLISYYSTESTI1 MENETELMÄ1.1 JohdantoValomyrkyllisyys määritellään toksiseksi vasteeksi, joka ilmenee sen jälkeen, kun iho on ensin altistunut tietyille kemikaaleille ja sen jälkeen valolle tai jonka kemikaali aiheuttaa ihoa säteilytettäessä aineen päästyä systeemisesti elimistöön.In vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestillä saadun informaation avulla voidaan tunnistaa testiaineen valomyrkyllisyystaipumus, ts. voiko testiaine yhdessä UV-valolle ja näkyvälle valolle tapahtuvan altistuksen kanssa aiheuttaa vauriota.Koska valomyrkyllisyys määritetään in vitro -testissä kemikaalin ja valon yhteisvaikutuksesta aiheutuvana fotosytotoksisuutena, testillä voidaan tunnistaa sekä yhdisteitä, jotka ovat valomyrkyllisiä in vivo elimistöön annettuna ja ihoon jakautuneina, että yhdisteitä, jotka ovat valoärsyttäviä sen jälkeen, kun niitä on aplikoitu iholle paikallisesti.In vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystesti kehitettiin ja validoitiin EU:n ja COLIPAn (Eurooppalainen kosmetiikka- ja hajuvesivalmisteyhdistys) yhteisessä hankkeessa vuosina 1992-1997 (1) (2) (3). Tarkoituksena oli kehittää validi in vitro -vaihtoehto erilaisille käytössä oleville in vivo -testeille. Vuonna 1996 OECD:n työryhmässä suositeltiin vaiheittaiseen in vitro -testaukseen perustuvaa lähestymistapaa valomyrkyllisyyden määrittämiseksi (4).In vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestin tuloksia verrattiin akuutteihin valomyrkyllisyys- ja valoärsytysvaikutuksiin eläimillä ja ihmisillä in vivo, ja testin osoitettiin ennustavan erinomaisesti näitä vaikutuksia. Testin tarkoituksena ei ole ennustaa muita kemikaalien ja valon yhteisvaikutuksesta aiheutuvia haitallisia vaikutuksia, esim. fotogenotoksisuutta, valoallergiaa ja fotokarsinogeenisuutta, vaikka monet tällaisia erityisominaisuuksia omaavat kemikaalit reagoivat positiivisesti in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä. Testi ei pysty arvioimaan aineen valomyrkyllisyyspotenssia kvantitatiivisesti.Lisäyksessä esitetään vaiheittainen lähestymistapa kemikaalien valomyrkyllisyyden määrittämiseksi.1.2 MääritelmätSäteilyvoimakkuus: pintaan kohdistuvan ultraviolettivalon (UV) tai näkyvän valon (VIS) intensiteetti mitattuna watteina neliömetriä kohti tai watteina neliösenttimetriä kohti (W/m2 tai mW/cm2).Valoannos: pintaan kohdistuvan ultraviolettisäteilyn (UV) tai näkyvän valon säteilyn määrä (= intensiteetti × aika) ilmaistuna jouleina (= W × s) pinta-alayksikköä kohti, esim. J/m2 tai J/cm2.UV-valon aallonpituusalueet: Kansainvälisen valaistustoimikunnan (ICI) suosittelemat nimitykset ovat: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) ja UVC (100-280 nm). Muitakin määritelmiä käytetään: UVB- ja UVA-alueen raja asetetaan usein 320 nanometriin ja UVA-alue voidaan jakaa alueisiin UV-A1 ja UV-A2, jolloin raja on noin 340 nanometrissä.Solujen elävyys: muuttuja, jolla mitataan solupopulaation kokonaisaktiivisuutta (esim. neutraalipunan ottoa solujen lysosomeihin), joka mittaussuureesta ja testimenetelmästä riippuen korreloi solujen kokonaismäärään ja/tai elinkykyyn.Suhteellinen solujen elävyys: solujen elävyys ilmaistuna suhteessa negatiivisiin kontrolleihin (liuotinkontrolleihin), jotka käyvät läpi testin muuten (joko + UV tai - UV), mutta joita ei ole käsitelty testikemikaalilla.Ennustemalli: algoritmi, jonka avulla myrkyllisyystestin tulokset muunnetaan ennusteeksi myrkyllisyyspotentiaalista. Tässä ohjeessa voidaan käyttää PIF:iä ja MPE:tä in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestin tulosten muuntamiseen valomyrkyllisyyspotentiaaliennusteeksi.PIF (valoärsyttävyystekijä): tekijä, joka muodostetaan vertaamalla testikemikaalin kahta yhtä tehokasta solumyrkyllisyyspitoisuutta (EC50), jotka on saatu, kun soluja säteilytetään UVA-/näkyvällä valolla (+ UV), joka ei ole solumyrkyllistä, ja kun soluja ei säteilytetä (- UV).MPE (keskimääräinen valovaikutus): uusi suure, joka saadaan analysoimalla matemaattisesti kokonaan kaksi pitoisuus-vaste-kuvaajaa, jotka on saatu, kun soluja säteilytetään UVA-/näkyvällä valolla, joka ei ole solumyrkyllistä, ja kun soluja ei säteilytetä (- UV).Valomyrkyllisyys: akuutti toksinen vaste, joka ilmenee sen jälkeen, kun iho on ensimmäisen kerran altistettu tietyille kemikaaleille ja sen jälkeen valolle, tai jonka ihon säteilytys aiheuttaa samalla tavalla sen jälkeen, kun kemikaalia on annettu elimistöön.Valoärsyttävyys: valomyrkyllisyyden alakäsite, jota käytetään vain sellaisista valomyrkyllisistä reaktioista, jotka ilmenevät ihossa (paikallisesti tai suun kautta annetulle) kemikaalille altistumisen jälkeen. Tällaiset valomyrkylliset reaktiot aiheuttavat aina epäspesifistä solutuhoa (auringonpolttaman tapaisia reaktioita).Valoallergia: hankittu immunologinen reaktiivisuus, joka ei ilmene ensimmäisen kemikaali- ja valokäsittelyn yhteydessä ja joka tarvitsee yhden tai kahden viikon induktioajan ennen kuin reaktiivisuus voidaan osoittaa.Fotogenotoksisuus: genotoksinen vaste, joka havaitaan genotoksisuusmäärityksellä ja joka ilmenee altistettaessa soluja sellaiselle UV-/näkyvän valon annokselle, joka ei ole genotoksinen, ja kemikaalille, joka ei ole genotoksinen.Fotokarsinogeenisuus: toistuvalla valo- ja kemikaalialtistuksella aiheutettu karsinogeenisuus. Termiä 'foto-kokarsinogeneesi' käytetään, jos kemikaali voimistaa UV-valon aiheuttamaa tuumorigeneesiä.1.3 VertailuaineetKun 3T3 NRU -valomyrkyllisyystesti otetaan käyttöön, suositellaan, että positiivisena kontrollina käytetyn, klooripromatsiinin, joka olisi testattava samanaikaisesti jokaisessa määrityksessä, lisäksi käytetään vertailukemikaaleina joitakin tämän testin yhteydessä laboratorioiden välisissä vertailuissa käytetyistä kemikaaleista (1) (3) (13).1.4 Alustavia huomioitaUseantyyppisten kemikaalien on ilmoitettu olevan valomyrkyllisiä (5) (6) (7) (8). Niiden ainoa yhteinen ominaisuus on kyky absorboida valoenergiaa auringonvalon spektrialueella. Valokemian ensimmäisen lain (Grotthaus-Draperin laki) mukaan valoreaktio edellyttää riittävää valokvanttien absorptiota. Tämä merkitsee sitä, että ennen kuin harkitaan tämän ohjeen mukaista biologista testausta, testikemikaalin UV-valon ja näkyvän valon absorptiospektri olisi määritettävä (esim. OECD:n testiohjeen 101 mukaisesti). Jos kemikaalin mooliekstinktio- tai absorptiokerroin on pienempi kuin 10 1 × mol- 1 × cm- 1, kemikaalilla ei ole valoreaktiokykyä eikä sitä tarvitse testata in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestillä tai millään muulla haitallisia valokemiallisia vaikutuksia määrittävällä biologisella testillä (Lisäys).1.5 Testimenetelmän periaateTunnetaan neljä mekanismia, joilla valomyrkyllisyysvaste voi syntyä, kun (kemiallinen) kromofori absorboi valoa (7). Kaikista aiheutuu soluvaurioita. Sen vuoksi in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystesti perustuu kemikaalin solumyrkyllisyyden vertaamiseen, kun kemikaalia testataan altistettaessa sellaiselle UVA- tai näkyvälle valolle, joka ei ole solumyrkyllinen, ja ilman tällaista valoaltistusta. Solumyrkyllisyys ilmaistaan tässä testissä pitoisuudesta riippuvana neutraalipunan (9) soluunoton/kertymisen vähenemisenä 24 tuntia kemikaalikäsittelyn ja säteilytyksen jälkeen.Balb/c 3T3 -soluja viljellään 24 tuntia yhden solun vahvuisen kerroksen aikaansaamiseksi. Kutakin testikemikaalia kohti inkuboidaan aluksi yhden tunnin ajan kahta 96 kuopan levyä, joissa on kahdeksaa eri pitoisuutta testattavaa kemikaalia. Sen jälkeen toinen levyistä altistetaan ei-solumyrkylliselle UVA-valon ja näkyvän valon annokselle 5 J/cm2 UVA:ta (+ UV-koe), ja toinen levy pidetään pimeässä (- UV-koe). Sitten kummankin levyn käsittelyneste korvataan viljelynesteellä, inkuboidaan toiset 24 tuntia, ja määritetään solujen elävyys neutraalipunan ottona (NRU) kolmessa tunnissa. Suhteellinen solujen elävyys, joka ilmaistaan prosenttiosuutena käsittelemättömistä negatiivisista kontrolleista, lasketaan kullekin kahdeksalle testipitoisuudelle. Valomyrkyllisyyskyvyn ennustamiseksi verrataan pitoisuusvasteita, jotka on saatu UV-säteilytyksen kanssa (+ UV) ja ilman sitä (- UV), yleensä EC50 -tasolla, ts. siinä pitoisuudessa, joka vähentää solujen elävyyttä 50 prosentilla verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin.1.6 LaatuvaatimuksetSolujen herkkyys UVA-valolle, solujen aiempaa käyttöä koskevat tiedot: solujen herkkyys UVA-valolle on tarkistettava säännöllisesti. Soluja pannaan viljelyyn samassa tiheydessä, jota käytetään in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä, säteilytetään seuraavana päivänä UVA-valoannoksilla, joiden suuruus on 1-9 J/cm2, ja määritetään solujen elävyys päivää myöhemmin NRU-määrityksellä. Solut täyttävät laatuvaatimukset, jos niiden elävyys UVA-säteilytyksen jälkeen, jonka voimakkuus on 5 J/cm2, on vähintään 80 % pimeässä pidettyjen kontrollien elinkykyisyydestä. Suurimmalla UVA-annoksella 9 J/cm2 elävyyden pitäisi olla vähintään 50 % pimeässä pidettyjen kontrollien elävyydestä. Tämä tarkistus olisi tehtävä suunnilleen joka 10. kerta soluja siirrostettaessa.Negatiivisten kontrollisolujen UVA-herkkyys, nykyinen testi: testi täyttää laatuvaatimukset, jos negatiivisten kontrollien (Earlen tasapainotetussa suolaliuoksessa, EBSS, jossa on tai ei ole 1 % dimetyylisulfoksidia, DMSO, tai 1 % etanolia, EtOH, olevat solut) elävyys + UVA-kokeessa on vähintään 80 % samassa liuottimessa olevien säteilyttämättömien solujen elinkykyisyydestä samaan aikaan tehdyssä pimeäkokeessa (- UVA).Negatiivisten kontrollien elävyys: negatiivisten kontrollien neutraalipunauutteesta mitattu absoluuttinen optinen tiheys (OD540 NRU) osoittaa, ovatko kuoppaa kohti aplikoidut 1 × 104 solua lisääntyneet normaalilla nopeudella määritykseen kuuluvien kahden päivän aikana. Testi täyttää hyväksymisvaatimukset, jos käsittelemättömien kontrollien keskimääräinen OD540 NRU on >= 0,2.Positiivinen kontrolli: kussakin in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä on testattava samanaikaisesti jokin tunnetusti valomyrkyllinen kemikaali. EU/COLIPA-validointitutkimuksessa käytettiin positiivisena kontrollina klooripromatsiinia (CPZ), jota sen vuoksi suositellaan. CPZ:n testaukselle in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyyden standardiprotokollassa määriteltiin seuraavat hyväksyntävaatimukset: CPZ, säteilytetty (+ UVA): EC50 = 0,1-2,0 µg/ml; CPZ, ei säteilytetty (- UVA): EC50 = 7,0-90,0 µg/ml. Valoärsyttävyystekijän (PIF), ts. EC50:n muutoksen, olisi oltava vähintään 6.CPZ:n sijasta voidaan samanaikaisesti testattavina positiivisina kontrolleina käyttää muita tunnettuja valomyrkyllisiä kemikaaleja, jotka sopivat kyseessä olevalle kemikaaliluokalle tai arvioitavana olevan testikemikaalin liukoisuusominaisuuksiin. Tällöin testin hyväksyntävaatimuksiksi pitäisi määritellä asianmukaisesti EC50-arvojen vaihtelualue ja PIF- tai MPE-arvot (keskimääräinen valovaikutus) aikaisempien tietojen perusteella (historiallinen kontrolli).1.7 Testimenetelmän kuvaus1.7.1 Valmistelut1.7.1.1 SolutValidointitutkimuksessa käytettiin joko ATCC:stä tai ECACC:stä hankittua pysyvää hiiren fibroblastisolulinjaa Balb/c 3T3, kloonia 31, ja siksi sitä suositellaan. Muita soluja tai solulinjoja voidaan käyttää, kun tutkimussuunnitelma on sama, jos viljelyolosuhteet mukautetaan solujen erityistarpeisiin. Samanlaisuus on tällöin osoitettava.Mykoplasmakontaminaatio on tutkittava säännöllisesti, ja soluja saa käyttää vain jos tutkimustulos on tyydyttävä.Koska solujen UVA-herkkyys voi lisääntyä siirrostamisten myötä, pitäisi käyttää sellaisia Balb/c 3T3 -soluja, joita on siirrostettu mahdollisimman harvoja kertoja, mieluiten alle 100 kertaa. On tärkeää, että Balb/c 3T3 -solujen UVA-herkkyys tarkistetaan tässä ohjeessa selostetun laadunvalvontamenettelyn mukaisesti.1.7.1.2 Viljelyneste ja viljelyolosuhteetSopivaa viljelynestettä ja inkubaatio-olosuhteita olisi käytettävä solujen tavanomaiseen siirrostamiseen ja testin aikana. Balb/c 3T3 -soluille käytetään DMEM:iä, jossa on 10 % vastasyntyneen vasikan seerumia, 4 mM glutamiinia, penisilliiniä ja streptomysiiniä, ja soluja inkuboidaan kaapissa, jonka lämpötila on 37 °C ja CO2-pitoisuus 7,5 %. On erityisen tärkeää, että viljelyolosuhteet ovat sellaiset, että solusykli pysyy samanlaisena kuin se on aiemminkin ollut käytetyillä soluilla tai solulinjalla.1.7.1.3 Viljelmien valmistusPakastetuista varastoviljelmistä otettuja soluja inokuloidaan viljelynesteessä sopivassa tiheydessä, ja niitä siirrostetaan vähintään kerran ennen kuin ne käytetään in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä.Valomyrkyllisyystestiä varten soluja inokuloidaan sellaisessa tiheydessä, että viljelmät eivät ole konfluentteja testin päättyessä, ts. kun solujen elinkykyisyys määritetään 48 tunnin kuluttua solujen inokuloinnista. Balb/c 3T3 -soluille, joita viljellään 96-kuoppalevyillä, suositellaan solutiheyttä 1 × 104 solua kuoppaa kohti.Kutakin testikemikaalia varten soluja inokuloidaan täysin samalla tavalla kahdelle erilliselle 96-kuoppalevylle, jotka käyvät läpi samanaikaisesti koko testiohjelman täysin samanlaisissa olosuhteissa, lukuun ottamatta aikaa, jolloin yhtä kuoppalevyä säteilytetään (+ UVA/VIS) ja toinen pidetään pimeässä (- UVA/VIS).1.7.1.4 Metabolinen aktivaatioVaikka metaboloivia järjestelmiä yleensä tarvitaan kaikissa in vitro -testeissä, joilla ennustetaan genotoksisuutta ja karsinogeenisuutta, valomyrkyllisyydelle ei toistaiseksi tunneta kemikaaleja, jotka edellyttäisivät metabolista aktivaatiota, jotta ne voisivat olla valomyrkyllisiä in vivo tai in vitro. Siten ei katsota olevan tarpeellista eikä tieteellisesti perusteltua suorittaa tätä testiä metabolisen aktivaatiojärjestelmän kanssa.1.7.1.5 Testikemikaalin valmistusTestikemikaalit on valmistettava välittömästi ennen käyttöä ellei stabiilisuustiedoista ilmene, että varastointi voidaan hyväksyä. Valmistus on mahdollisesti tarpeen tehdä punaisessa valossa, jos aine hajoaa nopeasti valossa.Testikemikaali pitäisi liuottaa puskuroituun suolaliuokseen, esim. Earlin tasapainotettuun suolaliuokseen (EBSS) tai fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen (PBS), joissa ei saa olla proteiinikontaminantteja tai valoa absorboivia pH-indikaattorivärejä, etteivät ne häiritsisi reaktioita säteilytyksen aikana.Huonosti vesiliukoiset testikemikaalit pitäisi liuottaa sopivaan liuottimeen 100-kertaisessa pitoisuudessa loppupitoisuuteen verrattuna ja laimentaa sitten suhteessa 1:100 puskuroidulla suolaliuoksella. Jos käytetään liuotinta, sitä on oltava 1 prosentin (tilavuus/tilavuus) vakiotilavuudessa kaikissa viljelmissä, ts. myös negatiivisissa kontrolleissa ja kaikissa testikemikaalipitoisuuksissa.Dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja etanoli (EtOH) ovat suositeltavia liuottimia. Muut liuottimet, jotka eivät ole kovin solumyrkyllisiä (esim. asetoni), voivat olla sopivia, mutta niiden erityisominaisuudet (esim. reaktiivisuus testikemikaalin kanssa, valomyrkyllisyysvaikutuksen vaimeneminen tai radikaalien sitomisominaisuus) on arvioitava huolellisesti.Vortex-sekoitusta ja/tai ultraäänihajoitusta ja/tai lämmittämistä 37 °C:een voidaan käyttää tarvittaessa liukenemisen helpottamiseksi.1.7.1.6 UV-säteilytys - valmisteluValolähde: sopivan valolähteen ja sopivien suodattimien valitseminen on tärkein asia valomyrkyllisyyden testauksessa. UVA ja näkyvä valo liittyvät yleensä valolle herkistymiseen (7) (10), kun taas UVB on vähemmän tärkeä ja välittömästi soluille erittäin myrkyllinen. Sen valomyrkyllisyys lisääntyy 1000-kertaiseksi aallonpituudelta 313 nm aallonpituudelle 280 nm (11). Perusteena sopivan valolähteen valitsemiseen pitäisi olla mm. olennainen vaatimus, että valolähde emittoi aallonpituuksia, joita testikemikaali absorboi, ja että valoannoksen (joka pitää saavuttaa järkevässä ajassa) pitäisi olla riittävä tunnettujen valolle herkistävien kemikaalien osoittamiseksi. Lisäksi käytetyt aallonpituudet ja annokset eivät saisi olla liian tuhoisia testijärjestelmälle; tällainen vaikutus olisi mm. lämmön muodostuminen (infrapuna-alue).Auringonvalon simulointia pidetään parhaimpana valolähteenä. Sekä ksenonkaarilamppuja että (seostettuja) elohopeahalidikaarilamppuja käytetään auringonvalosimulaattoreissa. Jälkimmäisillä on se etu, että ne muodostavat vähemmän lämpöä ja ovat halvempia, mutta niiden spektri ei täysin vastaa auringonvalon spektriä. Koska kaikki auringonvalosimulaattorit lähettävät huomattavia määriä UVB-valoa, ne pitäisi suodattaa sopivasti erittäin solumyrkyllisten UVB-aallonpituuksien vaimentamiseksi.In vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestiä varten olisi käytettävä säteilyspektriä, jossa ei käytännöllisesti katsoen ole UVB-valoa (UVA:UVB [sim     ] 1:20). Yksi esimerkki in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestin validointitutkimuksessa käytetyn suodatetun auringonvalosimulaattorin säteilyspektrijakaumasta on julkaistu (3).Dosimetria: valon voimakkuus (säteilyvoimakkuus, radianssi) olisi tarkistettava säännöllisesti ennen jokaista valomyrkyllisyystestiä käyttämällä sopivaa leveäkaistaista UV-mittaria. UV-mittarin on oltava kalibroitu valolähteen suhteen. Sen suorituskyky pitäisi tarkistaa, mitä varten suositetaan toisen, samantyyppisen ja täysin samalla tavalla kalibroidun vertailu-UV-mittarin käyttöä. Olisi toivottavaa, että tasaisin välein käytettäisiin spektrosäteilymittaria suodatetun valolähteen säteilyvoimakkuusspektrin mittaamiseen ja leveäkaista-UV-mittarin kalibroimiseen, mutta tällaiset laitteet vaativat asianmukaisesti koulutettua ammattihenkilöstöä niitä käyttämään.Validointitutkimuksessa todettiin, että annos 5 J/cm2 (UVA) ei ollut myrkyllinen Balb/c 3T3 -soluille ja että se pystyi eksitoimaan jopa heikosti valomyrkyllisiä kemikaaleja. Jotta saavutetaan arvo 5 J/cm2 50 minuutin aikana, säteilyvoimakkuus on säädettävä arvoon 1,666 mW/cm2. Jos käytetään muuta solulinjaa tai eri valolähdettä, UVA-annosta voi olla tarpeen mukauttaa hiukan ottaen huomioon, että se ei saa vahingoittaa soluja, mutta sen on oltava riittävä valomyrkyllisten standardiaineiden osoittamiseksi. Valoaltistusaika lasketaan seuraavasti:>PIC FILE= "L_2000136FI.010101.EPS">1.7.2 TestiolosuhteetTestikemikaalin enimmäispitoisuus ei saisi olla suurempi kuin 100 µg/ml, koska kaikki valomyrkylliset kemikaalit on osoitettu alemmissa pitoisuuksissa, kun taas korkeammilla pitoisuuksilla väärien positiivisten tulosten määrä nousee (13). Testikemikaalin pH:n pitäisi olla sopiva suurimmassa pitoisuudessa (välillä 6,5-7,8).UVA-valon kanssa (+ UVA) ja ilman sitä (- UVA) testattavan kemikaalin pitoisuusalue on määritettävä riittävän laajasti edeltävissä pitoisuusalueenmäärittelykokeissa. Pitoisuussarjan vaihtelualue ja yksittäiset pitoisuudet on asetettava siten, että koetuloksia on riittävästi pitoisuus-vastekuvaajan laatimiseksi. Pitoisuussarjan olisi oltava geometrinen (vakio laimennuskerroin).1.7.3 Testimenetelmä(1)1.7.3.1 Ensimmäinen päiväValmistetaan viljelynesteeseen solususpensio, jossa on 1 × 105 solua/ml, ja 100 µl viljelynestettä pipetoidaan 96-mikrotitterikuoppalevyn laitimmaisiin kuoppiin (= nollakokeet). Muihin kuoppiin pipetoidaan 100 µl solususpensiota, jossa on 1 × 105 solua/ml (= 1 × 104 solua/kuoppa). Kutakin testikemikaalia varten valmistetaan kaksi kuoppalevyä: yksi sytotoksisuuden määritystä varten (- UVA) ja toinen fotosytotoksisuuden määritystä varten (+ UVA).Soluja inkuboidaan 24 h (7,5 % CO2, 37 °C), kunnes ne muodostavat puoliksi konfluentin yhden solun vahvuisen kerroksen. Tässä ajassa solut toipuvat ja tarttuvat levyn pohjaan sekä aloittavat eksponentiaalisen kasvun.1.7.3.2 Toinen päiväInkubaation jälkeen viljelyneste kaadetaan kuopista pois ja solut pestään kahdesti 150 µl:lla EBSS/PBS:ää kuoppaa kohti. Lisätään 100 µl EBSS/PBS:ää, jossa on testikemikaalia tai ainoastaan liuotinta (negatiivinen kontrolli). Kuoppiin lisätään 8 eri pitoisuutta testikemikaalia. Soluja inkuboidaan testikemikaalin kanssa pimeässä 60 minuuttia (7,5 % CO2, 37 °C).Testin (+UVA)-osaa varten soluja säteilytetään huoneenlämpötilassa 50 minuuttia 96-kuoppalevyn kannen läpi valolla, jonka voimakkuus on 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2). Vesihöyryn tiivistyminen kuoppalevyn kannen alle estetään tuulettimella. Rinnakkaislevyt (- UVA) pidetään huoneenlämpötilassa pimeässä laatikossa 50 min (= UVA-altistusaika).Testiliuos kaadetaan pois ja solut pestään kahdesti 150 µl:lla EBSS/PBS:ää. EBSS/PBS korvataan viljelynesteellä, ja soluja inkuboidaan (7,5 % CO2, 37 °C) yli yön (18-22 h).1.7.3.3 Kolmas päiväMikroskooppitutkimusSoluja tutkitaan faasikontrastimikroskoopissa. Kirjataan solujen muodonmuutokset, jotka johtuvat testikemikaalin myrkyllisistä vaikutuksista. Tätä kontrollia suositellaan koevirheiden eliminoimiseksi, mutta näitä muistiinpanoja ei käytetä sytotoksisuuden tai fotosytotoksisuuden arvioinnissa.NeutraalipunatestiSolut pestään 150 µl:lla esilämmitettyä EBSS/PBS:ää. Pesuliuos kaadetaan pois ravistamalla levyä varovasti. Kuoppiin lisätään 100 µl NR-viljelynestettä ja soluja inkuboidaan 3 tunnin ajan 37 °C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa on 7,5 % CO2.Inkubaation jälkeen NR-viljelyneste poistetaan ja solut pestään 150 µl:lla EBSS/PBS:ää. EBSS/PBS kaadetaan pois ja kuopat kuivataan täysin imeyttäen neste paperiin. (Vaihtoehtoisesti: alassuin käännetty kuoppalevy sentrifugoidaan.)Lisätään tarkasti 150 µl NR-desorbointiliuosta (juuri valmistettu etanoli/etikkahappo).Mikrotitterilevyä ravistetaan nopeasti ravistajassa 10 minuutin ajan, kunnes NR on uuttunut soluista ja muodostanut tasaisen liuoksen.NR-uutteen optinen tiheys luetaan aallonpituudella 540 nm spektrofotometrissä käyttäen vertailuliuoksena nollanäytteitä. Mittaustulokset tallennetaan sopivassa muodossa (esim. ASCII) myöhempää analysointia varten.2 MITTAUSTULOKSET2.1 Mittautulosten laatu ja määräMittaustulosten avulla pitäisi voida analysoida järkevästi UVA-valon tai näkyvän valon kanssa ja ilman sitä saadut pitoisuusvasteet. Jos havaitaan sytotoksisuutta, sekä pitoisuusalue että yksittäiset pitoisuudet on valittava siten, että koetuloksiin voidaan sovittaa kuvaaja. Koska on mahdollista, että testikemikaali ei ole myrkyllinen soluille edes määritellyssä pitoisuusrajassa 100 pg/ml pimeäkokeessa (- UVA), mutta on erittäin myrkyllinen soluille säteilytettäessä (+ UVA), voi olla tarpeen valita kokeen kummassakin osassa testattavat pitoisuusalueet siten, että ne eroavat toisistaan jopa useita kymmenen potensseja, jotta mittaustulosten riittävää laatua koskevat vaatimukset täyttyvät. Jos kokeen kummassakaan osassa (- UVA ja + UVA) ei havaita solumyrkyllisyyttä, riittää testaaminen korkeimpaan pitoisuuteen asti siten, että yksittäisten annosten valillä on pitkä väli.Selvästi positiivista tulosta ei tarvitse tarkistaa toistamalla koetta. Myöskään selvästi negatiivisia tuloksia ei tarvitse tarkistaa, jos testikemikaali on testattu riittävän korkeissa pitoisuuksissa. Tällaisissa tapauksissa riittää yksi koe, jota tukee yksi tai useampia pitoisuusaluetta määrittäviä alustavia kokeita.Testit, joissa on saatu lähellä ennustemallin erotusrajaa olevia tuloksia, olisi toistettava tulosten tarkistuksen vuoksi.Jos testin toistaminen katsotaan tarpeelliseksi, koeolosuhteiden muuttaminen voi olla tärkeää selvän tuloksen saamiseksi. Keskeinen muuttuja tässä testissä on testikemikaaliliuosten valmistaminen. Valmistusolosuhteiden (muut liuottimet, hienontaminen, ultraäänihajoitus) muuntelu voi siksi olla tarkoituksenmukaisinta testiä toistettaessa. Vaihtoehtoisesti voidaan harkita säteilytystä edeltävän esi-inkubaatioajan muuntelua. Vedessä hajoaville kemikaaleille voi lyhyt aika olla tarkoituksenmukainen.2.2 Tulosten käsittelyAina kun on mahdollista, määritetään testikemikaalin pitoisuus, joka vastaa 50 prosentin laskua solujen NRU-otossa (EC50). Tämä voidaan tehdä soveltamalla pitoisuus-vastetuloksiin mitä tahansa sopivaa ei-lineaarista regressiomenetelmää (mieluiten Hill-funktiota tai logistista regressiota) tai käyttämällä muita sovitusmenetelmiä (14). Ennen kuin EC50:tä käytetään laskuissa, sovituksen laatu olisi tarkastettava asianmukaisesti. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää graafisia sovitusmenetelmiä EC50:n laskemiseksi. Tällöin suositellaan todennäköisyyspaperin käyttöä (x-akseli: log, y-akseli: probiitti), sillä usein pitoisuusvastefunktio tulee melkein lineaariseksi tämän muunnoksen jälkeen.2.3 Tulosten arviointi (ennustemallit)2.3.1 Ennustemalli versio 1: Valoärsyttävyystekijä (PIF)Jos molemmissa tapauksissa - sekä UVA-valon kanssa (+ UVA) että ilman sitä (- UVA) - saadaan täydelliset pitoisuus-vastekuvaajat, voidaan valoärsyttävyystekijä (PIF) laskea seuraavasta kaavasta:>PIC FILE= "L_2000136FI.010301.EPS">Jos PIF <  5, ennuste on 'ei valomyrkyllisyyspotentiaalia', kun taas PIF >= 5 ennustaa valomyrkyllisyyspotentiaalin olemassaoloa.Jos kemikaali on solumyrkyllinen ainoastaan UVA-valon kanssa testattaessa mutta ei ilman sitä, PIF:iä ei voida laskea, vaikka tulos viittaakin valomyrkyllisyyspotentiaaliin. Tällöin voidaan laskea ' > PIF', jos ilman UV-valoa tehtävä solumyrkyllisyystesti tehdään suurimmalla testipitoisuudella (Cmax) ja tätä arvoa käytetään ' > PIF':n laskemiseen:>PIC FILE= "L_2000136FI.010302.EPS">Jos saadaan ainoastaan arvo ' > PIF', kaikki arvot  > 1 ennustavat valomyrkyllisyyspotentiaalia.Jos ei voida laskea sen enempää arvoa EC50 (- UV) kuin arvoa EC50 (+ UV), koska kemikaali ei osoita solumyrkyllisyyttä korkeimmassakaan pitoisuudessa, tulos merkitsee, ettei kemikaalilla ole valomyrkyllisyyspotentiaalia. Tällöin käytetään muodollista arvoa 'PIF = *1' karakterisoimaan tulosta:>PIC FILE= "L_2000136FI.010303.EPS">Jos saadaan ainoastaan arvo 'PIF = *1', ennuste on 'ei valomyrkyllistä potentiaalia'.Tapauksissa b) ja c) on valomyrkyllisyyspotentiaalia arvioitaessa huolellisesti tarkasteltava niitä pitoisuuksia, jotka saatiin in vitro 3T3 NRU-valomyrkyllisyystestissä.2.3.2 Ennustemalli versio 2: Keskimääräinen valovaikutus (MPE)Vaihtoehtoisesti voidaan soveltaa uutta valomyrkyllisyyspotentiaalin ennustamiseen tarkoitettua mallia, joka on kehitetty käyttäen EU/COLIPA-validointitutkimuksen (15) tietoja ja testattu sokkokoeolosuhteissa myöhemmässä UV-suodinkemikaalien in vitro -valomyrkyllisyystutkimuksessa (13). Tässä mallissa ei esiinny PIF-mallin rajoitusta silloin, kun EC50-arvoa ei voida saada. Mallissa käytetään 'keskimääräistä valovaikutusta' (MPE). Se on suure, joka perustuu täydellisten pitoisuus-vastekuvaajien vertaamiseen. MPE-mallin soveltamiseen kehitettiin Humboldt-yliopistossa (Berliini) erityinen tietokoneohjelma, jonka saa maksutta käyttöön.2.4 Tulosten tulkintaPositiivinen tulos in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä (PIF >= 5 tai MPE >= 0,1 ) merkitsee, että testikemikaalilla on valomyrkyllisyyspotentiaalia. Jos tämä tulos saadaan pitoisuuksilla, jotka ovat pienemmät kuin 10 µg/ml, testikemikaali on myös todennäköisesti valomyrkyllinen erilaisissa altistusolosuhteissa in vivo. Jos positiivinen tulos saadaan vain suurimmalla testipitoisuudella 100 µg/ml, voi vaaran arviointia tai valomyrkyllisyyspotentiaalin arviointia varten olla tarpeen hankkia lisätietoja esimerkiksi kemikaalin kyvystä läpäistä iho sekä sen imeytymisestä ja mahdollisesta kertymisestä ihoon, tai kemikaali on testattava muulla testillä vahvistusta varten, esim. ihmisihoa käyttävällä in vitro -testillä.Negatiivinen tulos in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä (PIF <  5 tai MPE <  0,1 ) merkitsee, että testiaine ei ollut valomyrkyllinen kyseisille nisäkässoluille käytetyissä olosuhteissa. Jos kemikaali pystyttiin testaamaan suurimmassakin pitoisuudessa 100 µg/ml, negatiivinen tulos merkitsee, ettei kemikaalilla ole valomyrkyllisyyspotentiaalia, ja valomyrkyllisyys in vivo voidaan katsoa epätodennäköiseksi. Tapauksissa, joissa samat pitoisuus-myrkyllisyysvasteet (EC50+ UV ja EC50- UV) on saatu pienemmillä pitoisuuksilla, tulokset tulkittaisiin samalla tavalla. Jos sitä vastoin myrkyllisyyttä ei voida osoittaa (+ UV ja - UV) ja jos aineen liukenemattomuus veteen rajoittaa pitoisuudet pienemmiksi kuin 100 µg/ml, voidaan asettaa kyseenalaiseksi, sopiiko testiaine kyseiseen määritykseen, ja on harkittava vahvistavaa määritystä (esim. käyttämällä in vitro -ihomallia, ex vivo -ihomallia tai in vivo -testiä).3 RAPORTOINTITestiraporttiTestiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:Testikemikaali:- tunnistetiedot ja CAS-numero, jos se tiedetään,- fysikaalinen olomuoto ja puhtaus,- fysikokemialliset ominaisuudet, jotka vaikuttavat tutkimuksen tekemiseen,- stabiilius ja valostabiilius, jos tunnetaan.Liuotin:- perustelut liuottimen valinnalle,- testikemikaalin liukoisuus tähän liuottimeen,- liuottimen pitoisuus prosentteina käsittelynesteessä (EBSS tai PBS).Solut:- solujen tyyppi ja lähde,- onko soluissa mykoplasmaa,- solujen siirrostusjärjestysluku, jos se tiedetään,- solujen herkkyys UVA:lle määritettynä sillä säteilytyslaitteella, jota käytetään in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestissä.Testiolosuhteet a) - inkubointi ennen käsittelyä ja sen jälkeen:- viljelynesteen tyyppi ja koostumus,- inkubaatio-olosuhteet (CO2-pitoisuus, lämpötila, kosteus),- inkubaatioaika (esikäsittely, jälkikäsittely).Testiolosuhteet b) - käsittely kemikaalilla:- perustelut testikemikaalin pitoisuuksien valintaan käytettäväksi sekä UV-valon/näkyvän valon kanssa että ilman sitä,- jos testikemikaali on huonoliukoinen eikä osoita solumyrkyllisyyttä, perustelut suurimmalle testatulle pitoisuudelle,- käsittelynesteen tyyppi ja koostumus (puskuroitu suolaliuos),- kemikaalikäsittelyn kesto.Testiolosuhteet c) - säteilytys:- perustelut käytetyn valolähteen valinnalle,- valolähteen säteilyspektrin ominaisuudet,- käytetyn suotimen (käytettyjen suotimien) transmissio- ja absorptio-ominaisuudet,- säteilymittarin ominaisuudet ja sen kalibrointi yksityiskohtaisesti,- valolähteen etäisyys testijärjestelmästä,- UVA-säteilyn voimakkuus kyseisellä etäisyydellä, mW/cm2,- UV-altistuksen tai näkyvälle valolle altistuksen kesto,- UVA-annos (säteilyvoimakkuus × aika), ilmaistuna laatuna J/cm2,- soluviljelmien lämpötila säteilytyksen aikana ja samanaikaisesti pimeässä pidettyjen soluviljelmien lämpötila.Testiolosuhteet d) - NRU testi:- NR-nesteen koostumus,- NR-inkubaation kesto,- inkubaatio-olosuhteet (CO2-pitoisuus, lämpötila, kosteus),- NR-uutto-olosuhteet (uuttoaine, kesto),- aallonpituus, jolla NR:n optinen tiheys luettiin spektrofotometrillä,- toinen (vertailu-) aallonpituus, jos sellaista käytettiin,- spektrofotometrin mahdollisen nollaliuoksen sisältö.Tulokset:- solujen elinkykyisyys, joka on saatu kullekin testikemikaalin pitoisuudelle, ilmaistuna prosentteina kontrollien keskimääräisestä elinkykyisyydestä,- pitoisuus-vastekuvaajat (testikemikaalin pitoisuus vs. suhteellinen solujen elinkykyisyys), joka on saatu samanaikaisesti tehdyissä (+ UVA)- ja (- UVA)-kokeissa,- pitoisuus-vastekuvaajien tietojen analyysi; jos mahdollista, lasketaan EC50 (+ UVA) ja EC50 (- UVA)- niiden kahden pitoisuus-vastekuvaajan vertailu, jotka on saatu UVA-valon tai näkyvän valon kanssa ja ilman sitä, joko laskemalla valoärsyttävyystekijä (PIF) tai laskemalla keskimääräinen valovaikutus (MPE),- valomyrkyllisyyspotentiaalin luokitus,- testin hyväksyttävyyskriteerit a) - samanaikainen negatiivinen kontrolli:- säteilytettyjen ja säteilyttämättömien solujen absoluuttinen elävyys (NR-uutteen optinen tiheys),- negatiivista kontrollia koskevat aiemmat tiedot, keskiarvo ja vakiopoikkeama,testin hyväksyttävyyskriteerit b) - samanaikainen positiivinen kontrolli:- positiivisen kontrollikemikaalin EC50(+ UVA) ja EC50(- UVA) ja PIF,- positiivista kontrollikemikaalia koskevat aiemmat tiedot: EC50(+ UVA) ja EC50(- UVA) ja PIF, keskiarvo ja vakiopoikkeama.Tulosten tarkastelu.Päätelmät.4 KIRJALLISUUSVIITTEET(1) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer, F., Moore, L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, s. 793-796.(2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, s. 7-8.(3) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pechovitch, G., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA 'In vitro phototoxicity' validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, s. 305-327.(4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996.(5) Lovell, W.W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology in Vitro 7, s. 95-102.(6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, s. XI-XXXV.(7) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, s. 314-348.(8) Spikes, J.D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, s. 79-110.(9) Borenfreund, E. and Puerner, J.A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, s. 119-124.(10) Lambert L. A, Warner W.G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor &  Francis, Washington DC, 5th Edition, s. 515-530.(11) Tyrrell R.M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, s. 1825-1829.(12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project 'In Vitro Photoirritation'.(13) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, s. 679-708.(14) Holzhütter, H.G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, s. 127-138.(15) Holzhütter, H.G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, s. 445-462.Lisäys>PIC FILE= "L_2000136FI.010702.TIF">"(1) Lisätietoja annetaan viitteessä 12.