title: Nõukogu direktiiv 98/81/EÜ, 26. oktoober 1998, millega muudetakse direktiivi 90/219/EMÜ geneetiliselt muundatud mikroorganismide isoleeritud kasutamise kohta

text:
Tähtis õiguslik teade

|

31998L0081

Euroopa Liidu Teataja L 330 , 05/12/1998 Lk 0013 - 0031

		Nõukogu direktiiv 98/81/EÜ,26. oktoober 1998,millega muudetakse direktiivi 90/219/EMÜ geneetiliselt muundatud mikroorganismide isoleeritud kasutamise kohtaEUROOPA LIIDU NÕUKOGU,võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut, eriti selle artikli 130s lõiget 1,võttes arvesse komisjoni ettepanekut, [1]võttes arvesse majandus- ja sotsiaalkomitee arvamust, [2]vastavalt asutamislepingu artiklis 189c sätestatud menetlusele [3]ning arvestades, et:(1) asutamislepingu tähenduses põhinevad ühenduse keskkonnaalased meetmed ennetusmeetmete võtmisel ja nende eesmärk on säilitada, kaitsta ja parandada keskkonda ning kaitsta inimeste tervist;(2) geneetiliselt muundatud mikroorganismide (GMMide) isoleeritud kasutamised tuleks liigitada vastavalt ohtudele, mida nad tekitavad inimeste tervisele ja keskkonnale; selline liigitus peaks olema kooskõlas rahvusvahelise tavaga ja põhinema riskianalüüsil;(3) kaitstuse kõrge taseme tagamiseks peavad isoleeritud kasutamise suhtes kohaldatavad isoleerimis- ja muud kaitsemeetmed vastama isoleeritud kasutamise liigitusele; ebakindluse korral tuleks kohaldada kõrgemale liigitusele vastavaid isoleerimis- ja muid kaitsemeetmeid, kuni sobivad andmed õigustavad leebemaid meetmeid;(4) GMMide isoleeritud kasutamisel tekkinud materjali kõrvaldamise kontrollimiseks tuleks vastu võtta ja kasutada sobivaid meetmeid;(5) GMMid, mis kõrvaldatakse ilma sobivate säteteta konkreetsete isoleerimismeetmete kohta, mis piiraksid nende kokkupuudet rahvastiku ja keskkonnaga, ei kuulu käesoleva direktiivi reguleerimisalasse; kohaldada võidakse muid ühenduse õigusakte, nagu nõukogu 23. aprilli 1990. aasta direktiivi 90/220/EMÜ geneetiliselt muundatud organismide tahtliku keskkonda viimise kohta; [4](6) käesoleva direktiivi alusel tehtavad erandid ei hõlma ühegi teise võimalikult kohaldatava ühenduse õigusakti, näiteks direktiivi 90/220/EMÜ alusel tehtavaid erandeid;(7) igasuguse GMMe hõlmava tegevuse suhtes tuleks vastavalt asjakohastele ühenduse õigusaktidele kohaldada hea mikrobioloogilise tava ning hea tööohutuse ja -hügieeni põhimõtteid;(8) isoleeritud kasutamise suhtes kohaldatavad isoleerimis- ja muud kaitsemeetmed tuleks korrapäraselt läbi vaadata;(9) isoleeritud kasutamisega seotud inimestega tuleks konsulteerida vastavalt asjakohaste ühenduse õigusaktide, eriti töötajate kaitset bioloogiliste mõjuritega kokkupuutest tulenevate ohtude eest tööl käsitleva nõukogu 26. novembri 1990. aasta direktiivi 90/679/EMÜ (seitsmes üksikdirektiiv direktiivi 89/391/EMÜ artikli 16 lõikes 1 määratletud tähenduses) [5] nõuetele;(10) direktiivis 90/219/EMÜ [6] on leitud nõrkusi; halduskord ja teatamise nõuded tuleks ühendada isoleeritud kasutamise ohtudega;(11) direktiiv 90/219/EMÜ ei võimaldanud piisavat kohandamist tehnika arenguga; selle direktiivi tehnilised osad tuleb kohandada tehnika arenguga;(12) direktiivi 90/219/EMÜ rakendamiseks oleks kasulik lisada inimeste tervisele ja keskkonnale ohutute GMMide nimekiri; ohutuse kindlakstegemiseks peaksid need GMMid vastama teatavatele kriteeriumidele;(13) biotehnoloogia arengutempot, kujundatavaid kriteeriume ja selle nimekirja piiratud ulatust arvestades on nõukogul sobiv neid kriteeriume kindlaks määrata ja üle vaadata;(14) nüüd on olemas märkimisväärsed kogemused ja teadmised GMMide isoleeritud kasutamisest tulenevate ohtude kohta;(15) seetõttu tuleks direktiivi 90/219/EMÜ vastavalt muuta,ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:Artikkel 1Käesolevaga muudetakse direktiivi 90/219/EMÜ järgmiselt.1. Artiklid 2-16 asendatakse järgmise tekstiga:"Artikkel 2mikroorganism — rakuline või mitterakuline mikrobioloogiline isend, kes on võimeline replikatsiooniks või geneetilise materjali ülekandeks, kaasa arvatud viirused, viroidid, loomsed ja taimsed rakukultuurid;geneetiliselt muundatud mikroorganism (GMM) i) kasutatakse geneetilisel muundamisel vähemalt I lisa A osas loetletud meetodeid;ii) käsitletakse I lisa B osas loetletud meetodeid geneetilist muundamist mittepõhjustavatena;isoleeritud kasutamine — iga tegevus, mille käigus mikroorganisme geneetiliselt muundatakse või selliseid GMMe kasvatatakse, ladustatakse, veetakse, hävitatakse, käsutatakse või mõnel muul viisil kasutatakse ja mille puhul kasutatakse erilisi isoleerimismeetmeid, et piirata nende kokkupuudet rahvastiku ja keskkonnaga ning tagada viimati nimetatute ohutuse kõrge tase;õnnetus — kõik juhtumid, millega kaasneb isoleeritud kasutamise käigus GMMide märkimisväärne ja ettekavatsematu vabastamine, mis võib põhjustada vahetut või hilisemat ohtu inimeste tervisele või keskkonnale;kasutaja — iga füüsiline või juriidiline isik, kes vastutab GMMide isoleeritud kasutamise eest;teatamine — nõutava teabe esitamine liikmesriigi pädevatele asutustele.Artikkel 3Ilma et see piiraks artikli 5 lõike 1 kohaldamist, ei kohaldata käesolevat direktiivi:- juhul, kui geneetiline muundamine saavutatakse II lisa A osas loetletud menetluste/meetodite kasutamise teel, või- isoleeritud kasutamise suhtes, mis hõlmab ainult II lisa B osas loetletud kriteeriumidele vastavaid GMMide liike, mis kinnitavad nende ohutust inimeste tervisele ja keskkonnale. Need GMMide liigid on loetletud II lisa C osas.Artikkel 4Artikli 5 lõikeid 3 ja 6 ning artikleid 6-12 ei kohaldata GMMide veo suhtes maanteel, raudteel, siseveeteedel, merel või õhus.Käesolevat direktiivi ei kohaldata GMMide ladustamise, kultureerimise, veo, hävitamise, käsutamise või kasutamise suhtes, mis on turule viidud vastavalt nõukogu 23. aprilli 1990. aasta direktiivile 90/220/EMÜ geneetiliselt muundatud organismide tahtliku keskkonda viimise kohta [7] või muudele ühenduse õigusaktidele, mis sätestavad konkreetse selles direktiivis ettenähtule sarnase keskkonnaalase riskianalüüsi juhul, kui isoleeritud kasutamine on kooskõlas turule viimise nõusoleku võimalike tingimustega.Artikkel 51. Liikmesriigid tagavad kõigi vajalike meetmete võtmise, et vältida GMMide isoleeritud kasutamisest tulenevat võimalikku kahjulikku mõju inimeste tervisele ja keskkonnale.2. Sel eesmärgil annab kasutaja isoleeritud kasutamisele hinnangu ohtude osas, mida selline isoleeritud kasutamine võib tekitada inimeste tervisele ja keskkonnale, kasutades vähemalt III lisa A ja B jaos sätestatud hindamise elemente ja korda.3. Lõikes 2 nimetatud hinnangu tulemus on isoleeritud kasutamiste lõplik liigitamine nelja liiki, kohaldades III lisas ettenähtud korda, mille tulemusel määratakse isoleerimistasemed vastavalt artiklile 6:Liik 1 : ohutud või tühiselt ohtlikud tegevused, s.o tegevused, mille puhul inimeste tervise ja keskkonna kaitseks sobib isoleerituse 1. tase.Liik 2 : vähem ohtlikud tegevused, s.o tegevused, mille puhul inimeste tervise ja keskkonna kaitseks sobib isoleerituse 2. tase.Liik 3 : mõõdukalt ohtlikud tegevused, s.o tegevused, mille puhul inimeste tervise ja keskkonna kaitseks sobib isoleerituse 3. tase.Liik 4 : väga ohtlikud tegevused, s.o tegevused, mille puhul inimeste tervise ja keskkonna kaitseks sobib isoleerituse 4. tase.4. Kui pole selge, milline liik sobib kavandatava isoleeritud kasutamise puhul, kohaldatakse rangemaid kaitsemeetmeid, kui piisav tõendus pädeva asutuse nõusolekul ei õigusta leebemate meetmete kasutamist.5. Lõikes 2 nimetatud hinnangus võetakse eriti arvesse jäätmete ja heitvete kõrvaldamist. Vajaduse korral rakendatakse inimeste tervise ja keskkonna kaitseks vajalikke ohutusmeetmeid.6. Kasutaja säilitab lõikes 2 nimetatud hindamise protokolli ja teeb selle sobival kujul pädevale asutusele kättesaadavaks teatamise osana vastavalt artiklitele 7, 9 ja 10 või taotluse põhjal.Artikkel 61. Välja arvatud määral, mil IV lisa punkt 2 võimaldab kohaldada muid meetmeid, kohaldab kasutaja IV lisas sätestatud üldpõhimõtteid ning kohaseid isoleerimis- ja muid kaitsemeetmeid, mis vastavad isoleeritud kasutamise liigile, et hoida töökoha ja keskkonna kokkupuuteid kõigi GMMidega madalaimal tegelikult võimalikul tasemel ja tagada ohutuse kõrge tase.2. Artikli 5 lõikes 2 nimetatud hinnang ning kohaldatavad isoleerimis- ja muud kaitsemeetmed vaadatakse läbi korrapäraselt ja viivitamatult juhul, kui:a) kohaldatavad isoleerimismeetmed ei ole enam piisavad või isoleeritud kasutamisele määratud liik ei ole enam õige, võib) on põhjust kahtlustada, et uute teaduslike või tehniliste teadmiste põhjal otsustades ei ole hinnang enam sobiv.Artikkel 7Kui tööruume kasutatakse esmakordselt isoleeritud kasutamiseks, peab kasutaja esitama pädevatele asutustele enne sellise kasutamise algust teate, mis sisaldab vähemalt V lisa A osas loetletud teavet.Artikkel 8Pärast artiklis 7 nimetatud teatamist võib edasine 1. liigi isoleeritud kasutamine jätkuda uue teatamiseta. 1. liigi GMMide isoleeritud kasutamise korral peavad kasutajad säilitama iga artikli 5 lõikes 6 nimetatud hinnangu dokumentatsiooni, mis tehakse taotluse põhjal kättesaadavaks pädevale asutusele.Artikkel 91. Vastavalt artiklile 7 teatatud tööruumides toimuvate esmakordsete ja järgnevate 2. liigi kasutamiste puhul esitatakse V lisa B osas loetletud teavet sisaldav teade.2. Kui tööruumide kohta on esitatud varasem teade 2. või kõrgema liigi isoleeritud kasutamise kohta ja kõik sellega seotud nõusoleku nõuded on täidetud, võib 2. liigi isoleeritud kasutamine jätkuda kohe pärast teatamist.Taotleja ise võib pädevalt asutuselt taotleda ametliku loa andmise otsust. Otsus tuleb teha hiljemalt 45 päeva jooksul pärast teatamist.3. Kui tööruumide kohta pole varem esitatud teadet 2. või kõrgema liigi isoleeritud kasutamise kohta, võib 2. liigi isoleeritud kasutamine jätkuda, kui teatamisest on möödunud 45 päeva, või pädeva asutuse nõusolekul varem, kui pädev asutus ei esita mingeid vastuväiteid.Artikkel 101. Vastavalt artiklile 7 teatatud tööruumides toimuvate esmakordsete ja järgnevate 3. või 4. liigi kasutamiste puhul esitatakse V lisa C osas loetletud teavet sisaldav teade.2. 3. või kõrgema liigi isoleeritud kasutamine ei tohi jätkuda ilma eelneva nõusolekuta pädevalt asutuselt, kes edastab oma otsuse kirjalikult:a) hiljemalt 45 päeva möödumisel uue teate esitamist tööruumide puhul, mille suhtes on varem esitatud teade 3. või kõrgema liigi isoleeritud kasutamise kohta ja kus kõik vastavad nõusoleku nõuded isoleeritud kasutamise kavandatava või kõrgema liigi jaoks on täidetud;b) muudel juhtudel hiljemalt 90 päeva möödumisel teate esitamisest.Artikkel 111. Liikmesriigid määravad asutuse või asutused, mis on pädevad rakendama meetmeid, mida nad võtavad käesoleva direktiivi kohaldamiseks, ning vastu võtma ja heaks kiitma artiklites 7, 9 ja 10 nimetatud teateid.2. Pädevad asutused uurivad teadete vastavust käesoleva direktiivi nõuetele, esitatud teabe täpsust ja täielikkust, artikli 5 lõikes 2 nimetatud hinnangu õigsust ja isoleeritud kasutamise liiki ning vajaduse korral isoleerimis- ja muude kaitsemeetmete, jäätmekorralduse ja päästemeetmete sobivust.3. Vajaduse korral võib pädev asutus:a) paluda kasutajal esitada edasist teavet või muuta kavandatava isoleeritud kasutamise tingimusi või muuta isoleeritud kasutamis(t)ele määratud liiki. Sel juhul võib pädev asutus nõuda, et isoleeritud kasutamine, kui seda kavandatakse, ei algaks, või kui see toimub, peatataks või lõpetataks, kuni pädev asutus on andnud oma heakskiidu saadud edasise teabe või isoleeritud kasutamise muudetud tingimuste alusel;b) piirata isoleeritud kasutamise loa tähtaega või seada sellele teatavaid konkreetseid tingimusi.4. Artiklites 9 ja 10 märgitud tähtaegade arvutamisel ei võeta arvesse aega, mille kestel pädev asutus:- ootab edasist teavet, mida ta võis teatajalt taotleda vastavalt lõike 3 punktile a, või- korraldab avaliku küsitluse või ärakuulamise.vastavalt artiklile 13Artikkel 12Kui kasutaja saab asjakohast uut teavet või muudab isoleeritud kasutamist viisil, millel võib olla olulisi tagajärgi sellest tulenevatele ohtudele, teavitatakse võimalikult kiiresti pädevat asutust ning vastavalt artiklitele 7, 9 ja 10 esitatud teadet muudetakse.Kui pädevale asutusele saab edaspidi kättesaadavaks teave, millel võivad olla märkimisväärsed tagajärjed isoleeritud kasutamisest tekkivatele ohtudele, võib pädev asutus nõuda kasutajalt isoleeritud kasutamise tingimuste muutmist, kasutamise peatamist või lõpetamist.Artikkel 13Kui liikmesriik peab seda vajalikuks, võib ta ette näha, et kavandatava isoleeritud kasutamise ükskõik millise aspekti osas konsulteeritakse rühmade või avalikkusega, ilma et see piiraks artikli 19 kohaldamist.Artikkel 14Pädevad asutused tagavad, et enne isoleeritud kasutamise algust:a) koostatakse päästeplaan isoleeritud kasutamise puhul, kui isoleerimismeetmete tõrge võib kaasa tuua vahetu või hilisema tõsise ohu inimestele väljaspool rajatist ja/või keskkonnale, välja arvatud juhtudel, kui selline päästeplaan on koostatud vastavalt muudele ühenduse õigusaktidele;b) teave selliste päästeplaanide kohta, kaasa arvatud asjakohased kohaldatavad ohutusmeetmed, esitatakse sobival viisil ja ilma vajaduseta seda taotleda organitele ja asutustele, keda õnnetus tõenäoliselt mõjutab. Seda teavet ajakohastatakse korrapäraste ajavahemike tagant. Samuti tehakse see avalikult kättesaadavaks.Samaaegselt teevad asjaomased liikmesriigid igasuguse vajaliku konsulteerimise alusena nende kahepoolsete suhete raames teistele asjaomastele liikmesriikidele kättesaadavaks sama teabe, mida levitatakse nende endi kodanike seas.Artikkel 151. Liikmesriigid võtavad vajalikud meetmed tagamaks, et õnnetuse korral nõutakse kasutajalt viivitamatut teatamist artiklis 11 täpsustatud pädevale asutusele ja järgmise teabe esitamist:- õnnetuse asjaolud,- kõnealuste GMMide identiteet ja kogused,- kogu teave, mis on vajalik selleks, et hinnata õnnetuse mõju rahvastiku tervisele ja keskkonnale,- võetud meetmed.2. Kui teavet esitatakse vastavalt lõikele 1, peavad liikmesriigid:- tagama kõigi vajalike meetmete võtmise ja viivitamatult hoiatama iga liikmesriiki, keda õnnetus võib mõjutada,- koguma võimaluse korral õnnetuse täielikuks analüüsiks vajalikku teavet ja esitama vajaduse korral soovitusi selliste õnnetuste vältimiseks tulevikus ja nende tagajärgede piiramiseks.Artikkel 161. Liikmesriigid on kohustatud:a) konsulteerima päästeplaanide kavandatava rakendamise osas teiste liikmesriikidega, keda õnnetus võib mõjutada;b) teatama komisjonile võimalikult kiiresti igast käesoleva direktiivi rakendusalasse kuuluvast õnnetusest, esitades teabe õnnetusjuhtumi asjaoludest, asjaomaste GMMide identiteedi ja kogused, võetud päästemeetmed ja nende tõhususe ning õnnetuse analüüsi, kaasa arvatud soovitused selle mõju piiramiseks ja tulevikus sarnaste õnnetusjuhtumite vältimiseks.2. Komisjon kehtestab liikmesriikidega konsulteerides lõikes 1 nimetatud teabe vahetamise korra. Samuti kehtestab ta ja hoiab liikmesriikide käsutuses käesoleva direktiiviga reguleeritavate õnnetusjuhtumite registri, kaasa arvatud õnnetuste põhjuste analüüsid, omandatud kogemused ja edaspidi sarnaste õnnetusjuhtumite vältimiseks võetud meetmed."2. Artiklid 18, 19 ja 20 asendatakse järgmise tekstiga:"Artikkel 181. Liikmesriigid saadavad komisjonile iga aasta lõpus kokkuvõtliku aruande sel aastal vastavalt artiklile 10 teatatud 3. ja 4. liigi isoleeritud kasutamiste kohta, kaasa arvatud isoleeritud kasutamis(t)e kirjeldus, eesmärk ja ohud.2. Liikmesriigid saadavad iga kolme aasta tagant komisjonile aruande käesoleva direktiivi suhtes omandatud kogemuste kohta, esimene aruanne esitatakse 5. juunil 2003.3. Komisjon avaldab iga kolme aasta tagant kokkuvõtte lõikes 2 nimetatud aruannetest, esimene kokkuvõte avaldatakse 5. juunil 2004.4. Komisjon võib avaldada üldist statistilist teavet käesoleva direktiivi rakendamise ja sellega seotud küsimuste kohta, kuni see ei sisalda teavet, mis võib kahjustada mõne kasutaja konkurentsivõimet.Artikkel 191. Teataja võib vastavalt käesolevale direktiivile esitatud teadetes näidata teabe, mida tuleb käsitleda konfidentsiaalsena, kui selle avaldamine mõjutab üht või mitut nõukogu 7. juuni 1990. aasta direktiivi 90/313/EMÜ keskkonnaalase teabega tutvumise vabaduse kohta [8], artikli 3 lõikes 2 nimetatud punktidest. Sellisel juhul tuleb esitada kontrollitav põhjendus.2. Pädev asutus otsustab pärast nõupidamist teatajaga, millist teavet tuleb käsitleda konfidentsiaalsena, ja teatab teatajale oma otsusest.3. Mingil juhul ei tohi konfidentsiaalsena käsitleda järgmist vastavalt artiklitele 7, 9 või 10 esitatud teavet:- GMMide üldiseloomustus, teataja nimi ja aadress ning kasutamise asukoht,- isoleeritud kasutamise liik ja isoleerimismeetmed,- ennustatavate mõjude hindamine, eriti igasugune kahjulik mõju inimeste tervisele ja keskkonnale.4. Komisjon ja pädevad asutused ei tohi avaldada kolmandatele isikutele käesoleva direktiivi alusel teatatud või muul viisil esitatud teavet, mida vastavalt lõikele 2 loetakse konfidentsiaalseks, ning peavad kaitsma saadud andmetega seotud intellektuaalomandi õigusi.5. Kui teataja mingil põhjusel võtab teate tagasi, peab pädev asutus hoidma esitatud teavet konfidentsiaalsena.Artikkel 20Muudatused, mis on vajalikud II lisa A osa ja III–V lisa kohandamiseks tehnika arenguga ning II lisa C osa kohandamiseks, otsustatakse artiklis 21 sätestatud korras."3. Määrusesse lisatakse järgmine artikkel:"Artikkel 20aEnne 5. detsembrit 2000 võtab nõukogu kvalifitseeritud häälteenamusega komisjoni ettepaneku põhjal vastu kriteeriumid GMMide liikide liigitamiseks II lisa C ossa. II lisa B osa muudatused võtab nõukogu vastu kvalifitseeritud häälteenamusega komisjoni ettepaneku põhjal."4. Lisad asendatakse käesolevas direktiivis toodud lisadega.Artikkel 21. Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi täitmiseks vajalikud õigus- ja haldusnormid hiljemalt 18 kuu jooksul pärast direktiivi jõustumist. Liikmesriigid teatavad sellest viivitamata komisjonile.Kui liikmesriigid need normid vastu võtavad, lisavad nad nendesse või nende ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.2. Liikmesriigid edastavad komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas nende poolt vastuvõetud siseriiklike põhiliste õigusnormide teksti.Artikkel 3Käesolev direktiiv jõustub Euroopa Ühenduste Teatajas avaldamise päeval.Artikkel 4Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.Luxembourg, 26. oktoober 1998.Nõukogu nimeleesistujaW. Schüssel[1] EÜT C 356, 22.11.1997, lk 14 ja EÜT C 369, 6.12.1997, lk 12.[2] EÜT C 295, 7.10.1996, lk 52.[3] Euroopa Parlamendi 12. märtsi 1997. aasta arvamus (EÜT C 115, 14.4.1997, lk 59), nõukogu 16. detsembri 1997. aasta ühine seisukoht (EÜT C 62, 26.2.1998, lk 1) ja Euroopa Parlamendi 16. juuni 1998. aasta otsus (EÜT C 210, 6.7.1998).[4] EÜT L 117, 8.5.1990, lk 15. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 97/35/EÜ (EÜT L 169, 27.6.1997, lk 72).[5] EÜT L 374, 31.12.1990, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 97/59/EÜ (EÜT L 282, 15.10.1997, lk 33).[6] EÜT L 117, 8.5.1990, lk 1. Direktiivi on muudetud komisjoni direktiiviga 94/51/EÜ (EÜT L 297, 18.11.1994, lk 29).[7] EÜT L 117, 8.5.1990, lk 15. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 97/35/EÜ (EÜT L 169, 27.6.1997, lk 72).[8] EÜT L 158, 23.6.1990, lk 56.--------------------------------------------------LISA"I LISAA OSAArtikli 2 punkti b alapunktis i mainitud geneetilise muundamise viiside hulka kuuluvad muu hulgas:1. Rekombinantse nukleiinhappe tehnoloogiad, mis hõlmavad geneetilise materjali uute kombinatsioonide moodustamist ükskõik milliste vahenditega väljaspool organismi toodetud nukleiinhappe molekulide asetamist viirusesse, bakteriaalsesse plasmiidi või muusse vektorsüsteemi ja nende inkorporeerimist peremeesorganismi, milles nad looduslikult ei esine, aga milles nad on võimelised jätkuvaks paljunemiseks.2. Meetodid, mille puhul mikroorgnismiväliselt ettevalmistatud pärilikkusmaterjal viiakse organismi otse, sealhulgas mikroinjektsioon, makroinjektsioon ja mikrokapseldumine.3. Rakkude liitmine (kaasa arvatud protoplastide liitmine) ehk hübridiseerimine, mille puhul kahe või enama raku liitmisel looduses mitteesinevate meetodite abil tekivad uue pärilikkusmaterjali kombinatsiooniga elusrakud.B OSAArtikli 2 punkti b alapunktis ii nimetatud meetodid, mida ei loeta geneetilist muundamist põhjustavateks tingimusel, et need ei hõlma rekombinantse nukleiinhappe molekulide või GMMide kasutamist, mis ei ole saadud II lisa A osas välja arvatud menetluste/meetodite abil:1) viljastamine in vitro;2) looduslikud protsessid, nagu näiteks: konjugatsioon, transduktsioon, transformatsioon;3) polüploidsuse indutseerimine.II LISAA OSAGeneetilise muundamise menetlused või meetodid, mille abil saadud mikroorganismid arvatakse käesoleva direktiivi reguleerimisalast välja tingimusel, et need ei hõlma rekombinantse nukleiinhappe molekulide või GMMide kasutamist, mis ei ole saadud järgmisena loetletud menetluste/meetodite abil:1. Mutagenees.2. Tuntud füsioloogilise protsessi teel geneetilist materjali vahetavate prokarüootsete liikide rakuühendus (kaasa arvatud protoplasmiühendus).3. Kõigi eukarüootsete liikide rakuühendus (sealhulgas protoplasmiühendus), kaasa arvatud hübridoomide tootmine ja taimerakuühendused.4. Isekloonimine, mis seisneb nukleiinhappe järjestuste eemaldamises organismi rakust, millele võib järgneda osa või kogu selle nukleiinhappe (või sünteetilise ekvivalendi) uus sisestamine koos eelnevate ensüümi- või mehaaniliste etappidega või mitte, sama liigi rakkudesse või fülogeneetiliselt lähedases suguluses oleva liigi rakkudesse, mis võivad vahetada geneetilist materjali loodusliku füsioloogilise protsessi teel, mille tulemuseks saadav mikroorganism ei põhjusta usutavasti inimeste, loomade või taimede haigusi.Isekloonimine võib hõlmata rekombinantsete vektorite kasutamist, millel on konkreetsete mikroorganismide puhul pikaajalise ohutu kasutamise kogemused.B OSAKriteeriumid, millega määratakse GMMide ohutus inimeste tervisele ja keskkonnale:… (täidetakse artiklis 20a ettenähtud korras)C OSAB osas loetletud kriteeriumidele vastavate GMMide loetelu:… (täidetakse artiklis 21 ettenähtud korras)III LISAARTIKLI 5 LÕIKES 2 NIMETATUD HINNANGU ANDMISEL JÄRGITAVAD PÕHIMÕTTEDKäesolev lisa kirjeldab üldjoontes artikli 5 lõikes 2 nimetatud hinnangu andmisel arvesse võetavaid tegureid ja järgitavat korda. Seda täiendavad eriti B jao puhul suunavad märkused, mille koostab komisjon artiklis 21 ettenähtud korras.Need suunavad märkused koostatakse hiljemalt 5. juunil 2000.A. HINNANGU TEGURID1. Järgmisi tuleks lugeda võimalikeks kahjulikeks toimeteks:- inimeste haigused, kaasa arvatud allergeensed või toksilised mõjud,- loomade või taimede haigused,- kahjulik mõju haiguse ravimise või tõhusa profülaktika võimatuse tõttu,- kahjulik mõju keskkonnas kinnistumise või leviku tõttu,- kahjulik mõju sisestatud geneetilise materjali loodusliku ülemineku tõttu muudesse organismidesse.2. Artikli 5 lõikes 2 nimetatud hinnang peaks põhinema järgmisel:a) kõigi võimalike kahjulike mõjude, eriti selliste mõjude kindlakstegemine, mis on seotud:i) retsipientmikroorganismiga;ii) sisestatud geneetilise materjaliga (mis pärineb doonororganismist);iii) vektoriga;iv) doonormikroorganismiga (niivõrd kui toimingu käigus kasutatakse doonormikroorganismi);v) saadava GMMiga;b) tegevuse iseloomustus;c) võimalike kahjulike mõjude raskus;d) võimalike kahjulike mõjude tekkimise tõenäosus.B. KORD3. Hinnangu andmise esimene etapp peaks olema retsipiendi ja vajaduse korral doonormikroorganismi kahjulike omaduste, kõigi vektori või sisestatud materjaliga seonduvate kahjulike mõjude eristamine, kaasa arvatud kõik retsipientorganismi olemasolevate omaduste muutused.4. Üldiselt loetakse artiklis 5 määratletud 1. liiki sobivaks ainult sellised GMMid, millel on järgmised omadused:i) tõenäoliselt ei põhjusta retsipient- või vanemmikroorganism inimeste, loomade või taimede haigusi; [1]ii) vektori ja inserdi iseloom on selline, et nad ei anna GMMile fenotüüpi, mis tõenäoliselt põhjustaks inimeste, loomade või taimede haigusi [2] või avaldaks kahjulikku mõju keskkonnale;iii) tõenäoliselt ei põhjusta GMM inimeste, loomade ja taimede haigusi [3] ega avalda keskkonnale kahjulikku mõju.5. Selle protsessi rakendamiseks vajaliku teabe saamiseks võib kasutaja esmalt arvesse võtta asjakohaseid ühenduse õigusakte (eriti nõukogu direktiivi 90/679/EMÜ) [4] Samuti võib arvesse võtta rahvusvahelisi või riiklikke liigitusskeeme (nt WHO, NIH jne) ning nende uutest teaduslikult põhjendatud teadmistest ja tehnika arengust tulenevaid uusversioone.Need skeemid käsitlevad looduslikke mikroorganisme ja põhinevad sellistena harilikult mikroorganismide võimel põhjustada inimeste, loomade ja taimede haigusi ning tõenäoliselt põhjustatava haiguse raskusel ja kanduvusel. Direktiiv 90/679/EMÜ liigitab mikroorganismid kui bioloogilised mõjurid nelja ohuliiki võimaliku mõju põhjal, mida nad avaldavad tervele täiskasvanud inimesele. Neid ohuliike võib kasutada suunistena isoleeritud kasutamise tegevuste liigitamisel artikli 5 lõikes 3 nimetatud nelja ohuliiki. Samuti võib kasutaja arvesse võtta liigitusskeeme, mis viitavad taimede ja loomade patogeenidele (mis on tavaliselt kehtestatud riiklikul alusel). Nimetatud liigitusskeemid annavad ainult ajutise viite tegevuse ohuliigile ja vastavale ohutus- ja kontrollmeetmete kogumile.6. Vastavalt lõigetele 3-5 toimuv ohu identifitseerimise protsess peaks kaasa tooma GMMiga seotud ohu taseme identifitseerimise.7. Isoleerimis- ja muude kaitsemeetmete valik tuleks siis teha GMMiga seotud ohu taseme alusel, pidades samuti silmas:i) tõenäoliselt GMMiga kokkupuutuva keskkonna omadusi (näiteks seda, kas GMMidega tõenäoliselt kokkupuutuvas keskkonnas leidub teadaolevat elustikku, mida isoleeritud kasutamise käigus kasutatavad mikroorganismid võivad kahjulikult mõjutada);ii) tegevuse omadusi (nt selle ulatust, laadi);iii) kõiki mittestandardseid toiminguid (nt loomade inokulatsioon GMMidega, varustus, mis tõenäoliselt tekitab aerosoole).Alapunktide i–iii arvestamine konkreetse tegevuse puhul võib lõikes 6 identifitseeritud GMMidega seotud ohu taset tõsta, langetada või samaks jätta.8. Kirjeldatud viisil tehtud analüüs toob lõpuks kaasa tegevuse liigitamise ühte artikli 5 lõikes 3 kirjeldatud liikidest.9. Isoleeritud kasutamise lõpliku liigituse peab kinnitama artikli 5 lõikes 2 nimetatud lõpuleviidud hinnangu läbivaatamine.IV LISAISOLEERIMIS- JA MUUD KAITSEMEETMEDÜldpõhimõtted1. Need tabelid esitavad iga isoleerimistaseme tavalised minimaalsed nõuded ja vajalikud meetmed.Samuti saavutatakse isoleeritus heade töötavade, koolituse, isoleerimisvahendite ja rajatise erilise kavandamise kasutamise abil. Kõigi GMMe hõlmava tegevuse puhul kohaldatakse hea mikrobioloogilise tava põhimõtteid ning järgmisi hea tööohutuse ja -hügieeni põhimõtteid:i) hoida töökoha ja keskkonna kokkupuuteid iga GMMiga võimalikul madalal tasemel;ii) kasutada ohuallika juures tehnilise kontrolli meetmeid ja täiendada neid vajaduse korral sobivate isikukaitseriietuse ja -vahenditega;iii) piisavalt katsetada ja korras hoida kontrollmeetmeid ja -seadmeid;iv) otsida vajaduse korral eluvõimeliste töötlusorganismide olemasolu väljaspool peamist füüsilist kaitsetõket;v) tagada töötajate asjakohane koolitus;vi) moodustada vajaduse korral bioloogilise ohutuse komiteesid või allkomiteesid;vii) koostada ja rakendada vajaduse korral kohalikke töötajate ohutuse tegevusjuhiseid;viii) seada vajalikesse kohtadesse bioloogilise ohu hoiatusmärgid;ix) tagada töötajatele pesu- ja dekontaminatsioonivõimalused;x) pidada piisavat dokumentatsiooni;xi) keelata söömine, joomine, suitsetamine, kosmeetikatoodete kasutamine või inimtarbimiseks mõeldud toidu hoidmine tööpiirkonnas;xii) keelata pipeti suukaudne kasutamine;xiii) koostada ohutuse tagamiseks vajaduse korral kirjalik standardne töökord;xiv) hoida GMMide lekke jaoks kättesaadaval tõhusaid desinfektsioonivahendeid ja täpsustatud desinfitseerimiskorda;xv) tagada vajaduse korral saastunud laboriseadmete ja materjalide turvaline ladustamine.2. Tabelite pealkirjad on soovituslikud.Tabel I A esitab laboritegevuste minimaalseid nõudeid.Tabel I B esitab tabeli I A täiendusi ja muudatusi GMMe hõlmava tegevuse jaoks kasvuhoones/kasvukambris.Tabel I C esitab tabeli I A täiendusi ja muudatusi GMMe hõlmava tegevuse jaoks loomadega.Tabel II esitab minimaalsed nõuded tegevustele, mis ei ole laboritegevused.Mõnel konkreetsel juhul võib olla vajalik kohaldada tabelitest I A ja II võetud sama taseme meetmete kombinatsiooni.Mõnel juhul võivad kasutajad pädeva asutuse nõusolekul jätta kohaldamata konkreetse ohutustaseme täpsustuse või kombineerida kahe erineva taseme täpsustusi.Nendes tabelites tähendab "valikuline", et kasutaja võib kohaldada neid meetmeid üksikjuhtumite suhtes sõltuvalt artikli 5 lõikes 2 nimetatud hinnangust.3. Liikmeriigid võivad käesoleva lisa rakendamisel inkorporeerida järgmistesse tabelitesse nõuete selguse huvides lisaks lõigete 1 ja 2 üldpõhimõtted.Tabel I ALaboritegevuse isoleerimis- ja muud kaitsemeetmedTäpsustused | Isoleerimistasemed || | 1 | 2 | 3 | 4 |1 | Laborikompleks: isoleeritus | Ei nõuta | Ei nõuta | Nõutav | Nõutav |2 | Labor: fumigatsiooniks õhukindlalt suletav | Ei nõuta | Ei nõuta | Nõutav | Nõutav |Varustus3 | Vee-, happe-, aluse-, lahusti-, desinfitseerimisvahendi- ja dekontaminatsioonivahendikindlad ning kergestipuhastatavad pinnad | Nõutav (töölaud) | Nõutav (töölaud) | Nõutav (töölaud, põrand) | Nõutav (töölaud, põrand, lagi, seinad) |4 | Sissepääs laborisse läbi õhuluku | Ei nõuta | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav |5 | Negatiivne rõhk võrreldes keskkonnarõhuga | Ei nõuta | Ei nõuta | Nõutav, välja arvatud | Nõutav |6 | Laborisse sisenev ja sealt väljuv õhk peab olema HEPA-filtreeritud | Ei nõuta | Ei nõuta | Nõutav HEPA — väljuv õhk, välja arvatud | Nõutav HEPA — sisenev ja väljuv õhk |7 | Mikrobioloogiline ohutuspunkt | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav | Nõutav |8 | Autoklaav | Rajatises | Hoones | Ruumides | Laboris = kahepoolne |Töösüsteem9 | Piiratud ligipääs | Ei nõuta | Nõutav | Nõutav | Nõutav |10 | Bioloogilise ohu hoiatusmärk uksel | Ei nõuta | Nõutav | Nõutav | Nõutav |11 | Konkreetsed meetmed leviku kontrollimiseks | Ei nõuta | Nõutavad minimeerimiseks | Nõutavad vältimiseks | Nõutavad vältimiseks |13 | Dušš | Ei nõuta | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav |14 | Kaitseriietus | Sobiv kaitseriietus | Sobiv kaitseriietus | Sobiv kaitseriietus ja (valikulised) jalatsid | Riietuse ja jalatsite täielik vahetus enne sisenemist ja väljumist |15 | Kindad | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav | Nõutav |18 | Tõhus vektorikontroll (nt närilised ja putukad) | Valikuline | Nõutav | Nõutav | Nõutav |Jäätmed19 | GMMide inaktiveerimine kätepesukraanide või -torude ja duššide ning samalaadsetes heitvetes | Ei nõuta | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav |20 | GMMide inaktiveerimine saastunud materjalides ja jäätmetes | Valikuline | Nõutav | Nõutav | Nõutav |Muud meetmed21 | Labor omaenda varustuse isoleerimiseks | Ei nõuta | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav |23 | Seesviibijate nägemiseks peab olema jälgimisaken või selle alternatiiv | Valikuline | Valikuline | Valikuline | Nõutav |Täpsustused | Isoleerimistasemed || | 1 | 2 | 3 | 4 |Ehitis1 | Kasvuhoone: püsiehitis | Ei nõuta | Nõutav | Nõutav | Nõutav |Varustus3 | Sissekäik kahe vastastikku lukustuva uksega eraldi ruumi kaudu | Ei nõuta | Valikuline | Valikuline | Nõutav |4 | Saastunud äravooluvee hooldus | Valikuline | Äravooluvee minimeerimine | Äravooluvee vältimine | Äravooluvee vältimine |Töösüsteem6 | Meetmed soovimatute liikide, nagu putukate, näriliste ja lülijalgsete kontrolliks | Nõutav | Nõutav | Nõutav | Nõutav |7 | Elusmaterjali liigutamise kord kasvuhoone/kasvukambri, kaitseehitise ja labori vahel kontrollib geneetiliselt muundatud mikroorganismide levikut | Minimeerib leviku | Minimeerib leviku | Takistab levikut | Takistab levikut |Tabel I CLoomaosakondade isoleerimis- ja muud kaitsemeetmedKohaldatakse kõiki tabeli I A sätteid järgmiste täienduste/muudatustega:Täpsustused | Isoleerimistasemed || | 1 | 2 | 3 | 4 |Rajatised1 | Loomaosakonnaisolatsioon | Valikuline | Nõutav | Nõutav | Nõutav |2 | Loomarajatisi eraldavad lukustatavad uksed | Valikuline | Nõutav | Nõutav | Nõutav |3 | Loomarajatised on kavandatud saastatusest puhastamise hõlbustamiseks (veekindel ja kergesti pestav materjal (puurid jne)) | Valikuline | Valikuline | Nõutav | Nõutav |4 | Põrand ja/või seinad kergesti pestavad | Valikuline | Nõutav (põrand) | Nõutav (põrand ja seinad) | Nõutav (põrand ja seinad) |5 | Loomade hoidmine sobivates isoleerimisrajatistes, nagu puurid, latrid või basseinid | Valikuline | Valikuline | Valikuline | Valikuline |6 | Isolaatorite või isoleeritud ruumi filtrid | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav | Nõutav |Täpsustused | Isoleerimistasemed || | 1 | 2 | 3 | 4 |Üldine1 | Eluvõimelisi mikroorganisme tuleks hoida süsteemis, mis eraldab protsessi keskkonnast (suletud süsteem) | Valikuline | Nõutav | Nõutav | Nõutav |2 | Suletud süsteemist väljuvate gaaside kontroll | Ei nõuta | Nõutav leviku minimeerimiseks | Nõutav leviku takistamiseks | Nõutav leviku takistamiseks |3 | Aerosoolide kontroll proovivõtmise, suletud süsteemi materjali lisamise või materjali teise suletud süsteemi viimise ajal | Valikuline | Nõutav leviku minimeerimiseks | Nõutav leviku takistamiseks | Nõutav leviku takistamiseks |4 | Vedelate jäätmete inaktiveerimine enne suletud süsteemist väljavõtmist | Valikuline | Nõutav, tõendatud vahenditega | Nõutav, tõendatud vahenditega | Nõutav, tõendatud vahenditega |5 | Õhukindlad tõkked tuleks kavandada eraldumise minimeerimiseks või takistamiseks | Konkreetsed nõuded puuduvad | Leviku minimeerimiseks | Leviku takistamiseks | Leviku takistamiseks |6 | Jälgitav ala peaks olema kavandatud terve suletud süsteemi sisu tõkestamiseks | Valikuline | Valikuline | Nõutav | Nõutav |7 | Jälgitav ala peaks olema fumigatsiooniks õhukindlalt suletav | Ei nõuta | Valikuline | Valikuline | Nõutav |Varustus8 | Sissepääs õhuluku kaudu | Ei nõuta | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav |9 | Vee-, happe-, aluse-, lahusti-, desinfitseerimisvahendi- ja dekontaminatsioonivahendikindlad ning kergestipuhastatavad pinnad | Nõutav (töölaud, kui need leiduvad) | Nõutav (töölaud, kui need leiduvad) | Nõutav (töölaud, kui need leiduvad, põrand) | Nõutav (töölaud, põrand, lagi, seinad) |10 | Konkreetsed meetmed jälgitava ala piisavaks õhutamiseks õhu saastamise vältimiseks | Valikuline | Valikuline | Valikuline | Nõutav |11 | Jälgitaval alal tuleks hoida vahetu ümbrusega võrreldes negatiivset õhurõhku | Ei nõuta | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav |12 | Kontrollitavale alale sisenev ja sealt väljuv õhk peab olema HEPA-filtreeritud | Ei nõuta | Ei nõuta | Nõutav (väljuv õhk, sisenev õhk valikuline) | Nõutav (sisenev ja väljuv õhk) |Töösüsteem13 | Suletud süsteemid peavad asuma jälgitaval alal | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav | Nõutav |14 | Ligipääs peaks olema piiratud ainult määratud töötajatega | Ei nõuta | Nõutav | Nõutav | Nõutav |15 | Üles tuleks seada bioloogilise ohu hoiatusmärgid | Ei nõuta | Nõutav | Nõutav | Nõutav |17 | Töötajad peaksid enne jälgitavalt alalt lahkumist käima duši all | Ei nõuta | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav |18 | Töötajad peaksid kandma kaitseriietust | Nõutav (tööriietus) | Nõutav (tööriietus) | Nõutav | Täielik ümberriietumine enne väljumist ja sisenemist |Jäätmed22 | GMMide inaktiveerimine kätepesukraanide või -torude ja duššide ning samalaadsetes heitvetes | Ei nõuta | Ei nõuta | Valikuline | Nõutav |23 | GMMide inaktiveerimine saastunud materjalides ja jäätmetes, kaasa arvatud protsessi heitvetes enne lõplikku äravoolu | Valikuline | Nõutav, tõestatud vahenditega | Nõutav, tõestatud vahenditega | Nõutav, tõestatud vahenditega |V LISAA OSAArtiklis 7 nimetatud teatamise jaoks nõutav teave:- kasutaja(te) nimi, kaasa arvatud järelevalve ja ohutuse eest vastutavad isikud,- teave järelevalve ja ohutuse eest vastutavate isikute koolituse ja kvalifikatsiooni kohta,- kõigi bioloogiaalaste komiteede või allkomiteede üksikasjad,- rajatise aadress ja üldine kirjeldus,- kavandatava töö laadi kirjeldus,- isoleeritud kasutamiste liik,- ainult 1. liigi isoleeritud kasutamiste puhul artikli 5 lõikes 2 nimetatud hinnangu kokkuvõte ja teave jäätmehoolduse kohta.B OSAArtiklis 9 nimetatud teatamise jaoks nõutav teave:- artiklis 7 nimetatud teate esitamise kuupäev,- järelevalve ja ohutuse eest vastutavate isikute nimed ning teave koolituse ja kvalifikatsiooni kohta,- kasutatavad retsipient-, doonor- ja/või vanemmikroorganism(id) ja vajaduse korral kasutatavad peremees-vektorsüsteemid,- muundamis(t)ega hõlmatud geneetilis(t)e materjali(de) päritolu ja kavandatav toime,- GMMi identiteet ja omadused,- isoleeritud kasutamise eesmärk, kaasa arvatud eeldatavad tulemused,- kasutatavad ligikaudsed kultuuri mahud,- kohaldatavate isoleerimis- ja muude kaitsemeetmete kirjeldus, kaasa arvatud teave jäätmehoolduse kohta, sealhulgas tekkivad jäätmed, nende töötlus, lõplik kuju ja sihtkoht,- artikli 5 lõikes 2 nimetatud hinnangu kokkuvõte,- teave, mida pädev asutus vajab kõigi päästeplaanide hindamiseks, kui neid nõutakse vastavalt artiklile 14.C OSAArtiklis 10 nimetatud teatamise jaoks nõutav teave:a) - artiklis 7 nimetatud teate esitamise kuupäev,- järelevalve ja ohutuse eest vastutavate isikute nimed ning teave koolituse ja kvalifikatsiooni kohta;b) - kasutatavad retsipient- või vanemmikroorganismid,- kasutatav(ad) peremees-vektorsüsteem(id) (vajaduse korral),- muundamis(t)ega hõlmatud geneetilis(t)e materjali(de) päritolu ja kavandatav toime,- GMMi identiteet ja omadused,- kasutatavad kultuuri mahud;c) - kohaldatavate ohutus- ja muude kaitsemeetmete kirjeldus, kaasa arvatud teave jäätmehoolduse kohta, sealhulgas tekkivate jäätmete tüüp ja kuju, nende töötlus, lõplik kuju ja sihtkoht,- isoleeritud kasutamise eesmärk, kaasa arvatud eeldatavad tulemused,- rajatise osakondade kirjeldus;d) teave õnnetuste ennetamise ja päästeplaanide kohta, kui need on olemas:- kõik konkreetsed rajatise asukohast tulenevad ohud,- kohaldatavad ennetusmeetmed nagu ohutusvahendid, häiresüsteemid ja isoleerimismeetodid,- kord ja kavad isoleerimismeetmete jätkuva tõhususe kontrollimiseks,- töötajatele antud teabe kirjeldus,- teave, mida pädev asutus vajab kõigi päästeplaanide hindamiseks, kui neid nõutakse vastavalt artiklile 14;e) artikli 5 lõikes 2 nimetatud riskianalüüsi koopia."[1] Seda kohaldatakse ainult loomade ja taimede suhtes keskkonnas, mis tõenäoliselt puutub kokku mikroorganismidega.[2] Seda kohaldatakse ainult loomade ja taimede suhtes keskkonnas, mis tõenäoliselt puutub kokku mikroorganismidega.[3] Seda kohaldatakse ainult loomade ja taimede suhtes keskkonnas, mis tõenäoliselt puutub kokku mikroorganismidega.[4] EÜT L 374, 31.12.1990, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 97/59/EÜ (EÜT L 282, 15.10.1997, lk 33).--------------------------------------------------


Tähtis õiguslik teade

|

32000L0045

Komisjoni direktiiv 2000/45/EÜ, 6. juuli 2000, millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid A-vitamiini, E-vitamiini ja trüptofaani sisalduse määramiseks loomasöödasEMPs kohaldatav tekst

Euroopa Liidu Teataja L 174 , 13/07/2000 Lk 0032 - 0050 CS.ES Peatükk 3 Köide 30 Lk 12  - 30 ET.ES Peatükk 3 Köide 30 Lk 12  - 30 HU.ES Peatükk 3 Köide 30 Lk 12  - 30 LT.ES Peatükk 3 Köide 30 Lk 12  - 30 LV.ES Peatükk 3 Köide 30 Lk 12  - 30 MT.ES Peatükk 3 Köide 30 Lk 12  - 30 PL.ES Peatükk 3 Köide 30 Lk 12  - 30 SK.ES Peatükk 3 Köide 30 Lk 12  - 30 SL.ES Peatükk 3 Köide 30 Lk 12  - 30

		Komisjoni direktiiv 2000/45/EÜ,6. juuli 2000,millega kehtestatakse ühenduse analüüsimeetodid A-vitamiini, E-vitamiini ja trüptofaani sisalduse määramiseks loomasöödas(EMPs kohaldatav tekst)EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,võttes arvesse nõukogu 20. juuli 1970. aasta direktiivi 70/373/EMÜ sööda ametlikuks kontrolliks vajalike proovivõtu- ja analüüsimeetodite kehtestamise kohta ühenduses, [1] viimati muudetud Austria, Soome ja Rootsi ühinemisaktiga, [2] eriti selle artiklit 2,ning arvestades järgmist:(1) Direktiiv 70/373/EMÜ sätestab, et ametlikul kontrollimisel söötade nende kvaliteeti ja koostist reguleerivate õigusnormide nõuetele vastavuse suhtes kasutatakse ühenduses kehtestatud proovivõtu- ja analüüsimeetodeid.(2) Nõukogu 23. novembri 1970. aasta direktiiv 70/524/EMÜ loomasöödas kasutatavate lisaainete kohta, [3] viimati muudetud komisjoni 17. novembri 1999. aasta määrusega (EÜ) nr 2439/1999, [4] sätestab, et A-vitamiini ja E-vitamiini sisaldus peab olema märgistuses näidatud, kui neid on lisatud eelsegudele ja loomasöötadele.(3) Nõukogu 2. aprilli 1979. aasta direktiiv 79/373/EMÜ segasööda turustamise kohta, [5] viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2000/16/EÜ, [6] ja nõukogu 13. septembri 1993. aasta direktiiv 93/74/EMÜ eritoitmiseks mõeldud söötade kohta, [7] viimati muudetud direktiiviga 96/25/EÜ, [8] sätestavad, et loomasööda märgistuses tuleb näidata ära aminohapped.(4) Nende ainete kontrollimiseks tuleb kehtestada ühenduse analüüsimeetodid.(5) Käesolevas direktiivis ettenähtud meetmed on kooskõlas alalise söödakomitee arvamusega,ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:Artikkel 1Liikmesriigid sätestavad, et loomasöötade ja eelsegude A-vitamiini, E-vitamiini ja trüptofaani sisalduse ametlikuks kontrollimiseks tehtavad analüüsid viiakse läbi käesoleva direktiivi lisas ettenähtud meetodeid kasutades.Artikkel 2Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 31. augustil 2000. aastal. Liikmesriigid teatavad sellest viivitamata komisjonile.Nad kohaldavad neid norme alates 1. septembrist 2000.Kui liikmesriigid need õigusnormid vastu võtavad, lisavad nad nendesse normidesse või nende normide ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.Artikkel 3Käesolev direktiiv jõustub 20. päeval pärast avaldamist Euroopa Ühenduste Teatajas.Artikkel 4Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.Brüssel, 6. juuli 2000Komisjoni nimelkomisjoni liigeDavid Byrne[1] EÜT L 170, 3.8.1970, lk 2.[2] EÜT C 241, 29.8.1994, lk 1.[3] EÜT L 270, 14.12.1970, lk 1.[4] EÜT L 297, 18.11.1999, lk 8.[5] EÜT L 86, 6.4.1979, lk 30.[6] EÜT L 105, 3.5.2000, lk 36.[7] EÜT L 237, 22.9.1993, lk 23.[8] EÜT L 125, 23.5.1996, lk 35.--------------------------------------------------LISAA OSA A-VITAMIINI MÄÄRAMINE1. Eesmärk ja kasutusalaKäesolev meetod on A-vitamiini (retinooli) määramiseks loomasöödas ja eelsegudes. A-vitamiini all mõistetakse täielikult trans-konfiguratsioonis retinüülalkoholi ja selle cis-isomeere, nii nagu need määratakse käesoleva meetodiga. A-vitamiini sisaldust väljendatakse rahvusvahelistes ühikutes (RÜ) kilogrammi kohta. Üks RÜ vastab 0,300 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini alkoholi või 0,344 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini atsetaadi või 0,550 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini palmitaadi aktiivsusele.Määramise piir on 2000 RÜ A-vitamiini kilogrammi kohta.2. PõhimõteProov hüdrolüüsitakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusega ja A-vitamiin ekstraheeritakse petrooleetrisse. Lahusti aurustatakse ja jääk lahustatakse metanoolis ja vajadusel lahjendatakse nõutud kontsentratsioonini. A-vitamiini sisaldus määratakse pööratud faasi kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (RP-HPLC) meetodiga, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit. Kromatograafilised parameetrid valitakse nii, et täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini alkohol ja selle cis-isomeerid jääksid lahutamata.3. Reaktiivid3.1. Etanool, σ = 96 %3.2. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 °C3.3. Metanool3.4. Kaaliumhüdroksiidi lahus, β = 50 g/100 ml3.5. Naatriumaskorbaadi lahus, β = 10 g/100 ml (vt märkus 7.7)3.6. Naatriumsulfiid, Na2S · x H2O (x = 7–9)3.6.1. Naatriumsulfiidi lahus, c = 0,5 mol/l glütseroolis, β = 120 g/l (kui x = 9) (vt märkus 7.8)3.7. Fenoolftaleiini lilahus, β = 2 g/100 ml etanoolis (3.1)3.8. 2-propanool3.9. HPLC liikuv faas: metanooli (3.3) ja vee segu, nt 980 + 20 (v + v). Täpne vahekord määratakse kasutatava kolonni parameetrite järgi.3.10. Lämmastik, hapnikuvaba3.11. Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini atsetaat, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega, näit 2,80 ×106 RÜ/g3.11.1. Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini atsetaadi põhilahus: 100milliliitrisesse mõõtkolbi kaalutakse 0,1 mg täpsusega 50 mg A-vitamiini atsetaati (3.11). Lahustatakse 2-propanoolis (3.8) ja täiendatakse sama lahustiga märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 1400 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Täpne sisaldus määratakse vastavalt punktile 5.6.3.1.3.12. Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini palmitaat, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega, näit 1,80 × 106 RÜ/g3.12.1. Täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini palmitaadi põhilahus: 100milliliitrisesse mõõtkolbi kaalutakse 0,1 mg täpsusega 80 mg A-vitamiini palmitaati (3.12). Lahustatakse 2-propanoolis (3.8) ja täiendatakse sama lahustiga märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 1400 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Täpne sisaldus määratakse vastavalt punktile 5.6.3.2.3.13. 2,6-Di-tert-butüül-4-metüülfenool (BHT) (vt märkus 7.5)4. Seadmed4.1. Vaakumrotaatoraurusti4.2. Pruunist klaasist nõud4.2.1. Lihvavaga lamedapõhjalised või Erlenmeyeri kolvid, 500 ml4.2.2. Lihvkorgiga kitsakaelalised mõõtkolvid 10, 25, 100 and 500 ml4.2.3. Lihvkorgiga koonilised jaotuslehtrid, 1000 ml4.2.4. Lihviga pirnkolvid, 250 ml4.3. Lihvühendusega Allihni tagasivoolujahuti, ümbrise pikkus 300 mm, gaasitoru adapteriga4.4. Kurdfilterpaber faaside eraldamiseks, diameeter 185 mm (nt Schleicher & Schuell 597 HY ½)4.5. HPLC-seadmed sissepritsesüsteemiga4.5.1. Vedelikkromatograafia kolonn, 250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm, või samaväärne (lahutuskriteerium: ainult üks piik kõigi retinooli isomeeride jaoks HPLC antud tingimustel)4.5.2. Muudetava lainepikkusega UV- või fluorestsentsdetektor4.6. Spektrofotomeeter 10millimeetriste kvartsküvettidega4.7. Magnetsegajaga vesivann4.8. Ekstraktsiooniseade (vt joonis 1), mis koosneb:4.8.1. 1-liitrisest lihvava ja lihvkorgiga klaassilindrist,4.8.2. lihviga klaasotsikust, mis on varustatud kõrvaltoru ja keskelt läbi mineva üles-alla nihutatava toruga. Nihutataval torul peaks olema U-kujuline alumine ots ja teises otsas düüs, nii et silindris oleva vedeliku ülemist kihti oleks võimalik viia üle jaotuslehtrisse.5. Analüüsi käikMärkus:A-vitamiin on tundlik (UV) valguse ja oksüdeerumise suhtes. Kõik toimingud tuleks teostada valguse ja hapniku juurdepääsuta (kasutades pruunist klaasist või alumiiniumfooliumiga kaetud nõusid ja voolutades lämmastikuga). Ekstraheerimise ajal tuleb vedeliku kohal olev õhk asendada lämmastikuga (ülerõhu vältimiseks tuleb korki aeg-ajalt kergitada).5.1. Proovi ettevalmistamineProov jahvatatakse kuumenemist vältides nii peeneks, et see läheks läbi 1millimeetriste avadega sõela. Jahvatamine peab toimuma vahetult enne kaalumist ja seebistamist, vastasel juhul võib esineda A-vitamiini kadusid.5.2. Seebistamine500milliliitrisesse lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) kaalutakse 0,01 g täpsusega 2–25 g proovi, sõltuvalt A-vitamiini sisaldusest. Seejärel lisatakse ringliigutustega segades 130 ml etanooli (3.1), umbes 100 mg BHT (3.13), 2 ml naatriumaskorbaadi lahust (3.5) ja 2 ml naatriumsulfiidi lahust (3.6). Kolvi otsa ühendatakse tagasivoolujahutiga (4.3) ja kolb pannakse magnetsegajaga vesivanni (4.7). Kuumutatakse keemiseni ja keedetakse tagasivoolujahuti all 5 minutit. Seejärel lisatakse läbi jahuti (4.3) 25 ml kaaliumhüdroksiidi lahust (3.4) ja lastakse segamisel keeda tagasivoolujahuti all veel 25 minutit, voolutades nõrgalt lämmastikuga. Seejärel loputatakse jahutit umbes 20 ml veega ja jahutatakse kolvi sisu toatemperatuurini.5.3. EkstraheerimineSeebistamislahus viiakse dekanteerimise teel kvantitatiivselt üle 1000milliliitrisesse jaotuslehtrisse (4.2.3) või ekstraktsiooniseadmesse (4.8), loputades kokku 250 ml veega. Seebistamiskolbi loputatakse järjest 25 ml etanooli (3.1) ja 100 ml petrooleetriga (3.2) ning viiakse ka need vedelikukogused üle jaotuslehtrisse või ekstraktsiooniseadmesse. Vee ja etanooli vahekord ühendatud lahuses peaks olema umbes 2:1. Raputatakse tugevasti kaks minutit ja lastakse kaks minutit selgineda.5.3.1. Ekstraheerimine jaotuslehtriga (4.2.3)Kui kihid on eraldunud (vt märkus 7.3), kantakse petrooleetri kiht üle teise jaotuslehtrisse (4.2.3). Seda ekstraheerimist korratakse kaks korda 100 ml petrooleetriga (3.2) ja kaks korda 50 ml petrooleetriga (3.2).Ühendatud ekstrakte pestakse jaotuslehtris kergel pööritamisel (et vältida emulsiooni tekkimist) kaks korda 100milliliitriste veekogustega ja seejärel korduval raputamisel veel 100milliliitriste veekogustega, kuni vesi ei muuda enam värvust fenoolftaleiini lahuse (3.7) lisamisel (tavaliselt piisab neljakordsest pesemisest). Emulgeerunud vee kõrvaldamiseks filtritakse pestud ekstrakt läbi kuiva faasieraldusfiltri (4.4) 500milliliitrisesse mõõtkolbi (4.2.2). Jaotuslehtrit ja filtrit loputatakse 50 ml petrooleetriga (3.2), lahust täiendatakse petrooleetriga (3.2) märgini ja segatakse hästi.5.3.2. Ekstraheerimine ekstraktsiooniseadmega (4.8)Kui kihid on eraldunud (vt märkus 7.3), pannakse klaassilindri (4.8.1) korgi asemele lihviga klaasotsak (4.8.2) ja seatakse nihutatava toru U-kujuline alumine ots nii, et see oleks täpselt faaside eralduspinna kohal. Tõstes gaasivooliku kaudu kõrvaltorusse juhitava lämmastiku rõhku, viiakse ülemine petrooleetri kiht üle 1000milliliitrisesse jaotuslehtrisse (4.2.3). Klaassilindrisse lisatakse 100 ml petrooleetrit (3.2), suletakse korgiga ja raputatakse tugevasti segi. Kihtidel lastakse eralduda ja ülemine kiht viiakse üle jaotuslehtrisse nagu ennegi. Ekstraheerimist korratakse järgmise 100 ml petrooleetriga (3.2), siis kaks korda 50milliliitriste petrooleetri (3.2) kogustega ja viiakse petrooleetri kihid üle jaotuslehtrisse.Ühendatud petrooleetri ekstrakte pestakse, nagu on kirjeldatud punktis 5.3.1, ja jätkatakse, nagu seal on kirjeldatud.5.4. Proovilahuse valmistamine HPLC jaoksPetrooleetri lahuse (punktist 5.3.1 või 5.3.2) alikvoot viiakse pipetiga 250milliliitrisesse pirnkolbi (4.2.4). Vaakumrotaatoriga (4.1) aurustatakse lahusti vaakumis peaaegu kuivaks vesivanni temperatuuril mitte üle 40 °C. Kolbi lastakse lämmastik (3.10) kuni atmosfäärirõhuni ja kolb eemaldatakse vaakumrotaatorilt. Järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.10) voolutades ja jääk lahustatakse kohe kindla koguse (10–100 ml) metanooliga (3.3) (A-vitamiini kontsentratsioon peaks jääma vahemikku 5–30 RÜ/ml).5.5. Määramine HPLC-gaA-vitamiin eraldatakse C18 pööratud faasi kolonnil (4.5.1) ja mõõdetakse selle kontsentratsioon UV-detektori (325 nm) või fluorestsentsdetektori (ergastamine: 325 nm, emissioon: 475 nm) (4.5.2) abil.Punktis 5.4 saadud metanoolilahuse alikvoot (nt 20 μl) süstitakse kolonni ja elueeritakse liikuva faasiga (3.9). Arvutatakse sama proovilahuse erinevate süstide keskmine piigi kõrgus (pindala) ja kaliibrimislahuste (5.6.2) mitme süsti keskmised piigi kõrgused (pindalad).HPLC tingimusedAlljärgnevad tingimused on toodud orienteerumiseks; võib kasutada ka teistsuguseid tingimusi, kui need annavad samasuguseid tulemusi.Vedelikkromatograafia kolonn (4.5.1): | 250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm või samaväärne |Liikuv faas: | Metanooli (3.3) ja vee segu, nt 980 +20 (v + v) |Voolutamiskiirus: | 1–2 ml/min |Detektor (4.5.2): | UV-detektor (325 nm) või fluorestsentsdetektor (ergastamine: 325 nm/emissioon: 475 nm) |5.6. Kaliibrimine5.6.1. Standardtöölahuste ettevalmistamine20 ml A-vitamiini atsetaadi põhilahust (3.11.1) või 20 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust (3.12.1) pipeteeritakse 500-milliliitrisesse lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) ja hüdrolüüsitakse vastavalt punktis 5.2 kirjeldatule, kuid ilma BHT lisamata. Seejärel ekstraheeritakse petrooleetriga (3.2) vastavalt punktis 5.3 kirjeldatule ja täiendatakse kuni 500 ml-ni petrooleetriga (3.2). 100 ml seda ekstrakti aurustatakse vaakumrotaatoril (vt 5.4) peaaegu kuivaks, järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.10) voolutades ja jääk lahustatakse uuesti 10,0 ml metanooliga (3.3). Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 560 RÜ A-vitamiini ml kohta. Täpne sisaldus määratakse vastavalt punktile 5.6.3.3. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.2,0 ml seda standardtöölahust pipeteeritakse 20milliliitrisesse mõõtkolbi, täiendatakse metanooliga (3.3) kuni märgini ja segatakse. Selle lahjendatud standardtöölahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini ml kohta.5.6.2. Kaliibrimislahuste tegemine ja kaliibrimisgraafiku koostamine1,0, 2,0, 5,0 ja 10,0 ml lahjendatud standardtöölahust viiakse üle 20milliliitristesse mõõtkolbidesse, täiendatakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,8, 5,6, 14,0 ja 28,0 RÜ A-vitamiini ml kohta.Igast kaliibrimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kaliibrimisgraafik, kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid) ja arvestades UV-kontrolli (5.6.3.3) tulemusi.5.6.3. Standardlahuste UV-standardiseerimine5.6.3.1. A-vitamiini atsetaadi põhilahus2,0 ml A-vitamiini atsetaadi põhilahust (3.11.1) pipeteeritakse 50milliliitrisesse mõõtkolbi (4.2.2) ja täiendatakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini ml kohta. 3,0 ml selle lahjendatud A-vitamiini atsetaadi lahust pipeteeritakse 25milliliitrisesse mõõtkolbi ja täiendatakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini ml kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.A-vitamiini sisalduse arvutamine:+++++ TIFF +++++5.6.3.2. A-vitamiini palmitaadi põhilahus2,0 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust (3.12.1) pipeteeritakse 50milliliitrisesse mõõtkolbi (4.2.2) ja täiendatakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini ml kohta. 3,0 ml selle lahjendatud A-vitamiini palmitaadi lahust pipeteeritakse 25milliliitrisesse mõõtkolbi ja täiendatakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini ml kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.A-vitamiini sisalduse arvutamine:+++++ TIFF +++++5.6.3.3. A-vitamiini standardtöölahus3,0 ml A-vitamiini lahjendamata standardtöölahust, mis on valmistatud vastavalt punktile 5.6.1, pipeteeritakse 50milliliitrisesse mõõtkolbi (4.2.2) ja täiendatakse 2-propanooliga (3.8) märgini. 5,0 ml seda lahust pipeteeritakse 25milliliitrisesse mõõtkolbi ja täiendatakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini ml kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.A-vitamiini sisalduse arvutamine:+++++ TIFF +++++6. Tulemuste arvutamineProovilahuse A-vitamiini piigi keskmisest kõrgusest (pindalast) määratakse kaliibrimisgraafiku (5.6.2) järgi proovilahuse kontsentratsioon RÜ-des milliliitri kohta.Proovi A-vitamiini sisaldus w RÜ-des kilogrammi kohta arvutatakse järgmise valemi järgi:w =500 . β . V. 1000V. mkus:β = A-vitamiini kontsentratsioon proovilahuses (5.4) RÜ-des milliliitri kohtaV1 = proovilahuse (5.4) kogus milliliitritesV2 = vastavalt punktile 5.4 võetud alikvoodi kogus milliliitritesm = proovi mass grammides7. Märkused7.1. Madala A-vitamiini kontsentratsiooniga proovides võib olla kasulik ühendada kahe seebistamiseks võetud koguse (kaalutud kogus: 25 g) petrooleetri ekstraktid üheks proovilahuseks, mida määratakse HPLC-ga.7.2. Analüüsiks võetud proov ei tohiks sisaldada üle 2 g rasva.7.3. Faaside halva eraldumise puhul lisatakse emulsiooni lõhkumiseks umbes 10 ml etanooli (3.1).7.4. Kalamaksaõli ja muude puhaste rasvade puhul tuleks seebistamise aega pikendada 45–60 minutini.7.5. BHT asemel võib kasutada hüdrokinooni.7.6. Normaalfaasikolonni kasutamisel on võimalik retinooli isomeeride eraldumine.7.7. Naatriumaskorbaadi lahuse asemel võib kasutada umbes 150 mg askorbiinhapet.7.8. Naatriumsulfiidi lahuse asemel võib kasutada umbes 50 mg etüleendiamiintetraatsetaati.8. KorratavusSama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 15 % kõrgemast tulemusest.9. Paralleelmääramise tulemused [1]L : laborite arvn : üksikväärtuste arvsr : korratavuse standardhälvesR : reprodutseeritavuse standardhälver : korratavusR : reprodutseeritavusCVr : korratavuse variatsioonikordajaCVR : reprodutseeritavuse variatsioonikordaja| Eelsegu | Eelsegu | Mineraali-kontsentraat | Valgu-kontsentraat | Põrsaste söödasegu |L | 13 | 12 | 13 | 12 | 13 |n | 48 | 45 | 47 | 46 | 49 |keskmine [RÜ/kg] | 17,02 × 106 | 1,21 × 106 | 537100 | 151800 | 18070 |sr [RÜ/kg] | 0,51 × 106 | 0,039 × 106 | 22080 | 12280 | 682 |r [RÜ/kg] | 1,43 × 106 | 0,109 × 106 | 61824 | 34384 | 1910 |CVr [%] | 3,0 | 3,5 | 4,1 | 8,1 | 3,8 |sR [RÜ/kg] | 1,36 × 106 | 0,069 × 106 | 46300 | 23060 | 3614 |R [RÜ/kg] | 3,81 × 106 | 0,193 × 106 | 129640 | 64568 | 10119 |CVR [%] | 8,0 | 6,2 | 8,6 | 15 | 20 |+++++ TIFF +++++B OSA E-VITAMIINI MÄÄRAMINE1. Eesmärk ja kasutusalaKäesolev meetod on E-vitamiini määramiseks loomasöödas ja eelsegudes. E-vitamiini sisaldust väljendatakse DL-α-tokoferoolatsetaadi milligrammides kilogrammi kohta. 1 mg DL-α-tokoferoolatsetaati vastab 0,91 mg DL-α-tokoferoolile (E-vitamiin).Määramise piir on 2 mg E-vitamiini kilogrammi kohta.2. PõhimõteProov hüdrolüüsitakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusega ja E-vitamiin ekstraheeritakse petrooleetrisse. Lahusti aurustatakse ja jääk lahustatakse metanoolis ning vajadusel lahjendatakse nõutud kontsentratsioonini. E-vitamiini sisaldus määratakse pööratud faasi kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (RP-HPLC) meetodiga, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit.3. Reaktiivid3.1. Etanool, σ = 96 %3.2. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 °C3.3. Metanool3.4. Kaaliumhüdroksiidi lahus, β = 50 g/100 ml3.5. Naatriumaskorbaadi lahus, β = 10 g/100 ml (vt märkus 7.7)3.6. Naatriumsulfiid, Na2S · x H2O (x = 7–9)3.6.1. Naatriumsulfiidi lahus, c = 0,5 mol/l glütseroolis, β = 120 g/l (kui x = 9) (vt märkus 7.8)3.7. Fenoolftaleiini lahus, β = 2 g/100 ml etanoolis (3.1)3.8. HPLC liikuv faas: metanooli (3.3) ja vee segu, nt 980 + 20 (v + v). Täpne vahekord määratakse kasutatava kolonni parameetrite järgi.3.9. Lämmastik, hapnikuvaba3.10. DL-α-tokoferoolatsetaat, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega3.10.1. DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahus: 100milliliitrisesse mõõtkolbi kaalutakse 0,1 mg täpsusega 100 mg DL-α-tokoferoolatsetaati (3.10). Lahustatakse etanoolis (3.1) ja täiendatakse sama lahustiga märgini. 1 ml seda lahust sisaldab 1 mg DL-α-tokoferoolatsetaati. (UV-ga kontrollimise kohta vt punkt 5.6.1.3; stabiliseerimise kohta vt märkus 7.4).3.11. DL-α-tokoferool, eriti puhas, kontrollitud aktiivsusega3.11.1. 100milliliitrisesse mõõtkolbi kaalutakse 0,1 mg täpsusega 100 mg DL-α-tokoferooli (3.10). Lahustatakse etanoolis (3.1) ja täiendatakse sama lahustiga märgini. 1 ml seda lahust sisaldab 1 mg DL-α-tokoferooli (UV-ga kontrollimise kohta vt punkt 5.6.2.3; stabiliseerimise kohta vt märkus 7.4).3.12. 2,6-Di-tert-butüül-4- metüülfenool (BHT) (vt märkus 7.5).4. Seadmed4.1. Vaakumrotaatoraurusti4.2. Pruunist klaasist nõud4.2.1. Lihvavaga lamedapõhjalised või koonilised kolvid, 500 ml4.2.2. Lihvkorgiga kitsakaelalised mõõtkolvid 10, 25, 100 ja 500 ml4.2.3. Lihvkorgiga koonilised jaotuslehtrid, 1000 ml4.2.4. Lihviga pirnkolvid, 250 ml4.3. Lihvühendusega Allihni tagasivoolujahuti, ümbrise pikkus 300 mm, gaasitoru adapteriga4.4. Kurdfilterpaber faaside eraldamiseks, diameeter 185 mm (nt Schleicher & Schuell 597 HY ½)4.5. HPLC-seadmed sissepritsesüsteemiga4.5.1. Vedelikkromatograafia kolonn, 250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm, või samaväärne4.5.2. Muudetava lainepikkusega UV- või fluorestsentsdetektor4.6. Spektrofotomeeter 10millimeetriste kvartsküvettidega4.7. Magnetsegajaga vesivann4.8. Ekstraktsiooniseade (vt joonis 1), mis koosneb:4.8.1. 1-liitrisest lihvava ja lihvkorgiga klaassilindrist,4.8.2. lihviga klaasotsakust, mis on varustatud kõrvaltoruga ja keskelt läbi mineva üles-alla nihutatava toruga. Nihutataval torul peaks olema U-kujuline alumine ots ja teises otsas düüs, nii et silindris oleva vedeliku ülemist kihti oleks võimalik viia üle jaotuslehtrisse.5. Analüüsi käikMärkus:E-vitamiin on tundlik (UV-) valguse ja oksüdeerumise suhtes. Kõik toimingud tuleks teostada valguse ja hapniku juurdepääsuta (kasutades pruunist klaasist või alumiiniumfooliumiga kaetud nõusid ja voolutades lämmastikuga). Ekstraheerimise ajal tuleb vedeliku kohal olev õhk asendada lämmastikuga (ülerõhu vältimiseks tuleb korki aeg-ajalt kergitada).5.1. Proovi ettevalmistamineProov jahvatatakse kuumenemist vältides nii peeneks, et see läheks läbi 1millimeetriste avadega sõela. Jahvatamine peab toimuma vahetult enne kaalumist ja seebistamist, vastasel juhul võib esineda E-vitamiini kadusid.5.2. Seebistamine500milliliitrisesse lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) kaalutakse 0,01 g täpsusega 2–25 g proovi, sõltuvalt E-vitamiini sisaldusest. Seejärel lisatakse ringliigutustega segades 130 ml etanooli (3.1), umbes 100 mg BHT (3.12), 2 ml naatriumaskorbaadi lahust (3.5) ja 2 ml naatriumsulfiidi lahust (3.6). Kolvi otsa ühendatakse tagasivoolujahuti (4.3) ja kolb pannakse magnetsegajaga vesivanni (4.7). Kuumutatakse keemiseni ja keedetakse tagasivoolujahuti all 5 minutit. Seejärel lisatakse läbi jahuti (4.3) 25 ml kaaliumhüdroksiidi lahust (3.4) ja lastakse segamisel keeda tagasivoolujahuti all veel 25 minutit, voolutades nõrgalt lämmastikuga. Seejärel loputatakse jahutit umbes 20 ml veega ja jahutatakse kolvi sisu toatemperatuurini.5.3. EkstraheerimineSeebistamislahus viiakse dekanteerimise teel kvantitatiivselt üle 1000milliliitrisesse jaotuslehtrisse (4.2.3) või ekstraktsiooniseadmesse (4.8), loputades kokku 250 ml veega. Seebistamiskolbi loputatakse järjest 25 ml etanooli (3.1) ja 100 ml petrooleetriga (3.2) ja viiakse ka need vedelikukogused üle jaotuslehtrisse või ekstraktsiooniseadmesse. Vee ja etanooli vahekord ühendatud lahuses peaks olema umbes 2:1. Raputatakse tugevasti kaks minutit ja lastakse kaks minutit selgineda.5.3.1. Ekstraheerimine jaotuslehtriga (4.2.3)Kui kihid on eraldunud (vt märkus 7.3), kantakse petrooleetri kiht üle teise jaotuslehtrisse (4.2.3). Seda ekstraheerimist korratakse kaks korda 100 ml petrooleetriga (3.2) ja kaks korda 50 ml petrooleetriga (3.2).Ühendatud ekstrakte pestakse jaotuslehtris kergel pööritamisel (et vältida emulsiooni tekkimist) kaks korda 100milliliitriste veekogustega ja seejärel korduval raputamisel veel 100milliliitriste veekogustega, kuni vesi ei muuda enam värvust fenoolftaleiini lahuse (3.7) lisamisel (tavaliselt piisab neljakordsest pesemisest). Emulgeerunud vee kõrvaldamiseks filtritakse pestud ekstrakt läbi kuiva faasieraldusfiltri (4.4) 500milliliitrisesse mõõtkolbi (4.2.2). Jaotuslehtrit ja filtrit loputatakse 50 ml petrooleetriga (3.2), täiendatakse petrooleetriga (3.2) märgini ja segatakse hästi.5.3.2. Ekstraheerimine ekstraktsiooniseadmega (4.8)Kui kihid on eraldunud (vt märkus 7.3), pannakse klaassilindri (4.8.1) korgi asemele lihviga klaasotsak (4.8.2) ja seatakse nihutatava toru U-kujuline alumine ots nii, et see oleks täpselt faaside eralduspinna kohal. Tõstes gaasivooliku kaudu kõrvaltorusse juhitava lämmastiku rõhku, viiakse ülemine petrooleetri kiht üle 1000milliliitrisesse jaotuslehtrisse (4.2.3). Klaassilindrisse lisatakse 100 ml petrooleetrit (3.2), suletakse korgiga ja raputatakse tugevasti segi. Kihtidel lastakse eralduda ja ülemine kiht viiakse üle jaotuslehtrisse nagu ennegi. Ekstraheerimist korratakse järgmise 100 ml petrooleetriga (3.2), siis kaks korda 50milliliitriste petrooleetri (3.2) kogustega ja viiakse petrooleetri kihid üle jaotuslehtrisse.Ühendatud petrooleetri ekstrakte pestakse, nagu on kirjeldatud punktis 5.3.1, ja jätkatakse, nagu seal on kirjeldatud.5.4. Proovilahuse valmistamine HPLC jaoksPetrooleetri lahuse (punktist 5.3.1 või 5.3.2) alikvoot viiakse pipetiga 250milliliitrisesse pirnkolbi (4.2.4). Lahusti aurustatakse vaakumrotaatoril (4.1) vaakumis peaaegu kuivaks vesivanni temperatuuril mitte üle 40 °C. Kolbi lastakse lämmastik (3.9) kuni atmosfäärirõhuni ja kolb eemaldatakse vaakumrotaatorilt. Järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.9) voolutades ja jääk lahustatakse kohe kindla koguse (10–100 ml) metanooliga (3.3) (DL-α-tokoferooli kontsentratsioon peaks jääma vahemikku 5–30 μg/ml).5.5. Määramine HPLC-gaE-vitamiin eraldatakse C18 pööratud faasi kolonnil (4.5.1) ja mõõdetakse selle kontsentratsioon fluorestsentsdetektori (ergastamine: 295 nm, emissioon: 330 nm) või UV-detektori (292 nm) (4.5.2) abil.Punktis 5.4 saadud metanoolilahuse alikvoot (nt 20 μl) süstitakse kolonni ja elueeritakse liikuva faasiga (3.8). Arvutatakse sama proovilahuse erinevate süstide keskmine piigi kõrgus (pindala) ja kaliibrimislahuste (5.6.2) mitme süsti keskmised piigi kõrgused (pindalad).HPLC-tingimusedAlljärgnevad tingimused on toodud orienteerumiseks; võib kasutada ka teistsuguseid tingimusi, kui need annavad samasuguseid tulemusi.Vedelikkromatograafia kolonn (4.5.1): | 250 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 või 10 μm või samaväärne |Liikuv faas (3.8): | Metanooli (3.3) ja vee segu, nt 980 + 20 (v + v) |Voolutamiskiirus: | 1–2 ml/min |Detektor (4.5.2): | Fluorestsentsdetektor (ergastamine: 295 nm/emissioon: 330 nm) või UV-detektor (292 nm) |5.6. Kaliibrimine (DL-α-tokoferoolatsetaat või DL-α-tokoferool)5.6.1. DL-α-tokoferoolatsetaadi standard5.6.1.1. Standardtöölahuse ettevalmistamine25 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (3.10.1) viiakse pipetiga 500milliliitrisesse lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) ja hüdrolüüsitakse vastavalt punktis 5.2 kirjeldatule. Seejärel ekstraheeritakse petrooleetriga (3.2) vastavalt punktis 5.3 kirjeldatule ja täiendatakse petrooleetriga 500 milliliitrini. 25 ml seda ekstrakti aurustatakse vaakumrotaatoril (vt 5.4) peaaegu kuivaks, järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.9) voolutades ja jääk lahustatakse uuesti 25,0 ml metanooliga (3.3). Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 45,5 μg DL-α-tokoferooli ml kohta, mis on ekvivalentne 50 μg DL-α-tokoferoolatsetaadiga ml kohta. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.5.6.1.2. Kaliibrimislahuste tegemine ja kaliibrimisgraafiku koostamine1,0, 2,0, 4,0 ja 10,0 ml standardtöölahust viiakse üle 20milliliitristesse mõõtkolbidesse, täiendatakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,5, 5,0, 10,0 ja 25,0 μg DL-α-tokoferoolatsetaati/ml, s.o 2,28, 4,55, 9,10 ja 22,8 μg DL-α-tokoferooli/ml.Igast kaliibrimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kaliibrimisgraafik, kasutades keskmisi piikide kõrgusi (pindalasid).5.6.1.3 DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahuse (3.10.1) UV-standardiseerimine5,0 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust lahjendatakse etanooliga 25,0 milliliitrini ja mõõdetakse spektrofotomeetriga (4.6) selle lahuse UV-spekter vahemikus 250–320 nm etanooli (3.1) suhtes.Neeldumismaksimum peaks olema 284 nm:+++++ TIFF +++++Sellisel lahjendusel peaks ekstinktsiooni väärtus olema vahemikus 0,84–0,88.5.6.2. DL-α-tokoferooli standard5.6.2.1. Standardtöölahuse valmistamine2,0 ml DL-α-tokoferooli põhilahust (3.11.1) viiakse pipetiga 50milliliitrisesse mõõtkolbi, lahustatakse metanoolis (3.3) ja täiendatakse metanooliga märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 40 μg DL-α-tokoferooli ml kohta, mis on ekvivalentne 44,0 μg DL-α-tokoferoolatsetaadiga ml kohta. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.5.6.2.2. Kaliibrimislahuste tegemine ja kaliibrimisgraafiku koostamine1,0, 2,0, 4,0 ja 10,0 ml standardtöölahust viiakse üle 20milliliitristesse mõõtkolbidesse, täiendatakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,0, 4,0, 8,0 ja 20,0 μg DL-α-tokoferooli/ml, s.o 2,20, 4,40, 8,79 ja 22,0 μg DL-α-tokoferoolatsetaati/ml.Igast kaliibrimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid), koostatakse kaliibrimisgraafik.5.6.2.3. DL-α-tokoferooli põhilahuse (3.11.1) UV-standardiseerimine2,0 ml DL-α-tokoferooli põhilahust (3.11.1) lahjendatakse etanooliga 25,0 milliliitrini ja mõõdetakse spektrofotomeetriga (4.6) selle lahuse UV-spekter etanooli (3.1) suhtes vahemikus 250–320 nm. Neeldumismaksimum peaks olema 292 nm:+++++ TIFF +++++Sellisel lahjendusel peaks ekstinktsiooni väärtus olema 0,6.6. Tulemuste arvutamineProovilahuse E-vitamiini piikide keskmisest kõrgusest (pindalast) määratakse kaliibrimisgraafiku (5.6.1.2 või 5.6.2.2) järgi proovilahuse kontsentratsioon μg-des milliliitri kohta (arvutatuna α-tokoferoolatsetaadile).Proovi E-vitamiini sisaldus w mg-des kilogrammi kohta arvutatakse järgmise valemi järgi:+++++ TIFF +++++kus:β = E-vitamiini kontsentratsioon mikrogrammides milliliitri kohta proovilahuses (5.4)V1 = proovilahuse (5.4) kogus milliliitritesV2 = vastavalt punktile 5.4 võetud alikvoodi kogus milliliitritesm = proovi mass grammides7. Märkused7.1. Madala E-vitamiini kontsentratsiooniga proovides võib olla kasulik ühendada kahe seebistumiseks võetud koguse (kaalutud kogus: 25 g) petrooleetri ekstraktid üheks proovilahuseks, mida määratakse HPLC-ga.7.2. Analüüsiks võetud proov ei tohiks sisaldada üle 2 g rasva.7.3. Faaside halva eraldumise puhul lisatakse emulsiooni lõhkumiseks umbes 10 ml etanooli (3.1).7.4. Pärast DL-α-tokoferoolatsetaadi või DL-α-tokoferooli lahuste spektrofotomeetrilist mõõtmist vastavalt punktidele 5.6.1.3 või 5.6.2.3 lisatakse lahusele (3.10.1 või 3.10.2) umbes 10 mg BHT (3.12) ja hoitakse lahust külmkapis (kõlblikkusaeg maksimaalselt neli nädalat).7.5. BHT asemel võib kasutada hüdrokinooni.7.6. Normaalfaasikolonni kasutamisel on võimalik α-, β-, χ- ja δ-tokoferooli eraldumine.7.7. Naatriumaskorbaadi lahuse asemel võib kasutada umbes 150 mg askorbiinhapet.7.8. Naatriumsulfiidi lahuse asemel võib kasutada umbes 50 mg etüleendiamiintetraatsetaati.8. KorratavusSama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 15 % kõrgemast tulemusest.9. Paralleelmääramise tulemused [2]L : laborite arvn : üksikväärtuste arvsR : korratavuse standardhälvesR : reprodutseeritavuse standardhälver : korratavusR : reprodutseeritavusCVr : korratavuse variatsioonikordajaCVR : reprodutseeritavuse variatsioonikordaja| Eelsegu | Eelsegu | Mineraali-kontsentraat | Valgu-kontsentraat | Põrsaste söödasegu |L | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |n | 48 | 48 | 48 | 48 | 48 |keskmine [mg/kg] | 17380 | 1187 | 926 | 315 | 61,3 |sr [mg/kg] | 384 | 45,3 | 25,2 | 13,0 | 2,3 |r [mg/kg] | 1075 | 126,8 | 70,6 | 36,4 | 6,4 |CVr [%] | 2,2 | 3,8 | 2,7 | 4,1 | 3,8 |sR [mg/kg] | 830 | 65,0 | 55,5 | 18,9 | 7,8 |R [mg/kg] | 2324 | 182,0 | 155,4 | 52,9 | 21,8 |CVR [%] | 4,8 | 5,5 | 6,0 | 6,0 | 12,7 |+++++ TIFF +++++C OSA TRÜPTOFAANI MÄÄRAMINE1. Eesmärk ja kasutusalaKäesolev meetod on trüptofaani üldsisalduse ja vaba trüptofaani sisalduse määramiseks loomasöödas. Meetod ei erista D- ja L-vormi.2. PõhimõteTrüptofaani üldsisalduse määramiseks hüdrolüüsitakse proovi leeliselises keskkonnas küllastunud baariumhüdroksiidi lahusega ja kuumutatakse 110 °C juures 20 tundi. Pärast hüdrolüüsimist lisatakse sisestandard.Vaba trüptofaani määramiseks ekstraheeritakse proovi nõrgalt happelistes tingimustes sisestandardi juuresolekul.Trüptofaan ja sisestandard määratakse hüdrolüsaadis või ekstraktis HPLC-ga fluorestsentsdetektori abil.3. Reaktiivid3.1. Tuleb kasutada bidestilleeritud või samaväärse kvaliteediga vett (juhtivus < 10 μS/cm).3.2. Standardaine: trüptofaan (puhtus/sisaldus 99 %), mis on kuivatatud vaakumis difosforpentoksiidi kohal.3.3. Sisestandardaine: α-metüültrüptofaan (puhtus/sisaldus 99 %), mis on kuivatatud vaakumis difosforpentoksiidi peal.3.4. Baariumhüdroksiidi oktahüdraat (vältida Ba(OH)2 · 8H2O ülemäärast kontakti õhuga, kuna see võib viia BaCO3 moodustumiseni, mis võib määramist segada) (vt märkus 9.3)3.5. Naatriumhüdroksiid3.6. Ortofosforhape, w = 85 %3.7. Soolhape, ρ20 = 1,19 g/ml3.8. Metanool, HPLC jaoks3.9. Petrooleeter, keemisvahemik 40–60 °C3.10. Naatriumhüdroksiidi lahus, c = 1 mol/l:40,0 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täiendatakse veega (3.1) 1 liitrini.3.11. Soolhape, c = 6 mol/l:Võetakse 492 ml HCl (3.7) ja täiendatakse veega 1 liitrini.3.12. Soolhape, c = 1 mol/l:Võetakse 82 ml HCl (3.7) ja täiendatakse veega 1 liitrini.3.13. Soolhape, c = 0,1 mol/l:Võetakse 8,2 ml HCl (3.7) ja täiendatakse veega 1 liitrini.3.14. Ortofosforhape, c = 0,5 mol/l:Võetakse 34 ml ortofosforhapet (3.6) ja täiendatakse veega (3.1) 1 liitrini.3.15. Trüptofaani (3.2) kontsentreeritud lahus, c = 2,50 μmol/ml:500milliliitrises mõõtkolvis lahustatakse 0,2553 g trüptofaani (3.2) soolhappes (3.13) ja täiendatakse soolhappega (3.13) märgini. Lahust võib hoida temperatuuril –18 °C kuni neli nädalat.3.16. Sisestandardi kontsentreeritud lahus, c = 2,50 μmol/ml:500milliliitrises mõõtkolvis lahustatakse 0,2728 g α-metüültrüptofaani (3.3) soolhappes (3.13) ja täiendatakse soolhappega (3.13) märgini. Lahust võib hoida temperatuuril –18 °C kuni neli nädalat.3.17. Trüptofaani ja sisestandardi kaliibrimisstandardlahus:Võetakse 2,00 ml trüptofaani kontsentreeritud lahust (3.15) ja 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Lahjendatakse veega (3.1) ja metanooliga (3.8) umbes sama ruumalani ja umbes sama metanooli kontsentratsioonini (10–30 %), nagu on valmis hüdrolüsaadil.Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.Valmistamise ajal vältida otsest päikesevalgust.3.18. Äädikhape3.19. 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanool3.20. Etanoolamiin > 98 %3.21. 1 grammi 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahus 100 ml metanoolis (3.8)3.22. HPLC liikuv faas: 3,00 g äädikhapet (3.18) + 900 ml vett (3.1) + 50,0 ml 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahust (3.21) metanoolis (3.8) (1 g/100 ml). pH tuleb reguleerida etanoolamiiniga (3.20) 5,00 peale. Täiendatakse veega (3.1) 1000 ml-ni.4. Seadmed4.1. HPLC-seadmed spektrofluorimeetrilise detektoriga4.2. Vedelikkromatograafia kolonn, 125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 3 μm või samaväärne4.3. pH-meeter4.4. Laia kaela ja keeratava korgiga polüpropüleenkolb, maht 125 ml4.5. Membraanfilter, 0,45 μm4.6. Autoklaav, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar4.7. Mehaaniline loksuti või magnetsegaja4.8. Pöörissegaja5. Analüüsi käik5.1. Proovide ettevalmistamineProov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5millimeetriste avadega sõela. Kõrge niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril mitte üle 50 °C või lüofiliseerida. Kõrge rasvasisaldusega proove tuleks enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (3.9).5.2. Vaba trüptofaani määramine (ekstrakt)Ettevalmistatud proovi (5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 1 mg täpsusega koonilisse kolbi. Lisatakse 100,0 ml soolhapet, c = 0,1 mol/l, (3.13) ja 5,00 ml kontsentreeritud sisestandardlahust (3.16). Raputatakse või segatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegajat (4.7). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle keeduklaasi. Lisatakse 5 ml ortofosforhapet, c = 0,5 mol/l (3.14). pH viiakse naatriumhüdroksiidiga, c = 1,0 mol/l, 3,0 peale (3.10). Lisatakse piisavalt metanooli (3.8), et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 protsendini. Lahus viiakse üle sobiva suurusega mõõtkolbi ja lahjendatakse veega kuni kromatograafiaks sobiva koguseni (umbes sama kogus kui kaliibrimisstandardlahusel (3.17)).Enne HPLC-kolonni süstimist filtritakse paar milliliitrit lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt lõigule 5.4.Standardlahust ja ekstrakte tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui ekstrakte ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 °C kuni kolm päeva.5.3. Trüptofaani üldsisalduse määramine (hüdrolüsaat).0,2 mg täpsusega kaalutakse 0,1–1 g ettevalmistatud proovi (5.1) polüropüleenkolbi (4.4). Kaalutud proovi kogus peaks sisaldama umbes 10 mg lämmastikku. Lisatakse 8,4 g baariumhüdroksiidi oktahüdraati (3.4) ja 10 ml vett. Segatakse pöörissegajaga (4.8) või magnetsegajaga (4.7). Tefloniga kaetud magnet jäetakse segusse. Nõu seinad loputatakse üle 4 ml veega. Keeratav kork pannakse peale ja kolb suletakse lõdvalt. Kolb pannakse autoklaavi (4.6) ja kuumutatakse keevas vees 30–60 minutit. Autoklaav suletakse ja kuumutatakse 20 tundi 110 (± 2) °C juures.Enne autoklaavi avamist langetatakse temperatuur natuke alla 100 °C kraadi. Ba(OH)2 · 8H2O kristalliseerumise vältimiseks lisatakse soojale segule 30 ml toatemperatuuril olevat vett. Raputatakse või segatakse kergelt. Lisatakse 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Nõusid jahutatakse vee-/jäävannis 15 minutit.Seejärel lisatakse 5 ml ortofosforhapet, c = 0,5 mol/l (3.14). Nõu hoitakse jahutusvannis ja neutraliseeritakse segamisel HCl-iga, c = 6 mol/l (3.11); pH näit viiakse HCl-ga (3.12), c = 1 mol/l, 3,0 peale. Lisatakse piisavalt metanooli, et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 protsendini. Viiakse üle sobiva suurusega mõõtkolbi ja lahjendatakse veega kindla, kromatograafiaks sobiva ruumalani (näiteks 100 ml). Metanooli lisamine ei tohi tekitada sadenemist.Enne HPLC-kolonni süstimist filtritakse paar milliliitrit lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt lõigule 5.4.Standardlahust ja hüdrolüsaate tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui hüdrolüsaate ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 °C kuni kolm päeva.5.4. Määramine HPLC-gaSoovitatakse juhinduda järgmistest isokraatilise elueerimise tingimustest; võib kasutada muid tingimusi, kui need annavad samaväärsed tulemused (vt ka märkused 9.1 ja 9.2):Vedelikkromatograafia kolonn (4.2): | 125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 3 μm või samaväärne |Kolonni temperatuur: | toatemperatuur |Liikuv faas (3.22): | 3,00 g äädikhapet (3.18) + 900 ml vett (3.1) + 50,0 ml 1,1,1-trikloro-2-metüül-2-propanooli (3.19) lahust (3.21) metanoolis (3.8) (1 g/100 ml). pH seatakse etanoolamiiniga (3.20) 5,00 peale. Täiendatakse veega (3.1) 1000 milliliitrini. |Voolutamiskiirus: | 1 ml/min |Summaarne voolutamisaeg: | umbes 34 min |Detekteerimise lainepikkus: | ergastamine: 280 nm, emissioon: 356 nm |Süstimisruumala: | 20 μl |6. Tulemuste arvutamine+++++ TIFF +++++A = sisestandardi piigi pindala, kaliibrimisstandardlahus (3.17)B = trüptofaani piigi pindala, ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3)C = kaliibrimislahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (3.15) kogus milliliitrites (2 ml)D = kaliibrimislahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (3.15) kontsentratsioon, μmol/ml (= 2,50)E = kontsentreeritud sisestandardlahuse (3.16) kogus milliliitrites, mis lisati ekstraheerimisel (5.2) (= 5,00 ml) või hüdrolüsaadile (5.3) (= 2,00 ml)F = sisestandardi piigi pindala, ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3)G = trüptofaani piigi pindala, kaliibrimisstandardlahus (3.17)H = kaliibrimisstandardlahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud sisestandardlahuse (3.16) kogus milliliitrites (= 2,00 ml)W = proovi mass grammides (parandusega esialgsele massile, kui proovi kuivatati ja/või rasvatustati)MW = trüptofaani molekulmass (= 204,23)7. KorratavusSama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10 % kõrgemast tulemusest.8. Paralleelmääramise tulemusedKorraldati ühendusesisene paralleelne määramine (neljas võrdlusuuring), mille käigus kuni 12 laborit analüüsisid hüdrolüüsimeetodi sertifitseerimiseks kolme proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:L : tulemused esitanud laborite arvn : üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljaviskamist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)sr : korratavuse standardhälvesR : reprodutseeritavuse standardhälver : korratavusR : reprodutseeritavusCVr : korratavuse variatsioonikordaja, %CVR : reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %| Proov 1 Seasööt | Proov 2 L-trüptofaaniga rikastatud seasööt | Proov 3 Sigade söödakontsent- raat |L | 12 | 12 | 12 |n | 50 | 55 | 50 |keskmine [g/kg] | 2,42 | 3,40 | 4,22 |sr [g/kg] | 0,05 | 0,05 | 0,08 |r [g/kg] | 0,14 | 0,14 | 0,22 |CVr [%] | 1,9 | 1,6 | 1,9 |sR [g/kg] | 0,15 | 0,20 | 0,09 |R [g/kg] | 0,42 | 0,56 | 0,25 |CVR [%] | 6,3 | 6,0 | 2,2 |Teise ühendusesisese paralleelse määramise (kolmanda võrdlusuuringu) käigus analüüsisid kuni 13 laborit vaba trüptofaani ekstraheerimise meetodi sertifitseerimiseks kahte proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:L : tulemused esitanud laborite arvn : üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljaviskamist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)sr : korratavuse standardhälvesR : reprodutseeritavuse standardhälver : korratavusR : reprodutseeritavusCVr : korratavuse variatsioonikordaja, %CVR : reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %| Proov 4 Nisu ja soja segu | Proov 5 Nisu ja soja segu (proov 4), millele oli lisatud trüptofaani (0,457 g/kg) |L | 12 | 12 |n | 55 | 60 |keskmine [g/kg] | 0,391 | 0,931 |sr [g/kg] | 0,005 | 0,012 |r [g/kg] | 0,014 | 0,034 |CVr [%] | 1,34 | 1,34 |sR [g/kg] | 0,018 | 0,048 |R [g/kg] | 0,050 | 0,134 |CVR [%] | 4,71 | 5,11 |Veel ühe ühendusesisese paralleelse määramise käigus analüüsisid kuni seitse laborit trüptofaani hüdrolüüsi sertifitseerimise eesmärgiga nelja proovi. Tulemused on esitatud allpool. Kõigile proovidele tehti viis kordusanalüüsi.L : tulemused esitanud laborite arvn : üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljaviskamist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)sr : korratavuse standardhälvesR : reprodutseeritavuse standardhälver : korratavusR : reprodutseeritavusCVr : korratavuse variatsioonikordaja, %CVR : reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %| Proov 1 Sigade söödasegu (CRM 117) | Proov 2 Madala rasvasisaldusega kalajahu (CRM 118) | Proov 3 Sojajahu (CRM 119) | Proov 4 Lõssipulber (CRM 120) |L | 7 | 7 | 7 | 7 |n | 25 | 30 | 30 | 30 |keskmine [g/kg] | 2,064 | 8,801 | 6,882 | 5,236 |sr [g/kg] | 0,021 | 0,101 | 0,089 | 0,040 |r [g/kg] | 0,059 | 0,283 | 0,249 | 0,112 |CVr [%] | 1,04 | 1,15 | 1,30 | 0,76 |sR [g/kg] | 0,031 | 0,413 | 0,283 | 0,221 |R [g/kg] | 0,087 | 1,156 | 0,792 | 0,619 |CVR [%] | 1,48 | 4,69 | 4,11 | 4,22 |9. Märkused9.1. Järgmised kromatograafia eritingimused võivad tagada trüptofaani ja α-metüültrüptofaani parema eraldumise teineteisest.Isokraatiline elueerimine, millele järgneb kolonni puhastamine gradiendiga:Vedelikkromatograafia kolonn: | 125 mm × 4 mm, C18, täidise terasuurus 5 μm või samaväärne |Kolonni temperatuur: | 32 °C |Liikuv faas: | A: 0,01 mol/l KH2 PO4/metanool, 95 + 5 (v + v). B: metanool |Gradiendiprogramm: | 0 min | 100 % A | 0 % B |15 min | 100 % A | 0 % B |17 min | 60 % A | 40 % B |19 min | 60 % A | 40 % B |21 min | 100 % A | 0 % B |33 min | 100 % A | 0 % B |Voolutamiskiirus: | 1,2 ml/min |Summaarne voolutamisaeg: | umbes 33 min |9.2. Kromatograafilise määramise läbiviimine oleneb HPLC-tüübist ja kasutatavast kolonnitäidisest. Valitud süsteem peab tagama trüptofaani ja sisestandardi piikide täieliku eraldumise (kuni alusjooneni). Lisaks sellele on oluline, et lagunemisproduktid eralduksid hästi trüptofaanist ja sisestandardist. Kolonni tuleks süstida ilma sisestandardita hüdrolüsaate kontrollimaks, et sisestandardi piigi kohal ei moonutaks alusjoont lisandite väljumine. On oluline, et voolutamisaeg oleks piisavalt pikk kõigi lagunemisproduktide elueerimiseks, vastasel juhul võivad hiljem elueeruvad piigid segada järgnevaid kromatograafilisi määramisi.Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peaksid kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma kontsentratsioonist lineaarselt. Tulemuste lineaarsust tuleks kontrollida sisestandardi konstantsel (normaalsel) kontsentratsioonil erinevate trüptofaani kontsentratsioonidega. On oluline, et nii trüptofaani kui ka sisestandardi piigid oleksid HPLC-/fluorestsentssüsteemi lineaarses alas. Kui trüptofaani või sisestandardi piigid on liiga väikesed või liiga kõrged, siis tuleks analüüsi korrata teistsuguse proovi suurusega ja/või teistsuguse lõppruumalaga.9.3. BaariumhüdroksiidBaariumhüdroksiidi lahustamine raskeneb baariumhüdroksiidi vananemisel. Selle tulemusel saadakse HPLC-ga määramiseks hägune lahus, mis võib vähendada trüptofaani määramisel saadavaid tulemusi.[1] Määramised viis läbi ühenduse Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) söötade uurimisgrupp.[2] Määramised viis läbi ühenduse Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) söötade uurimisgrupp.--------------------------------------------------


title: Nõukogu direktiiv, 14. detsember 1981, millega täiendatakse omandatud õiguste osas direktiive 75/362/EMÜ, 77/452/EMÜ, 78/686/EMÜ ja 78/1026/EMÜ, mis käsitlevad vastavalt arstide, üldõdede, hambaarstide ja veterinaararstide diplomite, tunnistuste ja muude kvalifikatsiooni tõendavate dokumentide vastastikust tunnustamist

text:
Tähtis õiguslik teade

|

31981L1057

Euroopa Liidu Teataja L 385 , 31/12/1981 Lk 0025 - 0026 Soomekeelne eriväljaanne: Peatükk 16 Köide 1 Lk 0050  Hispaaniakeelne eriväljaanne: Peatükk 06 Köide 2 Lk 0126  Rootsikeelne eriväljaanne: Peatükk 16 Köide 1 Lk 0050  Portugalikeelne eriväljaanne Peatükk 06 Köide 2 Lk 0126

		Nõukogu direktiiv,14. detsember 1981,millega täiendatakse omandatud õiguste osas direktiive 75/362/EMÜ, 77/452/EMÜ, 78/686/EMÜ ja 78/1026/EMÜ, mis käsitlevad vastavalt arstide, üldõdede, hambaarstide ja veterinaararstide diplomite, tunnistuste ja muude kvalifikatsiooni tõendavate dokumentide vastastikust tunnustamist(81/1057/EMÜ)EUROOPA ÜHENDUSTE NÕUKOGU,võttes arvesse Euroopa Majandusühenduse asutamislepingut, eriti selle artikleid 49, 57 ja 66,võttes arvesse komisjoni ettepanekut, [1]võttes arvesse Euroopa Parlamendi arvamust, [2]võttes arvesse majandus- ja sotsiaalkomitee arvamust [3]ning arvestades, et:direktiivides 75/362/EMÜ, [4] 77/452/EMÜ, [5] 78/686/EMÜ [6] ja 78/1026/EMÜ, [7] mis käsitlevad vastavalt arstide, üldõdede, hambaarstide ja veterinaararstide diplomite, tunnistuste ja muude kvalifikatsiooni tõendavate dokumentide vastastikust tunnustamist ja mis sisaldavad meetmeid asutamisvabaduse ja teenuste osutamise vabaduse kasutamise hõlbustamiseks, käsitlevad omandatud õigustega seotud sätted arstide, üldõdede, hambaarstide ja veterinaararstide diplomeid, tunnistusi ja muid kvalifikatsiooni tõendavaid dokumente, mille liikmesriigid on välja andnud enne kõnealuste direktiivide rakendamist;seepärast ei hõlma need sätted otseselt diplomeid, tunnistusi ja muid kvalifikatsiooni tõendavaid dokumente, mis tõendavad koolitust, mis ei vasta direktiivides 75/363/EMÜ, [8] 77/453/EMÜ, [9] 78/687/EMÜ [10] ja 78/1027/EMÜ [11] sätestatud koolituse miinimumnõuetele ja mis viidi lõpule pärast, kuid mida alustati enne kõnealuste direktiivide jõustumist;see lünk oleks soovitatav täita,ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:Artikkel 1Direktiivi 75/362/EMÜ artikli 9 lõikeid 1 ja 2, direktiivi 77/452/EMÜ artiklit 4, direktiivi 78/686/EMÜ artikli 7 lõikeid 1 ja 2 ning direktiivi 78/1026/EMÜ artiklit 4 kohaldatakse ka nende diplomite, tunnistuste ja muude kvalifikatsiooni tõendavate dokumentide suhtes, mis tõendavad koolitust, mis ei vasta direktiivi 75/363/EMÜ artiklites 1, 2, 3, 4 ja 5, direktiivi 77/453/EMÜ artiklis 1, direktiivi 78/687/EMÜ artiklites 1, 2 ja 3 ning direktiivi 78/1027/EMÜ artiklis 1 sätestatud koolituse miinimumnõuetele ja mis viidi lõpule pärast, kuid mida alustati enne kõnealuste direktiivide jõustumist.Artikkel 2Liikmesriigid võtavad käesoleva direktiivi täitmiseks vajalikud meetmed hiljemalt 30. juuniks 1982. Liikmesriigid teatavad nendest viivitamata komisjonile.Artikkel 3Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.Brüssel, 14. detsember 1981Nõukogu nimeleesistujaG. Howe[1] EÜT C 121, 23.5.1981, lk 3.[2] EÜT C 172, 13.7.1981, lk 114.[3] EÜT C 185, 27.7.1981, lk 7.[4] EÜT L 167, 30.6.1975, lk 1.[5] EÜT L 176, 15.7.1977, lk 1.[6] EÜT L 233, 24.8.1978, lk 1.[7] EÜT L 362, 23.12.1978, lk 1.[8] EÜT L 167, 30.6.1975, lk 14.[9] EÜT L 176, 15.7.1977, lk 8.[10] EÜT L 233, 24.8.1978, lk 10.[11] EÜT L 362, 23.12.1978, lk 7.--------------------------------------------------