title: Komission direktiivi 2006/63/EY, annettu  14 päivänä heinäkuuta 2006 ,  Ralstonia solanacearum  (Smith) Yabuuchi  et al.  -kasvintuhoojan torjunnasta annetun neuvoston direktiivin 98/57/EY liitteiden II–VII muuttamisesta

text:
               27.7.2006

               FI

               Euroopan unionin virallinen lehti

               L 206/36

         KOMISSION DIREKTIIVI 2006/63/EY,
   annettu 14 päivänä heinäkuuta 2006,

      Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. -kasvintuhoojan torjunnasta annetun neuvoston direktiivin 98/57/EY liitteiden II–VII muuttamisesta
   EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka
   ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,
   ottaa huomioon Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. -kasvintuhoojan torjunnasta 20 päivänä heinäkuuta 1998 annetun neuvoston direktiivin 98/57/EY (1) ja erityisesti sen 11 artiklan,
   sekä katsoo seuraavaa:

               (1)

               Yksi merkittävistä perunalle ja tomaatille haitallisista organismeista on Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., perunan tumman rengasmädän sekä perunan ja tomaatin bakteerilakastumistaudin aiheuttaja (jäljempänä ”organismi”).

               (2)

               Tätä organismia esiintyy edelleen joissakin yhteisön osissa.

               (3)

               Direktiivissä 98/57/EY vahvistetaan yksityiskohtaiset toimenpiteet, joita jäsenvaltioissa on toteutettava tämän kasvintuhoojan osalta sen paikallistamiseksi ja sen levinneisyyden määrittämiseksi, sen esiintymisen ja leviämisen estämiseksi, ja jos tuhoojaa löydetään, sen leviämisen estämiseksi ja torjumiseksi tarkoituksena hävittää se.

               (4)

               Tämän kasvintuhoojan biologian ja toteamis- ja tunnistamismenettelyjen tuntemus on huomattavasti lisääntynyt direktiivin antamisen jälkeen. Lisäksi kasvintuhoojan torjunnasta saatu käytännön kokemus vaatii useiden torjuntatoimenpiteisiin liittyvien teknisten säännösten tarkistamista.

               (5)

               Tällaisen kehityksen seurauksena näyttäisi olevan välttämätöntä tarkistaa ja päivittää direktiivin 98/57/EY tiettyihin liitteisiin sisältyvät toimenpiteet.

               (6)

               Havaitsemis- ja tunnistamismenettelyjen osalta mukaan otetaan FISH-menetelmä (fluoresoiva in situ -hybridisaatio), joka on vastikään kehitetty toteamismenetelmä. Mukaan on otettu myös PCR-menetelmään (polymeraasiketjureaktio) sekä nykyisten toteamis- ja tunnistamismenettelyiden lukuisiin eri teknisiin elementteihin tehdyt parannukset samoin kuin menetelmät organismin havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi muissa isäntäkasveissa kuin perunassa sekä vedessä ja maaperässä.

               (7)

               Torjuntatoimenpiteiden teknisiä elementtejä on parannettu seuraavilta osin: testinäytteiden säilyttämistapa kasvintuhoojan jäljittämisen varmistamiseksi, todennäköisen saastumisen laajuuden määrittämiseksi tarvittavat elementit, kasvintuhoojan varmistetun esiintymisen ja saastuneiden alueiden ilmoittamista koskevat tiedot sekä saastuneiksi ilmoitetuilla tuotantopaikoilla ja rajoitetuilla alueilla toteutettavat toimenpiteet. Lisäksi mukaan on otettu joitakin tomaattia koskevia säännöksiä, jotta voitaisiin paremmin ottaa huomioon tämän kasvin merkitys kasvintuhoojan isäntänä.

               (8)

               Tässä päätöksessä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän kasvinsuojelukomitean lausunnon mukaiset,

         ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:
   1 artikla
   Korvataan direktiivin 98/57/EY liitteet II–VII tämän direktiivin liitteessä olevilla vastaavilla teksteillä.
   2 artikla
   1.   Jäsenvaltioiden on annettava ja julkaistava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset viimeistään 31 päivänä maaliskuuta 2007. Niiden on toimitettava komissiolle kirjallisina nämä säännökset sekä kyseisiä säännöksiä ja tätä direktiiviä koskeva vastaavuustaulukko viipymättä.
   Jäsenvaltioiden on sovellettava näitä säädöksiä 1 päivästä huhtikuuta 2007.
   Näissä jäsenvaltioiden antamissa säännöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään.
   2.   Jäsenvaltioiden on toimitettava tässä direktiivissä tarkoitetuista kysymyksistä antamansa keskeiset kansalliset säännökset viipymättä kirjallisina komissiolle.
   3 artikla
   Tämä direktiivi tulee voimaan kolmantena päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.
   4 artikla
   Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

      Tehty Brysselissä 14 päivänä heinäkuuta 2006.

            Komission puolesta

         Markos KYPRIANOU

            Komission jäsen

      (1)  EYVL L 235, 21.8.1998, s. 1.
   LIITE
   ”
         LIITE II
         TUTKIMUSMENETELMÄ RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. -KASVINTUHOOJAN MÄÄRITTÄMISEKSI, TOTEAMISEKSI JA TUNNISTAMISEKSI
         TUTKIMUSMENETELMÄN SOVELTAMISALA
         Esitetty menetelmä kuvaa eri menettelyjä, jotka koskevat

                     i)

                     tumman rengasmädän määritystä perunan mukuloista ja bakteerilakastumistaudin määritystä perunasta ja tomaatista ja eräistä muista isäntäkasveista;

                     ii)

                        Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamista perunan mukuloista, perunoista, tomaateista ja muista isäntäkasveista, vedestä ja maaperästä otetuista näytteistä;

                     iii)

                        Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) -kasvintuhoojan tunnistamista.

               SISÄLTÖ

                        Sivu

                     Yleiset periaatteet

                     40

                     I JAKSO:

                     Tutkimusmenetelmän soveltaminen

                     40

                     1.

                     Toteamismenetelmä tumman rengasmädän ja bakteerilakastumistaudin (R. solanacearum) määrittämiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita

                     40

                     2.

                     Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä

                     43

                     3.

                     Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista.

                     46

                     II JAKSO:

                     Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita

                     48

                     1.

                     Oireet

                     48

                     2.

                     Pikaseulontatestit

                     48

                     3.

                     Eristämismenettely

                     49

                     4.

                        R. solanacearum -kasvintuhoojan tunnistustestit

                     49

                     III JAKSO:

                     1.

                     Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä

                     49

                     1.1

                     Näytteiden valmistelu

                     49

                     1.2

                     Testaus

                     51

                     2.

                     Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista kasveista.

                     51

                     2.1

                     Näytteiden valmistelu

                     51

                     2.2

                     Testaus

                     52

                     IV JAKSO:

                     1.

                     Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä

                     53

                     2.

                     Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä

                     55

                     2.1

                     Näytteiden valmistelu

                     55

                     2.2

                     Testaus

                     55

                     V JAKSO:

                     1.

                     Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä

                     56

                     2.

                     Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä

                     58

                     2.1

                     Näytteen valmistus

                     58

                     2.2

                     Testaus

                     58

                     VI JAKSO:

                     Optimoidut protokollat R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi

                     58

                     A)

                     Määritys- ja toteamistestit

                     58

                     1.

                     Valutuskoe

                     58

                     2.

                     Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen

                     58

                     3.

                     Serologiset agglutinaatiokokeet

                     59

                     4.

                     Eristäminen selektiivisellä alustalla

                     60

                     4.1

                     Valikoiva maljaus

                     60

                     4.2

                     Rikastusmenettely

                     60

                     5.

                     Immunofluoresenssitesti (IF-testi)

                     61

                     6.

                     Polymeraasiketjureaktiotesti (PCR-testi)

                     64

                     6.1

                     DNA:n puhdistusmenetelmät

                     65

                     a)

                     Pastrikin menetelmä (2000)

                     65

                     b)

                     Muut menetelmät

                     65

                     6.2

                     PCR-testi

                     66

                     6.3.

                     PCR-tuotteen määrittäminen

                     66

                     7.

                     Fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH-testi)

                     67

                     8.

                     Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA-testi)

                     69

                     a)

                     Epäsuora ELISA-testi

                     69

                     b)

                     DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect) ELISA

                     70

                     9.

                     Biologinen määritys

                     71

                     B)

                     Tunnistustestit

                     72

                     1.

                     Ravintokokeet ja entsymaattiset tunnistustestit

                     72

                     2.

                     IF-testi

                     72

                     3.

                     ELISA-testi

                     73

                     4.

                     PCR-testi

                     73

                     5.

                     FISH-testi

                     73

                     6.

                     Rasvahappoprofilointi (FAP)

                     73

                     7.

                     Kantojen määrittämismenetelmät

                     73

                     7.1

                     Biovarin määrittäminen

                     73

                     7.2

                     Genomien sormenjäljet

                     74

                     7.3

                     PCR-menetelmät

                     74

                     C)

                     Varmistustesti

                     74

                        Lisäys 1

                     Optimointi- ja validointimenettelyissä mukana olevat laboratoriot

                     76

                        Lisäys 2

                     Ravintoalusta R. solanacearum -kasvintuhoojan eristämistä ja viljelyä varten

                     77

                        Lisäys 3

                     A)

                     Kaupallisesti saatavilla olevat standardoidut kontrollimateriaalit

                     79

                     B)

                     Kontrollien valmistaminen

                     80

                        Lisäys 4

                     Puskuriliuokset testimenettelyihin

                     82

                        Lisäys 5

                     Kontaminaatioasteen määritys IF- ja FISH-testeillä

                     85

                        Lisäys 6

                     Validoidut PCR-menettelyt ja reagenssit

                     86

                        Lisäys 7

                     Validoidut reagenssit FISH-testiä varten

                     91

                        Lisäys 8

                     Tomaatin ja munakoison viljelyolosuhteet

                     93

                     Viitteet

                     94

               YLEISET PERIAATTEET
         Lisäyksissä esitetään optimaaliset testausprotokollat eri menetelmien ja validoitujen reagenssien osalta sekä testi- ja kontrollimateriaalien valmistusta koskevat tiedot. Lisäyksessä 1 on luettelo niistä laboratorioista, jotka olivat mukana testausprotokollien optimoinnissa ja validoinnissa.
         Koska menettelyt liittyvät karanteenin alaisten organismien toteamiseen ja niissä käytetään R. solanacearum -kasvintuhoojan elinkykyisiä viljelmiä kontrollimateriaaleina, menettelyt on ehdottomasti toteutettava sopivissa karanteenioloissa siten, että käytössä on riittävät jätteenhävitysmahdollisuudet ja toiminta tapahtuu kasvikaranteenista vastaavien viranomaisten myöntämän luvan mukaisissa olosuhteissa.
         Testausparametreilla on varmistettava R. solanacearum -kasvintuhoojan määrien johdonmukainen ja toistettavissa oleva toteaminen valituilla menetelmillä asetetuilla kynnysarvoilla.
         Positiivisten kontrollinäytteiden huolellinen valmistaminen on ehdottoman tärkeää.
         Vaadittujen kynnysarvojen mukainen testaus edellyttää myös laitteiden asianmukaisia asetuksia sekä niiden asianmukaista huoltoa ja vakaamista, reagenssien huolellista käsittelyä ja säilyttämistä sekä kaikkien sellaisten toimenpiteiden toteuttamista, joilla ehkäistään näytteiden välinen kontaminaatio, esim. positiivisten kontrollinäytteiden pitämistä erillään testinäytteistä. Laadunvalvontastandardeja on sovellettava hallinnollisten ja muiden virheiden välttämiseksi, erityisesti pakkausmerkintöjen ja dokumentaation osalta.
         Direktiivin 98/57/EY 4 artiklan 2 kohdassa tarkoitettu epäilty esiintyminen tarkoittaa positiivista tulosta näytteelle jäljempänä olevissa vuokaavioissa esitetyissä määritys- tai seulontatesteissä. Jos ensimmäisen seulontatestin (IF- tai PCR/FISH-testi, selektiivinen eristäminen) tulos on positiivinen, se on vahvistettava toisella seulontatestillä, joka perustuu muihin biologisiin periaatteisiin.
         Jos ensimmäisestä seulontatestistä saadaan positiivinen tulos, näytteen epäillään olevan bakteerin saastuttama ja sille on tehtävä toinen seulontatesti. Jos toisesta seulontatestistä saadaan positiivinen tulos, epäilys varmistuu (epäilty esiintyminen) ja tutkimusmenetelmän mukaista testausta on jatkettava. Jos toisesta seulontatestistä saadaan negatiivinen tulos, näytteen katsotaan olevan puhdas R. solanacearum -bakteerista.
         Direktiivin 98/57/EY 5 artiklan 1 kohdassa tarkoitettu varmistettu esiintyminen tarkoittaa puhtaan R. solanacearum -viljelmän eristämistä ja tunnistamista siten, että sen patogeenisyys on varmistettu.
         I JAKSO
         TUTKIMUSMENETELMÄN SOVELTAMINEN
         1.   Toteamismenetelmä tumman rengasmädän ja bakteerilakastumistaudin (Ralstonia solanacearum) määrittämiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita
         Testimenetelmä on tarkoitettu perunan mukuloille, joiden oireet ovat tyypillisiä tummalle rengasmädälle tai johtosolukon lakastumistaudille taikka antavat aihetta epäillä näitä tauteja. Siihen kuuluu pikaseulontatesti, taudinaiheuttajan eristäminen infektoituneesta johtosolukosta (selektiiviselle) alustalle ja, jos tulos on positiivinen, viljelmän tunnistaminen Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojaksi.

         2.   Menetelmä Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä
         Periaate
         Menettely on tarkoitettu piilevien tartuntojen toteamiseen perunan mukuloissa. Jos erilaisiin biologisiin periaatteisiin perustuvista vähintään kahdesta seulontakokeesta saadaan positiivinen tutkimustulos, 3 sitä täydennetään eristämällä taudinaiheuttaja. Jos eristyskokeen tuloksena saadaan tyypillisiä pesäkkeitä, vuorossa on puhtaan viljelmän varmistaminen R. solanacearum -kasvintuhoojaksi. Positiivinen tulos ainoastaan yhdestä seulontatestistä ei riitä pitämään näytettä epäilyttävänä.
         Seulonta- ja eristystesteillä on saatava toteamisrajaksi 103–104 solua perunauutteen yhtä millilitraa kohden; ne sisältyvät positiivisina kontrollivälineinä kuhunkin testisarjaan.

         3.   Menetelmä Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista

         II JAKSO
         YKSITYISKOHTAISET MENETELMÄT RALSTONIA SOLANACEARUM -KASVINTUHOOJAN TOTEAMISEKSI PERUNAN MUKULOISTA JA PERUNASTA, TOMAATISTA TAI MUUSTA ISÄNTÄKASVISTA, JOSSA ON TUMMAN RENGASMÄDÄN TAI BAKTEERILAKASTUMISTAUDIN OIREITA
         1.   Oireet (ks. www-sivusto osoitteessa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)
         1.1   Oireet perunassa

            Perunakasvi. Tartunnan varhaisvaihe pellolla voidaan tunnistaa lehdistä, jotka nuutuvat kasvin tyvestä alkaen päivällä lämpimällä säällä ja toipuvat yöllä. Nuutumisen alkuvaiheessa lehdet pysyvät vihreinä, mutta myöhemmin ne kellastuvat ja niihin kehittyy ruskea nekroosi. Myös epinastiaa esiintyy. Yhden verson tai koko kasvin nuutuminen jää nopeasti pysyväksi ja johtaa kasvin kollapsiin ja kuolemaan. Nuutuneiden kasvien varsien johtosolukko muuttuu poikkileikkauksesta tarkasteltuna tavallisesti ruskeaksi, ja maitomaista bakteerimätää valuu leikatulta pinnalta tai sitä voidaan pusertaa ulos. Kun leikattu varsi asetetaan veteen, johtosolukkokimpuista valuu limaa.

            Perunan mukula. Perunan mukulat leikataan halki maavarren kiinnityskohdan läheltä tai poikkisuuntaan kiinnityskohdan yli. Tartunnan varhaisvaihe ilmenee lasimaisena, keltaisesta vaaleanruskeaan vaihtelevana värityksenä johtosolukkorenkaassa, josta muutaman minuutin kuluttua pursuaa itsestään vaaleankeltaista bakteerimätää. Myöhemmin johtojänteiden väritys muuttuu selvemmin ruskeaksi ja nekroosi voi laajeta tylppysolukkoon. Myöhemmässä vaiheessa tartunta leviää maavarren kiinnityskohdasta ja mukulan silmistä, ja näistä vuotaa bakteerimätää, johon kiinnittyy maahiukkasia. Kuoreen voi tulla punaruskeita hieman painuneita vioittumia, kun sisäiset johtosolukot painuvat kasaan. Taudin myöhemmissä vaiheissa esiintyy yleisesti sekundaarista sieni- ja bakteerimätää.
         1.2   Oireet tomaatissa

            Tomaattikasvi. Ensimmäinen näkyvä oire on nuorimpien lehtien velttous. Taudinaiheuttajalle suotuisissa ympäristöolosuhteissa (maaperän lämpötila noin 25 °C, kyllästyskosteus) on seurauksena muutaman päivän kuluessa epinastia ja kasvin yhden puolen tai koko kasvin nuutuminen, mikä johtaa koko kasvin kollapsiin. Vähemmän suotuisissa olosuhteissa (maaperän lämpötila alle 21 °C) nuutumista esiintyy vähemmän, mutta varteen saattaa kehittyä suuri määrä versojuuria. Varressa voidaan havaita varren alaosasta lähteviä vettyneitä juovia, jotka ovat osoitus johtojärjestelmän nekroosista. Jos varsi leikataan poikittaissuunnassa, varren värittyneistä ruskeista johtosolukoista tihkuu valkoista tai kellertävää bakteerimätää.
         1.3   Oireet muissa isäntäkasveissa

            Solanum dulcamara- ja S. nigrum -kasvit. Luonnonoloissa nuutumista esiintyy äärimmäisen harvoin näissä isäntinä toimivissa rikkakasveissa, ellei maaperän lämpötila ylitä 25 °C tai elleivät inokulaattitasot ole äärimmäisen korkeita (esim. S. nigrum, joka kasvaa saastuneiden peruna- tai tomaattikasvien vierellä). Jos nuutumista esiintyy, oireet vastaavat tomaatin yhteydessä kuvattuja oireita. Nuutumattomissa S. dulcamara -kasveissa, joiden varret ja juuret kasvavat vedessä, voi ilmetä johtosolukon sisäistä vaaleanruskeaa värinmuutosta varren alaosan tai varren vedenalaisen osan poikkileikkauksessa. Vaikka nuutumisoireita ei olisikaan, bakteereja voi tihkua johtosolukosta tai ne voivat muodostaa limanauhoja, jos leikattu varsi asetetaan pystysuoraan veteen.
         2.   Pikaseulontatestit
         Pikaseulontatestit helpottavat alustavaa taudinmääritystä, mutta ne eivät ole välttämättömiä. Käytetään yhtä tai useampaa seuraavista validoiduista testeistä:
         2.1   Valutuskoe
         (Ks. VI jakson A kohdan 1 alakohta)
         2.2   Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen
         Tyypilliset PHB-rakeet R. solanacearum -bakteerin soluissa saadaan näkyviin värjäämällä saastuneesta solukosta otetusta bakteerimädästä lämpökäsittelyllä kiinnitetyt preparaatit niilinsinisellä A tai sudaninmustalla (ks. VI jakson A kohdan 2 alakohta).
         2.3   Serologiset agglutinaatiokokeet
         (Ks. VI jakson A kohdan 3 alakohta)
         2.4   Muut testit
         Muita soveltuvia pikaseulontatestejä ovat IF-testi (ks. VI jakson A kohdan 5 alakohta), FISH-testi (ks. VI jakson A kohdan 7 alakohta), ELISA-testit (ks. VI jakson A kohdan 8 alakohta) ja PCR-testit (ks. VI jakson A kohdan 6 alakohta).
         3.   Eristämismenettely

                     a)

                     Otetaan bakteerilimaa tai värittyneen solukon pala mukulan johtosolukkorenkaasta tai perunan tai tomaatin tai muun nuutuvan isäntäkasvin varren johtojänteistä. Suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua vettä tai 50 mM fosfaattipuskuriin (lisäys 4). Jätetään liuos 5–10 minuutiksi.

                     b)

                     Valmistetaan suspensiosta kymmenkertaisten laimennosten sarja.

                     c)

                     Siirretään 50–100 µl suspensiota ja laimennoksia tavalliselle ravintoalustalle (NA, YPGA tai SPA; ks. lisäys 2) ja/tai Kelmanin tetratsoliumalustalle (lisäys 2) ja/tai validoidulle selektiiviselle alustalle (esim. SMSA; ks. lisäys 2). Levitetään tai sivellään maljalle tarkoituksenmukaista laimennussarjatekniikkaa käyttäen. Tarvittaessa valmistetaan erillisiä maljoja, joissa on laimennettua R. solanacearum biovaria 2 -solususpensioviljelmää positiivisena kontrollina.

                     d)

                     Inkuboidaan maljoja 2–6 päivän ajan 28 °C:ssa.

                                 —

                                 Tavallisella ravintoalustalla elinvoimaiset R. solanacearum -bakteerin isolaatit kehittyvät kermanvalkoisiksi, litteiksi, epäsäännöllisen muotoisiksi ja juokseviksi pesäkkeiksi, jotka ovat usein keskeltä tyypillisesti kierteisiä. Tautia aiheuttamattomat R. solanacearum -bakteerin muodot kehittävät pieniä, pyöreitä, voimaisia ja kokonaisuudessaan kermanvalkoisia pesäkkeitä, jotka eivät ole juoksevia.

                                 —

                                 Kelmanin tetratsolium- ja SMSA-alustalla kierteet ovat väriltään verenpunaisia. Tautia aiheuttamattomat Ralstonia solanacearum -bakteerin muodot kehittävät pieniä, pyöreitä, voimaisia ja kokonaisuudessaan syvänpunaisia pesäkkeitä, jotka eivät juoksevia.

               4.   R. solanacearum -kasvintuhoojan tunnistustestit
         Testit, joilla vahvistetaan oletettujen R. solanacearum -isolaattien tunnistus, esitetään VI jakson B kohdassa.
         III JAKSO
         1.   Yksityiskohtaiset menetelmät Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä
         1.1   Näytteiden valmistelu
         Huomautus:

                     —

                     Standardinäytekoko on 200 mukulaa testiä kohden. Laajempi näytteenotto edellyttää useampia testejä tämänkokoisille näytteille. Jos näytteessä on enemmän kuin 200 mukulaa, tulokset saattavat jäädä saamatta tai niitä on vaikea tulkita. Menettelyä voidaan kuitenkin hyvin käyttää alle 200 mukulan näytteisiin, jos 200:aa mukulaa ei ole käytettävissä.

                     —

                     Kaikkien jäljempänä kuvattujen toteamismenetelmien validointi perustuu 200 mukulan suuruisen näytteen testaamiseen.

                     —

                        Jäljempänä kuvattua perunauutetta voidaan käyttää myös perunan vaaleaa rengasmätää aiheuttavan Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -bakteerin toteamiseen.

               Näytteiden valmistamista edeltävät vapaavalintaiset esikäsittelyt:

                     a)

                     Inkuboidaan näytteitä 25–30 °C:ssa enintään 2 viikon ajan ennen testausta mahdollisten R. solanacearum -populaatioiden lisääntymisen helpottamiseksi.

                     b)

                     Pestään mukulat. Kunkin näytteen jälkeen käytetään tarkoituksenmukaisia desinfiointiaineita (tehtäessä PCR-testi on käytettävä klooriyhdisteitä patogeenisen DNA:n poistamiseksi) ja puhdistusaineita. Ilmakuivataan mukulat. Pesumenettelystä on erityistä hyötyä (vaikkakaan sitä ei vaadita), jos näytteissä on paljon ylimääräistä multaa ja jos PCR-testi tai suora eristysmenettely toteutetaan.

               1.1.1   Poistetaan puhtaalla ja desinfioidulla leikkausveitsellä tai vihannesveitsellä kuori mukulan napapäästä siten, että johtosolukot tulevat näkyviin. Leikataan varovasti pieni kartionmuotoinen kappale johtosolukosta kunkin mukulan napapäästä ja yritetään pitää muun solukon kuin johtosolukon osuus mahdollisimman pienenä (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

            Huomautus: Laitetaan sivuun jokainen (pilaantunut) mukula, jossa on tummaksi rengasmädäksi epäiltyjä oireita, ja testataan yksittäin.
         Jos napapään irrottamisen aikana havaitaan tummaksi rengasmädäksi epäiltyjä oireita, mukula olisi tutkittava silmämääräisesti ja lohkaistava läheltä napapäätä. Lohkaistuja mukuloita, joissa on epäilyttäviä oireita, olisi säilytettävä vähintään 2 vuorokautta huoneenlämmössä korkkiutumisen mahdollistamiseksi, minkä jälkeen mukula säilytetään jäähdytettynä (4–10 °C:ssa) asianmukaisissa karanteenioloissa. Kaikki mukulat (myös ne, joissa on epäilyttäviä oireita) olisi säilytettävä liitteen III mukaisesti.
         1.1.2   Kerätään napapääkappaleet käyttämättömiin kertakäyttöisiin säilytysastioihin, jotka voidaan sulkea ja/tai sinetöidä (jos astioita käytetään uudelleen, ne olisi puhdistettava perusteellisesti ja desinfioitava klooriyhdisteillä). Kappaleet olisi mieluiten käsiteltävä viipymättä. Jos tämä ei ole mahdollista, niitä voidaan säilyttää astiassa – lisäämättä puskuriliuosta – jäähdytettyinä enintään 72 tunnin ajan tai huoneenlämmössä enintään 24 tunnin ajan.
         Käsitellään napapääkappaleet yhtä seuraavista menettelyistä noudattaen: joko

                     a)

                     peitetään kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan tasoravistimella (50–100 rpm:n kierrosnopeudella) neljän tunnin ajan alle 24 °C:ssa tai 16–24 tunnin ajan jäähdytettyinä;
                     tai

                     b)

                     homogenoidaan kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) joko sekoittimella (esim. Waring tai Ultra Turrax) tai murskaamalla suljetussa kertakäyttöisessä liotepussissa (esim. luja Stomacher- tai Bioreba-polyeteenipussi, jonka mitat ovat 150 mm × 250 mm, säteilysteriili) käyttäen kumivasaraa tai sopivaa jauhamisvälinettä (esim. Homex).

            Huomautus: Näytteiden ristikontaminaation riski on suuri silloin, kun näytteet homogenoidaan sekoittimella. On ryhdyttävä varotoimiin roiskumisen tai läikkymisen välttämiseksi uuttamisprosessin aikana. On varmistettava, että jokaista näytettä varten käytetään vasta steriloituja sekoittimen lapoja ja astioita. Jos aiotaan tehdä PCR-testi, on vältettävä DNA:n siirtyminen astioihin tai jauhamislaitteisiin. Tehtäessä PCR-testi on suositeltavaa suorittaa murskaaminen kertakäyttöisissä pusseissa ja käyttää kertakäyttöisiä putkia.
         1.1.3   Dekantoidaan supernatantti. Jos liuos on liian sameaa, sitä kirkastetaan joko hitaasti sentrifugoiden (enintään 180 g kymmenen minuutin ajan 4–10 °C:n lämpötilassa) tai suodatetaan liuos (40–100 µm:n huokoskoon vakuumisuodatusjärjestelmällä) ja pestään suodatin vielä uuttopuskurilla (~10 ml).
         1.1.4   Konsentroidaan bakteerifraktio sentrifugoimalla 7 000 g 15 minuutin ajan (tai 10 000 g 10 minuutin ajan) 4–10 °C:n lämpötilassa ja poistetaan supernatantti sakkaa sekoittamatta.
         1.1.5   Suspendoidaan sakka uudelleen 1,5 ml:aan sakkapuskuria (lisäys 4). Käytetään 500 µl:aa R. solanacearum -bakteerin testaamiseksi, 500 µl:aa Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -bakteerin testaamiseksi ja 500 µl:aa vertailutarkoituksiin. Lisätään 10–25 % (v/v) steriiliä glyserolia 500 µl:aan vertailuarvona olevaan määräosaan ja jäljellä olevaan testimääräosaan, sekoitetaan ja varastoidaan –16––24 °C:n lämpötilaan (viikoiksi) tai –68––86 °C:n lämpötilaan (kuukausiksi). Säilytetään testimääräosat 4–10 °C:ssa testauksen ajan.
         Toistuva jäädytys ja sulatus ei ole suositeltavaa.
         Jos uutetta joudutaan kuljettamaan, toimitus on tehtävä kylmälaukussa 24–48 tunnin kuluessa.
         1.1.6   Saastunnan välttämiseksi on ehdottoman tärkeää käsitellä näytteet ja R. solanacearum -positiiviset vertailu-, kontrolli- ja valvontanäytteet toisistaan erillään. Tämä koskee sekä immunofluoresenssitestiä että kaikkia muitakin testejä.
         1.2   Testaus
         Ks. vuokaavio ja testien kuvaus sekä optimoidut protokollat niitä käsittelevissä lisäyksissä:

                        Eristäminen selektiivisellä alustalla (ks. VI jakson A kohdan 4 alakohta)

                        IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta)

                        PCR-testi (VI jakson A kohdan 6 alakohta)

                        FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta)

                        ELISA-testi (VI jakson A kohdan 8 alakohta)

                        Biologinen määritys (VI jakson A kohdan 9 alakohta).

               2.   Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista
         2.1   Näytteiden valmistelu

            Huomautus: Piilevien R. solanacearum -kantojen toteamiseksi on suositeltavaa käyttää kokoomanäytteitä. Menettelyä voidaan vaivatta käyttää jopa 200:n varresta otetun osan muodostamiin kokoomanäytteisiin. Jos tehdään tutkimuksia, niiden olisi perustuttava tilastollisesti edustavaan otokseen tutkittavana olevasta kasvipopulaatiosta.
         2.1.1   Kerätään 1–2 cm:n kokoiset varren palaset suljettavaan steriiliin astiaan seuraavien näytteenottomenetelmien mukaisesti:

            Tomaatin taimet taimitarhalla: Poistetaan desinfioiduilla leikkausveitsellä 1 cm:n palanen kunkin varren alaosasta juuri maanpinnan yläpuolelta.

            Pellolla tai kasvihuoneessa kasvatetut tomaattikasvit: Puhtaalla ja desinfioidulla veitsellä poistetaan kustakin kasvista alin sivuverso leikkaamalla juuri verson ja kasvin päävarren liitoskohdan yläpuolelta. Poistetaan alin 1 cm:n osa kustakin sivuversosta.

            Muut isäntäkasvit: Poistetaan desinfioiduilla leikkausveitsellä tai oksasaksilla 1 cm:n palanen kunkin varren alaosasta juuri maanpinnan yläpuolelta. Jos kyseessä on S. dulcamara tai muu vedessä kasvava isäntäkasvi, poistetaan 1–2 cm:n osia vedenalaisesta varresta tai rönsystä, jossa on vesijuuria.
         Kun näytteitä otetaan jostakin tietystä paikasta, on suositeltavaa testata tilastollisesti edustava näyte, jossa on vähintään 10 potentiaalista isäntärikkakasvia kustakin näytteenottopaikasta. Taudinaiheuttaja voidaan luotettavimmin havaita loppukeväästä, kesällä ja syksyllä, vaikka luonnossa voidaankin havaita tartuntoja läpi vuoden vesistöissä kasvavissa monivuotisissa Solanum dulcamara -kasveissa. Tunnettuja isäntäkasveja ovat ylivuotiset perunakasvit, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium ja muut Solanaceae-heimon jäsenet. Muita isäntäkasveja ovat Pelargonium spp. ja Portulaca oleracea. Muita eurooppalaisia rikkakasvilajikkeita, joiden juurissa ja/tai ritsosfäärissä (juurten ympäristössä) voidaan tietyissä ympäristöoloissa tavata R. solanacearum biovarin 2 rodun 3 populaatioita, ovat Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra ja Urtica dioica.

            Huomautus: Kasveja voidaan tässä vaiheessa tarkastella silmämääräisesti sisäisten oireiden varalta (johtosolukon värjäytyminen tai bakteerimätä. Laitetaan sivuun kaikki varren osat, joissa on oireita, ja testataan erikseen (ks. II jakso).
         2.1.2   Desinfioidaan varren osat pikaisesti 70-prosenttisella etanolilla ja kuivataan välittömästi paperipyyhkeeseen taputtamalla. Käsitellään tämän jälkeen varren palaset yhtä seuraavista menettelyistä noudattaen: joko

                     a)

                     peitetään kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan tasoravistimella (50–100 rpm:n kierrosnopeudella) neljän tunnin ajan alle 24 °C:ssa tai 16–24 tunnin ajan jäähdytettyinä; tai

                     b)

                     käsitellään välittömästi jauhamalla palaset lujassa pussissa (esim. Stomacher tai Bioreba) siten, että siinä on sopiva määrä uuttopuskuria (lisäys 4), käyttäen kumivasaraa tai sopivaa jauhamisvälinettä (esim. Homex). Jos tämä ei ole mahdollista, varastoidaan varren palaset jäähdytettyinä enintään 72 tunnin ajan tai huoneenlämmössä enintään 24 tunnin ajan.

               2.1.3   Dekantoidaan supernatantti, kun seos on saanut seistä 15 minuuttia.
         2.1.4   Uutteen kirkastaminen lisää tai bakteerifraktion konsentrointi ei yleensä ole tarpeen mutta voidaan tehdä suodattamalla ja/tai sentrifugoimalla, kuten III jakson 1.1.3–1.1.5 kohdassa kuvataan.
         2.1.5   Jaetaan laimentamaton tai konsentroitu näyteuute kahteen yhtä suureen osaan. Pidetään toista osaa 4–10 °C:n lämpötilassa testauksen ajan ja varastoidaan toinen puolisko 10–25 %:ssa (v/v) steriilissä glyserolissa –16––24 °C:n lämpötilaan (viikoiksi) tai –68––86 °C:n lämpötilaan (kuukaudeksi), mikäli lisätestaus on tarpeen.
         2.2   Testaus
         Ks. vuokaavio ja testien kuvaus sekä optimoidut protokollat niitä käsittelevissä lisäyksissä:

                        Eristäminen selektiivisellä alustalla (ks. VI jakson A kohdan 4 alakohta)

                        IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta)

                        PCR-testi (VI jakson A kohdan 6 alakohta)

                        FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta)

                        ELISA-testi (VI jakson A kohdan 8 alakohta)

                        Biologinen määritys (VI jakson A kohdan 9 alakohta).

               IV JAKSO
         1.   Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä

         2.   Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä
         Periaate
         Tässä jaksossa kuvattavaa validoitua toteamismenettelyä sovelletaan taudinaiheuttajan havaitsemiseksi pintavesinäytteistä, ja sitä voidaan soveltaa myös perunanjalostuksessa syntyvien tai muiden jätevesien näytteiden testaamiseen. On kuitenkin huomattava, että odotettu havaitsemisherkkyys vaihtelee substraatin mukaisesti. Eristystestin herkkyyteen vaikuttavat kilpailevien saprofyyttisten bakteerien populaatiot, jotka ovat yleensä huomattavasti suurempia perunanjalostuksen jätevesissä ja muissa jätevesissä kuin pintavedessä. Vaikka jäljempänä kuvattavalla menettelyllä odotetaan havaittavan niinkin pieniä pitoisuuksia kuin 103 solua litraa kohden, havaitsemisherkkyys on todennäköisesti merkittävästi pienempi, kun kyseessä ovat perunanjalostuksen jätevedet tai muut jätevedet. Tämän vuoksi suositellaan, että jätevedet testataan mahdollisten puhdistuskäsittelyiden (esim. sedimentointi tai suodatus) jälkeen, jolloin saprofyyttisten bakteereiden populaatiot ovat pienempiä. Testimenettelyn herkkyyteen liittyvät rajoitukset on pidettävä mielessä, kun arvioidaan mahdollisesti saatujen negatiivisten tulosten luotettavuutta. Vaikka tätä menettelyä on onnistuneesti käytetty tutkimustyössä, jolla on pyritty määrittämään taudinaiheuttajan esiintyminen pintavedessä, menettelyn rajoitukset on tunnettava, jos sitä käytetään vastaaviin tutkimuksiin, jotka koskevat perunanjalostuksessa syntyviä jätevesiä tai muita jätevesiä.
         2.1   Näytteiden valmistelu
         Huomautus:

                     —

                        R. solanacearum havaitaan pintavedestä luotettavimmin loppukeväästä, kesällä tai syksyllä, kun veden lämpötila on yli 15 °C.

                     —

                     Toistamalla näytteenotto määritetyistä näytteenottopaikoista eri aikoina edellä kuvatun kauden aikana voidaan vähentää ilmastollisten vaihteluiden vaikutuksia ja näin parantaa havaitsemisluotettavuutta.

                     —

                     Runsaiden sateiden ja vesistön maantieteellisen muodon vaikutus on otettava huomioon, jotta voidaan välttää laajan laimentumisen vaikutukset, jotka voisivat kätkeä taudinaiheuttajan esiintymisen.

                     —

                     Pintavesinäytteitä otetaan isäntäkasvien läheisyydestä, jos näitä kasveja esiintyy.

               2.1.1   Vesinäytteet kerätään valikoiduista näytteenottopaikoista täyttämällä kertakäyttöiset steriilit putket tai pullot yli 30 cm syvyydessä ja enintään 2 m etäisyydellä rannasta, jos mahdollista. Jalostus- ja jätevesinäytteet kerätään jäteveden laskupaikalta. Suositeltava näytekoko on enintään 500 ml näytteenottopaikkaa kohden. Jos halutaan käyttää pienempiä näytteitä, on suositeltavaa ottaa näytteitä vähintään kolmesti kustakin näytteenottopaikasta ja siten, että kukin näyte koostuu kahdesta samanlaisesta vähintään 30 ml:n osanäytteestä. Intensiivistä tutkimustyötä varten valitaan vähintään 3 näytteenottopaikkaa 3 vesistökilometriä kohden ja varmistetaan, että myös vesistöön laskevista sivujoista ja -puroista otetaan näytteet.
         2.1.2   Näytteet kuljetetaan pimeässä ja viileässä (4–10 °C) ja testataan 24 tunnin kuluessa.
         2.1.3   Bakteerifraktio voidaan tarvittaessa konsentroida jollakin seuraavista menetelmistä:

                     a)

                     Sentrifugoidaan 30–50 ml:n osanäytteitä 10 000 g:ssa 10 minuutin ajan (tai 7 000 g:ssa 15 minuutin ajan) mieluiten 4–10 °C:ssa, poistetaan supernatantti ja suspendoidaan pelletti uudelleen 1 ml:aan pellettipuskuria (lisäys 4).

                     b)

                     Kalvosuodatus (vähimmäishuokoskoko 0,45 µm), minkä jälkeen pestään suodatin 5–10 ml:ssa pellettipuskuria ja säilytetään pesuliuos. Tämä menetelmä soveltuu suurille vesimäärille, jotka sisältävät vähäisiä määriä saprofyyttejä.

               Konsentrointia ei yleensä suositella perunan jalostuksessa syntyvän jäteveden tai muun jäteveden näytteille, koska kilpailevien saprofyyttisten bakteereiden populaatioiden kasvu estää Ralstonia solanacearum -bakteerien havaitsemisen.
         2.2   Testaus
         Ks. vuokaavio ja testien kuvaus niitä käsittelevissä lisäyksissä.
         V JAKSO
         1.   Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä

         2.   Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä
         Periaatteet
         Tässä jaksossa kuvattavaa validoitua toteamismenettelyä sovelletaan taudinaiheuttajan havaitsemiseksi maaperänäytteissä, mutta sitä voidaan soveltaa myös perunan jalostuksessa syntyvän kiinteän jätteen tai viemärilietteen näytteiden testaamiseen. On kuitenkin huomattava, että nämä menetelmät eivät ole riittävän herkkiä sen takaamiseksi, että sillä havaittaisiin pienet ja/tai epätasaisesti jakautuneet Ralstonia solanacearum -populaatiot, joita voi esiintyä näistä substraateista saaduissa luonnollisesti saastuneissa näytteissä.
         Tämän testimenettelyn herkkyyden asettamat rajoitukset olisi otettava huomioon, kun arvioidaan mahdollisesti saatujen negatiivisten tulosten luotettavuutta sekä silloin kun menettelyä käytetään tutkimuksissa, joilla pyritään määrittämään taudinaiheuttajan esiintyminen maaperässä tai lietteessä. Luotettavin testi taudinaiheuttajan toteamiseksi maaperästä on se, että istutetaan taudille altis kasvi ja seurataan, saako se tartunnan. Tälläkään menetelmällä ei tosin havaita alhaisia saastumistasoja.
         2.1   Näytteiden valmistelu
         2.1.1   Näytteenotto peltomaasta tehdään sukkulamatojen varalta tehtävässä näytteenotossa käytettävien yleisten periaatteiden mukaisesti. Kerätään 0,5–1 kg maata näytettä kohden 10–20 cm syvyydeltä siten, että näytteenottopaikkoja on 60 jokaista 0,3 ha kohden (tai ruudukosta, joka on 7 × 7 m). Jos taudinaiheuttajaa epäillään esiintyvän, keruupisteiden määrä nostetaan 120:een 0,3 ha kohden. Näytteet säilytettään 12–15 °C:ssa ennen testausta. Näytteet perunoiden jalostuksen jätelietteestä ja viemärilietteestä otetaan keräämällä yhteensä 1 kg paikoista, jotka edustavat tutkittavan lietteen kokonaismäärää. Näytteet sekoitetaan hyvin ennen testaamista.
         2.1.2   Hajotetaan maaperästä tai lietteestä otetut 10–25 g:n osanäytteet tasoravistimella (250 rpm) 60–150 ml:aan uuttopuskuria (lisäys 4) enintään 2 tunnin ajan. Dispersiota voidaan tarvittaessa auttaa lisäämällä 0,02 % steriiliä Tween-20:tä ja 10–20 g steriiliä soraa.
         2.1.3   Suspensio pidetään 4 °C:ssa testauksen aikana.
         2.2   Testaus
         Ks. vuokaavio ja testien kuvaus niitä käsittelevissä lisäyksissä.
         VI JAKSO
         OPTIMOIDUT PROTOKOLLAT R. SOLANACEARUM -KASVINTUHOOJAN TOTEAMISEKSI JA TUNNISTAMISEKSI
         A)   Määritys- ja toteamistestit
         1.   Valutuskoe

            R. solanacearum -bakteerin esiintyminen nuutuvissa perunan, tomaatin tai muun isäntäkasvin varsissa voidaan osoittaa seuraavan yksinkertaisen ennakoivan testin avulla: Leikataan varsi aivan maanpinnan yläpuolelta. Suspendoidaan leikkuupinta putkelliseen puhdasta vettä. Seurataan, alkaako leikatuista johtosolukimpuista muutaman minuutin kuluttua spontaanisti valua bakteerilimarihmoja.
         2.   Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen

                     1.

                     Valmistetaan mikroskooppilevylle preparaatti saastuneesta solukosta saadusta bakteerimädästä tai 48 tunnin viljelmästä YPGA- tai SPA-alustalla (lisäys 2).

                     2.

                     Valmistetaan positiiviset kontrollipreparaatit R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 kannasta ja negatiivinen kontrollipreparaatti tunnetusti PHB-negatiivisesta lajista, jos tämä katsotaan hyödylliseksi.

                     3.

                     Annetaan kuivua ja kuljetetaan kunkin levyn pohjaa nopeasti liekin yllä preparaattien kiinnittämiseksi.

                     4.

                     Värjätään preparaatti joko niilinsinisellä tai sudaninmustalla ja tutkitaan sitä mikroskoopilla seuraavasti:

               Niilinsinisellä tehtävä testi

                     a)

                     Peitetään kukin preparaatti niilinsinisen A 1-prosenttisella vesiliuoksella. Inkuboidaan 10 minuuttia 55 °C:ssa.

                     b)

                     Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

                     c)

                     Peitetään preparaatti 8-prosenttisella etikkahapon vesiliuoksella ja annetaan inkuboitua 1 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa.

                     d)

                     Pestään nopeasti vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

                     e)

                     Kostutetaan uudelleen pisaralla vettä. Asetetaan peitelasi.

                     f)

                     Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, aallonpituudella 450 nm öljy- tai vesi-immersio-objektiivin 600–1 000-kertaisella suurennoksella.

                     g)

                     Seurataan, esiintyykö PHB-rakeiden kirkkaan oranssia fluoresenssia. Tarkastellaan myös tavanomaisessa valaistuksessa sen varmistamiseksi, että rakeet ovat solunsisäisiä ja että solujen morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille.

               Sudaninmustalla tehtävä testi

                     a)

                     Peitetään kukin preparaatti sudaninmustan B 0,3-prosenttisella 70-prosenttisessa etanolissa olevalla liuoksella. Inkuboidaan 10 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa.

                     b)

                     Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

                     c)

                     Kastetaan levyt pikaisesti ksyloliin. Taputellaan kuivaksi paperipyyhkeellä. Varoitus: Ksyloli on haitallinen aine. Tarvittaviin varotoimiin on ryhdyttävä. Työskennellään vetokaapissa.

                     d)

                     Peitetään levyt 0,5-prosenttisella (w/v) safraniinin vesiliuoksella ja jätetään 10 sekunniksi laboratoriolämpötilaan. Varoitus: Safraniini on haitallinen tuote. Tarvittaviin varotoimiin on ryhdyttävä. Työskennellään vetokaapissa.

                     e)

                     Pestään vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Kuivataan paperipyyhkeellä ja asetetaan peitelasi.

                     f)

                     Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia valomikroskoopilla öljyimmersio-objektiivin 1 000-kertaisella suurennoksella.

                     g)

                        R. solanacearum -bakteerin solujen PHB-rakeet värjäytyvät sinimustiksi ja soluseinät vaaleanpunaisiksi.

               3.   Serologiset agglutinaatiokokeet
         Bakteerimädässä tai oireilevassa kudoksessa olevien R. solanacearum -solujen agglutinaatio voidaan havaita parhaiten käyttämällä validoituja vasta-aineita (ks. lisäys 3), jotka on leimattu soveltuvilla värimarkkereilla, kuten punaisilla Staphylococcus aureus -soluilla tai värillisillä lateksihiukkasilla. Jos käytetään kaupallista testisarjaa (ks. lisäys 3), on noudatettava valmistajan ohjeita. Muussa tapauksessa toimitaan seuraavan menettelyn mukaisesti:

                     a)

                     Sekoitetaan leimatun vasta-aineen suspensiota ja bakteerimätää pisaroina (noin 5 µl kumpaakin) monisyvennyslevyjen syvennyksissä.

                     b)

                     Valmistetaan positiivinen ja negatiivinen kontrolli käyttämällä R. solanacearum biovarin 2 suspensiota ja heterologista kantaa.

                     c)

                     Positiivissa näytteissä voidaan havaita agglutinaatio, kun niitä on kevyesti sekoitettu 15 sekunnin ajan.

               4.   Eristäminen selektiivisellä alustalla
         4.1   Valikoiva maljaus

            Huomautus: Ennen kuin tätä menetelmää käytetään ensimmäisen kerran, on suoritettava alustavia testejä, jolla varmistetaan, että aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä muodostavat yksiköt (103–104/ml) voidaan todeta. Testi on voitava toistaa.
         Käytetään asiamukaisesti validoitua selektiivistä alustaa, esim. SMSA:ta (sellaisena kuin se muutettuna Elphinstone et al., 1996; ks. lisäys 2).

            R. solanacearum -bakteerin erottaminen muista alustalla mahdollisesti kehittyvistä bakteereista edellyttää huolellisuutta. R. solanacearum -pesäkkeet voivat lisäksi olla morfologialtaan epätyypillisiä, jos alustalla on liian suuri populaatio tai jos myös antagonistisia bakteereita esiintyy. Jos epäillään kilpailua tai antagonismia, näyte olisi testattava uudestaan eri testiä käyttäen.
         Tämän menetelmän tunnistamisherkkyys on suurin, kun käytetään vasta valmistettuja näyteuutteita. Menetelmää voidaan kuitenkin käyttää myös silloin, kun uutteita on säilytetty glyserolissa –68––86 °C:ssa.
         Positiivisiksi kontrolleiksi valmistetaan kymmenkertaiset laimennokset suspensiosta, jossa on 106 PMY/ml R. solanacearum -bakteerin virulenttia biovari 2 -kantaa (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Mahdollisen kontaminaation välttämiseksi positiiviset kontrollit on valmistettava täysin erillään testinäytteistä.
         Ennen kuin vasta valmistettua selektiivisen alustan erää käytetään rutiininäytteiden testaamiseen, olisi testattava sen soveltuvuus taudinaiheuttajan kasvattamiseen.
         Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).
         4.1.1   Käytetään tarkoituksenmukaista laimennussarjatekniikkaa, jolla pyritään varmistamaan, että mahdolliset taustalla olevat saprofyyttiset pesäkkeitä muodostavat populaatiot laimentuvat pois. Levitetään levyä kohden 50–100 µl näyteuutetta ja kutakin laimennosta.
         4.1.2   Inkuboidaan levyjä 28 °C:n lämpötilassa. Tarkastellaan levyjä 48 tunnin kuluttua ja tämän jälkeen päivittäin kuuden päivän ajan. Tyypilliset R. solanacearum -pesäkkeet SMSA-alustalla ovat maidonvalkoisia, litteitä, epäsäännöllisiä ja juoksevia, ja kolmen päivän inkubaation jälkeen niiden keskustaan kehittyy vaaleanpunaisesta verenpunaiseen vaihtelevaa väritystä, johon liittyy sisäinen raidoitus tai kierteet. (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

            Huomautus: Tällä alustalla muodostuu joskus epätyypillisiä R. solanacearum -pesäkkeitä. Nämä voivat olla pieniä, pyöreitä, täysin punaisia ja ei-juoksevia tai ainoastaan osittain juoksevia. Tämän vuoksi niitä on vaikeaa erottaa saprofyyttisista pesäkkeitä muodostavista bakteereista.
         4.1.3   Puhdistetaan oletetut R. solanacearum -pesäkkeet sen jälkeen, kun ne on sivelty tai laimennettu tavanomaiselle ravintoalustalle eristettyjen pesäkkeiden saamiseksi (ks. lisäys 2).
         4.1.4   Viljelmiä säilytetään lyhyen aikaa steriilissä vedessä (pH 6–8, klooriton) huoneenlämmössä ja pimeässä tai pidemmän aikaa soveltuvassa kylmäsuojaavassa alustassa –68––86 °C:ssa tai ne lyofilisoidaan.
         4.1.5   Tunnistetaan oletetut viljelmät (ks. VI jakson B kohta) ja tehdään patogeenisyystesti (ks. VI jakson C kohta).
         Laimennussarjatestin tulosten tulkinta
         Laimennussarjatesti on negatiivinen, jos yhtään pesäkettä ei ole havaittu kuuden päivän jälkeen tai jos yhtään R. solanacearum -bakteerille tyypillistä pesäkettä ei löydetä edellyttäen, että ei epäillä muiden bakteerien kilpailevaa tai estävää vaikutusta ja että R. solanacearum -bakteerin tyypillisiä pesäkkeitä löytyy positiivisesta kontrollista.
         Laimennussarjatesti on positiivinen, jos oletettuja R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä eristetään.
         4.2   Rikastusmenettely

            Käytetään validoitua rikastusalustaa kuten muutettua Wilbrinkin lientä (ks. lisäys 2).

            Tällä menettelyllä voidaan valikoivasti kasvattaa R. solanacearum -populaatioita näyteuutteissa ja lisätä toteamisherkkyyttä. Menettely laimentaa myös tehokkaasti PCR-reaktion inhibiittoreita (1:100). On kuitenkin huomattava, että R. solanacearum -bakteerin rikastaminen voi epäonnistua saprofyyttisten organismien kilpailun tai estovaikutuksen vuoksi, sillä nämä rikastuvat usein samanaikaisesti. R. solanacearum -bakteerin eristäminen rikastetuista liemiviljelmistä voi tämän vuoksi olla vaikeaa. Koska serologisesti samankaltaisten saprofyyttien populaatiot voivat kasvaa, suositellaan spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttämistä polyklonaalisten vasta-aineiden sijaan, kun käytetään ELISA-testiä.

         4.2.1   Rikastus-PCR:ää varten siirretään 100 µl näyteuutetta 10 ml:aan rikastuslientä (lisäys 2), joka on aiemmin jaettu DNA-vapaisiin putkiin tai pulloihin. Rikastus-ELISAa varten näyteuutteen suhde liemeen voi olla suurempi (esim. 100 µl 1,0 ml:ssa rikastuslientä).
         4.2.2   Inkuboidaan 72 tuntia 27–30 °C:ssa ravisteltavassa viljelmässä tai staattisessa viljelmässä siten, että korkit ovat löysällä ilmanvaihdon turvaamiseksi.
         4.2.3   Sekoitetaan hyvin ennen ELISA- tai PCR-testeihin käyttämistä.
         4.2.4   Rikastuslientä käytetään edellä mainituissa testeissä samoin kuin näytteitäkin.

            Huomautus: Jos epäillään, että R. solanacearum -bakteerin rikastaminen voi estyä tiettyjen kilpailevien saprofyyttisten bakteerien suurten populaatioiden vuoksi, parempia tuloksia voidaan saada rikastamalla näyteuutteita ennen sentrifugointia tai muuta konsentrointivaihetta.
         5.   Immunofluoresenssitesti (IF)
         Periaate
         IF-testin käyttö pääasiallisena seulontatestinä on suositeltavaa, koska se on todistetusti riittävän herkkä vaadittavien kynnysarvojen saavuttamiseksi.
         Kun IF-testiä käytetään pääasiallisena seulontatestinä ja IF-testin tulos on positiivinen, toisena seulontatestinä on tehtävä eristämistesti, PCR- tai FISH-testi. Jos IF-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja IF-testin tulos on positiivinen, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen analyysin suorittamiseksi.

            Huomautus: Käytetään validoitua R. solanacearum -vasta-aineiden lähdettä (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On suositeltavaa määrittää titteri kullekin uudelle vasta-aine-erälle. Titteri määritellään korkeimmaksi laimennokseksi, jolla optimaalinen reaktio tapahtuu, kun testataan suspensiota, joka sisältää R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta saatuja soluja, 105–106/ml, sopivalla fluoreseiini-isotiosyanaattikonjugaatilla (FITC) valmistajan suositusten mukaisesti. Validoidun polyklonaalisen antiseerumin IF-titterin olisi oltava vähintään 1:2 000. Testauksen aikana vasta-aineita olisi käytettävä lähellä titteriä olevassa tai titterin suuruisessa työskentelylaimennoksessa (tai -laimennoksissa).
         Testi olisi tehtävä vasta valmistetuista näyteuutteista. Testi voidaan tarvittaessa tehdä uutteista, joita on säilytetty –68––86 °C:ssa glyserolissa. Glyseroli voidaan poistaa näytteestä lisäämällä 1 ml sakkapuskuria (lisäys 4), sentrifugoimalla uudelleen 15 minuutin ajan 7 000 g:ssä ja suspendoimalla uudelleen yhtä suureen määrään puskuriliuosta. Tämä ei ole useinkaan välttämätöntä erityisesti, jos näytteet kiinnitetään levyihin liekittämällä.
         Valmistetaan erilliset positiiviset kontrollilevyt R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta tai mistä tahansa muusta vertailukannasta, jotka on suspendoitu perunauutteeseen, kuten lisäyksen 3 B kohdassa täsmennetään, ja vaihtoehtoisesti puskuriliuokseen.

            Luonnollisesti saastunutta solukkoa (joka on säilytetty lyofilisoimalla tai pakastamalla–16––24 °C:ssa) olisi mahdollisuuksien mukaan käytettävä vertailua varten samalla levyllä.
         Negatiivisina kontrolleina käytetään sellaisia näyteuutteen määräosia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi.
         Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksessä 3.
         Käytetään mikroskoopin monisyvennyslevyjä, joissa on mieluiten 10 halkaisijaltaan vähintään 6 mm:n syvennystä.
         Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).
         5.1   Käsitellään testilevyt yhdellä seuraavista menettelyistä:

                     i)

                     Pelletit, joissa on suhteellisen vähän tärkkelystä:
                     Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 µl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen – lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) suhteessa 1:100 laimennettua, uudelleen suspendoitua sakkaa ensimmäiseen syvennykseen. Pipetoidaan samanlainen määrä laimentamatonta sakkaa (1:1) rivin muihin syvennyksiin. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuviossa 1 on esitetty.

                     ii)

                     Muut pelletit:
                     Valmistetaan kymmenkertaisia laimennoksia (1:10, 1:100) uudelleen suspendoidusta sakasta sakkapuskuriin. Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 µl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen – lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) uudelleen suspendoitua sakkaa ja kutakin laimennosta riville syvennyksiä. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuviossa 2 on esitetty.

               5.2   Annetaan pisaroiden kuivua huoneenlämmössä tai lämmittämällä 40–45 °C:n lämpötilaan. Kiinnitetään bakteerisolut levylle joko kuumentamalla (15 minuuttia 60 °C:n lämpötilassa), liekittämällä tai 95 % etanolilla tai vasta-aineiden toimittajien nimenomaisten ohjeiden mukaisesti.
         Kiinnitettyjä levyjä voidaan tarvittaessa säilyttää jäädytettyinä kuivatusainetta sisältävässä laatikossa mahdollisimman lyhyen aikaa (enintään 3 kuukautta) ennen lisätestejä.
         5.3   IF-menettely

                     i)

                     Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan i alakohdan mukaisesti:
                     Valmistetaan kaksinkertaisten laimennosten sarja. Ensimmäisen syvennyksen olisi oltava 1/2 titteriä (T/2), ja muiden 1/4 titteriä (T/4), 1/2 titteriä (T/2), titteri (T) ja titteri kaksinkertaisena (2T).

                     ii)

                     Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan ii alakohdan mukaisesti:
                     Valmistetaan työskentelylaimennos vasta-aineesta IF-puskuriin. Työskentelylaimennos vaikuttaa spesifisyyteen.

               Kaavio 1.   Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan i alakohdan ja 5.3 alakohdan i alakohdan mukaisesti

                        Laimennokset uudelleen suspendoidusta sakasta

                     1/100

                     1/1

                     1/1

                     1/1

                     1/1

                     

                     Uudelleen suspendoidun sakan laimennos

                     (T = titteri)

                     T/2

                     T/4

                     T/2

                     T

                     2T

                     

                     Antiseerumin/vasta-aineen kaksinkertaiset laimennokset

                     Näyte 1

                     1

                     2

                     3

                     4

                     5

                     Näytteen 1 toisinto tai näyte 2

                     6

                     7

                     8

                     9

                     10

         Kaavio 2.   Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan ii alakohdan ja 5.3 alakohdan ii alakohdan mukaisesti

                        Työskentelylaimennos antiseerumista/vasta-aineesta

                     1/1

                     1/10

                     1/100

                     Tyhjä

                     Tyhjä

                     

                     Uudelleen suspendoidun sakan kymmenkertainen laimennos

                     näyte 1

                     1

                     2

                     3

                     4

                     5

                     Näytteen 1 toisinto tai näyte 2

                     6

                     7

                     8

                     9

                     10

               5.3.1   Järjestetään levyt kostean paperipyyhkeen päälle. Täytetään testisyvennykset kokonaisuudessaan vasta-aineen laimennoksella tai laimennoksilla. Syvennyksiin lisättävän vasta-aineen tilavuuden on vastattava vähintään levitetyn uutteen tilavuutta.
         Seuraava menettely olisi toteutettava, jos vasta-aineiden toimittajilta ei ole saatu nimenomaisia ohjeita:
         5.3.2   Inkuboidaan levyjä kannen alla kostealla paperilla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä (18–25 °C).
         5.3.3   Ravistetaan pisarat pois kaikilta levyiltä ja huuhdellaan levyt varovasti IF-puskurilla. Pestään 5 minuutin ajan IF-puskuri-Tweenillä (lisäys 4) ja sen jälkeen IF-puskurissa. Vältetään roiskeita tai pisaroiden kulkeutumista, joista saattaa olla seurauksena ristikontaminaatio. Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyhkeellä.
         5.3.4   Järjestetään levyt kostean paperin päälle. Täytetään testisyvennykset FITC-konjugaatin laimennoksella, jota on käytetty titterin määrittämiseen. Syvennyksiin lisätyn konjugaatin määrän on vastattava lisätyn vasta-aineen määrää.
         5.3.5   Inkuboidaan levyt kannen alla kostealla paperilla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä (18–25 °C).
         5.3.6   Ravistetaan konjugaattipisarat pois levyltä. Huuhdellaan ja pestään kuten edellä (5.3.3 alakohta).
         Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyhkeellä.
         5.3.7   Pipetoidaan 5–10 µl 0,1 M fosfaattipuskuroitua glyserolia (lisäys 4) tai vastaavaa kaupallisesti saatavilla olevaa haalistumiselta suojaavaa peittausainetta kuhunkin syvennykseen ja asetetaan peitelasi.
         5.4   IF-testin lukeminen
         5.4.1   Tutkitaan testilevyjä mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, FITC:n eksitaatioon sopivilla suodattimilla öljy- tai vesi-immersio-objektiivin 500–1 000-kertaisella suurennoksella. Tarkastellaan objektikenttää laidasta laitaan pystysuoraan ja vaakasuoraan ja kiertämällä ulkoreunaa pitkin. Näytteistä, joissa ei näy yhtään tai vain hyvin vähän soluja, tarkastellaan vähintään 40 mikroskooppikenttää.
         Tutkitaan ensin positiiviset kontrollilevyt. Solujen on oltava kirkkaasti fluoresoivia ja täydellisesti värjäytyneitä määritellyllä vasta-ainetitterillä tai työskentelylaimennoksella. IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta) on uusittava, jos värjäytyminen ei ole täydellistä.
         5.4.2   Tarkastellaan testisyvennyksissä kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluoresenssin intensiteetin on vastattava positiivista kontrollikantaa samassa vasta-ainelaimennoksessa. Sellaisia soluja, joiden värjäytyminen on epätäydellistä tai joiden fluoresenssi on heikko, ei oteta huomioon.
         Jos epäillään kontaminaatiota, testi on toistettava. Näin saattaa käydä, jos kaikilla erän levyillä on positiivisia soluja puskurin kontaminaation vuoksi tai jos positiivisia soluja löytyy (levyn syvennysten ulkopuolelta) levyn kalvolta.
         5.4.3   Immunofluoresenssitestien spesifisyyteen liittyy useita ongelmia. Perunan napapäiden ja varren palasten sakassa esiintyy todennäköisesti morfologisesti epätyypillisiä fluoresoivien solujen ja R. solanacearum -bakteerin kanssa kooltaan ja morfologialtaan samanlaisten ristiin reagoivien saprofyyttisten bakteerien populaatioita.
         5.4.4   Tarkastellaan ainoastaan fluoresoivia soluja, joilla on tyypillinen koko ja morfologia vasta-ainetitterissä tai -työskentelylaimennoksessa, kuten 5.3 alakohdassa kuvattiin.
         5.4.5   IF-testin tulosten tulkinta:

                     i)

                     Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, arvioidaan tyypillisten solujen keskimääräinen lukumäärä mikroskooppikenttää kohden ja lasketaan näiden solujen lukumäärä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (lisäys 5).
                     IF-testin tulos on positiivinen, jos näytteissä on vähintään 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden. Näytettä pidetään mahdollisesti saastuneena, ja lisätestaus on tarpeen.

                     ii)

                     IF-testin tulos on negatiivinen, jos näytteissä on vähemmän kuin 5 × 103 solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, ja näytettä pidetään negatiivisena. Lisätestausta ei vaadita.

               6.   PCR-testi
         Periaatteet
         Kun PCR-testiä käytetään pääasiallisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, toisena pakollisena seulontatestinä on tehtävä eristys- tai IF-testi. Kun PCR-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen määrityksen tekemiseksi.
         Tätä menetelmää on suositeltavaa käyttää pääasiallisena seulontatestinä ainoastaan, jos käytettävissä on sen tekemiseen vaadittavaa erityisasiantuntemusta.

            Huomautus: Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin solut (103–104/ml). Testi on voitava toistaa. Optimointikokeet saattavat olla tarpeen herkkyyden ja spesifisyyden maksimoimiseksi kaikissa laboratorioissa.
         Käytetään validoituja PCR-reagensseja ja -testausprotokollia (ks. lisäys 6). Olisi mielellään valittava menetelmä, johon kuuluu sisäinen kontrolli.
         On toteutettava tarkoituksenmukaisia varotoimia, jotta vältetään näytteen kontaminaatio kohde-DNA:lla. PCR-testi olisi annettava kokeneiden teknikoiden tehtäväksi erikoistuneissa molekyylibiologian laboratorioissa, jotta minimoidaan näytteen mahdollinen kontaminaatio kohde-DNA:lla.
         Negatiivisia kontrolleja (DNA:n uuttamis- ja PCR-menettelyjen osalta) olisi aina käsiteltävä menettelyn viimeisenä näytteenä, jotta voitaisiin osoittaa selvästi, onko DNA:n siirtymistä tapahtunut.
         PCR-testiin olisi sisällytettävä seuraavat negatiiviset kontrollit:

                     —

                     näyteuute, joka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin suhteen negatiiviseksi,

                     —

                     puskurikontrollit, joita käytetään bakteerin ja DNA:n uuttamiseksi näytteestä,

                     —

                     PCR-reaktioseos.

               Testissä olisi käytettävä seuraavia positiivisia kontrolleja:

                     —

                     uudelleen suspendoitujen sakkojen määräosat, joihin R. solanacearum -bakteeri on lisätty (valmistus ks. lisäyksen 3 B kohta),

                     —

                     vesisuspensio R. solanacearum -bakteerin virulentista isolaatista (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ks. lisäyksen 3 B kohta) saaduista soluista, 106 solua/ml,

                     —

                     jos mahdollista, PCR-testissä käytetään myös positiivisista kontrollinäytteistä saatua DNA:ta.

            Mahdollisen kontaminaation välttämiseksi positiiviset kontrollit valmistetaan erillään testinäytteistä.

         Näyteuutteiden olisi oltava mahdollisimman puhtaita mullasta. Joissakin tapauksissa saattaisi siksi olla suositeltavaa valmistaa uutteet pestyistä perunoista, mikäli aiotaan käyttää PCR-testausprotokollia.
         Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksessä 3.
         6.1   DNA:n puhdistusmenetelmät
         Käytetään edellä kuvattuja negatiivisia ja positiivisia kontrollinäytteitä (ks. lisäys 3).
         Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).
         Kohde-DNA:n eristämiseksi kompleksisista näytealustoista on käytettävissä useita eri menetelmiä, joilla voidaan poistaa PCR:n ja muiden entsyymireaktioiden inhibiittorit ja konsentroida kohde-DNA näyteuutteessa. Seuraava menetelmä on optimoitu käytettäväksi lisäyksessä 6 kuvatuilla validoiduilla PCR-menetelmillä.
         a)   Pastrikin menetelmä (2000)

                     1)

                     Pipetoidaan 220 µl lyysipuskuria (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml:n eppendorfputkeen.

                     2)

                     Lisätään 100 µl näyteuutetta ja asetetaan kuumentimelle tai vesihauteeseen 95 °C:ssa 10 minuutin ajaksi.

                     3)

                     Siirretään putki jäihin 5 minuutiksi.

                     4)

                     Lisätään 80 µl lysotsyymikantaliuosta (50 mg lysotsyymia/ml 10 mM Tris HCl:ssa, pH 8,0) ja inkuboidaan 37 °C:ssa 30 minuutin ajan.

                     5)

                     Lisätään 220 µl Easy DNA® -liuosta A (Invitrogen), sekoitetaan hyvin vorteksoimalla ja inkuboidaan 65 °C:ssa 30 minuutin ajan.

                     6)

                     Lisätään 100 µl Easy DNA® -liuosta B (Invitrogen), vorteksoidaan voimakkaasti, kunnes sakka valuu putkessa vapaasti ja näyte on kauttaaltaan yhtäläisen viskoosi.

                     7)

                     Lisätään 500 µl kloroformia ja vorteksoidaan, kunnes viskositeetti vähenee ja seos on homogeeninen.

                     8)

                     Sentrifugoidaan 15 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa faasien erottamiseksi ja interfaasin muodostamiseksi.

                     9)

                     Siirretään yläfaasi puhtaaseen eppendorfputkeen.

                     10)

                     Lisätään 1 ml 100 % etanolia (-20 °C), vorteksoidaan pikaisesti ja inkuboidaan jäissä 10 minuutin ajan.

                     11)

                     Sentrifugoidaan 15 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa ja poistetaan etanoli pelletistä.

                     12)

                     Lisätään 500 µl 80 % etanolia (-20 °C) ja sekoitetaan kääntelemällä putkea.

                     13)

                     Sentrifugoidaan 15 000 g 10 minuutin ajan 4 °C:ssa, säästetään pelletti ja poistetaan etanoli.

                     14)

                     Annetaan pelletin kuivua ilmassa tai DNA Speed Vac -laitteessa.

                     15)

                     Suspendoidaan pelletti uudelleen 100 µl:aan steriiliä ultrapuhdasta vettä ja jätetään seisomaan huoneenlämpöön vähintään 20 minuutin ajaksi.

                     16)

                     Varastoidaan -20 °C:ssa, kunnes näytettä tarvitaan PCR-testissä.

                     17)

                     Erotetaan mahdollinen valkea sakka sentrifugoimalla, ja PCR-määritykseen käytetään 5 µl DNA:ta sisältävää liuosta.

               b)   Muut menetelmät
         Muita DNA:n uuttamismenetelmiä (esim. Qiagen Dneasy Plant Kit) voidaan käyttää, jos niiden on osoitettu olevan yhtä tehokkaita DNA:n puhdistamisessa kontrollinäytteistä, jotka sisältävät 103–104 taudinaiheuttajasolua/ml.
         6.2   PCR-testi
         6.2.1   Valmistetaan PCR-testin testi- ja kontrollitemplaatit validoitujen testausprotokollien mukaisesti (VI jakson A kohdan 6 alakohta). Valmistetaan yksi kymmenkertainen laimennos DNA-näyteuutetta (1:10 ultrapuhtaaseen veteen).
         6.2.2   Valmistetaan tarkoituksenmukainen PCR-reaktioseos julkaistujen testausprotokollien mukaisesti (lisäys 6) kontaminaatiolta vapaassa ympäristössä. Jos mahdollista, on suositeltavaa käyttää moninkertaisista PCR-protokollaa, johon sisältyy myös sisäinen PCR-kontrolli.
         6.2.3   Lisätään 2–5 µl DNA-uutetta 25 µl:aan PCR-reaktioseosta steriileihin PCR-putkiin PCR-protokollien mukaisesti (ks. lisäys 6).
         6.2.4   Otetaan ainoastaan PCR-reaktioseosta sisältävä negatiivinen kontrollinäyte ja lisätään näytteen sijasta ultrapuhdasta vettä samasta lähteestä, jota käytettiin PCR-seoksessa.
         6.2.5   Asetetaan putket samaan lämpösyklilaitteeseen, jota käytettiin esitestauksessa, ja ajetaan asianmukaisesti optimoitu PCR-ohjelma (lisäys 6).
         6.3   PCR-tuotteen määrittäminen
         6.3.1   Erotetaan PCR-amplikonit agaroosigeelielektroforeesilla. Lisätään vähintään 12 µl monistettua DNA-reaktioseosta jokaisesta näytteestä ja sekoitetaan se 3 µl:aan latauspuskuria (lisäys 6) 2,0 % (w/v) agaroosigeelissä trisasetaattielektroforeesipuskurissa (TAE) (lisäys 6) ajaen geeliä 5–8 V/cm. Käytetään tarkoituksenmukaista DNA-markkeria, ’esim. 100 emäsparia.’
         6.3.2   Saatetaan DNA-fragmentit näkyviin värjäämällä näyte etidiumbromidiliuoksessa (0,5 mg/l) 30–60 minuutin ajan huolehtien asianmukaisista varotoimista tämän mutageenin käsittelyssä.
         6.3.3   Tarkastellaan värjäytynyttä geeliä UV-läpivalaisulla (λ = 302 nm) odotetunkokoisten monistettujen PCR-tuotteiden (lisäys 6) löytämiseksi ja dokumentoidaan tiedot.
         6.3.4   Kaikkien uusien löydösten/tapausten osalta varmistetaan PCR-amplikonin autenttisuus tekemällä restriktioentsyymianalyysi jäljellä olevan monistetun DNA:n näytteelle inkuboimalla optimilämpötilassa ja -ajassa tarkoituksenmukaisella entsyymillä ja puskurilla (ks. lisäys 6). Määritetään pilkotut fragmentit agaroosigeelielektrofereesillä kuten edellä ja tarkkaillaan tyypillistä restriktiofragmenttikuviota UV-läpivalaisulla etidiumbromidivärjäyksen jälkeen ja verrataan pilkkoutumattomiin ja pilkottuihin positiivisiin kontrolleihin.
         PCR-testin tulosten tulkinta
         PCR-testin tulos on negatiivinen, jos odotetunkokoista R. solanacearum -spesifistä PCR-amplikonia ei todeta kyseisestä näytteestä, mutta se todetaan kaikista positiivisista kontrollinäytteistä (kun on kyse moninkertaisista PCR-tuotteista, joilla on kasveille spesifiset sisäiset kontrollialukkeet: toinen odotetunkokoinen PCR-tuote on monistettava kyseisellä näytteellä).
         PCR-testin tulos on positiivinen, jos odotetunkokoinen R. solanacearum -spesifinen PCR-amplikoni ja odotettu restriktioreaktio (jos sellaista vaaditaan) todetaan edellyttäen, että sitä ei ole monistettu mistään negatiivisesta kontrollinäytteestä. Positiivisen tuloksen luotettava varmistus voidaan saada myös toistamalla testi toisilla PCR-alukkeilla (lisäys 6).

            Huomautus: PCR:n inhibitiota voidaan epäillä, jos odotettu amplikoni saadaan positiivisesta kontrollinäytteestä, joka sisältää R. solanacearum -bakteeria vedessä, mutta negatiiviset tulokset saadaan positiivisista kontrolleista, jotka sisältävät R. solanacearum -bakteeria perunauutteessa. Moninkertaisten reaktioiden määritykseen perustuvissa PCR-testausprotokollissa, joissa on mukana sisäinen PCR-kontrolli, reaktion inhibitio näyttää olevan kyseessä silloin, jos ei saada kumpaakaan näistä kahdesta amplikonista.
         Saastuntaa voidaan epäillä, jos odotettua amplikonia ei saada yhdestä tai useammasta negatiivisesta kontrollista.
         7.   FISH-testi
         Periaate
         Kun FISH-testiä käytetään ensimmäisenä seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, toisena pakollisena seulontatestinä on tehtävä eristystesti tai IF-testi. Kun FISH-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen määrityksen tekemiseksi.

            Huomautus: Käytetään validoituja R. solanacearum -spesifisiä oligokoettimia (lisäys 7). Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan toistettavasti todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin solut vähintään pitoisuudella 103–104/ml.
         Menettely voidaan tarvittaessa kuitenkin tehdä näyteuutteille, joita on säilytetty glyserolissa –16––24 °C:ssa tai –68––86 °C:ssa.
         Negatiivisina kontrolleina käytetään sellaisia näyteuutteen osia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi.
         Positiivisiksi kontrolleiksi valmistetaan suspensioita, jotka sisältävät 105–106 solua/ml R. solanacearum -bakteerin biovaria 2 (esim. kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ks. lisäys 3) 0,01 M fosfaattipuskurissa (PB) 3–5 vuorokauden viljelmästä. Valmistetaan erilliset positiiviset kontrollilevyt R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta tai mistä tahansa muusta vertailukannasta, jotka on suspendoitu perunauutteeseen, kuten lisäyksen 3 B kohdassa täsmennetään.
         FITC-leimatun eubakteriaalisen oligokoettimen käyttö toimii kontrollina hybridisaatioprosessissa, sillä se värjää kaikki näytteessä olevat eubakteerit.
         Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksen 3 A kohdassa.
         Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).
         7.1   Perunauutteen fiksointi
         Seuraava testausprotokolla on peräisin lähteestä Wullings et al., (1998):
         7.1.1   Valmistetaan kiinniteliuos (ks. lisäys 7).
         7.1.2   Pipetoidaan 100 µl kustakin näyteuutteesta eppendorfputkeen ja sentrifugoidaan 7 minuuttia 7 000 g:ssä.
         7.1.3   Poistetaan supernatantti ja liuotetaan sakka 200 µl:aan kiinniteliuosta, joka on valmistettu < 24 tuntia aiemmin. Sekoitetaan vorteksilla ja inkuboidaan tunnin ajan jääkaapissa.
         7.1.4   Sentrifugoidaan 7 minuutin ajan 7 000 g:ssä, poistetaan supernatantti ja suspensoidaan pelletti uudelleen 75 µl:aan 0,01 M fosfaattipuskuria (ks. lisäys 7).
         7.1.5   Tiputetaan 16 µl kiinnitettyjä suspensioita kuvassa 7,1 esitetylle puhtaalle monitestilevylle. Laitetaan kullekin levylle 2 laimentamatonta eri näytettä ja käytetään 10 µl 1/100-laimennoksen (0,01 M:ssa fosfaattipuskuria) tekemiseksi. Jäljellä oleva näyteliuos (49 µl) voidaan varastoida -20 °C:ssa, kun siihen on lisätty 1 tilavuus 96-prosenttista etanolia. Jos FISH-testi on toistettava, poistetaan etanoli sentrifugoimalla ja lisätään sama määrä 0,01 M fosfaattipuskuria (sekoitetaan vorteksilla).
         Kuvio 7.1   FISH-levy

                     Näyte 1

                     Nollakoe

                     Nollakoe

                     Nollakoe

                     Näyte 2

                     syvennys 1

                     syvennys 2

                     syvennys 3

                     syvennys 4

                     syvennys 5

                     Näyte 1

                     Nollakoe

                     Nollakoe

                     Nollakoe

                     Näyte 2

                     syvennys 6

                     syvennys 7

                     syvennys 8

                     syvennys 9

                     syvennys 10

                     Peitelasi 1

                     Peitelasi 2

               7.1.6   Ilmakuivataan levyt (tai kuivataan ne levynkuivaajalla 37 °C:ssa) ja kiinnitetään ne liekittämällä.
         Tässä vaiheessa menettely voidaan keskeyttää, ja hydridisaatiota voidaan jatkaa seuraavana päivänä. Levyt olisi säilytettävä pölyltä suojassa ja kuivassa paikassa huoneenlämmössä.
         7.2   Hybridisaatio
         7.2.1   Poistetaan soluista vesi vaiheittain 50-, 80- ja 96-prosenttisessa etanolissa minuutin ajan kussakin. Ilmakuivataan levyt levynpidikkeessä.
         7.2.2   Valmistellaan kostea inkubaatiokammio peittämällä ilmatiiviin laatikon pohja paperi- tai suodatinpaperilla, joka on kastettu 1X hybmixiin (lisäys 7). Esi-inkuboidaan laatikko hybridisaatiouunissa 45 °C:ssa vähintään 10 minuutin ajan.
         7.2.3   Asetetaan 10 μl hybridisaatioliuosta (lisäys 7) kunkin levyn 8 syvennykseen (syvennykset 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 ja 10; ks. kuva 7.1) siten, että kaksi keskimmäistä syvennystä (3 ja 8) jäävät tyhjiksi.
         7.2.4   Asetetaan peitelasit (24 × 24 mm) ensimmäiseen ja neljään viimeiseen syvennykseen siten, että väliin ei jää ilmaa. Laitetaan levyt esilämmitettyyn kosteaan kammioon ja hybridisoidaan 5 tuntia pimeässä uunissa 45 °C:ssä.
         7.2.5   Valmistetaan 3 dekanterilasia, joiden koostumus on seuraava: 1 l Milli Q (molekyylisuodattimilla puhdistettua) -vettä, 1 l 1X hybmix (334 ml 3X hybmix ja 666 ml Milli Q -vettä) ja 1 l 1/8X hybmix (42 ml 3X hybmix ja 958 ml Milli Q -vettä). Esi-inkuboidaan kukin vesihauteessa 45 °C:ssa.
         7.2.6   Poistetaan peitelasit levyiltä ja asetetaan levyt levytelineeseen.
         7.2.7   Pestään ylimääräinen koetin inkuboimalla 15 minuutin ajan dekanterilasissa, jossa on 1X hybmix, 45 °C:ssa.
         7.2.8   Siirretään levyteline 1/8X hybmix -pesuliuokseen ja inkuboidaan vielä 15 minuutin ajan.
         7.2.9   Kastetaan levyt pikaisesti Milli Q -veteen ja asetetaan ne suodatinpaperille. Poistetaan liiallinen kosteus peittämällä pinta kevyesti suodatinpaperilla. Pipetoidaan 5–10 μl haalistumiselta suojaavaa peittausainetta (esim. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA, tai vastaavaa) jokaiseen syvennykseen ja asetetaan iso peitelasi (24 × 60 mm) koko levyn päälle.
         7.3   FISH-testin lukeminen
         7.3.1   Tutkitaan levyt välittömästi mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, öljyimmersio-objektiivin 630–1 000-kertaisella suurennoksella. FITC:iin sopivilla suodattimilla näytteen eubakteerisolut (mukaan luettuina useimmat gramnegatiiviset solut) fluoresoivat vihreinä. Kun käytetään tetrametyylirodamiini-5-isotiosyanaatille tarkoitettua suodatinta, Cy3-värjätyt R. solanacearum -bakteerin solut näkyvät fluoresoivan punaisina. Verrataan solujen morfologiaa positiivisten kontrollien morfologiaan. Solujen on oltava kirkkaasti fluoresoivia ja täydellisesti värjäytyneitä. FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta) on toistettava, jos värjäytyminen on poikkeavaa. Tutkitaan syvennyksiä tarkasti kohtisuoraan kahden halkaisijan suuntaisesti ja pitkin aukon kehää. Näytteistä, joissa ei näy yhtään tai vain hyvin vähän soluja tarkastellaan vähintään 40 mikroskooppikenttää.
         7.3.2   Tarkastellaan testisyvennyksissä kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluoresenssin intensiteetin on vastattava vähintään positiivisen kontrollikannan fluoresenssin intensiteettiä. Sellaisia soluja, joiden värjäytyminen on epätäydellistä tai joiden fluoresenssi on heikko, ei oteta huomioon.
         7.3.3   Jos epäillään kontaminaatiota, testi on toistettava. Näin saattaa käydä, jos kaikilla erän levyillä on positiivisia soluja puskurin saastumisen vuoksi tai jos positiivisia soluja löytyy (levyn syvennysten ulkopuolelta) levyn kalvolta.
         7.3.4   FISH-testin spesifisyyteen liittyy useita ongelmia. Perunan napapäiden ja varren palasten sakassa saattaa esiintyä morfologisesti epätyypillisiä fluoresoivien solujen ja R. solanacearum -bakteerin kanssa kooltaan ja morfologialtaan samanlaisten ristiin reagoivien saprofyyttisten bakteerien populaatioita, vaikkakin huomattavasti harvemmin kuin IF-testissä.
         7.3.5   Ainoastaan ne fluoresoivat solut, jotka ovat kooltaan ja morfologialtaan tyypillisiä, on otettava huomioon.
         7.3.6   FISH-testin tulosten tulkinta

                     i)

                     FISH-testistä saadaan validit tulokset, jos FITC-suodatinta käyttäen havaitaan kirkkaan vihreitä fluoresoivia soluja, joiden koko ja morfologia on R. solanacearum -bakteerille tyypillinen, ja jos rodamiinisuodatinta käyttäen havaitaan kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja kaikissa positiivissa kontrolleissa muttei yhdessäkään negatiivisessa kontrollissa. Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, arvioidaan tyypillisten solujen keskimääräinen lukumäärä mikroskooppikenttää kohden ja lasketaan näiden solujen lukumäärä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (lisäys 4). Näytteitä, joissa on vähintään 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, pidetään mahdollisesti saastuneina. Lisätestaus on tarpeen. Näytteitä, joissa on vähemmän kuin 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, pidetään negatiivisina.

                     ii)

                     FISH-testin tulos on negatiivinen, jos rodamiinisuodatinta käyttäen ei havaita kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja, joiden koko ja morfologia on R. solanacearum -bakteerille tyypillinen edellyttäen, että tyypillisiä kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja havaitaan positiivisissa kontrollivalmisteissa silloin, kun käytetään rodamiinisuodatinta.

               8.   ELISA-testi
         Periaate
         ELISA-testiä voidaan käyttää ainoastaan valinnaisena testin IF-, PCR- tai FISH-testin lisäksi, koska testin herkkyys on verrattain alhainen. Kun käytetään DAS ELISA -testiä, rikastus ja monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö ovat pakollisia (ks. www-sivusto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Näytteiden rikastus ennen ELISA-testin käyttöä voi olla hyödyllistä testin herkkyyden parantamiseksi, mutta se voi epäonnistua näytteessä olevien muiden organismien kilpailun vuoksi.

            Huomautus: Käytetään validoitua R. solanacearum -vasta-aineiden lähdettä (ks. www-sivusto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On suositeltavaa määrittää titteri kullekin uudelle vasta-aine-erälle. Titteri määritellään korkeimmaksi laimennokseksi, jolla optimaalinen reaktio tapahtuu, kun testataan suspensiota, joka sisältää millilitraa kohden 105–106
            R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta saatua solua, ja kun käytetään sopivia sekundaareja vasta-ainekonjugaatteja valmistajan suositusten mukaisesti. Testauksen aikana vasta-aineita olisi käytettävä lähellä kaupallisesti saatavilla olevaa titteriä olevassa tai titterin suuruisessa työskentelylaimennoksessa.
         Määritetään vasta-aineiden titteri suspensiossa, jossa on millilitraa kohden 105–106 solua R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta.
         Negatiiviksi kontrolleiksi otetaan näyteuute, joka on aiemmin testattu negatiiviseksi R. solanacearum -bakteerin osalta, sekä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) oleva bakteeri, joka ei reagoi ristiin.
         Positiivisena kontrollina käytetään sellaisia näyteuutteen osia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi ja joihin on sekoitettu millilitraa kohden 103–104
            R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 solua (esim. kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ks. lisäyksen 2 A ja B kohta). Tulosten vertailemiseksi kullakin levyllä käytetään standardiliuosta, jossa on millilitraa kohden 105–106 R. solanacearum -solua fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. On varmistettava, että positiiviset kontrollit on tarkoin erotettu testattavista näytteistä mikrotitterilevyllä.
         Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksen 3 A kohdassa.
         Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).
         Kaksi ELISA-protokollaa on validoitu.
         a)   Epäsuora ELISA (Robinson Smith et al., 1995)

                     1)

                     Käytetään 100–200 µl näyteuutteen osia. (Kuumentaminen 100 °C:ssa 4 minuutin ajan vesihauteessa tai kuumentimella voi joissakin tapauksissa vähentää ei-spesifisiä tuloksia.)

                     2)

                     Lisätään sama tilavuusmäärä väkevyydeltään kaksinkertaista kiinnityspuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan vorteksilla.

                     3)

                     Lisätään 100 µl:aa kuhunkin, vähintään kahteen, mikrotitterilevyn syvennykseen (esim. Nunc-Polysorp tai vastaava). Inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa tai yön yli 4 °C:ssa.

                     4)

                     Kaadetaan uutteet pois syvennyksistä. Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4) siten, että viimeinen pesuliuos jätetään syvennyksiin vähintään 5 minuutiksi.

                     5)

                     Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerin vasta-aineista estopuskuriin (lisäys 4). Validoiduista kaupallisista vasta-aineista käytetään suositeltuja laimennoksia (yleensä kaksinkertainen konsentraatio titteriin verrattuna).

                     6)

                     Lisätään 100 µl kuhunkin syvennykseen ja inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa.

                     7)

                     Kaadetaan vasta-aineliuos syvennyksistä ja pestään kuten edellä (kohta 4).

                     8)

                     Valmistetaan sopiva laimennos sekundaarista vasta-aine-emäsfosfataasikonjugaattia estopuskuriin. Lisätään 100 µl kuhunkin syvennykseen ja inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa.

                     9)

                     Kaadetaan konjugaattivasta-aine syvennyksistä ja pestään kuten edellä (kohta 4).

                     10)

                     Lisätään 100 µl emäksistä fosfataasisubstraattiliuosta (lisäys 4) kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan pimeässä huoneenlämmössä ja mitataan absorbanssi 405 nm:ssä säännöllisesti 90 minuutin välein.

               b)   DASI ELISA

                     1)

                     Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerin polyklonaalisista immunoglobuliinivasta-aineista kiinnityspuskuriin, pH 9,6 (lisäys 4). Lisätään 200 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan 37 °C:ssa 4–5 tunnin ajan tai 4 °C:ssa 16 tunnin ajan.

                     2)

                     Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).
                     Lisätään 190 µl näyteuutetta vähintään kahteen syvennykseen. Lisätään myös positiiviset ja negatiiviset kontrollit kahteen syvennykseen kullakin levyllä. Inkuboidaan 16 tunnin ajan 4 °C:ssa.

                     3)

                     Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

                     4)

                     Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerille spesifisistä monoklonaalisista vasta-aineista fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) (lisäys 4), joka sisältää myös 0,5 % naudan seerumin albumiinia (BSA), ja lisätään 190 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan kahden tunnin ajan 37 °C:ssa.

                     5)

                     Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

                     6)

                     Valmistetaan sopiva laimennus hiiren vasta-aineimmunoglobuliineja konjugoituna emäksiseen fosfataasiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Lisätään 190 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan kahden tunnin ajan 37 °C:ssa.

                     7)

                     Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

                     8)

                     Valmistetaan emäksinen fosfataasisubstraattiliuos, jossa on 1 mg p-nitrofenyylifosfaattia substraattipuskurin millilitraa kohden (lisäys 4). Lisätään 200 µl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan pimeässä huoneenlämmössä ja mitataan absorbanssi 405 nm:ssä säännöllisesti 90 minuutin välein.

               ELISA-testitulosten tulkinta
         ELISA-testi on negatiivinen, jos kahden näytteen keskimääräinen optinen tiheys (OD) on < 2 × negatiivisen kontrollinäytesyvennyksen OD, sillä edellytyksellä, että kaikkien positiivisten kontrollien OD on suurempi kuin 1,0 (kun kontrolleja on inkuboitu 90 minuutin ajan substraatin kanssa) ja enemmän kuin kaksinkertainen negatiivista näyteuutteista saatuun OD:hen verrattuna.
         ELISA-testi on positiivinen, jos kahden näytesyvennyksen keskimääräinen OD on > 2 × negatiivisen näyteuutteen syvennyksen OD, sillä edellytyksellä, että kaikkien negatiivisten kontrollisyvennysten OD on < 2 × positiivisten kontrollisyvennysten OD.
         Negatiivinen ELISA-tulos positiivisissa kontrollisyvennyksissä osoittaa, että testiä ei ole tehty oikein tai se on inhiboitunut. Positiiviset ELISA-tulokset negatiivisissa kontrollisyvennyksissä ilmaiset, että testissä on tapahtunut ristikontaminaatiota tai epäspesifistä vasta-aineen sitoutumista.
         9.   Biologinen määritys

            Huomautus: Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä muodostavat yksiköt (103–104) (valmistus ks. lisäys 3). Testi on voitava toistaa.
         Suurinta todentamisherkkyyttä voidaan odottaa, kun käytetään vasta valmistettua näyteuutetta optimaalisissa kasvuolosuhteissa. Menetelmää voidaan kuitenkin käyttää menestyksekkäästi myös sellaisiin uutteisiin, joita on varastoitu glyserolissa -68–-86 °C:ssa.
         Seuraava testausprotokolla on peräisin lähteestä Janse (1988):
         9.1   Testikasveina käytetään 10 kasvia, jotka ovat taudille altista kolmilehtiasteella olevaa tomaattilajiketta (esim. Moneymaker tai lajike, jonka alttiuden testilaboratorio on määrittänyt vastaavaksi). Viljelyn yksityiskohdista tarkemmin ks. lisäys 8. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää munakoisoja (esim. lajike Black Beauty tai lajikkeet, joiden alttius on vastaava). Käytetään ainoastaan kasveja, jotka ovat kaksi- tai kolmilehtilehtiasteella ja enintään todellisen kolmannen lehden täyteen puhkeamiseen asti. Munakoison oireiden on osoitettu olevan lievempiä ja kehittyvän hitaammin. Tämän vuoksi suositellaan mahdollisuuksien mukaan tomaatin taimien käyttöä.
         Jaetaan 100 µl näyteuutetta testikasvien kesken.
         9.2.1   Inokulointi injektoimalla
         Inokulointi tehdään ruiskulla, joka on varustettu hypodermisellä neulalla (vähintään 23G), kasvin varsiin juuri sirkkalehtien yläpuolelle. Näyte jaetaan testikasvien kesken.
         9.2.2   Inokulointi viiltämällä
         Pidellään kasvia kahden sormen välissä ja tiputetaan pipetillä pisara (noin 5–10 µl) suspendoitua sakkaa varren päälle sirkkalehtien ja ensimmäisen kasvulehden väliin.
         Tehdään steriilillä leikkausveitsellä sakan pisarasta lähtien vinosti poikittainen noin 1 cm:n viilto, jonka syvyys on noin kaksi kolmannesta varren paksuudesta.
         Suljetaan viilto steriilillä vaseliinilla ruiskua käyttäen.
         9.3   Inokuloidaan samalla tekniikalla viisi taimea positiivisena kontrollina vesisuspensiolla, jossa on 105–106 solua/ml virulenttia R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 kantaa (positiivinen kontrolli) 48 tunnin viljelmästä, ja negatiivisena kontrollina sakkapuskurilla (lisäys 4). Kasvit, joita käytetään positiivisena ja negatiivisena kontrollina, pidetään erillään muista kasveista ristikontaminaation estämiseksi.
         9.4   Kasvatetaan testikasveja karanteenioloissa enintään 4 viikon ajan 25–30 °C:ssa ja korkeassa suhteellisessa kosteudessa sopivasti kastellen siten, että vältetään sekä vettyminen että toisaalta kuihtuminen vedenpuutteen vuoksi. Saastunnan välttämiseksi inkuboidaan positiiviset ja negatiiviset kontrollikasvit selkeästi toisistaan erotettuihin penkkeihin kasvihuoneessa tai kasvatuskammioissa tai, jos tilaa on rajoitetusti, huolehditaan siitä, että käsittelyt tehdään tiukasti toisistaan erillään. Jos eri näytteisiin kuuluvat kasvit on inkuboitava lähellä toisiaan, ne on eroteltava asianmukaisilla suojilla. Lannoitettaessa, kasteltaessa tai tutkimuksia ja muita toimenpiteitä tehtäessä on huolellisesti vältettävä ristikontaminaatio. Kasvihuoneisiin ja kasvatuskammioihin ei ehdottomasti saa päästä mitään hyönteistuholaisia, sillä ne saattavat siirtää bakteeria näytteestä toiseen.
         Tarkkaillaan nuutumisoireita, epinastiaa, kloroosia ja/tai hidastunutta kasvua.
         9.5   Tartunnan saaneista kasveista eristetään (II jakson 3 kohta) ja tunnistetaan oletetun R. solanacearum -bakteerin puhtaat viljelmät (VI jakson B kohta).
         9.6   Jos 3 viikon jälkeen ei havaita oireita, tehdään IF-, PCR- tai eristystesti kokoomanäytteelle, jossa on kustakin testikasvista 1 cm:n mittaisia varren palasia, jotka on otettu inokulointipaikan yläpuolelta. Jos testi on positiivinen, tehdään laimennussarja (alakohta 4.1).
         9.7   Tunnistetaan mahdolliset oletetun R. solanacearum -bakteerin puhtaat viljelmät (VI jakson B kohta).
         Biologisen määrityksen tulosten tulkinta
         Biologisesta määrityksestä saadaan validit tulokset, jos positiivisen kontrollin kasveissa näkyy tyypillisiä oireita, bakteerit voidaan eristää uudelleen näistä kasveista ja negatiivisista kontrolleista ei löydy oireita.
         Biologisen määrityksen tulos on negatiivinen, jos testikasveissa ei ole R. solanacearum -bakteerin aiheuttamaa tartuntaa ja R. solanacearum -bakteeri todetaan positiivisista kontrolleista.
         Biologisen määrityksen tulos on positiivinen, jos testikasveissa on R. solanacearum -bakteerin aiheuttama tartunta.
         B)   TUNNISTUSTESTIT
         Tunnistetaan oletettujen R. solanacearum -isolaattien puhtaat viljelmät käyttäen ainakin kahta seuraavista eri biologisiin periaatteisiin perustuvista testeistä.
         Sisällytetään tarvittaessa tunnetut vertailukannat kuhunkin testiin (ks. lisäys 3).
         1.   Ravintokokeet ja entsymaattiset tunnistustestit
         Määritetään seuraavat fenotyyppiset ominaisuudet, jotka yleisesti joko esiintyvät R. solanacearum -bakteerissa tai puuttuvat siitä. Käytetään seuraavissa lähteissä kuvattuja menetelmiä: Lelliott ja Stead (1987), Klement et al. (1990) ja Schaad (2001).

                     Testi

                     Tavoiteltavat tulokset

                     Fluoresoivan pigmentin muodostus

                     –

                     Poly-β-hydroksibutyraatti-inkluusiot

                     +

                     Hapettumis-/käymistesti (O/F)

                     O+/F–

                     Katalaasi aktiivisuus

                     +

                     Kovacin oksidaasitesti

                     +

                     Nitraatin pelkistyminen

                     +

                     Sitraatin käyttö

                     +

                     Kasvu 40 °C:ssa

                     –

                     Kasvu 1-prosenttisessa NaCl:ssa

                     +

                     Kasvu 2-prosenttisessa NaCl:ssa

                     –

                     Arginiinidihydrolaasin aktiivisuus

                     –

                     Gelatiinin nesteytyminen

                     –

                     Tärkkelyksen hydrolyysi

                     –

                     Eskuliinin hydrolyysi

                     –

                     Levaanin tuotanto

                     –

               2.   IF-testi
         2.1   Valmistetaan suspensio (noin 106 solua/ml) IF-puskuriin (lisäys 4).
         2.2   Valmistetaan kaksinkertaisia laimennoksia tarkoituksenmukaisesta antiseerumista (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
         2.3   Sovelletaan IF-menettelyä (VI jakson A kohdan 5 alakohta).
         2.4   IF-testistä saadaan positiivinen tulos, jos viljelmän IF-titteri vastaa positiivisen kontrollin titteriä.
         3.   ELISA-testi

            Huomautus: Jos tehdään ainoastaan kaksi tunnistustestiä, ei tämän menetelmän lisäksi käytetä muuta serologista testiä.
         3.1   Valmistetaan suspensio (noin 108 solua/ml) 1X PBS -puskuriin (lisäys 4).
         3.2   Toteutetaan soveltuva ELISA-menettely R. solanacearum -taudinaiheuttajalle spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella.
         3.3   Positiivinen ELISA-testitulos saadaan, jos viljelmästä saatu ELISA-tulos on vähintään puolet positiivisen kontrollin tuloksesta.
         4.   PCR-testi
         4.1   Valmistetaan suspensio (noin 106 solua/ml) molekyylisuodattimilla puhdistettuun veteen.
         4.2   Kuumennetaan 100 µl solususpensiota suljetuissa putkissa kuumentimessa tai kiehuvassa vesihauteessa 100 °C:ssa 4 minuutin ajan. Näytteet voidaan varastoida -16–-24 °C:ssa, kunnes niitä tarvitaan.
         4.3   Sovelletaan tarkoituksenmukaisia PCR-menettelyjä R. solanacearum -spesifisten amplikonien monistamiseksi (esim. Seal et al. (1993); Pastrik and Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)).
         4.4   R. solanacearum -bakteerin positiivinen tunnistus toteutuu, jos PCR-amplikonit ovat samankokoisia kuin positiivisen kontrollikannan amplikonit ja niillä esiintyy samaa restriktiofragmenttien pituuspolymorfiaa.
         5.   FISH-testi
         5.1   Valmistetaan suspensio (noin 106 solua/ml) ultrapuhtaaseen veteen.
         5.2   Käytetään FISH-menettelyä (VI jakson A kohdan 7 alakohta) vähintään kahdella R. solanacearum -spesifisellä oligokoettimella (lisäys 7).
         5.3   FISH-testistä saadaan positiivinen tulos, jos viljelmästä ja positiivisesta kontrollista saadaan samat reaktiot.
         6.   Rasvahappoprofilointi (FAP)
         6.1   Kasvatetaan viljelmä tryptikaasi-soija-agarissa (Oxoid) 48 tunnin ajan 28 °C:ssa.
         6.2   Tehdään tarkoituksenmukainen FAP-testi (Janse, 1991; Stead, 1992).
         6.3   FAP-testistä saadaan positiivinen tulos, jos oletetun viljelmän profiili on identtinen positiivisen kontrollin profiilin kanssa. Tyypillisten rasvahappojen esiintyminen on seuraava: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ja 18:1 2OH, ja 16:0 3OH:n puuttuminen on erittäin vahva osoitus Ralstonia sp:stä.
         7.   Kantojen määrittämismenetelmät
         Kannan määritystä jollakin seuraavista menetelmistä suositellaan kaikissa uusissa R. solanacearum -bakteerin eristämistapauksissa.
         Sisällytetään tarvittaessa tunnetut vertailukannat kuhunkin testiin (ks. lisäys 3).
         7.1   Biovarin määrittäminen

            R. solanacearum -bakteerin biovarit erotetaan kolmen disakkaridin ja kolmen heksoosialkoholin käyttö- ja/tai hapetuskyvyn perusteella (Hayward, 1964 ja Hayward et al., 1990). Biovaritestin kasvualustat kuvataan lisäyksessä 2. Testi voidaan tehdä inokuloimalla kasvualusta pistämällä siihen R. solanacearum -bakteerin isolaattien puhdasta viljelmää ja inkuboimalla 28 °C:ssa. Jos kasvualustat laitetaan steriileihin 96-syvennyksen soluviljelmälevyihin (200 µl/syvennys), 72 tunnin kuluessa voidaan havaita värinmuutos oliivinvihreästä keltaiseksi, mikä osoittaa positiivisen testituloksen.

                     Biovari

                     1

                     2

                     3

                     4

                     5

                     Käyttö:

                     Maltoosi

                     –

                     +

                     +

                     –

                     +

                     Laktoosi

                     –

                     +

                     +

                     –

                     +

                     D (+) sellobioosi

                     –

                     +

                     +

                     –

                     +

                     Mannitoli

                     –

                     –

                     +

                     +

                     +

                     Sorbitoli

                     –

                     –

                     +

                     +

                     –

                     Dulsitoli

                     –

                     –

                     +

                     +

                     –

               Lisätesteillä biovari 2 jaetaan alafenotyyppeihin.

                     Biovari 2A
                     (esiintyy maailmanlaajuisesti)

                     Biovari 2A
                     (esiintyy Chilessä ja Kolumbiassa)

                     Biovari 2T
                     (esiintyy tropiikissa)

                     Trehaloosin käyttö

                     –

                     +

                     +

                        Meso-inositolin käyttö

                     +

                     –

                     +

                     D-riboosin käyttö

                     –

                     –

                     +

                     Pektolyyttinen aktiivisuus (1)

                     vähäinen

                     vähäinen

                     suuri

               7.2   Genomien sormenjäljet

            R. solanacearum -kompleksin kantojen molekulaarinen erottaminen voi tapahtua useilla menetelmillä. Näitä ovat
         7.2.1   RFLP-analyysi (Restriction fragment length polymorphism analysis) (Cook et al., 1989).
         7.2.2   Toistuvan järjestyksen PCR, jossa käytetään REP-, ERIC- ja BOX-alukkeita (primers) (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).
         7.2.3   AFLP-analyysi (Amplified fragment length polymorphism) (Van der Wolf et al., 1998).
         7.3   PCR-menetelmät
         Spesifisiä PCR-alukkeita (primers) (Pastrik et al., 2002; ks. lisäys 6) voidaan käyttää alunperin RFLP-analyysilla (Cook et al., 1989) ja 16S rDNA -sekvensoinnilla (Taghavi et al., 1996) R. solanacearum -bakteerin luokkaan 1 (biovarit 3, 4 ja 5) sekä luokkaan 2 (biovarit 1, 2A ja 2T) kuuluvien kantojen erottamiseksi.
         C)   VARMISTUSTESTI
         Patogeenisyystesti on tehtävä R. solanacearum -bakteerin määrityksen lopulliseksi varmistamiseksi ja R. solanacearum -bakteeriksi tunnistettujen viljelmien virulenssin arvioimiseksi.

                     1)

                     Valmistetaan inokulaatti (noin 106 solua/ml) testattavan isolaatin 24–48 tunnin viljelmästä ja R. solanacearum -bakteerin asianmukaisesta positiivisesta kontrollikannasta (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ks. lisäys 3).

                     2)

                     Inokuloidaan 5–10 taudille altista tomaatin tai munakoison taimea niiden kolmilehtiasteella (ks. VI jakson A kohdan 9 alakohta).

                     3)

                     Inkuboidaan enintään 2 viikon ajan 25–28 °C:ssa ja korkeassa suhteellisessa kosteudessa sopivasti kastellen siten, että vältetään sekä vettyminen että toisaalta kuivuusstressi. Puhtailla viljelmillä pitäisi 14 päivän kuluessa saavuttaa tyypillinen kasvin nuutuminen. Jos oireita ei ole tämän ajan kuluessa ilmaantunut, ei voida vakuuttua siitä, että olisi kyse R. solanacearum -bakteerin patogeenisen muodon kasvustosta.

                     4)

                     Tarkkaillaan nuutumisoireita, epinastiaa, kloroosia ja hidastunutta kasvua.

                     5)

                     Eristetään kasveista, joilla esiintyy oireita, poistamalla pätkä varresta noin 2 cm inokulaatiokohdan yläpuolelta. Pienennetään ja suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua vettä tai 50 mM fosfaattipuskuria (lisäys 4). Eristetään suspensiosta levittämällä laimennos tai sivelemällä soveltuvalle alustalle, mieluiten selektiiviselle alustalle (lisäys 2), inkuboidaan 48–72 tuntia 28 °C:ssa ja tutkitaan, muodostuuko R. solanacearum -bakteerille tyypillisiä pesäkkeitä.

         Lisäys 1
         Optimointi- ja validointimenettelyissä mukana olevat laboratoriot

                     Laboratorio (2)

                     Paikka

                     Maa

                     Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit

                     Wien ja Linz

                     Itävalta

                     Departement Gewasbescherming

                     Merelbeke

                     Belgia

                     Plantedirektoratet

                     Lyngby

                     Tanska

                     Central Science Laboratory

                     York

                     Englanti

                     Scottish Agricultural Science Agency

                     Edinburgh

                     Skotlanti

                     Laboratoire national de la protection des végétaux, Unité de Bactériologie

                     Angers

                     Ranska

                     Laboratoire national de la protection des végétaux, Station de quarantaine de la pomme de terre

                     Le Rheu

                     Ranska

                     Biologische Bundesanstalt

                     Kleinmachnow

                     Saksa

                     Pflanzenschutzamt Hannover

                     Hannover

                     Saksa

                     State Laboratory

                     Dublin

                     Irlanti

                     Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali

                     Bologna

                     Italia

                     Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari

                     Verona

                     Italia

                     Nederlandse Algemene Keuringsdienst

                     Emmeloord

                     Alankomaat

                     Plantenziektenkundige Dienst

                     Wageningen

                     Alankomaat

                     Direcção-Geral de Protecção das Culturas

                     Lissabon

                     Portugali

                     Centro de Diagnostico de Aldearrubia

                     Salamanca

                     Espanja

                     Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

                     Valencia

                     Espanja

                     Sveriges lantbruksuniversitet (Swedish University of Agricultural Sciences)

                     Upsala

                     Ruotsi

         Lisäys 2
         Kasvatusalustat R. solanacearum -kasvintuhoojan eristämistä ja viljelyä varten
         a)   Yleinen kasvatusalusta
         Ravinneagar (NA)

                     Ravinneagar (Difco)

                     23,0 g

                     Tislattua vettä

                     1,0 l

               Liuotetaan ainesosat ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
         Hiiva-peptoni-glukoosiagar (YPGA)

                     Hiivauute (Difco)

                     5,0 g

                     Bacto-Peptoni (Difco)

                     5,0 g

                     D(+)-glukoosi (monohydraatti)

                     10,0 g

                     Bacto-Agar (Difco)

                     15,0 g

                     Tislattua vettä

                     1,0 l

               Liuotetaan ainesosat ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
         Sakkaroosipeptoniagar (SPA)

                     Sakkaroosi

                     20,0 g

                     Bacto-Peptoni (Difco)

                     5,0 g

                     K2HPO4

                     0,5 g

                     MgSO4.7H2O

                     0,25 g

                     Bacto-Agar (Difco)

                     15,0 g

                     Tislattua vettä

                     1,0 l

                     pH 7,2–7,4

               Liuotetaan ainesosat ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
         Kelmanin tetratsolium-alusta

                     Casaminohapot (Difco)

                     1,0 g

                     Bacto-Peptoni (Difco)

                     10,0 g

                     Dekstroosi

                     5,0 g

                     Bacto-Agar (Difco)

                     15,0 g

                     Tislattua vettä

                     1,0 l

               Liuotetaan ainesosat ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
         Jäähdytetään 50 °C:een ja lisätään suodatinsteriloitua 2,3,5-trifenyylitetratsoliumkloridin (Sigma) vesiliuosta, jotta loppupitoisuudeksi saadaan 50 mg/l.
         b)   Validoitu selektiivinen kasvatusalusta
         SMSA-alusta (Englebrecht, 1994, sellaisena kuin se on muutettuna julkaisulla Elphinstone et al., 1996)

                     Kasvualusta

                     Casaminohappoja (Difco)

                     1,0 g

                     Bacto-Peptoni (Difco)

                     10,0 g

                     Glyseroli

                     5,0 ml

                     Bacto-Agar (Difco) (ks. Huomautus 2)

                     15,0 g

                     Tislattua vettä

                     1,0 L

               Liuotetaan ainesosat ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
         Jäähdytetään 50 °C:een ja lisätään seuraavien aineiden suodatinsteriloituja vesikantaliuoksia, jotta saadaan määrätyt loppupitoisuudet:

                     Kristallivioletti (Sigma)

                     5 mg/l

                     Polymyksiini-B-sulfaatti

                     (Sigma P-1004) 600 000 U(noin 100 mg) / l

                     Basitrasiini (Sigma B-0125)

                     1 250 U (noin 25 mg)/l

                     Kloramfenikoli (Sigma C-3175)

                     5 mg/l

                     Penisilliini G (Sigma P-3032)

                     825 U (noin 0,5 mg)/l

                     2,3,5-trifenyylitetratsoliumkloridi (Sigma)

                     50 mg/l

               HUOMAUTUS:

                     1.

                     Muiden kuin edellä määritettyjen reagenssien käyttö voi vaikuttaa R. solanacearum -bakteerin kasvuun.

                     2.

                     Oxoid Agar #1:tä voidaan käyttää Bacto-Agarin (Difco) sijaan. Tällöin R. solanacearum -bakteerien kasvu on hitaampaa, mutta kilpailevien saprofyyttien kasvu voi myös vähentyä. Tyypillisten R. solanacearum -pesäkkeiden syntymiseen voi mennä 1–2 päivää kauemmin ja niiden punainen väritys voi olla vaaleampaa ja hajanaisempaa kuin Bacto-Agarissa.

                     3.

                     Basitrasiinipitoisuuden nostaminen arvoon 2 500 U/l voi pienentää kilpailevien bakteerien populaatiota vaikuttamatta Ralstonia solanacearum -bakteerin kasvuun.

               Kasvualustat ja antibioottien kantaliuokset on varastoitava 4 °C:ssa pimeässä ja käytettävä kuukauden kuluessa.
         Levyillä ei saa olla tiivistynyttä kosteutta ennen niiden käyttöä.
         Levyjen liiallista kuivumista on vältettävä.
         Jokaisen uuden alustaerän valmistuksen jälkeen olisi toteutettava laadunvarmistustoimia maljaamalla R. solanacearum -bakteerin viiteviljelmän suspensio (ks. lisäys 3) ja tarkkailemalla tyypillisten pesäkkeiden muodostumista, kun levyä on inkuboitu 28 °C:ssa 2–5 päivän ajan.
         c)   Validoitu rikastusalusta
         SMSA-ravintoliuos (Elphinstone et al., 1996)
         Valmistetaan kuten selektiivinen SMSA-agaralusta, mutta jätetään pois Bacto-Agar ja 2,3,5-tetratsoliumkloridi.
         Muunnettu Wilbrinkin ravintoliuos (Caruso et al., 2002)

                     Sakkaroosi

                     10 g

                     Proteoosipeptoni

                     5 g

                     K2HPO4

                     0,5 g

                     MgSO4

                     0,25 g

                     NaNO3

                     0,25 g

                     Tislattua vettä

                     1 l

               Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan ja jäähdytetään 50 °C:seen.
         Lisätään antibioottien kantaliuokset kuten SMSA-ravintoliuoksessa.

         Lisäys 3
         A)   Kaupallisesti saatavilla olevat standardoidut kontrollimateriaalit
         a)   Bakteeri-isolaatit
         Seuraavia bakteerien isolaatteja suositellaan käytettäviksi standardoituina viitemateriaaleina joko positiivisina kontrolleina (taulukko 1) tai testien optimoinnin aikana ristireaktioiden välttämiseksi (taulukko 2). Kaikki kannat ovat kaupallisesti saatavilla seuraavista lähteistä:

                     1.

                     National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK.

                     2.

                     Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, the Netherlands.

                     3.

                     Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, France.

               Taulukko 1   R. solanacearum -isolaattien SMT-viitepaneeli

                     NCPPB-koodi

                     SMT-nro
                     #

                     Muut koodit

                     Alkuperämaa

                     Biovari

                     NCPPB 4153

                     6

                     CFBP 4582, Pr 3020, EURS11

                     Egypti

                     2

                     NCPPB 4154

                     10

                     CFBP 4585, 550, EURS21

                     Turkki

                     2

                     NCPPB 3857

                     12

                     CFBP 4587, Pr 1140, EURS26

                     Englanti

                     2

                     NCPPB 1584

                     23

                     CFBP 4598, EURS49

                     Kypros

                     2

                     NCPPB 2505

                     24

                     CFBP 4599, EURS50

                     Ruotsi

                     2

                     NCPPB 4155

                     26

                     CFBP 4601, 502, EURS55

                     Belgia

                     2

                     NCPPB 4156 (3)

                     71 (3)

                     PD 2762, CFBP 3857

                     Alankomaat

                     2

                     NCPPB 4157

                     66

                     LNPV 15.59

                     Ranska

                     2

                     NCPPB 4158

                     39

                     CFBP 4608, Port 448, EURS80, NCPPB 4066

                     Portugali

                     2

                     NCPPB 4160

                     69

                     IVIA-1632-2

                     Espanja

                     2

                     NCPPB 4161

                     76

                     B3B

                     Saksa

                     2

                     NCPPB 325

                     41

                     CFBP 2047, KEL60-1, R842

                     Yhdysvallat

                     1

                     NCPPB 3967

                     42

                     CFBP 4610, R285, GONg7

                     Costa Rica

                     1

                     NCPPB 4028

                     43

                     CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205

                     Kolumbia

                     2

                     NCPPB 3985

                     44

                     CFBP 4612, R578, CIP312

                     Peru

                     2T

                     NCPPB 3989

                     45

                     CFBP 4613, R568, CIP226

                     Brasilia

                     2T

                     NCPPB 3996

                     46

                     CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225

                     Peru

                     3

                     NCPPB 3997

                     47

                     CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a

                     Australia

                     3

                     NCPPB 4029

                     48

                     CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861

                     Sri Lanka

                     4

                     NCPPB 4005

                     49

                     CFBP 4616, R470

                     Filippiinit

                     4

                     NCPPB 4011

                     50

                     CFBP 4617, R288, HEmps2

                     Kiina

                     5

            Huomautus: Edellä lueteltujen kantojen aitous voidaan taata ainoastaan, jos ne on saatu aidosta viljelmäkokoelmasta.
         Taulukko 2   Serologisesti tai geneettisesti toisiaan muistuttavien bakteerien SMT-viitepaneeli käytettäväksi toteamistestien optimoinnissa.

                     NCPPB-koodi

                     SMT-nro
                     #

                     Muu koodi

                     Tunnistus

                     NCPPB 4162

                     51

                     CFBP 1954

                        Bacillus polymyxa
                         (4)

                     NCPPB 4163

                     52

                     CFBP 1538

                        Pseudomonas marginalis pv. marginalis
                         (4)

                     NCPPB 4164

                     —

                     CFBP 2227

                        Burkholderia cepacia
                         (5)

                     NCPPB 4165

                     —

                     CFBP 2459

                        Ralstonia pickettii
                         (5)

                     NCPPB 4166

                     58

                     CFBP 3567
                     CSL Pr1150

                        Ralstonia pickettii
                         (4)

                     NCPPB 4167

                     60

                     CFBP 4618
                     PD 2778

                        Ralstonia sp. (4)

                     NCPPB 1127

                     53

                     CFBP 3575

                        Burkholderia andropogonis
                         (4)

                     NCPPB 353

                     54

                     CFBP 3572

                        Burkholderia caryophylli
                         (4)

                     NCPPB 945

                     55

                     CFBP 3569

                        Burkholderia cepacia
                         (4)

                     NCPPB 3708

                     56

                     CFBP 3574

                        Burkholderia glumae
                         (4)

                     NCPPB 3590

                     57

                     CFBP 3573

                        Burkholderia plantarii
                         (4)

                     NCPPB 3726

                     59

                     CFBP 3568

                        Banana Blood Disease Bacterium
                         (4)
                         (5)
                         (6)

                     NCPPB 4168

                     61

                     CFBP 4619
                     IPO S339

                        Enterobacter sp. (4)

                     NCPPB 4169

                     62

                     IPO 1695

                        Enterobacter sp. (4)

                     NCPPB 4170

                     63

                     CFBP 4621
                     IPO S306

                        Ochrobactrum anthropi
                         (4)
                         (5)

                     NCPPB 4171

                     64

                     CFBP 4622
                     IPO 1693

                        Curtobacterium sp. (4)
                         (5)

                     NCPPB 4172

                     65

                     IPO 1696a

                        Pseudomonas sp. (4)

                     NCPPB 4173

                     —

                     PD 2318

                        Aureobacterium sp. (5)

                     NCPPB 4174

                     81

                     IVIA 1844.06

                        Flavobacterium sp. (4)
                         (5)

               b)   Kaupallisesti saatavilla olevat standardoidut kontrollimateriaalit
         Seuraavat standardoidut kontrollimateriaalit ovat saatavilla NCPPB-viljelmäkokoelmasta.
         Pakastekuivattuja perunauutepellettejä 200:sta terveestä mukulasta kaikissa testeissä käytettäviksi negatiivisiksi kontrolleiksi.
         200:sta terveestä mukulasta saatuja pakastekuivattuja perunauutepellettejä, jotka sisältävät 103–104 ja 104–106
            R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 solua (kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) positiivisiksi kontrolleiksi serologisiin ja PCR-testeihin. Koska pakastekuivaus vaikuttaa solujen elinkelpoisuuteen, ne eivät sovellu standardikontrolleiksi eristystesteihin tai biologiseen määritykseen.
         Formaliinikiinnitetyt suspensiot (106 solua/ml) R. solanacearum -bakteerin biovarista 2 (kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) positiivisiksi kontrolleiksi serologisiin testeihin.
         B)   Positiivisten ja negatiivisten kontrollien valmistaminen napapäiden seulontatestejä PCR/IF ja FISH varten
         Tuotetaan 48 tunnin viljelmä R. solanacearum -bakteerin rodun 3 / biovarin 2 virulentista kannasta (esim. kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) SMSA-kasvualustalle ja suspendoidaan 10 mM fosfaattipuskuriin, jotta saataisiin solutiheydeksi noin 2 × 108 PMY/ml. Tämä saadaan tavallisesti hieman samealla suspensiolla, joka vastaa 0,15:n optista tiheyttä 600 nanometrissä.
         Poistetaan 200 mukulan napapäästä kappaleet, jotka on otettu valkokuorisesta osasta, jonka tiedetään olevan R. solanacearum -bakteerista vapaa.
         Käsitellään napapäät tavalliseen tapaan ja suspendoidaan sakka uudelleen 10 ml:aan.
         Valmistetaan 10 steriiliä 1,5 ml:n mikroampullia, joissa on 900 µl uudelleen suspendoitua sakkaa.
         Siirretään 100 µl R. solanacearum -bakteerin suspensiosta ensimmäiseen mikroampulliin. Sekoitetaan vorteksilla.
         Saastumisaste määritetään laimennussarjan (seuraavat 5 ampullia) avulla.
         Kuutta mikroampullia, jotka sisältävät bakteerinäytettä, käytetään positiivisina kontrolleina. Neljää mikroampullia, jotka eivät sisällä bakteerinäytettä, käytetään negatiivisina kontrolleina. Ampullit merkitään vastaavasti.
         Valmistetaan 100 µl:an osanäytteitä steriileihin 1,5 ml:n mikroampulleihin, jolloin saadaan 9 toisintoa kustakin kontrollinäytteestä. Varastoidaan –16––24 °C:ssa käyttöön saakka.

            R. solanacearum -bakteerin esiintyminen ja määrä kontrollinäytteissä olisi ensin varmistettava IF-testillä.
         PCR-testiä varten DNA uutetaan positiivisista ja negatiivisista kontrollinäytteistä kullakin testinäytesarjalla.
         IF- ja FISH-testejä varten tehdään määritykset positiivisista ja negatiivisista kontrollinäytteistä kullakin testinäytesarjalla.
         IF-, FISH- ja PCR-määrityksissä R. solanacearum -bakteeri on on osoitettava ainakin niistä positiivisista kontrolleista, joissa on 106 ja 104 solua/ml, eikä sitä saa esiintyä yhdessäkään negatiivisessa kontrollissa.

         Lisäys 4
         Puskuriliuokset testimenettelyihin

            YLEISTÄ: Avaamattomia steriloituja puskuriliuoksia voidaan säilyttää enintään vuoden ajan.
         1.   Puskurit uuttamismenettelyä varten
         1.1   Uuttopuskuri (50 mM fosfaattipuskuri, pH 7,0)
         Tätä puskuriliuosta käytetään bakteerin uuttamiseen kasvisolukoista homogenoimalla tai ravistamalla.

                     Na2HPO4 (vedetön)

                     4,26 g

                     KH2PO4

                     2,72 g

                     Tislattua vettä

                     1,00 l

               Liuotetaan ainesosat, tarkastetaan pH ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
         Muita aineksia voidaan lisätä seuraavasti:

                        Päämäärät

                        Määrä (litraa kohden)

                     Lubrol-hiutaleita

                     Höytelöitymisenestoaine (7)

                     0,5 g

                     DC-silikoni-vaahdonesto

                     Vaahdonestoaine (7)

                     1,0 ml

                     Tetranatriumpyrofosfaatti

                     Hapettumisenestoaine

                     1,0 g

                     Polyvinyylipyrrolidoni-40000 (PVP-40)

                     PCR:n inhibiittorien sidonta-aine

                     50 g

               1.2   Sakkapuskuri (10 mM fosfaattipuskuri, pH 7,2)
         Tätä puskuria käytetään perunan mukulan napapääuutteiden uudelleen suspendointiin ja laimentamiseen, kun ne on ensin konsentroitu sakaksi sentrifugoimalla.

                     Na2HPO4.12H2O

                     2,7 g

                     NaH2PO4.2H2O

                     0,4 g

                     Tislattua vettä

                     1,0 l

               Liuotetaan ainesosat, tarkastetaan pH ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
         2.   Puskurit IF-testiä varten
         2.1   IF-puskuri (10 mM fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), pH 7,2)
         Tätä puskuria käytetään vasta-aineiden laimentamiseen.

                     Na2HPO4.12H2O

                     2,7 g

                     NaH2PO4.2H2O

                     0,4 g

                     NaCl

                     8,0 g

                     Tislattua vettä

                     1,0 l

               Liuotetaan ainesosat, tarkastetaan pH ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
         2.2   IF-puskuri-Tween
         Tätä puskuria käytetään levyjen pesuun.
         Lisätään 0,1 % Tween 20:tä IF-puskuriin.
         2.3   Fosfaattipuskuroitu glyseroli, pH 7,6
         Tätä puskuria käytetään peittausliuoksena IF-levyjen syvennyksissä fluoresenssin tehostamiseksi.

                     Na2HPO4.12H2O

                     3,2 g

                     NaH2PO4.2H2O

                     0,15 g

                     Glyseroli

                     50 ml

                     Tislattua vettä

                     100 ml

               Haalistumiselta suojaavia peittausaineita on saatavana kaupallisesti, esim. Vectashield® (Vector Laboratories) tai Citifluor® (Leica).
         3.   Puskurit epäsuoraa ELISA-testiä varten
         3.1   Väkevyydeltään kaksinkertainen kiinnityspuskuri, pH 9,6

                     Na2CO3

                     6,36 g

                     NaHCO3

                     11,72 g

                     Tislattua vettä

                     1,00 l

               Liuotetaan ainesosat, tarkastetaan pH ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.
         Natriumsulfiittia (0,2 %) voidaan lisätä antioksidanttina, jos halutaan estää hapettuneiden aromaattisten molekyylien muodostuminen.
         3.2   10X fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), pH 7,4

                     NaCl

                     80,0 g

                     KH2PO4

                     2,0 g

                     Na2HPO4.12H2O

                     29,0 g

                     KCl

                     2,0 g

                     Tislattua vettä

                     1,0 l

               3.3   PBS-Tween

                     10X PBS

                     100 ml

                     10 % Tween 20

                     5 ml

                     Tislattua vettä

                     895 ml

               3.4   Estopuskuri (valmistettava juuri ennen käyttöä)

                     10X PBS

                     10,0 ml

                     Polyvinyylipyrrolidoni-44000 (PVP-44)

                     2,0 g

                     10 % Tween 20

                     0,5 ml

                     Maitojauhe

                     0,5 g

                     Tislattua vettä

                     100 ml:aan asti

               3.5   Emäksinen fosfataasisubstraattiliuos, pH 9,8

                     Dietanolamiini

                     97 ml

                     Tislattua vettä

                     800 ml

               Sekoitetaan ja säädetään pH:ksi 9,8 väkevällä HCI:llä.
         Täytetään 1 l:ksi tislatulla vedellä.
         Lisätään 0,2 g MgCl2:a.
         Liuotetaan 2 × 5 mg fosfataasisubstraattitablettia (Sigma) 15 ml liuosta kohden.
         4.   Puskurit DASI ELISA -testiä varten
         4.1   Kiinnityspuskuri, pH 9,6

                     Na2CO3

                     1,59 g

                     NaHCO3

                     2,93 g

                     Tislattua vettä

                     1 000 ml

               Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH 9,6.
         4.2   10X fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), pH 7,2–7,4

                     NaCl

                     80,0 g

                     NaH2PO4.2 H2O

                     4,0 g

                     Na2HPO4.12H2O

                     27,0 g

                     Tislattua vettä

                     1 000 ml

               4.3   PBS-Tween

                     10X PBS

                     50 ml

                     10 % Tween 20

                     5 ml

                     Tislattua vettä

                     950 ml

               4.4   Substraattipuskuri, pH 9,8

                     Dietanolamiini

                     100 ml

                     Tislattua vettä

                     900 ml

               Sekoitetaan ja säädetään pH:ksi 9,8 väkevällä HCI:llä.

         Lisäys 5
         Bakteerien määrän arvioiminen IF- ja FISH-testeillä

                     1.

                     Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä kenttää kohden (c).

                     2.

                     Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä kuoppaa kohden (C).
                     C = c × S/s

                                 jossa

                                 S

                                 =

                                 monikuoppatestilevyn yhden kuopan pinta-ala

                                 ja

                                 s

                                 =

                                 objektiivikentän pinta-ala

                                 s = πi2/4G2K2

                                 jossa

                                 i

                                 =

                                 kentän kerroin (8-24 okulaarin tyypin mukaan)

                                 K

                                 =

                                 putken kerroin (1 tai 1,25)

                                 G

                                 =

                                 objektiivin suurennos (100-kertainen, 40-kertainen jne.).

                     3.

                     Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohti (N):
                     N = C × 1 000/y × F

                                 jossa

                                 y

                                 =

                                 uudelleen suspendoidun sakan tilavuus kuopassa

                                 ja

                                 F

                                 =

                                 uudelleen suspendoidun sakan laimennuskerroin.

         Lisäys 6
         Validoidut PCR-protokollat ja -reagenssit

            Huomautus: Alustavan testauksen pitäisi mahdollistaa se, että voidaan todeta R. solanacearum -bakteerin solut, joiden pitoisuus on 103–104 näyteuutteen millilitraa kohden. Testi on voitava toistaa.
         Alustavassa testauksessa ei myöskään pitäisi näkyä vääriä positiivisia tuloksia valikoiduilla bakteerikannoilla (ks. lisäys 3).
         1.   PCR-protokolla: Seal et al. (1993)
         1.1   Oligonukleotidialukkeet

                     Koodaavan suunnan aluke OLI-1

                     5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′

                     Vastakkaisen suunnan aluke Y-2

                     5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′

            R. solanacearum -bakteerin templaatti-DNA:sta odotettu amplikonikoko = 288 bp.
         1.2   PCR-reaktioseos

                     Reagenssi

                     Määrä reaktiota kohden

                     Lopullinen pitoisuus

                     Steriiliä ultrapuhdasta vettä

                     17,65 µl

                     10X PCR-puskuri (8) (15 mM MgCl2)

                     2,5 µl

                     1X (1,5 mM MgCl2)

                     dNTP-seos (20 mM)

                     0,25 µl

                     0,2 mM

                     Aluke OLI-1 (20 µM)

                     1,25 µl

                     1µM

                     Aluke Y-2 (20 µM)

                     1,25 µl

                     1µM

                     Taq-polymeraasi (5 U/µl) (8)

                     0,1 µl

                     0,5 U

                     Näytteen tilavuus:

                     2,0 µl

                     Kokonaistilavuus:

                     25 µl

               1.3   PCR-reaktion olosuhteet
         Ajetaan seuraava ohjelma:

                     1 sykli

                     i)

                     2 minuuttia 96 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

                     35 sykliä

                     ii)

                     20 sekuntia 94 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

                     iii)

                     20 sekuntia 68 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen)

                     iv)

                     30 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen)

                     1 sykli

                     v)

                     10 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen)

                     vi)

                     pidetään 4 °C:ssa.

            Huomautus: Tämä ohjelma on optimoitu käytettäväksi Perkin Elmer 9600 -lämpösyklilaitteella. Muut mallit saattavat vaatia syklien ii, iii ja iv keston muuttamisen.
         1.4   Amplikonin restriktio-entsyymianalyysi

            R. solanacearum -bakteerin DNA:sta monistetut PCR-tuotteet tuottavat entsyymillä Ava II tyypillistä restriktiofragmenttien pituuspolymorfiaa, kun niitä on inkuboitu 37 °C:ssa.
         2.   PCR-protokolla: Pastrik ja Maiss (2000)
         2.1   Oligonukleotidialukkeet

                     Koodaavan suunnan aluke Ps-1

                     5′-agt cga acg gca gcg ggg g-3′

                     Vastakkaisen suunnan aluke Ps-2

                     5′-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3′

            R. solanacearum -bakteerin templaatti-DNA:sta odotettu amplikonikoko = 553 bp.
         2.2   PCR-reaktioseos

                     Reagenssi

                     Määrä reaktiota kohden

                     Lopullinen pitoisuus

                     Steriiliä ultrapuhdasta vettä

                     16,025 µl

                     10X PCR-puskuri (9)

                     2,5 µl

                     1X (1,5 mM MgCl2)

                     BSA (fraktio V) (10 %)

                     0,25 µl

                     0,1 %

                     dNTP-seos (20 mM)

                     0,125 µl

                     0,1 mM

                     Aluke Ps-1 (10 µM)

                     0,5 µl

                     0,2 µM

                     Aluke Ps-2 (10 µM)

                     0,5 µl

                     0,2 µM

                     Taq-polymeraasi (5 U/µl) (9)

                     0,1 µl

                     0,5 U

                     Näytteen tilavuus

                     5,0 µl

                     Kokonaistilavuus:

                     25,0 µl

                        Huom: Alun perin optimoitu käytettäväksi MJ Research PTC 200 -lämpösyklilaitteella Gibcon Taq -polymerasilla.
                     Myös Perkin Elmerin AmpliTaqia ja puskuria voidaan käyttää samoina pitoisuuksina.

               2.3   PCR-reaktion olosuhteet
         Ajetaan seuraava ohjelma:

                     1 sykli

                     i)

                     5 minuuttia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

                     35 sykliä

                     ii)

                     30 sekuntia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:

                     iii)

                     30 sekuntia 68 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen)

                     iv)

                     45 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen)

                     1 sykli

                     v)

                     5 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen)

                     vi)

                     pidetään 4 °C:ssa.

            Huomautus: Tämä ohjelma on optimoitu käytettäväksi MJ Research PTC 200 -lämpösyklilaitteella. Muut mallit saattavat vaatia syklien ii, iii ja iv keston muuttamisen.
         2.4   Amplikonin restriktio-entsyymianalyysi

            R. solanacearum -bakteerin DNA:sta monistetut PCR-tuotteet tuottavat entsyymillä Taq I tyypillistä restriktiofragmenttien pituuspolymorfiaa, kun niitä on inkuboitu 65 °C:ssa 30 minuutin ajan. R. solanacearum -spesifisestä fragmentista saadut restriktiofragmentit ovat kooltaan 457 ja 96 emäsparia.
         3.   Moninkertaiseen reaktioon perustuva PCR-testausprotokolla, johon kuuluu sisäinen PCR-kontrolli (Pastrik et al., 2002)
         3.1   Oligonukleotidialukkeet

                     Koodaavan suunnan aluke Rs-1-F

                     5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′

                     Vastakkaisen suunnan aluke Rs-1-R

                     5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′

                     Koodaavan suunnan aluke Ns-5-F

                     5′-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3′

                     Vastakkaisen suunnan aluke Ns-6-R

                     5′-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3′

            R. solanacearum -bakteerin templaatti-DNA:sta odotettu amplikonikoko = 718 bp (Rs-alukesarja).
         18S rRNA sisäisestä PCR-kontrollista odotettu amplikonikoko = 310 emäsparia (Ns-alukesarja).
         3.2   PCR-reaktioseos

                     Reagenssi

                     Määrä reaktiota kohden

                     Lopullinen pitoisuus

                     Steriiliä ultrapuhdasta vettä

                     12,625 µl

                     10X PCR-puskuri (10) (15 mM MgCl2)

                     2,5 µl

                     1X (1,5 mM MgCl2)

                     BSA (fraktio V) (10 %)

                     0,25 µl

                     0,1 %

                     dNTP-seos (20 mM)

                     0,125 µl

                     0,1 mM

                     Aluke Rs-1-F (10 µM)

                     2,0 µl

                     0,8 µM

                     Aluke Rs-1-R (10 µM)

                     2,0 µl

                     0,8 µM

                     Aluke Ns-5-F (10µM) (11)

                     0,15 µl

                     0,06 µM

                     Aluke Ns-6-R (10µM) (11)

                     0,15 µl

                     0,06 µM

                     Taq-polymeraasi (5 U/µl) (10)

                     0,2 µl

                     1,0 U

                     Näytteen tilavuus

                     5,0 µl

                     Kokonaistilavuus:

                     25,0 µl

               3.3   PCR-reaktion olosuhteet
         Ajetaan seuraava ohjelma:

                     1 sykli

                     i)

                     5 minuuttia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

                     35 sykliä

                     ii)

                     30 sekuntia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

                     iii)

                     30 sekuntia 58 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen)

                     iv)

                     45 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen)

                     1 sykli

                     v)

                     5 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen)

                     vi)

                     pidetään 4 °C:ssa.

            Huomautus: Tämä ohjelma on optimoitu käytettäväksi MJ Research PTC 200 -lämpösyklilaitteella. Muut mallit saattavat vaatia syklien ii, iii ja iv keston muuttamisen.
         3.4   Amplikonin restriktio-entsyymianalyysi

            R. solanacearum -bakteerin DNA:sta monistetut PCR-tuotteet tuottavat entsyymillä Bsm I tyypillistä restriktiofragmenttien pituuspolymorfiaa tai isoskitsomeerin (esim. Mva 1269 I), kun niitä on inkuboitu 65 °C:ssa 30 minuutin ajan.
         4.   R. solanacearum -bakteerin biovarispesifinen PCR-protokolla (Pastrik et al., 2001)
         4.1   Oligonukleotidialukkeet

                     Koodaavan suunnan aluke Rs-1-F

                     5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′

                     Vastakkaisen suunnan aluke Rs-1-R

                     5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′

                     Vastakkaisen suunnan aluke Rs-3-R

                     5′-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3′

            R. solanacearum -bakteerin templaatti-DNA:sta odotettu amplikonikoko:
         Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp
         Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.
         4.2   PCR-reaktioseos

                     a)

                     Biovari 1/2 -spesifinen PCR

                                 Reagenssi

                                 Määrä reaktiota kohden

                                 Lopullinen pitoisuus

                                 Steriiliä ultrapuhdasta vettä

                                 12,925 µl

                                 10X PCR-puskuri (12)

                                 2,5 µl

                                 1X (1,5 mM MgCl2)

                                 BSA (fraktio V) (10 %)

                                 0,25 µl

                                 0,1 %

                                 dNTP-seos (20mM)

                                 0,125 µl

                                 0,1 mM

                                 Aluke Rs-1-F (10 µM)

                                 2 µl

                                 0,8 µM

                                 Aluke Rs-1-R (10 µM)

                                 2 µl

                                 0,8 µM

                                 Taq-polymeraasi (5 U/µl) (12)

                                 0,2 µl

                                 1 U

                                 Näytteen tilavuus

                                 5,0 µl

                                 Kokonaistilavuus:

                                 25,0 µl

                     b)

                     Biovari 3/4/5 -spesifinen PCR

                                 Reagenssi

                                 Määrä reaktiota kohden

                                 Lopullinen pitoisuus

                                 Steriiliä ultrapuhdasta vettä

                                 14,925 µl

                                 10X PCR-puskuri (13)

                                 2,5 µl

                                 1X (1,5 mM MgCl2)

                                 BSA (fraktio V) (10 %)

                                 0,25 µl

                                 0,1 %

                                 dNTP-seos (20 mM)

                                 0,125 µl

                                 0,1 mM

                                 Aluke Rs-1-F (10 µM)

                                 1 µl

                                 0,4 µM

                                 Aluke Rs-3-R (10 µM)

                                 1 µl

                                 0,4 µM

                                 Taq-polymeraasi (5 U/µl) (13)

                                 0,2 µl

                                 1 U

                                 Näytteen tilavuus

                                 5,0 µl

                                 Kokonaistilavuus:

                                 25,0 µl

               4.3   PCR-reaktion olosuhteet
         Ajetaan seuraava ohjelma sekä biovari 1/2- että biovari 3/4/5-spesifisiä reaktioita varten:

                     1 sykli

                     i)

                     5 minuuttia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

                     35 sykliä

                     ii)

                     30 sekuntia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

                     iii)

                     30 sekuntia 58 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen)

                     iv)

                     45 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen)

                     1 sykli

                     v)

                     5 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen)

                     vi)

                     pidetään 4 °C:ssa.

            Huomautus: Tämä ohjelma optimoitiin käytettäväksi MJ Research PTC 200 -lämpösyklilaitteella. Muut mallit saattavat vaatia syklien ii, iii ja iv keston muuttamisen.
         4.4   Amplikonin restriktio-entsyymianalyysi

            R. solanacearum -bakteerin DNA:sta alukkeita Rs-1-F ja Rs-1-R käyttämällä monistetut PCR-tuotteet tuottavat entsyymillä Bsm I tyypillistä restriktiofragmenttien pituuspolymorfiaa tai isoskitsomeerin (esim. Mva 1269 I), kun niitä on inkuboitu 65 °C:ssa 30 minuutin ajan. R. solanacearum -bakteerin DNA:sta alukkeita Rs-1-F ja Rs-1-R käyttämällä monistetuilla PCR-tuotteilla ei ole restriktiokohtia.
         5.   Latauspuskurin valmistaminen
         5.1   Bromifenolisininen (10-prosenttinen kantaliuos)

                     Bromifenolisininen

                     5 g

                     Kahteen kertaan tislattua vettä

                     50 ml

               5.2   Latauspuskuri

                     Glyseroli (86 %)

                     3,5 ml

                     Bromifenolisininen (5.1)

                     300 µl

                     Kahteen kertaan tislattua vettä

                     6,2 ml

               6.   10X trisasetaatti-EDTA-puskuri (TAE), pH 8,0

                     Tris-puskuri

                     48,40 g

                     Jääetikka

                     11,42 ml

                     EDTA (dinatriumsuola)

                     3,72 g

                     Tislattua vettä

                     1,00 l

               Laimennetaan 1X:ään ennen käyttöä.
         Saatavana myös kaupallisesti (esim. Invitrogen tai vastaava).

         Lisäys 7
         Validoidut reagenssit FISH-testiä varten
         1.   Oligokoettimet

            R. solanacearum -spesifinen koetin OLI-1-CY3 5′- ggc agg tag caa gct acc ccc-3′
         Ei-spesifinen eubakteriaalinen koetin EUB-338-FITC 5′- gct gcc tcc cgt agg agt -3′
         2.   Kiinniteliuos

            [VAROITUS! KIINNITE SISÄLTÄÄ PARAFORMALDEHYDIÄ, JOKA ON TOKSISTA. SITÄ EI SAA HENGITTÄÄ, JA ON KÄYTETTÄVÄ KÄSINEITÄ. ON SUOSITELTAVAA TYÖSKENNELLÄ VETOKAAPISSA.]

                     i)

                     Kuumennetaan 9 ml molekyylisuodattimilla puhdistettua vettä (esim. ultrapuhdasta vettä – UPW) noin 60 °C:een ja lisätään 0,4 g paraformaldehydiä. Paraformaldehydi liukenee, kun on lisätty 5 tippaa 1N NaOH:ta ja sekoitettu magneettisekoittimella.

                     ii)

                     Säädetään pH arvoon 7,0 lisäämällä 1 ml 0,1 M fosfaattipuskuria (PB; pH 7,0) ja 5 tippaa 1N HCl:ää. Tarkistetaan pH indikaattoriliuskoilla ja säädetään tarvittaessa HCl:llä tai NaOH:lla. [VAROITUS! PARAFORMALDEHYDILIUOKSISSA EI SAA KÄYTTÄÄ PH-MITTARIA.]

                     iii)

                     Suodatetaan liuos 0,22 µm:n kalvosuodattimen läpi ja pidetään pölyltä suojassa 4 °C:ssa, kunnes sitä tarvitaan.

               3.   3X Hybmix

                     NaCl

                     2,7 M

                     Tris-HCl

                     60 mM (pH 7,4)

                     EDTA (suodatinsteriloitu ja autoklavoitu)

                     15 mM

               Laimennetaan 1X:ään tarpeen mukaan.
         4.   Hybridisaatioliuos

                     1X Hybmix

                     Natriumdodekyylisulfaatti (SDS)

                     0,01 %

                     Formamidi

                     30 %,

                     koetin EUB 338

                     5 ng/μl

                     koetin OLI-1 tai OLI-2

                     5 ng/μl

               Valmistetaan taulukossa esitettyjen laskelmien mukaisia määriä hybridisaatioliuosta. Kutakin levyä (jotka sisältävät 2 eri näytettä kahteen kertaan) varten tarvitaan 90 μl hybridisaatioliuosta. TÄRKEÄÄ: FORMAMIDI ON ERITTÄIN TOKSISTA, JOTEN KÄSINEITÄ ON KÄYTETTÄVÄ JA TARVITTAVIIN VAROTOIMIIN ON RYHDYTTÄVÄ!

         Taulukko   Hybridisaatioseoksen valmistamiseen ehdotetut määrät

                     Levyjen lukumäärä:

                     1

                     4

                     6

                     8

                     10

                     Steriiliä ultrapuhdasta vettä

                     23,1

                     92,4

                     138,6

                     184,8

                     231,0

                     3X hybmix

                     30,0

                     120,0

                     180,0

                     240,0

                     300,0

                     1 % SDS

                     0,9

                     3,6

                     5,4

                     7,2

                     9,0

                     Formamidi

                     27,0

                     108,0

                     162,0

                     216,0

                     270,0

                     Koetin EUB 338 (100 ng/μl)

                     4,5

                     18,0

                     27,0

                     36,0

                     45,0

                     Koetin OLI-1 tai OLI-2 (100 ng/μl)

                     4,5

                     18,0

                     27,0

                     36,0

                     45,0

                     Kokonaismäärä (μl)

                     90,0

                     360,0

                     540,0

                     720,0

                     900,0

                        Huom. Varastoidaan kaikki valolle herkkiä oligokoettimia sisältävät liuokset pimeässä –20 °C:ssa.
                     Suojataan käytön aikana suoralta auringonvalolta tai sähkövalolta.

               5.   0,1M fosfaattipuskuri, pH 7,0

                     Na2HPO4

                     8,52 g

                     KH2PO4

                     5,44 g

                     Tislattua vettä

                     1,00 l

               Liuotetaan ainesosat, tarkastetaan pH ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.

         Lisäys 8
         Munakoiso- ja tomaattiviljelmä
         Kylvetään tomaatin (Lycopersicon esculentum) tai munakoison (Solanum melongena) siemeniä pastöroidulle kylvöalustalle. Istutetaan kylvötaimet uudelleen pastöroituun istutusalustaan, kun sirkkalehdet ovat täysin kehittyneet (10–14 päivää).
         Munakoisot tai tomaatit on ennen inokulointia viljeltävä kasvihuoneessa seuraavissa olosuhteissa:

                     Päivän pituus

                     14 tuntia tai luonnollinen päivän pituus, jos se on tätä pidempi

                     Lämpötila

                     päivä 21–24 °C
                     yö 14–18 °C

                     Sopiva tomaattilajike

                     ’Moneymaker’

                     Sopiva munakoisolajike

                     ’Black Beauty’

                     Tomaattien tai munakoisojen toimittajat

                     ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

               VIITTEET

                     1.

                     Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

                     2.

                     Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

                     3.

                     Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.

                     4.

                     Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

                     5.

                     Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

                     6.

                     Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.

                     7.

                     Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

                     8.

                     Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.

                     9.

                     Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

                     10.

                     Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

                     11.

                     Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

                     12.

                     Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

                     13.

                     Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

                     14.

                     Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

                     15.

                     Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

                     16.

                     Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

                     17.

                     Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

                     18.

                     Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

                     19.

                     Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

                     20.

                     Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

                     21.

                     Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

                     22.

                     Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

                     23.

                     Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

                     24.

                     Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

                     25.

                     Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

                     26.

                     Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

                     27.

                     Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

                     28.

                     Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

                     29.

                     Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

                     30.

                     Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

         LIITE III

                     1.

                     Kaikissa epäillyissä esiintymistapauksissa, joiden seulontakokeista on luettelossa olevan kasviaineiston osalta sekä kaikkien muiden tapausten osalta saatu positiivinen tulos käyttäen liitteessä II esitettyä asianmukaista menetelmää ja joille odotetaan vahvistusta tai kumoamista kyseisen menetelmän päätyttyä, olisi säilytettävä ja varastoitava asianmukaisissa olosuhteissa kyseisen menetelmän loppuun saattamiseen asti

                                 —

                                 kaikki mukulat, joista on otettu näyte, ja jos se on mahdollista, kaikki kasvit, joista on otettu näyte,

                                 —

                                 jäljellä oleva uute ja seulontatestejä varten valmistettu lisämateriaali, esim. immunofluoresenssilevyt,
                                 ja

                                 —

                                 kaikki asian kannalta merkityksellinen dokumentaatio kyseisten menetelmien loppuun saattamiseen asti.

                           Mukuloiden säilyttämisen ansiosta voidaan tarvittaessa tehdä lajiketestaus.

                     2.

                     Niissä tapauksissa, joissa organismin esiintyminen on varmistunut, olisi säilytettävä ja varastoitava asianmukaisissa olosuhteissa vähintään yhden kuukauden ajan 5 artiklan 2 kohdassa säädetyn ilmoitusmenettelyn jälkeen

                                 —

                                 1 kohdassa tarkoitettu aineisto,
                                 ja

                                 —

                                 tomaatti- tai munakoisonäyte, joka on saastutettu inokuloimalla mukula- tai kasviuutteella,
                                 ja

                                 —

                                 organismin eristetty viljelmä.

         LIITE IV
         Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan i alakohdassa tarkoitetussa tutkimuksessa olisi tarvittaessa otettava huomioon seuraavat tekijät:

                     i)

                     tuotantopaikat,

                                 —

                                 joilla viljellään tai on viljelty perunoita, jotka polveutuvat samasta kloonista kuin organismin saastuttamat perunat,

                                 —

                                 joilla viljellään tai on viljelty tomaatteja, joiden alkuperä on sama kuin organismin saastuttamien tomaattien,

                                 —

                                 joilla viljellään tai on viljelty perunoita tai tomaatteja, jotka ovat virallisen valvonnan alaisina organismin epäillyn esiintymisen vuoksi,

                                 —

                                 joilla viljellään tai on viljelty perunoita, jotka polveutuvat samasta kloonista kuin perunat, joiden on todettu kasvaneen organismin saastuttamissa tuotantopaikoissa,

                                 —

                                 joilla viljellään perunoita tai tomaatteja, jotka sijaitsevat saastuneiden tuotantopaikkojen läheisyydessä mukaan lukien tuotantopaikat, jotka joutuvat tekemisiin samojen välineiden tai tuotantotilojen kanssa välittömästi tai yhteisen yrittäjän välityksellä,

                                 —

                                 joilla käytetään pintavettä kasteluun tai sumutukseen lähteestä, joka on vahvistettu tai jota epäillään organismin saastuttamaksi,

                                 —

                                 joilla käytetään pintavettä kasteluun tai sumutukseen lähteestä, jota käytetään myös organismin saastuttamiksi vahvistetuilla tai epäillyillä tuotantopaikoilla,

                                 —

                                 joilla organismin saastuttamaksi vahvistettu tai epäilty pintavesi tulvii tai on tulvinut;

                           ja

                     ii)

                     pintavesi, jota käytetään kasteluun tai sumutukseen tai joka on tulvinut pellolla (pelloilla) tai tuotantopaikalla (-paikoilla), jonka on vahvistettu olevan organismin saastuttamia.

         LIITE V

                     1.

                     Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iii alakohdassa ja 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan iii alakohdassa tarkoitetun todennäköisen saastunnan laajuuden määrittämiseen olisi otettava huomioon seuraavat tekijät:

                                 —

                                 luettelossa oleva kasviaineisto, jota on viljelty 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetulla tuotantopaikalla,

                                 —

                                 tuotantopaikat, jotka ovat tuotantojärjestelmässä jossakin yhteydessä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettuun luettelossa olevaan kasviaineistoon, mukaan lukien ne, jotka joutuvat tekemisiin samojen välineiden tai tuotantotilojen kanssa välittömästi tai yhteisen yrittäjän välityksellä,

                                 —

                                 luettelossa oleva kasviaineisto, joka on tuotettu edellisessä luetelmakohdassa tarkoitetulla tuotantopaikalla (-paikoilla) tai joka on mainitulla paikalla (mainituilla paikoilla) aikana, jolloin 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettu luettelossa oleva kasviaineisto oli ensimmäisessä luetelmakohdassa tarkoitetuissa tuotantopaikoissa,

                                 —

                                 tilat, joissa on käsitelty edellä mainituissa luetelmakohdissa tarkoitetuilta tuotantopaikoilta peräisin olevaa luettelossa olevaa kasviaineistoa,

                                 —

                                 kaikki koneet, ajoneuvot, säiliöt, varastot tai näiden osat sekä kaikki muut esineet, mukaan lukien pakkaukset, jotka ovat voineet olla kosketuksissa 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetun luettelossa olevan kasviaineiston kanssa,

                                 —

                                 luettelossa oleva kasviaineisto, joka on varastoitu johonkin edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettuun rakenteeseen tai esineeseen tai joka on ollut kosketuksissa niiden kanssa ennen kyseisten rakenteiden ja esineiden puhdistamista ja desinfiointia,

                                 —

                                 perunan osalta 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan i alakohdassa tarkoitettujen tutkimusten ja testien jälkeen ne mukulat tai kasvit, jotka ovat samaa sisarus- tai vanhemmaiskloonialkuperää, ja tomaatin osalta kasvit, jotka ovat samasta lähteestä kuin 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettu luettelossa oleva kasviaineisto ja joiden saastunta näyttäisi todennäköiseltä samasta kloonista polveutumisen kautta, vaikka niiden testitulokset ovat negatiiviset organismin osalta. Saastuneiden ja samasta kloonista polveutuvien mukuloiden tai kasvien tunnistamisen varmistamiseksi voidaan tehdä lajiketestaus,

                                 —

                                 edellisessä luetelmakohdassa tarkoitetun luettelossa olevan kasviaineiston tuotantopaikka (-paikat),

                                 —

                                 luettelossa olevan kasviaineiston tuotantopaikka (-paikat), jossa (joissa) käytetään 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettua pintavettä kasteluun tai sumutukseen,

                                 —

                                 pelloilla, joilla on tulvinut organismin saastuttamaksi vahvistettu pintavesi, tuotettu luettelossa oleva kasviaineisto.

                     2.

                     Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdassa ja 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan iii alakohdassa tarkoitetun mahdollisen leviämisen määrittämisessä on otettava huomioon seuraavat tekijät:

                                 i)

                                 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan mukaisissa tapauksissa

                                             —

                                             muiden sellaisten tuotantopaikkojen läheisyys, joilla viljellään luettelossa olevaa kasviaineistoa,

                                             —

                                             siemenperunoiden yhteistuotanto ja -käyttö,

                                             —

                                             tuotantopaikat, joilla käytetään pintavettä luettelossa olevan kasviaineiston kasteluun tai sumutukseen, jos kyseessä olevissa tapauksissa 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetulta tuotantopaikalta (-paikoilta) on tai on ollut vaarana valua pintavettä tai jos siellä on tai on ollut tulvimisvaara;

                                 ii)

                                 tapauksissa, joissa pintavesi on edellä 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti ilmoitettu saastuneeksi

                                             —

                                             tuotantopaikka (-paikat), jossa tuotetaan luettelossa olevaa kasviaineistoa ja joka sijaitsee saastuneeksi ilmoitetun pintaveden läheisyydessä tai jossa esiintyy sen tulvimisen uhka,

                                             —

                                             kaikki erilliset kastelualtaat, jotka ovat yhteydessä saastuneeksi ilmoitettuun pintaveteen,

                                             —

                                             kaikki vedet, jotka ovat yhteydessä saastuneeksi ilmoitettuun pintaveteen, ottaen huomioon

                                                         —

                                                         saastuneeksi ilmoitetun veden virtaussuunta ja -nopeus,

                                                         —

                                                         luonnonvaraisten isäntäkasvina toimivien koisokasvien esiintyminen.

                     3.

                     Edellä 5 artiklan 2 kohdan ensimmäisessä alakohdassa tarkoitettu ilmoittaminen on hoidettava seuraavien sääntöjen mukaisesti:

                                 —

                                 välittömästi sen jälkeen, kun kasvintuhoojan esiintyminen on varmistettu laboratoriotestauksella käyttäen liitteessä II esitettyjä menetelmiä, on ilmoitettava ainakin

                                             —

                                             perunoiden osalta

                                                         a)

                                                         perunaerän lajikenimi;

                                                         b)

                                                         tyyppi (ruoka-, siemenperuna jne.) ja tarvittaessa siemenluokka,

                                             —

                                             tomaattikasvien osalta erän lajikenimi ja tarvittaessa luokka,

                                 —

                                 jos on olemassa toisesta jäsenvaltiosta tai toiseen jäsenvaltioon siirrettävään luettelossa olevaan kasviaineistoon liittyvä saastuntariski, sen jäsenvaltion, jossa taudinaiheuttajan esiintyminen on vahvistettu, on ilmoitettava viipymättä kyseiselle toiselle jäsenvaltiolle (-valtioille) 5 artiklan 3 kohdan noudattamisen edellyttämät tiedot, sanotun kuitenkaan rajoittamatta 4 artiklan 3 kohdassa säädettyjä velvoitteita ilmoittaa epäillystä esiintymistapauksesta; näitä tietoja ovat esimerkiksi

                                             a)

                                             peruna- tai tomaattierän lajikenimi;

                                             b)

                                             lähettäjän ja vastaanottajan nimi ja osoite;

                                             c)

                                             peruna- tai tomaattierän toimituspäivämäärä;

                                             d)

                                             toimitetun peruna- tai tomaattierän koko;

                                             e)

                                             jäljennös kasvipassista tai tarvittaessa ainakin kasvipassin numero, tai tarvittaessa viljelijän tai kauppiaan rekisteröintinumero ja jäljennös toimitusilmoituksesta.

                           Komissiolle on viipymättä ilmoitettava tällaisten tietojen toimittamisesta.

                     4.

                     Edellä 5 artiklan 2 kohdan toisessa alakohdassa tarkoitettu ilmoittaminen on hoidettava seuraavien sääntöjen mukaisesti:
                     kun kaikki tutkimukset on tehty, on aina ilmoitettava

                                 a)

                                 päivämäärä, jona saastunta varmistui;

                                 b)

                                 lyhyt kuvaus tutkimuksista, jotka tehtiin saastunnan lähteen ja mahdollisen leviämisen tunnistamiseksi, toteutetun näytteenoton laajuus mukaan luettuna;

                                 c)

                                 tiedot saastunnan tunnistetusta tai oletetusta lähteestä (tai lähteistä);

                                 d)

                                 ilmoitetun saastunnan laajuutta koskevat tiedot, mukaan luettuina tuotantopaikkojen lukumäärä ja perunoiden osalta erien lukumäärä ja lajike sekä siemenperunoiden yhteydessä myös luokka;

                                 e)

                                 alueen rajoittamista koskevat tiedot, mukaan luettuina sellaisten tuotantopaikkojen lukumäärä, joita ei ole ilmoitettu saastuneiksi mutta jotka on sisällytetty alueeseen;

                                 f)

                                 tiedot vedestä, myös veden nimi ja sijainti sekä saastuneeksi toteamisen/kastelukiellon laajuus;

                                 g)

                                 kaikkien saastuneiksi ilmoitettujen tomaattilähetysten tai -erien osalta direktiivin 2000/29/EY 13 artiklan 1 kohdan ii alakohdassa säädetyt todistukset ja passin numero direktiivin 2000/29/EY liitteessä V olevan A kohdan I jakson 2.2 kohdan luettelon mukaisesti;

                                 h)

                                 vahvistettua esiintymistä (tai esiintymisiä) koskevat muut tiedot, joita komissio voi vaatia.

         LIITE VI

                     1.

                     Edellä 6 artiklan 1 kohdassa tarkoitetut säännökset ovat seuraavat:

                                 —

                                 käyttäminen eläinten rehuksi sellaisen lämpökäsittelyn jälkeen, jolla varmistetaan ettei organismi jää henkiin,
                                 tai

                                 —

                                 hävittäminen virallisesti hyväksytyllä tarkoitukseen varatulla jätteidenhävittämispaikalla, jossa ei ole tunnistettavaa riskiä organismin pääsystä ympäristöön, esimerkiksi siten, että se valuisi maatalousmaahan tai joutuisi kosketuksiin sellaisten vedensaantilähteiden kanssa, joita voitaisiin käyttää maatalousmaan kasteluun,
                                 tai

                                 —

                                 tuhkaksi polttaminen,
                                 tai

                                 —

                                 teollinen käsittely toimittamalla suoraan ja välittömästi sellaiselle käsittelylaitokselle, jolla on käytettävissään virallisesti hyväksytyt jätteidenhävitystilat ja -laitteet, joista on todettu, että minkäänlaista tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ei ole, sekä järjestelmä, jolla ainakin laitoksesta lähtevät ajoneuvot voidaan puhdistaa ja desinfioida,
                                 tai

                                 —

                                 muut toimenpiteet, jos on todettu, että minkäänlaista tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ei ole; nämä toimenpiteet ja niiden perustelut on ilmoitettava komissiolle ja muille jäsenvaltioille.

                           Edellä mainittuihin vaihtoehtoihin liittyvä tai niistä syntyvä mahdollinen jäljelle jäävä jäte hävitetään virallisesti hyväksytyillä menetelmillä tämän direktiivin liitteen VII mukaisesti.

                     2.

                     Kyseisen jäsenvaltion (-valtioiden) vastuullisten toimivaltaisten viranomaisten valvonnan alaista 6 artiklan 2 kohdassa tarkoitetun luettelossa olevan kasviaineiston asianmukaista käyttöä tai hävittämistä on, edellyttäen, että toimivaltaisten viranomaisten välillä toimii asianmukainen tiedonvaihto jatkuvan valvonnan varmistamiseksi ja että jäsenvaltion vastuullinen toimivaltainen viranomainen on hyväksynyt ensimmäisessä ja toisessa luetelmakohdassa tarkoitetut jätteidenhävitystilat ja -laitteet paikoissa, joissa perunat on tarkoitus pakata tai jalostaa, seuraava:

                                 i)

                                 perunan mukuloiden osalta

                                             —

                                             niiden käyttö kulutukseen tarkoitettuina ruokaperunoina, suoraan toimitukseen ja käyttöön valmiissa pakkauksissa, jotka eivät edellytä minkäänlaista uudelleen pakkaamista, paikassa, jossa on asianmukaiset jätteidenhävitystilat ja -laitteet. Kylvämiseen tarkoitettuja perunoita saa käsitellä samassa paikassa ainoastaan, jos tämä tapahtuu erikseen tai puhdistuksen ja desinfioinnin jälkeen,
                                             tai

                                             —

                                             niiden käyttö teolliseen käsittelyyn tarkoitettuina perunoina, jotka toimitetaan suoraan ja välittömästi sellaiselle käsittelylaitokselle, jolla on käytettävissään asianmukaiset jätteidenhävitystilat ja -laitteet sekä järjestelmä, jolla ainakin laitoksesta lähtevät ajoneuvot voidaan puhdistaa ja desinfioida,
                                             tai

                                             —

                                             mikä tahansa muu käyttö tai hävittäminen, jos on todettu, että se ei aiheuta tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ja jos se on saanut mainittujen vastuussa olevien viranomaisten hyväksynnän;

                                 ii)

                                 muiden kasvin osien osalta, varsien ja lehtien jätteet mukaan luettuina,

                                             —

                                             hävittäminen,
                                             tai

                                             —

                                             mikä tahansa muu käyttö tai hävittäminen, jos on todettu, että se ei aiheuta tunnistettavaa organismin leviämisvaaraa, ja jos se on saanut mainittujen vastuullisten toimivaltaisten viranomaisten hyväksynnän.

                     3.

                     Asianmukaiset 6 artiklan 3 kohdassa tarkoitettujen esineiden puhdistamismenetelmät ovat pesu ja tarvittaessa desinfioiminen siten, että ne eivät aiheuta tunnistettavaa organismin leviämisvaaraa; niitä on käytettävä jäsenvaltioiden vastuullisten viranomaisten valvonnassa.

                     4.

                     Toimenpiteisiin, jotka jäsenvaltioiden on toteutettava 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan ja 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan iii alakohdan mukaisesti vahvistetuilla ja 6 artiklan 4 kohdassa tarkoitetuilla alueilla on kuuluttava seuraavat toimenpiteet:

                     4.1

                     Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneiksi ilmoitettujen tuotantopaikkojen tapauksissa

                                 a)

                                 edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetulla pellolla tai katteen alla kasvatettujen satokasvien tuotantoyksikössä joko

                                             i)

                                             ilmoitettua saastuntaa seuraavien vähintään neljän kasvuvuoden aikana

                                                         —

                                                         toteutetaan toimenpiteitä ylivuotisten perunan ja tomaatin kasvien sekä muiden organismin isäntäkasvien, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina, hävittämiseksi,
                                                         ja

                                                         —

                                                         ei istuteta eikä kylvetä

                                                                     —

                                                                     perunan mukuloita, kasveja tai siemeniä,

                                                                     —

                                                                     tomaatin kasveja tai siemeniä,

                                                                     —

                                                                     organismin biologia huomioon ottaen

                                                                     —

                                                                     muita isäntäkasveja,

                                                                     —

                                                                        Brassica-sukuisia kaaleja, joiden osalta on olemassa tunnistettava vaara, että organismi säilyy hengissä,

                                                                     —

                                                                     satokasveja, joiden osalta on tunnistettu organismin leviämisvaara,

                                                         —

                                                         edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettua ajanjaksoa seuraavan ensimmäisen perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana ja edellyttäen, että pelto on virallisen tarkastuksen yhteydessä todettu vähintään kahden perättäisen kasvuvuoden aikana ennen istuttamista vapaaksi ylivuotisista perunan tai tomaatin kasveista tai muista isäntäkasveista, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina,

                                                                     —

                                                                     perunoiden osalta sallitaan ainoastaan ruokaperunan tuotanto,

                                                                     —

                                                                     perunoiden ja tomaattien osalta korjatut mukulat tai tomaattikasvit on tutkittava liitteessä II kuvatun menettelyn mukaisesti,

                                                         —

                                                         edeltävässä luetelmakohdassa tarkoitettua kautta seuraavan perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana ja sopivan viljelykierron jälkeen – jonka pituus on vähintään kaksi vuotta, jos on kasvatettava siemenperunoita – perunoiden ja tomaattien osalta suoritetaan virallisia tutkimuksia 2 artiklan 1 kohdan mukaisesti;

                                                   tai

                                             ii)

                                             ilmoitettua saastuntaa seuraavien viiden kasvuvuoden aikana

                                                         —

                                                         toteutetaan toimenpiteitä ylivuotisten peruna- ja tomaattikasvien ja muiden luonnossa esiintyvien organismin isäntäkasvien, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina, hävittämiseksi,
                                                         ja

                                                         —

                                                         pelto jätetään avokesannoksi ja sitä pidetään ensimmäisten kolmen vuoden ajan joko avokesantona tai viljalla tunnistetusta vaarasta riippuen tai se jätetään pysyvästi laitumeksi, jolloin sitä joko niitetään usein ja lyhyeksi tai laidunnetaan tehokkaasti, tai se pidetään nurmella siementuotantoa varten, minkä jälkeen seuraavien kahden vuoden ajan siinä viljellään muita kuin organismin isäntäkasveja, joista ei aiheudu tunnistettavaa organismin säilymis- tai leviämisvaaraa,

                                                         —

                                                         edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettua ajanjaksoa seuraavan ensimmäisen perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana ja edellyttäen, että pelto on virallisen tarkastuksen yhteydessä todettu vähintään kahden perättäisen kasvuvuoden aikana ennen istuttamista vapaaksi ylivuotisista perunan tai tomaatin kasveista tai muista isäntäkasveista, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina,

                                                                     —

                                                                     perunoiden osalta sallitaan ainoastaan siemen- tai ruokaperunan tuotanto,

                                                                     —

                                                                     korjatut mukulat tai tomaattikasvit on tutkittava liitteessä II kuvatun menettelyn mukaisesti;

                                 b)

                                 kaikilla muilla saastuneen tuotantopaikan pelloilla, jos vastuussa olevilla viranomaisilla on varmuus siitä, että ylivuotiset peruna- ja tomaattikasvit ja muut luonnostaan esiintyvät kasvintuhoojan isäntäkasvit, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina, on hävitetty

                                             —

                                             ilmoitettua saastuntaa seuraavan kasvuvuoden aikana

                                                         —

                                                         ei istuteta tai kylvetä yhtään perunan mukulaa, kasvia tai siementä tai muuta kasvintuhoojan isäntäkasvia,
                                                         tai

                                                         —

                                                         perunan mukuloiden osalta istutetaan sertifioitua siemenperunaa ainoastaan ruokaperunan tuottamiseksi,

                                                         —

                                                         tomaattien osalta istutetaan tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, ainoastaan hedelmien tuottamiseksi,

                                             —

                                             ilmoitettua saastuntaa seuraavan toisen kasvuvuoden aikana

                                                         —

                                                         istutetaan tai kylvetään siemen- tai ruokaperunan tuottamiseksi ainoastaan varmennettuja siemenperunoita tai siemenperunoita, jotka on virallisissa testeissä todettu perunan tummasta rengasmädästä vapaiksi ja jotka on kasvatettu virallisessa valvonnassa muissa kuin 4.1 kohdassa tarkoitetuissa tuotantopaikoissa,

                                                         —

                                                         istutetaan tai kylvetään kasvien tai hedelmien tuottamiseksi ainoastaan sellaisia tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai jos ne on lisätty kasvullisesti, tomaattikasveista, jotka on tuotettu sellaisesta siemenestä ja kasvatettu virallisessa valvonnassa muissa kuin 4.1 kohdassa tarkoitetuissa tuotantopaikoissa,

                                             —

                                             vähintäänkin kolmannen ilmoitettua saastuntaa seuraavan kasvuvuoden aikana

                                                         —

                                                         perunoiden osalta istutetaan ainoastaan sertifioituja siemenperunoita tai sertifioiduista siemenperunoista virallisen valvonnan alaisina kasvatettuja siemenperunoita joko siemenen tai ruokaperunan tuottamiseksi,

                                                         —

                                                         tomaattien osalta istutetaan ainoastaan sellaisia tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai virallisessa valvonnassa tällaisista kasveista kasvatettuja tomaattikasveja, joko kasvien tai hedelmien tuottamiseksi,

                                             —

                                             edellisissä alakohdissa tarkoitettujen kasvuvuosien aikana toteutetaan toimenpiteitä ylivuotisten peruna- ja tomaattikasvien ja muiden luonnostaan esiintyvien kasvintuhoojan isäntäkasvien hävittämiseksi, jos niitä esiintyy, ja tehdään korjattavalle sadolle sopivina ajankohtina virallinen tarkastus ja tehdään kullakin perunapellolla virallisia testejä korjatuille perunoille liitteessä II kuvatun menettelyn mukaisesti;

                                 c)

                                 välittömästi 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisen saastunnan toteamisen jälkeen ja ensimmäisenä tätä seuraavana kasvuvuotena

                                             —

                                             kaikki tuotantopaikan koneet ja varastotilat, joita käytetään perunan ja tomaatin tuotantoon, on puhdistettava ja tarvittaessa desinfioitava sopivin menetelmin 3 kohdan mukaisesti,

                                             —

                                             kastelu- ja sumutusohjelmia sekä niiden kieltoa koskevia virallisia tarkastuksia on tarvittaessa toteutettava organismin leviämisen estämiseksi;

                                 d)

                                 edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetussa, katteen alla kasvatettujen satokasvien yksikössä, jossa kasvualustan korvaaminen kokonaan on mahdollista

                                             —

                                             mukuloita, kasveja tai siemeniä tai muita organismin isäntäkasveja, tomaattikasvit ja tomaatin siemenet mukaan luettuina, saa istuttaa tai kylvää ainoastaan, jos tuotantoyksikköön sovelletaan virallisessa valvonnassa toimenpiteitä, joiden tarkoituksena on organismin ja kaikkien isäntäkasviaineistoon kuuluvien kasvien hävittäminen, mukaan lukien vähintään kasvualustan vaihtaminen kokonaan sekä kyseisen yksikön ja kaikkien välineiden puhdistus ja tarvittaessa desinfiointi, ja jos vastuulliset viranomaiset ovat tämän seurauksena hyväksyneet sen perunan tai tomaatin tuotantoon,
                                             ja

                                             —

                                             perunantuotannossa perunoita tuotetaan sertifioiduista siemenperunoista tai testatuista lähteistä olevista minimukuloista tai mikrokasveista,

                                             —

                                             tomaatintuotannossa tomaatteja tuotetaan direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai jos ne on lisätty kasvullisesti, tomaattikasveista, jotka on tuotettu sellaisesta siemenestä ja kasvatettu virallisessa valvonnassa,

                                             —

                                             kastelu- ja sumutusohjelmia sekä niiden kieltoa koskevia virallisia tarkastuksia on tarvittaessa toteutettava organismin leviämisen estämiseksi.

                     4.2

                     Rajoittamatta 4.1 kohdassa lueteltujen toimenpiteiden soveltamista, jäsenvaltioiden on rajoitusalueen sisällä

                                 a)

                                 huolehdittava siitä, että välittömästi ilmoitetun saastunnan jälkeen kaikki tuotantopaikan laitteistot ja varastotilat, jotka ovat yhteydessä perunan tai tomaatin tuotantoon, puhdistetaan ja desinfioidaan tarvittaessa 3 kohdassa tarkoitetuilla sopivilla menetelmillä;

                                 b)

                                 välittömästi todetun saastunnan jälkeen ja sen jälkeen vähintään kolmen kasvuvuoden ajan

                                             ba)

                                             edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan mukaisesti määritetyn alueen osalta

                                                         —

                                                         määrättävä vastuulliset viranomaiset valvomaan tiloja, joissa harjoitetaan perunan mukuloiden tai tomaattien viljelyä varastointia tai käsittelyä, sekä niiden yritysten tiloja, jotka käyttävät perunan- tai tomaatintuotannossa koneita sopimuksen perusteella,

                                                         —

                                                         vaadittava, että kyseisen alueen kaikki perunasadot istutetaan ainoastaan sertifioitua siementä käyttäen tai virallisen valvonnan alaisena kasvatettua siementä ja että korjuun jälkeen testataan 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iii alakohdan mukaisesti mahdollisesti saastuneiksi määritellyillä tuotantopaikoilla kasvaneet siemenperunat,

                                                         —

                                                         vaadittava, että kaikissa alueen yrityksissä siemenperuna ja ruokaperuna käsitellään erillään tai että siemen- ja ruokaperunoiden käsittelyn välillä huolehditaan tarvittaessa puhdistamisesta ja desinfioinnista,

                                                         —

                                                         vaadittava, että kaiken alueella kasvatettavan tomaattisadon istutukseen käytetään ainoastaan tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai jos ne on lisätty kasvullisesti, tomaattikasveja, jotka on tuotettu sellaisesta siemenestä ja kasvatettu virallisessa valvonnassa,

                                                         —

                                                         toteutettava viralliset tutkimukset 2 artiklan 1 kohdan mukaisesti;

                                             bb)

                                             edellä 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetun tai liitteessä V olevan 2 kohdan mukaisesti organismin mahdollisen leviämisen määrittämisessä huomioon otettaviin tekijöihin kuuluvan pintaveden osalta

                                                         —

                                                         toteutettava luettelossa olevan kasviaineiston osalta soveltuvina ajankohtina vuosittainen tutkimus, joka käsittää näytteenoton pintavedestä sekä asiaankuuluvista isäntäkoisokasveista soveltuviin vedensaantilähteisiin liittyen sekä testauksen liitteessä II vahvistetuin soveltuvin menetelmin ja muiden tapausten osalta,

                                                         —

                                                         toteutettava virallisia tarkastuksia, jotka koskevat kastelu- ja sumutusohjelmia sekä saastuneeksi ilmoitetun veden luettelossa olevan kasviaineiston kasteluun ja sumutukseen tarkoitettua käyttöä koskevaa kieltoa ja tarvittaessa muita isäntäkasveja organismin leviämisen estämiseksi. Kieltoa voidaan tarkistaa mainitussa vuosittaisessa tutkimuksessa saatujen tulosten perusteella ja saastuneeksi toteaminen voidaan peruuttaa, jos vastuullinen toimivaltainen viranomainen katsoo, että pintavesi ei enää ole saastunutta. Kiellon kohteena olevan veden käyttö isäntäkasvien kasteluun ja sumutukseen voidaan sallia virallisessa valvonnassa, jos käytetään virallisesti hyväksyttyjä menetelmiä, joilla taudinaiheuttaja hävitetään ja sen leviäminen estetään,

                                                         —

                                                         saastuneiden nestemäisten jätepäästöjen osalta toteutettava virallisia tarkastuksia, jotka koskevat luettelossa olevaa kasviaineistoa käsittelevien teollisten jalostus- ja pakkauslaitosten kiinteiden jätteiden tai nestemäisten jätepäästöjen hävittämistä;

                                 c)

                                 laadittava tarvittaessa ohjelma kaikkien siemenperunavarastojen korvaamiseksi sopivan ajanjakson kuluessa.

         LIITE VII
         Liitteessä VI olevassa 1 kohdassa tarkoitettujen virallisesti hyväksyttyjen jätteidenhävitysmenetelmien on vastattava seuraavia säännöksiä siten, että vältetään mahdollinen tunnistettava kasvintuhoojan leviämisvaara:

                     i)

                     peruna- ja tomaattijäte (hylätyt perunat ja kuoret ja tomaatit mukaan luettuina) ja mahdollinen muu perunoihin ja tomaatteihin liittyvä kiinteä jäte (maaperä, kivet ja muu jäte mukaan luettuina) hävitetään joko

                                 —

                                 hävittämällä virallisesti hyväksytyllä tarkoitukseen varatulla jätteidenhävittämispaikalla, jossa ei ole tunnistettavaa riskiä kasvintuhoojan pääsystä ympäristöön, esimerkiksi siten, että se imeytyisi maatalousmaahan tai joutuisi kosketuksiin sellaisten vedensaantilähteiden kanssa, joita saatetaan käyttää maatalousmaan kasteluun; jäte on kuljetettava suoraan hävittämispaikalle pakkaamalla se siten, ettei ole vaaraa jätteen häviämisestä,
                                 tai

                                 —

                                 tuhkaksi polttamalla,
                                 tai

                                 —

                                 muilla toimenpiteillä, jos on todettu, että minkäänlaista tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ei ole; nämä toimenpiteet on ilmoitettava komissiolle ja muille jäsenvaltioille;

                     ii)

                     nestemäinen jäte: nestemäinen jäte, joka sisältää suspendoituneita kiinteitä aineita, suodatetaan ennen hävittämistä tai kiintoaineet poistetaan laskeuttamalla. Nämä kiintoaineet hävitetään i alakohdassa esitetyllä tavalla.
                     Tämän jälkeen nestemäinen jäte joko

                                 —

                                 kuumennetaan kauttaaltaan vähintään 60 °C:seen 30 minuutin ajaksi ennen hävittämistä,
                                 tai

                                 —

                                 hävitetään muulla virallisesti hyväksytyllä tavalla virallisessa valvonnassa siten, ettei ole olemassa tunnistettavaa riskiä jätteen pääsystä kosketuksiin maatalousmaan tai sellaisten vedensaantilähteiden kanssa, joita saatetaan käyttää maatalousmaan kasteluun. Asiaan liittyvät yksityiskohdat on ilmoitettava muille jäsenvaltioille ja komissiolle.

               Tässä liitteessä kuvatut vaihtoehdot koskevat myös saastuneiden erien käsittelyyn, hävittämiseen ja prosessointiin liittyvää jätettä.
      ”

      (1)  Ks. Lelliott and Stead (1987).

      (2)  Yhteyshenkilöt: ks. www-sivusto .

      (3)  Käytetään R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 (rotu 3) standardoituna viitekantana.

      (4)  Serologisissa testeissä (IF ja/tai ELISA), joissa käytetään polyklonaalisia antiseerumeita, potentiaalisesti ristiin reagoiva kanta.

      (5)  Kanta, josta joissakin laboratorioissa voidaan monistaa PCR-tuote, joka on vastaavan kokoinen kuin spesifisiä OLI-1- ja Y-2-alukkeita käytettäessä odotettava tulos (ks. lisäys 6).

      (6)  Aiheuttaa todennäköisesti ristireaktion useimmissa testeissä mutta esiintyy tunnetusti ainoastaan banaanissa Indonesiassa.

      (7)  Käytetään homogenoimalla tapahtuvassa uuttamismenettelyssä.

      (8)  Menetelmä validoitiin käyttäen Perkin Elmerin Taq-polymeraasia (AmpliTaq) ja Gibco BRL:tä.

      (9)  Menetelmät validoitiin käyttäen Perkin Elmerin Taq-polymeraasia (AmpliTaq) ja Gibco BRL:tä.

      Huom: Alun perin optimoitu käytettäväksi MJ Research PTC 200 -lämpösyklilaitteella Gibcon Taq -polymerasilla.
   Myös Perkin Elmerin AmpliTaqia ja puskuria voidaan käyttää samoina pitoisuuksina.

      (10)  Menetelmät validoitiin käyttäen Perkin Elmerin Taq-polymeraasia (AmpliTaq) ja Gibco BRL:tä.

      (11)  Alukkeiden Ns-5-F ja Ns-6-R konsentraatio optimoitiin perunan napapääuutteelle käyttäen homogenointimenettelyä ja DNA:n puhdistusta Pastrikin mukaan (2000) (ks. VI jakson A kohdan 6.1.a alakohta). Reagenssien konsentraatiot on optimoitava uudelleen, jos käytetään ravistamalla tapahtuvaa uuttamismenetelmää tai muuta DNA:n eristämismenetelmää.

      (12)  Menetelmät on validoitu käyttäen Perkin Elmerin Taq-polymeraasia (AmpliTaq) ja Gibco BRL:tä.

      (13)  Menetelmät on validoitu käyttäen Perkin Elmerin Taq-polymeraasia (AmpliTaq) ja Gibco BRL:tä.