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31972L0199

Tercera Directiva 72/199/CEE de la Comisión, de 27 de abril de 1972, por la que se determinan métodos de análisis comunitario para el control oficial de los alimentos para animales

Diario Oficial n° L 123 de 29/05/1972 p. 0006 - 0034 Edición especial en finés : Capítulo 3 Tomo 4 p. 0184  Edición especial en danés: Serie III Capítulo 1966-1972 p. 0071  Edición especial sueca: Capítulo 3 Tomo 4 p. 0184  Edición especial en inglés: Serie III Capítulo 1966-1972 p. 0074  Edición especial griega: Capítulo 03 Tomo 8 p. 0007  Edición especial en español: Capítulo 03 Tomo 6 p. 0008  Edición especial en portugués: Capítulo 03 Tomo 6 p. 0008

 TERCERA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN    de 27 de abril de 1972    por la que se determinan métodos de   análisis comunitario para el control oficial de   los alimentos para animales     ( 72/199/CEE )    LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,    Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad   Económica Europea ,    Vista la Directiva del Consejo , de 20 de julio de 1970 ,   relativa a la introducción de métodos de toma de   muestras y de análisis comunitarios para el control   oficial de los alimentos para animales (1) y , en   particular , su artículo 2 ,    Considerando que la Directiva antes mencionada prevé   que los controles oficiales de los alimentos para animales   dirigidos a comprobar si se respetan las condiciones   establecidas en virtud de las disposiciones legales ,   reglamentarias o administrativas relativas a la calidad y   la composición de los alimentos para animales se   efectuarán según métodos de toma de muestras y de   análisis comunitarios ;    Considerando que las Directivas n º 71/250/CEE y   n º 71/393/CEE de la Comisión , de 15 de junio de 1971   (2) y de 18 de noviembre de 1971 (3) , ha establecido ya   determinados métodos de análisis comunitarios ; que ,   habida cuenta del grado de avance de los trabajos   efectuados desde entonces , es conveniente adoptar una   tercera serie de medidas ;    Considerando que las medidas previstas en la presente   Directiva se ajustan al dictamen del Comité Permanente   de la Alimentación Animal ;    HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :    Artículo 1    Los Estados miembros dispondrán que los análisis para   los controles oficiales de los alimentos para animales , en   lo que se refiere a sus contenidos en almidón ,   proteínas brutas , proteínas brutas solubilizables   mediante la pepsina y el ácido chlorhídrico , y en   gosipol libre y total , así como la actividad de la   pepsina , se efectúen según los métodos descritos   en el Anexo I de la presente Directiva .    Se aplicarán a los métodos descritos en el Anexo I de   la presente Directiva las disposiciones generales que   figuran en la Parte 1 ( Introducción ) del Anexo de la   primera Directiva n º 71/250/CEE de la Comisión , de   15 de junio de 1971 , por la que se determinan los   métodos de análisis comunitarios para el control   oficial de los alimentos para animales .    Artículo 2    Los Estados miembros dispondrán que los análisis   para los controles oficiales de los alimentos para animales   destinados a la detección e identificación de los   antibióticos del grupo de las tetraciclinas , así como   los referidos al contenido de dichos alimentos en   clortetraciclina , oxitetraciclina , tetraciclina ,   oleandomicina , tilosina y virginiamicina , se efectúen   según los métodos descritos en el Anexo II de la   presente Directiva .    Serán aplicables a los métodos descritos en el Anexo   II de la presente Directiva las disposiciones generales que   figuran en la Parte 1 ( Introducción ) del Anexo de la   primera Directiva n º 71/250/CEE de la Comisión , de   15 de junio de 1971 , con excepción de la parte relativa a   la preparación de la muestra para análisis .    Artículo 3    Los Estados miembros aplicarán , a más tardar el 1 de   julio de 1973 , las disposiciones legales , reglamentarias o   administrativas necesarias para cumplir las disposiciones   de la presente Directiva . Informarán de ello   inmediatamente a la Comisión .    Artículo 4    Los destinatarios de la presente Directiva serán los   Estados miembros .    Hecho en Bruselas , el 27 de abril de 1972 .    Por la Comisión    El Presidente    S. L. MANSHOLT    (1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .    (2) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .    (3) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .    ANEXO I    1 . DETERMINACIÓN DEL ALMIDÓN     - Método polarimétrico -    1 . Objetivos y campo de aplicación    El método permite determinar el contenido en   almidón y en productos de degradación de alto   peso molecular del almidón de la Alimentación   Animal , excepto de aquellos que contienen peladuras ,   pulpas , hojas o cuellos secos de remolacha , pulpa   de patata , levadura deshidratada , productos ricos en   inulina ( por ejemplo , peladuras y harina de   topinambures ) o chicharrones .    2 . Principio    El método comprende una doble determinación .   En la primera , la muestra se trata en caliente   mediante ácido clorhídrico diluido . Previa   defecación y filtración , se medirá   mediante un polarímetro el poder rotatorio de la   solución .    En el segundo , la muestra se extrae mediante el   etanol al 40 % . Tras la acidificación del filtrado   por el ácido clorídrico , defecación y   filtración , se mide el poder rotatorio en las   mismas condiciones que cuando la primera determinación .    La diferencia entre los dos multiplicada por un   factor común da como resultado el contenido en   almidón de la muestra .    3 . Reactivos    3.1 . Ácido clorhídrico al 25 % ( p/p ) , d : 1,126 .    3.2 . Ácido clorhídrico al 1,128 % ( p/v ) .    La concentración debe comprobarse mediante   trituración con la ayuda de una solución de   hidróxido de sodio 0,1 N en presencia de rojo   de metilo al 0,1 % ( p/v ) en el etanol al 94 % ( v/v ) .   10 ml = 30,94 ml de NaOh 0,1 N .    3.3 . Solución de Carrez I : Disolver en el agua   21,9 g. de acetato acético glacial . Completar a 100 ml   con agua .    3.4 . Solución de Carrez II : Disolver en el agua   10,6 g. de ferrocianuro de potasio K4 [ Fe(CN)6 ] ·   3H2O . Completar a 100 ml con agua .    3.5 . Etanol al 40 % ( v/v ) , d : 0,948 a 20 ° C .    4 . Equipo    4.1 . Erlenmeyer de 250 ml de esmerilado normalizado ,   con refrigerante de reflujo .    4.2 . Polarímetro o sacarímetro .    5 . Método operatorio    5.1 . Preparación de la muestra    Triturar la muestra de forma que pase en su   totalidad a través de un tamiz de malla   redonda de 0,5 mm de diámetro .    5.2 . Determinación del poder rotatorio total   ( P o S ) ( v. observaciones 7.1 )    Pesar , con precisión de 1 mg , 2,5 g de la muestra   triturada e introducirlos en un matraz aforado de   100 ml . Añadir 25 ml de ácido clorhídrico   ( 3.2 ) , agitar para obtener un buen reparto   de la toma de muestras y añadir de nuevo   25 ml de ácido clorhídrico ( 3.2 ) . Sumergir   el matraz en un baño de agua hirviendo y ,   durante los 3 primeros minutos siguientes , agitar   enérgicamente y con regularidad para evitar la   formación de aglomerados . La cantidad de agua   del baño debe ser suficiente para permitir mantener   el baño en ebullición cuando el matraz esté   sumergido en él . Este no podrá ser retirado del   baño a lo largo de la agitación . Después de   15 minutos exactamente , retirar el matraz del baño ,   añadir a ello 30 ml de agua fría y refrigerar   inmediatamente hasta 20 ° C .    Añadir a continuación 5 ml de solución   de Carrez II ( 3.4 ) y agitar de nuevo durante un   minuto . Completar el volumen con agua , homogeneizar   y filtrar . Si el filtrado no está perfectamente   límpido ( lo que es poco frecuente ) , volver a   comenzar el análisis empleando una cantidad mayor de   las soluciones de Carrez I y II , por ejemplo 10 ml .    Medir a continuación el poder rotatorio de la   solución en un tubo de 200 mm mediante un   polarímetro o un sacarímetros .    5.3 . Determinación del poder rotatorio   ( P' o S' ) de las substancias solubles en el etanol al   40 %    Pesar , con precisión de 1 mg , 5 g de la muestra ,   introducirlos en un matraz aforado de 100 ml y   añadir 8 ml aproximadamente de etanol ( 3.5 )   ( v. observaciones 7.2 ) . Dejar el matraz en reposo   durante 1 hora a temperatura ambiente ; a lo largo   de este lapso de tiempo , proceder 5 veces a una   agitación enérgica de forma que la toma de   muestra esté bien mezclada con el etanol . Llevar   después el volumen con el etanol ( 3.5 ) ,   homogeneizar y filtrar .    Introducir mediante la pipeta 50 ml del filtrado   ( = 2,5 g de la muestra ) en un erlenmeyer de 250 ml ,   añadir 2,1 ml de ácido clorhídrico ( 3,1 ) y   agitar enérgicamente . Ajustar un refrigerante a   reflujo al erlenmeyer y sumergirlo en un baño de   agua hirviendo . Después del baño , retirar el   erlenmeyer del baño , transvasar su contenido a   un matraz aforado de 100 ml limpiando con un poco   de agua fría , y refrigerar hasta 20 ° C . Defecar   a continuación con ayuda de las soluciones de   Carrez I ( 3.3 ) y II ( 3.4 ) , completar al   volúmen con agua , homogeneizar , filtrar y   medir el poder rotatorio como se indica en 5.2 ,   párrafos segundo y tercero .    6 . Cálculo de los resultados    El contenido en almidón por ciento de la muestra   se calcula de la siguiente manera :    6.1 . Mediciones efectuadas con polarímetro    porcentaje de almidón = 2000 ( P - P' ) / [ a ]   (20 ° ,D)    P = poder rotatorio total en grados de arco    P' = poder rotatorio en grados de arco dado   para las substancias solubles en el etanol al 40 %     [ a ] (20 ° ,D) = poder rotatorio específico   del almidón puro . Los valores convencionalmente   admitidos para dicho factor son los siguientes :     + 185,9 ° : almidón de arroz     + 185,4 ° : almidón de patata     + 184,6 ° : almidón de maíz     + 182,7 ° : almidón de trigo     + 181,5 ° : almidón de cebada     + 181,3 ° : almidón de avena     + 184,0 ° : otros tipos de almidón ,   así como mezclas de almidones de los piensos   completos compuestos .    6.2 . Mediciones efectuadas mediante sacarímetro    porcentaje de almidón = 2000/ [ a ] (20 ° ,D)   · ( 2 N · 0,665 ) ( S - S' ) /100 = 26,6 N   ( S - S' ) / [ a ] (20 ° ,D)    S = poder rotatorio total en grados sacarimétricos .    S' = poder rotatorio en grados sacarimétricos dado   por las substancias solubles en el etanol al 40 % .    N = peso en g de sacarosa en 100 ml de agua dando   bajo un espesor de 200 mm un poder rotatorio de   100 ° sacarimétricos .    16,29 g para los sacarímetros franceses ,    26,00 g para los sacarímetros alemanes ,    20,00 g para los sacarímetros mixtos .     [ a ] (20 ° ,D) = poder rotatorio específico   del almidón puro ( v. 6.1 ) .    6.3 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas efectuadas sobre una misma muestra no debe   exceder del 0,4 en valor absoluto para los contenidos   en almidón inferiores al 40 % 1,1 % en valor   relativo para los contenidos en almidón iguales o   superiores al 40 % .    7 . Observaciones    7.1 . Cuando la muestra contenga más del 6 % de   los carbonatos , calculados en carbonato de calcio , éstos   deben ser destruíos mediante un tratamiento con   ayuda de una cantidad exactamente apropiada de ácido   sulfúrico diluido , antes de la determinación   del poder rotatorio total .    7.2 . En el caso de los productos de elevado contenido   en lactosa , tales como el polvo de suero láctico o   de leche descremada , proceder como sigue según la   adición de los 80 ml de etanol ( 3.5 ) . Ajustar al   matraz un refrigerante de reflujo , sumergir el matraz   durante 30 minutos en un baño de agua a 50 ° C .   Dejar a continuación refrigerar y seguir con el   análisis tal como se indica en 5.3 .    2 . DETERMINACIÓN DE LAS PROTEÍNAS BRUTAS    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar convencionalmente el   contenido en proteínas brutas de la Alimentación   Animal a partir del contenido en nitrógeno ,   determinado según Kjeldahl .    2 . Principio    La muestra se mineraliza por vía húmeda .   La solución se alcaliniza mediante una solución   de hidróxido de sodio . El amoníaco liberado se   arrastra por destilación y se recoge en una   cantidad determinada de ácido sulfúrico cuyo   exceso es titulado por una solución de   hidróxido de sodio .    3 . Reactivos    3.1 . Sulfato de potasio p.a.    3.2 . Catalizador : óxido cúprico CuO p.a. ,   o sulfato cúprico cristalizado CuSO4 · 5H2O p.a. ,   o mercurio , u óxido mercúrico HgO p.a.    3.3 . Zinc p.a. , en granulados    3.4 . Ácido sulfúrico p.a. , d : 1,84    3.5 . Ácido sulfúrico 0,1 N .    3.6 . Ácido sulfúrico 0,5 N .    3.7 . Indicador al rojo de metilo : disolver 300 mg   de rojo de metilo en 100 ml de etanol al 95-96 % ( v/v ) .    3.8 . Solución al 40 % ( p/v ) de hidróxido de   sodio .    3.9 . Solución de hidróxido de sodio 0,1 N .    3.10 . Solución de hidróxido de sodio 0,25 N .    3.11 . Solución saturada de sulfuro de sodio p.a.    3.12 . Solución al 8 % ( p/v ) de tiosulfato de   sodio , Na2S2O3 ¸ H2O p.a.    3.13 . Piedra pómez en granos , lavada con   ácido clorhídrico y calcinada .    4 . Equipo    Aparatos de mineralizar y destilar según   Kjeldahl ( v. observación 7.1 ) .    5 . Método operatorio    5.1 . Mineralización    Pesar , con precisión de 1 mg , 1 g de la   muestra e introducir la toma de muestra en el matraz del   aparato que haga de mineralizador . Añadir 10 g   de sulfato de potasio ( 3.1 ) , una cantidad   apropiada de catalizador ( 3.2 ) ( 0,3 a 0,4 g de   óxido cúprico o una gota de mercurio o 0,9 a   1,2 g de sulfato cúprico o una gota de mercurio   o 0,6 a 0,7 g de óxido mercúrico ) , 25 ml   de ácido sulfúrico ( 3.4 ) y algunos granulados   de piedra pómez ( 3.13 ) . Homogeneizar . Calentar   el matraz primero con moderación y agitando de   vez en cuando hasta carbonización de la masa   y desaparición de la espuma ; después   más intensamente hasta ebullición regular del   líquido . Evitar el recalentamiento de las paredes   y la adhesión de partículas orgánicas . Cuando   la solución aparezca límpida e incolora ( verde   claro en presencia de catalizador a base de cobre ) ,   mantener la ebullición durante 1 h más . Dejar   enfriar a continuación .    5.2 . Destilación    Añadir de 250 a 350 ml de agua , con precaución   y agitando siempre para disolver completamente   los sulfatos ; dejar refrigerar .    Añadir a continuación algunos granulados de   zinc ( 3.3 ) .    Introducir en el frasco colector del aparato de   destilar 25 ml medidos con exactitud de ácido   sulfúrico 0,1 N ( 3.5 ) o 0,5 N ( 3.6 ) , según   el contenido supuesto en nitrógeno ( v. observaciones   7.2 ) y algunas gotas del indicador en rojo de metilo   ( 3.7 ) .    Conectar el matraz al refrigerante del aparato   de destilar y sumergir la extremidad de este último   sobre una altura de 1 cm al menos en el líquido   del frasco colector ( v. observaciones 7.3 ) .   Introducir lentamente en el matraz por el embudo   de grifo 100 ml de solución al 40 % de hidróxido   de sodio ( 3.8 ) . Si se ha empleado un catalizador   a base de mercurio , introducir además en el matraz   ya sea 10 ml de solución de sulfuro de sodio   ( 3.11 ) , ya sea 25 ml de solución de   tiosulfato de sodio ( 3.12 ) .    Calentar el matraz de forma que se destilen   150 ml aproximadamente de líquido en 30 minutos .   Después de este lapso de tiempo , comprobar la   neutralidad del destilado que se desagua por medio del   papel de tornasol . Si la reacción es alcalina ,   continuar con la destilación . Detenerla cuando   el destilado aparezca neutro en el papel de tornasol .   A lo largo de la destilación , remover de vez en   cuando el contenido del frasco colector y vigilar   la coloración . Si esta vivo el amarillo , añadir   inmediatamente un volumen medido con exactitud   de ácido sulfúrico 0,1 N ( 3.5 ) o 0,5 N ( 3.6 ) .    5.3 . Titulación    Titular en el frasco corrector el exceso de   ácido sulfúrico mediante la solución de hidróxido de   sodio 0,1 N ( 3.9 ) o 0,25 N ( 3.10 ) , según la   normalidad del ácido sulfúrico empleado ,   hasta el viraje de la coloración al amarillo claro .    5.4 . Control del método    Para controlar que los activos estén exentos   de nitrógeno , efectuar una prueba en blanco   ( destilación y titulación ) , a falta de   muestra para analizar . Para controlar la exactitud   del método , efectuar el análisis ( mineralización ,   destilación y titulación ) sobre 1,5 a 2,0 g de   acetanilida p.a. ( P.F. 114 ° C ; % N : 10,36 )   en presencia de 1 g de sacarosa , exento de nitrógeno ;   1 g de acetanilida consumo 14,80 ml de ácido   sulfúrico 0,5 N .    6 . Cálculo de los resultados    Determinar el volumen de ácido sulfúrico   consumido , 1 ml de ácido sulfúrico 0,1 N   corresponde a 1,4 mg de nitrógeno . Multiplicar   la cantidad de nitrógeno por el factor 6,25 .   Expresar el resultado en porcentaje de la muestra .    Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos   determinaciones paralelas efectuadas sobre una   misma muestra no debe sobrepasar :     - 0,2 en valor absoluto para los contenidos en   proteínas brutas inferiores al 20 % .     - 1,0 % en valor relativo para los contenidos   comprendidos entre el 20 y el 40 % .     - 0,4 en valor absoluto para los contenidos   superiores al 40 % .    7 . Observaciones    7.1 . Determinados aparatos que exigen un   trasvase entre mineralización y destilación   pueden emplearse . En dichos casos , el trasvase debe   efectuarse sin pérdida .    7.2 . Para los productos pobres en materias   nitrogenadas , el volumen de ácido sulfúrico 0,1 N   que deba introducirse en el frasco , si fuera   necesario , a 10 o 15 ml y completarse a 25 ml   mediante agua .    7.3 . Si el matraz del aparato de destilar   no está provisto de un embudo de grifo , añadir   la solución de hidróxido de sodio inmediatamente   antes de conectar el matraz al refrigerante y   dejando deslizar el líquido lentamente a lo largo   de las paredes de forma que se evite que se mezcle   con la solución ácida .    3 . DETERMINACIÓN DE LAS PROTEÍNAS BRUTAS   SOLUBLES POR LA PEPSINA Y EL ÁCIDO CLORHÍDRICO    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar la fracción de   las proteínas brutas solubilizadas por la pepsina   y el ácido clorhídrico en unas condiciones determinadas .   Es aplicable a todos los alimentos .    2 . Principio    La muestra se someterá a un tratamiento de 48 h a   40 ° C por una solución clorhídrica de pepsina .   La suspensión se filtra y el contenido en   nitrógeno del filtrado se determina según el   método descrito para la determinación de las   proteínas brutas .    3 . Reactivos    3.1 . Ácido clorhídrico , d : 1,125    3.2 . Ácido clorhídrico 0,075 N .    3.3 . Pepsina a 2,0 v/mg ; dicha actividad se   define y debe controlarse según el método objeto   de la parte 4 del presente Anexo .    3.4 . Solución recien preparada de aproximadamente   0,02 % ( p/v ) de pepsina en el ácido clorhídrico   ( 3.2 ) ; actividad : 400 V/l .    3.5 . Emulsión de antiespuma ( silicona por ejemplo ) .    3.6 . Todos los reactivos indicados en el punto 3 del   método de determinación de las proteínas brutas .    4 . Equipo    4.1 . Baño de agua o estufa de incubación ,   regulada a 40 ° C más o menos 1 ° C .    4.2 . Aparatos de mineralizar y de destilar   según Kjeldahl .    5 . Método operatorio    5.1 . Puesta en solución ( v. observaciones 7.2 )    Pesar , con precisión de 1 mg , 2 g de la muestra .   Introducir la toma de muestra en un matraz aforado   de 500 ml y añadir 450 ml de solución   clorhídrica de pepsina ( 3.4 ) previamente llevada a   40 ° C . Agitar de forma que se evite la formación   de aglomerados . Comprobar que el pH de la suspensión   sea inferior a 1,7 . Llevar el matraz en el baño   de agua o la estufa de incubación ( 4.1 ) y   mantenerlo allí durante 48 h . Agitar después   8 , 24 y 32 h . Después de 48 h , añadir 15 ml   de ácido clorhídrico ( 3.1 ) , refrigerar   hasta 20 ° C , completar el volumen con agua y filtrar .    5.2 . Mineralización    Tomar 250 ml del filtrado e introducirlos en el   matraz del aparato de destilar ( 4.2 ) . Añadir   los reactivos necesarios para la mineralización   como se indica en el método de determinación de   las proteínas brutas , en la segunda frase del   punto 5.1 .    Homogeneizar y calentar hasta ebullición . Si hay   formación de espuma , añadir algunas gotas de   emulsión de antiespuma ( 3.5 ) . Mantener una ebullición   viva hasta evaporación casi completa del agua . Eliminar   los últimos residuos de agua con precaución ,   reduciendo la intensidad del calentamiento . Cuando   aparezca límpida e incolora la solución ( verde   claro en presencia de catalizador a base de cobre ) ,   continuar la ebullición durante 1 h más . Dejar   refrigerar a continuación .    5.3 . Destilación y titulación    Proceder como se indica en el método de determinación   de las proteínas brutas , puntos 5.2 y 5.3 .    5.4 . Prueba en blanco    Efectuar una prueba en blanco aplicando el método   operatorio en falta de muestra para analizar .    6 . Cálculo de los resultados    Deducir el volumen de ácido sulfúrico consumido   por la prueba en blanco del consumido por la toma   de muestra . 1 ml de ácido sulfúrico 0,1 N   corresponde a 1,4 mg de nitrógeno .    Multiplicar la cantidad de nitrógeno por el   factor 6,25 . Expresar el resultado en porcentaje de   la muestra .    Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de las dos   determinaciones paralelas efectuadas sobre una misma   muestra no debe exceder de :     - 0,4 en valor absoluto , para los contenidos   inferiores al 20 % ;     - 2,0 % , en valor relativo , para los contenidos   comprendidos entre el 20 y el 40 % ;     - 0,8 , en valor absoluto , para los contenidos   superiores al 40 % .    7 . Observaciones    7.1 . Los valores obtenidos por el presente   método no tienen relación directa con la   digestibilidad en vivo .    7.2 . Los productos cuyo contenido en materias grasas   exceda del 10 % deben ser previamente desgrasados   por extracción del éter de petróleo   ( éb. 40-60 ° C ) .    4 . DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA PEPSINA    1 . Objetivo y ámbito de aplicación    El método permite controlar la actividad de la   pepsina empleada para la determinación de las   proteínas brutas solubilizadas por la pepsina y el   ácido clorhídrico .    2 . Principio    La hemoglobina se trata en las condiciones   definidas por la pepsina en medio clorhídrico . La   fracción no hidrolizada de las proteínas y se   precipita por el ácido tricloracético . Al filtrado   se le añade hidróxido de sodio y reactivo   según Folin-Ciocalteu . La densidad ofítica de   esta solución se mide a 750 mm y la cantidad de   tirosina que corresponda se lee sobre una curva   de muestreo .    Definición : La unidad de pepsina se define como   la cantidad de dicha encima que libera por minuto ,   en las condiciones del método , una cantidad de   agrupaciones hidroxianil cuya coloración por el   reactivo según Folin-Ciocalteu tiene una densidad   óptica correspondiente a la de un mol de tirosina ,   en las mismas condiciones .    3 . Reactivos    3.1 . Ácido clorhídrico 0,2 N .    3.2 . Ácido clorhídrico 0,06 N .    3.3 . Ácido clorhídrico 0,025 N .    3.4 . Solución al 5 % ( p/v ) de ácido   tricloracético .    3.5 . Solución de hidróxido de sodio .    3.6 . Reactivo según Folin-Ciocalteu . Introducir 100 g   de tungstato de sodio ( Na2 WO4 . 2 H2O ) , 25 g de   molibdato de sodio ( Na2MO4 . 2 H2O ) y 700 ml de   agua en un matraz de fondo redondo de 2 l de   esmerilado normalizado . Añadir 50 ml de ácido   fosfórico ( d : 1,71 ) y 100 ml de ácido   clorhídrico concentrado ( d : 1,19 ) , ajustar al   matraz un refrigerante de reflujo , calentar hasta   ebullición y mantener la solución en ebullición   suave durante 10 h . Dejar refrigerar , separar el   refrigerante de reflujo , añadir 175 g de sulfato   de litio ( Li2SO4 . 2H2O ) , 50 ml de agua y   1 ml de bromo . Hacer hervir durante 15 minutos   para eliminar el exceso de bromo .    Dejar refrigerar , transvasar la solución en un   matraz aforado de 1 l , completar el volumen con   agua , homogeneizar y filtrar . No puede subsistir   coloración verduzca . Antes de su empleo ,   diluir 1 volumen del reactivo por dos volúmenes de agua .    3.7 . Solución de hemoglobina : Pesar una cantidad   de hemoglobina , sustrato proteíco según   Anson ( 2 g aproximadamente ) correspondiente   a 354 mg de nitrógeno (1) e introducirla en un   matraz de 200 ml de esmerilado normalizado . Añadir   algunos ml de ácido clorhídrico ( 3.2 ) ,   conectar el matraz a la bomba de vacío y agitar hasta   disolución completa de hemoglobina . Cortar el   vacío y añadir agitando constantemente el ácido   clorhídrico ( 3.2 ) para completar a 100 ml .   Preparar inmediatamente antes de su empleo .    3.8 . Solución patrón de tirosina : Disolver 181,2 mg   de tirosina en el ácido clorhídrico ( 3.1 ) y   completar a 1 l con el mismo ácido ( solución   madre ) . Tomar 20,0 ml y diluir a 100 ml mediante   ácido clorhídrico ( 3.1 ) 1 ml de dicha   solución contiene 0,2 mmoles de tirosina .    4 . Equipo    4.1 . Baño de agua , regulado a 25 ° C más o   menos 0,1 ° C por el ultratermostato .    4.2 . Espectofotómetro .    4.3 . Cronómetro , precisión : 1 segundo .    4.4 . pH-metro .    5 . Método operatorio    5.1 . Preparación de la solución ( v.   observaciones 7.1 )    Disolver 150 mg de pepsina en 100 ml de ácido   clorhídrico ( 3.2 ) . Tomar mediante la pipeta 2 ml de   la solución , introducirlos en un matraz aforado   de 50 ml y completar al volumen mediante ácido   clorhídrico ( 3.3 ) . El pH , controlado por el pH metro ,   debe ser de 1,6 más o menos 0,1 . Sumergir el   matraz en el baño de agua .    5.2 . Hidrólisis    Introducir mediante la pipeta en un tubo de   ensayo 5,0 ml de solución de hemoglobina ( 3.7 ) ,   llevar a 25 ° C en el baño de agua ( 4.1 ) ,   añadir 1,0 ml de la solución de pepsina obtenida   en 5.1 y mezclar con ayuda de una varilla de cristal ,   espesada en una extremidad , mediante aproximadamente   10 movimientos de vaivén . Mantener el tubo de   ensayo en el baño de agua a 25 ° C durante 10 minutos   exactamente , contados desde el momento de la adición   de la solución de pepsina ( la duración y la   temperatura deben ser perfectamente respetadas ) .   Añadir a continuación 10,0 ml de solución de   ácido tricloracético ( 3.4 ) , previamente   llevada a 25 ° C , homogeneizar y filtrar sobre un   filtro seco .    5.3 . Desarrollo de la coloración y medición   de la densidad óptica    Tomar mediante la pipeta 5,0 ml del filtrado ,   introducirlos en un erlenmeyer de 50 ml , añadir 10,0 ml   de solución de hidrócido de sodio ( 3.5 ) y ,   agitando constantemente , 3,0 ml de reactivo diluido   de Folin-Ciocalteu ( 3.6 ) . Tras 5 a 10 minutos ,   determinar la densidad óptica de la solución al   espectofotómetro de 750 mm en las cubetas de 1 cm de   espesor , en comparación con el agua .    5.4 . Prueba en blanco    Para cada determinación , proceder a una prueba   en blanco tal como se indica a continuación .    Introducir mediante la pipeta en un tubo de   ensayo 5,0 ml de solución de hemoglobina ( 3.7 ) ,   llevar a 25 ° C en el baño de agua ( 4.1 ) ,   añadir 10,0 ml de solución de ácido   tricloracético ( 3.4 ) previamente llevado a 25 ° C ,   homogeneizar y añadir a continuación 1,0 ml de la   solución de pepsina obtenida en 5.1 . Mezclar con   la ayuda de una varilla de cristal y mantener el tubo   de ensayo 10 minutos exactamente en el baño de   agua ( 4.1 ) a 25 ° C . Homogeneizar y filtrar sobre   un filtro seco . Continuar el método operativo   tal como se indica en 5.3 .    5.5 . Curva de calibrado    Introducir en los erlenmeyers de 50 ml volúmenes   de 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 y 5,0 ml de solución   patrón de tirosina ( 3.8 ) , correspondientes   respectivamente a unas cantidades de tirosina   de 0,2 ; 0,4 ; 0,6 ; 0,8 y 1,0 mmoles . Completar la   serie mediante un testigo exento de tirosina . Llevar   los volúmenes a 5,0 ml con la ayuda de ácido   clorhídrico ( 3.1 ) . Añadir 10,0 ml de solución   de hidróxido de sodio ( 3.5 ) y , agitando constantemente ,   3,0 ml del reactivo diluido de Folin-Ciocalteu ( 3.6 ) .   Medir la densidad óptica tal como se indica en la   última frase del punto 5.3 . Trazar la curva de   calibrado llevando las densidades ópticas en relación   con las cantidades de tirosina .    6 . Cálculo de los resultados    Leer sobre la curva de calibrado la cantidad de   tirosina , en mmol , correspondiente a la densidad   óptica de la solución coloreada , corregida de la   prueba en blanco .    La actividad de la pepsina , en mmol de tirosina ,   por mg y por minuto , a 25 ° C , está dada por la   fórmula .    Unidades por mg ( V/mg ) = 0,32 a/P    en la que :    a - cantidad de tirosina , en mmol , leída sobre   la curva de calibrado ;    b - peso en mg de la cantidad de pepsina añadida   en 5.2 .    7 . Observaciones    7.1 . La cantidad de pepsina que haya de ponerse en   solución debe ser escogida de forma que se pueda   obtener , cuando la medida fotométrica final ,   una densidad óptica de 0,35 más o menos 0,035 .    7.2 . Dos unidades por mg obtenidas por el presente   método corresponden a : 3,64 unidades millonésimas   Anson/mg ( mmol de tirosina/mg ) min a 35,5 ° C ) .    5 . DETERMINACIÓN DEL GOSSIPOL LIBRE Y TOTAL    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar el gossipol libre ,   el gossipol total y las substancias químicamente   presentes en las semillas , harinas y tortas de   algodón así como en los alimentos compuestos que   los contengan . El límite inferior de la determinación   es de 20 ppm .    2 . Principio    El gossipol se extrae en presencia de 3-amino-l-propanol ,   ya sea mediante una mezcla de iso-propanol y de hexano   para la determinación del gossipol libre , y sea por   la dimetilformamida para la determinación del gossipol   total . El gossipol se transforma mediante anilina en   gossipol-dianilina , cuya densidad óptica se mide   a 440 nm .    3 . Reactivos    3.1 . Mezcla isopropanol-lexano : mezclar 60 partes en   volumen de isopropanol p.a. con 40 partes en volumen   de lexano normal .    3.2 . Disolvente A : Situar en un matraz aforado   de 1 l , 500 ml aproximadamente de la mezcla de   isopropanollexano ( 3.1 ) , 2 ml de 3-amino-l-propanol ,   8 ml de ácido acético glacial y 50 ml de agua .   Completar al volumen mediante la mezcla de   isopropanol-lexano ( 3.1 ) . Dicho reactivo es estable   durante una semana .    3.3 . Disolvente B : Situar mediante la pipeta en un   matraz aforado de 100 ml , 2 ml de 3-amino-l-propanol y   10 ml de ácido acético glacial . Refrigerar a la   temperatura ambiente y completar al volumen mediante   la N , N-dimetilformamida . Dicho reactivo es estable   durante una semana .    3.4 . Anilina p.a. : si la densidad óptica de la   prueba en blanco excede de 0,022 destilar la anilina sobre   polvo de cinc eliminando las fracciones primera y   última del 10 % destilado . Este reactivo en frasco   tapado de cristal pardo y en el refrigerador , se   conserva varios meses .    3.5 . Solución patrón A de gossipol : Colocar en   un matraz aforado de 250 ml , 27,9 mg de aceite de   gossipol . Disolver y completar al volumen por el   disolvente A ( 3.2 ) . Introducir mediante la pipeta   50 ml de dicha solución en un matraz aforado de 250 ml y   completar al volumen por el disolvente A . La   concentración en gossipol de dicha solución es   de 0,02 mg/ml . Dejar reposar durante 1 h a la   temperatura ambiente , antes de su empleo .    3.6 . Solución patrón B de gossipol : Colocar en   un matraz aforado de 50 ml , 27,9 mg de acetato de   gossipol . Disolver y completar el volumen mediante   el disolvente B ( 3.3 ) . La concentración en   gossipol de dicha solución es de 0,5 mg/ml .    Conservados al resguardo de la luz las soluciones   patrón A y B de gossipol se mantienen estables   durante 24 h .    4 . Equipo    4.1 . Mezclador ( balancín ) : alrededor de   35 revoluciones por minuto .    4.2 . Espectofotómetro .    5 . Método operatorio    5.1 . Toma de muestras    La toma de muestras en relación con el supuesto   contenido en gossipol de la muestra . Es preferible   operar sobre una pequeña toma de muestras y sobre   una parte alícuota del filtrado relativamente importante ,   de forma que se obtenga una cantidad de gossipol suficiente   para efectuar una medición fotométrica precisa .   Para la determinación del gossipol libre en las semillas ,   las harinas y la torta de algosón , la toma de   muestras no debe exceder de 1 g ; para los piensos   completos compuestos podrá alcanzar los 5 g . Una   parte alícuota de 10 ml de filtrado es conveniente en   la mayoría de los casos ; deberá contener de 50 a   100 mg de gossipol . Para la determinación del   gossipol total , la toma de muestras podrá variar   de 0,5 a 5 g con el fin de que una parte alícuota   de 2 ml de filtrado contenga de 40 a 200 mg de gossipol .    El análisis debe efectuarse a una temperatura   ambiente cercana a los 20 ° C .    5.2 . Determinación del gossipol libre    Introducir la toma de muestras en un matraz de   cuello esmerilado de 250 ml , cuyo fondo esté recubierto   de cristal pulverizado . Añadir con la pipeta   50 ml de disolvente A ( 3.2 ) , tapar el matraz y   mezclar durante 1 h en el balancín . Filtrar en seco   y recoger el filtrado en un pequeño matraz de cuello   esmerilado . A lo largo de la filtración , recubrir   el embudo con un cristal de reloj . Introducir con la   pipeta respectivamente en dos matraces aforados   de 25 ml ( A y B ) unas partes alícuotas idénticas   de filtrado que contengan de 50 a 100 mg de gossipol .   Completar si fuera necesario , el volumen a 10 ml con la   ayuda del disolvente A ( 3.2 ) . Completar seguidamente   al volumen el contenido del matraz ( A ) mediante la   mezcla isopropanol-hexano ( 3.1 ) . Dicha solución   se empleará como solución de referencia para la   medición de la solución de la muestra .    Introducir con la pipeta 10 ml del disolvente A ( 3.2 )   respectivamente en otros dos matraces aforados de   5 ml ( C y D ) . Completar al volumen el contenido del   matraz ( C ) mediante la mezcla isopropanol-hexano ( 3.1 ) .   Dicha solución se empleará como solución de   referencia para la medición de la solución de la   prueba en blanco .    Añadir 2 ml de anilina ( 3.4 ) respectivamente en   los matraces ( D ) y ( B ) . Calentar durante 30 minutos   sobre un baño de agua hirviendo para desarrollar la   coloración . Refrigerar a la temperatura ambiente ,   completar al volumen mediante la mezcla isopropanol-hexano   ( 3.1 ) , homogeneizar y dejar reposar durante 1 h .    Determinar mediante el espectómetro a 440 nm ,   en las cubetas de cristal de 1 cm , la densidad   óptica de la solución de la prueba en blanco ( D )   en comparación con la solución de referencia ( C )   y la densidad óptica de la solución de la muestra ( B )   en comparación con la solución de referencia ( A ) .    Sustraer la densidad óptica de la solución de   prueba en blanco de la solución de la muestra   ( = densidad óptica corregida ) . Calcular a partir   de dicho valor el contenido en gossipol libre tal como   se indica en 6 .    5.3 . Determinación del gossipol total    Introducir una toma de muestras que contenga de 1 a 5 mg   de gossipol en un matraz aforado de 50 ml y añadir   10 ml de disolvente B ( 3.3 ) . Preparar simultáneamente   una prueba en blanco introduciendo 10 ml de disolvente B   ( 3.3 ) , en otro matraz aforado de 50 ml . Calentar   ambos matraces durante 30 minutos sobre un baño de   agua hirviendo . Refrigerar a la temperatura ambiente   y completar el contenido de cada matraz al volumen por   la mezcla isopropanol-hexano ( 3.1 ) . Homogeneizar y   dejar reposar durante 10 a 15 minutos , filtrar a   continuación y recoger los filtrados en matraces de   cuello esmerilado .    Llevar mediante la pipeta 2 ml del filtrado de la   muestra respectivamente a dos matraces aforados de   25 ml y 2 ml del filtrado de la prueba en blanco   respectivamente a otros dos matraces de 25 ml . Tomar   un matraz de cada serie y completar los contenidos   respectivos a 25 ml mediante la mezcla isopropanol-hexano   ( 3.1 ) . Estas soluciones se emplearán como   soluciones de referencia .    Añadir 2 ml de anilina ( 3.4 ) respectivamente en   los otros dos matraces . Calentar durante 30 minutos   sobre baño de agua hirviendo para desarrollar la   coloración . Refrigerar a la temperatura ambiente ,   completar a 25 ml mediante la mezcla de isopropanol-hexano   ( 3.1 ) , homogeneizar y dejar reposar durante 1 h .    Determinar la densidad óptica tal como se indica   en 5.2 para el gossipol libre . Calcular a partir de   dicho valor el contenido en gossipol total como se   indica en 6 .    6 . Cálculo de los resultados    El cálculo de los resultados puede hacerse ya sea   a partir de la densidad óptica específica ( 6.1 ) ,   ya sea refiriéndose a una curva de calibrado ( 6.2 ) .    6.1 . A partir de la densidad óptica específica    En las condiciones descritas , las densidades ópticas   específicas son las siguientes :    gossipol libre : E (1 % ,1 cm) = 625    gossipol total : E (1 % ,1 cm) = 600    El contenido en gossipol libre o total de la   muestra está dado por la siguiente fórmula :    gossipol % = E · 1250/E (1 % ,1 cm) · p · a    en la que :   E = densidad óptica corregida , determinada como   se indica en 5.2 ,    p = toma de muestras en g ,    a - parte alícuota del filtrado en ml .    6.2 . A partir de una curva de calibrado    6.2.1 . Gossipol libre    Preparar 2 series de 5 matraces aforados de 25 ml .   En cada serie , introducir mediante la pipeta en los   matraces unos volúmenes respectivos de 2,0 - 4,0 - 6,0 -   8,0 y 10,0 ml de la solución patrón A de gossipol   ( 3.5 ) . Completar cada serie mediante un testigo   constituído por un matraz aforado de 25 ml que contenga   únicamente 10 ml de disolvente A ( 3.2 ) .    Completar a 25 ml el volumen de los matraces de la   primera serie ( incluido el testigo ) mediante la   mezcla isopropanol-hexano ( 3.1 ) ( serie de referencia ) .    Añadir 2 ml de anilina ( 3.4 ) en cada matraz   de la segunda serie ( incluyendo el testigo ) . Calentar   durante 30 minutos sobre un baño de agua hirviendo   para desarrollar la coloración . Refrigerar a la   temperatura ambiente , completar al volumen mediante   la mezcla isopropanol-hexano ( 3.1 ) , homogeneizar y   dejar reposar durante 1 h ( serie patrón ) .    Determinar en las condiciones indicadas en 5.2 la   densidad óptica de las soluciones de la serie   patrón en comparación con las soluciones correspondientes   de la serie de referencia . Trazar gráficamente la curva   curva de calibrado poniendo las densidades ópticas en   relación con las cantidades de gossipol ( en mg ) .    6.2.2 . Gossipol total    Preparar 6 matraces aforados de 50 ml . Introducir   en el primer matraz 10 ml de disolvente B ( 3.3 ) y   en los otros , respectivamente 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 y   10,0 ml de la solución etalón B de gossipol ( 3.6 ) .   Completar el contenido de cada matraz de 10 ml con la   ayuda del disolvente B ( 3.3 ) . Calentar durante 30 minutos   sobre un baño de agua hirviendo . Refrigerar a la   temperatura ambiente , completar al volumen mediante   la mezcla isopropanol-hexano ( 3.1 ) y homogeneizar .    Introducir 2,0 ml de dichas soluciones respectivamente   en dos series de 6 matraces aforados de 25 ml . Completar   a 25 ml el contenido de los matraces de la primera   serie mediante la mezcla de isopropanol-hexano ( 3.1 )   ( serie de referencia ) .    Añadir 2 ml de anilina ( 3.4 ) en cada matraz   de la segunda serie . Calentar durante 30 minutos sobre   un baño de agua hirviendo . Refrigerar a la temperatura   ambiente , completar al volumen mediante la mezcla   isopropanol-hexano ( 3.1 ) , homogeneizar y dejar   reposar durante 1 h ( serie patrón ) .    Determinar en las condiciones indicadas en 5.2 la   densidad óptica de las soluciones de la serie patrón   en comparación con las soluciones correspondientes de   la serie de referencia . Trazar gráficamente la   curva de calibrado poniendo las densidades ópticas   en relación con las cantidades de gossipol ( en mg ) .    6.3 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas efectuadas sobre una misma muestra no debe   exceder :     - del 15 % , en valor relativo , para los contenidos   en gossipol inferiores a 500 ppm ,     - de 75 ppm , en valor absoluto , para los contenidos   comprendidos entre 500 y 750 ppm ,     - del 10 % , en valor relativo , para los contenidos   superiores a 750 ppm .    (1) Determinar el contenido en nitrógeno mediante   un semi-microkjeldahl ( contenido teórico : 17,7 % de   nitrógeno ) .    ANEXO II    1 . DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS   ANTIBIÓTICOS DEL GRUPO DE LAS TETRACICLINAS    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite descubrir e identificar los   antibióticos del grupo de las tetraciclinas en los   alimentos que contengan al menos 0,1 ppm de ella ,   los concentrados y las premezclas .    2 . Principio    La muestra está sometida a la extracción   mediante una mezcla de metanol y de ácido clorhídrico .   El extracto se cromatografía sobre papel por vía   ascendente comparativamente a unas soluciones   de referencia . Los antibióticos se descubren   e identifican en comparación con sus valores Rf con   los de las substancias patrón , y sea por   fluorescencia de luz UV ( elevados contenidos en   antibióticos ) , ya sea por bioautografía   sobre medio de gelosa inoculado con B. cereus .    3 . Reactivos y medio de cultivo    3.1 . Tampón , pH 3,5    Ácido cítrico monohidratado p.a. * 10,256 g *    Fosfato disódico NA2HPO4 2H2O p.a. * 7,45 g *    Acetona p.a. * 300 ml *    Agua destilada ad * 1 000 ml *    3.2 . Tampón fosfato , pH 5,5    Fosfato monopotásico KH2PO4 p.a. * 130,86 g *    Fosfato disódico Na2HPO4 · 2H2O * 6,947 g *    Agua destilada ad * 1 000 ml *    3.3 . Eluyente I : Mezcla nitrometano puro/cloroforma   puro a-dicloricina : 20/10/1,5 en volumen .   Preparar en el momento de su empleo .    3.4 . Eluyente II : Mezcla nitrometano puro/cloroformo   puro a-picolino : 20/10/3 en volumen . Preparar   en el momento de su empleo .    3.5 . Mezcla matanol puro/ácido clorhídrico   ( d : 1,19 ) : 98/2 en volumen .    3.6 . Ácido clorhídrico 0,1 N .    3.7 . Amoníaco , d : 0,91 .    3.8 . Substancias patrón : clortetraciclina ,   oxitetraciclina , tetraciclina cuya actividad se   expresa en clorhidrato .    140363.9.Microorganismo : B. cereus ATCC n º 11.778    Mantenimiento de la cepa , preparación de la   suspensión de esporas e inoculación del medio de   cultivo : aplicar las disposiciones 3.1 y 3.2 del   método de determinación de la clortetraciclina ,   de la oxitetraciclina y de la tetraciclina , por   difusión sobre gelosa , objeto de la parte 2 del   presente Anexo .    3.10 . Medio de cultivo (1)    Glucosa * 1 g *    Peptona tripsica * 10 g *    Extracto de carne * 1,5 g *    Extracto de levadura * 3 g *    Gelosa * 20 g *    Agua destilada ad * 1 000 ml *    Ajustar el pH a 5,8 en el momento de su empleo .    3.11 . Solución al 0,1 % ( p/v ) de cloruro   de 2,3,5-tripeniltetrazolio y el 5 % ( p/v ) de glucosa .    4. Equipo    4.1 . Equipo para cromatrografía ascendente sobre   papel ( altura del papel : 25 cm ) .   Papeles Schleicher y Schuell 2040 b o 2043 b , o   equivalentes .    4.2 . Centrifugadora .    4.3 . Estufa de incubación , regulada a 30 ° C .    4.4 . Lámpara UV para detección de la fluorescencia .    4.5 . Placas de vídrio de 20 por 30 cm aproximadamente ,   que permitan el montaje de una caja plana para   la bioautografía .    5 . Soluciones de calibrado    5.1 . Soluciones-madre    Preparar , a partir de las substancias de calibrado   ( 3.8 ) y con ayuda de ácido clorhídrico ( 3.6 ) ,   unas soluciones cuya concentración corresponda   respectivamente a 500 mg de clortetraciclina-HCl de   oxitetraciclina-HCl y de tetraciclina-HCl por ml .    5.2 . Soluciones de referencia para la detección   en luz UV    Diluir las soluciones ( 5.1 ) por el tampón de   fosfato ( 3.2 ) para obtener unas soluciones cuya   concentración corresponda a 100 mg de   clortetraciclina-HCl de oxitetraciclina-HCl y de   tetraciclina-HCl por ml .    5.3 . Soluciones de referencia para la detección   por bioautografía    Diluir las soluciones ( 5.1 ) por el tampón   fosfato ( 3.2 ) para obtener unas soluciones cuya   concentración corresponda a 5 mg de   clortetraciclina-HCl , de oxitetraciclina-HCl y   de tetraciclina-HCl por ml .    6 . Extracción    Cuando el contenido supuesto de antibiótico sea   inferior a 10 ppm , se podrá emplear o la   muestra homogeneizada , o la fracción más fina   separada mediante tamizado , dado que los   antibióticos se encontrarán preferentemente en   dicha fracción .    Poner la muestra en suspensión en la mezcla   ( 3.5 ) y centrifugar . Recoger el líquido   sobrenadante para emplearlo tal como esté o diluirlo ,   si fuera necesario , por medio de la mezcla ( 3.5 ) ,   para obtener unas concentraciones en antibiótico   de 100 mg ( 6.1 ) y de 5 mg ( 6.2 ) aproximadamente por ml .    7 . Detección de identificación    7.1 . Cromatografía    Sumergir el papel en la solución tampón ,   pH 3,5 ( 3.1 ) . Eliminar el exceso de líquido   comprimiendo el papel entre unas hojas de papel de filtro   seco . Depositar a continuación sobre el papel unos   volúmenes de 0,01 ml de las soluciones de referencia   ( 5.2 y 5.3 ) y del extracto ( 6.1 y 6.2 ) . Para   obtener una buena separación , el contenido apropiado   en humedad del papel es determinante ; en su caso ,   dejar secar ligeramente .    Revelar por cromatografía ascendente . Emplear el   aluyente ( 3.3 ) para la detección por bioautografía ,   el eluyente II ( 3.4 ) para la detección en luz UV .   Cuando el frente del disolvente alcance de 15 a 20 cm   de alto ( aproximadamente 1 h 30 ) , interrumpir   la cromatografía y secar el papel .    7.2 . Detección en luz UV    Cuando el contenido en antibiótico sea superior a   1 mg/cm2 , se pueden percibir manchas fluorescentes   amarillo o por irradiación bajo la lámpara UV   ( 4.4 ) previo tratamiento del cromatograma mediante   vapores amoniacales ( 3.7 ) .    7.3 . Detección por bioautografía    Verter el medio de cultivo ( 3.10 ) , previamente   inoculado por B cereus ( 3.9 ) , sobre unas placas de   vidrio ( 4.5 ) y colocar el papel sobre el medio   de cultivo . Tras 5 minutos de contacto , apartar el   papel y colocarlo sobre un lugar distinto del medio de   cultivo , donde se le mantendrá durante el período   de inoculación . Incubar durante una noche en la estufa   a 30 ° C . La presencia de un antibiótico del   grupo de las tetraciclinas se marca por zonas de   inhibición claras en el medio de cultivo turbio .    Para fijar el cromatograma , vaporizar la solución   ( 3.11 ) sobre el papel , previa incubación .    7.4 . Identificación    Los valores Rf relativos de los antibióticos del   grupo de las tetraciclinas se dan a continuación .   Dichos valores podrán variar ligeramente según la   calidad del papel y su contenido en humedad .    Clortetraciclina ( CTC ) 0,60    Tetraciclina ( TC ) 0,40    Oxitetraciclina ( OTC ) 0,20    4-epi-CTC 0,15    4-epi-TC 0,13    4-epi-OTC 0,10    Los compuestos « epi » tienen una actividad   antibiótica inferior a la de los compuestos normales .    2 . DETERMINACIÓN DE LA CLORTETRACICLINA , DE LA   OXITETRACICLINA Y DE LA TETRACICLINA    A . POR DIFUSIÓN SOBRE GELOSA    1 . Objetivo y ámbito de aplicación    El método permite determinar la cortetraciclina   ( CTC ) , la oxitetraciclina ( OTC ) y la   tetraciclina ( TC ) en los alimentos , los concentrados   y las premezclas . El límite inferior de la   determinación es de 5 ppm . Los contenidos inferiores   a 5 ppm pueden estimarse por interpolación gráfica .    2 . Principio    Para los contenidos iguales o inferiores a 50 ppm ,   la muestra estará sometida a la extracción por la   formamida diluida . Para los contenidos superiores a   50 ppm , se somete a extracción mediante una   mezcla de acetona , de agua y de ácido clorhídrico   para la determinación de la CTC y por una mezcla   de metanol y de ácido clorhídrico para la   determinación del UTC y de la TC .    Los extractos se diluirán a continuación y su   actividad antibiótica se determinará por la   medición de la difusión de la CTC , de la OTC y   de la TC en un medio gelosificado inseminado con B.   cereus . La difusión se indica por la formación   de zonas de inhibición en presencia del microorganismo .   El diámetro de dichas zonas es directamente proporcional   al logaritmo de la concentración del antibiótico .    3 . Microorganismo : B. cereus ATCC n º 11.778    3.1 . Mantenimiento de la cepa    Inocular B cereus sobre gelosa inclinada en tubo   constituído por el medio de cultivo ( 4.1 ) , exento   de azul de metileno y de ácido bórico . Incubar   durante una noche a 30 ° C aproximadamente .   Conservar el cultivo en refrigerador y repicar   cada 14 días sobre gelosa inclinada .    3.2 . Preparación de la suspensión de esporas    Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa inclinada   ( 3.1 ) con ayuda de 2 a 3 ml de suero fisiológico   ( 4.5 ) . Inseminar con dicha suspensión un frasco   de Roux que contenga 300 ml del medio de cultivo   ( 4.1 ) , exento de azul de metileno y de ácido   bórico , cuya concentración en gelosa es del   3 al 4 % . Incubar 3 a 5 días a 28-30 ° C , recoger   a continuación las esporas en 15 ml de etanol   ( 4.6 ) , tras haber comprobado la esporulación   bajo el microscopio , y homogeneizar . Dicha suspensión   puede conservarse en refrigerador durante 5 meses al menos .    Por unos ensayos preliminares sobre placas con el medio   de base de la determinación ( 4.1 ) , determinar   la cantidad de inóculo que permita obtener para las   diferentes concentraciones de antibiótico empleadas ,   unas zonas de inhibición tan extendidas como sea posible   y que estén además claras . Dicha cantidad es   generalmente de 0,2 a 0,3 ml/1 000 ml . La inoculación   del medio de cultivo se hace entre 50 y 60 ° C .    4 . Medios de cultivo y reactivos    4.1 . Medio de base de la determinación (2)    Glucosa 1 g    Peptone tripsica 10 g    Extracto de carne 1,4 g    Extracto de levadura 3 g    Gelosa , según la cantidad 10 a 20 g    Tween 80 1 ml    Tampón fosfato , pH 5,5 ( 4.2 ) 10 ml    Solución al 5 % ( p/v ) de ácido bórico 15 ml    Solución etanólica al 0,5 % de azul de   metileno 4 ml    Agua destilada ad 1 000 ml    Ajustas a pH 5,8 antes del empleo    4.2 . Tampón fosfato , pH 5,5    Fosfato monopotásico KH2PO4 p.a. 130,86 g    Fosfato disódico Na2HPO4 · 2H2O p.a. 6,947 g    Agua destilada ad 1 000 ml    4.3 . Tampón fosfato , pH 5,5 diluido a 1/10 .    4.4 . Tampón fosfato , pH 8    Fosfato monopotásico KH2PO4 p.a. 1,407 g    Fosfato disódico Na2HPO4 · 2H4O p.a. 57,559 g    Agua destilada ad 1 000 ml    4.5 . Suero fisiológico estéril    4.6 . Etanol al 20 % ( v/v ) .    4.7 . Acido clorhídrico 0,1 N .    4.8 . Formamida al 70 % ( v/v ) : preparar en   fresco antes del empleo y ajustar el pH 4,5 con ayuda   de ácido sulfúrico 2 N aproximadamente .    4.9 . Mezcla acetona pura/agua/ácido clorhídrico   ( d : 1,19 ) : 65/33/2 en volumen .    4.10 . Mezcla metanol puro/ácido clorhídrico   ( d : 1,19 ) : 98/2 en volumen .    4.11 . Substancias de calibrado : CTC , OTC ,   TC cuya actividad se expresa en clorhidrato .    5 . Soluciones de calibrado    5.1 . Clortetraciclina    Preparar , a partir de la substancia de calibrado   ( 4.11 ) y con la ayuda de ácido clorhídrico   ( 4.7 ) , una solución madre cuya concentración   corresponda a 500 mg de clortetraciclina-HCl por ml .   Dicha solución se conserva una semana en refrigerador .    A partir de dicha solución madre , preparar una   solución de calibrado de trabajo S8 cuya   concentración corresponda a 0,2 mg de   clortetraciclina-HCl por ml . La dilución se hace   con la ayuda del tampón fosfato , pH 5,5 diluido   a 1/10 ( 4.3 ) , con adición del 0,01 % de negro   amido (3) .    Preparar a continuación por sucesivas diluciones   ( 1 + 1 ) con ayuda del tampón ( 4.3 ) , las   concentraciones siguientes :    S4 0,1 mg/ml    S2 0,05 mg/ml    S1 0,025 mg/ml    5.2 . Oxitetraciclina    Procediendo como se indica en 5.1 , preparar ,   a partir de una solución madre cuya concentración   corresponde a 400 mg de oxitetraciclina-HCl por   milímetro , una solución madre de trabajo S8   de 1,6 mg de oxitetraciclina-HCl por ml y las   concentraciones siguientes :    S4 0,8 mg/ml    S2 0,4 mg/ml    S1 0,2 mg/ml    5.3 . Tetraciclina    Procedimiento tal como se indica en 5.1 , preparar ,   a partir de una solución madre cuya concentración   corresponda a 500 mg de tetraciclina-HCl por ml ,   una solución de calibrado de trabajo S8 de   1,0 mg de tetraciclina-HCl por ml y las siguientes   concentraciones    S4 0,5 mg/ml    S2 0,25 mg/ml    S1 0,125 mg/ml    6 . Extracción    6.1 . Contenidos iguales o inferiores a 50 ppm    Tratar la toma de muestras por la formamida   ( 4.8 ) , según las indicaciones que se den a   continuación en el cuadro . Agitar durante 30 minutos   sobre mesa de sacudidas . Diluir inmediatamente   después con ayuda del tampón fosfato ( 4.3 ) ,   según las indicaciones dadas a continuación en   el cuadro , para obtener la concentración U8 . La   concentración en formamida de dicha solución no debe   exceder del 40 % . Centrifugar o dejar decantar de   manera que se obtenga una solución límpida .    Preparar a continuación las concentraciones U4 ,   U2 y U1 , por diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con   ayuda del tampón fosfato ( 4.3 ) .    Antibiótico * CTC * OTC * TC *    Contenido supuesto en ppm * 10 * 50 * 10 * 50 *   10 * 50 *    Toma de muestras en g * 10 * 10 * 24 * 9,6 * 20 * 10 *    ml de formamida ( 4.8 ) * 100 * 100 * 80 * 100 *   80 * 100 *    ml de tampón fosfato ( 4.3 ) * dil. 1 : 5 (a) *   dil. 1 : 25 (b) * 70 * 200 * 120 * dil. 1 : 5 (a) *    Concentración U8 en mg/ml * 0,2 * 0,2 * 1,6 *   1,6 * 1,0 * 1,0 *    (a) Tomar 20 ml de extracto y completar a 100 ml por   el tampón en un matraz aforado .    (b) Tomar 4 ml de extracto y completar a 100 ml   por el tampón en un matraz aforado .    6.2 . Contenidos superiores a 50 ppm    6.2.1 . Clortetraciclina    Tratar , según el contenido supuesto en antibiótico   de la muestra o su garantía de fabricación , una   toma de muestras de 1 a 10 g por 20 veces su volumen   de mezcla ( 4.9 ) . Agitar durante 30 minutos sobre   mesa de sacudidas . Comprobar que el pH permanece   por debajo de 3 a lo largo de la extracción ; si   fuera necesario , ajustar a pH 3 ( para los compuestos   minerales , con ayuda de ácido acético al 10 % ) .   Tomar una parte alícuota del extracto y ajustar el   pH a 5,5 con ayuda del tampón fosfato , pH 8 ( 4.4 )   en presencia del verde de bromocresil ( viraje del   amarillo al azul ) . Diluir con ayuda del tampón   fosfato , pH 5,5 diluido a 1/10 ( 4.3 ) para obtener   la concentración U6 ( v. 6.1 ) .    Preparar seguidamente las concentraciones U4 ,   U2 y U1 por diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con   ayuda del tampón fosfato ( 4.3 ) .    6.2.2 . Oxitetraciclina y tetraciclina    Proceder como se indica en 6.2.1 sustituyendo la   mezcla ( 4.9 ) por la mezcla ( 4.10 ) .    7. Modalidades de la determinación    7.1 . Inoculación del medio de cultivo    Inocular a 50-60 ° C el medio de base de la   determinación ( 4.1 ) por la suspensión de esporas   ( 3.2 ) .    7.2 . Preparación de las cajas    La difusión sobre gelosa se efectúa en cajas con   las 4 concentraciones de la solución de calibrado   ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las cuatro concentraciones   del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja debe   recibir necesariamente las 4 concentraciones de   calibrado y del extracto .    Con tal fin , escoger las dimensiones de las cajas   de tal forma que se puedan practicar en el medio   gelosificado al menos 8 cavidades de 10 a 13 mm de   diámetro . Calcular la cantidad de medio de   cultivo inoculado ( 7.1 ) que habrá de utilizarse   de forma que se pueda obtener un recubrimiento   uniforme de 2 mm aproximadamente de espesor . Es   preferible emplear como cajas unas placas de   vidrio planas provistas de un anillo de aluminio o de   material plástico perfectamente plano de 200 mm de   diámetro y 20 mm de altura .    Introducir mediante la pipeta en las cavidades   unas cantidades exactamente medidas de solución de   antibiótico comprendidas entre 0,10 y 0,15 ml ,   según el diámetro .    Para cada muestra , hacer al menos 4 repeticiones   de difusión con cada concentración de forma que   cada determinación sea objeto de una evaluación   de 32 zonas de inhibición .    7.3 . Incubación    Incubar las cajas durante 18 h aproximadamente a   28-30 ° C .    8 . Evaluación    Medir el diámetro de las zonas de inhibición ,   preferentemente por proyección . Inscribir las   mediciones sobre papel semilogarítmico llevando   el logaritmo de las concentraciones en relación con los   diámetros de las zonas de inhibición . Trazar las   rectas de la solución de calibrado y del extracto . A   falta de interferencias , las dos rectas deberán ser   paralelas .    El logaritmo de la actividad relativa se calcula   por la siguiente fórmula :     ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) · 0,602 ) /   ( U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2 )    Actividad real = actividad supuesta por actividad   relativa    9 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe   exceder del 10 % en valor relativo .    B . POR TURBIDIMETRIA    1 . Objetivo y ámbito de aplicación    El método permite determinar la cloretraciclina   ( CTC ) , la oxitetraciclina ( OTC ) , y la   tetraciclina ( TC ) en las concentraciones superiores   a 1 g/kg , en la medida en que ninguna otra substancia   interfiera dando lugar a unos extractos turbios . Dicho   método es más rápido que el método por difusión   sobre gelosa .    2 . Principio    La muestra está sometida a la extracción por   una mezcla de acetona de agua y de ácido clorhídrico   para la determinación de la CTC y por una mezcla de   metanol y de ácido clorhídrico para la determinación   del OTC y de la TC .    Los extractos se diluyen a continuación y su efecto   antibiótico se determina por la medición de la   transmisión luminosa de un medio de cultivo inseminado   con Staphylococcus aureus y antibiótico añadido .   La transmisión luminosa es función de la concentración   del antibiótico .    3 . Microorganismo : Staphilococuccus aureus K 141 (4)    3.1 . Mantenimiento de la cepa    Inocular S. aureus sobre gelosa inclinada en tubo   constituído por el medio de cultivo ( 4.1 ) , un 1,5 a   un 3 % de gelosa añadido ( según la cantidad ) .   Incubar durante una noche a 37 ° C . Conservar el   cultivo en refrigerador y repicar cada 4 semanas sobre   gelosa inclinada . Preparar simultáneamente unos   subcultivos para el empleo de laboratorio .    3.2 . Preparación del Inóculo    24 h antes de su empleo , repicar un subcultivo   sobre gelosa inclinada e incubar durante una noche   a 37 ° C . Poner en suspensión la totalidad del   cultivo de un tubo de gelosa en 2 ml aproximadamente   del medio de base ( 4.1 ) y transvasar a continuación la   suspensión en unas condiciones estériles en 100 ml   aproximadamente del mismo medio de base ( 4.1 ) .   Incubar en baño de agua a 37 ° C , hasta que   el crecimiento de la cepa entre en su fase logarítmica   ( 1 h 30 a 2 h ) .    4 . Medios de cultivo y reactivos    4.1 . Medio de base de la determinación (5)    Peptona * 5 g *    Extracto de levadura * 1,5 g *    Extracto de carne * 1,5 g *    Cloruro de sodio * 3,5 g *    Glucosa * 1,0 g *    Fosfato monopotásico KH2PO4 p.a. * 1,32 g *    Fosfato bipotásico K2HPO4 p.a. * 3,68 g *    Agua destilada ad * 1 000 ml *    pH tras esterilización : 6,8 a 7,0    4.2 . Tampón fosfato , pH 4,5    Fosfato monopotásico KH2PO4 p.a. * 13,6 g *    Agua destilada * 1 000 ml *    4.3 . Ácido clorhídrico 0,1 N .    4.4 . Mezcla acetona pura/agua/ácido clorhídrico   ( d : 1,19 ) : 65/33/2 en volumen .   4.5 . Mezcla metanol puro/ácido clorhídrico ( d :   1,19 ) : 98/2 en volumen .    4.6 . Solución al 10 % aproximadamente ( p/v ) de   formaldehido .    4.7 . Substancias de calibrado : OTC , CTC , TC cuya   actividad se exprese en clorhidrato .    5 . Solución de calibrado    Preparar , a partir de la substancia de calibrado   ( 4.7 ) y con ayuda de ácido clorhídrico ( 4.3 ) una   solución madre cuya concentración corresponda a 400   a 500 mg de CTC-HCl , OTC-HCl o TC-HCl por ml .   Dicha solución se conserva una semana en refrigerador .    6 . Extracción    6.1 . Clortetraciclina    Introducir en un matraz aforado de 200 o 250 ml una   toma de muestras de 1 a 2 g . Añadir 100 ml   aproximadamente de la mezcla ( 4.4 ) y agitar durante   30 minutos sobre mesa de sacudidas . Completar al   volumen por el tampón fosfato , pH 4,5 ( 4.2 ) .   Homogeneizar y dejar que se deposite .    6.2 . Oxitetraciclina y tetraciclina    Introducir en un matraz aforado de 200 a 250 ml una   toma de muestras de 1 a 2 g . Añadir 100 ml   aproximadamente de la muestra ( 4.5 ) y agitar durante   30 minutos sobre mesa de sacudidas . Completar al   volumen por el tampón de fosfato , pH 4,5 ( 4.2 ) .   Homogeneizar y dejar que se deposite .    7 . Modalidades de la determinación    7.1 . Preparación de series de calibrado y del extracto    Diluir de forma apropiada con ayuda del tampón de   fosfato , pH 4,5 ( 4.2 ) la solución de calibrado (3)   y el extracto (6) de forma que se obtenga una serie de   concentraciones que permita establecer , para cada   determinación , una curva de calibrado y la   interpolación sobre dicha curva de al menos dos valores   relativos al extracto . Las diluciones deben escogerse en   función de las condiciones de crecimiento de la cepa ,   que pueden variar de un laboratorio a otro . Se procede   generalmente de la siguiente forma :    7.1.1 . Clortetraciclina    Diluir la solución de calibrado (5) con ayuda del   tampón de fosfato ( 4.2 ) para obtener una   solución de calibrado cuya concentración   corresponde a 0,2 mg de CTC-HCl por ml . Preparar   a continuación con ayuda de un tampón de fosfato   ( 4.2 ) , como se indica a continuación y en unos   tubos destinados a la determinación , 6 diluciones con   una repetición de cada dilución .    ml de solución de calibrado de trabajo * ml de   tampón fosfato ( 4.2 ) * Concentración en CTC-HCl   ( mg/ml ) *    0,7 * 0,3 * 0,14 *    0,6 * 0,4 * 0,12 *    0,55 * 0,45 * 0,11 *    0,45 * 0,55 * 0,09 *    0,4 * 0,6 * 0,08 *    0,3 * 0,7 * 0,06 *    Diluir el extracto ( 6.1 ) con ayuda del tampón de   fosfato ( 4.2 ) para obtener una concentración   supuesta en CTC-HCl de 0,12 mg/l . Introducir 1 ml de dicha   solución en 2 tubos de 0,75 ml ( = 0,09 mg ) en otros   2 tubos . Completar el volumen de los 2 últimos tubos   a 1 ml mediante el tampón de fosfato ( 4.2 ) .    7.1.2 . Oxitetraciclina y tetraciclina    Diluir la solución de calibrado (5) con ayuda del   tampón de fosfato ( 4.2 ) para obtener una solución   de calibrado de trabajo cuya concentración corresponda   a 0,6 mg de OTC-HCl o de TC-HCl por ml . Preparar a   continuación con ayuda el tampón de fosfato ( 4.2 )   como se indica a continuación y en los tubos destinados   a la determinación , 7 diluciones con una repetición   de cada dilución .    ml de solución de calibrado de trabajo * ml de tampón   fosfato ( 4.2 ) * Concentración en OTC-HCl o CT-HCl   ( 1 mg/ml ) *    0,9 * 0,1 * 0,54 *    0,8 * 0,2 * 0,48 *    0,7 * 0,3 * 0,42 *    0,6 * 0,4 * 0,36 *    0,4 * 0,6 * 0,24 *    0,3 * 0,7 * 0,18 *    0,2 * 0,8 * 0,12 *    Diluir el extracto ( 6.2 ) por el tampón de fosfato   ( 4.2 ) para obtener una concentración supuesta   en OTC-HCl o TC-HCl de 0,48 mg/ml . Introducir 1 ml   dicha solución en 2 tubos y 0,5 ml ( = 0,24 mg ) en   otros dos tubos . Completar el volumen de los 2 últimos   tubos a 1 ml por el tampón de fosfato ( 4.2 ) .    7.2 . Inoculación del medio de cultivo    Inocular el medio de base de la determinación ( 4.1 ) por   el inóculo ( 3.2 ) de forma que se pueda obtener   mediante el fotómetro a 590 nm una transmisión   luminosa del 85 % en una cubeta de 5 cm o del 92 %   en una cubeta de 2 cm , estando el aparato regulado al   100 % de transmisión sobre el medio de base ( 4.1 ) no   inoculado .    7.3 . Inseminación    Introducir cada tubo ( 7.1.1 o 7.1.2 ) 9 ml del medio   de cultivo inoculado ( 7.2 ) . La operación de relleno   de los tubos deberá hacerse con limpieza , pero no   necesariamente en condiciones estériles .    7.4 . Incubación    La incubación debe hacerse obligatoriamente en un   baño de agua cuya temperatura se mantenga   homogénea a 37 ° C más o menos 0,1 ° C por   agitación . El tiempo de incubación debe ser   escogido de forma que se puedan trazar unas curvas de   transmisión cuya inclinación sea apropiada a unas   medidas precisas ( generalmente 2 h 30 a 3 h ) .   Bloquear a continuación el crecimiento inyectando   rápidamente 1 ml de solución de formaldehido ( 4.6 )   en cada tubo .    7.5 . Medición del crecimiento    Medir las transmisiones mediante el fotómetro a   590 nm , regulando el aparato al 100 % de transmisión   cobre la solución de calibrado más límpida ( la   que corresponda al contenido más elevado de   antibiótico ) . Debido a las pequeñas diferencias   de turbiedad presentadas por los distintos tubos , se   recomienda utilizar cubetas de 2cm al menos y ,   preferiblemente , de 5 cm .   8 . Cálculo de los resultados    Trazar gráficamente la curva de calibrado sobre papel   milimetrado poniendo las transmisiones fotométricas   en relación con las concentraciones en antibiótico .   Interpolar sobre la curva las transmisiones relativas   al extracto . Calcular el contenido en antibiótico de   la muestra .    9 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos terminaciones   paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe   exceder del 10 % , en valor relativo .    3 . DETERMINACIÓN DE LA OLEANDOMICINA     - por difusión de gelosa -    1 . Objetivo y ámbito de aplicación    El método permite determinar la oleandomicina en los   alimentos , los concentrados y las premezclas , incluso   en presencia de tetraciclinas . El límite inferior de la   determinación es 0,5 ppm .    2 . Principio    La muestra se somete a la extracción por una   solución metanólica diluida de tris ( hidroximetil )   aminometano . Previa centrifugación , el extracto se   diluye y su actividad antibiótica se determina por la   medición de la difusión de la oleandomicina en un   medio gelosificado inseminado con B. cereus . La   difusión estará indicada por la formación de zonas   de inhibición en presencia del microorganismo . El   diámetro de dichas zonas es directamente proporcional   al logaritmo de la concentración del antibiótico .    3 . Microorganismo : B. cereus K 205 TR (6) ( resistente   a las tetraciclinas )    3.1 . Mantenimiento de la cepa    Inocular B. cereus sobre gelosa inclinada en tubo   constituído por el medio de cultivo ( 4.1 ) con la   adición de 100 mg de oxitetraciclina por 5 ml .   Incubar durante una noche a 30 ° C aproximadamente .   Conservar el cultivo en el refrigerador y repicar cada   4 semanas sobre gelosa inclinada .    3.2 . Preparación de la suspensión de las esporas    Recoger los gérmenes en un tubo de gelosa inclinado   ( 3.1 ) con ayuda de 3 ml aproximadamente del suero   fisiológico ( 4.3 ) . Inseminar con dicha suspensión   un frasco de Roux que contenga 300 ml del medio de   cultivo ( 4.1 ) cuya concentración de gelosa es   del 3 al 4 % . Incubar 3 a 5 días a 28-30 ° C ,   recoger a continuación las esporas en 15 ml de etanol   ( 4.4 ) , después de haber comprobado la esporulación   bajo el microscopio , y homogeneizar . Dichas suspensión   puede conservarse en el refrigerador durante 5 meses al   menos .    Mediante ensayos previos sobre placas con el medio de base   de la determinación ( 4.2 ) , determinar la cantidad   de inóculo que permita obtener para las diferentes   concentraciones de oleandomicina empleadas , unas   zonas de inhibición tan extendidas como sea posible y   que además sean claras . Dicha cantidad es generalmente   de 0,1 a 0,2 ml/1 000 ml . La inoculación del medio   de cultivo se hará a 60 ° C .    4 . Medios de cultivo y reactivos    4.1 . Medio de mantenimiento de la cepa (7)    Glucosa * 1 g *    Peptona tripsica * 10 g *    Extracto de varne * 1,5 g *    Extracto de levadura * 3 g *    Gelosa , según la calidad * 10 a 20 g *    Agua destilada ad * 1 000 ml *    Ajustar el pH a 6,5 en el momento de su empleo    4.2 . Medio de base de la determinación (1)    Medio ( 4.1 ) ajustado a pH 8,8    4.5 . Suero fisiológico estéril    4.4 . Etanol al 20 % ( v/v )    4.5 . Metanol , puro    4.6 . Solución al 0,5 % ( p/v ) de tris ( hidroximetil )   amino-metano p.a.    4.7 . Solución de extracción    Metanol puro * 50 ml *    Agua destilada * 50 ml *    Tris ( hidroximetil ) amino-metano p.a. * 0,5 g *    4.8 . Substancia de calibrado : oleandomicina de actividad   conocida .    5 . Solución de calibrado    Disolver algo de la substancia de calibrado ( 4.8 ) en 5 ml   de metanol ( 4.5 ) y diluir por la solución ( 4.6 )   para obtener una concentración en oleandomicina de   100 mg/ml .    A partir de dicha solución-madre , preparar diluyendo   mediante la solución ( 4.6 ) una solución de   calibrado de trabajo S8 que contenga 0,1 mg de oleandomicina   por ml . Preparar a continuación por diluciones sucesivas   ( 1 + 1 ) con ayuda de la solución ( 4.6 ) las   siguientes concentraciones :    S4 0,05 mg/ml    S2 0,025 mg/ml    S1 0,0125 mg/ml    6 . Extracción    Tomar , según el contenido supuesto en oleandomicina   de la muestra , una toma de muestras de 2 a 10 g ,   añadir 100 ml de la solución ( 4.7 ) y agitar   durante 30 minutos sobre mesa de sacudidas .    Centrifugar , tomar una parte alícuota del extracto y   diluir mediante la solución ( 4.6 ) para obtener una   concentración supuesta en oleandomicina de 0,1 g/ml   ( = U8 ) . Preparar a continuación las concentraciones   U4 , U2 y U1 por diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con   ayuda de la solución ( 4.6 ) .    7 . Modalidades de la determinación    7.1 . Inoculación del medio de cultivo    Inocular a 60 ° C del medio de base de las   determinación ( 4.2 ) por la suspensión de   esporas ( 3.2 ) .    7.2 . Preparación de las cajas    La difusión sobre gelosa se efectúa en una caja   con las cuatro concentraciones de la solución de   calibrado ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las 4 concentraciones   del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja deberá   recibir necesariamente las 4 concentraciones de calibrado   y del extracto .    Con tal fin , escoger las dimensiones de las cajas   de tal forma que se puedan efectuar en el medio gelosificado   al menos 8 cavidades de 10 a 13 mm de diámetro . Calcular   la cantidad del medio de cultivo inoculado ( 7.1 ) que   debe emplearse para obtener un recubrimiento uniforme de   2 mm aproximadamente de espesor . Es preferible emplear   como cajas unas placas de vidrio planas provistas de   un anillo de aluminio o de material plástico   perfectamente plano de 200 mm de diámetro y 20 mm   de altura .    Introducir con la pipeta en las cavidades unas cantidades   exactamente medidas de solución antibiótica comprendidas   entre 0,10 y 0,15 ml según el diámetro .    Para cada muestra , hacer al menos 4 repeticiones   de difusión con cada concentración , de forma   que cada determinación sea objeto de una evaluación   de 32 zonas de inhibición .    7.3 . Incubación    Incubar las cajas durante 18 h aproximadamente a   28-30 ° C .    8 . Evaluación    Medir el diámetro de las zonas de inhibición ,   preferiblemente , por proyección . Describir las   mediciones sobre papel semilogarítmico , llevando el   logaritmo de los concentrados en relación con los   diámetros de las zonas de inhibición . Trazar las   rectas de la solución de calibrado y del extracto .   A falta de interferencias , las dos rectas habrán de   ser paralelas .    El logaritmo de la actividad relativa se calculará   por medio de la siguiente fórmula :     ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) · 0,602/   U4 + U8 + S4 + S8 - V1 - V2 - S1 - S2    Actividad real = actividad supuesta por   actividad relativa .    9 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos   determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma   muestra no debe exceder del 10 % m , en valor relativo .    4 . DETERMINACIÓN DE LA TILOSINA     - por difusión sobre gelosa -    1 . Objeto y ámbito de aplicación    El método permite determinar la tilosina en los   alimentos , los concentrados y las premezclas . El   límite inferior de la determinación es de 2 ppm .    2 . Principio    La muestra se trata mediante una solución tampón   de fosfato de pH 8 , previamente llevada a 80 ° C ,   y se la someterá a continuación a la extracción   por metanol . Previa centrifugación , el extracto   se diluye y su actividad antibiótica se determina   por la medición de la difusión de la tilosina en un medio   gelosificado inseminado con Sarcina lutea . La difusión   indicada por la formación de zonas de inhibición   en presencia del microorganismo . El diámetro de dichas   zonas es directamente proporcional al logaritmo de la   concentración del antibiótico .    3 . Microorganismo : Sarcina lutea ATCC n º 9341    3.1 . Mantenimiento de la cepa    Inocular Sarcina lutea sobre gelosa inclinada en tubo   constituída por medio de cultivo ( 4.1 ) , ajustado   a pH 7,0 . Incubar durante una noche a 35 ° C   aproximadamente . Conservar el cultivo en refrigerador   y repicar todos los meses sobre glucosa inclinada .    3.2 . Preparación de la suspensión de gérmenes    Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa inclinada   ( 3.1 ) de reciente preparación , por 2 a 3 ml de   suelo fisiológico ( 4.4 ) . Inseminar con dicha   suspensión un frasco de Roux que contenga 250 ml   del medio de cultivo ( 4.1 ) , ajustado a pH 7,0 .   Incubar durante 24 h a 35 ° C , recoger los gérmenes   con ayuda de 25 ml de suero fisiológico ( 4.4 ) .   Homogeneizar y diluir dicha suspensión para obtener   una transformación luminosa del 75 % aproximadamente   a 65 mm .    Conservar en refrigerador , dicha suspensión es   utilizable durante una semana .    Mediante unos ensayos preliminares sobre placas con el   medio de base de la determinación ( 4.1 ) , determinar   la cantidad de inóculo que permita obtener para   las diferentes concentraciones de tilosina empleada   en las zonas de inhibición tan extendidas como sea   posible y que además estén claras . La inoculación   del medio de cultivo se hace a 48-50 ° C .    4 . Medios de cultivo y reactivos    4.1 . Medio de base de la determinación (8)    Glucosa * 1 g *    Peptona tripsica * 10 g *    Extracto de carne * 1,5 g *    Extracto de levadura * 3 g *    Gelosa , según la calidad * 10 a 20 g *    Agua destilada ad * 1 000 ml *    Ajustar en el momento del empleo a pH 7,0 para el   mantenimiento de la cepa y la preparación de la   suspensión de gérmenes y a pH 2,0 para la   determinación .    4.2 . Tampón fosfato , pH 8    Fosfato monopotásico KH2PO4 p.a. * 0,523 g *    Fosfato bipotásico K2HPO4 p.a. * 16,730 g *    Agua destilada ad * 1 000 ml *    4.3 . Tampón fosfato , pH 7    Fosfato monopotásico KH2PO4 p.a. * 5,5 g *    Fosfato bipotásico K2HPO4 p.a. * 13,6 g *    Agua destilada ad * 1 000 ml *    4.4 . Suero fisiológico estéril    4.5 . Metanol puro    4.6 . Metanol al 10 % ( v/v )    4.7 . Mezcla tampón fosfato ( 4.2 )/metanol   puro : 60/40 en volumen .    4.8 . Substancia de calibrado : tilosina conocida .    5 . Soluciones de calibrado    Secar la substancia de calibrado ( 4.8 ) durante   3 h a 60 ° C en una estufa de vacío ( 5 mm de   mercurio ) . Pasar 10 a 50 mg en un matraz aforado ,   disolverlos en 5 ml de metanol ( 4.5 ) y diluir la   solución mediante el tampón fosfato , pH 7 ( 4.3 )   para obtener una concentración en tilosina-base   de 1 000 mg/ml .    A partir de dicha solución-madre , preparar diluyendo   mediante la mezcla ( 4.7 ) una solución de calibrado   de trabajo S8 que contenga 2-mg de tilosina-base por ml .    Preparar a continuación por diluciones sucesivas   ( 1 + ) con ayuda de la mezcla ( 4.7 ) , las   concentraciones siguientes :    S4 1 mg/ml    S2 0,5 mg/ml    S1 0,25 mg/ml    6 . Extracción    Tomar para los concentrados una toma de muestras de   10 g ; para las premezclas y los alimentos una   toma de muestras de 20 g . Añadir 60 ml de tampón   fosfato , pH 8 ( 4.2 ) , previamente llevado a 80 ° C ,   y homogeneizar durante 2 minutos ( electrodoméstico ,   Ultra-turrax , etc. )    Dejar reposar durante diez minutos , añadir 40 ml   de metanol ( 4.5 ) y homogeneizar durante 5 minutos .   Centrifugar , tomar una parte alícuota de extracto y   diluir mediante la solución ( 4.7 ) para obtener una   concentración supuesta en tilosina de 2 mg/ml   ( = U8 ) . Preparar a continuación las concentraciones   U4 , U2 y U1 por diluciones sucesivas ( 1 + 1 ) con   ayuda de la solución ( 4.7 ) .    Para los contenidos inferiores a 10 ppm , evaporar   el extracto en seco en un evaporador rotativo a 35 ° C   y recoger el residuo mediante metanol al 40 % ( 4.6 ) .    7 . Modalidades de la determinación    7.1 . Inoculación del medio de cultivo    Inocular a 48-50 ° C el medio de base de la   determinación ( 4.1 ) , ajustado a pH 8,0 , por la   suspensión de gérmenes ( 3.2 ) .    7.2 . Preparación de las cajas    La difusión sobre gelosa se efectúa en unas cajas   con las 4 concentraciones de la solución de calibrado   ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las 4 concentraciones del   extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja deberá   recibir necesariamente las 4 concentraciones de calibrado   o del extracto .    Con tal fin , escoger las dimensiones de las cajas   de tal forma que se puedan practicar en el medio   gelosificado al menos 8 unidades de 10 a 13 mm de   diámetro . Calcular la cantidad del medio de cultivo   inoculado ( 7.1 ) que habrá de emplearse de forma   que se pueda obtener un recubrimiento uniforme de 2 mm   aproximadamente de espesor . Es preferible emplear como   cajas placas de vidrio planas previstas de un anillo de   aluminio o de material plástico perfectamente plano   de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura .    Introducir mediante la pipeta en las cavidades unas   cantidades exactamente medidas de solución de   antibiótico comprendidas entre 0,10 y 0,15 ml , según   el diámetro .    Para cada muestra , hacer al menos 4 repeticiones de   difusión con cada concentración , de forma que   cada determinación sea objeto de una evaluación de   32 zonas de inhibición .    7.3 . Incubación    Incubar las cajas durante una noche a 35-37 ° C .    8 . Evaluación    Medir el diámetro de las zonas de inhibición , de   preferencia , por proyección . Inscribir las medidas   sobre papel semilogarítmico , llevando el logaritmo   de las concentraciones en relación con los diámetros   de zonas de inhibición . Trazar las rectas de la   solución de calibrado y del extracto . A falta de   interferencias , las dos rectas deberán ser paralelas .    El logaritmo de la actividad relativa está calculado   por la siguiente fórmula :     ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) · 0,602/   U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2    Actividad real = actividad supuesta por actividad   relativa .    9 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe   sobrepasar el 10 % , en valor relativo .    5 . DETERMINACIÓN DE LA VIRGINIAMICINA     - por difusión sobre gelosa -    1 . Objetivo y ámbito de aplicación    El método permite determinar la virginiamicina en   los alimentos , los concentrados y las premezclas . El   límite inferior de la determinación es de 2 ppm .    2 . Principio    La muestra se someterá a la extracción por una   solución metanólica de Tween 80 . Previa   centrifugación o filtración , el extracto se diluye y   su actividad antibiótica se determina por la medición   de la difusión de la virginiamicina en un medio   gelosificado inseminado con Sarcina lutea . La difusión   está indicada por la formación de zonas de inhibición   en presencia del microorganismo . El diámetro de   dichas zonas es directamente proporcional al logaritmo   de la concentración del antibiótico .    3 . Microorganismo : Sarcina lutea ATCC n º 9341    3.1 . Creación de la cepa    Unocular S. lutea sobre gelosa inclinada en tubo   constituída por el medio de cultivo ( 4.1 ) . Incubar   durante una noche a 35 ° C aproximadamente . Conservar   el cultivo en refrigerador y repicar cada 14 días   sobre gelosa inclinada .    3.2 . Preparación de la suspensión de gérmenes    Recoger los gérmenes de un tubo de gelosa inclinada   ( 3.1 ) , de reciente preparación , mediante 2 a   3 ml de suero fisiológico ( 4.3 ) . Inseminar con   dicha suspensión un frasco de Roux que contenga 250 ml   del medio de cultivo ( 4.1 ) . Incubar durante 24 h a   35 ° C , recoger los gérmenes con ayuda de 25 ml   de suero fisiológico ( 4.3 ) . Homogeneizar y diluir   dicha suspensión para obtener una transmisión   luminosa del 75 % aproximadamente a 650 nm . Conservada   en refrigerador , dicha suspensión es utilizable   durante una semana .    Mediante unos ensayos preliminares sobre placas con el   medio de base de la determinación ( 4.1 ) , determinar   la cantidad de inóculo que permita obtener para las   diferentes concentraciones de virginiamicina empleadas   unas zonas de inhibición tan extendidas como sea   posible y que sean además claras . La inoculación   del medio de cultivo se hace a 48-50 ° C .    4 . Medios de cultivo y reactivos    4.1 . Medio de base de la determinación (9)    Glucosa * 1 g *    Peptona tripsica * 10 g *    Extracto de carne * 1,5 g *    Extracto de levadura * 3 g *    Gelosa , según la calidad * 10 a 20 g *    Agua destilada ad * 1 000 ml *    Ajustar el pH a 6,5 antes de su empleo * *    4.2 . Tampón fosfato , pH 6    Fosfato monopotásico KH2PO2 p.a. * 8,0 g *    Fosfato bipotásico K2HPO4 p.a. * 2,0 g *    Agua destilada ad * 1 000 ml *    4.3 . Suero fisiológico estéril    4.4 . Metanol , puro    4.5 . Mezcla tampón fosfato ( 4.2 ) /metanol puro : 80/20   en volumen .    4.6 . Solución metanólica al 0,5 % ( p/v ) de   Tween 80 .    4.7 . Substancia de calibrado : virginiamicina de   actividad conocida .    5 . Solución de calibrado    Preparar una solución metanólica de substancia de   calibrado ( 4.7 ) a 800 mg de virginiamicina por ml . A   partir de dicha solución madre , preparar diluyendo por   la mezcla ( 4.5 ) una solución de calibrado de trabajo .   S8 que contenga 1 mg de virginiamicina por ml .   Preparar después por diluciones sucesivas ( 1 + 1 )   con ayuda de la mezcla ( 4.5 ) , las concentraciones   siguientes :    S4 0,5 mg/ml    S2 0,25 mg/ml    S1 0,125 mg/ml    6 . Extracción    6.1 . Productos cuyo contenido en virginiamicina es   igual o inferior a 50 ppm    Tomar una toma de muestras de 10 a 20 g , añadir 100 ml   de la solución ( 4.6 ) y agitar durante 30 minutos   sobre mesa de sacudidas . Centrifugar o filtrar , tomar   20 ml de la solución límpida y evaporarlos en seco   en un evaporador rotativo . Recoger el residuo mediante   20 ml o más de la mezcla ( 4.5 ) para obtener una   concentración supuesta en virginiamicina de   1 mg/ml ( = U8 ) . Preparar a continuación las   concentraciones U4 , U2 y U1 por diluciones sucesivas   ( 1 + 1 ) con ayuda de la mezcla ( 4.5 ) .    6.2 . Productos cuyo contenido en virginiamicina es   superior a 50 ppm    Tomar una toma de muestra de 1 a 10 g , añadir   100 ml de la solución ( 4.6 ) y agitar durante   30 minutos sobre mesa de sacudidas . Centrifugar o   filtrar y diluir a continuación por la mezcla ( 4.5 )   para obtener una concentración supuesta en virginiamicina   de 1 mg/ml ( = U8 ) . Preparar a continuación las   concentraciones U4 , U2 y U1 tal como se indica en 6.1 .    7 . Modalidades de determinación    7.1 . Inoculación del medio de cultivo    Inocular a 46-50 ° C el medio de base de la   determinación ( 4.1 ) por la suspensión de gérmenes   ( 3.2 ) .    7.2 . Preparación de las cajas    La difusión sobre gelosa se efectúa en unas cajas   con las cuatro concentraciones de la solución de   calibrado ( S8 , S4 , S2 , S1 ) y las 4 concentraciones   del extracto ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Cada caja debe recibir   necesariamente las 4 concentraciones de calibrado   y del extracto .    Con tal fin , escoger las dimensiones de las cajas de   tal forma que se puedan practicar en el medio gelosificado   al menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de diámetro .   Calcular la cantidad del medio de cultivo inoculado ( 7.1 )   que haya de emplearse y de forma que se obtenga un   recubrimiento uniforme de 2 mm aproximadamente de   espesor . Es preferible emplear como cajas unas placas de   vidrio planas provistas de un anillo de aluminio o de   material plástico perfectamente plano de 200 mm de   diámetro y 20 mm de altura .    Introducir mediante la pipeta en las cavidades   unas cantidades medidas con exactitud de solución   de antibiótico comprendidas entre 0,10 y   0,15 milímetros , según el diámetro .    Para cada muestra , hacer al menos 4 repeticiones de   difusión con cada concentración , de forma que cada   determinación sea objeto de una evaluación de   32 zonas de inhibición .    7.3 . Incubación    Incubar las cajas durante 18 h aproximadamente a   28-30 ° C .    8 . Evaluación    Medir el diámetro de las zonas de inhibición ,   preferiblemente por proyección . Inscribir las   mediciones sobre papel semilogarítmico , llevando el   logaritmo de las concentraciones en relación con los   diámetros de las zonas de inhibición . Trazar las   rectas de la solución de calibrado y del extracto . A   falta de interferencias , las dos rectas deberán   ser paralelas .    El logaritmo de la actividad relativa se calcula   mediante la siguiente fórmula :     ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) · 0,602/   U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2    Actividad real = actividad supuesta por actividad   relativa .    9 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas efectuadas sobre la misma muestra no deben   sobrepasar el 10 % , en valor relativo .    (1) Cualquier medio de cultivo comercial de composición   análoga y que dé los mismos resultados podrá   ser empleado .    (2) Podrá emplearse cualquier medio de cultivo   comercial de análoga composición y que dé los mismos   resultados , podrá emplearse .    (3) El negro amido sirve para caracterizar las zonas   de inhibición de las soluciones de calibrado ( anillos   azules ) .    (4) Esta deba , aislada por la LUFA en Kiel , acusa   un crecimiento más rápido que el S. aureus ATCC 6538 P .    (5) Podrá emplearse cualquier medio de cultivo   comercial de composición análoga y que dé los   mismos resultados .    (6) Cepa aislada por la LUFA en Kiel .    (7) Cualquier medio de cultivo comercial de composición   análoga y que dé los mismos resultados puede ser   utilizado .    (8) Cualquier medio de cultivo comercial de   composición análoga y que dé los mismos   resultados puede ser utilizado .    (9) Cualquier medio de cultivo comercial de análoga   composición y que dé los mismos resultados podrá   ser utilizado .