Avis juridique important

|

31992L0069

Οδηγία 92/69/ΕΟΚ της Επιτροπής της 31ης Ιουλίου 1992 για την προσαρμογή στην τεχνική πρόοδο, για δέκατη έβδομη φορά, της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ του Συμβουλίου σχετικά με την προσέγγιση των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων σε ό,τι αφορά την ταξινόμηση, τη συσκευασία και την επισήμανση των επικίνδυνων ουσιών

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 383 της 29/12/1992 σ. 0113 - 0115 Φινλανδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 6 τόμος 6 σ. 0003  Σουηδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 6 τόμος 6 σ. 0003  L 383A 29/12/1992 P. 0001 - 0235

ΟΔΗΓΙΑ 92/69/ΕΟΚ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 31ης Ιουλίου 1992 για την προσαρμογή στην τεχνική πρόοδο, για δέκατη έβδομη φορά, της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ του Συμβουλίου σχετικά με την προσέγγιση των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων σε ό,τι αφορά την ταξινόμηση, τη συσκευασία και την επισήμανση των επικινδύνων ουσιώνΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,Έχοντας υπόψη:τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητας,την οδηγία 67/548/ΕΟΚ του Συμβουλίου της 27ης Ιουνίου 1967 για την προσέγγιση των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων σε ό,τι αφορά την ταξινόμηση, συσκευασία και επισήμανση των επικίνδυνων ουσιών (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 92/32/ΕΟΚ (2), και ιδίως τα άρθρα 28 και 29,(1) ΕΕ αριθ. 96 της 16. 8. 1967, σ. 1.(2) ΕΕ αριθ. L 154 της 5. 6. 1992, σ. 1.Εκτιμώντας:ότι στο άρθρο 3 παράγραφος 1 της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ καθώς και στο άρθρο 3 της οδηγίας 88/379/ΕΟΚ του Συμβουλίου της 7ης Ιουνίου 1988 για την προσέγγιση των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων σχετικά με την ταξινόμηση, συσκευασία και επισήμανση των επικινδύνων παρασκευασμάτων (3), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 90/492/ΕΟΚ της Επιτροπής (4), προβλέπεται ότι οι φυσικοχημικές ιδιότητες, η τοξικότητα και η οικοτοξικότητα των ουσιών και παρασκευασμάτων προσδιορίζονται σύμφωνα με τις μεθόδους που προβλέπονται στο παράρτημα V της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ (3) ΕΕ αριθ. L 187 της 16.7.1988, σ. 14.(4) ΕΕ αριθ. L 275 της 5.10.1990, σ. 35.ότι το κείμενο του παραρτήματος V της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ δημοσιεύεται σε δύο μέρη, που αντιστοιχούν στο παράρτημα της οδηγίας 84/449/ΕΟΚ της Επιτροπής (5) και στο παράρτημα της οδηγίας 88/302/ΕΟΚ της Επιτροπής (6) (5) ΕΕ αριθ. L 251 της 19.9.1984, σ. 1.(6) ΕΕ αριθ. L 133 της 30.5.1988, σ. 1 και ΕΕ αριθ. L 136 της 2.6.1988, σ. 20.ότι προκειμένου να ληφθούν υπόψη οι τεχνικές εξελίξεις είναι αναγκαίο να επανεξεταστούν οι μέθοδοι δοκιμασίας που αναφέρονται στο παράρτημα της οδηγίας 84/449/ΕΟΚ ότι προκειμένου να ληφθούν υπόψη οι τεχνικές εξελίξεις είναι επίσης αναγκαίο να επανεξεταστεί η μέθοδος δοκιμασίας που συνίσταται στην αναστολή των αυξητικών διεργασιών σε καλλιέργειες αλγών, η οποία αναφέρεται στο παράρτημα της οδηγίας 88/302/ΕΟΚ της Επιτροπής και επί τη ευκαιρία, να μεταφερθεί η εν λόγω μέθοδος δοκιμασίας στο παράρτημα της οδηγίας 84/449/ΕΟΚ ότι επιβάλλεται να περιορισθεί σε ένα ελάχιστο όριο ο αριθμός των χρησιμοποιουμένων για πειραματικούς σκοπούς ζώων, σε συμφωνία με την οδηγία 86/609/ΕΟΚ, για την προσέγγιση των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων των κρατών μελών σχετικά με την προστασία των ζώων των χρησιμοποιουμένων για πειραματικούς σκοπούς (7) (7) ΕΕ αριθ. L 358 της 18.12.1986, σ. 1.ότι οι διατάξεις της εν λόγω οδηγίας ευρίσκονται σε συμφωνία με τη γνώμη της Επιτροπής για την προσαρμογή στην τεχνική πρόοδο των οδηγιών για την εξάλειψη των τεχνικών φραγμών του εμπορίου σε ό,τι αφορά τις επικίνδυνες ουσίες και παρασκευάσματα,ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:Άρθρο 1Το κείμενο της οδηγίας 84/449/ΕΟΚ αντικαθίσταται από το παράρτημα της παρούσας οδηγίας.Άρθρο 2Καταργείται η μέθοδος δοκιμασίας που συνίσταται στην αναστολή της αύξησης αλγών, η οποία περιγράφεται στο παράρτημα της οδηγίας 88/302/ΕΟΚ.Άρθρο 3Τα κράτη μέλη θέτουν σε ισχύ τις νομοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις που απαιτούνται για να συμμορφωθούν με την παρούσα οδηγία το αργότερο στις 30 Οκτωβρίου 1993. Τα κράτη μέλη ενημερώνουν αμέσως την Επιτροπή σχετικά.Οι διατάξεις που θεσπίζουν τα κράτη μέλη περιέχουν παραπομπή στην παρούσα οδηγία ή συνοδεύονται από μια τέτοια παραπομπή κατά την επίσημη δημοσίευσή τους.Ο τρόπος της εν λόγω παραπομής αποφασίζεται από τα κράτη μέλη.Άρθρο 4Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα κράτη μέλη.Βρυξέλλες, 31 Ιουλίου 1992.Για την ΕπιτροπήKarel VAN MIERT   Μέλος της Επιτροπής ΠΑΡΑΡΤΗΜΑτης οδηγίας 92/69/ΕΟΚ της Επιτροπής της 31ης Ιουλίου 1992 για την προσαρμογή στην τεχνική πρόοδο, για δέκατη έβδομη φορά, της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ του Συμβουλίου σχετικά με την προσέγγιση των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων σε ό,τι αφορά την ταξινόμηση, τη συσκευασία και την επισήμανση των επικινδύνων ουσιών (1) (1)  ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ  ΕΙΣΑΓΩΓΗ  ΜΕΡΟΣ Α: ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ  Α.1. Θερμοκρασία τήξεως/πήξεως//5Α.2. Θερμοκρασία ζέσεως//15Α.3. Σχετική πυκνότητα//21Α.4. Τάση ατμών//26Α.5. Επιφανειακή τάση//47Α.6. Υδατοδιαλυτότητα//54Α.8. Συντελεστής κατανομής//63Α.9. Σημείο ανάφλεξης//74Α.10. Αναφλεξιμότητα (στερεά)//76Α.11. Αναφλεξιμότητα (αέρια)//79Α.12. Αναφλεξιμότητα (σε επαφή με νερό)//81Α.13. Πυροφωσφορικές ιδιότητες στερεών και υγρών//85Α.14. Εκρηκτικές ιδιότητες//87Α.15. Θερμοκρασία αυτοανάφλεξης (υγρά και αέρια)//98Α.16. Σχετική θερμοκρασία αυτοανάφλεξης για στερεά//99Α.17. Οξειδωτικές ιδιότητες (στερεά)//102  ΜΕΡΟΣ Β: ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ//107  Γενική Εισαγωγή//107  Β.1. Οξεία τοξικότητα (από το στόμα)//110Β1α Οξεία τοξικότητα (από το στόμα) Μέθοδος σταθερής δόσης//113Β.2. Οξεία τοξικότητα (αναπνευστική)//117Β.3. Οξεία τοξικότητα (διαδερμική)//121Β.4. Οξεία τοξικότητα (δερματικός ερεθισμός)//124Β.5. Οξεία τοξικότητα (ερεθισμός οφθαλμού)//127Β.6. Ευαισθητοποίηση δέρματος//131Β.7. Τοξικότητα επαναλαμβανόμενης (28 ημέρες) δόσης (από το στόμα)//136Β.8. Τοξικότητα επαναλαμβανόμενης (28 ημέρες) δόσης (από το στόμα)//140Β.9. Τοξικότητα επαναλαμβανόμενης (28 ημέρες) δόσης (από το στόμα)//144Β.10. Μεταλλαξογένεση (κυτταρογενετική δοκιμασία θηλαστικών in vitro)//148Β.11. Μεταλλαξογένεση (κυτταρογενετική δοκιμασία σε μυελό οστών θηλαστικών in vivo, χρωμοσωμική ανάλυση)//151Β.12. Μεταλλαξογένεση (δοκιμασία μικροπυρήνων)//154Β.13. Μεταλλαξογένεση (Escherichia coli - δοκιμασία ανάστροφης μετάλλαξης)//157Β.14. Μεταλλαξογένεση (Salmonella typhimurium - δοκιμασία ανάστροφης μετάλλαξης)//160  ΜΕΡΟΣ Γ: ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΟΙΚΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ//163  Γ.1. Οξεία τοξικότητα για φάρια//163Γ.2. Οξεία τοξικότητα για Daphnia//172Γ.3. Δοκιμή αναστολής σε φύκια//179Γ.4. Βιοαποικοδόμηση: προσδιορισμός της «άμεσης» βιοαποικοδομη-σιμότητας//187Γ.4-Α: Ελλάτωση διαλελυμένου οργανικού άνθρακα (DOC)//194Γ.4-Β: Τροποποιημένη βασική δοκιμή OECD (screening test)//197Γ.4-Γ: Μεταβολή συγκέντρωσης CO2//202Γ.4-Δ: Μανομετρική αναπνευσιομέτρια//207Γ.4-Ε: Κλειστή φιάλη//211Γ.4-Ζ: MITI (Ministry of International Trade and Industry Ιαπωνία)//216  Παραρτήματα//221Γ.5. Αποικοδόμηση: βιοχημικώς απαιτούμενοοξυγόνο//226Γ.6. Αποικοδόμηση: χημικώς απαιτούμενο οξυγόνο//227Γ.7. Αποικοδόμηση: Αβιοτική αποικοδόμηση: Υδρόλυση ως συνάρτηση του pH//229 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το παράρτημα καθιερώνει μεθόδους δοκιμών για τον προσδιορισμό των φυσικοχημικών, τοξικολογικών και οικοτοξικολογικών ιδιοτήτων που περιλαμβάνονται στα παραρτήματα VII και VIII της οδηγίας 79/831/ΕΟΚ. Οι μέθοδοι βασίζονται στις μεθόδους που αναγνωρίζονται και συνιστώνται από αρμόδιους διεθνείς οργανισμούς (ιδιαίτερα τον ΟΟΣΑ). Στις περιπτώσεις που δεν υπήρχαν τέτοιες μέθοδοι, υιοθετήθηκαν εθνικά πρότυπα ή γενικώς αποδεκτές επιστημονικές μέθοδοι. Γενικά, οι δοκιμές θα πρέπει να εκτελούνται με την ουσία όπως ορίζεται από την οδηγία. Ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δίδεται στην πιθανή επίδραση ξένων προσμείξεων στα αναλυτικά αποτελέσματα. Όταν οι μέθοδοι του παραρτήματος αυτού δεν είναι κατάλληλες για τη διερεύνηση μιας ιδιότητας, ο γνωστοποιών πρέπει να αιτιολογεί την εναλλακτική μέθοδο που χρησιμοποιεί. Οι δοκιμές και οι μελέτες σε ζώα πρέπει να διεξάγονται σύμφωνα με τους εθνικούς κανονισμούς και να λαμβάνουν υπόψη τις ανθρωπιστικές αρχές και τις διεθνείς εξελίξεις στον τομέα της ζωικής ευζωίας. Στην περίπτωση ισοδυνάμων μεθόδων δοκιμής, επιλέγεται η μέθοδος στην οποία χρησιμοποιείται ο μικρότερος δυνατός αριθμός ζώων. ΜΕΡΟΣ Α: ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ Α.1. ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΤΗΞΕΩΣ/ΠΗΞΕΩΣ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ Οι περισσότερες από τις περιγραφόμενες μεθόδους βασίζονται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ (1). Οι βασικές αρχές δίδονται στις παραπομπές (2) και (3). (1) (2) (3)   1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Οι μέθοδοι και τα όργανα που περιγράφονται, εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως ουσιών, χωρίς οποιοδήποτε περιορισμό ως προς το βαθμό καθαρότητάς τους.Η επιλογή της μεθόδου εξαρτάται από τη φύση της ουσίας που πρόκειται να εξετασθεί. Κατά συνέπεια, σαν περιοριστικός παράγοντας για την επιλογή θεωρείται το αν η ουσία μπορεί να κονιοποιηθεί εύκολα, δύσκολα ή καθόλου. Για μερικές ουσίες, είναι προτιμότερος ο προσδιορισμός της θερμοκρασίας πήξεως ή στερεοποίησης και γι'αυτό το λόγο, στη μέθοδο αυτή, περιελήφθησαν και τα πρότυπα για τους προσδιορισμούς αυτούς. Όταν, λόγω κάποιων συγκεκριμένων ιδιοτήτων της ουσίας, καμία από τις ανωτέρω παραμέτρους δεν μπορεί να μετρηθεί εύκολα, το σημείο ροής μπορεί να είναι κατάλληλο.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Ως θερμοκρασία τήξεως ορίζεται η θερμοκρασία στην οποία λαμβάνει χώρα η μετάβαση από τη στερεά στην υγρά φάση υπό ατμοσφαιρική πίεση και αυτή η θερμοκρασία κάτω από ιδανικές συνθήκες αντιστοιχεί στη θερμοκρασία τήξεως ή πήξεως.Δεδομένου ότι η μετατροπή φάσης πολλών ουσιών λαμβάνει χώρα σε μία περιοχή θερμοκρασιών, συχνά χαρακτηρίζεται ως περιοχή πήξεως.  Μετατροπή μονάδων (Κ σε  C)t = T   273,15t: θερμοκρασιακή κλίμακα Κελσίου, βαθμός Κελσίου ( C)Τ: θερμοδυναμική θερμοκρασία, Κέλβιν (Κ)  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κυρίως για να ελέγχεται κατά διαστήματα η μέθοδος που εφαρμόζεται και για να γίνεται δυνατή η σύγκριση με τα αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.Μερικές ουσίες βαθμονόμησης (calibration) αναφέρονται στη βιβλιογραφία (4).  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ  Προσδιορίζεται η θερμοκρασία (περιοχή θερμοκρασίας) μετάβασης από τη στερεά στην υγρά κατάσταση ή από την υγρά στη στερεά κατάσταση. Στην πράξη, κατά τη θέρμανση/ψύξη ενός δείγματος της υπό δοκιμή ουσίας υπό ατμοσφαιρική πίεση, προσδιορίζονται οι θερμοκρασίες της αρχής τήξεως/πήξεως και της τελικής φάσης τήξεως/πήξεως. Περιγράφονται πέντε τύποι μεθόδων, συγκεκριμένα η μέθοδος τριχοειδoύς, μέθοδοι θερμών επιφανειών, προσδιορισμοί του σημείου πήξεως, οι μέθοδοι θερμικής ανάλυσης και ο προσδιορισμός του σημείου ροής (όπως αναπτύχθηκε για τα πετρελαιοειδή).  Σε ορισμένες περιπτώσεις, μπορεί αν είναι σκόπιμο να μετρηθεί αντί της θερμοκρασίας τήξεως η θερμοκρασία πήξεως.  1.4.1. Μέθοδος τριχοειδούς  1.4.1.1. Συσκευή θερμοκρασίας τήξεως με υγρό λουτρό  Μικρή ποσότητα της λεπτά κονιοποιημένης ουσίας φέρεται σε τριχοειδή σωλήνα και συμπιέζεται καλά. Ο σωλήνας θερμαίνεται, μαζί με ένα θερμόμετρο, και η άνοδος της θερμοκρασίας ρυθμίζεται σε λιγότερο από περίπου 1 K/min κατά τη διάρκεια της κυρίως τήξεως. Προσδιορίζονται η αρχική και η τελική θερμοκρασία τήξεως.  1.4.1.2. Συσκευή θερμοκρασίας τήξεως με μεταλλικό κορμό  Όπως περιγράφεται στο 1.4.1.1, με τη διαφορά ότι ο τριχοειδής σωλήνας και το θερμόμετρο είναι μέσα σε ένα θερμαινόμενο μεταλλικό κορμό (θάλαμο) και η παρατήρηση γίνεται μέσα από τρύπες πάνω στο θάλαμο.  1.4.1.3. Ανίχνευση με φωτοκύτταρο  Το δείγμα στον τριχοειδή σωλήνα θερμαίνεται αυτόματα σ'ένα μεταλλικό κύλινδρο. Μία δέσμη φωτός κατευθύνεται, μέσω της ουσίας, από μια τρύπα στον κύλινδρο, προς ένα, βαθμονομημένο με ακρίβεια, φωτοκύτταρο. Οι οπτικές ιδιότητες των περισσοτέρων ουσιών αλλάζουν από σκιερές σε διαφανείς όταν τήκονται. Η ένταση του φωτός που φθάνει στο φωτοκύτταρο αυξάνει και στέλνει σήμα «stop» στην ψηφιακή ενδεικτική διάταξη που διαβάζει τη θερμοκρασία ενός θερμομέτρου με αντίσταση από λευκόχρυσο, που βρίσκεται στο θάλαμο θέρμανσης. Η μέθοδος αυτή δεν είναι κατάλληλη για μερικές ισχυρά χρωματιστές ουσίες.  1.4.2. Θερμές επιφάνειες  1.4.2.1. Θερμή ράβδος Kofler  Η θερμή ράβδος Kofler χρησιμοποιεί δύο τεμάχια μετάλλου με διαφορετική θερμική αγωγιμότητα, που θερμαίνονται ηλεκτρικά, με τη ράβδο κατασκευασμένη κατά τρόπο ώστε η πτώση θερμοκρασίας να είναι σχεδόν γραμμική κατά την κατεύθυνση του μήκους της. Η θερμοκρασία της θερμής ράβδου μπορεί να κυμαίνεται από 283 K έως 573 K με ένα ειδικό εξάρτημα ανάγνωσης της θερμοκρασίας, που περιλαμβάνει ένα δρομέα με ένα δείκτη και μία κλίμακα σχεδιασμένη για τη συγκεκριμένη ράβδο. Για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως, η ουσία τοποθετείται σε λεπτή στιβάδα απευθείας στην επιφάνεια της θερμής ράβδου. Σε λίγα δευτερόλεπτα σχηματίζεται μία λεπτή διαχωριστική γραμμή μεταξύ της υγράς και της στερεάς φάσης. Διαβάζεται η θερμοκρασία στη διαχωριστική γραμμή με την μετακίνηση του δείκτη πάνω στη γραμμή αυτή.  1.4.2.2. Μικροσκόπιο τήξεως  Για τον προσδιορισμό θερμοκρασιών τήξεως με πολύ μικρές ποσότητες υλικού χρησιμοποιούνται διάφορα μικροσκόπια θερμών επιφανειών. Στις περισσότερες από τις θερμές επιφάνειες η θερμοκρασία μετριέται με ένα ευαίσθητο θερμοστοιχείο, αν και μερικές φορές χρησιμοποιούνται θερμόμετρα υδραργύρου. Ένα τυπικό μικροσκόπιο θερμών επιφανειών για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως αποτελείται από ένα θερμαινόμενο θάλαμο, ο οποίος περιέχει μία μεταλλική πλάκα, στην οποία τοποθετείται το δείγμα πάνω σε ειδικό πλακίδιο. Στο κέντρο της μεταλλικής πλάκας υπάρχει μία τρύπα, που επιτρέπει την είσοδο του φωτός από το κάτοπτρο φωτισμού του μικροσκοπίου. Κατά τη χρήση, ο θάλαμος κλείνεται με μία γυάλινη πλάκα, που αποκλείει τον αέρα από το χώρο του δείγματος. Η θέρμανση του δείγματος ρυθμίζεται με ένα ροοστάτη. Για πολύ ακριβείς μετρήσεις σε οπτικά ανισότροπες ουσίες, μπορεί να χρησιμοποιηθεί πολωμένο φως.  1.4.2.3. Μέθοδος μηνίσκου  Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται ειδικά για πολυαμίδια. Ο προσδιορισμός της θερμοκρασίας κατά την οποία γίνεται η μετατόπιση μηνίσκου από έλαιο σιλικόνης, που περικλείεται μεταξύ μιας θερμής επιφάνειας και μιας γυάλινης καλυπτρίδας, που στηρίζεται στο εξεταζόμενο δείγμα πολυαμιδίου, γίνεται οπτικά.  1.4.3. Μέθοδος προσδιορισμού της θερμοκρασίας πήξεως  Το δείγμα φέρεται σε ειδικό δοκιμαστικό σωλήνα και τοποθετείται σε μία συσκευή προσδιορισμού της θερμοκρασίας πήξεως. Το δείγμα αναδεύεται ελαφρά και συνεχώς κατά τη διάρκεια της ψύξεως και η θερμοκρασία μετράται σε κατάλληλα χρονικά διαστήματα. Όταν η θερμοκρασία παραμείνει σταθερή κατά τη διάρκεια μερικών αναγνώσεων, αυτή η θερμοκρασία (διορθωμένη για θερμομετρικό σφάλμα) καταγράφεται ως η θερμοκρασία πήξεως.  Πρέπει να αποφεύγεται υπερψύξη με τη διατήρηση ισορροπίας μεταξύ της στερεάς και της υγράς φάσης.  1.4.4. Θερμική ανάλυση  1.4.4.1. Διαφορική θερμική ανάλυση (ΔΘΑ)  Αυτή η τεχνική καταγράφει τη διαφορά θερμοκρασιών μεταξύ της ουσίας και ενός υλικού αναφοράς ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, ενώ η ουσία και το υλικό αναφοράς υποβάλλονται στο ίδιο ελεγχόμενο θερμοκρασιακό πρόγραμμα. Όταν το δείγμα υφίσταται μετατροπή που περιλαμβάνει αλλαγή ενθαλπίας, αυτή η αλλαγή καταδεικνύεται από μία ενδοθερμική (τήξη) ή εξωθερμική (πήξη) απόκλιση από τη βασική γραμμή της καταγραφόμενης θερμοκρασίας.  1.4.4.2. Θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης (ΘΔΣ)  Αυτή η τεχνική καταγράφει τη διαφορά ενεργειακών απολαβών μιας ουσίας και ενός υλικού αναφοράς, σαν συνάρτηση της θερμοκρασίας, ενώ η ουσία και το υλικό αναφοράς υποβάλλονται στο ίδιο ελεγχόμενο θερμοκρασιακό πρόγραμμα. Η ενέργεια αυτή είναι αναγκαία για την επίτευξη μηδενικής θερμοκρασιακής διαφοράς μεταξύ της ουσίας και του υλικού αναφοράς. Όταν το δείγμα υφίσταται μετατροπή που περιλαμβάνει αλλαγή ενθαλπίας, η αλλαγή αυτή καταδεικνύεται από μία ενδοθερμική (τήξη) ή εξωθερμική (πήξη) απόκλιση από τη βασική γραμμή της καταγραφόμενης ροής θερμότητας.  1.4.5. Σημείο ροής  Η μέθοδος αυτή αναπτύχθηκε για να χρησιμοποιηθεί σε πετρελαιοειδή και είναι κατάλληλη για ελαιώδεις ουσίες με χαμηλή θερμοκρασία τήξεως.  Μετά από προκαταρκτική θέρμανση, το δείγμα ψύχεται με ένα συγκεκριμένο ρυθμό και εξετάζεται ανά διαστήματα 3 K ως προς τα χαρακτηριστικά ροής του. Ως σημείο ροής καταγράφεται η κατώτερη θερμοκρασία στην οποία παρατηρείται κίνηση της ουσίας.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Το πεδίο εφαρμογής και η ακρίβεια των διαφόρων μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως/περιοχή τήξως αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα:  ΠΙΝΑΚΑΣ: ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ  >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ  Η τεχνική σχεδόν όλων των μεθόδων δοκιμής περιγράφεται σε εθνικά και διεθνή πρότυπα (βλέπε προσάρτημα 1).  1.6.1. Μέθοδοι με τριχοειδή σωλήνα  Οι λεπτά κονιοποιημένες ουσίες, όταν υποβάλλονται σε διαδικασία αργής ανύψωσης της θερμοκρασίας, εμφανίζουν συνήθως τα στάδια τήξεως που εμφανίζονται στην εικόνα 1.  Εικόνα 1 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Στάδιο ΑΣτάδιο ΒΣτάδιο ΓΣτάδιο ΔΣτάδιο Ε  Στάδιο Α (Αρχή της τήξεως): Λεπτά σταγονίδια προσκολλώνται ομοιόμορφα στο εσωτερικό τοίχωμα του τριχοειδούς σωλήνα.  Στάδιο Β Εμφανίζεται ένα διάκενο μεταξύ του δείγματος και του εσωτερικού τοιχώματος λόγω της συρρίκνωσης του τήγματος.  Στάδιο Γ Το συρρικνωθέν δείγμα αρχίζει να καταρρέει και να υγροποιείται.  Στάδιο Δ Στην επιφάνεια του δείγματος δημιουργείται ένας πλήρης μηνίσκος, σημαντική όμως ποσότητα του δείγματος παραμένει στερεά.  Στάδιο Ε (Τελικό στάδιο τήξεως): δεν υπάρχουν καθόλου στερεά σωματίδια.  Κατά τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως καταγράφονται οι θερμοκρασίες στην αρχή της τήξεως και στο τελικό στάδιο.  1.6.1.1. Συσκευές θερμοκρασίας τήξεως με υγρό λουτρό  Στην εικόνα 2 παρουσιάζεται ένας τύπος πρότυπης συσκευής θερμοκρασίας τήξεως κατασκευασμένης από γυαλί (JIS K 0064); όλες οι διαστάσεις εκφράζονται σε mm.  Εικόνα 2 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Α: Δοχείο μέτρησης.Β: Πώμα.C: Αερισμός.D: Θερμόμετρο.Ε: Βοηθητικό θερμόμετρο.F: Υγρό λουτρό.G: Τριχοειδής σωλήνας κατασκευασμένος από γυαλί 80 έως 100 mm μήκος, 1,0 ± 0,2 mm εσωτερική διάμετρος, 0,2 έως 0,3 mm πάχος τοιχώματος.Η: Πλευρικός σωλήνας.  Υγρό λουτρό:Θα πρέπει να επιλέγεται το κατάλληλο υγρό. Η επιλογή του υγρού εξαρτάται από την, προς προσδιορισμό, θερμοκρασία τήξεως, π.χ. υγρή παραφίνη για θερμοκρασίες τήξεως όχι υψηλότερες από 473 Κ, έλαιο σιλικόνης για θερμοκρασίες τήξεως όχι υψηλότερες από 573 Κ.  Για θερμοκρασίες τήξεως πάνω από 523 Κ, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μείγμα αποτελούμενο από τρία μέρη θειικού οξέος και δύο μέρη θειικού καλίου (κατά βάρος). Κατάλληλες προφυλάξεις θα πρέπει να λαμβάνονται εάν χρησιμοποιηθεί ένα τέτοιο μείγμα.  Θερμόμετρο:Πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο εκείνα τα θερμόμετρα που είναι σύμφωνα με τις απαιτήσεις των ακόλουθων ή ισοδύναμων προτύπων:ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  Διαδικασία:Η ξηρά ουσία κονιοποιείται σε λεπτή μορφή σε ιγδίο και φέρεται στον τριχοειδή σωλήνα, συντετηγμένου στη μία άκρη, έτσι ώστε το ύψος της στάθμης της να είναι περίπου 3 mm μετά από καλή συμπίεση. Για να ληφθεί ένα ομοιόμορφα συμπιεσμένο δείγμα, ο τριχοειδής σωλήνας πρέπει να πέφτει από ένα ύψος περίπου 700  mm μέσω ενός κατακόρυφου γυάλινου σωλήνα, πάνω σε ένα γιαλί ρολογιού.  Ο γεμισμένος τριχοειδής σωλήνας τοποθετείται στο λουτρό έτσι ώστε το μεσαίο τμήμα της λεκάνης υδραργύρου του θερμομέτρου να ακουμπά τον τριχοειδή σωλήνα στο τμήμα που ευρίσκεται το δείγμα. Συνήθως ο τριχοειδής σωλήνας εισάγεται στη συσκευή σε 10 K κάτω από τη θερμοκρασία τήξεως. Το υγρό λουτρό θερμαίνεται έτσι ώστε η ανύψωση της θερμοκρασίας να είναι περίπου 3 K/min. Το υγρό πρέπει να αναδεύεται. Στους 10  Κ περίπου κάτω από την αναμενόμενη θερμοκρασία τήξεως ο ρυθμός ανύψωσης της θερμοκρασίας ρυθμίζεται σε 1 K/min κατά ανώτατο όριο.  Υπολογισμός:Ο υπολογισμός της θερμοκρασίας τήξεως γίνεται όπως παρακάτω:T = TD + 0,00016 (TD   TE) ή όπου:Τ  = διορθωμένη θερμοκρασία τήξεως σε ΚΤD  = ένδειξη θερμοκρασίας θερμομέτρου D σε ΚΤΕ  = ένδειξη θερμοκρασίας θερμομέτρου Ε σε Κn  = αριθμός διαιρέσεων της υδραργυρικής στήλης του θερμομέτρου D στην εμβαπτισμένη λεκάνη.  1.6.1.2. Συσκευές θερμοκρασίας τήξεως με μεταλλικό κορμό  Συσκευή:  Η συσκευή αποτελείται από:- έναν κυλινδρικό μεταλλικό κορμό, το πάνω μέρος του οποίου είναι κοίλο και σχηματίζει ένα θάλαμο (βλέπε σχήμα 3)  - ένα μεταλλικό πώμα, με δύο ή περισσότερες τρύπες, που επιτρέπουν να εισαχθούν σωλήνες μέσα στο μεταλλικό κορμό - ένα σύστημα θέρμανσης, για το μεταλλικό κορμό, που επιτυγχάνεται για παράδειγμα με μία ηλεκτρική αντίσταση ενσωματωμένη στον κορμό  - ένα ροοστάτη για ρύθμιση της ισχύος, αν χρησιμοποιείται η ηλεκτρική θέρμανση  - τέσσερα παράθυρα, από γυαλί ανθεκτικό στη θερμότητα, πάνω στα όρθια τοιχώματα του θαλάμου, διαμετρικά τοποθετημένα σε ορθή γωνία μεταξύ τους. Εμπρός από το ένα από τα παράθυρα αυτά είναι στερεωμένος ένας προσοφθάλμιος φακός για παρατήρηση του τριχοειδή σωλήνα. Τα άλλα τρία παράθυρα χρησιμεύουν για το φωτισμό του εσωτερικού της διάταξης με λάμπες  - έναν τριχοειδή σωλήνα από γυαλί ανθεκτικό στη θερμότητα, κλειστό στη μία άκρη (βλέπε σημείο 1.6.1.1).  Θερμόμετρο:  Βλέπε τα πρότυπα που αναφέρονται στο 1.6.1.1. Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν και θερμοηλεκτρικές συσκευές μέτρησης με παρεμφερή ακρίβεια.  Εικόνα 3 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> 1.6.1.3. Προσδιορισμός με φωτοκύτταρο  Συσκευή και διαδικασία:Η συσκευή αποτελείται από ένα μεταλλικό θάλαμο με αυτόματο σύστημα θέρμανσης. Τρεις τριχοειδείς σωλήνες γεμίζονται σύμφωνα με το σημείο 1.6.1.1 και τοποθετούνται στον κλίβανο.Αρκετές γραμμικές αυξήσεις της θερμοκρασίας είναι διαθέσιμες για τη βαθμονόμηση της συσκευής, και η κατάλληλη ανύψωση της θερμοκρασίας ρυθμίζεται ηλεκτρικά σε μία προεπιλεγμένη σταθερή και γραμμική ταχύτητα. Οι καταγραφείς δείχνουν την πραγματική θερμοκρασία του κλίβανου και τη θερμοκρασία της ουσίας στους τριχοειδείς σωλήνες.  1.6.2. Θερμές επιφάνειες  1.6.2.1. Θερμή επιφάνεια KoflerΒλέπε προσάρτημα.  1.6.2.2. Μικροσκόπιο τήξεωςΒλέπε προσάρτημα.  1.6.2.3. Μέθοδος μηνίσκου (πολυαμίδια)Βλέπε προσάρτημα.  Η ταχύτητα θέρμανσης κατά τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας τήξεως θα πρέπει να είναι μικρότερη από 1 K/min.  1.6.3. Μέθοδοι προσδιορισμού της θερμοκρασίας πήξεωςΒλέπε προσάρτημα.  1.6.4. Θερμική ανάλυση  1.6.4.1. Διαφορική θερμική ανάλυσηΒλέπε προσάρτημα.  1.6.4.2. Θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσηςΒλέπε προσάρτημα.  1.6.5. Προσδιορισμός του σημείου ροήςΒλέπε προσάρτημα.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Σε ορισμένες περιπτώσεις είναι αναγκαία η διόρθωση του θερμομέτρου.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - η χρησιμοποιηθείσα μέθοδος  - επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις) και τυχόν προκαταρκτικό στάδιο καθαρισμού  - εκτίμηση της ακρίβειας (accuracy).  Ως θερμοκρασία τήξεως αναφέρεται ο μέσος όρος δύο τουλάχιστον μετρήσεων που είναι μέσα στην περιοχή της υπολογισθείσας ακρίβειας(βλέπε πίνακες).  Εάν η διαφορά μεταξύ της θερμοκρασίας στην αρχή και στο τελικό στάδιο τήξεως είναι μέσα στα όρια της ακρίβειας της μεθόδου, ως θερμοκρασία τήξεως λαμβάνεται η θερμοκρασία στο τελικό στάδιο τήξεως G διαφορετικά, καταγράφονται και οι δύο θερμοκρασίες.  Αν η ουσία αποσυντίθεται ή εξαχνούται πριν από τη θερμοκρασία τήξεως, η θερμοκρασία στην οποία παρατηρείται το γεγονός αυτό πρέπει να αναφέρεται .  Πρέπει να αναφέρονται όλες οι πληροφορίες και παρατηρήσεις που σχετίζονται με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.  (2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.  (3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.  (4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.  Προσάρτημα  Για πρόσθετες τεχνικές πληροφορίες, μπορούν για παράδειγμα να χρησιμοποιηθούν τα ακόλουθα πρότυπα.  1. Μέθοδοι τριχοειδούς  1.1. Συσκευές θερμοκρασίας τήξεως με υγρό λουτρό ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and melting range of organic chemicals BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range DIN 53181 Bestimmung der Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren.  JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products.  1.2. Συσκευές θερμοκρασίας τήξεως με μεταλλικό κορμό  DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen KunststoffenISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of «melting point»  2. Θερμές επιφάνειες  2.1. Θερμή ράβδος Kofler  ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommanded practices for testing polymeric powder coatings  2.2. Μικροσκόπιο τήξεως  DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen.  2.3. Μέθοδος μηνίσκου (πολυαμίδια)  ISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of «melting point»  ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resine injection moulding and extrusion materials NF T 51-050  Rιsines de polyamides. Dιtermination du «point de fusion». Mιthode du mιnisque  3. Μέθοδοι για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας πήξεως  BS 4633 Method for the determination of crystallizing point  BS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (cooling curve)  DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen  ISO 2207 Cires de pιtrole: dιtermination de la tempιrature de figeage.  DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsδuren  NF T 60-114 Point de fusion des paraffines  NF T 20-051 Mιthode de dιtermination du point de cristallisation (point de congιlation)  ISO 1392 Method for the determination of the freezing point. 4. Θερμική ανάλυση  4.1. Διαφορική θερμική ανάλυση  ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis  ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis  ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data  DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  4.2. Θερμιδομετρία διαφορικής σάρωσης  ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis  ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis  ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data  DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  5. Προσδιορισμός του σημείου ροής  NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pιtrole: point de trouble et point d'ιcoulement limite - Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt  ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils  ISO 3016 Petroleum oils - Determination of pour point.  Α.2. ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΖΕΣΕΩΣ  1. ΜΕΘΟΔΟΣ  Οι περισσότερες από τις περιγραφόμενες μεθόδους βασίζονται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ (1). Οι βασικές αρχές δίδονται στις παραπομπές (2) και (3). (1)   1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Οι μέθοδοι και οι συσκευές που περιγράφονται εδώ μπορούν να χρησιμοποιηθούν για υγρές και χαμηλού σημείου τήξεως ουσίες, υπό την προϋπόθεση ότι οι ουσίες αυτές δεν εμφανίζουν χημικές αντιδράσεις σε θερμοκρασία κάτω της θερμοκρασίας ζέσεως (π.χ.: αυτοξείδωση, αναδιάταξη, αποικοδόμηση, κ.λπ.). Οι μέθοδοι μπορούν να εφαρμοσθούν τόσο σε καθαρές, όσο και σε μη καθαρές υγρές ουσίες.  Έμφαση δίνεται στις μεθόδους που χρησιμοποιούν προσδιορισμό με φωτοκύτταρο και θερμική ανάλυση, διότι οι μέθοδοι αυτές επιτρέπουν τον προσδιορισμό τόσο της θερμοκρασίας τήξεως, όσο και της θερμοκρασίας ζέσεως. Επιπλέον, οι μετρήσεις μπορούν να γίνουν αυτόματα.  Η «δυναμική μέθοδος» έχει το πλεονέκτημα ότι μπορεί επίσης να εφαρμοσθεί στον προσδιορισμό της τάσης ατμών και ότι δεν χρειάζεται να διορθώνεται η θερμοκρασία ζέσεως σε κανονική πίεση (101,325 kPa) διότι η κανονική πίεση μπορεί να ρυθμιστεί κατά τη διάρκεια της μέτρησης με ένα μανόμετρο.  Παρατηρήσεις:  Η επίδραση των προσμείξεων στον προσδιορισμό της θερμοκρασίας ζέσεως εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη φύση της πρόσμειξης. Όταν στο δείγμα υπάρχουν πτητικές προσμείξεις, πράγμα που μπορεί να επηρεάσει τα αποτελέσματα, η ουσία μπορεί να καθαρισθεί.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Ως κανονική θερμοκρασία ζέσεως ορίζεται η θερμοκρασία στην οποία η τάση ατμών ενός υγρού είναι 101,325 kPa.  Αν η θερμοκρασία ζέσεως δεν μετράται σε κανονική ατμοσφαιρική πίεση, η εξάρτητη της τάσης ατμών από τη θερμοκρασία μπορεί να περιγραφεί με την εξίσωση Clausius-Clapeyron:  log p = 2,3 RTΔ Hv + σταθερά όπου:p = η τάση ατμών της ουσίας σε πασκάλΔΗν = η θερμότητα εξατμίσεως σε J mol 1R = η παγκόσμια σταθερά των αερίων = 8,314 J mol 1 K 1Τ = η θερμοδυναμική θερμοκρασία σε Κ  Κατά τη διάρκεια της μέτρησης η θερμοκρασία ζέσεως αναφέρεται σε σχέση με την ατμοσφαιρική πίεση.  Μετατροπές:  Πίεση (μονάδες: kPa)100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa(το «bar» επιτρέπεται ακόμη, αλλά δεν συνιστάται) G133 Pa = 1mm Hg = 1 Torr(οι μονάδες «mm Hg» και «Torr» δεν επιτρέπονται).1 atm = πρότυπη ατμόσφαιρα = 101 325 Pa(η μονάδα «atm» δεν επιτρέπεται).  Θερμοκρασία (μονάδες: Κ)t = T   273,15t: θερμοκρασία Κελσίου, βαθμός Κελσίου ( C)Τ: θερμοδυναμική θερμοκρασία, Κέλβιν (Κ)  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μια νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κυρίως για να ελέγχεται κατά διαστήματα η απόδοση της μεθόδου και για να γίνεται δυνατή η σύγκριση με τα αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.  Μερικές ουσίες βαθμονόμησης μπορούν να βρεθούν στις μεθόδους που περιλαμβάνονται στο Προσάρτημα.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ  Πέντε μέθοδοι για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας ζέσεως (περιοχής ζέσεως) βασίζονται στη μέτρηση της θερμοκρασίας ζέσεως, ενώ δύο άλλες βασίζονται στη θερμική ανάλυση.  1.4.1. Προσδιορισμός με τη χρήση ζεσεομέτρου  Τα ζεσεόμετρα αναπτύχθηκαν αρχικά για τον προσδιορισμό του μοριακού βάρους από την ανύψωση της θερμοκρασίας ζέσεως, είναι όμως επίσης κατάλληλα και για ακριβείς μετρήσεις της θερμοκρασίας ζέσεως. Μία πολύ απλή συσκευή περιγράφεται στο ASTM D 1120-72 (βλ. Προσάρτημα). Στη συσκευή αυτή το υγρό θερμαίνεται κάτω από συνθήκες ισορροπίας σε ατμοσφαιρική πίεση μέχρι να αρχίσει να βράζει.  1.4.2. Δυναμική μέθοδος  Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στη μέτρηση της θερμοκρασίας ανασυμπύκνωσης των ατμών με τη βοήθεια κατάλληλου θερμομέτρου στον κάθετο ψυκτήρα κατά τό βρασμό. Η πίεση στη μέθοδο αυτή μπορεί να μεταβάλλεται.  1.4.3. Μέθοδος απόσταξης για τη θερμοκρασία ζέσεως  Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην απόσταξη του υγρού και στη μέτρηση της θερμοκρασίας ανασυμπύκνωσης των ατμών και στον προσδιορισμό της ποσότητας του αποστάγματος.  1.4.4. Μέθοδος κατά Siwoloboff  Δείγμα θερμαίνεται σε σωλήνα δείγματος που είναι βυθισμένος σε θερμό υδρόλουτρο. Στο σωλήνα του δείγματος βυθίζεται συντηγμένο τριχοειδές που περιέχει στο κάτω άκρο μία φυσσαλίδα αέρα.  1.4.5. Προσδιορισμός με φωτοκύτταρο  Ακολουθώντας την αρχή κατά Siwoboloff, εκτελείται αυτόματη φωτοηλεκτρική μέτρηση χρησιμοποιώντας τις ανερχόμενες φυσαλλίδες.  1.4.6. Διαφορική θερμική ανάλυση  Στην τεχνική αυτή καταγράφεται η διαφορά θερμοκρασιών μεταξύ της ουσίας και ενός υλικού αναφοράς ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, ενώ η ουσία και το υλικό αναφοράς υποβάλλονται στο ίδιο ελεγχόμενο θερμοκρασιακό πρόγραμμα. Όταν το δείγμα υφίσταται κάποια μετατροπή που περιλαμβάνει μεταβολή της ενθαλπίας, η μεταβολή αυτή καταδεικνύεται από μία ενδόθερμη απόκλιση (ζέση) από τη βασική γραμμή της θερμοκρασίας που έχει καταγραφεί.  1.4.7. Σάρωση διαφορικής θερμιδομετρίας  Στην τεχνική αυτή καταγράφεται η διαφορά ενεργειακής απολαβής μιας ουσίας και ενός υλικού αναφοράς ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, ενώ η ουσία και το υλικό αναφοράς υποβάλλονται στο ίδιο ελεγχόμενο θερμοκρασιακό πρόγραμμα. Η ενέργεια αυτή είναι η ενέργεια που χρειάζεται για την επίτευξη μηδενικής θερμοκρασιακής διαφοράς μεταξύ της ουσίας και του υλικού αναφοράς. Όταν το δείγμα υφίσταται κάποια μετατροπή που περιλαμβάνει μεταβολή της ενθαλπίας, η μεταβολή αυτή καταδεικνύεται από μία ενδόθερμη απόκλιση (ζέση) από τη βασική γραμμή της ροής θερμότητας που έχει καταγραφεί.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Το πεδίο εφαρμογής και η ακρίβεια των διαφόρων μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας ζέσεως/περιοχής ζέσεως περιλαμβάνονται στον Πίνακα 1.  >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ  Η πειραματική διαδικασία μερικών από τις μεθόδους δοκιμής περιγράφεται σε διεθνή και εθνικά πρότυπα (βλέπε Προσάρτημα).  1.6.1. ΖεσεόμετροΒλέπε Προσάρτημα.  1.6.2. Δυναμική μέθοδοςΒλέπε μέθοδο ελέγχου στο σημείο Α.4 για τον προσδιορισμό της τάσεως ατμών. Καταγράφεται η θερμοκρασία ζέσεως που παρατηρείται με εφαρμογή της πίεσης 101,325 kPa.  1.6.3. Διαδικασία απόσταξης (περιοχή ζέσως)Βλέπε Προσάρτημα.  1.6.4. Μέθοδος κατά SiwoloboffΤο δείγμα θερμαίνεται σε συσκευή θερμοκρασίας τήξεως μέσα σε σωλήνα δείγματος, με διάμετρο περίπου 5 mm (εικόνα 1).  Στην εικόνα 1 εικονίζεται ένας τύπος πρότυπης συσκευής θερμοκρασίας τήξεως και ζέσεως (JIS K 0064) (κατασκευασμένης από γυαλί, όλες οι διαστάσεις σε χιλιοστόμετρα).  Εικόνα 1  >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Α: Δοχείο μέτρησηςΒ: ΠώμαC: ΑερισμόςD: ΘερμόμετροΕ: Βοηθητικό θερμόμετροF: Υγρό λουτρόG: Σωλήνας δείγματος με εξωτερική διάμετρο 5 mm κατ'ανώτατο όριο G περιέχων τριχοειδή σωλήνα, μήκους περίπου 100 mm, εσωτερικής διαμέτρου περίπου 1 mm και πάχους τοιχώματος περίπου 0,2 έως 0,3 mmH: Πλευρικός σωλήνας  Ένας τριχοειδής σωλήνας (τριχοειδές ζέσεως), συντετηγμένος περίπου 1 cm πάνω από το κατώτατο σημείο του, φέρεται μέσα στο σωλήνα δείγματος. Το επίπεδο μέχρι το οποίο προστίθεται η ελεγχόμενη ουσία είναι τέτοιο ώστε η συντετηγμένη τομή του τριχοειδή σωλήνα να είναι κάτω από την επιφάνεια του υγρού. Ο σωλήνας δείγματος που περιέχει το τριχοειδές ζέσεως στερεώνεται είτε πάνω στο θερμόμετρο με έναν ελαστικό σύνδεσμο είτε σε ένα πλευρικό υποστήριγμα (βλέπε εικόνα 2).  Εικόνα 2 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Αρχή κατά Siwoloboff  Εικόνα 3 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Τροποποιημένη αρχή  Το υγρό λουτρό επιλέγεται ανάλογα με τη θερμοκρασία ζέσεως. Για θερμοκρασίες μέχρι 573 Κ, μπορεί να χρησιμοποιηθεί έλαιο σιλικόνης. Υγρή παραφίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο μέχρι τους 473 Κ. Η θέρμανση του λουτρού θα πρέπει να ρυθμίζεται έτσι ώστε αρχικά η ανύψωση της θερμοκρασίας να γίνεται με ταχύτητα 3 K/min. Το λουτρό πρέπει να αναδεύεται. Στους 10 Κ περίπου κάτω από την αναμενόμενη θερμοκρασία ζέσεως, η θέρμανση ελαττώνεται έτσι ώστε η ταχύτητα ανύφωσης της θερμοκρασίας να είναι λιγότερο από 1 K/min. Όταν προσεγγίζεται η θερμοκρασία ζέσεως, από το τριχοειδές ζέσεως αρχίζουν να βγαίνουν με ταχύτητα φυσαλλίδες.  Η θερμοκρασία ζέσεως είναι η θερμοκρασία εκείνη στην οποία, σε στιγμιαία ψύξη, σταματάει η αλυσίδα των φυσαλλίδων και αρχίζει να ανέρχεται ξαφνικά υγρό μέσα στο τριχοειδές. Η αντίστοιχη ένδειξη του θερμομέτρου είναι η θερμοκρασία ζέσεως της ουσίας.  Στην τροποποιημένη αρχή (εικόνα 3) η θερμοκρασία ζέσεως προσδιορίζεται σε τριχοειδή σωλήνα θερμοκρασίας τήξεως. Ο σωλήνας αυτός καταλήγει σε ένα λεπτό άκρο μήκους περίπου 2 cm (α) και αναρροφάται μικρή ποσότητα του δείγματος. Το ανοικτό άκρο του λεπτού τριχοειδούς κλείνεται με σύντηξη έτσι ώστε να εγκλωβισθεί στην άκρη μία μικρή φυσαλλίδα αέρα. Κατά τη θέρμανση στη συσκευή θερμοκρασίας τήξεως (b), η φυσαλλίδα του αέρα διαστέλλεται. Η θερμοκρασία ζέσεως αντιστοιχεί στη θερμοκρασία στην οποία η υπό μορφή πώματος ουσία φθάνει στο επίπεδο της επιφάνειας του λουτρού (c).  1.6.5. Προσδιορισμός με φωτοκύτταρο  Το δείγμα θερμαίνεται μέσα σε τριχοειδή σωλήνα σε θερμαινόμενο μεταλλικό κορμό (θάλαμο).  Δέσμη φωτός κατευθύνεται, μέσω κατάλληλων οπών στον κορμό, διαμέσου της ουσίας ό ένα βαθμονομημένο με ακρίβεια φωτοκύτταρο.  Κατά την αύξηση της θερμοκρασίας του δείγματος, από το τριχοειδές ζέσεως αναδύονται μεμονωμένες φυσαλλίδες αέρα. Όταν η θερμοκρασία φθάσει στη θερμοκρασία ζέσεως ο αριθμός των φυσαλλίδων αυξάνει σε μεγάλο βαθμό. Το γεγονός αυτό προκαλεί μεταβολή στην ένταση του φωτός, που καταγράφεται από ένα φωτοκύτταρο και δίνει σήμα «stop» στο δείκτη ανάγνωσης της θερμοκρασίας ενός θερμομέτρου με αντίσταση από λευκόχρυσο που βρίσκεται στον κορμό.  Η μέθοδος αυτή είναι ιδιαίτερα χρήσιμη διότι επιτρέπει την πραγματοποίηση προσδιορισμών σε θερμοκρασίες κάτω από τη θερμοκρασία δωματίου και μέχρι τους 253,15 Κ ( 20  C) χωρίς καμμία αλλαγή στη συσκευή. Απλώς το όργανο πρέπει να τοποθετηθεί σε λουτρό ψύξης.  1.6.6. Θερμική ανάλυση  1.6.6.1. Διαφορική θερμική ανάλυσηΒλέπε Προσάρτημα.  1.6.6.2. Σάρωση διαφορικής θερμιδομετρίαςΒλέπε Προσάρτημα.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Για μικρές αποκλίσεις από την κανονική πίεση (μέγιστο ± 5 kPa), οι θερμοκρασίες ζέσεως ανάγονται σε κανονικές Τn με τη βοήθεια της παρακάτω εξίσωσης αριθμών-τιμών του Sidney Young:Tn = T + (fT Χ Δ p) όπου:  Δp = (101,325 p) [σημείωση συμβόλου]p = μέτρηση πίεσης σε kPa,fΤ = ταχύτητα μεταβολής της θερμοκρασίας ζέσεως με την πίεση σε Κ/kPaΤ = μετρούμενη θερμοκρασία ζέσεως σε ΚΤn = θερμοκρασία ζέσεως διορθωμένη σε κανονική πίεση σε Κ Οι συντελεστές διόρθωσης της θερμοκρασίας fΤ και οι εξισώσεις για τις προσεγγίσεις τους συμπεριλαμβάνονται στα διεθνή και εθνικά πρότυπα που προαναφέρθηκαν για πολλές ουσίες.  Η μέθοδος DIN 53171, π.χ., μνημονεύει τις ακόλουθες κατά προσέγγιση διορθώσεις για διαλύτες που περιλαμβάνονται στα χρώματα: >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - τη χρησιμοποιηθείσα μέθοδο,- επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις) και προκαταρκτικό στάδιο καθαρισμού, εφόσον υπάρχει,- εκτίμηση της ορθότητας.  Ως θερμοκρασία ζέσεως αναφέρεται ο μέσος όρος δύο τουλάχιστον μετρήσεων που είναι μέσα στα όρια της εκτιμώμενης ακρίβειας (βλέπε Πίνακα 1).  Πρέπει να δηλώνονται οι μετρηθείσες θερμοκρασίες ζέσεως και ο μέσος όρος τους, οι δε πιέσεις στις οποίες έγιναν οι μετρήσεις πρέπει να αναφέρονται σε kPa. Η πίεση θα πρέπει κατά προτίμηση να είναι κοντά στην κανονική ατμοσφαιρική πίεση.  Πρέπει να αναφέρεται κάθε πληροφορία ή παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 final.  (2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II.  (3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.  Προσάρτημα  Για πρόσθετες τεχνικές πληροφορίες, μπορούν για παράδειγμα να χρησιμοποιηθούν τα ακόλουθα πρότυπα:  1. Ζεσεόμετρο  ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes  2. Μέθοδος απόσταξης (περιοχή ζέσεως)  ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)  BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products  BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics  DIN 53171 Lφsungmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes  NF T 20-608 Distillation: dιtermination du rendement et de l'intervalle de distillation  3. Διαφορική θερμική ανάλυση και σάρωση διαφορικής θερμιδομετρίας  ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis  ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis  ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data  DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe  Α.3. ΣΧΕΤΙΚΗ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  Οι περιγραφόμενες μέθοδοι βασίζονται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ (1). Οι βασικές αρχές δίδονται στη βιβλιογραφία (2). (1)   1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗΟι μέθοδοι για τον προσδιορισμό της σχετικής πυκνότητας που περιγράφονται εδώ εφαρμόζονται σε στερεές και υγρές ουσίες, χωρίς οποιονδήποτε περιορισμό σχετικά με το βαθμό καθαρότητάς τους. Οι διάφορες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται αναφέρονται στον πίνακα 1.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Σχετική πυκνότητα, D420 των στερεών ή των υγρών είναι ο λόγος της μάζας ενός όγκου της εξεταζόμενης ουσίας προσδιορισμένου στους 20  C, προς τη μάζα ίσου όγκου νερού, προσδιορισμένου στους 4  C. Η σχετική πυκνότητα δεν έχει διαστάσεις.  Πυκνότητα, ρ, μιας ουσίας είναι το πηλίκον της μάζας, m, προς τον όγκο, v.  Η πυκνότητα, ρ, εκφράζεται, σε μονάδες SI, σε Kg/m3.  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ (1) (3) (1) (3)   Δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κυρίως για να ελέγχεται κατά διαστήματα η μέθοδος που εφαρμόζεται και για να γίνεται δυνατή η σύγκριση με αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ  Χρησιμοποιούνται τέσσερεις τάξεις μεθόδων.  1.4.1. Μέθοδοι άνωσης  1.4.1.1. Υδρόμετρο (για υγρές ουσίες)  Ικανοποιητική ακρίβεια και γρήγοροι προσδιορισμοί της πυκνότητας επιτυγχάνονται με τα επιπλέοντα υδρόμετρα, τα οποία επιτρέπουν την εκτίμηση της πυκνότητας ενός υγρού από το βάθος που βυθίζονται και με ανάγνωση σε βαθμολογημένη κλίμακα.  1.4.1.2. Υδροστατικός ζυγός (για υγρές και στερεές ουσίες)  Η διαφορά μεταξύ των βαρών ενός εξεταζόμενου δείγματος όταν μετριέται στον αέρα και σε κατάλληλο υγρό (π.χ. νερό) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της πυκνότητάς του.  Στα στερεά, η μετρούμενη πυκνότητα είναι αντιπροσωπευτική μόνο του συγκεκριμένου δείγματος. Για τον προσδιορισμό της πυκνότητας υγρών, σώμα γνωστού όγκου, v, ζυγίζεται πρώτα στον αέρα και κατόπιν στο υγρό.  1.4.1.3. Μέθοδος βυθιζόμενου σώματος (για υγρές ουσίες) (4) (4)   Με τη μέθοδο αυτή, η πυκνότητα ενός υγρού προσδιορίζεται από τη διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων της ζύγισης του υγρού πριν και μετά τη βύθιση ενός σώματος γνωστού όγκου στο εξεταζόμενο υγρό.  1.4.2. Μέθοδοι πυκνομέτρου  Για στερεά ή υγρά μπορούν να χρησιμοποιηθούν πυκνόμετρα διαφόρων σχημάτων με γνωστούς όγκους. Η πυκνότητα υπολογίζεται από τη διαφορά βάρους του γεμάτου και του άδειου πυκνόμετρου και από το γνωστό όγκο του.  1.4.3. Συγκριτικά πυκνόμετρα αέρα (για στερεά)  Η πυκνότητα ενός στερεού, οποιασδήποτε μορφής, μπορεί να μετρηθεί σε θερμοκρασία δωματίου με το συγκριτικό πυκνόμετρο αέρα. Ο όγκος μιας ουσίας μετριέται στον αέρα ή σε ένα αδρανές αέριο, σε έναν κύλινδρο μεταβλητά βαθμονομημένου όγκου. Για τον υπολογισμό της πυκνότητας γίνεται μια μέτρηση μάζας, αφού πρώτα γίνει η μέτρηση του όγκου.  1.4.4. Πυκνόμετρο ταλάντωσης (5) (6) (7) (5) (6) (7)   Η πυκνότητα ενός υγρού μπορεί να μετρηθεί με ένα πυκνόμετρο ταλάντωσης. Μηχανικός ταλαντωτής σε σχήμα σωλήνα U δονείται στη συχνότητα συντονισμού του ταλαντωτή που εξαρτάται από τη μάζα του. Η εισαγωγή του δείγματος αλλάζει τη συχνότητα συντονισμού του ταλαντωτή. Η συσκευή πρέπει να βαθμονομείται με δύο υγρές ουσίες γνωστών πυκνοτήτων. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να επιλέγονται, κατά προτίμηση, έτσι ώστε οι πυκνότητές τους να καλύπτουν την περιοχή που πρόκειται να μετρηθεί.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Το πεδίο εφαρμογής των διαφόρων μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της σχετικής πυκνότητας παρατίθενται στον πίνακα.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ  Τα πρότυπα που δίνονται σαν παραδείγματα, και που πρέπει να συμβουλεύονται για πρόσθετες τεχνικές λεπτομέρειες, αναφέρονται στο Προσάρτημα.  Οι δοκιμές πρέπει να εκτελούνται στους 20  C με διεξαγωγή τουλάχιστον δύο μετρήσεων.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑΒλέπε πρότυπα.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - χρησιμοποιηθείσα μέθοδο,- επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις) και καθαρισμού, εφόσον υπάρχει. Η σχετική πυκνότητα D420 πρέπει να αναφέρεται όπως ορίζεται στο 1.2, μαζί με τη φυσική κατάσταση της εξεταζόμενης ουσίας.  Πρέπει να αναφέρεται κάθε πληροφορία και παρατήρηση που έχει σχέση με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.  >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.  (2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.  (3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.  (4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flόssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.11, 427-430.  (5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flόssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302.  (6) Baumgarten, D., Fόllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen - Verfahren zur Dichtebestimmung bei flόssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.  (7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.  Προσάρτημα  Για πρόσθετες τεχνικές πληροφορίες, μπορούν για παράδειγμα να χρησιμοποιηθούν τα ακόλουθα πρότυπα:  1. ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΩΣΗΣ  1.1. Υδρόμετρο  DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions  DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, adjustment and use   Part II: Density hydrometers; standardized sizes, designation   Part III: Use and test  ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrometers for general purpose  NF T 20-050 Chemical products for industrial use - Determination of density of liquids - Areometric method  DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydrometers  1.2. Υδροστατικός ζυγός  Για στερεές ουσίες  ISO 1183 Method A: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics  NF T 20-049 Chemical products for industrial use - Determination of the density of solids other than powders and cellular products - Hydrostatic balance method  ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by displacement  DIN 53479 Testing of plastics and elastometers; determination of density  Για υγρές ουσίες  ISO 901 ISO 758  DIN 51757 Testing of mineral oils and related materials; determination of density  ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 and ASTM D 1481-62  ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method  BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method  1.3. Μέθοδος βυθιζόμενου σώματος  DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar coating materials; determination of density; immersed body method  2. ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΥΚΝΟΜΕΤΡΟΥ  2.1. Για υγρές ουσίες  ISO 3507 Pycnometers  ISO 758 Liquid chemical products; determination of density at 20  C  DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile liquids which are not too viscous)  DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10 6 m2 s 1 at 15  C)  DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 12798)  DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with a kinematic viscosity of less than 100,10 6 m2 s 1 at 20  C, applicable in particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approximately 1 bar at 90  C)  DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids of all types which do not have too high a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in DIN 12801)  DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for ethanol-water mixture)  DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube (for liquids which are not too viscous)  DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar products; determination of density by pycnometer  DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and related materials; determination of density  ASTM D 297 Section 15: Rubber products - chemical analysis  ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compounds  BS 4699 Method for determination of specific gravity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method)  BS 5903 Method for determination of relative density and density of petroleum products by the capillary-stoppered pycnometer method  NF T 20-053 Chemical products for industrial use - Determination of density of solids in powder and liquids - Pyknometric method  2.2. Για στερεές ουσίες  ISO 1183 Method B: Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics.  NF T 20-053 Chemical products for industrial use - Determination of density of solids in powder and liquids - Pyknometric method  DIN 19683 Determination of the density of soils  3. ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟ ΠΥΚΝΟΜΕΤΡΟ ΑΕΡΑ  DIN 55990 Part 3: Prόfung von Anstrichstoffen und δhnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der Dichte  DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; Prόfung  Α.4. ΤΑΣΗ ΑΤΜΩΝ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  Οι περισσότερες από τις περιγραφόμενες μεθόδους βασίζονται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ (1). Οι βασικές αρχές δίδονται στα σημεία (2) και (3) της βιβλιογραφίας. (1)   1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Για την εκτέλεση της δοκιμής αυτής, χρήσιμο είναι να έχουμε προκαταρκτικές πληροφορίες για τη δομή, τη θερμοκρασία τήξεως και τη θερμοκρασία ζέσεως της ουσίας. Δεν υπάρχει ενιαία πειραματική διαδικασία μέτρησης που να μπορεί να εφαρμοσθεί σε όλη την κλίμακα των τιμών της τάσης ατμών. Συνεπώς, αρκετές μέθοδοι συνιστάται να χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση τάσεως ατμών στην περιοχή από ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ  1.6.1. Δυναμική μέτρηση  1.6.1.1. Συσκευή  Η συσκευή προσδιορισμού αποτελείται συνήθως από δοχείο ζέσεως με γυάλινο ή μεταλλικό ψυκτήρα (εικόνα 1), εξάρτημα μέτρησης της θερμοκρασίας και εξάρτημα ρύθμισης και μέτρησης της πίεσης. Μία τυπική συσκευή προσδιορισμού που εικονίζεται στο σχήμα είναι κατασκευασμένη από πυρίμαχο γυαλί και αποτελείται από πέντε μέρη:  Ο μεγάλος σωλήνας με μερικώς διπλά τοιχώματα αποτελείται από μια εσμυρισμένη βαλβίδα, ένα ψυκτήρα, ένα δοχείο ψύξης και μία εισαγωγή.  Ο γυάλινος κύλινδρος, με την αντλία Cottrell, είναι τοποθετημένος στο τμήμα ζέσεως του σωλήνα και έχει τραχεία επιφάνεια από τρίμματα γυαλιού προς αποφυγή εκτινάξεων κατά τη διάρκεια του βρασμού.  Η θερμοκρασία μετριέται με κατάλληλο αισθητήρα θερμοκρασίας (π.χ. θερμόμετρο αντίστασης, θερμοστοιχείο επένδυσης) βυθισμένο στη συσκευή στο σημείο μέτρησης (σημείο 5, εικόνα 1) μέσω κατάλληλης εισαγωγής (π.χ. εσμυρισμένη σύνδεση).  Στο εξάρτημα ρύθμισης και μέτρησης της πίεσης γίνονται οι κατάλληλες συνδέσεις.  Η βαλβίδα, που παίζει το ρόλο ρυθμιστή του όγκου, συνδέεται με τη συσκευή μέτρησης μέσω τριχοειδούς σωλήνα.  Το δοχείο ζέσεως θερμαίνεται με ένα θερμαντικό στοιχείο (π.χ. θερμομανδύα) που εισάγεται στη γυάλινη συσκευή από το κάτω μέρος. Το απαιτούμενο ρεύμα θέρμανσης παρέχεται και ρυθμίζεται μέσω θερμοστοιχείου.  Το αναγκαίο κενό μεταξύ 102 Pa και 105 Pa περίπου, επιτυγχάνεται με μια αντλία κενού.  Υπάρχει κατάλληλη βαλβίδα για την παροχή αέρα ή αζώτου για τη ρύθμιση της πίεσης (περιοχή μέτρησης περίπου 102 έως 105 Pa) και για αερισμό.Η πίεση μετριέται με μανόμετρο.  1.6.1.2. Διαδικασία μέτρησης  Η τάση ατμών μετριέται προσδιορίζοντας τη θερμοκρασία ζέσεως του δείγματος σε διάφορες συγκεκριμένες πιέσεις μεταξύ περίπου 103 και 105. Σταθερή θερμοκρασία υπό σταθερή πίεση δείχνει ότι φθάσαμε στη θερμοκρασία ζέσεως. Με τη μέθοδο αυτή δεν μπορούν να εξετασθούν αφρίζουσες ουσίες.Η ουσία τοποθετείται σ'ένα καθαρό, ξηρό δοχείο δείγματος. Για μη κονιοποιημένα στερεά μπορεί να προκύψουν κάποια προβλήματα αλλά αυτά μπορούν, μερικές φορές, να λυθούν με θέρμανση του ψυκτήρα. Όταν πληρωθεί το δοχείο, η συσκευή κλείνεται αεροστεγώς με φλάντζα και η ουσία απαερώνεται. Η πίεση κατόπιν ρυθμίζεται στο χαμηλότερο επιθυμητό σημείο και τίθεται σε λειτουργία το σύστημα θέρμανσης. Ταυτόχρονα, ο αισθητήρας θερμοκρασίας συνδέεται με ένα καταγραφέα.  Όταν υπό σταθερή πίεση σημειωθεί σταθερή θερμοκρασία ζέσεως τότε έχει επιτευχθεί ισορροπία. Οταίτερη φροντίδα πρέπει να λαμβάνεται για να αποφεύγονται εκτινάξεις κατά τη διάρκεια του βρασμού. Όταν προσδιορίζεται η τάση ατμών στερεών χαμηλού σημείου τήξεως, πρέπει να λαμβάνεται φροντίδα να αποφεύγεται τυχόν φράξιμο του συμπυκνωτή.  Μετά την καταγραφή αυτού του σημείου ισορροπίας, η πίεση ρυθμίζεται σε υψηλότερη τιμή. Η διαδικασία συνεχίζεται με τον ίδιο τρόπο μέχρις ότου να φθάσουμε στην τιμή των 105 Pa. (περίπου 5 ώς 10 σημεία μέτρησης συνολικά). Στη δοκιμή ελέγχου, πρέπει να ακολουθηθεί αντίθετη πορεία μειώνοντας τις τιμές της πίεσης και επιτυγχάνοντας τα ίδια σημεία ισορροπίας.  1.6.2. Στατική ρύθμιση  1.6.2.1. Συσκευή  Η συσκευή περιλαμβάνει δοχείο δείγματος, σύστημα θέρμανσης και σύστημα ψύξης για τη ρύθμιση της θερμοκρασίας του δείγματος και τη μέτρηση της θερμοκρασίας. Η συσκευή περιλαμβάνει επίσης όργανα ρύθμισης και μέτρησης της πίεσης. Στις εικόνες 2α και 2β απεικονίζονται οι βασικές αρχές.  Ο θάλαμος του δείγματος (εικόνα 2α) συνδέεται από τη μία πλευρά με μία κατάλληλη βαλβίδα υψηλού κενού. Από την άλλη πλευρά συνδέεται σωλήνας σχήματος U που περιέχει κατάλληλο μανομετρικό υγρό. Το ένα άκρο του U-οειδούς σωλήνα διακλαδίζεται προς την αντλία κενού, τον κύλινδρο αζώτου ή βαλβίδα εξαερισμού και ένα μανόμετρο.  Αντί U-οειδούς σωλήνα μπορεί να χρησιμοποιηθεί μετρητής πίεσης με δείκτη πίεσης (εικόνα 2β).Για να ρυθμίζεται η θερμοκρασία του δείγματος, το δοχείο δείγματος με τη βαλβίδα και τον U-οειδή σωλήνα ή τον μετρητή πίεσης τοποθετείται σε λουτρό που διατηρείται σε σταθερή θερμοκρασία ± 0,2 Κ. Οι μετρήσεις της θερμοκρασίας πραγματοποιούνται στο εξωτερικό τοίχωμα του δοχείου που περιέχει το δείγμα ή μέσα στο ίδιο το δοχείο.  Για την εκκένωση της συσκευής χρησιμοποιείται αντλία κενού με παγίδα ψύξης αντίθετου ρεύματος.  Στη μέθοδο 2α η τάση ατμών της ουσίας μετριέται έμμεσα χρησιμοποιώντας δείκτη μηδενός. Στην περίπτωση αυτή λαμβάνεται υπόψη το γεγονός ότι η πυκνότητα του υγρού στον U-οειδή σωλήνα μεταβάλλεται αν μεταβληθεί σημαντικά η θερμοκρασία.  Ως δείκτες μηδενός για U-οειδή σωλήνα, ανάλογα με την κλίμακα πίεσης και τη χημική συμπεριφορά της εξετάζομενης ουσίας, είναι κατάλληλα τα ακόλουθα υγρά: υδράργυρος, έλαια σιλικόνης, φθαλικά άλατα. Η υπό δοκιμή ουσία δεν πρέπει να διαλύεται σε μεγάλο βαθμό ή να αντιδρά με το υγρό του U-οειδή σωλήνα.  Για το μανόμετρο ο υδράργυρος μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μία περιοχή κανονικής ατμοσφαιρικής πίεσης μέχρι 102 Pa, ενώ τα έλαια σιλικόνης και τα φθαλικά είναι κατάλληλα από 102 Pa μέχρι 10 Pa. Μπορούν ακόμη να χρησιμοποιηθούν σε τιμές κάτω των 10 1 Pa μανόμετρα μεμβράνης. Υπάρχουν και άλλοι μετρητές πίεσης που μπορούν να χρησιμοποιηθούν κάτω των 102 Pa. 1.6.2.2. Διαδικασία μέτρησης  Πριν από τη διεξαγωγή της μέτρησης, όλα τα εξαρτήματα της συσκευής που εικονίζεται στην εικόνα 2 πρέπει να καθαρίζονται και να ξηραίνονται επισταμένα.  Στη μέθοδο 2α, ο U-οειδής σωλήνας γεμίζεται με το επιλεγμένο υγρό, που πρέπει να απαερώνεται σε υψηλή θερμοκρασία πριν γίνουν οι μετρήσεις.  Η υπό δοκιμή ουσία τοποθετείται στη συσκευή, που κατόπιν κλείνεται και η θερμοκρασία μειώνεται σε βαθμό επαρκή για απαέρωση. Η θερμοκρασία πρέπει να είναι αρκετά χαμηλή ώστε να εξασφαλίζεται ότι αναρροφάται ο αέρας, όμως - στην περίπτωση συστήματος πολλών συστατικών - δεν πρέπει να αλλοιώνεται η σύνθεση του υλικού. Εφόσον απαιτείται, η ισορροπία μπορεί να αποκαθίσταται γρηγορότερα με ανάδευση.  Το δείγμα μπορεί να υπερψυχθεί με π.χ. υγρό άζωτο (προνοούμε ώστε να αποφευχθεί συμπύκνωση του αέρα ή υγρό αντλίας) ή μείγμα αιθανόλης και ξηρού πάγου. Για μετρήσεις σε χαμηλές θερμοκρασίες χρησιμοποιείται θερμοκρασιακά ρυθμιζόμενο λουτρό που συνδέεται με διάταξη υπέρψυξης.  Με ανοικτή τη βαλβίδα πάνω από το δοχείο δείγματος, εφαρμόζεται για μερικά λεπτά αναρρόφηση για να απομακρυνθεί ο αέρας. Η βαλβίδα κατόπιν κλείνεται και η θερμοκρασία του δείγματος μειώνεται στο χαμηλότερο επιθυμητό επίπεδο. Εφόσον απαιτείται, η απαέρωση πρέπει να επαναλαμβάνεται αρκετές φορές.  Όταν το δείγμα θερμαίνεται η τάση ατμών αυξάνεται. Έτσι μεταβάλλεται η ισορροπία του υγρού στον U-οειδή σωλήνα. Για εξουδετέρωση αυτής της μεταβολής, άζωτο ή αέρας αφήνεται να εισέλθει στη συσκευή μέσω βαλβίδας μέχρι που ο δείκτης πίεσης (το υγρό) να είναι πάλι στο μηδέν. Η πίεση που απαιτείται για το σκοπό αυτό μπορεί να εξακριβωθεί με ένα μανόμετρο ακριβείας σε θερμοκρασία δωματίου. Η πίεση αυτή αντιστοιχεί στην τάση ατμών της ουσίας στη συγκεκριμένη αυτή θερμοκρασία μέτρησης.  Η μέθοδος 2β είναι παρόμοια εκτός από το ότι η τάση ατμών μετράται απευθείας.  Η εξάρτηση της τάσης ατμών από τη θερμοκρασία προσδιορίζεται σε κατάλληλα μικρά διαστήματα θερμοκρασίας (περίπου 5 έως 10 σημεία μέτρησης συνολικά) μέχρι το επιθυμητό ανώτατο σημείο. Αναγνώσεις σε χαμηλές θερμοκρασίες πρέπει να επαναλαμβάνονται ως δοκιμές ελέγχου.  Αν οι τιμές που λαμβάνονται από τις επαναλαμβανόμενες αναγνώσεις δεν συμπίπτουν με την καμπύλη που λαμβάνεται όταν αυξάνεται η θερμοκρασία, αυτό μπορεί να οφείλεται σε έναν από τους ακόλουθους λόγους:  1. Το δείγμα περιέχει ακόμη αέρα (π.χ. υλικά υψηλού ιξώδους) ή ουσίες χαμηλού σημείου ζέσεως, που απελευθερώνονται κατά τη θέρμανση και μπορούν να απομακρυνθούν με αναρρόφηση μετά από περαιτέρω υπέρψυξη.  2. Η θερμοκρασία ψύξης δεν είναι αρκετά χαμηλή. Στην περίπτωση αυτή, ως ψυκτικό μέσον χρησιμοποιείται υγρό άζωτο.  Αν συμβαίνει είτε η πρώτη είτε η δεύτερη περίπτωση, οι μετρήσεις πρέπει να επαναληφθούν.  3. Η ουσία υφίσταται χημική αντίδραση στη διερευνώμενη περιοχή θερμοκρασιών (π.χ. αποσύνθεση, πολυμερισμό).  1.6.3. Ισοτενισκόπιο  Πλήρης περιγραφή της μεθόδου αυτής υπάρχει στην παραπομπή (7). Η  αρχή της συσκευής μέτρησης εμφανίζεται στην εικόνα 3. Όπως και η στατική μέθοδος που περιγράφεται στο σημείο 1.6.2, το ισοτενισκόπιο είναι κατάλληλο για τη διερεύνηση στερεών και υγρών.  Στην περίπτωση των υγρών, σαν υγρό στο βοηθητικό μανόμετρο χρησιμεύει η ίδια η ουσία. Ποσότητα του υγρού, επαρκής για την πλήρωση της φούσκας και του μικρού σκέλους του μανομέτρου, φέρεται στο ισοτενισκόπιο. Το ισοτενισκόπιο συνδέεται με σύστημα κενού και εκκενώνεται, κατόπιν πληρούται με άζωτο. Η εκκένωση και ο καθαρισμός του συστήματος επαναλαμβάνεται δύο φορές για να απομακρυνθεί το εναπομένον οξυγόνο. Το γεμάτο ισοτενισκόπιο τοποθετείται σε οριζόντια θέση έτσι ώστε το δείγμα να απλωθεί σε μορφή λεπτής στιβάδας στη φούσκα και στο μανόμετρο (τμήμα U). Η πίεση του συστήματος ελαττώνεται στα 133 Pa και το δείγμα θερμαίνεται ήπια μέχρι μόλις να αρχίσει να βράζει (απομάκρυνση των διαλυμένων αερίων). Το ισοτενισκόπιο τοποθετείται κατόπιν έτσι ώστε το δείγμα να επιστρέφει στη φούσκα και στο κοντό σκέλος του μανομέτρου, έτσι ώστε και τα δύο να γεμισθούν τελείως με υγρό. Η πίεση διατηρείται όσο χρειάζεται για απαέρωση G το προεξέχον άκρο της φούσκας θερμαίνεται με μία μικρή φλόγα μέχρι που ο απελευθερούμενος ατμός του δείγματος να αυξηθεί αρκετά ώστε να εκτοπίσει μέρος του δείγματος από το πάνω μέρος της φούσκας και του μανομετρικού βραχίονα στο μανομετρικό τμήμα του ισοτενισκοπίου, δημιουργώντας ένα χώρο γεμάτο με ατμό και ελεύθερο απο άζωτο.  Το ισοτενισκόπιο τοποθετείται κατόπιν σε λουτρό σταθερής θερμοκρασίας, και η πίεση του αζώτου ρυθμίζεται μέχρις ότου η πίεση του να είναι ίση με την πίεση του δείγματος. Η εξίσωση των πιέσεων γίνεται αντιληπτή από το μανομετρικό τμήμα του ισοτενισκοπίου. Κατά την ισορροπία, η τάση ατμών του αζώτου είναι ίση με την τάση ατμών της ουσίας.  Στην περίπτωση των στερεών, ανάλογα με την πίεση και τη θερμοκρασία, χρησιμοποιούνται τα μανομετρικά υγρά που αναφέρονται στο σημείο 1.6.2.1. Το απαερωμένο μανομετρικό υγρό φέρεται σε μια υποδοχή στο μικρό βραχίονα του ισοτενισκοπίου. Κατόπιν το διερευνόμενο στερεό τοποθετείται στη φούσκα και απαερώνεται σε υψηλή θερμοκρασία.  Ύστερα, το ισοτενικόσπιο τοποθετείται με κλίση έτσι ώστε το μανομετρικό υγρό να μπορεί να ρέει στον U-οειδή σωλήνα. Η μέτρηση της τάσης ατμών ως συνάρτηση της θερμοκρασίας πραγματοποιείται σύμφωνα με το σημείο 1.6.2.  1.6.4. Μέθοδος διάχυσης: ζυγός τάσης ατμών  1.6.4.1. Συσκευή  Στη βιβλιογραφία (1) περιγράφονται διάφορες παραλλαγές της συσκευής. Η συσκευή που περιγράφεται εδώ, περιγράφει τη γενική αρχή (εικόνα 4). Στην εικόνα 4 εικονίζονται τα κύρια μέρη της συσκευής, που περιλαμβάνει ένα δοχείο υψηλού κενού από ανοξείδωτο χάλυβα ή γυαλί, διάταξη παραγωγής και μέτρησης κενού και ενσωματωμένα εξαρτήματα για τη μέτρηση της τάσης ατμών σε ζυγό. Στη συσκευή περιλαμβάνονται τα ακόλουθα ενσωματωμένα εξαρτήματα:  - Φούρνος εξάτμισης με δακτύλιο στεγανότητας και περιστροφική εισαγωγή. Ο φούρνος εξάτμισης είναι ένα κυλινδρικό δοχείο, κατασκευασμένο π.χ. από χαλκό ή από ένα ανθεκτικό στα χημικά αντιδραστήρια κράμα με καλή θερμική αγωγιμότητα. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί γυάλινο δοχείο με χάλκινο τοίχωμα. Ο φούρνος έχει διάμετρο περίπου 3 έως 5 cm και ύψος 2 έως 5 cm. Το ρεύμα ατμού διέρχεται από ένα έως τρία ανοίγματα διαφορετικών μεγεθών. Ο φούρνος θερμαίνεται είτε με μια θερμαντική πλάκα που είναι κάτω από αυτόν είτε με ένα πηνίο θέρμανσης τυλιγμένο στο εξωτερικό του. Για να εμποδισθεί η διάχυση της θερμότητας στην πλάκα της βάσης, ο φούρνος προσαρμόζεται στην πλάκα που χρησιμεύει ως βάση μέσω ενός μετάλλου χαμηλής θερμικής αγωγιμότητας (χάλυβας νικελίου-αργύρου ή χρωμίου-νικελίου), π.χ. ένα σωλήνα νικελίου-αργύρου προσαρμοσμένο σε μια περιστροφική εισαγωγή εφόσον χρησιμοποιείται φούρνος με ορισμένα ανοίγματα. Η διάταξη αυτή έχει το πλεονέκτημα ότι επιτρέπει την είσοδο μιας ράβδου από χαλκό. Αυτό επιτρέπει την ψύξη απέξω χρησιμοποιώντας ένα λουτρό ψύξης.  - Αν το χάλκινο κάλυμμα του φούρνου έχει τρία ανοίγματα διαφόρων διαμέτρων υπό γωνία 90ο το ένα προς το άλλο, μπορούν να καλυφθούν διάφορες περιοχές τάσης ατμών μέσα στα όρια της όλης περιοχής μέτρησης (ανοίγματα διαμέτρου μεταξύ 0,30 και 4,5 mm). Μεγάλα ανοίγματα χρησιμοποιούνται για χαμηλές τάσεις ατμών και αντίστροφα. Με την περιστροφή του φούρνου το επιθυμητό άνοιγμα ή μία ενδιάμεση θέση (άνοιγμα φούρνου - θώρακας - φάλαγγα ζυγού), μπορεί να έλθει στο ρεύμα του ατμού και το ρεύμα των μορίων ελευθερώνεται ή εκτρέπεται μέσω του ανοίγματος του φούρνου προς το δίσκο του ζυγού. Για να μετρηθεί η θερμοκρασία της ουσίας, τοποθετείται σε κατάλληλο σημείο ένα θερμοστοιχείο ή ένα θερμόμετρο αντίστασης.  - Πάνω από το θώρακα υπάρχει ένας δίσκος ζυγού που ανήκει σε ένα μικροζυγό υψηλής ευαισθησίας (βλέπε πιο κάτω). Ο δίσκος του ζυγού έχει διάμετρο περίπου 30 mm. Κατάλληλο υλικό είναι το επιχρυσωμένο αλουμίνιο.  - Ο δίσκος του ζυγού περιβάλλεται από ένα κυλινδρικό ορειχάλκινο ή χάλκινο δοχείο ψύξης. Ανάλογα με τον τύπο του ζυγού, έχει ανοίγματα για τη φάλαγγα του ζυγού και ένα άνοιγμα στο θώρακα για το ρεύμα των μορίων και θα πρέπει να εξασφαλίζει την πλήρη συμπύκνωση του ατμού στο δίσκο του ζυγού. Η διάχυση της θερμότητας προς τα έξω εξασφαλίζεται π.χ. με μια χάλκινη ράβδο που συνδέεται με το δοχείο ψύξης. Η ράβδος διέρχεται διαμέσου της πλάκας-βάσης και είναι θερμικά μονωμένη από αυτή, π.χ. με σωλήνα από χάλυβα χρωμίου-νικελίου. Η ράβδος βυθίζεται σε ένα δοχείο Dewar που περιέχει υγρό άζωτο. κάτω από την πλάκα-βάση ή διαμέσου της ράβδου κυκλοφορεί υγρό άζωτο. Το δοχείο ψύξης διατηρείται έτσι στους  120  C περίπου. Ο δίσκος του ζυγού ψύχεται αποκλειστικά με ακτινοβολία και είναι ικανοποιητικός για την εξεταζόμενη περιοχή πίεσης (ψύξη περίπου μία ώρα πριν από την έναρξη των μετρήσεων).  - Ο ζυγός τοποθετείται πάνω από το δοχείο ψύξης. Κατάλληλοι για την περίπτωση ζυγοί είναι π.χ. οι ηλεκτρονικοί μικροζυγοί δύο βραχιόνων υψηλής ευαισθησίας (8) ή διατάξεις κινούμενου πηνίου υψηλής ευαισθησίας (βλέπε κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ 104. Έκδοση 12,05.81).  - Η πλάκα που χρησιμεύει ως βάση περιλαμβάνει επίσης ηλεκτρικές συνδέσεις για θερμοστοιχεία (ή θερμόμετρα αντίστασης) και πηνία θέρμανσης.  - Στο δοχείο παράγεται κενό χρησιμοποιώντας αντλία μερικού κενού ή αντλία υψηλού κενού (απαιτούμενο κενό περίπου 1 έως 2,10 3 Pa, που επιτυγχάνεται μετά από δύο ώρες άντληση). Η πίεση ρυθμίζεται με κατάλληλο μανόμετρο ιοντισμού.  1.6.4.2. Διαδικασία μέτρησης  Το δοχείο πληρούται με την εξεταζόμενη ουσία και κλείνεται το κάλυμμα. Τοποθετούνται στο φούρνο ο θώρακας και ο ψυκτήρας. Η συσκευή κλείνεται και τίθενται σε λειτουργία οι αντλίες κενού. Η τελική πίεση πριν αρχίσουμε να παίρνουμε μετρήσεις θα πρέπει να είναι περίπου 10 4 Pa. Η ψύξη του δοχείου ψύξης αρχίζει στα 10 2 Pa.  Όταν επιτευχθεί το απαιτούμενο κενό, αρχίζει η σειρά των μετρήσεων βαθμονόμησης στη χαμηλότερη απαιτούμενη θερμοκρασία. Κανονίζεται το ανίστοιχο άνοιγμα στο κάλυμμα, ο ατμός διέρχεται διαμέσου του θώρακα αμέσως πάνω από το άνοιγμα και κτυπά τον ψυχόμενο δίσκο του ζυγού. Ο δίσκος του ζυγού πρέπει να είναι αρκετά μεγάλος ώστε να εξασφαλίζεται η πρόσκρουση όλου του ρεύματος ατμού που περνάει από το θώρακα πάνω σ'αυτόν. Η ορμή του ατμού ενεργεί σαν δύναμη στο δίσκο του ζυγού και τα μόρια συμπυκνώνονται στην ψυχρή του επιφάνεια.  Η ορμή και η ταυτόχρονη συμπύκνωση παράγουν στον καταγραφέα ένα σήμα. Η αξιολόγηση των σημάτων παρέχει δύο ειδών πληροφορίες:  1. Στη συσκευή που περιγράφεται εδώ, η τάση ατμών προσδιορίζεται απευθείας από την ορμή στο δίσκο του ζυγού [δεν είναι αναγκαίο να γνωρίζουμε γι'αυτό το μοριακό βάρος (2)]. Για την αξιολόγηση των ενδείξεων, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη και γεωμετρικοί παράγοντες όπως το άνοιγμα του φούρνου και η γωνία του μοριακού ρεύματος.  2. Μπορεί να μετρηθεί ταυτόχρονα η μάζα του συμπυκνωμένου και από αυτή μπορεί να υπολογισθεί η ταχύτητα εξάτμισης. Η τάση ατμών μπορεί επίσης να υπολογισθεί από την ταχύτητα εξάτμισης και το μοριακό βάρος χρησιμοποιώντας την εξίσωση Hertz (2).  (2)    p = G  2 π RT Χ 103M  όπου:  G = ταχύτητα εξάτμισης (Kg s 1 m 2)Μ = μοριακή μάζα (g mol 1)Τ = θερμοκρασία (Κ)R = παγκόσμια σταθερά των αερίων (J mol 1 K 1)p = τάση ατμών (Pa)  Αφού επιτευχθεί το αναγκαίο κενό, αρχίζει η σειρά των μετρήσεων στη χαμηλότερη επιθυμητή θερμοκρασία μέτρησης. Για περαιτέρω μετρήσεις, η θερμοκρασία αυξάνεται κατά διαστήματα μέχρι που να επιτευχθεί η μέγιστη επιθυμητή θερμοκρασιακή τιμή. Το δείγμα κατόπιν ψύχεται πάλι και μπορεί να χαραχθεί μία δεύτερη καμπύλη τάσεως ατμών. Αν η δεύτερη δοκιμή δεν επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα της πρώτης δοκιμής, τότε είναι πιθανόν η ουσία να αποσυντίθεται στη χρησιμοποιούμενη περιοχή θερμοκρασιών.  1.6.5. Μέθοδος διάχυσης - Προσδιορισμός από την απώλεια βάρους  1.6.5.1. Συσκευή  Η συσκευή διάχυσης αποτελείται από τα ακόλουθα βασικά μέρη:  - μια δεξαμενή που μπορεί να θερμοστατηθεί και εκκενωθεί και στην οποία ευρίσκονται τα κύταρρα διάχυσης,  - μία αντλία υψηλού κενού (π.χ. αντλία διάχυσης ή στροβιλομοριακή αντλία) με μετρητή κενού,  - μία παγίδα, όπου χρησιμοποιείται υγροποιημένο άζωτο ή ξηρός πάγος.  Ως παράδειγμα, στην εικόνα 5 εικονίζεται μία ηλεκτρικά θερμαινόμενη δεξαμενή κενού από αλουμίνιο με 4 κύταρρα διάχυσης από ανοξείδωτο χάλυβα. Το φύλλο του ανοξείδωτου χάλυβα, πάχους περίπου 0,3 mm, έχει μία τρύπα διάχυσης διαμέτρου 0,2 έως 1,0 mm και συνδέεται με τα κύταρρα διάχυσης με ένα βιδωτό καπάκι.  1.6.5.2. Διαδικασία μέτρησης  Φέρονται σε κάθε κύταρρο διάχυσης η εξεταζόμενη ουσία και η ουσία αναφοράς, το μεταλλικό διάφραγμα με την τρύπα ασφαλίζεται με το βιδωτό καπάκι και το κάθε κύταρρο ζυγίζεται με ακρίβεια 0,1 mg. Το κύτταρο τοποθετείται στη θερμοστατημένη συσκευή, η οποία κατόπιν εκκενώνεται μέχρι κάτω από το ένα δέκατο της αναμενόμενης πίεσης. Σε καθορισμένες χρονικές στιγμές σε διάστημα από 5 έως 30 ώρες, εισάγεται αέρας στη συσκευή , και προσδιορίζεται με ξαναζύγισμα η απώλεια μάζας του κυτάρρου διάχυσης.  Για να εξασφαλισθεί ότι τα αποτελέσματα δεν επηρεάζονται από πτητικές προσμείξεις, το κύταρρο ξαναζυγίζεται σε καθορισμένες χρονικές στιγμές, για να ελεγχθεί αν η ταχύτητα εξάτμισης παραμένει σταθερή τουλάχιστον σε δύο τέτοιες χρονικές στιγμές.  Η τάση ατμών p στο κύταρρο διάχυσης δίνεται από τον παρακάτω τύπο   p = m KAtE 2 π R TM  όπου:  p = τάση ατμών (Pa)m = η μάζα της ουσίας που εγκαταλείπει το κύταρρο κατά το χρονικό διάστημα t (Kg)t = χρόνος (s)Α = εμβαδόν της τρύπας (m2)Κ = συντελεστής διόρθωσηςR = παγκόσμια σταθερά των αερίων (J mol 1 K 1)Τ = θερμοκρασία (Κ)Μ = μοριακή μάζα (Kg mol 1)  Ο συντελεστής διόρθωσης Κ εξαρτάται από τη σχέση του μήκους προς την ακτίνα της κυλινδρικής τρύπας:  σχέση:0,10,20,61,02,0Κ:0,9520,9090,7710,6720,514Η προηγούμενη εξίσωση μπορεί να γραφεί: p = E m t M   όπου E = 1 KA  2 π R είναι η σταθερά του κυτάρρου διάχυσης.  Η σταθερά αυτή του κυτάρρου διάχυσης Ε μπορεί να προσδιορισθεί με ουσίες αναφοράς (2,9), χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:   E = p (r) t m M (r) T  όπου:   p(r) = η τάση ατμών της ουσίας αναφοράς (Pa)M(r) = η μοριακή μάζα της ουσίας αναφοράς (Kg: 7mol 1)  1.6.6. Μέθοδος κορεσμού αερίου  1.6.6.1. Συσκευή  Μία τυπική συσκευή που χρησιμοποιείται για την εκτέλεση της δοκιμής αυτής περιλαμβάνει διάφορα τμήματα που εικονίζονται στην εικόνα 6α και περιγράφονται κατωτέρω (1).(1)   Αδρανές αέριο:  Το αέριο μεταφοράς δεν πρέπει να αντιδρά χημικώς με την εξεταζόμενη ουσία. Συνήθως, για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιείται άζωτο αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να απαιτούνται άλλα αέρια (10). Το χρησιμοποιούμενο αέριο πρέπει να είναι ξηρό (βλέπε εικόνα 6α, σημείο 4: αισθητήρας σχετικής υγρασίας).  Έλεγχος ροής:  Για να εξασφαλίζεται σταθερή και προκαθορισμένη ροή διαμέσου της στήλης κορεσμού, απαιτείται η χρησιμοποίηση κατάλληλου συστήματος ελέγχου αερίων.  Παγίδες συλλογής ατμών:  Οι παγίδες αυτές εξαρτώνται από τα χαρακτηριστικά του συγκεκριμένου δείγματος και από την επιλεγείσα μέθοδο ανάλυσης. Ο ατμός θα πρέπει να παγιδεύεται ποσοτικά και με τη μορφή που να επιτρέπει τη μετέπειτα ανάλυση. Για ορισμένες εξεταζόμενες ουσίες, κατάλληλες είναι παγίδες που περιέχουν υγρά όπως το εξάνιο ή η αιθυλενογλυκόλη. Για άλλες, μπορεί να χρησιμοποιούνται στερεά προσροφητικά υλικά.  Ως εναλλακτική λύση αντί της παγίδευσης των ατμών και της μετέπειτα ανάλυσης, σύγχρονες αναλυτικές τεχνικές, μπορεί να χρησιμοποιούνται, όπως χρωματογραφία, για τον ποσοτικό προσδιορισμό του υλικού που μεταφέρεται από γνωστή ποσότητα αερίου μεταφοράς. Περαιτέρω, μπορεί να μετρηθεί η απώλεια μάζας του δείγματος.  Εναλλάκτης θερμότητας:  Για μετρήσεις σε διαφορετικές θερμοκρασίες, μπορεί να είναι αναγκαίο να συμπεριληφθεί στη διάταξη και εναλλάκτης θερμότητας.  Στήλη κορεσμού:  Η εξεταζόμενη ουσία εναποτίθεται από διάλυμα σε κατάλληλο αδρανές υπόστρωμα. Το υπόστρωμα συμπιέζεται στη στήλη κορεσμού, οι διαστάσεις της οποίας και η ταχύτητα ροής θα πρέπει να είναι τέτοιες ώστε να εξασφαλίζεται ο πλήρης κορεσμός του αερίου μεταφοράς. Η στήλη κορεσμού πρέπει να είναι θερμοστατημένη. Για μετρήσεις πάνω από τη θερμοκρασία δωματίου, το τμήμα μεταξύ στήλης κορεσμού και παγίδων θα πρέπει να θερμαίνεται για να παρεμποδίζεται η συμπύκνωση της εξεταζόμενης ουσίας.  Για να μειώνεται η μεταφορά μάζας που επέρχεται με διάχυση, μπορεί να τοποθετηθεί ένας τριχοειδής σωλήνας μετά τη στήλη κορεσμού (εικόνα 6β).  1.6.6.2. Διαδικασία μέτρησης Προπαρασκευή της στήλης κορεσμού: Διάλυμα της εξεταζόμενης ουσίας σε πολύ πτητικό διαλύτη φέρεται σε κατάλληλη ποσότητα υποστρώματος. Θα πρέπει να προστίθεται επαρκής ποσότητα της εξεταζόμενης ουσίας ώστε να διατηρείται ο κορεσμός σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής. Ο διαλύτης απομακρύνεται τελείως με εξάτμιση στον αέρα ή με περιστροφική συσκευή εξάτμισης και το υλικό, αφού αναμειχθεί επισταμένα, προστίθεται στη στήλη κορεσμού. Αφού θερμοστατηθεί το δείγμα, διαβιβάζεται διαμέσου της συσκευής ξηρό άζωτο.  Μέτρηση:  Οι παγίδες ή ο χρησιμοποιούμενος ανιχνευτής συνδέονται με την έξοδο της στήλης και καταγράφεται ο χρόνος. Στην αρχή και σε τακτά χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια του πειράματος ελέγχεται η ταχύτητα ροής χρησιμοποιώντας ένα φυσαλιδόμετρο (ή συνεχώς, με ροόμετρο μάζας).  Στην έξοδο της στήλης πρέπει να μετριέται η πίεση. Αυτό μπορεί να γίνει είτε:  α) παρεμβάλλοντας ένα μετρητή πίεσης μεταξύ της στήλης και των παγίδων (ο τρόπος αυτός μπορεί να μην είναι ικανοποιητικός διότι έτσι αυξάνεται ο νεκρός χώρος και η προσροφητική επιφάνεια) είτε  β) προσδιορίζοντας την πτώση πίεσης κατά μήκος του χρησιμοποιούμενου συγκεκριμένου συστήματος παγίδευσης, σαν συνάρτηση της ταχύτητας ροής σε ξεχωριστό πείραμα (πράγμα που ενδέχεται να μην είναι πολύ ικανοποιητικό για υγρές παγίδες).  Ο χρόνος που απαιτείται για τη συλλογή της ποσότητας της εξεταζόμενης ουσίας που είναι αναγκαία για τις διάφορες μεθόδους ανάλυσης προσδιορίζεται σε προκαταρκτικές δοκιμές ή κατ' εκτίμηση. Ως εναλλακτική λύση αντί της συλλογής της ουσίας για περαιτέρω ανάλυση, μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάποια σύγχρονη τεχνική ποσοτικής ανάλυσης (π.χ. χρωματογραφία). Πριν να υπολογισθεί η τάση ατμών σε μια δεδομένη θερμοκρασία, πρέπει να διεξαχθούν προκαταρκτικές δοκιμές για να προσδιορισθεί η μέγιστη ταχύτητα ροής με την οποία μπορεί να κορεσθεί πλήρως το αέριο μεταφοράς με τους ατμούς της ουσίας. Αυτό εξασφαλίζεται αν το αέριο μεταφοράς διαβιβασθεί διαμέσου της στήλης αρκετά αργά ώστε τυχόν χαμηλότερη ταχύτητα να μη παρέχει μεγαλύτερη υπολογιζόμενη τάση ατμών.  Η ενδεδειγμένη αναλυτική μέθοδος καθορίζεται από τη φύση της εξεταζόμενης ουσίας (π.χ. αέρια χρωματογραφία ή σταθμική μέθοδος).  Προσδιορίζεται η ποσότητα ουσίας που μεταφέρεται από γνωστό όγκο αερίου μεταφοράς. 1.6.6.3. Υπολογισμός τάσης ατμών  Η τάση ατμών υπολογίζεται από την πυκνότητα ατμών, W/V, με την παρακάτω εξίσωση:   p = W Χ R T M  όπου:  p = τάση ατμών (Pa)  W = μάζα της εξεταζόμενης ουσίας που εξατμίζεται (g)V = όγκος κορεσμένου αερίου (m3)R = παγκόσμια σταθερά των αερίων (mol 1 K 1)T = θερμοκρασία (Κ)Μ = μοριακή μάζα της εξεταζόμενης ουσίας (g mol 1)  Οι μετρούμενοι όγκοι πρέπει να διορθώνονται για τυχόν διαφορές πίεσης και θερμοκρασίας μεταξύ του ροομέτρου και της θερμοστατημένης στήλης. Αν το ροόμετρο βρίσκεται μετά την παγίδα κατά τη διεύθυνση της ροής, μπορεί να χρειάζεται να γίνουν διορθώσεις για να ληφθούν υπόψη τυχόν εξατμιζόμενα συστατικά της παγίδας (1).(1)  1.6.7. Στροβιλιζόμενη μαγνητική σφαίρα (8,11,13)  1.6.7.1. Συσκευή  Η τεχνική της στροβιλιζόμενης σφαίρας μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας το μετρητή ιξώδους με περιστρεφόμενη σφαίρα όπως εικονίζεται στην εικόνα 8. Στην εικόνα 7 εικονίζεται ένα σχηματικό διάγραμμα της πειραματικής εγκατάστασης.  Η συσκευή μέτρησης αποτελείται συνήθως από μία κεφαλή μέτρησης με περιστρεφόμενη σφαίρα, τοποθετημένη μέσα σε θερμοστατημένο περίβλημα (που ρυθμίζεται με ακρίβεια 0,1  C). To δοχείο που περιέχει το δείγμα τοποθετείται μέσα σε θερμοστατούμενο περίβλημα (ρυθμιζόμενο με ακρίβεια 0,01  C) και όλα τα άλλα τμήματα της διάταξης διατηρούνται σε υψηλότερη θερμοκρασία για να παρεμποδίζεται η συμπύκνωση. Στο σύστημα συνδέεται διάταξη αντλίας υψηλού κενού μέσω βαλβίδων υψηλού κενού.  Η κεφαλή του περιστρεφομένης σφαίρας αποτελείται από μία χαλύβδινη σφαίρα (διαμέτρου 4 έως 5 mm) μέσα σε ένα σωλήνα. Η σφαίρα φέρεται και σταθεροποιείται σε ένα μαγνητικό πεδίο, χρησιμοποιώντας γενικά συνδυασμό μονίμων μαγνητών και πηνίων ελέγχου.  Η σφαίρα εξαναγκάζεται να στροβιλίζεται υπό την επενέργεια περιστρεφομένων πεδίων που παράγονται από πηνία. Πηνία ανάληψης, που καταμετρούν τον υπάρχοντα πάντοτε χαμηλό πλευρικό μαγνητισμό της σφαίρας, δίνουν τη δυνατότητα μέτρησης της ταχύτητας στροβιλισμού (περιστροφής).  1.6.7.2. Διαδικασία μέτρησης  Όταν η σφαίρα φθάσει σε μια δεδομένη ταχύτητα περιστροφής v(ο) (συνήθως γύρω στις 400 στροφές το δευτερόλεπτο), διακόπτεται η περαιτέρω λειτουργία και επέρχεται επιβράδυνση, λόγω τριβής του αερίου.  Η πτώση της ταχύτητας περιστροφής μετριέται ως συνάρτηση του χρόνου. Δεδομένου ότι η τριβή που προκαλείται από τη μαγνητική αναστολή είναι αμελητέα σε σύγκριση με την τριβή του αερίου, η πίεση p του αερίου δίνεται από τον παρακάτω τύπο:   p = π c r ρ σ 10 t Χ ln v (t) v (o)  όπου:  c  = η μέση ταχύτητα των μορίων του αερίουr = η ακτίνα της σφαίραςp = η πυκνότητα της μάζας της σφαίραςσ = συντελεστής εφαπτομενικής ορμής (σ = 1 για ιδεώδη σφαιρική επιφάνεια της σφαίρας)t = χρόνοςv(t) = ταχύτητα περιστροφής μετά από χρόνο tv(o) = αρχική ταχύτητα περιστροφής  Η εξίσωση αυτή μπορεί επίσης να γραφεί:   p = π c r ρ 10 σ Χ tn   tn-1 tn Χ tn-1  όπου tn, tn 1 είναι οι χρόνοι που απαιτούνται για ένα δεδομένο αριθμό περιστροφών.Τα χρονικά αυτά διαστήματα tn και tn 1 διαδέχονται το ένα το άλλο, και tn > tn 1.  Η μέση ταχύτητα των μορίων του αερίου c δίνεται από τον παρακάτω τύπο: c  = (8 RTπ M)12  όπου:  Τ = θερμοκρασίαR = παγκόσμια σταθερά των αερίωνΜ = μοριακή μάζα  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Η τάση ατμών, από οποιαδήποτε από τις προηγούμενες μεθόδους, θα πρέπει να προσδιορίζεται για δύο τουλάχιστον θερμοκρασίες. Στην περιοχή 0 έως 50  C προτιμώνται τρεις ή περισσότερες μετρήσεις για να ελέγχεται η γραμμικότητα της καμπύλης της τάσης ατμών.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - τη μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε,  - επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις) και προκαταρκτικό στάδιο καθαρισμού, εφόσον υπάρχει,  - δύο τουλάχιστον τιμές τάσης ατμών και πίεσης, κατά προτίμηση στην περιοχή 0 έως 50  C,  - όλα τα προκαταρκτικά δεδομένα,  - καμπύλη του log p συναρτήσει του 1/Τ,  - μία κατ' έκτίμηση τιμή της τάσης ατμών στους 20 ή 25  C.  Αν παρατηρήθηκε κάποια μεταβολή (μεταβολή κατάστασης, αποσύνθεση), πρέπει να αναφέρονται οι ακόλουθες πληροφορίες:  - φύση της μεταβολής,  - θερμοκρασία στην οποία επέρχεται η μεταβολή υπό ατμοσφαιρική πίεση,  - τάση ατμών σε 10 και 20  C κάτω από τη θερμοκρασία μεταβολής και 10 και 20  C πάνω από τη θερμοκρασία αυτή (εκτός κι αν η μεταβολή είναι από στερεό σε αέριο).  Πρέπει να αναφέρεται κάθε πληροφορία και παρατήρηση που έχει σχέση με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.  (2) Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II.  (3) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.  (4) Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593.  (5) NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 1 to 105 Pa - Static method.  (6) NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 3 to 1 Pa - Vapour pressure balance method.  (7) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.  (8) G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, vol. 5 (4), 2440.  (9) Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173.  (10) B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435.  (11) G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642.  (12) G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148.  (13) J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3), 1715.  Προσάτημα 1  Μέθοδος εκτίμησης  ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Οι υπολογισμένες τιμές της τάσης ατμών μπορούν να χρησιμοποιηθούν:  - για να αποφασισθεί ποια από τις πειραματικές μεθόδους είναι κατάλληλη,  - για να υπάρχει μία εκτίμηση ή μία οριακή τιμή σε περιπτώσεις όπου η πειραματική μέθοδος δεν μπορεί να εφαρμοσθεί για τεχνικούς λόγους (συμπεριλαμβανομένων και των περιπτώσεων όπου η τάση ατμών είναι πολύ χαμηλή),  - για να υποβοηθείται η αναγνώριση των περιπτώσεων εκείνων όπου δικαιολογείται η παράλειψη της πειραματικής μέτρησης διότι η τάση ατμών είναι πιθανόν να είναι ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσεως ατμών κατά τη δυναμική μέθοδο  1 = Θερμοστοιχείο2 = Ρυθμιζόμενος όγκος κενού3 = Βαλβίδα πίεσης4 = Κενό5 = Σημείο μέτρησης6 = Θερμαντικό στοιχείο, περίπου 150 W  Εικόνα 2α >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσεως ατμών σύμφωνα με τη στατική μέθοδο (xρησιμοποιώντας μανόμετρο σχήματος σωλήνα U)  1. Eξεταζόμενη ουσία 6. Θερμοκρασιακό λουτρό2. Φάση ατμών7. Διάταξη μέτρησης θερμοκρασίας3. Βαλβίδα υψηλού κενού8. Προς αντλία κενού4. U-οειδής σωλήνας (βοη-9. Εξαερισμός θητικό μανόμετρο)5. Μανόμετρο  Εικόνα 2β >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσης ατμών σύμφωνα με τη στατική μέθοδο (χρησιμοποιώντας δείκτη πίεσης)  1. Εξεταζόμενη ουσία5. Δείκτης πίεσης2. Φάση ατμών6. Θερμοκρασιακό λουτρό3. Βαλβίδα υψηλού κενού7. Διάταξη μέτρησης θερμοκρασίας4. Μετρητής πίεσης  Εικόνα 3 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Ισοτενισκόπιο (βλέπε υποσημείωση 7)  1. Προς σύστημα ελέγχου και μέτρησης της πίεσης2. Σωλήνας εξωτερικής διαμέτρου 8 mm3. Ξηρό άζωτο στο σύστημα πίεσης4. Ατμός δείγματος5. Μικρό άκρο6. Υγρό δείγμα  Εικόνα 4 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Συσκευή προσδιορισμού της καμπύλης τάσης ατμών σύμφωνα με τη μέθοδο του ζυγού τάσης ατμών  1. Εξεταζόμενη ουσία7. Θώρακας2. Φάση ατμού με ρεύμα ατμού8. Ράβδος ψύξης για δοχείο ψύξης3. Φούρνος εξάτμισης με περιστροφική εισαγωγή9. Δίσκος ζυγού3α. Κάλυμμα φούρνου με άνοιγμα10. Μικροζυγός4. Θέρμανση φούρνου (ψύξη)11. Προς καταγραφέα5. Μέτρηση θερμοκρασίας δείγματος12. Προς αντλία υψηλού κενού6. Δοχείο ψύξηςΕικόνα 5 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Παράδειγμα συσκευής για εξάτμιση σε χαμηλή πίεση με τη μέθοδο της διάχυσης, με κύταρρο διάχυσης όγκου 8 cm3  1. Σύνδεση με κενό2. Υποδοχές για θερμόμετρο με αντίσταση λευκόχρυσου3. Κάλυμμα για δεξαμενή κενού ανοξείδωτο χάλυβα4. Δακτύλιος5. Δεξαμενή αλουμινίου κενού6. Διάταξη για εγκατάσταση και απομάκρυνση των κυτάρρων διάχυσης7. Κοχλιοτομημένο κάλυμμα8. Παξιμάδι πεταλούδα(6)9. Μπουλόνι (6) ή για μέτρηση και έλεγχο θερμοκρασίας (2)10. Κύταρρα διάχυσης από11. Θερμαντικοί κάλυκες(6)  Εικόνα 6α >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Παράδειγμα συστήματος ροής για τον προσδιορισμό της τάσης ατμών με τη μέθοδο κορεσμού αερίου  1. Ρυθμιστής ροής2. Εναλλάκτης θερμότητας3. Βελονοειδείς βαλβίδες4. Αισθητήρας σχετικής υγρασίας5. Στήλες κορεσμού6. Συνδέσεις PTFE7. Μετρητής ροής8. Παγίδα (προσροφητής)9. Παγίδα λαδιού10. Παραγωγή φυσαλλίδων  Εικόνα 6β >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Παράδειγμα συστήματος για τον προσδιορισμό της τάσης ατμών με τη μέθοδο κορεσμού αερίου, με ένα τριχοειδές τοποθετημένο μετά από το θάλαμο κορεσμού  1. Μετρητής ροής θερμικής μάζας6. Θάλαμος κορεσμού αερίου2. Μανόμετρο7. Τριχοειδές3. Θάλαμος ελεγχόμενης θερμοκρασίας8. Δοχεία απορρόφησης4. Θερμοστατούμενο έλασμα για αέριο μεταφορέα9. Μετρητής αερίου5. Θερμόμετρο (Pt 100)10. Ψυχρή παγίδα  Εικόνα 7 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Παράδειγμα της πειραματικής διάταξης για τη μέθοδο στροβιλιζόμενης σφαίρας  Συσκευή τάσης ατμών  A. κεφαλή αισθητήρα στροβιλιζόμενης σφαίραςΒ. κύταρρο δείγματοςC. θερμοστάτηςD. γραμμή κενού (στροβιλαντλία)Ε. θερμοστάτης αέραΕικόνα 8 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Παράδειγμα μετρητικής κεφαλής στροβιλιζόμενης σφαίρας  1. Σφαίρα G2. Εκκενούμενη σωληνοειδής επέκταση της Φλάυτδας σύνδεσης G3. Μόνιμοι μαγνήτες (2) G4. Πηνία (2) για κάθετησταθεροποίηση G5. Πηνία οδηγοί (4) G6. Φλάντζα σύνδεσης.  Α.5. ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΗ ΤΑΣΗ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  Οι περιγραφόμενες μέθοδοι βασίζονται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ (1). Οι βασικές αρχές δίνονται στη βιβλιογραφία (2).  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Οι περιγραφόμενες μέθοδοι εφαρμόζονται στη μέτρηση της επιφανειακής τάσης των υδατικών διαλυμάτων.Είναι χρήσιμο να υπάρχουν προκαταρκτικές πληροφορίες για τη διαλυτότητα στο νερό, το συντακτικό τύπο, τις ιδιότητες υδρόλυσης και την κρίσιμη συγκέντρωση για τη δημιουργία μικκυλίων της ουσίας πριν από την εκτέλεση αυτών των δοκιμών. Οι παρακάτω μέθοδοι είναι εφαρμόσιμες στις περισσότερες χημικές ουσίες, χωρίς οποιονδήποτε περιορισμό όσον αφορά το βαθμό καθαρότητάς τους.  Η μέτρηση της επιφανειακής τάσης με τη μέθοδο του μετρητή τάσης με δακτύλιο, περιορίζεται για τα υδατικά διαλύματα με δυναμικό ιξώδες μικρότερο των 200 m Pa S περίπου.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Η ελεύθερη επιφανειακή ενθαλπία ανά μονάδα επιφάνειας αναφέρεται σαν επιφανειακή τάση.  Η επιφανειακή τάση δίνεται σαν:N/m (μονάδα SI) ήmN/m (υπομονάδα SI)1 N/m = 103 δύνες/cm1 mN/m = 1 δύνη/cm στο σύστημα CGS που χρησιμοποιείτο παλαιά  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές πρέπει να χρησιμοποιούνται κυρίως για να ελέγχεται κατά διαστήματα η μέθοδος που εφαρμόζεται και για να γίνεται δυνατή η σύγκριση με αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.  Στη βιβλιογραφία (1) και (3) δίνονται ουσίες αναφοράς που καλύπτουν μία μεγάλη περιοχή επιφανειακών τάσεων.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ  Οι μέθοδοι βασίζονται στη μέτρηση της μέγιστης δύναμης που απαιτείται να ασκηθεί κάθετα σ'έναν αναβολέα ή σε ειδικό δακτύλιο που είναι σε επαφή με το εξεταζόμενο υγρό το οποίο βρίσκεται τοποθετημένο σε ένα δοχείο μέτρησης, με σκοπό την αποχώρισή του από αυτή την επιφάνεια ή σε ένα δίσκο, με τη μία πλευρά σε επαφή με την επιφάνεια, ώστε να επανέλθει κανονικά στη θέση της η μεμβράνη που σχηματίστηκε.Ουσίες διαλυτές στο νερό σε συγκέντρωση τουλάχιστον 1 mg/l εξετάζονται σε υδατικό διάλυμα σε μία μόνη συγκέντρωση.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Οι μέθοδοι αυτές είναι μεγαλύτερης ακρίβειας από αυτήν που φαίνεται να απαιτείται για περιβαλλοντική εκτίμηση.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ  Παρασκευάζεται διάλυμα της ουσίας σε απεσταγμένο νερό. Η συγκέντρωση του διαλύματος αυτού θα πρέπει να είναι το 90 % της διαλυτότητας κορεσμού της ουσίας σε νερό G όταν η συγκέντρωση κορεσμού υπερβαίνει το 1 g/l, χρησιμοποιείται συγκέντρωση 1 g/l για τη δοκιμή. Ουσίες με υδατοδιαλυτότητα μικρότερη από 1 mg/l δεν απαιτείται να εξετάζονται.  1.6.1. Μέθοδος δίσκου  Βλέπε ISO 304 και NF T 73-060 (Επιφανειακά ενεργές ουσίες - Προσδιορισμός της επιφανειακής τάσης με σχηματισμό υγρών μεμβρανών).  1.6.2. Μέθοδος αναβολέα  Βλέπε ISO 304 και NF T 73-060 (Επιφανειακά ενεργές ουσίες - Προσδιορισμός της επιφανειακής τάσης με σχηματισμό υγρών μεμβρανών).  1.6.3. Μέθοδος δακτυλίου  Βλέπε ISO 304 και NF T 73-060 (Επιφανειακά ενεργές ουσίες - Προσδιορισμός της επιφανειακής τάσης με σχηματισμό υγρών μεμβρανών).  1.6.4. Εναρμονισμένη μέθοδος δακτυλίου του ΟΟΣΑ  1.6.4.1. Συσκευή  Οι μετρητές τάσης που κυκλοφορούν στο εμπόριο είναι κατάλληλοι για τη μέτρηση αυτή. Αποτελούνται από τα παρακάτω στοιχεία:  - κινητό τραπέζι δείγματος,- σύστημα μέτρησης δύναμης,- σώμα μέτρησης (δακτύλιος),- δοχείο μέτρησης.  1.6.4.1.1. Κινητό τραπέζι δείγματος  Το κινητό τραπέζι δείγματος χρησιμοποιείται σαν υποστήριγμα για το δοχείο μέτρησης, ελεγχόμενης θερμοκρασίας, που περιέχει το υγρό που πρόκειται να εξεταστεί. Μαζί με το σύστημα μέτρησης της δύναμης, συναρμολογείται πάνω σε ένα βάθρο.  1.6.4.1.2. Σύστημα μέτρησης της δύναμης  Το σύστημα μέτρησης της δύναμης (βλέπε εικόνα) είναι τοποθετημένο πάνω από το τραπέζι του δείγματος. Το σφάλμα μέτρησης της δύναμης δεν πρέπει να υπερβαίνει το ± 10 6 Ν, που αντιστοιχεί σε ένα όριο σφάλματος ± 0,1 mg σε μια μέτρηση μάζας. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η κλίμακα μέτρησης των μετρητών τάσης που κυκλοφορούν στο εμπόριο βαθμολογείται σε mN/m, έτσι ώστε η επιφανειακή τάση να μπορεί να μετρηθεί απευθείας σε mN/m, με μια ακρίβεια 0,1 mN/m. 1.6.4.1.3. Σώμα μέτρησης (δακτύλιος)  Ο δακτύλιος αποτελείται συνήθως από ένα σύρμα από κράμα λευκοχρύσουιριδίου πάχους 0,4 mm περίπου και μέσης περιφέρειας 60 mm. Ο συρμάτινος δακτύλιος κρέμεται οριζόντια από ένα μεταλλικό στέλεχος και από ένα συρμάτινο υποστήριγμα για να αποκαθίσταται η σύνδεση με το σύστημα μέτρησης της δύναμης (βλέπε εικόνα).  Εικόνα >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Σώμα μέτρησης  (Όλες οι διαστάσεις εκφρασμένες σε mm)  1.6.4.1.4. Δοχείο μέτρησης  Το δοχείο μέτρησης που περιέχει το διάλυμα το οποίο πρόκειται να μετρηθεί θα είναι ένα γυάλινο δοχείο με ελεγχόμενη θερμοκρασία. Θα σχεδιαστεί έτσι ώστε κατά τη διάρκεια της μέτρησης η θερμοκρασία του εξεταζόμενου υγρού διαλύματος και η αέρια φάση πάνω από την επιφάνειά του να παραμένουν σταθερές και το δείγμα να μην μπορεί να εξατμίζεται. Κυλινδρικά γυάλινα δοχεία που έχουν εσωτερική διάμετρο όχι μικρότερη των 45 mm είναι αποδεκτά.  1.6.4.2. Προετοιμασία τη συσκευής  1.6.4.2.1. Καθαρισμός  Τα γυάλινα δοχεία πρέπει να καθαρίζονται προσεκτικά. Εάν είναι ανάγκη θα πρέπει να πλένονται με ζεστό χρωμοθειικό οξύ και μετά με πυκνό φωσφορικό οξύ (83 έως 98 % κατά βάρος H3PO4), να ξεπλένονται πλήρως με τρεχούμενο νερό και τελικά να πλένονται με διπλά απεσταγμένο νερό μέχρι να παρθεί ουδέτερη αντίδραση, στη συνέχεια να ξηραίνονται ή να ξεπλένονται με μέρος από το υγρό που πρόκειται να μετρηθεί.  Ο δακτύλιος θα πρέπει αρχικά να ξεπλένεται πλήρως με νερό για την απομάκρυνση κάθε ουσίας διαλυτής στο νερό, να βυθίζεται για λίγο σε χρωμοθειικό οξύ, να πλένεται με διπλά απεσταγμένο νερό μέχρι να παρθεί ουδέτερη αντίδραση και τελικά να θερμαίνεται για λίγο πάνω από φλόγα μεθανόλης.  Σημείωση:  Οι τυχόν ουσίες που δεν διαλύονται ή δεν καταστρέφονται με χρωμοθειικό ή φωσφορικό οξύ, όπως οι σιλικόνες, θα πρέπει να απομακρύνονται με τη βοήθεια ενός κατάλληλου οργανικού διαλύτη.  1.6.4.2.2. Βαθμονόμηση της συσκευής  Η βαθμονόμηση της συσκευής συνίσταται στην επαλήθευση του μηδενικού σημείου ρυθμίζοντάς το έτσι ώστε η ένδειξη του οργάνου να επιτρέπει αξιόπιστο προσδιορισμό σε mN/m.  Συναρμολόγηση:  Η συσκευή θα πρέπει να οριζοντιώνεται, π.χ. με τη βοήθεια μιας στάθμης οινοπνεύματος στη βάση του μετρητή τάσης, ρυθμίζοντας τις βίδες οριζοντίωσης στη βάση.  Ρύθμιση του μηδενικού σημείου:  Μετά τη συναρμολόγηση του δακτυλίου στη συσκευή και πριν τη βύθισή του στο υγρό θα πρέπει να ρυθμιστεί η ένδειξη του μετρητή τάσης στο μηδέν και να ελεγχθεί ότι ο δακτύλιος είναι παράλληλος προς την επιφάνεια του υγρού. Για το σκοπό αυτό, η υγρή επιφάνεια μπορεί να χρησιμεύσει ως καθρέφτης.  Βαθμονομήσεις:  Ο έλεγχος βαθμονόμησης μπορεί να γίνει με μία από τις δύο παρακάτω μεθόδους:  α) Χρησιμοποίηση μιας μάζας: μέθοδος που χρησιμοποιεί ιππείς γνωστής μάζας μεταξύ 0,1 g και 1,0 g που τοποθετούνται πάνω στο δακτύλιο. Ο παράγοντας βαθμονόμησης Φa, με τον οποίο πρέπει να πολλαπλασιάζονται όλες οι αναγνώσεις του οργάνου, θα πρέπει να καθορίζεται σύμφωνα με την εξίσωση (1):  Φa =  σrσa(1)  όπου:  σr = mg2b (mN/m)m = μάζα του ιππέα (g)g = επιτάχυνση βαρύτητας (981 cm s 2 στην επιφάνεια της θάλασσας)b = μέση περιφέρεια του δακτύλιου (cm),σa = ανάγνωση του μετρητή τάσης μετά την τοποθέτηση του ιππέα πάνω στο δακτύλιο (mN/m).  β) Χρησιμοποίηση νερού: μέθοδος που χρησιμοποιεί καθαρό νερό, του οποίου η επιφανειακή τάση π.χ. στους 23  C είναι ίση με 72,3 mN/m. Αυτή η μέθοδος εκτελείται πιο γρήγορα από τη βαθμονόμηση βάρους, αλλά υπάρχει πάντα ο κίνδυνος να αλλοιωθεί η επιφανειακή τάση του νερού από ίχνη επιφανειακά ενεργών ουσιών.Ο παράγoντας βαθμονόμησης Φb, με τον οποίο πρέπει να πολλαπλασιάζονται όλες οι ενδείξεις του οργάνου, πρέπει να προσδιορίζεται σύμφωνα με την εξίσωση (2):Φb =  σoσg(2)  όπου:  σo = τιμή αναφερόμενη στη βιβλιογραφία για την επιφανειακή τάση του νερού (mN/m),σg = μετρηθείσα τιμή της επιφανειακής τάσης του νερού (mN/m),και οι δύο στην ίδια θερμοκρασία.  1.6.4.3. Παρασκευή των δειγμάτων  Θα πρέπει να παρασκευάζονται υδατικά διαλύματα των ουσιών που πρόκειται να εξεταστούν, χρησιμοποιώντας τις απαιτούμενες συγκεντρώσεις στο νερό και δε θα πρέπει να περιέχουν αδιάλυτες ουσίες.  Το διάλυμα πρέπει να διατηρείται σε σταθερή θερμοκρασία (ρ 0,5  C). Εάν η επιφανειακή τάση ενός διαλύματος μέσα στο δοχείο μέτρησης μεταβάλλεται με το χρόνο, θα πρέπει να εκτελούνται μερικές μετρήσεις σε διάφορους χρόνους και να χαράσσεται μια καμπύλη της επιφανειακής τάσης ως συνάρτητη του χρόνου. Όταν δεν παρατηρείται περαιτέρω μεταβολή, έχει επιτευχθεί μια κατάσταση ισορροπίας.  Σκόνη ή αέρια επιμόλυνση από άλλες ουσίες επηρρεάζει τη μέτρηση. Γι' αυτό η εργασία θα πρέπει να γίνεται κάτω από προστατευτικό κάλυμμα.  1.6.5. Συνθήκες δοκιμής  Η μέτρηση θα πρέπει να γίνει στους 20  C περίπου με αποκλίσεις όχι μεγαλύτερες απο ρ 0,5  C.  1.6.6. Εκτέλεση της δοκιμής  Τα διαλύματα που πρόκειται να μετρηθούν θα πρέπει να μεταφέρονται στο προσεκτικά καθαρισμένο δοχείο μέτρησης, προσέχοντας να αποφευχθεί τυχόν αφρισμός, και μετά το δοχείο μέτρησης θα πρέπει να τοποθετείται στο τραπέζι της συσκευής. Το πάνω μέρος του τραπεζιού με το δοχείο μέτρησης θα πρέπει να ανυψώνεται μέχρις ότου ο δακτύλιος να βυθιστεί κάτω από την επιφάνεια του διαλύματος που πρόκειται να μετρηθεί. Μετά θα πρέπει να χαμηλώνεται βαθμιαία και ομαλά (με μια ταχύτητα περίπου 0,5 cm/min) για να αποσπαστεί ο δακτύλιος από την επιφάνεια μέχρις ότου επιτευχθεί η μέγιστη δύναμη. Η υγρή στοιβάδα που είναι προσκολλημένη στο δακτύλιο δεν πρέπει να αποχωριστεί από το δακτύλιο. Mετά το τέλος των μετρήσεων, ο δακτύλιος θα πρέπει να βυθίζεται πάλι κάτω από την επιφάνεια και οι μετρήσεις να επαναλαμβάνονται μέχρις ότου επιτευχθεί μια σταθερή τιμή επιφανειακής τάσεως. Ο χρόνος από τη μεταφορά του διαλύματος στο δοχείο μέτρησης θα πρέπει να καταγράφεται για κάθε προσδιορισμό. Οι αναγνώσεις θα πρέπει να λαμβάνονται στη μέγιστη δύναμη που απαιτείται προκειμένου να αποσπαστεί ο δακτύλιος από την υγρή επιφάνεια.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Προκειμένου να υπολογιστεί η επιφανειακή τάση, η τιμή ανάγνωσης, σε mN/m στη συσκευή, θα πρέπει να πολλαπλασιάζεται πρώτα με τον παράγοντα βαθμονόμησης Φa ή Φb (που εξαρτάται από τη μέθοδο βαθμονόμησης που έχει χρησιμοποιηθεί). Αυτό θα δώσει μια τιμή που ισχύει μόνο κατά προσέγγιση και γι'αυτό απαιτείται διόρθωση.  Οι Harkins και Jordan (4) έχουν εμπειρικά καθορίσει παράγοντες διόρθωσης για τις τιμές της επιφανειακής τάσης που μετράται με τη μέθοδο του δακτυλίου και που εξαρτώνται από τις διαστάσεις του δακτυλίου, την πυκνότητα του υγρού και την επιφανειακή του τάση.  Επειδή είναι κουραστικό να προσδιορίζεται ο συντελεστής διόρθωσης από τους πίνακες των Harkins και Jordan για κάθε ξεχωριστή μέτρηση, προκειμένου να υπολογίζεται η επιφανειακή τάση στα υδατικά διαλύματα, μπορεί να χρησιμοποιείται η απλοποιημένη μέθοδος ανάγνωσης των διορθωμένων τιμών της επιφανειακής τάσης απευθείας από τον πίνακα που ακολουθεί. (Για αναγνώσεις που περιλαμβάνονται μεταξύ των τιμών του πίνακα θα χρησιμοποιείται η μέθοδος υπολογισμού ενδιάμεσων τιμών).  >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> Ο πίνακας αυτός έγινε με βάση τη διόρθωση των Harkins-Jordan. Είναι παρόμοιος με εκείνον του DIN Standard (DIN 53914) για το νερό και τα υδατικά διαλύματα (πυκνότητα p = 1 g/cm3) και ισχύει για δακτύλιο του εμπoρίου με διαστάσεις R = 9,55 mm (μέση ακτίνα δακτυλίου) και r = 0,185 mm (ακτίνα του σύρματος του δακτυλίου).Ο πίνακας παρέχει τις διορθωμένες τιμές για τις μετρήσεις της επιφανειακής τάσης που λαμβάνονται μετά από βαθμονόμηση με μάζα ή βαθμονόμηση με νερό.  Εναλλακτικά, χωρίς την προηγούμενη βαθμονόμηση, η επιφανειακή τάση μπορεί να υπολογιστεί σύμφωνα με τον παρακάτω τύπο:σ = 4 π Rf Χ F  όπου:  F = η δύναμη που μετράται με δυναμόμετρο στο σημείο που θραύεται η μεμβράνη.R = η ακτίνα του δακτυλίου.f = ο συντελεστής διόρθωσης (1). (1)   3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - χρησιμοποιηθείσα μέθοδος,  - τύπος του νερού ή του διαλύματος που χρησιμοποιήθηκε,  - επακριβή καθορισμό της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις),  - αποτελέσματα της μέτρησης: επιφανειακή τάση (ληφθείσα ένδειξη) που να περιλαμβάνει τόσο τιςληφθείσες ενδείξεις ξεχωριστά και τον αριθμητικό τους μέσο όρο όσο και το διορθωμένο μέσον όρο (λαμβάνοντας υπόψη το συντελεστή συσκευής και τον πίνακα διόρθωσης),  - συγκέντρωση του διαλύματος,  - θερμοκρασία τη δοκιμής,  - παλαιότητα του χρησιμοποιηθέντος διαλύματος, ιδιαίτερα τον χρόνος μεταξύ παρασκευής και μέτρησης του διαλύματος,  - περιγραφή της εξάρτησης από το χρόνο της επιφανειακής τάσης μετά τη μεταφορά του διαλύματος στο δοχείο μέτρησης,  - κάθε πληροφορία και παρατήρηση που έχει σχέση με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων πρέπει να αναφέρεται, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.  3.2. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ  Λαμβάνοντας υπόψη ότι το απεσταγμένο νερό έχει επιφανειακή τάση 72,75 mN/m στους 20  C, ουσίες που παρουσιάζουν επιφανειακή τάση μικρότερη από 60 mN/m στις συνθήκες της μεθόδου αυτής, θα πρέπει να θεωρούνται ως επιφανειακώς ενεργές ουσίες.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.  (2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV  (3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.  (4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.  Α.6. ΥΔΑΤΟΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  Οι περιγραφόμενες μέθοδοι βασίζονται στην κατευθυντήρια δοκιμασία του ΟΟΣΑ (1). (1)  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Είναι χρήσιμο να υπάρχει προκαταρκτική πληροφορία για το συντακτικό τύπο, την τάση ατμών, τη σταθερά διάστασης και την υδρόλυση (σαν συνάρτηση του pH) της ουσίας για την εκτέλεση αυτής της δοκιμής.Δεν υπάρχει ενιαία μέθοδος που να καλύπτει όλη την περιοχή των διαλυτοτήτων στο νερό.Οι δύο μέθοδοι δοκιμής που περιγράφονται κατωτέρω καλύπτουν όλη την κλίμακα τιμών διαλυτότητας δεν έχουν όμως εφαρμογή σε πτητικές ουσίες:  - μία που εφαρμόζεται στις βασικά καθαρές ουσίες με χαμηλές διαλυτότητες (10 2 g/l) και που είναι σταθερές στο νερό, αναφέρεται σαν «μέθοδος φιάλης».  Η διαλυτότητα στο νερό της ελεγχόμενης ουσίας μπορεί να επηρρεαστεί σημαντικά από την παρουσία ξένων προσμείξεων.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Η υδατοδιαλυτότητα μιας ουσίας ορίζεται σαν η συγκέντρωση της μάζας κορεσμού της ουσίας στο νερό σε δεδομένη θερμοκρασία. Η υδατοδιαλυτότητα εκφράζεται σε μονάδες μάζας κατ' όγκο διαλύματος. Η μονάδα SΙ είναι Kg/m3 (μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν τα γραμμάρια ανά λίτρο).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Δεν είναι απαραίτητο να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κυρίως για να ελέγχεται κατά διαστήματα η εφαρμοζόμενη μέθοδος και για να γίνεται δυνατή η σύγκριση με αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η κατά προσέγγιση ποσότητα του δείγματος και ο αναγκαίος χρόνος για να επιτευχθεί η συγκέντρωση της μάζας κορεσμού θα μπορούσε να προσδιοριστεί σε μια απλή προκαταρκτική δοκιμή.  1.4.1. Μέθοδος έκλουσης στήλης  Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην έκλουση της εξεταζόμενης ουσίας με νερό από μία μικροστήλη που γεμίζεται με ένα αδρανές υλικό σαν υπόστρωμα, όπως γυάλινα σφαιρίδια ή άμμος, καλυπτόμενο από μία περίσσεια της εξεταζόμενης ουσίας. Η υδατοδιαλυτότητα προσδιορίζεται όταν η μάζα του εκλούσματος είναι σταθερή. Αυτό φαίνεται από την οριζοντιοποίηση της καμπύλης συγκέντρωσης σαν συνάρτηση του χρόνου.  1.4.2. Μέθοδος φιάλης  Στη μέθοδο αυτή, η ουσία (τα στερεά πρέπει να κονιοποιούνται) διαλύεται σε νερό σε θερμοκρασία λίγο πάνω από τη θερμοκρασία δοκιμής. Όταν επιτευχθεί κορεσμός, το μείγμα ψύχεται και διατηρείται στη θερμοκρασία δοκιμής, αναδεύοντας όσο χρειάζεται ώστε να επιτευχθεί ισορροπία. Εναλλακτικά, η μέτρηση μπορεί να πραγματοποιηθεί απευθείας στη θερμοκρασία δοκιμής, αν εξασφαλισθεί με κατάλληλη δειγματοληψία ότι επιτεύχθηκε η ισορροπία κορεσμού. Στη συνέχεια, προσδιορίζεται με κατάλληλη αναλυτική μέθοδο, η κατά βάρος συγκέντρωση της ουσίας στο υδατικό διάλυμα, το οποίο δεν πρέπει να περιέχει καθόλου αδιάλυτα σωματίδια.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  1.5.1. Επαναληψιμότητα  Για τη μέθοδο έκλουσης στήλης, μπορεί να ληφθεί 3 % ανά  C) , θα ήταν επίσης δυνατό να χρησιμοποιηθούν δύο άλλες θερμοκρασίες, τουλάχιστον 10  C πάνω και κάτω από τη θερμοκρασία που είχε αρχικά επιλεγεί. Σάυτή την περίπτωση ο έλεγχος της θερμοκρασίας θα ήταν ± 0,1  C. Η θερμοκρασία που έχει επιλεγεί θα μπορούσε να διατηρείται σταθερή σε όλα τα σχετικά μέρη της συσκευής.  1.6.2. Προκαταρκτική δοκιμή  Σε ποσότητα 0,1 g περίπου δείγματος (οι στερεές ουσίες πρέπει να κονιοποιούνται) μέσα σε ογκομετρικό κύλινδρο των 10 ml με γυάλινο πώμα, προστίθενται αύξοντες όγκοι απεσταγμένου νερού σε θερμοκρασία δωματίου, σύμφωνα με τα στάδια του παρακάτω πίνακα:  >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> Μετά από κάθε προσθήκη της ενδεικνυόμενης ποσότητας νερού, το μείγμα ανακινείται ισχυρά επί 10 λεπτά και ελέγχεται οπτικά για τυχόν αδιάλυτα μέρη του δείγματος. Αν, μετά από προσθήκη 10 ml νερού, το δείγμα ή μέρη αυτού παραμένουν αδιάλυτα, το πείραμα πρέπει να επαναληφθεί σε ογκομετρικό κύλινδρο 100 ml με μεγαλύτερες ποσότητες νερού. Σε χαμηλότερες διαλυτότητες, ο χρόνος που απαιτείται για να διαλυθεί μια ουσία μπορεί να είναι σημαντικά μεγαλύτερος (θα πρέπει να αφήνεται τουλάχιστον 24 ώρες). Η κατά προσέγγιση διαλυτότητα δίδεται στον πίνακα κάτω από τον όγκο του προστιθέμενου νερού στον οποίο επέρχεται πλήρης διάλυση της ουσίας. Αν η ουσία είναι ακόμη εμφανώς αδιάλυτη, θα πρέπει να αφήνεται περισσότερο από 24 ώρες (96 ώρες κατ' ανώτατο όριο) ή θα πρέπει να επιχειρείται περαιτέρω αραίωση για να εξακριβώνεται αν θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί η μέθοδος έκλουσης στήλης ή η μέθοδος της φιάλης.  1.6.3. Μέθοδος έκλουσης στήλης  1.6.3.1. Υλικό πλήρωσης, διαλύτης και υγρό έκλουσης  Το υλικό πλήρωσης στη μέθοδο έκλουσης στήλης θα πρέπει να είναι αδρανές. Πιθανά υλικά που μπορούν να χρησιμοποιηθούν είναι γυάλινα σφαιρίδια και άμμος. Για τη μεταφορά της εξεταζόμενης ουσίας στο υλικό πλήρωσης θα πρέπει να χρησιμοποιείται κατάλληλος πτητικός διαλύτης αναλυτικής καθαρότητας. Σαν υγρό έκλουσης θα πρέπει να χρησιμοποιείται νερό διπλά απεσταγμένο σε γυάλινη ή χαλαζιακή συσκευή.  Σημείωση:  Δεν πρέπει να χρησιμοποιείται νερό απευθείας από οργανικό ιοντοανταλλάκτη.  1.6.3.2. Φόρτιση του υλικού πλήρωσης  Ζυγίζονται περίπου 600 mg υλικού πλήρωσης και μεταφέρονται σε φιάλη των 50 ml με σφαιρικό πυθμένα.  Κατάλληλη, ζυγισθείσα ποσότητα της εξεταζόμενης ουσίας διαλύεται στον επιλεγέντα διαλύτη. Κατάλληλη ποσότητα του διαλύματος αυτού προστίθεται στο υλικό πλήρωσης. Ο διαλύτης πρέπει να εξατμισθεί πλήρως, π.χ. σε περιστροφική συσκευή εξάτμισης G διαφορετικά, δεν επιτυγχάνεται κορεσμός του υλικού πλήρωσης με νερό εξαιτίας φαινομένων κατανομής στην επιφάνεια του υλικού πληρώσεως.  Η φόρτιση του υλικού πλήρωσης μπορεί να προκαλέσει προβλήματα (εσφαλμένα αποτελέσματα) αν η εξεταζόμενη ουσία αποτεθεί σαν έλαιο ή διαφορετική κρυσταλλική φάση. Το πρόβλημα θα πρέπει να εξετάζεται πειραματικά και οι λεπτομέρειες να αναφέρονται.  Το φορτισμένο υλικό πλήρωσης αφήνεται να εμποτισθεί για δύο περίπου ώρες σε 5 ml νερού και μετά το αιώρημα μεταφέρεται στη μικροστήλη. Εναλλακτικά, ξηρό φορτισμένο υλικό πλήρωσης μεταφέρεται στη μικροστήλη, η οποία έχει γεμίσει με νερό, και αφήνεται να ισορροπήσει για δύο ώρες περίπου.  Διαδικασία δοκιμής:  Η έκλουση της ουσίας από το υλικό πλήρωσης μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο διαφορετικούς τρόπους:  - αντλία ανακύκλωσης (βλέπε εικόνα 1)  - δοχείο ισοστάθμισης (βλέπε εικόνα 4)  1.6.3.3. Μέθοδος έκλουσης στήλης με αντλία ανακύκλωσης  Συσκευή  Στην εικόνα 1 απεικονίζεται σε σχηματική διάταξη ένα τυπικό σύστημα. Μία κατάλληλη μικροστήλη εμφανίζεται στην εικόνα 2, αν και κάθε μέγεθος είναι αποδεκτό, αρκεί να πληρεί τα κριτήρια αναπαραγωγιμότητας και ευαισθησίας. Η στήλη θα πρέπει να διαθέτει στο πάνω μέρος ένα χώρο εισαγωγής με πενταπλάσιο τουλάχιστον όγκο από εκείνον της στήλης νερού και να μπορεί να συγκρατεί κατ'ελάχιστο πέντε δείγματα. Εναλλακτικά, το μέγεθος μπορεί να μειωθεί αν χρησιμοποιηθεί συμπληρωματικός διαλύτης για να αντικαταστήσει τους αρχικούς πέντε βασικούς όγκους που απομακρύνθηκαν με προσμείξεις.  Η στήλη πρέπει να συνδέεται με αντλία ανακύκλωσης που να μπορεί να ελέγχει ροή αντιστοιχούσα σε περίπου 25 ml/ώρα. Η αντλία συνδέεται με συνδέσεις από πολυτετραφθοροαιθυλένιο (P.T.F.E) ή/και γυαλί. Κατά τη σύνδεση στήλης και αντλίας, θα πρέπει να προβλέπεται να υπάρχει δυνατότητα δειγματοληψίας του εκλούσματος και εξισορρόπηση της πίεσης του χώρου εισαγωγής με την ατμοσφαιρική πίεση. Το υλικό της στήλης υποστηρίζεται με ένα μικρό (5 mm) πώμα από υαλοβάμβακα, που χρησιμεύει επίσης και για τη διήθηση σωματιδίων. Η αντλία ανακύκλωσης μπορεί να είναι, για παράδειγμα, μια περισταλτική αντλία ή αντλία μεμβράνης (πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα για αποφυγή οποιασδήποτε μόλυνσης ή/και προσρόφησης με το υλικό του σωλήνα).  Διαδικασία μέτρησης  Αρχίζει η ροή διαμέσου της στήλης. Συνιστάται να χρησιμοποιείται μία ταχύτητα ροής περίπου 25 ml/ώρα (πράγμα που αντιστοιχεί σε 10 βασικούς όγκους/ώρα για την περιγραφείσα στήλη). Οι πέντε πρώτοι βασικοί όγκοι (τουλάχιστον) απορρίπτονται για να απομακρυνθούν οι υδατοδιαλυτές προσμείξεις. Μετά απ'αυτό, η αντλία ανακύκλωσης τίθεται σε λειτουργία μέχρι να αποκατασταθεί ισορροπία, όπως καθορίζεται από πέντε διαδοχικά δείγματα των οποίων οι συγκεντρώσεις δεν διαφέρουν πάνω από ± 30% κατά τυχαίο τρόπο. Τα δείγματα αυτά θα πρέπει να χωρίζονται μεταξύ τους κατά χρονικά διαστήματα που αντιστοιχούν με το πέρασμα τουλάχιστον δέκα βασικών όγκων του υγρού έκλουσης.  1.6.3.4. Μέθοδος έκλουσης στήλης με δοχείο ισοστάθμισης  Συσκευή (βλέπε εικόνες 4 και 3)  Δοχείο ισοστάθμισης: Η σύνδεση με το δοχείο ισοστάθμισης γίνεται με τη χρησιμοποίηση ενός γυάλινου εσμυρισμένου συνδέσμου ο οποίος συνδέεται με σωληνώσεις PTFE. Συνιστάται η χρησιμοποίηση μιας ταχύτητας ροής περίπου 25 ml/ώρα. Θα συλλέγονται διαδοχικά κλάσματα έκλουσης καί θα αναλύονται με τη μέθοδο που έχει επιλεγεί.  Διαδικασία μέτρησης  Για τον προσδιορισμό της υδατοδιαλυτότητας, χρησιμοποιούνται τα κλάσματα από τη μέση περιοχή του εκλούσματος στα οποία οι συγκεντρώσεις είναι σταθερές (± 30 %) σε πέντε τουλάχιστον διαδοχικά κλάσματα. Και στις δύο περιπτώσεις (αντλία ανακύκλωσης ή δοχείο ισοστάθμισης), πρέπει να εκτελείται μία δεύτερη δοκιμή με τη μισή από την πρώτη ταχύτητα ροής. Εάν τα αποτελέσματα των δύο πειραμάτων συμφωνούν, η δοκιμή είναι ικανοποιητική. Εάν υπάρχει μεγαλύτερη φαινομενική διαλυτότητα με τη χαμηλότερη ταχύτητα ροής, τότε η κατά το 50 % μείωση της ταχύτητας ροής πρέπει να συνεχιστεί, μέχρις ότου δύο διαδοχικά περάσματα δώσουν την ίδια διαλυτότητα.  Και στις δύο περιπτώσεις (χρησιμοποιώντας μια αντλία ανακύκλωσης ή ένα δοχείο ισοστάθμισης) τα κλάσματα θα πρέπει να ελέγχονται για την παρουσία κολλοειδούς ουσίας με την εξέταση του φαινομένου Tyndall (διάχυση του φωτός). Η παρουσία τέτοιων σωματιδίων ακυρώνει τα αποτελέσματα και η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται, μεγαλώνοντας τη διηθητική δράση της στήλης.  Το pH κάθε δείγματος θα πρέπει να καταγράφεται. Ένα δεύτερο πέρασμα θα πρέπει να εκτελείται στην ίδια θερμοκρασία.  1.6.4. Μέθοδος φιάλης  1.6.4.1. Συσκευή  Για τη μέθοδο φιάλης απαιτείται το παρακάτω υλικό:  - κανονικός εξοπλισμός εργαστηρίου σε γυάλινα σκεύη και σε όργανα,  - κατάλληλος μηχανισμός για την ανατάραξη των διαλυμάτων κάτω από ελεγχόμενες σταθερές θερμοκρασίες,  - μια φυγόκεντρος (κατά προτίμηση θερμοστατούμενη), εάν κρίνεται αναγκαίο με γαλακτώματα και - εξοπλισμός για αναλυτικό προσδιορισμό.  1.6.4.2. Πορεία μέτρησης  Η αναγκαία ποσότητα υλικού, για να κορεστεί ο επιθυμητός όγκος νερού, εκτιμάται από την προκαταρκτική δοκιμή. Ο όγκος του απαιτούμενου νερού θα εξαρτάται από την αναλυτική μέθοδο και από την περιοχή διαλυτότητας. Ζυγίζεται περίπου πέντε φορές η ποσότητα του υλικού που έχει καθοριστεί παραπάνω, σε κάθε ένα από τα τρία γυάλινα δοχεία με γυάλινα πώματα (π.χ. σωλήνες φυγοκέντρου, φιάλες). Ο όγκος νερού που έχει επιλεγεί προστίθεται σε κάθε δοχείο και τα δοχεία κλείνονται ερμητικά. Μετά τα κλειστά δοχεία αναταράσσονται στους 30  C. (Θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ένας μηχανισμός ανατάραξης ή ανάδευσης ικανός να λειτουργεί σε σταθερή θερμοκρασία, π.χ. μαγνητικός αναδευτήρας σε ένα θερμοστατικά ελεγχόμενο υδρόλουτρο). Μετά από μία ημέρα το ένα από τα δοχεία απομακρύνεται και ισορροπείται ξανά για 24 ώρες στη θερμοκρασία του ελέγχου με ανάδευση απο καιρό σε καιρό. Μετά τα περιεχόμενα του δοχείου φυγοκεντρούνται στη θερμοκρασία δοκιμής και η συγκέντρωση της ουσίας στην καθαρά υδατική φάση προσδιορίζεται με μια κατάλληλη αναλυτική μέθοδο. Οι άλλες δύο φιάλες υφίστανται την ίδια κατεργασία μετά από αρχική εξισορόπηση στους 30  C για δύο έως τρεις ημέρες, αντίστοιχα. Εάν τα αποτελέσματα της συγκέντρωσης από τα δύο τουλάχιστον τελευταία δοχεία συμφωνούν με την απαιτούμενη αναπαραγωγιμότητα, η δοκιμή είναι ικανοποιητική. Όλη η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται με μεγαλύτερους χρόνους εξισορρόπησης, εάν τα αποτελέσματα από τα δοχεία 1, 2 και 3 δείχνουν μια τάση αύξησης των τιμών.  Η διαδικασία μέτρησης μπορεί επίσης να διεξαχθεί και χωρίς προεπώαση στους 30  C. Για να εκτιμηθεί η ταχύτητα αποκατάστασης της ισορροπίας κορεσμού, λαμβάνονται δείγματα μέχρις ότου ο χρόνος ανάδευσης να μην επηρρεάζει πλέον τη συγκέντρωση του διαλύματος που εξετάζεται.  Το pH κάθε δείγματος πρέπει να καταγράφεται.  1.6.5. Ανάλυση  Μια ειδική αναλυτική μέθοδος για την ουσία προτιμάται για τους προσδιορισμούς αυτούς, αφού μικρές ποσότητες διαλυτών ξένων προσμείξεων μπορούν να προκαλέσουν μεγάλα σφάλματα στη μετρούμενη διαλυτότητα. Παραδείγματα τέτοιων μεθόδων είναι: αέρια ή υγρή χρωματογραφία, μέθοδοι τιτλοδότησης, φωτομετρικές μέθοδοι, βολταμετρικές μέθοδοι.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  2.1. ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΣΤΗΛΗΣ  Σε κάθε δοκιμή πρέπει να υπολογίζεται η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση από πέντε τουλάχιστον διαδοχικά δείγματα λαμβανόμενα από την περιοχή κορεσμού. Τα αποτελέσματα πρέπει να εκφράζονται σε μονάδες μάζας κατ'όγκο διαλύματος.  Συγκρίνονται οι μέσοι όροι που υπολογίζονται από δύο δοκιμές με διαφορετικές τιμές ροής και θα πρέπει να παρουσιάζουν μία επαναληψιμότητα μικρότερη του 30%.  2.2. ΜΕΘΟΔΟΣ ΦΙΑΛΗΣ  Τα ξεχωριστά αποτελέσματα θα πρέπει να δίνονται για καθεμία από τις τρεις φιάλες και τα αποτελέσματα εκείνα που κρίνονται ότι είναι σταθερά (επαναληψιμότητα μικρότερη του 15 %) θα πρέπει να υπολογίζονται κατά μέσον όρο και να δίνονται σε μονάδες μάζας ανά όγκο διαλύματος. Αυτό μπορεί να απαιτήσει τη μετατροπή των μονάδων μάζας σε μονάδες όγκου, χρησιμοποιώντας την πυκνότητα όταν η διαλυτότητα είναι πολύ υψηλή (> των 100 g/l).  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΣΤΗΛΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - τα αποτελέσματα της προκαταρκτικής δοκιμής,  - επακριβή καθορισμό της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις),  - τις συγκεντρώσεις, τις ταχύτητες ροής και το pH κάθε δείγματος,  - το μέσο όρο και την τυπική απόκλιση από πέντε τουλάχιστον δείγματα από την περιοχή κορεσμού κάθε περάσματος,  - το μέσο όρο των δύο διαδοχικών, αποδεκτών περασμάτων,  - τη θερμοκρασία του νερού κατά τη διαδικασία κορεσμού,  - τη χρησιμοποιηθείσα μέθοδο ανάλυσης,  - τη φύση του χρησιμοποιηθέντος υλικού πλήρωσης,  - τη φόρτιση του υλικού πλήρωσης,  - το χρησιμοποιηθέντα διαλύτη,  - ενδείξεις οποιασδήποτε χημικής αστάθειας της ουσίας κατά τη διάρκεια της δοκιμής και τη χρησιμοποιηθείσα μέθοδο,  - κάθε πληροφορία σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.  3.2. ΜΕΘΟΔΟΣ ΦΙΑΛΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - τα αποτελέσματα της προκαταρκτικής δοκιμής,  - επακριβή καθορισμό της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις),  - τους ξεχωριστούς αναλυτικούς προσδιορισμούς και το μέσο όρο όπου έχουν προσδιοριστεί περισσότερες της μιας τιμές για κάθε φιάλη,  - το pH κάθε δείγματος,  - το μέσο όρο των τιμών για τις διάφορες φιάλες που βρίσκονται σε συμφωνία,  - τη θερμοκρασία ελέγχου,  - τη χρησιμοποιηθείσα μέθοδο ανάλυσης,  - ενδείξεις οποιασδήποτε χημικής αστάθειας της ουσίας κατά τη διάρκεια της δοκιμής και τη χρησιμοποιηθείσα μέθοδο,  - κάθε πληροφορία σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα όσον αφορά τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.  (2) NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method  (3) NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask method  ΠροσάρτημαΕικόνα 1 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Μέθοδος έκλουσης στήλης με αντλία ανακύκλωσης Εικόνα 2 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Μια τυπική μικροστήλη (Όλες οι διαστάσεις σε mm) Εικόνα 3 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Μια τυπική μικροστήλη (Όλες οι διαστάσεις σε mm)  Εικόνα 4 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Μέθοδος έκλουσης στήλης με δοχείο ισοστάθμισης  1 = Δοχείο ισοστάθμισης (π.χ. χημική φιάλη 2,5 λίτρων)2 = Στήλη (βλέπε σχήμα 3)3 = Κλασματικός συλλέκτης4 = Θερμοστάτης5 = Σωλήνας από τεφλόν6 = Γυάλινο βύσμα εσμυρισμένο7 = Σωλήνας νερού (μεταξύ θερμοστάτη και στήλης, εσωτερικής διαμέτρου 8 mm περίπου)  Α.8. ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗΣ ΚΑΤΑΝΟΜΗΣ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  Η περιγραφόμενη μέθοδος της «ανακινούμενης φιάλης» βασίζεται στην κατευθυντήρια οδηγία δοκιμών του ΟΟΣΑ (1).(1)   1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Για την εκτέλεση της δοκιμής αυτής, χρήσιμο είναι να έχουμε προκαταρκτικές πληροφορίες για τη δομή, τη σταθερά διάστασης, την υδατοδιαλυτότητα, την υδρόλυση, τη διαλυτότητα σε n-οκτανόλη και την επιφανειακή τάση της ουσίας.  Οι μετρήσεις σε ιονιζόμενες ουσίες θα πρέπει να εκτελούνται μόνο στη μη ιονισμένη μορφή τους (ελεύθερο οξύ ή ελεύθερη βάση) που παράγεται με τη χρησιμοποίηση κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος με pH τουλάχιστον κατά μία μονάδα κάτω (ελεύθερο οξύ) ή πάνω (ελεύθερη βάση) από το pK.  Αυτή η μέθοδος περιλαμβάνει δύο ξεχωριστές διαδικασίες - τη μέθοδο ανακινούμενης φιάλης και την υγρή χρωματογραφία υφηλής απόδοσης (HPLC). Η πρώτη εφαρμόζεται όταν η τιμή του lοg Pow (βλ. παρακάτω για ορισμούς) είναι στην περιοχή  2 έως 4 και η δεύτερη στην περιοχή 0 έως 6. Πριν από την πραγματοποίηση οποιασδήποτε από τις πειραματικές διαδικασίες, θα πρέπει πρώτα να γίνεται μία προκαταρκτική εκτίμηση του συντελεστή κατανομής.  Η μέθοδος της ανακινούμενης φιάλης εφαρμόζεται μόνο σε ουσιαστικά καθαρές ουσίες, διαλυτές στο νερό και σε n-οκτανόλη. Δεν έχει εφαρμογή σε επιφανειοδραστικές ουσίες (για τις οποίες θα πρέπει να προβλέπεται μία εξ υπολογισμού τιμή ή μία εξ εκτιμήσεως τιμή με βάση τις διαλυτότητες σε n-οκτανόλη και στο νερό).  H μέθοδος HPLC δεν έχει εφαρμογή σε ισχυρά οξέα και βάσεις, σε σύμπλοκα μετάλλων, σε επιφανειοδραστικές ουσίες ή σε ουσίες που αντιδρούν με το μέσον έκλουσης. Για τα υλικά αυτά, θα πρέπει να προβλέπεται μία δια υπολογισμού ή δια εκτίμησης τιμή με βάση τις διαλυτότητες σε n-οκτανόλη και στο νερό.  Η μέθοδος HPLC είναι λιγότερο ευαίσθητη στην παρουσία προσμείξεων στην εξεταζόμενη ένωση απ'ό,τι η μέθοδος της ανακινούμενης φιάλης. Εντούτοις, σε ορισμένες περιπτώσεις οι προσμείξεις μπορεί να κάνουν δύσκολη την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, διότι ο διαχωρισμός των κορυφών είναι ασαφής. Για μείγματα που δεν παρέχουν καθορισμένη ζώνη, θα πρέπει να δηλώνεται ανώτερο και κατώτερο όριο lοg P.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Ως συντελεστής κατανομής (Ρ) ορίζεται ο λόγος των συγκεντρώσεων ισορροπίας (ci) μιας διαλελυμένης ουσίας σε ένα διφασικό σύστημα που αποτελείται από δύο σε μεγάλο βαθμό μη αναμείξιμους στην ουσία διαλύτες. Στην περίπτωση n-οκτανόλης και νερού:  Pow = cn-οκτανόληςcνερού  Κατά συνέπεια ο συντελεστής κατανομής (Ρ) είναι το πηλίκον δύο συγκεντρώσεων και δίνεται συνήθως με τη μορφή του δεκαδικού λογαρίθμου του (log P).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης  Δεν απαιτείται να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Αυτές θα πρέπει κατά βάση να χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο κατά διαστήματα της μεθόδου και για να γίνεται σύγκριση με τα αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.  Μέθοδος HPLC  Για να συσχετισθούν τα δεδομένα, που λαμβάνονται από την HPLC, μιας ένωσης με την τιμή Ρ αυτής, πρέπει να χαραχθεί καμπύλη βαθμονόμησης τιμών log P σαν συνάρτηση των χρωματογραφικών δεδομένων με τη χρησιμοποίηση, τουλάχιστον, 6 σημείων αναφοράς. Η επιλογή των κατάλληλων ουσιών αναφοράς εναπόκειται στον χρήστη. Όταν είναι δυνατό, τουλάχιστον μία ένωση αναφοράς θα πρέπει να έχει Pow μεγαλύτερη από εκείνη της εξεταζόμενης ουσίας και μία άλλη τιμή Pοw κάτω από εκείνη της εξεταζόμενης ουσίας. Για τιμές log P μικρότερες του 4, η βαθμονόμηση μπορεί να βασίζεται σε δεδομένα λαμβανόμενα από τη μέθοδο της ανακινούμενης φιάλης. Για τιμές log P μεγαλύτερες από 4, η βαθμονόμηση μπορεί να βασίζεται σε έγκυρες βιβλιογραφικές τιμές αν αυτές συμφωνούν με τις τιμές που λαμβάνονται δια υπολογισμού. Για μεγαλύτερη ακρίβεια, είναι προτιμότερο να επιλέγονται ουσίες αναφοράς που σχετίζονται από πλευράς δομής με την εξεταζόμενη ουσία.  Για πολλές ομάδες χημικών ουσιών υπάρχουν εκτεταμένοι πίνακες τιμών του log Pow (2) (3). Αν δεν υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία για τους συντελεστές κατανομής ουσιών σχετικών από πλευράς δομής, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία γενικότερη βαθμονόμηση, που να στηρίζεται σε άλλες ουσίες αναφοράς. (2) (3)   Στο προσάρτημα 2 δίνεται πίνακας των ουσιών αναφοράς που συνιστώνται μαζί με τις Pow τιμές τους.  1.4. AΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.4.1. Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης  Για να προσδιορισθεί ο συντελεστής κατανομής, πρέπει να επιτευχθεί ισορροπία μεταξύ όλων των αντιδρώντων συστατικών του συστήματος και να προσδιορισθούν οι συγκεντρώσεις των ουσιών που είναι διαλελυμένες στις δύο φάσεις. Μελέτη της βιβλιογραφίας στο θέμα αυτό δείχνει ότι για την επίλυση του προβλήματος αυτού, δηλ. την επισταμένη ανάμειξη των δύο φάσεων και στη συνεχεία το διαχωρισμό τους προκειμένου να προσδιορισθεί η συγκέντρωση ισορροπίας της εξεταζόμενης ουσίας, μπορούν να χρησιμοποιηθούν αρκετές διαφορετικές τεχνικές.  1.4.2. Μέθοδος HPLC  H HPLC διεξάγεται σε αναλυτικές στήλες που φέρουν μία στερεά φάση, διατιθέμενη στο εμπόριο, με μακρυές αλυσίδες υδρογονανθράκων (π.χ. C8, C18) χημικώς ενωμένες με διοξείδιο του πυριτίου (silica). Οι χημικές ουσίες που φέρονται στη στήλη αυτή κινούνται κατά μήκος αυτής με διαφορετικές ταχύτητες εξαιτίας των διαφορετικών βαθμών κατανομής των, μεταξύ της κινητής φάσης και της υδρογονανθρακικής στατικής φάσης. Μείγματα χημικών ουσιών εκλούονται κατά σειρά υδροφοβίας, με τις υδατοδιαλυτές χημικές ουσίες να εκλούονται πρώτες και τις λιποδιαλυτές χημικές ουσίες τελευταίες, ανάλογα με το συντελεστή κατανομής τους σε υδρογονάνθρακα-νερό. Έτσι καθορίζεται η σχέση μεταξύ του χρόνου κατακράτησης στη στήλη αυτή (ανάστροφη φάση) και του συντελεστή κατανομής σε n-οκτανόλη/νερό. Ο συντελεστής κατανομής ευρίσκεται από τον παράγοντα χωρητικότητας k, που δίνεται από την έκφραση:  k = tR   toto  όπου, tR= χρόνος κατακράτησης της εξεταζόμενης ουσίας καιto= μέσος χρόνος που χρειάζεται το μόριο ενός διαλύτη να περάσει από τη στήλη (νεκρός χρόνος).  Ποσοτικές αναλυτικές μέθοδοι δεν απαιτούνται. Αναγκαίος είναι μόνον ο προσδιορισμός των χρόνων έκλουσης.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  1.5.1. Επαναληψιμότητα  Μέθοδοι ανακινούμενης φιάλης  Για να επιβεβαιωθεί η ορθότητα του συντελεστή κατανομής, πρέπει να εκτελούνται διπλοί προσδιορισμοί κάτω από τρεις διαφορετικές συνθήκες δοκιμής, στις οποίες μπορεί να διαφέρει τόσο η ποσότητα της εξεταζόμενης ουσίας, όσο και ο λόγος των όγκων των διαλυτών. Οι προσδιοριζόμενες τιμές του συντελεστή κατανομής που εκφράζονται υπό την μορφή κοινών λογάριθμών τους θα πρέπει να μη διαφέρουν περισσότερο από ±0,3 λογαριθμικές μονάδες.  Μέθοδος HPLC  Για να αυξηθεί η αξιοπιστία της μέτρησης, πρέπει να εκτελούνται διπλοί προσδιορισμοί. Οι τιμές του log P που βρίσκονται από κάθε μέτρηση ξεχωριστά θα πρέπει να είναι μέσα στα όρια των ± 0,1 λογαριθμικών μονάδων.  1.5.2. Ευαισθησία  Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης  Η περιοχή μέτρησης της μεθόδου προσδιορίζεται από το όριο ανίχνευσης της αναλυτικής διαδικασίας. Το όριο αυτό θα πρέπει να επιτρέπει την εκτίμηση τιμών log Pow στην περιοχή από 2 έως 4 (κατά περίπτωση, όταν το επιτρέπουν οι εφαρμοζόμενες συνθήκες, η κλίμακα αυτή μπορεί να επεκταθεί μέχρι log Pow = 5) όταν η συγκέντρωση της διαλελυμένης ουσίας σε καθεμιά από τις φάσεις δεν είναι μεγαλύτερη από 0,01 mol ανά λίτρο.  Μέθοδος HPLC  Η μέθοδος HPLC δίνει τη δυνατότητα εκτίμησης των συντελεστών κατανομής των οποίων η τιμή του log Pow είναι στην περιοχή από 0 έως 6.  Κανονικά, ο συντελεστής κατανομής μιας ένωσης μπορεί να εκτιμηθεί στα πλαίσια ±1 λογαριθμικής μονάδας της τιμής της μεθόδου ανακινούμενης φιάλης. Τυπικοί συσχετισμοί μπορούν να βρεθούν στη βιβλιογραφία (4) (5) (6) (7) (8). Μεγαλύτερη ορθότητα μπορεί συνήθως να επιτευχθεί όταν οι καμπύλες συσχετισμού βασίζονται σε ουσίες αναφοράς σχετικές από πλευράς δομής (9). (9)   1.5.3. Εξειδίκευση  Μέθοδοι ανακινούμενης φιάλης  Ο νόμος κατανομής του Nernst εφαρμόζεται μόνο σε σταθερή θερμοκρασία, πίεση και pH για αραιά διαλύματα. Εφαρμόζεται αυστηρά σε καθαρή ουσία διεσπαρμένη μεταξύ δύο καθαρών διαλυτών. Εάν στη μία ή και στις δύο φάσεις συναντώνται ταυτόχρονα περισσότερες διαφορετικές διαλελυμένες ουσίες, αυτό μπορεί να επηρρεάσει τα αποτελέσματα.  Τυχόν διάσταση ή συνένωση των διαλελυμένων μορίων έχει ως αποτέλεσμα αποκλίσεις από το νόμο κατανομής του Nernst. Οι αποκλίσεις αυτές καταδεικνύονται από το γεγονός ότι ο συντελεστής κατανομής καταλήγει να εξαρτάται από τη συγκέντρωση του διαλύματος.  Εξαιτίας των πολλαπλών ισορροπιών που εμπερικλείει, η μέθοδος αυτή δεν θα πρέπει να εφαρμόζεται σε ενώσεις που ιονίζονται χωρίς να γίνεται κάποια διόρθωση. Σε περίπτωση τέτοιων ενώσεων θα πρέπει να εξετάζεται η χρήση ρυθμιστικών διαλυμάτων αντί του νερού G το pH του ρυθμιστικού διαλύματος θα πρέπει να απέχει τουλάχιστον 1 μονάδα pH από το pKa της ουσίας λαμβανομένης υπόψη και της σημασίας του pH αυτού για το περιβάλλον.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προκαταρκτική εκτίμηση του συντελεστή κατανομής  Ο συντελεστής κατανομής εκτιμάται κατά προτίμηση χρησιμοποιώντας μία μέθοδο υπολογισμού (βλ. Προσάρτημα 1), ή όπου είναι ενδεδειγμένο, από το λόγο των διαλυτοτήτων της εξεταζόμενης ουσίας στους καθαρούς διαλύτες (10). (10)   1.6.2. Μέθοδος ανακινούμενης φιάλης  1.6.2.1. Προπαρασκευή  n-οκτανόλη: Ο προσδιορισμός του συντελεστή κατανομής θα πρέπει να εκτελείται με αναλυτικά αντιδραστήρια υψηλής καθαρότητας.  Νερό: Θα πρέπει να χρησιμοποιείται νερό απεσταγμένο ή διπλά απεσταγμένο σε γυάλινη ή χαλαζιακή συσκευή. Για ιονιζόμενες ενώσεις, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται, εφόσον δικαιολογείται, αντί του νερού ρυθμιστικά διαλύματα.  Σημείωση:  Δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται νερό λαμβανόμενο απευθείας από ιοντοανταλλάκτη.  1.6.2.1.1. Προ-κορεσμός των διαλυτών  Πριν από τον προσδιορισμό του συντελεστή κατανομής, οι φάσεις του συστήματος των διαλυτών κορένυνται αμοιβαία με ανατάραξη στη θερμοκρασία του πειράματος. Για να γίνει αυτό, είναι πρακτικό να αναταράσσονται δύο μεγάλες φιάλες αποθήκευσης με υψηλό βαθμό αναλυτικής καθαρότητας n-οκτανόλης ή νερού, η κάθε μία με αρκετή ποσότητα από τον άλλο διαλύτη, για 24 ώρες με ένα μηχανικό αναδευτήρα και μετά να αφήνονται σε ηρεμία για αρκετό χρόνο, μέχρι να χωριστούν οι φάσεις και να επιτευχθεί μία κατάσταση κορεσμού.  1.6.2.1.2. Προετοιμασία για τη δοκιμή  Ο συνολικός όγκος του διφασικού συστήματος θα πρέπει να γεμίζει σχεδόν το δοχείο δοκιμής. Αυτό θα βοηθάει στο να προλαβαίνεται απώλεια του υλικού που οφείλεται σε πτητικότητα. Η αναλογία όγκου και οι ποσότητες της ουσίας που χρησιμοποιούνται καθορίζονται από τα παρακάτω:  - την προκαταρκτική εκτίμηση του συντελεστή κατανομής (βλέπε ανωτέρω),  - την ελάχιστη ποσότητα που απαιτείται από τη εξεταζόμενη ουσία για την αναλυτική διαδικασία, και  - τον περιορισμό μιας μέγιστης συγκέντρωσης και στις δύο φάσεις 0,01 mol/l.  Διεξάγονται τρεις δοκιμές. Στην πρώτη, χρησιμοποιείται η υπολογισθείσα κατόγκο αναλογία n-οκτανόλης προς νερό G στη δεύτερη, η αναλογία αυτή διαιρείται δια του δύο G και στην τρίτη, η αναλογία αυτή πολλαπλασιάζεται με το δύο (π.χ. 1:1, 1:2, 2:1).  1.6.2.1.3. Εξεταζόμενη ουσία  Παρασκευάζεται διάλυμα για εναποθήκευση σε n-οκτανόλη προκορεσμένη με νερό. Η συγκέντρωση του εναποθηκευμένου διαλύματος θα πρέπει να προσδιορίζεται με ακρίβεια πριν να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του συντελεστή κατανομής. Το διάλυμα αυτό θα πρέπει να εναποθηκεύεται υπό συνθήκες που να εξασφαλίζουν τη σταθερότητά του.  1.6.2.2. Συνθήκες δοκιμής  Η θερμοκρασία δοκιμής θα πρέπει να διατηρείται σταθερή (±1  C) και να βρίσκεται στην περιοχή από 20 έως 25  C.  1.6.2.3. Διαδικασία μέτρησης  1.6.2.3.1. Αποκατάσταση της ισορροπίας κατανομής  Για κάθε μια από τις συνθήκες δοκιμής πρέπει να ετοιμάζονται διπλά δοχεία περιέχοντα τις απαιτούμενες, και με ακρίβεια μετρημένες, ποσότητες των δύο διαλυτών μαζί με την αναγκαία ποσότητα του διαλύματος εναποθήκευσης.  Οι φάσεις της n-οκτανόλης θα πρέπει να μετρούνται κατόγκο. Τα δοχεία δοκιμής πρέπει να τοποθετούνται είτε σε κατάλληλο αναδευτήρα είτε να ανακινούνται με το χέρι. Όταν χρησιμοποιείται ο σωλήνας φυγοκέντρησης η μέθοδος που συνιστάται είναι να περιστρέφεται ο σωλήνας γρήγορα κατά 180  περί τον εγκάρσιο άξονά του έτσι ώστε αν υπάρχει παγιδευμένος αέρας να διαφεύγει από τις δύο φάσεις. Η εμπειρία έχει δείξει ότι 50 τέτοιες περιστροφές επαρκούν συνήθως για την αποκατάσταση της ισορροπίας κατανομής. Για να είμαστε σίγουροι, συνιστώνται 100 περιστροφές σε πέντε λεπτά.  1.6.2.3.2. Διαχωρισμός φάσεων  Όταν είναι αναγκαίο, για να διαχωρισθούν οι φάσεις, θα πρέπει να πραγματοποιείται φυγοκέντρηση του μείγματος. Αυτό πρέπει να γίνεται με εργαστηριακή φυγόκεντρο διατηρούμενη σε θερμοκρασία δωματίου, ή, αν χρησιμοποιείται μη ελεγχόμενη θερμοκρασιακά φυγόκεντρος, οι σωλήνες φυγοκέντρησης θα πρέπει να διατηρούνται στη θερμοκρασία δοκιμής για μία τουλάχιστον ώρα πριν από την ανάλυση προκειμένου να επέλθει θερμοκρασιακή εξισορρόπηση.  1.6.2.4. Ανάλυση  Για τον προσδιορισμό του συντελεστή κατανομής είναι αναγκαίο να προσδιορίζονται οι συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης ουσίας και στις δύο φάσεις. Αυτό μπορεί να γίνει λαμβάνοντας ένα μέρος από καθεμία από τις δύο φάσεις από κάθε σωλήνα για καθεμία συνθήκη δοκιμής και αναλύοντας αυτά με τη διαδικασία που έχει επιλεγεί. Η ολική ποσότητα της ουσίας που βρίσκεται και στις δύο φάσεις θα πρέπει να υπολογίζεται και να συγκρίνεται με την ποσότητα της ουσίας που είχε εισαχθεί αρχικά.  Η λήψη των δειγμάτων από την υδατική φάση θα πρέπει να πραγματοποιείται με διαδικασία που να ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο να υπάρχουν ίχνη n-οκτανόλης: μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία γυάλινη σύριγγα με βελόνα που αποσπάται για τη δειγματοληψία της υδατικής φάσης. Η σύριγγα αρχικά θα πρέπει να γεμίζεται μερικά με αέρα. Ο αέρας θα πρέπει να εκδιώκεται σιγά, ενώ θα βυθίζεται η βελόνα στη στιβάδα οκτανόλης. Κατάλληλος όγκος υδατικής φάσης εισάγεται στη σύριγγα. Η σύριγγα αποσύρεται γρήγορα από το διάλυμα και η βελόνα αποσπάται. Τα περιεχόμενα της σύριγγας μπορούν τότε να χρησιμοποιηθούν σαν το υδατικό δείγμα. Η συγκέντρωση στις δύο χωριστές φάσεις θα πρέπει να προσδιορίζεται κατά προτίμηση με μία ειδική για την ουσία μέθοδο. Παραδείγματα αναλυτικών μεθόδων που μπορεί να είναι κατάλληλες είναι:  - φωτομετρικές μέθοδοι,  - αέρια χρωματογραφία,  - υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης.  1.6.3. Μέθοδος HPLC  1.6.3.1. Προετοιμασία  Συσκευή  Απαιτείται υγρή χρωματογραφία, εφοδιασμένη με μη παλμική αντλία και κατάλληλη διάταξη ανίχνευσης. Συνιστάται η χρησιμοποίηση βαλβίδας ένεσης με βρόχους(loops) ένεσης. Η παρουσία πολικών ομάδων στη στατική φάση μπορεί να επηρρεάσει σοβαρά την απόδοση της στήλης HPLC. Κατά συνέπεια, οι στατικές φάσεις θα πρέπει να έχουν το ελάχιστο δυνατό ποσοστό πολικών ομάδων (11). Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διατιθέμενα στο εμπόριο λεπτά διαμερισμένα υλικά πλήρωσης ανάστροφης φάσης ή έτοιμες γεμισμένες στήλες. Μεταξύ του συστήματος ένεσης και της αναλυτικής στήλης μπορεί να τοποθετηθεί μία προφυλακτική στήλη. (11)   Κινητή φάση  Για την παρασκευή του διαλύτη έκλουσης ο οποίος προηγουμένως απαερούται χρησιμοποιούνται μεθανόλη και νερό κατάλληλης καθαρότητας για HPLC. Πρέπει να χρησιμοποιείται ισοκρατική έκλουση. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται αναλογίες μεθανόλης/νερού με ελάχιστη περιεκτικότητα σε νερό 25%. Συνήθως, μείγμα 3:1 (n/n) μεθανόλης-νερού είναι ικανοποιητικό για την έκλουση ενώσεων με log P 6 μέσα σε μία ώρα, με ταχύτητα ροής 1 ml/λεπτό. Για ενώσεις υψηλού log P μπορεί να απαιτείται μείωση του χρόνου έκλουσης (όπως και των ενώσεων αναφοράς) με μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης ή του μήκους της στήλης.  Ενώσεις με πολύ μικρή διαλυτότητα σε n-οκτανόλη έχουν την τάση να παρέχουν ασυνήθιστα χαμηλές τιμές log Pow με τη μέθοδο HPLC G οι κορυφές των ενώσεων αυτών ακολουθούν μερικές φορές το μέτωπο του διαλύτη. Αυτό οφείλεται πιθανά στο γεγονός ότι η διαδικασία κατανομής είναι πολύ αργή για την επίτευξη της ισορροπίας μέσα στον χρόνο που απαιτείται κανονικά για το διαχωρισμό με HPLC. Για την επίτευξη μιας αξιόπιστης τιμής, μπορεί να είναι αποτελεσματικό να μειωθεί η ταχύτητα ροής ή/και να ελαττωθεί η αναλογία μεθανόλης/νερού.  Οι εξεταζόμενες και οι ουσίες αναφοράς θα πρέπει να είναι διαλυτές στην κινητή φάση σε βαθμό επαρκή για να μπορούν να ανιχνεύονται. Μόνο σε εξαιρετικές περιπτώσεις μπορεί να χρησιμοποιηθούν πρόσθετα με το μείγμα μεθανόλης-νερού, δεδομένου ότι τα πρόσθετα αλλάζουν τις ιδιότητες της στήλης. Για χρωματογραφήματα με πρόσθετα, είναι υποχρεωτικό να χρησιμοποιείται ξεχωριστή στήλη του ίδιου τύπου. Εάν το μίγμα μεθανόλης-νερού δεν είναι το ενδεδειγμένο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν μείγματα άλλων οργανικών διαλυτών με νερό, π.χ. αιθανόλη-νερό ή ακετονιτρίλιο-νερό.  Το pH του μέσου έκλουσης είναι σημαντικό για τις ιονιζόμενες ενώσεις. Θα πρέπει να είναι μέσα στην περιοχή του pH λειτουργίας της στήλης, που συνήθως είναι μεταξύ 2 και 8. Συνιστάται η χρήση ρυθμιστικού διαλύματος. Πρέπει να λαμβάνεται πρόνοια να αποφεύγεται η καθίζηση αλάτων και η φθορά της στήλης γεγονός που συμβαίνει με ορισμένα μίγματα οργανικής φάσης/ρυθμιστικού διαλύματος. Δεν συνιστώνται οι μετρήσεις HPLC με στατικές φάσεις που έχουν σαν βάση silica για pH πάνω από 8, δεδομένου ότι η χρήση αλκαλικής κινητής φάσης μπορεί να προκαλέσει ταχεία ελάττωση της απόδοσης της στήλης.  Διαλυόμενες ουσίες  Οι ουσίες αναφοράς θα πρέπει να είναι της μεγαλύτερης διαθέσιμης καθαρότητας. Αν είναι δυνατόν, οι ενώσεις που χρησιμοποιούνται για τους σκοπούς της δοκιμής ή της βαθμονόμησης πρέπει να διαλύονται στην κινητή φάση.  Συνθήκες δοκιμής  Η θερμοκρασία κατά τη διάρκεια των μετρήσεων δεν θα πρέπει να διαφέρει περισσότερο από ± 2 Κ.  1.6.3.2. Μέτρηση  Υπολογισμός του νεκρού χρόνου to  Ο νεκρός χρόνος μπορεί να προσδιορισθεί χρησιμοποιώντας είτε μία ομόλογη σειρά (π.χ. n-αλκυλο μεθυλο κετόνες) είτε μη συγκρατούμενες οργανικές ενώσεις (π.χ. θειουρία η φορμαμίδιο). Για τον υπολογισμό του νεκρού χρόνου to με τη χρησιμοποίηση ομόλογης σειράς, εγχύεται μία ομάδα  τουλάχιστον μελών μιας ομόλογης σειράς και προσδιορίζονται οι αντίστοιχοι χρόνοι κατακράτησης. Οι μεικτοί χρόνοι κατακράτησης tr(nc+1) σημειώνονται σαν συνάρτηση του tr(nc), και προσδιορίζονται το τμήμα α και η κλίση b της εξίσωσης αναγωγής:  tr(nc + 1) = a + b tr(nc)  (nc = αριθμός ατόμων άνθρακα). Ο νεκρός χρόνος to δίνεται κατόπιν με τον τύπο:  to = a / (1   b)  Καμπύλη αναφοράς  Το επόμενο βήμα είναι να χαραχθεί η καμπύλη των τιμών του log k σαν συνάρτηση του log P για μερικές ουσίες αναφοράς. Στην πράξη, εγχύεται ταυτόχρονα μία ομάδα από 5 έως 10 πρότυπες ουσίες αναφοράς των οποίων ο log P είναι της αναμενόμενης τάξης και προσδιορίζονται οι χρόνοι κατακράτησης, κατά προτίμηση με ένα καταγραφικό ολοκληρωτή συνδεόμενο με το σύστημα ανίχνευσης. Υπολογίζονται οι αντίστοιχοι λογάριθμοι των παραγόντων χωρητικότητας, log k, και σημειώνονται σαν συνάρτηση του log P που προσδιορίζεται με τη μέθοδο της ανακινούμενης φιάλης. Η βαθμονόμηση εκτελείται σε τακτά χρονικά διαστήματα, τουλάχιστον μία φορά την ημέρα, ώστε να λαμβάνονται υπόψη οι πιθανές αλλαγές στην απόδοση της στήλης.  Προσδιορισμός του παράγοντα χωρητικότητας της εξεταζόμενης ουσίας  Η εξεταζόμενη ουσία εγχύεται σε όσο το δυνατόν μικρότερη ποσότητα της κινητής φάσης. Προσδιορίζεται ο χρόνος κατακράτησης (δύο φορές), πράγμα που επιτρέπει τον υπολογισμό του παράγοντα χωρητικότητας k. Από την καμπύλη των ουσιών αναφοράς, μπορεί να υπολογισθεί ο συντελεστής κατανομής της εξεταζόμενης ουσίας. Για πολύ χαμηλούς και πολύ υψηλούς συντελεστές είναι αναγκαία η προεκβολή. Στις περιπτώσεις αυτές, πρέπει να λαμβάνεται ιδιαίτερη μέριμνα για τα όρια εμπιστοσύνης της γραμμής αναγωγής.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑΜέθοδος ανακινούμενης φιάλης  Η αξιοπιστία των προσδιοριζομένων τιμών Ρ μπορεί να ελεγχθεί κάνοντας σύγκριση του μέσου όρου των διπλών προσδιορισμών με το γενικό μέσον όρο.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτότητα και προσμείξεις),  - όταν οι μέθοδοι δεν έχουν εφαρμογή (π.χ. επιφανειοδραστικές ουσίες), πρέπει να παρέχεται μία τιμή, με υπολογισμό ή με εκτίμηση, με βάση τις διαλυτότητες σε n-οκτανόλη και νερό ανεξάρτητα,  - κάθε πληροφορία και παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, ιδιαίτερα σχετικά με τις προσμείξεις και τη φυσική κατάσταση της ουσίας,  Για τη μέθοδο της ανακινούμενης φιάλης- το αποτέλεσμα της προκαταρκτικής εκτίμησης, εφόσον υπάρχει:  - το αποτέλεσμα της προκαταρκτικής εκτίμησης, εφόσον υπάρχει,  - θερμοκρασία του προσδιορισμού,  - στοιχεία για τις αναλυτικές διαδικασίες που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων,  - ο χρόνος και η ταχύτητα φυγοκέντρησης, εφόσον χρησιμοποιήθηκε,  - οι μετρηθείσες συγκεντρώσεις και στις δύο φάσεις για κάθε προσδιορισμό (αυτό σημαίνει ότι πρέπει να αναφερθούν συνολικά 12 συγκεντρώσεις),  - το βάρος της εξεταζόμενης ουσίας, ο όγκος κάθε φάσης που χρησιμοποιήθηκε σε κάθε δοχείο δοκιμής και η ολική υπολογισθείσα ποσότητα εξεταζόμενης ουσίας σε κάθε φάση μετά την εξισορρόπηση,  - οι υπολογισθείσες τιμές του συντελεστή κατανομής (Ρ) και ο μέσος όρος θα πρέπει να αναφέρονται για κάθε ομάδα συνθηκών δοκιμής όπως πρέπει να αναφέρεται και ο μέσος όρος για όλους τους προσδιορισμούς. Αν υπάρχει ένδειξη εξάρτησης του συντελεστή κατανομής από τη συγκέντρωση, αυτό πρέπει να δηλώνεται στην έκθεση,  - η τυπική απόκλιση των ανεξάρτητων τιμών Ρ ως προς το μέσον όρο τους πρέπει επίσης να αναφέρεται,  - ο μέσος όρος Ρ από όλους τους προσδιορισμούς θα πρέπει επίσης να εκφράζεται σαν ο δεκαδικός λογάριθμός του,  - η υπολογισθείσα θεωρητική τιμή Pow εφόσον προσδιορίσθηκε ή όταν η μετρηθείσα τιμή είναι >104,  - το pH του χρησιμοποιηθέντος νερού και της υδατικής φάσης κατά τη διάρκεια του πειράματος,  - αν χρησιμοποιήθηκαν ρυθμιστικά διαλύματα, αιτιολόγηση της χρήσης ρυθμιστικών διαλυμάτων αντί νερού, σύνθεση, συγκέντρωση και pH των ρυθμιστικών διαλυμάτων, pH της υδατικής φάσης πριν και μετά από το πείραμα.  Για τη μέθοδο HPLC:  - το αποτέλεσμα τυχόν προκαταρκτικής εκτίμησης,  - εξετασθείσες και ουσίες αναφοράς όπως και η καθαρότητά τους,  - περιοχή θερμοκρασιών στην οποία έγιναν οι προσδιορισμοί,  - pH στο οποίο έγιναν οι προσδιορισμοί,  - λεπτομερή στοιχεία για την αναλυτική και προφυλακτική στήλη, την κινητή φάση και το μέσον ανίχνευσης,  - στοιχεία κατακράτησης και βιβλιογραφικές τιμές log P για τις ουσίες αναφοράς που χρησιμοποιήθηκαν στη βαθμονόμηση,  - λεπτομερή στοιχεία για την καμπύλη αναγωγής (log k σαν συνάρτηση log P),  - δεδομένα μέσης κατακράτησης και ενδιάμεση τιμή log P για την εξεταζόμενη ουσία,  - περιγραφή του εξοπλισμού και των λειτουργικών συνθηκών,  - περιγραφικά στοιχεία για την έκλουση,  - ποσότητες της ελεγχόμενης ουσίας και τηςουσίας αναφοράς που εισήχθηκαν στη στήλη,  - νεκρός χρόνος και πως μετρήθηκε.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.  (2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.  (3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman; A.J. Leo, dir.) - Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.  (4) L. Renberg, G. Sundstrom and K. Sundh-Nygard, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683.  (5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981).  (6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.  (7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.  (8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675.  (9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787.  (10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.  (11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479.  (12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  (13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.  (14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use - Determination of partition coefficient - Flask shaking method.  (15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459 (16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525 (17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.  (18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Technol., 1974, vol. 8, 1113.  (19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382  (20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivitδt von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.  (21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam 1984,  (22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel 1978.  (23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.  Προσάρτημα 1  Μέθοδοι υπολογισμού/εκτίμησης  ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Μια γενική εισαγωγή στις μεθόδους υπολογισμού, στοιχεία και παραδείγματα παρέχονται στο Handbook of Chemical Property Estimation Methods (α).  Οι δια υπολογισμού τιμές του Pow μπορούν να χρησιμοποιηθούν:  - για να αποφασισθεί ποια από τις πειραματικές μεθόδους είναι η κατάλληλη (κλίμακα μεθόδου ανακινούμενης φιάλης: log Pow:  2 έως 4, κλίμακα μεθόδου HPLC: log Pow: 0 έως 6),  - για να επιλεγούν οι κατάλληλες συνθήκες δοκιμής (π.χ. ουσίες αναφοράς για τις διαδικασίες της HPLC, αναλογία όγκων n- οκτανόλης/νερού για τη μέθοδο της ανακινούμενης φιάλης),  - ως εργαστηριακός εσωτερικός έλεγχος για πιθανά πειραματικά σφάλματα,  - για την παροχή μιας εκτίμησης του Pow σε περιπτώσεις όπου οι πειραματικές μέθοδοι δεν μπορούν να εφαρμοσθούν για τεχνικούς λόγους.  ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΚΤΙΜΗΣHΣ  Προκαταρκτική εκτίμηση του συντελεστή κατανομής  Η τιμή του συντελεστή κατανομής μπορεί να εκτιμηθεί με τη χρησιμοποίηση των διαλυτοτήτων της εξεταζόμενης ουσίας στους σταθερούς διαλύτες:  Γί αυτό:  Ρεκτιμ. = cn-οκτανόλη κορεσμούcνερό κορεσμού  ΜΕΘΟΔΟΙ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ  Αρχή των μεθόδων υπολογισμού  Όλες οι μέθοδοι υπολογισμού βασίζονται στη συμβατική κατάτμηση του μορίου σε κατάλληλα δομικά τμήματα με γνωστές αξιόπιστες μεταβολές του log Pow. O log Pow του όλου μορίου υπολογίζεται στη συνέχεια σαν το άθροισμα των αντίστοιχων τμηματικών του τιμών συν το άθροισμα των διορθωτικών όρων για ενδομοριακές αλληλεπιδράσεις.  Υπάρχουν πίνακες σταθερών και διορθωτικών όρων για τμήματα (b)(c)(d)(e). Ορισμένοι ενημερώνονται τακτικά (b).  Ποιοτικά κριτήρια  Γενικά, η αξιοπιστία της μεθόδου υπολογισμού μειώνεται όσο αυξάνει η πολυπλοκότητα της υπό μελέτη ένωσης. Στην περίπτωση απλών μορίων με μικρό μοριακό βάρος και μία ή δύο λειτουργικές ομάδες, μπορεί να αναμένεται μια απόκλιση 0,1 έως 0,3 μονάδων του log Pow μεταξύ των αποτελεσμάτων των διαφόρων μεθόδων κατάτμησης και της μετρούμενης τιμής. Στην περίπτωση πολυπλοκότερων μορίων το περιθώριο σφάλματος μπορεί να είναι μεγαλύτερο. Αυτό εξαρτάται από την αξιοπιστία και την ύπαρξη σταθερών τμημάτων, όπως επίσης και από την ικανότητα αναγνώρισης ενδομοριακών αλληλεπιδράσεων (π.χ. δεσμοί υδρογόνου) και την ορθή χρήση των διορθωτικών παραγόντων (το πρόβλημα μειώνεται με το πρόγραμμα για υπολογιστή CLOGP-3) (b). Στην περίπτωση ιονιζόμενων ενώσεων σημαντικό ρόλο παίζει το να ληφθεί σωστά υπόψη το φορτίο ή ο βαθμός ιονισμού.  Διαδικασίες υπολογισμού  Μέθοδος με το π του HANSCH  Η πρωτογενής σταθερά υδρόφοβου υποκαταστάτη, π, που εισήχθη από τους Fujita et al. (f) ορίζεται από:  πx = log Pow (PhX)   log Pow (PhH)  όπου Pow(PhH) είναι ο συντελεστής κατανομής ενός αρωματικού παραγώγου και Pow(PhH) ο συντελεστής κατανομής της μητρικής ένωσης (π.χ. πΨλ= λογ Πος (Ψ6Η5Ψλ)   λογ Πος (Ψ6Η6) = 2,84   2,13 = 0,71).  Σύμφωνα με τον ορισμό της, η μέθοδος του π έχει εφαρμογή κυρίως σε περίπτωση αρωματικής υποκατάστασης. Οι τιμές του π για διάφορους υποκαταστάτες υπάρχουν σε πίνακες (b)(c)(d). Χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό του log Pow για αρωματικά μόρια ή μέρη αυτών.  Μέθοδος REKKER  Σύμφωνα με τον REKKER (g), η τιμή του log Pow υπολογίζεται όπως παρακάτω:  log Pow = Σiai fi + Σj (όροι αλληλεπίδρασης)  όπου το fi παριστάνει τις σταθερές των διάφορων μοριακών τμημάτων και ai τη συχνότητα με την οποία απαντώνται στο εξεταζόμενο μόριο. Οι διορθωτικοί παράγοντες μπορούν να εκφρασθούν σαν το ακέραιο πολλαπλάσιο μίας μόνης σταθεράς Cm (που καλείται κοινά «μαγική σταθερά»). Οι σταθερές τμημάτων fi και Cm προσδιορίστηκαν από ένα κατάλογο 1 054 πειραματικών τιμών Pow (825 ενώσεις) χρησιμοποιώντας ανάλυση πολλαπλής αναγωγής (c) (h). Ο προσδιορισμός των όρων αλληλεπίδρασης διενεργείται σύμφωνα με κανόνες που περιγράφονται στη βιβλιογραφία (e) (h) (i).  Μέθοδος HANSCH-LEO  Σύμφωνα με τους Hansch και Leo (c), η τιμή του log Pow υπολογίζεται από τον τύπο:  log Pow = Σiai fi + Σj bj Fj  παριστάνει τις σταθερές των διαφόρων μοριακών τμημάτων, Fj τους διορθωτικούς παράγοντες και ai, Σj τις αντίστοιχες συχνότητες με τις οποίες απαντώνται. Με βάση πειραματικές τιμές Pow, προσδιορίσθηκαν εμπειρικά ένας κατάλογος ατομικών και ομαδικών τιμών τμημάτων και ένας κατάλογος διορθωτικών όρων Fj (που καλούνται κοινώς «παράγοντες»). Οι διορθωτικοί όροι ταξινομήθηκαν σε πολλές διαφορετικές τάξεις (α) (c). Eίναι σχετικώς πολύπλοκο και χρονοβόρο να ληφθούν υπόφη όλοι οι κανόνες και οι διορθωτικοί όροι. Για τον λόγο αυτό έχουν αναπτυχθεί πακέτα λογισμικού (b).  Συνδυασμένη μέθοδος  Ο υπολογισμός του log Pow πολυπλόκων μορίων μπορεί να βελτιωθεί σημαντικά, αν το μόριο χωρισθεί σε μεγαλύτερα τμήματα για τα οποία υπάρχουν αξιόπιστες τιμές log Pow, είτε από πίνακες (b) (c) είτε από ίδιες μετρήσεις. Τα τμήματα αυτά (ετεροκυκλικοί δακτύλιοι, ανθρακινόνη, αζωβενζόλιο) μπορούν να συνδυασθούν κατόπιν με τις τιμές π της μεθόδου HANSCH ή με τις σταθερές του REKKER ή του LEO.  Παρατηρήσεις  i) Οι μέθοδοι υπολογισμού μπορούν να εφαρμοσθούν σε μερικώς ή πλήρως ιονιζόμενες ενώσεις μόνον όταν είναι δυνατόν να ληφθούν υπόψη οι αναγκαίοι διορθωτικοί παράγοντες,  ii) Αν μπορεί να προϋποτεθεί η ύπαρξη ενδομοριακών δεσμών υδρογόνου, πρέπει να προστεθούν οι αντίστοιχοι διορθωτικοί όροι (α) (περίπου + 0,6 έως + 1,0 log Pow μονάδες). Ενδείξεις για την παρουσία τέτοιων δεσμών μπορούν να ληφθούν από στερεοχημικά μοντέλα ή φασματοσκοπικά δεδομένα του μορίου,  iii) Αν υπάρχει πιθανότητα ορισμένων ταυτομερών μορφών, σαν βάση του υπολογισμού θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί η πιο πιθανή μορφή,  iv) Θα πρέπει να ακολουθούνται προσεκτικά οι αναθεωρήσεις των πινάκων των σταθερών τμημάτων.  Έκθεση  Όταν χρησιμοποιούνται μέθοδοι υπολογισμού/εκτίμησης, η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - περιγραφή της ουσίας (μείγμα, προσμείξεις, κ.λπ.),  - υπόδειξη για την ενδεχόμενη ύπαρξη ενδομοριακού δεσμού υδρογόνου, διάστασης, φορτίου και οποιωνδήποτε άλλων μη συνηθισμένων φαινομένων (π.χ. ταυτομέρεια),  - περιγραφή της μεθόδου υπολογισμού,  - ταυτοποίηση ή παροχή βάσης δεδομένων,  - ιδιαιτερότητες στην επιλογή των τμημάτων,  - περιεκτική τεκμηρίωση του υπολογισμού.  ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  (b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  (c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  (d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  (e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. - Chim. Ther. 1979, vol. 14, 479.  (f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.  (g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.  (h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12 1459.  (i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.  Προσάρτημα 2  >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> A.9. ΣΗΜΕΙΟ ΑΝΑΦΛΕΞΗΣ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Πριν από την εκτέλεση της δοκιμής αυτής, χρήσιμο είναι να υπάρχουν προκαταρκτικές πληροφορίες για την αναφλεξιμότητα της ουσίας. Η δοκιμή μπορεί να εφαρμοσθεί σε υγρές ουσίες των οποίων οι ατμοί μπορούν να αναφλεγούν από πηγές ανάφλεξης. Οι μέθοδοι δοκιμής που περιλαμβάνονται στο κείμενο αυτό είναι αξιόπιστες μόνο σε περιοχές σημείων ανάφλεξης που καθορίζονται στις συγκεκριμένες μεθόδους.  Κατά την επιλογή της μεθόδου που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόφη η πιθανότητα χημικών αντιδράσεων μεταξύ της ουσίας και του υποδοχέα του δείγματος.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Σημείο ανάφλεξης καλείται η χαμηλότερη θερμοκρασία, διορθωμένη για πίεση 101,325 kPa, στην οποία ένα υγρό εκλύει ατμούς, κάτω απο τις συνθήκες που ορίζονται στη μέθοδο δοκιμής, σε τέτοια ποσότητα ώστε να παράγεται στο δοχείο δοκιμής αναφλέξιμο μείγμα ατμών/αέρα.Μονάδες:   C  t = T   273,15  (t σε ο C και Τ σε Κ)  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Δεν απαιτείται να χρησιμοποιούνται ουσίες αναφοράς σε όλες τις περιπτώσεις κατά τις οποίες διερευνάται μία νέα ουσία. Οι ουσίες αυτές θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κατά βάση για να ελέγχεται κατά διαστήματα η εφαρμοζόμενη μέθοδος και για να γίνεται σύγκριση με αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η ουσία τοποθετείται σε δοχείο δοκιμής και θερμαίνεται ή φύχεται στη θερμοκρασία δοκιμής ανάλογα με τη διαδικασία που περιγράφεται στη συγκεκριμένη μέθοδο δοκιμής. Για να εξακριβωθεί αν το δείγμα ανεφλέγη ή όχι στη θερμοκρασία δοκιμής, διενεργούνται δοκιμές ανάφλεξης.  1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ  1.5.1. Επαναληψιμότητα  Η επαναληψιμότητα ποικίλλει ανάλογα με την περιοχή του σημείου ανάφλεξης και τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο δοκιμής G μέγιστο 2  C.  1.5.2. Ευαισθησία  Η ευαισθησία εξαρτάται από τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο δοκιμής.  1.5.3. Εξειδίκευση  Η δυνατότητα εφαρμογής μερικών μεθόδων δοκιμής περιορίζεται σε συγκεκριμένες περιοχές σημείων ανάφλεξης και εξαρτάται από δεδομένα που σχετίζονται με την ουσία (π.χ. υψηλό ιξώδες).  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασίες  Δείγμα της εξεταζόμενης ουσίας τοποθετείται σε μια συσκευή δοκιμής σύμφωνα με το σημείο 1.6.3.1. ή/και 1.6.3.2.  Για λόγους ασφαλείας, συνιστάται να χρησιμοποιείται μέθοδος που απαιτεί μικρό δείγμα, περίπου 2 cm3, στην περίπτωση ενεργητικών ή τοξικών ουσιών.  1.6.2. Συνθήκες δοκιμής  Η συσκευή θα πρέπει, στο βαθμό που συμβαδίζει με το θέμα της ασφάλειας, να τοποθετείται μακρυιά από ρεύματα αέρα.  1.6.3. Εκτέλεση της δοκιμής  1.6.3.1. Μέθοδος ισορροπίας  Βλέπε ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  1.6.3.2. Μέθοδος μη ισορροπίας  Συσκευή ABEL:  Βλέπε BS 2000 μέρος 170, NF MO7-011, NF T06-009.  Συσκευή Abel-Pensky:  Βλέπε EN 57, DIN 51755 μέρος 1 (για θερμοκρασίες από 5 έως 65  C), DIN 51755 μέρος 2 (για θερμοκρασίες κάτω των 5  C), NF MO7-036.  Συσκευή Tag:  Βλέπε. ASTM D 56.  Συσκευή Pensky-Martens:  Βλέπε. ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF MO7-019.  Παρατηρήσεις:  Όταν το σημείο ανάφλεξης, προσδιοριζόμενο με μια μέθοδο μη ισορροπίας όπως αναφέρεται στο 1.6.3.2., βρίσκεται να είναι 0 ± 2  C, 21 ± 2  C ή 55  2  C, θα πρέπει να επαληθεύεται με μια μέθοδο ισορροπίας χρησιμοποιώντας την ίδια συσκευή.  Για γνωστοποίηση μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνον οι μέθοδοι που μπορούν να δώσουν τη θερμοκρασία του σημείου ανάφλεξης.  Για τον προσδιορισμό του σημείου ανάφλεξης ιξωδών υγρών (βαφές, κόμμεα και παρόμοια) που περιέχουν διαλύτες, μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο συσκευές και μέθοδοι δοκιμών κατάλληλες για τον προσδιορισμό του σημείου ανάφλεξης ιξωδών υγρών.  Βλέπε ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 μέρος 1.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - τις επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτοποίηση και προσμείξεις) G  - η χρησιμοποιηθείσα μέθοδος θα πρέπει να δηλώνεται όπως επίσης και ενδεχόμενες αποκλίσεις G  - τα αποτελέσματα και τυχόν πρόσθετες παρατηρήσεις σχετικές με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Ουδεμία.  A.10. ΑΝΑΦΛΕΞΙΜΟΤΗΤΑ, στερεά 1. ΜΕΘΟΔΟΣ 1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Πριν από την εκτέλεση της δοκιμής αυτής, χρήσιμο είναι να υπάρχουν προκαταρκτικές πληροφορίες για τις δυνητικές εκρηκτικές ιδιότητες της ουσίας.  Η δοκιμή αυτή θα πρέπει να εφαρμόζεται μόνο σε ουσίες με μορφή σκόνης, κόκκων ή πάστας.  Για να μη περιληφθούν όλες οι ουσίες που μπορούν να αναφλεγούν αλλά μόνον εκείνες που καίγονται γρήγορα ή εκείνες των οποίων η συμπεριφορά όταν καίγονται είναι σε οποιαδήποτε περίπτωση ιδιαίτερα επικίνδυνη, θεωρούνται σαν λίαν εύφλεκτες μόνον οι ουσίες των οποίων η ταχύτητα καύσης υπερβαίνει μία ορισμένη οριακή τιμή.  Ιδιαίτερα επικίνδυνη, λόγω των δυσκολιών που υπάρχουν στο σβήσιμο μιας τέτοιας φωτιάς, μπορεί να είναι η περίπτωση στην οποία η πυράκτωση διαδίδεται στη μάζα μιας μεταλλικής σκόνης. Οι μεταλλικές σκόνες θα πρέπει να θεωρούνται λίαν εύφλεκτες αν η πυράκτωση επεκτείνεται διαμέσου της μάζας τους μέσα σε ορισμένο χρονικό διάστημα.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Χρόνος καύσης εκφραζόμενος σε δευτερόλεπτα.  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Δεν καθορίζονται.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η ουσία στρώνεται με τη μορφή συνεχούς λωρίδας ή γραμμής από σκόνη μήκους περίπου 250 mm και εκτελείται μία προκαταρκτική δοκιμή ελέγχου για να διαπιστωθεί αν, η έναυση με φλόγα αερίου, οδηγεί σε διάδοση της καύσης με φλόγα ή η ουσία σιγοκαίγεται. Εάν η διάδοση της καύσης σε μήκος 200 mm της γραμμής επέρχεται μέσα σε ορισμένο χρονικό διάστημα, τότε εκτελείται το πλήρες πρόγραμμα της δοκιμής για να προσδιορισθεί η ταχύτητα καύσης.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Δεν δηλώνονται.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προκαταρκτική δοκιμή ελέγχου  Η ουσία στρώνεται με τη μορφή συνεχούς λωρίδας ή γραμμής από σκόνη μήκους περίπου 250 mm, πλάτους 20 mm και ύφους 10 mm σε μία άκαυστη πλάκα, χωρίς πόρους και χαμηλής θερμοαγωγιμότητας. Στο ένα άκρο της γραμμής φέρεται θερμή φλόγα από καυστήρα αερίου (ελάχιστη διάμετρος 5 mm) μέχρι που η σκόνη να αναφλεγεί ή για δύο λεπτά κατ'ανώτατο όριο (πέντε λεπτά για σκόνες μετάλλων ή μεταλλικών κραμάτων). Θα πρέπει να σημειωθεί αν η καύση διαδίδεται στα 200 mm της γραμμής μέσα σε χρονικό διάστημα τεσσάρων λεπτών δοκιμής (ή 40 λεπτών για μεταλλικές σκόνες). Αν η ουσία δεν αναφλεγεί και δεν διαδοθεί η καύση είτε με φλόγα είτε με σιγανή καύση σε μήκος 200 mm της γραμμής της σκόνης μέσα σε χρονικό διάστημα δοκιμής τεσσάρων λεπτών (ή 40 λεπτών), τότε η ουσία δεν θα πρέπει να θεωρείται σαν λίαν εύφλεκτη και δεν απαιτείται καμμία περαιτέρω δοκιμασία. Αν η διάδοση της καύσης της ουσίας σε μήκος 200 mm της γραμμής επέρχεται σε λιγότερο από τέσσερα λεπτά ή σε λιγότερο από 40 λεπτά στην περίπτωση μεταλλικής σκόνης, θα πρέπει να πραγματοποιείται η δοκιμασία που περιγράφεται πιο κάτω (σημείο 1.6.2 και μετέπειτα).  1.6.2. Δοκιμή ταχύτητας καύσης  1.6.2.1. Προετοιμασία  Ουσίες με μορφή σκόνης ή κόκκων χύνονται χωρίς να συμπιέζονται μέσα σε ένα καλούπι μήκους 250 mm με τριγωνική διατομή εσωτερικού ύψους 10 mm και πλάτους 20 mm. Και στις δύο πλευρές του καλουπιού, κατά τη διαμήκη διεύθυνση, τοποθετούνται δύο μεταλλικές πλάκες σαν πλευρικά όρια που προεξέχουν 2 mm από την πάνω ακμή της τριγωνικής διατομής (εικόνα). Το καλούπι αφήνεται κατόπιν να πέσει τρεις φορές από ύψος 2 cm σε μια στερεή επιφάνεια. Αν χρειασθεί, το καλούπι γεμίζεται και πάλι. Οι πλευρικές πλάκες κατόπιν αφαιρούνται και η περίσσεια της ουσίας απομακρύνεται με ξύσιμο. Στο πάνω μέρος του καλουπιού τοποθετείται μία άκαυστη, χωρίς πόρους και χαμηλής θερμοαγωγιμότητας πλάκα, η διάταξη ανατρέπεται και το καλούπι απομακρύνεται.  Οι ουσίες που έχουν τη μορφή πάστας απλώνονται σε μία άκαυστη, χωρίς πόρους και χαμηλής θερμοαγωγιμότητας πλάκα με τη μορφή σχοινιού μήκους 250 mm και διατομής περίπου 1 cm2.  1.6.2.2. Συνθήκες δοκιμής  Στην περίπτωση ουσίας που είναι ευαίσθητη στην υγρασία, η δοκιμή πρέπει να εκτελείται όσο το δυνατόν γρηγορότερα μετά από την απομάκρυνσή της από το δοχείο.  1.6.2.3. Εκτέλεση της δοκιμής  Η στήλη της ουσίας φέρεται μέσα σε ένα απαγωγό.  Η ταχύτητα του αέρα (το «τράβηγμα») θα πρέπει να είναι αρκετή ώστε να εμποδίζεται η διαφυγή ατμών μέσα στο εργαστήριο ενώ δεν θα πρέπει να μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Γύρω από τη διάταξη πρέπει να τοποθετείται μιά οθόνη ρεύματος.  Η στήλη ανάβεται στο ένα άκρο της χρησιμοποιώντας τη θερμή φλόγα ενός καυστήρα αερίου (ελάχιστη διάμετρος 5 mm). Όταν η καύση έχει προχωρήσει σε μήκος 80 mm της στήλης, μετριέται η ταχύτητα καύσης στα επόμενα 100 mm. Η δοκιμή πραγματοποιείται έξι φορές, χρησιμοποιώντας κάθε φορά καθαρή κρύα πλάκα, εκτός κι αν παρατηρηθεί νωρίτερα κάποιο θετικό αποτέλεσμα.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Για την εκτίμηση λαμβάνονται υπόψη ο χρόνος καύσης από την προκαταρκτική δοκιμή ελέγχου (1.6.1) και ο βραχύτερος χρόνος καύσης στις μέχρι έξι δοκιμές (1.6.2.3).  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - τις επακριβείς προδιαγραφές ουσίας (ταυτοποίηση και προσμείξεις),  - περιγραφή της εξεταζόμενης ουσίας, τη φυσική της κατάσταση συμπεριλαμβανόμενης και της περιεκτικότητάς της σε υγρασία,  - αποτελέσματα από την προκαταρκτική δοκιμή ελέγχου και από τη δοκιμή ταχύτητας καύσης, εφόσον υπάρχουν,  - κάθε πρόσθετη παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ  Οι ουσίες σε μορφή σκόνης, κόκκων ή πάστας πρέπει να θεωρούνται σαν λίαν εύφλεκτες όταν ο χρόνος καύσης σε οποιαδήποτε από τις δοκιμές που έγιναν σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο 1.6.2 είναι μικρότερος από 45 δευτερόλεπτα. Οι σκόνες μετάλλων ή μεταλλικών κραμάτων θεωρούνται σαν λίαν εύφλεκτες όταν μπορούν να αναφλεγούν και η φλόγα ή η ζώνη αντίδρασης απλώνεται σε όλο το δείγμα μέσα σε δέκα λεπτά ή λιγότερο.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.  Προσάρτημα  Εικόνα >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Καλούπι και εξαρτήματα για την παρασκευή της στήλης(Όλες οι διαστάσεις σε mm)  Α.11. ΑΝΑΦΛΕΞΙΜΟΤΗΤΑ (Αέρια) 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Με τη μέθοδο αυτή προσδιορίζεται το κατά πόσον αέρια αναμεμειγμένα με αέρα, σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20  C) και υπό ατμοσφαιρική πίεση, είναι εύφλεκτα και, σε θετική περίπτωση, σε ποια περιοχή συγκεντρώσεων. Μείγματα αυξανόμενων συγκεντρώσεων του ελεγχόμενου αερίου με αέρα εκτίθενται σε ηλεκτρικό σπινθήρα και παρατηρείται εάν συμβαίνει έναυση.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Η περιοχή αναφλεξιμότητας είναι η περιοχή συγκέντρωσης μεταξύ των χαμηλότερων και των υψηλότερων ορίων έκρηξης. Τα χαμηλότερα και τα υψηλότερα όρια έκρηξης είναι εκείνα τα όρια συγκέντρωσης του εύφλεκτου αερίου, σε μείγμα με αέρα, στα οποία δεν συμβαίνει διάδοση της φλόγας.  1.3. ΟΥΣΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Δεν καθορίζεται.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η συγκέντρωση αερίου στον αέρα αυξάνεται βαθμιαία και το μείγμα, σε κάθε στάδιο, εκτίθεται σε ηλεκτρικό σπινθήρα.  1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ  Δεν δηλώνονται.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Συσκευή  Ως δοχείο δοκιμής χρησιμοποιείται όρθιος γυάλινος κύλινδρος με εσωτερική διάμετρο 50 mm κατ'ελάχιστο και ύψος 300 mm κατ' ελάχιστο. Τα ηλεκτρόδια έναυσης έχουν μεταξύ τους απόσταση 3 έως 5 mm και είναι τοποθετημένα 60 mm πάνω από τον πυθμένα του κυλίνδρου. Ο κύλινδρος φέρει άνοιγμα εκτόνωσης της πίεσης. Η συσκευή πρέπει να θωρακίζεται για να περιορίζεται οποιαδήποτε ζημιά από έκρηξη.  Ως πηγή έναυσης χρησιμοποιείται σταθερός επαγωγικός σπινθήρας διάρκειας 0,5 δευτερολέπτων, που παράγεται από μετασχηματιστή υψηλής τάσης με τάση εξόδου 10 έως 15 KV (μέγιστη ισχύς εισόδου 300 W). Ένα παράδειγμα κατάλληλης συσκευής περιγράφεται στην παραπομπή (2). (2)   1.6.2. Συνθήκες δοκιμής  Η δοκιμή πρέπει να εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20  C).  1.6.3. Εκτέλεση της δοκιμής  Χρησιμοποιώντας αναλογικές αντλίες, εισάγεται στο γυάλινο κύλινδρο μείγμα γνωστής συγκέντρωσης αερίου σε αέρα. Διαμέσου του μίγματος διέρχεται σπινθήρας και παρατηρείται αν αποσπάται ή όχι από την πηγή έναυσης φλόγα και διαδίδεται ανεξάρτητα. Η συγκέντρωση του αερίου μεταβάλλεται κατά βαθμίδες της τάξης του 1 % κ.ο.κ. μέχρις ότου επέλθει ανάφλεξη όπως περιγράφεται πιο πάνω.  Εάν η χημική δομή του αερίου καταδεικνύει ότι αυτό θα πρέπει να είναι μη εύφλεκτο και ότι μπορεί να υπολογισθεί η σύσταση του στοιχειομετρικού μείγματος με αέρα, τότε, κατά βαθμίδες της τάξης του 1% χρειάζεται να εξετασθούν μόνο μείγματα που εμπίπτουν στην κλίμακα που αντιστοιχεί από 10% κάτω έως 10% πάνω από τη στοιχειομετρική σύσταση.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Η ύπαρξη διάδοσης της φλόγας είναι το μόνο σχετικό πληροφοριακό στοιχείο για τον προσδιορισμό της ιδιότητας αυτής.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - τις επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτοποίηση και προσμείξεις),  - μιά περιγραφή, με διαστάσεις, της χρησιμοποιηθείσας συσκευής,  - τη θερμοκρασία στην οποία έγινε η δοκιμή,  - τις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν και τα ληφθέντα αποτελέσματα,  - το αποτέλεσμα της δοκιμής: μη εύφλεκτο αέριο ή λίαν εύφλεκτο αέριο,  - στην περίπτωση που συμπεραίνεται ότι το αέριο είναι μη εύφλεκτο, τότε θα πρέπει να δηλώνεται η περιοχή συγκεντρώσεων στην οποία πραγματοποιήθηκαν δοκιμές κατά βαθμίδες της τάξης του 1 %,  - πρέπει να αναφέρεται κάθε πληροφορία και παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.  (2) W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse-Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. «Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen». Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol 56, 2, 126-127.  Α.12. ΑΝΑΦΛΕΞΙΜΟΤΗΤΑ (σε επαφή με νερό) 1. MΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Αυτή η μέθοδος δοκιμής μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εξετασθεί αν η αντίδραση μιάς ουσίας με νερό ή ένυγρο αέρα οδηγεί στην παραγωγή επικίνδυνων ποσοτήτων αερίου ή αερίων που μπορεί να είναι λίαν εύφλεκτα.  Η μέθοδος δοκιμής μπορεί να εφαρμοστεί και σε στερεές όπως και σε υγρές ουσίες. Δεν εφαρμόζεται για ουσίες που σε επαφή με τον αέρα αναφλέγονται αυθόρμητα.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Λίαν εύφλεκτες: ουσίες οι οποίες σε επαφή με το νερό ή με ένυγρο αέρα, εκλύουν λίαν εύφλεκτα αέρια σε επικίνδυνες ποσότητες με ελάχιστη ταχύτητα 1 λίτρο/χιλιόγραμμο ανά ώρα.  1.3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η ουσία εξετάζεται σύμφωνα με τη σταδιακή διαδικασία που περιγράφεται πιο κάτω G αν σε κάποιο στάδιο επέρχεται ανάφλεξη, δεν χρειάζεται περαιτέρω εξέταση. Αν είναι γνωστό ότι η ουσία δεν αντιδρά βίαια με το νερό, τότε προχωρούμε στο στάδιο 4 (1.3.4).  1.3.1. Στάδιο 1  Η εξεταζόμενη ουσία τοποθετείται σε δοχείο που περιέχει απεσταγμένο νερό στους 20  C και σημειώνεται αν το παραγόμενο αέριο αναφλέγεται ή όχι.  1.3.2. Στάδιο 2  Η εξεταζόμενη ουσία τοποθετείται πάνω σε διηθητικό χαρτί που επιπλέει στην επιφάνεια δοχείου το οποίο περιέχει απεσταγμένο νερό στους 20  C και σημειώνεται αν το παραγόμενο αέριο αναφλέγεται ή όχι. Το διηθητικό χαρτί χρησιμοποιείται απλά για να κρατήσει την ουσία σε μία θέση, πράγμα που αυξάνει τις πιθανότητες για ανάφλεξη.  1.3.3. Στάδιο 3  Η εξεταζόμενη ουσία διαμορφώνεται σε σωρό ύφους περίπου 2 cm και διαμέτρου 3 cm. Στο σωρό προσθέτονται λίγες σταγόνες νερό και σημειώνεται αν το παραγόμενο αέριο αναφλέγεται ή όχι.  1.3.4. Στάδιο 4  Η εξεταζόμενη ουσία ανακατεύεται με απεσταγμένο νερό 20  C και μετριέται η παραγωγή αερίου για περίοδο επτά ωρών ανά διαστήματα μίας ώρας. Αν ο ρυθμός παραγωγής του αερίου, μετά το επτάωρο, είναι ασταθής ή αυξάνεται, η περίοδος μετρήσεων θα έπρεπε να επεκταθεί σε ένα μέγιστο χρόνο πέντε ημερών. Ο έλεγχος πρέπει να διακοπεί αν η παραγωγή αερίου υπερβεί το 1 λίτρο/χιλιόγραμμο ανά ώρα.  1.4. ΟΥΣΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Δεν καθορίζεται.  1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ  Δεν δηλώνονται.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ  1.6.1 Στάδιο 1  1.6.1.1. Συνθήκες δοκιμής  Η δοκιμή εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20  C).  1.6.1.2. Εκτέλεση της δοκιμής  Μικρή ποσότητα της ελεγχόμενης ουσίας (διαμέτρου περίπου 2 mm) τοποθετείται σε δοχείο που περιέχει απεσταγμένο νερό. Θα πρέπει να σημειωθεί (i) αν παράγεται κανένα αέριο και (ii) αν παρουσιάζεται ανάφλεξη του αερίου. Αν το αέριο αναφλεγεί, δεν χρειάζεται περαιτέρω έλεγχος της ουσίας, δεδομένου ότι η ουσία θεωρείται επικίνδυνη. 1.6.2. Στάδιο 2  1.6.2.1. Συσκευή  Ένα διηθητικό χαρτί επιπλέει επίπεδο στην επιφάνεια απεσταγμένου νερού σε οποιοδήποτε κατάλληλο δοχείο, π.χ. ένα κρυσταλλωτήριο εξάτμισης διαμέτρου 100 mm.  1.6.2.2. Συνθήκες δοκιμής  Η δοκιμή εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20  C).  1.6.2.3. Εκτέλεση της δοκιμής  Μικρή ποσότητα της εξεταζόμενης ουσίας (διαμέτρου περίπου 2 mm) τοποθετείται στο κέντρο του διηθητικού χαρτιού. Θα πρέπει να σημειωθεί (i) αν παράγεται κανένα αέριο και (ii) αν παρουσιάζεται ανάφλεξη του αερίου. Αν το αέριο αναφλεγεί, δε χρειάζεται περαιτέρω έλεγχος της ουσίας, δεδομένου ότι η ουσία θεωρείται επικίνδυνη.  1.6.3. Στάδιο 3  1.6.3.1. Συνθήκες δοκιμής  Η δοκιμή εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20  C).  1.6.3.2. Εκτέλεση της δοκιμής  Η εξεταζόμενη ουσία γίνεται μία σωρός ύψους περίπου 2 cm και διαμέτρου 3 cm με κοίλωμα στην κορυφή. Προσθέτονται στο κοίλωμα μερικές σταγόνες νερού και σημειώνεται αν (i) παράγεται κανένα αέριο και (ii) αν συμβεί ανάφλεξη του αερίου. Αν το αέριο αναφλεγεί, δε χρειάζεται περαιτέρω έλεγχος της ουσίας, δεδομένου ότι η ουσία θεωρείται επικίνδυνη.  1.6.4. Στάδιο 4  1.6.4.1. Συσκευή  Η συσκευή στήνεται όπως εικονίζεται στην εικόνα.  1.6.4.2. Συνθήκες δοκιμής  Το δοχείο της εξεταζόμενης ουσίας ελέγχεται ως προς την τυχόν ύπαρξη σκόνης με μέγεθος σωματιδίων ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Συσκευή  Α.13. ΠΥΡΟΦΩΣΦΟΡΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΣΤΕΡΕΩΝ ΚΑΙ ΥΓΡΩΝ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Η δοκιμή έχει εφαρμογή σε στερεές και υγρές ουσίες, που αναφλέγονται αυθόρμητα, λίγη ώρα αφότου έλθουν σε επαφή με τον αέρα σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20  C).  Ουσίες που χρειάζεται να εκτεθούν στον αέρα επί ώρες ή ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου ή σε υψηλές θερμοκρασίες πριν να αναφλεγούν, δεν καλύπτονται από αυτυή τη μέθοδο δοκιμής.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Οι ουσίες θεωρούνται ότι είναι πυροφωσφορικές αν αναφλέγονται ή προκαλούν απανθράκωση κάτω από τις συνθήκες που περιγράφονται στο 1.6.  Μπορεί επίσης να χρειασθεί να ελεγχθεί η αυτοαναφλεξιμότητα των υγρών χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Α.15 Θερμοκρασία αυτοαναφλέξεως (υγρά και αέρια).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Δεν καθορίζονται.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η ουσία, στερεά ή υγρά, προστίθεται σε αδρανή φορέα και φέρεται σε επαφή με τον αέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για χρονικό διάστημα πέντε λεπτών. Αν οι υγρές ουσίες δεν αναφλέγονται, τότε αυτές προσροφούνται σε διηθητικό χαρτί και εκτίθενται στον αέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (περίπου 20  C) για πέντε λεπτά. Αν μια στερεά ή υγρά ουσία αναφλέγεται, ή μια υγρά ουσία αναφλέγεται ή απανθρακώνει ένα διηθητικό χαρτί, τότε η ουσία θεωρείται σαν πυροφωσφορι κή.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Επαναληψιμότητα: εξαιτίας της σπουδαιότητας που παρουσιάζει σε σχέση με το θέμα «ασφάλεια», και ένα μόνο θετικό αποτέλεσμα είναι αρκετό για να θεωρηθεί μία ουσία σαν πυροφωσφορική.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ  1.6.1. Συσκευή  Κάψα πορσελάνης με διάμετρο 10 cm περίπου γεμίζεται με γη διατόμων μέχρι ένα ύψος περίπου 5 mm σε θερμοκρασία δωματίου (περίπου 20  C).  Σημείωση:  Η γη διατόμων, ή οποιαδήποτε άλλη παρόμοια αδρανής ουσία που γενικά μπορεί να ληφθεί, πρέπει να θεωρείται σαν αντιπροσωπευτική του εδάφους στο οποίο μπορεί να χύνεται η εξεταζόμενη ουσία, σε περίπτωση ατυχήματος.  Για την εξέταση υγρών που δεν αναφλέγονται σε επαφή με αέρα όταν ευρίσκονται σε επαφή με αδρανή φορέα, απαιτείται ξηρό διηθητικό χαρτί.  1.6.2. Εκτέλεση της δοκιμής  α) Στερεά με μορφή σκόνης  1 έως 2 cm3 της εξεταζόμενης ουσίας χύνονται από ύψος 1 m περίπου πάνω σε μία άκαυστη επιφάνεια και παρατηρείται αν η ουσία αναφλέγεται κατά την απόχυση ή μέσα σε 5 λεπτά μετά την απόχυση.  Η δοκιμή εκτελείται έξι φορές εκτός κι αν επέλθει ανάφλεξη.  β) Υγρά  Περίπου 5 cm3 του εξεταζόμενου υγρού χύνονται μέσα σε μια προετοιμασμένη κάφα πορσελάνης και παρατηρείται αν η ουσία αναφλέγεται μέσα σε 5 λεπτά.  Εάν και στις έξι δοκιμές δεν επέλθει ανάφλεξη, εκτελούνται οι ακόλουθες δοκιμές:  Δείγμα 0,5 ml της εξεταζόμενης ουσίας φέρεται με σύριγγα σε πτυχωτό διηθητικό χαρτί και παρατηρείται αν μέσα σε πέντε λεπτά από την προσθήκη του υγρού επέρχεται ανάφλεξη ή απανθράκωση του διηθητικού χαρτιού. Η δοκιμή εκτελείται τρεις φορές, εκτός κι αν το χαρτί αναφλεγεί ή απανθρακωθεί.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  2.1. ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ  Αν σε κάποια από τις δοκιμές παρουσιασεί θετικό αποτέλεσμα, τότε η διαδικασία των δοκιμών μπορεί να διακοπεί.  2.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ  Αν μία ουσία αναφλεγεί μέσα σε πέντε λεπτά από την προσθήκη της σε αδρανή φορέα και την έκθεσή της στον αέρα, ή εάν υγρά ουσία προκαλέσει ανάφλεξη ή απανθράκωση διηθητικού χαρτιού μέσα σε πέντε λεπτά από την προσθήκη και έκθεσή της στον αέρα, τότε η ουσία αυτή χαρακτηρίζεται σαν πυροφωσφορική.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - τις επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτοποίηση και προσμείξεις),  - τα αποτελέσματα των δοκιμών,  - επιπρόσθετες παρατηρήσεις σχετικές με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, εφόσον υπάρχουν.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.  (2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.  A.14. ΕΚΡΗΚΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ  1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Η μέθοδος παρέχει ένα σχήμα δοκιμής για να προσδιορισθεί αν μία στερεά ή πολτώδης ουσία παρουσιάζει κίνδυνο έκρηξης όταν υφίσταται την επίδραση φλόγας (θερμική ευαισθησία) ή κρούσης ή τριβής (ευαισθησία σε μηχανικά ερεθίσματα) και αν μία υγρά ουσία παρουσιάζει κίνδυνο έκρηξης όταν υφίσταται την επίδραση φλόγας ή κρούσης.  Η μέθοδος περιλαμβάνει τρία μέρη:  α) δοκιμή θερμικής ευαισθησίας (1) G  β) δοκιμή μηχανικής ευαισθησίας όσον αφορά την κρούση (1) G  γ) δοκιμή μηχανικής ευαισθησίας όσον αφορά την τριβή (1).  Η μέθοδος παρέχει στοιχεία για την εκτίμηση της πιθανότητας πρόκλησης έκρηξης μέσω ορισμένων κοινών ερεθισμάτων. Η μέθοδος δεν αποσκοπεί στο να διαπιστωθεί αν μία ουσία είναι ικανή να εκραγεί κάτω από οποιεσδήποτε συνθήκες.  Η μέθοδος είναι κατάλληλη για να προσδιορισθεί αν μία ουσία παρουσιάζει κίνδυνο έκρηξης (θερμική και μηχανική ευαισθησία) κάτω από τις συγκεκριμένες συνθήκες που καθορίζονται στην οδηγία. Βασίζεται σ' ένα αριθμό τύπων συσκευών που χρησιμοποιούνται ευρέως διεθνώς (1) και που παρέχουν συνήθως σοβαρά αποτελέσματα. Αναγνωρίζεται ότι η μέθοδος δεν είναι καθοριστική. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί συσκευή διαφορετική από την καθοριζόμενη υπό την προϋπόθεση ότι αυτή αναγνωρίζεται διεθνώς και τα αποτελέσματα μπορούν να συσχετισθούν κατάλληλα με τα αποτελέσματα που παρέχει η προδιαγραφόμενη συσκευή. (1)   Οι δοκιμές δεν χρειάζεται να εκτελεσθούν όταν τα διαθέσιμα θερμοδυναμικά δεδομένα (π.χ. η θερμότητα σχηματισμού, η θερμότητα αποσύνθεσης) ή/και η μη ύπαρξη ορισμένων δραστικών ομάδων (2) στο συντακτικό της τύπο πείθουν πέρα από κάθε αμφιβολία ότι η ουσία δεν μπορεί να υποστεί ταχεία αποσύνθεση με έκλυση αερίων ή απελευθέρωση θερμότητας (δηλ. το υλικό δεν παρουσιάζει κανένα κίνδυνο έκρηξης). Για τα υγρά δεν απαιτείται δοκιμή μηχανικής ευαισθησίας όσον αφορά την τριβή. (2)   1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Εκρηκτικές:  Ουσίες που μπορεί να εκραγούν υπό την επίδραση φλόγας ή που είναι ευαίσθητες σε κρούση ή τριβή στην προδιαγραφόμενη συσκευή (ή είναι περισσότερο ευαίσθητες μηχανικά από το 1,3-δινιτροβενζόλιο σε εναλλακτική συσκευή).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  1,3- δινιτροβενζόλιο, τεχνητό κρυσταλλικό προϊόν που μπορεί να διέρχεται από κόσκινο με οπές 0,5 mm, για τη μέθοδο της τριβής και της κρούσης.  1,3,5-τριαζίνη, εξαϋδρο-1,3,5-τρινιτρο- (RDX, εξογόνο, κυκλονίτης - CAS 121-82-4), ανακρυσταλλωμένη από υδατική κυκλοεξανόνη, διερχόμενη υπό υγρά μορφή από κόσκινο με οπές 250 μm και συγκρατούμενη από κόσκινο με οπές 150 μm, ξηραμένη δε στους 103 ± 2  C (επί 4 ώρες) για τη δεύτερη σειρά δοκιμών τριβής και κρούσης.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Προκειμένου να διαμορφωθούν ασφαλείς συνθήκες για την πραγματοποίηση των τριών δοκιμών ευαισθησίας, απαιτούνται ορισμένες προκαταρκτικές δοκιμές.  1.4.1. Δοκιμές ασφαλούς χειρισμού (3) (3)   Για λόγους ασφαλείας, πριν να εκτελεσθούν οι βασικές δοκιμές, πολύ μικρά δείγματα (περίπου 10 mg) της ουσίας υποβάλλονται σε θέρμανση χωρίς περιορισμό σε φλόγα αερίου, σε κρούση σε οποιαδήποτε κατάλληλης μορφής συσκευή και σε τριβή χρησιμοποιώντας τη μέθοδο «σφυρί σε αμόνι» ή οποιαδήποτε μορφή μηχανής τριβής. Σκοπός είναι να διαπιστωθεί αν η ουσία είναι τόσο ευαίσθητη και εκρηκτική ώστε οι καθοριζόμενες δοκιμές ευαισθησίας, ιδιαίτερα η δοκιμή της θερμικής ευαισθησίας, να πρέπει να εκτελεσθούν με ιδιαίτερες προφυλάξεις ώστε να αποφευχθεί τραυματισμός του χειριστή.  1.4.2. Θερμική ευαισθησία  Η μέθοδος περιλαμβάνει θέρμανση της ουσίας σε ένα χαλύβδινο σωλήνα, που κλείνεται με τρυπημένες πλάκες με οπές διαφορετικής διαμέτρου, για να διαπιστωθεί αν η ουσία μπορεί να εκραγεί κάτω από συνθήκες έντονης θέρμανσης και καθορισμένου περιορισμού χώρου.  1.4.3. Μηχανική ευαισθησία (κρούση)  Η μέθοδος περιλαμβάνει κτύπημα της ουσίας από μία συγκεκριμένη μάζα που πέφτει από καθορισμένο ύψος.  1.4.4. Μηχανική ευαισθησία (τριβή)  Η μέθοδος περιλαμβάνει την υποβολή στερεών ή πολτωδών ουσιών σε τριβή μεταξύ τυποποιημένων επιφανειών κάτω από καθορισμένες συνθήκες φορτίου και σχετικής κίνησης.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Δεν δηλώνονται.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ1.6.1. Θερμική ευαισθησία (επίδραση φλόγας)  1.6.1.1. Συσκευή  Η συσκευή αποτελείται από ένα χαλύβδινο σωλήνα μιας χρήσης που κλείνεται με μια επαναχρησιμοποιούμενη διάταξη (εικόνα 1) και τοποθετείται μέσα σε μια θερμαντική και προστατευτική διάταξη. Κάθε σωλήνας είναι κατασκευασμένος από χαλύβδινο έλασμα με κυπελοειδή έλαση (βλ. Προσάρτημα) και έχει εσωτερική διάμετρο 24 mm, μήκος 75 mm και πάχος τοιχώματος 0,5 mm. Οι σωλήνες φέρουν στο ανοικτό άκρο φλάντζα ώστε να κλείνουν καλά με τη διάταξη κλεισίματος. Η διάταξη αυτή αποτελείται από μία, ανθεκτική στην πίεση τρυπητή πλάκα με μία τρύπα στο κέντρο, η οποία προσαρμόζεται σφικτά στο σωλήνα με τη βοήθεια ενός βιδωτού συνδέσμου που αποτελείται από δύο μέρη (παξιμάδι και κοχλιοτομημένο κολλάρο). Το παξιμάδι και το κοχλιοτομημένο κολλάρο είναι κατασκευασμένα από χρωμιομαγγανιούχο χάλυβα (βλ. Προσάρτημα) που μέχρι τους 800  C δεν δημιουργεί σπινθήρα. Οι τρυπητές πλάκες έχουν πάχος 6 mm, είναι κατασκευασμένες από θερμοανθεκτικό χάλυβα (βλ. Προσάρτημα) και είναι διαθέσιμες με τρύπες διαφόρων διαμέτρων.  1.6.1.2. Συνθήκες δοκιμής  Κανονικά η ουσία υποβάλλεται στη δοκιμή όπως έχει, αν και σε ορισμένες περιπτώσεις, π.χ. αν είναι συμπιεσμένη, χυτή ή με κάποιο άλλο τρόπο συμπυκνωμένη, μπορεί να χρειάζεται να υποβληθεί στη δοκιμή μετά από θρυματισμό.  Στα στερεά, η μάζα του υλικού που χρησιμοποιείται σε κάθε δοκιμή προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας μία διαδικασία ξηράς δοκιμής δύο σταδίων. Προζυγισμένος σωλήνας γεμίζεται με 9 cm3 ουσίας και η ουσία συμπιέζεται με δύναμη 80 Ν που εφαρμόζεται στην όλη διατομή του σωλήνα. Για λόγους ασφάλειας ή σε περιπτώσεις όπου η φυσική μορφή του δείγματος μπορεί να αλλοιωθεί με συμπίεση, μπορούν να χρησιμοποιηθούν άλλες διαδικασίες γεμίσματος G π.χ. αν η ουσία είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη στην τριβή, τότε δεν προσφέρεται για συμπίεση. Αν το υλικό είναι συμπιέσιμο τότε προστίθεται κι άλλο και συμπιέζεται μέχρις ότου ο σωλήνας να γεμίσει μέχρι τα 55 mm από την κορυφή. Προσδιορίζεται η συνολική μάζα που χρησιμοποιείται για να γεμίσει ο σωλήνας μέχρι του επιπέδου των 55 mm και γίνονται δύο ακόμη προσθήκες, που κάθε μία συμπιέζεται με δύναμη 80 Ν. Κατόπιν, ανάλογα, είτε προστίθεται είτε αφαιρείται υλικό ώστε ο σωλήνας να παραμείνει γεμισμένος μέχρι τα 15 mm από την κορυφή. Εκτελείται μία δεύτερη ξηρά δοκιμασία, ξεκινώντας με μία συμπιεσμένη ποσότητα ίση με το ένα τρίτο της συνολικής μάζας που χρησιμοποιήθηκε κατά την πρώτη ξηρά δοκιμασία. Πραγματοποιούνται δύο ακόμη προσθήκες ουσίας με συμπίεση 80 Ν και το επίπεδο της ουσίας στο σωλήνα προσαρμόζεται στα 15 mm από την κορυφή προσθέτοντας ή αφαιρώντας ανάλογα υλικό. Η ποσότητα του στερεού που προσδιορίζεται στη δεύτερη ξηρά δοκιμασία χρησιμοποιείται για κάθε δοκιμή G το γέμισμα πραγματοποιείται σε τρείς ίσες ποσότητες, που κάθε μία συμπιέζεται μέχρι τα 9 cm3 με την απαιτούμενη γι' αυτό δύναμη. (Αυτό μπορεί να διευκολυνθεί χρησιμοποιώντας διαχωριστικούς δακτυλίους).  Τα υγρά και οι πάστες φέρονται στο σωλήνα μέχρι ένα ύψος 60 mm προσέχοντας ιδιαίτερα τις πηκτές ουσίες για την αποφυγή δημιουργίας κενών. Το κοχλιοτομημένο κολλάρο τοποθετείται από κάτω στο σωλήνα, η κατάλληλη τρυπητή πλάκα εισάγεται και το παξιμάδι σφίγγεται αφού προστεθεί λίγο λιπαντικό από δισουλφίδιο του μολυβδαινίου. Ιδιαίτερη σημασία έχει να προσεχθεί ώστε μεταξύ της φλάντζας και της πλάκας, ή στο σπείρωμα, να μη παγιδευτεί καθόλου ουσία.  Η θέρμανση επιτυγχάνεται με προπάνιο από βιομηχανική οβίδα, εφοδιασμένη με ρυθμιστή πίεσης (60 έως 70 mbar), μέσω μετρητή και το οποίο προπάνιο κατανέμεται σε ίσα μέρη (όπως διαπιστώνεται οπτικά παρατηρώντας τις φλόγες από τους καυστήρες) με μία πολλαπλή βάνα στους τέσσερεις καυστήρες. Οι καυστήρες τοποθετούνται γύρω από το θάλαμο δοκιμής όπως εικονίζεται στην εικόνα 1. Οι τέσσερεις καυστήρες έχουν συνολική κατανάλωση περίπου 3.2 λίτρα προπανίου ανά λεπτό. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά και άλλα αέρια ή καυστήρες, η θέρμανση όμως πρέπει να είναι αυτή που καθορίζεται στην εικόνα 3. Σ'όλες τις συσκευές, η θέρμανση πρέπει να ελέγχεται κατά διαστήματα χρησιμοποιώντας σωλήνες γεμισμένους με φθαλικό διβουτυλεστέρα όπως εικονίζεται στην εικόνα 3.  1.6.1.3. Εκτέλεση των δοκιμών  Κάθε δοκιμή διαρκεί μέχρις ότου ο σωλήνας είτε θραυματιστεί ή θερμανθεί επί πέντε λεπτά. Μια δοκιμή που έχει σαν αποτέλεσμα το θραύσιμο του σωλήνα σε τρία ή περισσότερα κομμάτια, τα οποία σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να συνδέονται το ένα με το άλλο με στενές λωρίδες μετάλλου, όπως εικονίζεται στην εικόνα 2, αξιολογείται σαν δοκιμή που έχει σαν αποτέλεσμα έκρηξη. Δοκιμή που καταλήγει σε λιγότερα θραύσματα ή κατά την οποία δεν δημιουργούνται καθόλου θραύσματα, θεωρείται σαν δοκιμή που δεν δίνει έκρηξη.  Στην αρχή εκτελείται μία σειρά τριών δοκιμών με τρυπητή πλάκα διαμέτρου οπής 6.0 mm και, εφόσον δεν παρατηρηθούν εκρήξεις, εκτελείται μία δεύτερη σειρά τριών δοκιμών με τρυπητές πλάκες διαμέτρου οπής 2,0 mm. Εάν σε οποιαδήποτε από τις δύο σειρές δοκιμών παρατηρηθεί έκρηξη, δεν απαιτούνται άλλες δοκιμές.  1.6.1.4. Αξιολόγηση  Το αποτέλεσμα της δοκιμής θεωρείται θετικό αν σε οποιαδήποτε από τις πιο πάνω σειρές δοκιμών, παρατηρηθεί έκρηξη.  1.6.2. Μηχανική ευαισθησία (κρούση)  1.6.2.1. Συσκευή (εικόνα 4)  Τα βασικά μέρη μιας τυπικής συσκευής πτώσης σφύρας είναι ένα μπλοκ από χυτό χάλυβα με βάση, αμόνι, στήλη, οδηγούς, πίπτοντα βάρη, διάταξη απελευθέρωσης και υποδοχή δείγματος. Το χαλύβδινο αμόνι διαμέτρου 100 mm και ύφους 70 mm βιδώνεται στο πάνω μέρος ενός χαλύβδινου μπλοκ ύψους 200 mm, μήκους 230 mm και πλάτους 250 mm με μία χυτή βάση μήκους 450 mm, πλάτους 450 mm και ύφους 60 mm. Σε υποδοχέα βιδωμένο στο πίσω μέρος του χαλύβδινου μπλοκ στερεώνεται μία στήλη, κατασκευασμένη από ελατό χάλυβα χωρίς ραφή. Η συσκευή στερεώνεται σε ένα στερεό συμπαγές τεμάχιο 60 Χ 60 Χ 60 cm με τέσσερις βίδες, έτσι ώστε οι οδηγοί να είναι απολύτως κατακόρυφοι και τα βάρη να πέφτουν ελεύθερα. Χρησιμοποιούνται βάρη 5 και 10 χιλιογράμμων, κατασκευασμένα από στερεό χάλυβα. Η κεφαλή κρούσης κάθε βάρους είναι από βαμμένο χάλυβα, HRC 60 έως 63, και έχει ελάχιστη διάμετρο 25 mm.  Το εξεταζόμενο δείγμα τοποθετείται μέσα σε μία διάταξη κρούσης που αποτελείται από δύο ομοαξονικούς συμπαγείς χαλύβδινους κυλίνδρους, τον ένα πάνω στον άλλο, σε ένα κοίλο κυλινδρικό χαλύβδινο δακτύλιο-οδηγό. Οι συμπαγείς χαλύβδινοι κύλινδροι πρέπει να είναι διαμέτρου 10 ( 0,003,  0,005) mm και ύψους 10 mm με γυαλισμένες επιφάνειες, στρογγυλεμένες ακμές (ακτίνα καμπυλώματος 0,5 mm) και σκληρότητας HRC 58 έως 65. Ο κοίλος κύλινδρος πρέπει να έχει εξωτερική διάμετρο 16 mm, στιλβωμένο διάτρημα 10 (+0,005, +0,010) mm και ύψος 13 mm. Η διάταξη κρούσης προσαρμόζεται σε ένα ενδιάμεσο αμόνι (26 mm διάμετρος και 26 mm ύψος) κατασκευασμένο από χάλυβα και κεντράρεται με ένα δακτύλιο με τρύπες για να μπορούν να διαφεύγουν οι καπνοί.  1.6.2.2. Συνθήκες δοκιμής  Ο όγκος του δείγματος θα πρέπει να είναι 40 mm3ή τέτοιος που να ταιριάζει σε οποιαδήποτε εναλλακτική συσκευή. Οι στερεές ουσίες πρέπει να υποβάλλονται στη δοκιμή σε ξηρά κατάσταση και να παρασκευάζονται με τον πιο κάτω τρόπο:  α) οι ουσίες σε μορφή σκόνης κοσκινίζονται (μέγεθος οπών: 0,5 mm) G αυτό που περνάει από το κόσκινο χρησιμοποιείται για τη δοκιμή G  β) οι συμπιεσμένες, χυτές ή κατ' άλλο τρόπο συμπυκνωμένες ουσίες θραύονται σε μικρά τεμάχια και κοσκινίζονται G για τη δοκιμή χρησιμοποιείται το κλάσμα κοσκινίσματος διαμέτρου 0,5 έως 1 mm το οποίο και θα πρέπει να είναι αντιπροσωπευτικό της αρχικής ουσίας.  Οι ουσίες που προμηθεύονται σε μορφή πάστας πρέπει να δοκιμάζονται κατά το δυνατόν σε στεγνή κατάσταση ή σε οποιαδήποτε περίπτωση, αφού αφαιρεθεί όσο το δυνατόν περισσότερη ποσότητα αραιωτικού. Οι υγρές ουσίες υποβάλλονται στη δοκιμή με διάκενο 1 mm μεταξύ του πάνω και του κάτω κυλίνδρου.  1.6.2.3. Εκτέλεση δοκιμών  Πραγματοποιείται μία σειρά έξι δοκιμών με πτώση της μάζας των 10 χιλιογράμμων από 0,40 m (40 J). Εάν κατά τις έξι αυτές δοκιμές των 40 J παρατηρηθεί έκρηξη, πρέπει να εκτελεσθεί ακόμη μία σειρά 6 δοκιμών, με πτώση της μάζας των 5 kg από 0,15 m (7,5 J). Σε άλλες συσκευές, το δείγμα συγκρίνεται με την επιλεγείσα ουσία αναφοράς χρησιμοποιώντας μία καθιερωμένη διαδικασία (π.χ. τεχνική του επάνω-κάτω, κλπ.).  1.6.2.4. Αξιολόγηση  Το αποτέλεσμα της δοκιμής θεωρείται θετικό, αν παρατηρηθεί έκρηξη (σκάσιμο με φλόγα ή/και κρότο είναι ισοδύναμο με έκρηξη) σε μία τουλάχιστον από τις δοκιμές με την προδιαγεγραμμένη συσκευή κρούσης ή το δείγμα είναι πιο ευαίσθητο από 1,3-δινιτροβενζόλιο ή RDX σε εναλλακτικό τεστ κρούσης.  1.6.3. Μηχανική ευαισθησία (τριβή)  1.6.3.1. Συσκευή (εικόνα 5)  Η συσκευή τριβής αποτελείται από μία χαλύβδινη χυτή πλάκα σαν βάση στην οποία στερεώνεται η διάταξη τριβής. Αυτή αποτελείται από ένα σταθερό πάσσαλο πορσελάνης και κινούμενες πορσελάνινες πλάκες. Η πορσελάνινη πλάκα συγκρατείται σε ένα φορείο που κινείται σε δύο οδηγούς. Το φορείο συνδέεται με ένα ηλεκτρικό κινητήρα μέσω μιας συνδετικής ράβδου, μιας έκκεντρης τροχαλίας και κατάλληλης μετάδοσης κίνησης έτσι ώστε η πορσελάνινη πλάκα να κινείται, μια φορά μόνο, μπρος-πίσω κάτω από τον πάσσαλο πορσελάνης για διάστημα 10 mm. Ο πορσελάνινος πάσσαλος πρέπει να φορτισθεί, π.χ. με 120 ή 360 Ν.  Οι επίπεδες πορσελάνινες πλάκες κατασκευάζονται από λευκή τεχνητή πορσελάνη (τραχύτητα 9 έως 32 μm) και έχουν διαστάσεις 25 mm (μήκος) Χ 25 mm (πλάτος) Χ 5 mm (ύψος). Ο κυλινδρικός πορσελάνινος πάσσαλος είναι επίσης κατασκευασμένος από λευκή τεχνητή πορσελάνη και έχει μήκος 15 mm, διάμετρο 10 mm και τραχείες σφαιρικές ακραίες επιφάνειες με ακτίνα καμπύλωσης 10 mm.  1.6.3.2. Συνθήκες δοκιμής  Ο όγκος του δείγματος θα πρέπει να είναι 10 mm3 ή ο κατάλληλος για την εναλλακτική συσκευή όγκος.  Οι στερεές ουσίες υποβάλλονται στη δοκιμή σε ξηρά κατάσταση και προετοιμάζονται όπως παρακάτω:  α) οι ουσίες με μορφή σκόνης κοσκινίζονται (μέγεθος οπών κοσκίνου 0,5 mm) G για τη δοκιμασία χρησιμοποιείται το κλάσμα που περνάει διαμέσου του κοσκίνου G  β) οι συμπιεσμένες, χυτές ή κατ' άλλν τρόπο συμπυκνωμένες ουσίες θραύονται σε μικρά τεμάχια και κοσκινίζονται G για τη δοκιμή χρησιμοποιείται το κλάσμα κοσκινίσματος με διάμετρο ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Συσκευή δοκιμής θερμικής ευαισθησίας(όλες οι διαστάσεις σε χιλιοστόμετρα)  Εικ. 1α Χαλύβδινος σωλήνας Εικ. 1β Προστατευτική και εξαρτήματαθερμαντική διάταξη (1)σωλήνας(7)2 παξιμάδια για κλειδί N  36  (1α) εξωτερική φλάντζα(8)δοχείο αδιαπέρατο από (2) κοχλιοτομημένο κολλάροθραύσματα  σπείρωμα χαμηλής τριβής(9)2 ράβδοι υποστήριξης για (3) τρυπημένη πλάκα α= 2,0ήτο σωλήνα 6 mm διάμετρος(10)συναρμολογημένος σωλήνας (4)παξιμάδι β= 10 mm διάμετρος(11)θέση οπίσθιου καυστήρα.Οι (5) λοξοτομημένη επιφάνεια άλλοι καυστήρες είναι ορατοί (6)2 παξιμάδια για κλειδί N  41 (12)πίδακας-πιλότος  Εικόνα 2 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Δοκιμή θερμικής ευαισθησίας  Παραδείγματα θραυσματοποίησης  Εικόνα 3 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Βαθμονόμηση ταχύτητας θέρμανσης για τη δοκιμή θερμικής ευαισθησίας  Καμπύλη θερμοκρασίας/χρόνου που λαμβάνεται θερμαίνοντας φθαλικό διβουτυλεστέρα (27 cm3) σε κλειστό (τρυπητή πλάκα 1,5 mm) σωλήνα χρησιμοποιώντας προπάνιο με ταχύτητα ροής 3.2 λίτρα ανά λεπτό. Η θερμοκρασία μετριέται με ένα θερμοστοιχείο χρωμίου/αλουμινίου σε θήκη από ανοξείδωτο χάλυβα διαμέτρου 1 mm, τοποθετημένο κεντρικά 43 mm κάτω από το περιστόμιο του σωλήνα. Η ταχύτητα θέρμανσης μεταξύ 135 και 285  C θα πρέπει να είναι μεταξύ 185 και 215 K/min.  Εικόνα 4 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Συσκευή δοκιμής κρούσης(όλες οι διαστάσεις σε χιλιοστόμετρα)  Εικ. 4αΣυσκευή πίπτουσας σφύρας, εμπρόσθιαΕικ. 4βΠίπτουσα σφύρα, κάτω μέρος και πλαγία όψη, γενική άποψη  (1) βάση, 450 Χ 450 Χ 60(9) πίπτουσα σφύρα (πίπτουσα μάζα)  (2) χαλύβδινος κορμός, 230 Χ 250  Χ 200(10) διάταξη συγκράτησης και  (3) αμόνι, 100 διάμετρος Χ 70 απελευθέρωσης  (4) στήλη (11) πλάκα στερέωσης  (5) μεσαίο εγκάρσιο στέλεχος(12) ενδιάμεσο αμόνι (εναλλάξιμο),  (6) 2 οδηγοί 26 διάμετρος Χ 26  (7) οδοντωτός κανόνας(13) δακτύλιος στερέωσης με (8) βαθμολογημένη κλίμακα τρύπες (14) διάταξη κρούσης  Εικόνα 4  >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>(Συνέχεια) Εικ. 4γΔιάταξη κρούσης για ουσίες με μορφή  Eικ. 4δΔιάταξη κρούσης για υγρές ουσίες  >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> σκόνης ή πάστας(1) χαλύβδινοι κύλινδροι  (2) δακτύλιος οδηγός για χαλύβδινους κυλίνδρους  (3) δακτύλιος τοποθέτησης με τρύπες  (α) κατακόρυφη διατομή  (β) επίπεδη  (4) ελαστικός δακτύλιος  (5) υγρή ουσία (40 mm3)  (6) χώρος χωρίς υγρό  Εικ. 4εΣφύρα (πίπτουσα μάζα 5 Kg)  >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> (1) Πείρος ανάρτησης  (2) δείκτης ύψους  (3) χαραγή καθορισμού θέσης  (4) κυλινδρική κεφαλή κρούσης  (5) επαναφερόμενο μάνδαλο  Εικόνα 5 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Συσκευή ευαισθησίας σε τριβή   Εικ. 5α Συσκευή τριβής Εικ. 5β Αρχική θέση πασσάλου  Κάθετη και οριζόντια όψηστο δείγμα  (1) χαλύβδινη βάση(7) βραχίονας φόρτισης  (2) κινούμενο φορείο(8) αντίβαρο  (3) πορσελάνινη πλάκα, 25 Χ 25 Χ 5 mm,(9) διακόπτης  συγκρατούμενη στο φορείο(10) τροχός για την τοποθέτηση  (4) σταθερός πορσελάνινος πασσαλίσκος,του φορείου σε θέση εκκίνησης  10 διάμετρος Χ 15 mm(11) διεύθυνση προς τον ηλεκρικό  (5) δείγμα υπό δοκιμή, περίπου 10 mm3 κινητήρα  (6) υποδοχή πασσαλίσκου  Α.15. ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΑΥΤΟΑΝΑΦΛΕΞΗΣ ΓΙΑ ΥΓΡΑ ΚΑΙ ΑΕΡΙΑ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Οι εκρηκτικές ουσίες και οι ουσίες που αναφλέγονται αυθόρμητα σε επαφή με τον αέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος δεν θα πρέπει να υποβάλλονται στη δοκιμή αυτή. Η δοκιμή αυτή εφαρμόζεται σε αέρια, υγρά και ατμούς που, παρουσία αέρα, μπορούν να αναφλεγούν από μία θερμή επιφάνεια.  Η θερμοκρασία αυτοανάφλεξης μπορεί να μειωθεί σημαντικά εξαιτίας παρουσίας προσμείξεων που δρούν καταλυτικά, από το επιφανειακό υλικό ή εξαιτίας μεγαλύτερου όγκου του δοχείου δοκιμής 1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Ο βαθμός αυτοαναφλεξιμότητας εκφράζεται με βάση τη θερμοκρασία αυτοανάφλεξης. Θερμοκρασία αυτοανάφλεξης είναι η χαμηλότερη θερμοκρασία στην οποία αναφλέγεται η εξεταζόμενη ουσία όταν αναμειγνύεται με αέρα υπό τις συνθήκες που καθορίζονται στη μέθοδο δοκιμής.  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουσίες αναφοράς αναφέρονται στα πρότυπα (βλ. 1.6.3). Οι ουσίες αυτές θα πρέπει πρωταρχικά να χρησιμοποιούνται για να ελέγχεται η απόδοση της μεθόδου κατά διαστήματα και να γίνεται δυνατή η σύγκριση με αποτελέσματα από άλλες μεθόδους.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η μέθοδος προσδιορίζει την ελάχιστη θερμοκρασία της εσωτερικής επιφάνειας κλειστού χώρου που οδηγεί σε ανάφλεξη ενός αερίου, ατμών ή υγρού που εγχύεται στον κλειστό αυτό χώρο.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Η επαναληψιμότητα ποικίλλει ανάλογα με την περιοχή των θερμοκρασιών αυτοανάφλεξης και με την χρησιμοποιούμενη μέθοδο δοκιμής.  Η ευαισθησία και η εξειδίκευση εξαρτάται από τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο δοκιμής.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Συσκευή  Η συσκευή περιγράφεται στη μέθοδο που αναφέρεται στο σημείο 1.6.3.  1.6.2. Συνθήκες δοκιμής  Δείγμα της εξεταζόμενης ουσίας δοκιμάζεται σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται στο σημείο 1.6.3.1.6.3. Εκτέλεση της δοκιμής  Βλέπε IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Καταγράφεται η θερμοκρασία δοκιμής, η ατμοσφαιρική πίεση, η ποσότητα του χρησιμοποιούμενου δείγματος και ο χρόνος μέχρι να επέλθει ανάφλεξη.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - τις επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας (ταυτοποίηση και προσμείξεις),  - την ποσότητα του χρησιμοποιηθέντος δείγματος και την ατμοσφαιρική πίεση,  - τη χρησιμοποιηθείσα συσκευή,  - τα αποτελέσματα μετρήσεων (θερμοκρασία δοκιμής, αποτελέσματα που αφορούν την ανάφλεξη, αντίστοιχους χρόνους),  - κάθε πρόσθετη παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Ουδεμία.  Α.16. ΣΧΕΤΙΚΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΑΥΤΟΑΝΑΦΛΕΞΗΣ ΓΙΑ ΣΤΕΡΕΑ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Εκρηκτικές ουσίες και ουσίες που αναφλέγονται αυθόρμητα σε επαφή με τον αέρα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος δεν θα πρέπει να υποβάλλονται στη δοκιμή αυτή.  Σκοπός της δοκιμής αυτής είναι να δίνει προκαταρκτικές πληροφορίες για την αυτοαναφλεξιμότητα των στερεών ουσιών σε υψηλές θερμοκρασίες.  Αν η θερμότητα που αναπτύσσεται είτε από αντίδραση της ουσίας με οξυγόνο είτε από εξώθερμη αποσύνθεση δεν διαχέεται αρκετά γρήγορα στον περιβάλλοντα χώρο, επέρχεται αυτοθέρμανση που οδηγεί σε αυτοανάφλεξη. Κατά συνέπεια, αυτοανάφλεξη συμβαίνει όταν η ταχύτητα παραγωγής θερμότητας υπερβαίνει την ταχύτητα διάχυσης της θερμότητας.  Η δοκιμή είναι χρήσιμη σαν μία προκαταρκτική ερευνητική δοκιμή για τις στερεές ουσίες. Εξαιτίας της πολύπλοκης φύσης της ανάφλεξης και καύσης των στερεών, η θερμοκρασία αυτοανάφλεξης που προσδιορίζεται με τη μέθοδο της δοκιμής αυτής, θα πρέπει να χρησιμοποιείται για συγκριτικούς και μόνον σκοπούς.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Η θερμοκρασία αυτοανάφλεξης, όπως λαμβάνεται κατά τη μέθοδο αυτή, είναι η χαμηλότερη θερμοκρασία περιβάλλοντος σε  C στην οποία ένας ορισμένος όγκος μιας ουσίας αυτοαναφλέγεται κάτω από καθορισμένες συνθήκες.  1.3. ΟΥΣΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Ορισμένος όγκος της εξεταζόμενης ουσίας τοποθετείται σε φούρνο σε θερμοκρασία δωματίου G καταγράφεται η καμπύλη μεταβολής της θερμοκρασίας στο κέντρο του δείγματος ως συνάρτηση του χρόνου, ενώ η θερμοκρασία του φούρνου αυξάνεται στους 400  C ή μέχρι του σημείου τήξεως αν αυτό είναι χαμηλότερο, με ρυθμό 0,5  C/min. Για τον σκοπό της δοκιμής αυτής, η θερμοκρασία του φούρνου στην οποία η θερμοκρασία του δείγματος φτάνει τους 400  C με αυτοθέρμανση, καλείται θερμοκρασία αυτοανάφλεξης.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Συσκευή  1.6.1.1. Φούρνος  Εργαστηριακός φούρνος προγραμματιζόμενης θερμοκρασίας (όγκος περίπου 2 λίτρα), με φυσική κυκλοφορία αέρα και διέξοδο για περίπτωση έκρηξης. Για την αποφυγή πιθανού κινδύνου έκρηξης, αέρια προερχόμενα από τυχόν αποσύνθεση δεν πρέπει να μπορούν να έλθουν σε επαφή με τα ηλεκτρικά θερμαντικά στοιχεία.  1.6.1.2. Κύβος με συρμάτινο πλέγμα  Τεμάχιο συρμάτινου πλέγματος από ανοξείδωτο χάλυβα με ανοίγματα 0,045 mm κόβεται σύμφωνα με το υπόδειγμα της εικόνας 1. Το πλέγμα διπλώνεται και στερεώνεται με σύρμα σε μορφή κύβου ανοικτού στο πάνω μέρος.  1.6.1.3. Θερμοστοιχεία  Κατάλληλα θερμοστοιχεία.  1.6.1.4. Καταγραφέας  Οποιοσδήποτε καταγραφέας δύο καναλιών βαθμονομημένος από 0  C έως 600  C ή αντίστοιχη τάση.  1.6.2. Συνθήκες δοκιμής  Οι ουσίες εξετάζονται όπως παραλαμβάνονται.  1.6.3. Εκτέλεση της δοκιμής  Ο κύβος γεμίζεται με την εξεταζόμενη ουσία και κτυπιέται ελαφρά, προσθέτοντας κι άλλη ουσία μέχρις ότου ο κύβος να γεμίσει τελείως. Ο κύβος κατόπιν κρεμιέται στο κέντρο του φούρνου σε θερμοκρασία δωματίου. Στο κέντρο του κύβου τοποθετείται ένα θερμοστοιχείο ενώ το άλλο τοποθετείται μεταξύ του κύβου και του τοιχώματος του φούρνου για την καταγραφή της θερμοκρασίας του φούρνου.  Οι θερμοκρασίες του φούρνου και του δείγματος καταγράφονται συνεχώς ενώ η θερμοκρασία του φούρνου αυξάνεται στους 400  C ή μέχρι του σημείου τήξεως αν αυτό είναι χαμηλότερο, με ρυθμό 0,5  C/min.  Όταν η ουσία αναφλέγεται, το θερμοστοιχείο του δείγματος δείχνει μία ιδιαίτερα οξεία αύξηση της θερμοκρασίας πάνω από τη θερμοκρασία του φούρνου.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Για την αξιολόγηση, σημασία έχει η θερμοκρασία του φούρνου στην οποία η θερμοκρασία του δείγματος φθάνει τους 400  C με αυτοθέρμανση (βλ. εικόνα 2).  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - περιγραφή της προς εξέταση ουσίας,  - τα αποτελέσματα μετρήσεων συμπεριλαμβανομένης και της καμπύλης θερμοκρασίας/χρόνου,  - κάθε πρόσθετη παρατήρηση σχετική με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) NF T 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.  Εικόνα 1 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Υπόδειγμα κύβου ελέγχου 20 mm  Εικόνα 2 >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Τυπική καμπύλη θερμοκρασίας/χρόνου  Α.17. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ (ΣΤΕΡΕΑ) 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Πριν να εκτελεσθεί αυτή η δοκιμή, χρήσιμο είναι να έχουμε προκαταρκτικές πληροφορίες για την τυχόν ύπαρξη εκρηκτικών ιδιοτήτων στην ουσία.  Η δοκιμή αυτή δεν εφαρμόζεται σε υγρά, αέρια, εκρηκτικές ή λίαν εύφλεκτες ουσίες ή οργανικά υπεροξείδια.  Η δοκιμή αυτή δεν χρειάζεται να εκτελείται όταν ο συντακτικός τύπος της ουσίας δείχνει πέρα από κάθε αμφιβολία ότι η ουσία δεν μπορεί να αντιδράσει εξώθερμα με ένα καύσιμο υλικό.  Για να διαπιστωθεί αν η δοκιμή πρέπει να εκτελείται με κάποιες ειδικές προφυλάξεις, θα πρέπει να εκτελείται μία προκαταρκτική δοκιμή.  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Χρόνος καύσης: ο χρόνος αντίδρασης, σε δευτερόλεπτα, που απαιτείται για να διαδοθεί η ζώνη αντίδρασης κατά μήκος μιας στήλης, σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο σημείο 1.6.  Ταχύτητα καύσης: εκφραζόμενη σε mm/s.  Μέγιστη ταχύτητα καύσης: η υψηλότερη τιμή από τις ταχύτητες καύσης που λαμβάνονται με μείγματα που περιέχουν 10 % έως 90 % κατά βάρος οξειδωτικό.  1.3. ΟΥΣΙΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ως ουσία αναφοράς για τη δοκιμή και την προκαταρκτική δοκιμή χρησιμοποιείται νιτρικό βάριο (αναλυτικού βαθμού καθαρότητας).  Μείγμα αναφοράς είναι το μείγμα εκείνο νιτρικού βαρίου με κονιοποιημένη κυτταρίνη, που παρασκευάζεται σύμφωνα με το σημείο 1.6, το οποίο έχει τη μέγιστη ταχύτητα καύσης (συνήθως μείγμα με 60 % νιτρικό βάριο κατά βάρος).  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Για λόγους ασφάλειας εκτελείται μια προκαταρκτική δοκιμή. Οταν η προκαταρκτική δοκιμή δείχνει ξεκάθαρα ότι η εξεταζόμενη ουσία έχει οξειδωτικές ιδιότητες δεν απαιτείται περαιτέρω δοκιμασία. Σε αντίθετη περίπτωση, η ουσία θα πρέπει τότε να υποβάλλεται σε πλήρη δοκιμή.  Στην πλήρη δοκιμή, αναμειγνύονται σε διάφορες αναλογίες η εξεταζόμενη ουσία και μία ορισμένη καύσιμη ουσία. Κατόπιν, σε κάθε μείγμα δίνεται η μορφή στήλης και η στήλη αναφλέγεται στη μια άκρη. Η προσδιοριζόμενη μέγιστη ταχύτητα καύσης συγκρίνεται με τη μέγιστη ταχύτητα καύσης του μείγματος αναφοράς.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Εάν είναι απαραίτητο, κάθε μέθοδος άλεσης και ανάμειξης θεωρείται κατάλληλη, εφόσον η διαφορά στη μέγιστη ταχύτητα καύσης στις έξι διαφορετικές δοκιμές δεν διαφέρει από τη μέση αριθμητική τιμή περισσότερο από 10%. 1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασία  1.6.1.1. Εξεταζόμενη ουσία  Το εξεταζόμενο δείγμα μετατρέπεται σε σωματίδια μεγέθους ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Καλούπι και εξαρτήματα για την ετοιμασία της στήλης(Ολες οι διαστάσεις εκφράζονται σε mm)  ΜΕΡΟΣ Β: ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ: A. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή. Β. ΟΡΙΣΜΟΙ (i) Η οξεία τοξικότητα περιλαμβάνει τις δυσμενείς επιδράσεις που εμφανίζονται μέσα σε δεδομένο χρονικό διάστημα (συνήθως 14 ημέρες) μετά από τη χορήγηση μιας και μόνο δόσης μιας ουσίας.  (ii) Η LD50 (μέση θανατηφόρος δόση) είναι η στατιστικά υπολογισμένη μία και μοναδική δόση μιας ουσίας, η οποία αναμένεται να προκαλέσει το θάνατο στο 50% των εκτεθέντων ζώων. Η τιμή της LD50 εκφράζεται με το βάρος της ελεγχόμενης ουσίας προς τη μονάδα βάρους του πειραματόζωου (mg/kg).  (iii) Η LC50 (μέση θανατηφόρος συγκέντρωση) είναι η στατιστικά υπολογισμένη συγκέντρωση μιας ουσίας, η οποία αναμένεται να προκαλέσει το θάνατο, κατά την έκθεση ή μέσα σε προκαθορισμένο χρόνο μετά την έκθεση, στο 50% των εκτεθέντων σ' αυτή ζώων για ένα ορισμένο χρονικό διάστημα. Η τιμή της LC50 εκφράζεται με το βάρος της ελεγχόμενης ουσίας ανά σταθερό όγκο αέρα (mg/l).  (iv) Επίπεδο μη δυσμενών επιδράσεων είναι το μέγιστο επίπεδο δόσης ή έκθεσης που χρησιμοποιείται σε μια δοκιμή και το οποίο δεν προκαλεί κανένα ανιχνεύσιμο σημείο τοξικότητας.  (v) Η υποξεία/υποχρόνια τοξικότητα περιλαμβάνει τις δυσμενείς επιδράσεις που εμφανίζονται στα πειραματόζωα σαν αποτέλεσμα των επανειλημμένων ημερήσιων χορηγήσεων μιας χημικής ουσίας ή εκθέσεων σ'αυτή για ένα βραχύ διάστημα της αναμενόμενης διάρκειας ζωής τους.  (vi) Μέγιστη ανεκτή δόση (ΜΑΔ) είναι το υψηλότερο επίπεδο δόσης που προκαλεί, στη δοκιμή που χρησιμοποιείται, τοξικά φαινόμενα σε ζώα χωρίς να έχει μείζονες επιδράσεις στην επιβίωση τους.  (vii) Δερματικός ερεθισμός είναι η δημιουργία αντιστρεπτών φλεγμονωδών αλλοιώσεων στο δέρμα μετά την επίθεση της εξεταζόμενης ουσίας.  (viii) Ερεθισμός οφθαλμού είναι η δημιουργία αντιστρεπτών αλλοιώσεων στον οφθαλμό μετά την επίθεση της εξεταζόμενης ουσίας στην εμπρόσθια επιφάνεια του οφθαλμού.  (ix) Ευαισθητοποίηση δέρματος (δερματίτις απο αλλεργική επαφή) είναι η δερματική αντίδραση σε μια ουσία μέσω της ανοσολογικής οδού.  Ειδικοί ορισμοί για την αναπνευστική τοξικότητα  - ως αερόλυμα (αεροζόλ) χαρακτηρίζονται σωματίδια (στερεά ή/και υγρά) διεσπαρμένα ομοιογενώς στον αέρα.  - η αεροδυναμική διάμετρος είναι η διάμετρος μιας σφαίρας μοναδιαίας πυκνότητας (1 gcm 3) που έχει την ίδια τελική ταχύτητα καθίζησης με το θεωρούμενο σωματίδιο.  - η μέση αεροδυναμική διάμετρος μάζας (ΜΑΔΜ) είναι η υπολογιζόμενη αεροδυναμική διάμετρος που διαιρεί στη μέση την κατανομή μεγεθών του αερολύματος, όταν μετριέται κατά μάζα.  - η γεωμετρική τυπική απόκλιση (ΓΤΑ) είναι ο λόγος του εκτιμώμενου εκατοστιαίου ποσοστού 84 προς το εκατοστιαίο ποσοστό 50 και δείχνει την κλίση της καμπύλης της αθροιστικής κατανομής του μεγέθους των σωματιδίων, με την υπόθεση ότι η κατανομή του μεγέθους είναι λογαριθμικώς κανονική.  Ειδικοί ορισμοί για τη μέθοδο σταθερής δόσης κατά τον προσδιορισμό της οξείας τοξικότητας από το στόμα  - η έκδηλη τοξικότητα (evident toxicity) αναφέρεται σε τοξικές επιπτώσεις που παρατηρούνται μετά από χορήγηση μιας πειραματικής ουσίας, η οποία είναι τόσο ισχυρή ώστε η χορήγηση στο αμέσως υψηλότερο επίπεδο δόσης μπορεί να οδηγήσει σε θνησιμότητα.  - η διακρίνουσα δόση (discriminating dose) είναι το υψηλότερο απο τα τέσσερα επίπεδα σταθερής δόσης που μπορεί να χορηγηθεί χωρίς να προκαλέσει συνακόλουθη θνησιμότητα (συμπεριλαμβανομένων των ανώδυνων θανάτων).  Γ. ΜΕΤΑΛΛΑΞΟΓΕΝΕΣΗ(συμπεριλαμβανομένης και της δοκιμής προελέγχου καρκινογένεσης)  Για την προκαταρκτική εκτίμηση της ικανότητας μεταλλαξογένεσης μιας ουσίας, είναι αναγκαίο να αποκτηθούν πληροφορίες για δύο κατηγορίες τελικών απολήξεων, συγκεκριμένα, τη μετάλλαξη γονιδίων και τις χρωμοσωμικές ανωμαλίες.  Οι δύο αυτές τελικές απολήξεις αξιολογούνται με τις ακόλουθες δοκιμές:  (i) δοκιμές ως προς την παραγωγή γονιδιακών μεταλλάξεων (σημειακές μεταλλάξεις) σε προκαρυωτικά κύτταρα, όπως η Salmonella typhimurium. Δοκιμές με την Escherichia coli είναι επίσης επιτρεπτές. Η εκλογή ανάμεσα στους δύο αυτούς πειραματικούς οργανισμούς μπορεί να καθοριστεί από τη φύση της ελεγχόμενης χημικής ουσίας.  (ii) δοκιμές για την παραγωγή χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε κύτταρα θηλαστικών αναπτυχθέντα in vitro. Διαδικασία in vivo (όπως αυτή του μικροπυρήνα ή της ανάλυσης της μετάφασης στα κύτταρα του μυελού των οστών) είναι επίσης επιτρεπτή. Εντούτοις, στην περίπτωση απουσίας αντιθέτων ενδείξεων οι διαδικασίες in vitro προτιμούνται.  Δ. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Κατά την αξιολόγηση και ερμηνεία των δοκιμών πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ότι υπάρχουν περιορισμοί στην έκταση που τα αποτελέσματα στα ζώα και στις δοκιμές in vitro μπορούν να προεκταθούν απευθείας στον άνθρωπο.  Όπου υπάρχουν στοιχεία για παρενέργειες σε ανθρώπους, μπορεί αυτά να είναι σημαντικά για τον προσδιορισμό των πιθανών επιπτώσεων των χημικών ουσιών στον ανθρώπινο πληθυσμό.  Ε. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ  Η τοξικολογία είναι μία αναπτυσσόμενη πειραματική επιστήμη και υπάρχει άφθονη βιβλιογραφία για κάθε θέμα. Σχετικές πληροφορίες μπορούν να βρεθούν στις κατευθυντήριες οδηγίες δοκιμών του ΟΟΣΑ.  Πρόσθετες παρατηρήσεις  Φροντίδα ζώων  Για τις δοκιμές τοξικότητας ουσιαστικό ρόλο παίζει ο αυστηρός έλεγχος των περιβαλλοντικών συνθηκών και οι κατάλληλες τεχνικές φροντίδας των ζώων.  (i) Συνθήκες στέγασης  Οι περιβαλλοντικές συνθήκες στους θαλάμους ή περιφράγματα των πειραματοζώων θα πρέπει να είναι κατάλληλες για το κάθε είδος πειραματόζωου. Για τους επίμυες, ποντικούς και ινδικά χοιρίδια, κατάλληλες συνθήκες ειναι η θερμοκρασία δωματίου 22 ± 3  C με σχετική υγρασία 30% έως 70% G για τα κουνέλια η θερμοκρασία θα πρέπει να είναι 20 + 3  C με σχετική υγρασία 30% έως 70%.  Μερικές πειραματικές τεχνικές είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες στην επίδραση της θερμοκρασίας και, σ'αυτές τις περιπτώσεις, η περιγραφή της πειραματικής μεθόδου πρέπει να περιλαμβάνει και λεπτομέρειες για τις κατάλληλες συνθήκες. Σε όλες τις έρευνες για τις τοξικές επιδράσεις, η θερμοκρασία και η υγρασία πρέπει να παρακολουθούνται, να καταγράφονται και να περιλαμβάνονται στη σύνταξη της τελικής έκθεσης της μελέτης.  Όταν ο φωτισμός είναι τεχνητός, η φωτοπερίοδος πρέπει να αποτελείται από δώδεκα ώρες φωτός και δώδεκα ώρες σκότους. Λεπτομέρειες για τον προγραμματισμό της φωτοπεριόδου πρέπει να καταγράφονται και να περιλαμβάνονται στη σύνταξη της τελικής έκθεσης της μελέτης.  Στις εκθέσεις πειραματισμού στα ζώα, είναι σημαντικό να αναφέρεται ο τύπος των χρησιμοποιουμένων κλουβιών και ο αριθμός των ζώων ανά κλουβί, τόσο κατά την περίοδο έκθεσης στη χημική ουσία, όσο και κατά την περίοδο των παρατηρήσεων.  (ii) Συνθήκες διατροφής  Τα σιτηρέσια πρέπει να ανταποκρίνονται σε όλες τις διατροφικές απαιτήσεις του χρησιμοποιούμενου πειραματόζωου. Όταν οι ουσίες χορηγούνται στα ζώα μαζί με την τροφή τους, η θρεπτική αξία του σιτηρεσίου μπορεί να ελαττωθεί λόγω αλληλεπιδράσεων μεταξύ της ουσίας και των συστατικών της τροφής.  Η δυνατότητα μιας τέτοιας αντίδρασης πρέπει να λαμβάνεται υπόψη όταν γίνεται ερμηνεία των αποτελεσμάτων του πειράματος.  Τροφικές μολυσματικές ουσίες που είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την τοξικότητα δεν πρέπει να περιέχονται στο σιτηρέσιο σε ικανές συγκεντρώσεις.  Ζωική ευζωία  Κατά την επεξεργασία των μεθόδων δοκιμής, ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στη ζωική ευζωία. Μερικά παραδείγματα δίνονται σε συντομία παρακάτω χωρίς αυτός ο κατάλογος να είναι εξαντλητικός. Η επακριβής διατύπωση ή/και συνθήκες υπάρχουν στο κείμενο των μεθόδων:  - για τον προσδιορισμό της οξείας τοξικότητας απο το στόμα προτείνεται μια εναλλακτική μέθοδος «η τεχνική της σταθερής δόσης». Η τεχνική αυτή, δεν χρησιμοποιεί το θάνατο σαν ειδικό οριακό σημείο. Χρησιμοποιεί λιγότερα ζώα και προκαλεί λιγότερο πόνο και δυσφορία απ'ό,τι ο κλασσικός προσδιορισμός της οξείας τοξικότητας απο το στόμα,  - ο αριθμός των χρησιμοποιούμενων ζώων μειώνεται στο ελάχιστο επιστημονικά αποδεκτό: στις μεθόδους Β.1. και Β.3. γίνεται έλεγχος σε πέντε μόνο ζώα του ίδιου φύλου ανά επίπεδο δόσης G για τον προσδιορισμό της ευαισθητοποίησης του δέρματος χρησιμοποιούνται μόνο δέκα ζώα (και μόνο πέντε για τη μονάδα αρνητικoύ ελέγχου) απο τη δοκιμή μεγιστοποίησης στα ινδικά χοιρίδια(μέθοδος Β.6) G επίσης μειώνεται ο αριθμός των ζώων που χρειάζονται για το θετικό έλεγχο στη δοκιμή της μεταλλαξογένεσης in vivo (μέθοδοι Β.11 και Β.12),  - κατά τη διάρκεια των δοκιμών ελαχιστοποιείται ο πόνος και η δυσφορία των ζώων: ζώα που παρουσιάζουν έντονες και παρατεταμένες ενδείξεις δυσφορίας και πόνου ίσως να πρέπει να θανατωθούν ανώδυνα G η χορήγηση πειραματικών ουσιών κατά τρόπο που είναι γνωστό ότι προκαλεί έντονο πόνο και δυσφορία λόγω διαβρωτικών ή ερεθιστικών ιδιοτήτων (μέθοδοι Β.1, Β.2 και Β.3),  - ο πειραματισμός με υπερβολικά υψηλές δόσεις αποφεύγεται με την εισαγωγή οριακών δοκιμών, όχι μόνο στα πειράματα της οξείας τοξικότητας(μέθοδοι Β.1, Β.2 καί Β.3), αλλά και στα in vivo πειράματα για μεταλλαξογένεση (μέθοδοι Β.11 και Β.12),  - μια στρατηγική ελέγχου για ερεθιστικότητα επιτρέπει τώρα τη μη εκτέλεση ενός πειράματος ή τον υποβαθμισμό του σε μια απλή μελέτη ενός μόνου ζώου, εφόσον μπορούν να αποκτηθούν επαρκείς επιστημονικές αποδείξεις.  Οι επιστημονικές αυτές αποδείξεις μπορούν να βασίζονται στις φυσικοχημικές ιδιότητες της ουσίας, στα αποτελέσματα άλλων δοκιμών που έχουν ήδη πραγματοποιηθεί ή στα αποτελέσματα έγκυρων δοκιμών in vitro. Για παράδειγμα, αν με την ουσία έχει διενεργηθεί μελέτη οξείας τοξικότητας δια της δερματικής οδού με τη δόση της οριακής δοκιμής (μέθοδος Β.3) και δεν έχει παρατηρηθεί κανένας ερεθισμός του δέρματος, μπορεί να μη χρειάζεται η περαιτέρω δοκιμασία ως προς το δερματικό ερεθισμό (μέθοδος Β.4) G υλικά για τα οποία έχει διαπιστωθεί σαφής διαβρωτική ή σοβαρή δερματική ερεθιστικότητα κατά τη μελέτη του δερματικού ερεθισμού (μέθοδος Β.4) δεν θα πρέπει να υποβάλλονται σε περαιτέρω δοκιμασία ως προς την ικανότητα ερεθισμού στα μάτια (μέθοδος Β.5).  Β.1. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ (ΑΠΟ ΤΟ ΣΤΟΜΑ) 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Β).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η εξεταζόμενη ουσία χορηγείται από το στόμα, με οισοφαγικό καθετηριασμό, σε διαβαθμισμένες δόσεις σε ορισμένες ομάδες πειραματοζώων ενώ, χρησιμοποιείται μία δόση κατά ομάδα. Οι επιλεγόμενες δόσεις μπορεί να βασίζονται στα αποτελέσματα δοκιμής προσδιορισμού περιοχής. Ακολούθως, γίνονται παρατηρήσεις ως προς τις επιδράσεις και τους θανάτους. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμής νεκροτομούνται, όπως επίσης νεκροτομούνται και τα ζώα που επιζούν μετά το τέλος της δοκιμής. Η μέθοδος αυτή έχει πρωτίστως εφαρμογή για μελέτες σε τρωκτικά.  Τα ζώα που εμφανίζουν έντονα και διαρκή σημεία δυσφορίας και πόνου μπορεί να χρειάζεται να θανατωθούν ανώδυνα. Δεν χρειάζεται να γίνεται χορήγηση εξεταζόμενων ουσιών με τρόπο, ο οποίος είναι γνωστό ότι προκαλεί ιδιαίτερο πόνο καί δυσφορία λόγω διαβρωτικών ή ερεθιστικών ιδιοτήτων.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασίες  Τα ζώα κρατούνται, για τουλάχιστον πέντε ημέρες πριν από την έναρξη του πειράματος, στις πειραματικές συνθήκες εγκλωβισμού και διατροφής. Πριν από τη δοκιμή,γίνεται δειγματοληψία νεαρών, υγιών, ενήλικων ζώων και κατανομή σε πειραματικές ομάδες. Χρησιμοποιείται, όταν χρειάζεται, διάλυμα ή αιώρημα της ελεγχόμενης ουσίας. Όπου είναι δυνατόν, προτιμάται η χρήση υδατικού διαλύματος, στη συνέχεια η χρήση διαλυμάτων σε φυτικά λάδια και τέλος η δυνατότητα διάλυσης ή αιώρησης σε άλλους φορείς. Για μη υδατικούς φορείς, τα σχετικά τοξικά χαρακτηριστικά τους πρέπει να είναι γνωστά ή να προσδιορίζονται πριν ή κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Για τα τρωκτικά, ο όγκος του φορέα δεν πρέπει κανονικά να υπερβαίνει τα 10 ml/kg βάρους του σώματος, εκτός από την περίπτωση των υδατικών διαλυμάτων όπου μπορεί να χρησιμοποιείται όγκος φορέα 20 ml/kg. Μεταβλητότητα στο χορηγούμενο όγκο πρέπει να ελαχιστοποιείται με την προσαρμογή της συγκεντρώσεως, ώστε να εξασφαλίζεται ο σταθερός όγκος για όλες τις χορηγούμενες δόσεις.  1.6.2. Συνθήκες δοκιμής  1.6.2.1. Πειραματόζωα  Εφόσον δεν υπάρχουν αντενδείξεις, ο επίμυς είναι το προτιμόμενο είδος.  Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται οι συνήθως χρησιμοποιούμενες εργαστηριακές φυλές. Για κάθε φύλο, το εύρος της διαφοράς βαρών των ζώων στην αρχή της δοκιμής δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το ± 20 % της συνιστάμενης μέσης τιμής.  1.6.2.2. Αριθμός και φύλο  Σε κάθε επίπεδο δόσης χρησιμοποιούνται τουλάχιστον πεντε τρωκτικά. Όλα θα πρέπει να είναι του ίδιου φύλου. Αν χρησιμοποιούνται θηλυκά, θα πρέπει να είναι άτοκα και να μην ευρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Όπου υπάρχουν πληροφορίες ότι ένα από τα δύο φύλα είναι πολύ περισσότερο ευαίσθητο, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται για τη δοκιμή ζώα του φύλου αυτού.  Σημείωση: Σε δοκιμές οξείας τοξικότητας με ζώα υψηλότερης τάξης από την τάξη των τρωκτικών, θα πρέπει να εξετάζεται η ενδεχόμενη χρησιμοποίηση μικρότερου αριθμού ζώων.  Οι δόσεις θα πρέπει να επιλέγονται με προσοχή, ενώ θα πρέπει να καταβάλλεται κάθε προσπάθεια ώστε να μη γίνεται υπέρβαση μετρίως τοξικών δόσεων. Στις δοκιμές αυτές, θα πρέπει να αποφεύγεται η χορήγηση θανατηφόρων δόσεων της εξεταζόμενης ουσίας.  1.6.2.3. Επίπεδα δόσεων  Τα επίπεδα των δόσεων θα πρέπει να είναι επαρκή ως προς τον αριθμό, τουλάχιστον τρία και να απέχουν μεταξύ τους αρκετά ώστε να παρέχουν ομάδες πειραματισμού με εύρος τοξικών επιδράσεων και ποσοστών θνησιμότητας. Τα δεδομένα θα πρέπει να είναι αρκετά για τη χάραξη καμπύλης δόσεως/αποκρίσεως και, όπου είναι δυνατό, να δίνουν τη δυνατότητα αποδεκτού προσδιορισμού της LD50.  1.6.2.4. Οριακή δοκιμή  Όταν χρησιμοποιούνται τρωκτικά, μπορεί να πραγματοποιηθεί οριακή δοκιμή σε επίπεδο μιας δόσης τουλάχιστον 2 000 mg/kg βάρους σώματος, σε ομάδα πεντε αρσενικών και πεντε θηλυκών, χρησιμοποιώντας τις διαδικασίες που περιγράφονται ανωτέρω. Αν σημειωθεί θνησιμότητα σχετιζόμενη με τη χορήγηση της ουσίας, θα πρέπει να εξετασθεί η ανάγκη πλήρους μελέτης.  1.6.2.5. Περίοδος παρατηρήσεως  Η περίοδος παρατηρήσεως θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 14 ημέρες. Εντούτοις, η διάρκεια των παρατηρήσεων δεν πρέπει να είναι αυστηρά καθορισμένη. Αυτή θα προσδιορίζεται από τις τοξικές αντιδράσεις, την ταχύτητα εμφανίσεως τους και τη διάρκεια του χρόνου που απαιτείται για την ανάρρωση. Έτσι η περίοδος μπορεί να επεκταθεί, αν αυτό κριθεί αναγκαίο. Ο χρόνος εμφανίσεως και εξαφανίσεως των τοξικών συμπτωμάτων και ο χρόνος θανάτου είναι σημαντικοί, κυρίως όταν παρατηρείται μια τάση θνησιμότητας που επακολουθεί αργότερα.  1.6.3. Διαδικασία  Τα ζώα πρέπει να υποβάλλονται σε νηστεία πριν από τη χορήγηση της ουσίας. Ο επίμυς πρέπει να μένει χωρίς τροφή όλη τη νύκτα. Για ζώα με υψηλότερο μεταβολισμό, συνιστάται μικρότερη περίοδος νηστείας. Για χορήγηση νερού δεν υπάρχει περιορισμός. Την επόμενη ημέρα, τα ζώα πρέπει να ζυγίζονται και κατόπιν να τους χορηγείται η εξεταζόμενη ουσία, με οισοφαγικό καθετηριασμό, σε μία μόνο δόση. Αν η χορήγηση μίας μόνο δόσεως δεν είναι δυνατή, η δόση μπορεί να χορηγείται σε μικρότερα κλάσματα, σε μία περίοδο που δεν υπερβαίνει τις 24 ώρες.  Μετά τη χορήγηση της ουσίας, δεν πρέπει να παρέχεται τροφή για άλλες τρεις - τέσσερις ώρες. Όταν μία δόση χορηγείται κατά κλάσματα μέσα σε μία χρονική περίοδο, ίσως χρειασθεί η χορήγηση τροφής και νερού και αυτό θα εξαρτηθεί από τη διάρκεια χορηγήσεως της χημικής ουσίας. Μετά τη χορήγηση της ουσίας, γίνονται παρατηρήσεις που θα πρέπει να καταγράφονται συστηματικά και ατομικά για κάθε ζώο. Κατά τη διάρκεια της πρώτης ημέρας, οι παρατηρήσεις πρέπει να γίνονται συχνά.  Πρέπει να γίνεται μία προσεκτική κλινική εξέταση, τουλάχιστον μια φορά κάθε εργάσιμη ημέρα, άλλες παρατηρήσεις πρέπει να γίνονται καθημερινά και να λαμβάνονται τα απαραίτητα μέτρα για την ελάττωση απωλειών ζώων, π.χ. νεκροψία ή ψύξη των ζώων που βρέθηκαν νεκρά και απομόνωση ή θανάτωση των εξασθενημένων ή ετοιμοθάνατων ζώων. Οι παρατηρήσεις πρέπει να περιλαμβάνουν τις αλλαγές στο δέρμα και στο τρίχωμα, στα μάτια και στους βλεννογόνους, όπως επίσης και τις αλλαγές του αναπνευστκού, κυκλοφοριακού, αυτόνομου και κεντρικού νευρικού συστήματος, της σωματοκινητικής δραστηριότητας και του τρόπου συμπεριφοράς. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται στις παρατηρήσεις σπασμών, σιελόρροιας, διάρροιας, λήθαργου, ύπνου και κώματος. Ο χρόνος θανάτου πρέπει να καταγράφεται όσο το δυνατόν ακριβέστερα.  Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας και εκείνα που επιζούν στο τέλος του πειράματος υπόκεινται σε νεκροψία. Όλες οι μακροσκοπικά παρατηρούμενες παθολογικές αλλαγές πρέπει να καταγράφονται. Όπου ενδείκνυται, πρέπει να λαμβάνονται ιστοί για ιστοπαθολογική εξέταση.  Εκτίμηση τοξικότητας στο άλλο φύλο  Μετά από τη συμπλήρωση της μελέτης σε ένα φύλο, υποβάλλεται στη χορήγηση ουσίας μία τουλάχιστον ομάδα από πεντε ζώα του άλλου φύλου προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι ζώα του φύλου αυτού δεν είναι σε ιδιαίτερο βαθμό πιο ευαίσθητα στην εξεταζόμενη ουσία. Σε συγκεκριμένες περιπτώσεις, μπορεί να δικαιολογείται η χρησιμοποίηση λιγότερων ζώων. Όπου υπάρχουν σαφείς πληροφορίες ότι τα ζώα του εξεταζόμενου φύλου είναι εμφανώς περισσότερο ευαίσθητα, μπορεί να μη χρειασθεί να πραγματοποιηθεί η δοκιμή και σε ζώα του άλλου φύλου.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα πρέπει να παρουσιάζονται συνοπτικά σε πίνακα στον οποίο θα φαίνονται, για κάθε πειραματική ομάδα, ο αριθμός των ζώων κατά την έναρξη του πειράματος, χρόνος θανάτου για κάθε ζώο χωριστά, ο αριθμός των ζώων που εμφανίζουν άλλα συμπτώματα τοξικότητας, περιγραφή τοξικών συμπτωμάτων και τα αποτελέσματα της νεκροψίας. Το βάρος κάθε ζώου πρέπει να προσδιορίζεται και να καταγράφεται λίγο πριν από τη χορήγηση της ελεγχόμενης ουσίας, κατόπιν ανά εβδομάδα και κατά το θάνατο. Οι αλλαγές στο βάρος πρέπει να υπολογίζονται και να καταγράφονται, εφόσον τα ζώα επιζούν περισσότερο από μία ημέρα μετά τη χορήγηση. Τα ζώα που θανατώνονται ανωδυνα λόγω αγωνίας ή πόνου που έχει σχέση με την ουσία, καταγράφονται ως θάνατοι που σχετίζονται με την ουσία. Η LD50 μπορεί να προσδιοριστεί με μια αναγνωρισμένη μέθοδο. Η αξιολόγηση των δεδομένων πρέπει να περιλαμβάνει τη σχέση, εάν υπάρχει, μεταξύ της εκθέσεως των ζώων στην ελεγχόμενη ουσία και της συχνότητας και σοβαρότητας όλων των ανωμαλιών, συμπεριλαμβανομένων των ανωμαλιών συμπεριφοράς και των κλινικών ανωμαλιών, μακροσκοπικών αλλοιώσεων, αλλαγών του σωματικού βάρους, της θνησιμότητας και άλλων τοξικών επιπτώσεων.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. Έκθεση δοκιμής  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - είδος, φυλή, πηγή, περιβαλλοντικές συνθήκες, διατροφή, κλπ.,  - συνθήκες δοκιμής,  - επίπεδα δόσεων (με φορέα, εφόσον χρησιμοποιήθηκε, και συγκέντρωση),  - φύλο των εξετασθέντων ζώων,  - κατάταξη σε πίνακα των δεδομένων αποκρίσεως κατά φύλο και επίπεδο δόσεως (δηλ. αριθμός ζώων που πέθαναν ή θανατώθηκαν κατά τη διάρκεια της δοκιμής, αριθμός ζώων με συμπτώματα τοξικότητας, αριθμός ζώων που εκτέθηκαν),  - χρόνος θανάτου μετά τη χορήγηση της ουσίας, λόγοι και κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την ανώδυνη θανάτωση ζώων,  - όλες οι παρατηρήσεις,  - η τιμή LD50 για το φύλο που υποβλήθηκε σε πλήρη μελέτη προσδιορισμένη τη 14η ημέρα (με την καθορισμένη μέθοδο προσδιορισμού),  - όριο αξιοπιστίας 95 % για την LD50 (όπου είναι δυνατόν),  - καμπύλη δόσης/θνησιμότητας και κλίση (όπου το επιτρέπει η μέθοδος προσδιορισμού),  - ευρήματα νεκροφίας,  - κάθε ιστοπαθολογικό εύρημα,  - αποτελέσματα οποιασδήποτε δοκιμής στο άλλο φύλο,  - συζήτηση των αποτελεσμάτων (ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δοθεί στο αποτέλεσμα που μπορεί να έχει στην υπολογιζόμενη τιμή LD50 η ανώδυνη θανάτωση ζώων κατά τη διάρκεια της δοκιμής),  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. Αξιολόγηση και ερμηνεία  Βλ. Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλ. Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  Β.1α ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ (ΑΠΟ ΣΤΟΜΑ) - ΜΕΘΟΔΟΣ ΣΤΑΘΕΡΗΣ ΔΟΣΗΣ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε «Γενική Εισαγωγή», μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε «Γενική Εισαγωγή», μέρος Β (Β).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Το πείραμα για την οξεία από στόματος τοξικότητα παρέχει πληροφορίες για τις δυσάρεστες επιπτώσεις που μπορούν να ακολουθήσουν, σε μία βραχεία χρονική περίοδο, την κατάποση μιας απλής δόσης της πειραματικής ουσίας.  Η μέθοδος σταθερής δόσης πραγματοποιείται σε δύο στάδια.  Στην προκαταρκτική μελέτη προσδιορισμού, χορηγούνται από στόματος, με καθετήρα στομάχου, διαφορετικές δόσεις σε μία ομάδα ζώων του ιδίου φύλου και εξετάζονται κατά συστηματικό τρόπο. Η μελέτη παρατήρησης δίνει πληροφορίες για τη σχέση δόσης-τοξικότητας παρέχοντας επίσης μια εκτίμηση για την κατώτερη δόση θνησιμότητας. Συνήθως, δεν χρησιμοποιούνται περισσότερα από 5 ζώα σ'αυτή την πρώτη φάση.  Στην κυρίως μελέτη η εξεταζόμενη ουσία χορηγείται από στόματος, με καθετήρα στομάχου, σε μια ομάδα που αποτελείται από 5 αρσενικά καί 5 θηλυκά ζώα σε ένα από τα προκαθορισμένα επίπεδα δόσης  (5, 50, 500 ή 2 000 mg/kg).Η χρησιμοποιούμενη δόση επιλέγεται από τη μελέτη παρατήρησης και είναι αυτή που πιθανόν θα προκαλέσει «έκδηλη τοξικότητα» (βλέπε σημείο 1.2 Ορισμοί) αλλά όχι θανάτους.  Μετά τη χορήγηση γίνονται παρατηρήσεις για τις επιδράσεις.  Σε περίπτωση που το επίπεδο της αρχικής δόσης που επιλέγεται προκαλεί έκδηλη τοξικότητα αλλά όχι συνακόλουθη θνησιμότητα, δεν απαιτούνται άλλα πειράματα.  Σε περίπτωση που δεν παρατηρηθεί έκδηλη τοξικότητα στο επίπεδο δόσης που επιλέχθηκε, θα πρέπει να γίνει εκ νέου έλεγχος της ουσίας στο αμέσως υψηλότερο επίπεδο δόσης. Σε περίπτωση που τα ζώα πεθαίνουν ή που η ισχυρή τοξική αντίδραση απαιτεί την ανώδυνη θανάτωση των ζώων, θα πρέπει να γίνει νέος έλεγχος της ουσίας στο αμέσως χαμηλότερο επίπεδο δόσης.  Η διαδικασία αυτή επιτρέπει τον καθορισμό της «διακρίνουσας δόσης» (discriminating dose), (βλέπε σημείο 1.2 «Ορισμοί») δηλαδή του υφηλότερου από τα προκαθορισμένα επίπεδα δόσης που μπορεί να χορηγηθούν χωρίς να προκαλέσουν θνησιμότητα (συμπεριλαμβανομένων των ανώδυνων θανατώσεων).  Τα ζώα που παρουσιάζουν ισχυρές και παρατεταμένες ενδείξεις δυσφορίας και πόνου ίσως να πρέπει να θανατωθούν ανώδυνα. Η χορήγηση δόσεων των πειραματικών ουσιών κατά τρόπο που είναι γνωστό ότι προκαλεί καταφανή πόνο και δυσφορία που οφείλεται σε διαβρωτικές ή ερεθιστικές ιδιότητες δεν πρέπει να γίνεται.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασίες  1.6.1.1. Πειραματόζωα  Το προτιμώμενο είδος είναι ο επίμυς, εκτός αν υπάρχουν αντενδείξεις.  Πρέπει να χρησιμοποιούνται οι συνηθισμένες εργαστηριακές ποικιλίες. Για κάθε φύλο, στην αρχή του πειράματος, το εύρος της απόκλισης βάρους των ζών που χρησιμοποιούνται δεν πρέπει να υπερβαίνει το ± 20 % της ενδεδειγμένης μέσης τιμής.  Τα ζώα διατηρούνται στις πειραματικές συνθήκες εγκλωβισμού και διατροφής για τουλάχιστον πέντε μέρες πριν από την έναρξη του πειράματος. Πριν από το πείραμα, ξεχωρίζονται με τυχαία επιλογή υγιή, νεαρά, ενήλικα ζώα και εντάσσονται στις ομάδες της μελέτης προσδιορισμού και στις ομάδες της κυρίως μελέτης. Στην πράξη, ίσως να απαιτείται μία μόνο ομάδα από κάθε φύλο για την κυρίως μελέτη.  1.6.1.2. Προετοιμασία δόσης και χορήγηση  Εφόσον χρειάζεται, η πειραματική ουσία διαλύεται ή εναιωρείται σε κατάλληλο έκδοχο. Συνιστάται, όπου είναι δυνατό, να προτιμάται η χρήση υδατικού διαλύματος, μετά διάλυμα σε φυτικό έλαιο και τέλος η δυνατότητα διάλυσης σε άλλα έκδοχα, ή εναιώρημα. Για μη υδατικά έκδοχα, θα πρέπει να είναι γνωστά ή να προσδιορίζονται κατά τη διάρκεια του πειράματος τα σχετικά τοξικά χαρακτηριστικά. Στα τρωκτικά, ο όγκος κανονικά δεν πρέπει vα υπερβαίνει τα 10 ml/kg βάρους του σώματος εκτός από την περίπτωση υδατικών διαλυμάτων όπου μπορούν να χρησιμοποιηθούν 20 ml/kg. Οι διακυμάνσεις του πειραματικού όγκου θα πρέπει να ελαχιστοποιούνται ρυθμίζοντας τη συγκέντρωση έτσι ώστε να εξασφαλίζεται ένας σταθερός όγκος σε όλα τα επίπεδα δόσης.  Τα ζώα θα πρέπει πρίν από τη χορήγηση της ουσίας να είναι νηστικά. Προκειμένου για τον επίμυ, θα πρέπει να του στερηθεί τροφή επί μία νύχτα G στο νερό δεν υπάρχει περιορισμός. Την επόμενη ημέρα, τα ζώα θα πρέπει να ζυγιστούν και στη συνέχεια να χορηγηθεί η πειραματική ουσία με καθετήρα στομάχου σε μια δόση. Αν η χορήγηση δεν μπορεί να γίνει σε μια μόνο δόση, τότε αυτή δίνεται τμηματικά κατά τη διάρκεια περιόδου όχι μεγαλύτερης των 24 ωρών. Αφού χορηγηθεί η ουσία, μπορεί να στερηθεί η τροφή για 3 έως 4 ώρες ακόμα. Σε περίπτωση που η δόση χορηγείται τμηματικά κατά τη διάρκεια μιας περιόδου, ίσως να είναι αναγκαίο να δοθεί στα ζώα τροφή και νερό ανάλογα με τη διάρκεια αυτής της περιόδου.  1.6.2. Διαδικασία  1.6.2.1. Μελέτη προσδιορισμού  Οι επιπτώσεις των διαφορετικών δόσεων εξετάζονται σε ξεχωριστά ζώα. Κανονικά θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν θηλυκά ζώα σε περίπτωση απουσίας πληροφοριών που δείχνουν ότι τα αρσενικά θα είναι το πιο ευαίσθητο φύλο. Οι δόσεις χορηγούνται κατά συστηματικό τρόπο, αφήνοντας τουλάχιστον 24 ώρες μεταξύ της χορήγησης στο επόμενο ζώο. Όλα τα ζώα παρατηρούνται προσεκτικά γιά την εμφάνιση ενδείξεων τοξικότητας τουλάχιστον για μία περίοδο 7 ημερών G εάν ενδείξεις μέτριας τοξικότητας εμμένουν για 7 ημέρες, το ζώο θα πρέπει να παρατηρηθεί για 7 ημέρες επιπλέον. Τα αρχικά χορηγούμενα επίπεδα δόσης είναι τα εξής: 5, 50, 500, 2 000 mg/kg. Αν η αρχικά επιλεγόμενη δόση δεν προκαλέσει έκδηλη τοξικότητα, και το αμέσως υψηλότερο επίπεδο δόσης προκαλέσει θνησιμότητα, τότε είναι απαραίτητο να ελεγχθούν ένα ή περισσότερα από τα ενδιάμεσα επίπεδα δόσης όπως ενδείκνυται. Κατ'αυτό τον τρόπο θα είναι δυνατόν να αποκτηθούν πληποφορίες σχετικά με το επίπεδο(α) δόσης(εων) που προκαλεί(ούν) κάποιες ενδείξεις τοξικότητας και το κατώτερο επίπεδο δόσης που προκαλεί θνησιμότητα.  Προσπάθεια θα πρέπει να καταβληθεί προκειμένου να επιλεγεί η αρχική δόση χρησιμοποιώντας στοιχεία από σχετικές χημικές ουσίες. Σε περίπτωση που τέτοιου είδους πληροφορίες δεν είναι διαθέσιμες, συνιστάται να χρησιμοποιηθεί αρχικά η δόση των 500 mg/kg. Εάν δεν υπάρχουν ενδείξεις τοξικότητας κατά τη χορήγηση της αρχικής δόσης, στην συνέχεια εξετάζεται το υψηλότερο επίπεδο δόσης. Εάν δεν εμφανίζεται θνησιμότητα στα 2 000 mg/kg, θεωρείται ότι η μελέτη προσδιορισμού έχει ολοκληρωθεί και η κυρίως μελέτη θα πρέπει να αρχίσει σ'αυτό το επίπεδο δόσης. Στην περίπτωση έντονων επιπτώσεων που απαιτούν ανώδυνη θανάτωση στην αρχική δόση (π.χ 500 mg/kg) η αμέσως κατώτερη δόση (π.χ 50 mg/kg) χορηγείται σε άλλο ζώο. Εάν αυτό το ζώο επιβιώνει, χορηγούνται σε άλλα ζώα κατάλληλα επίπεδα ενδιάμεσων δόσεων μεταξύ των σταθερών δόσεων. Κανονικά δεν θα πρέπει να αναμένεται η χρησιμοποίηση περισσοτέρων από 5 ζώα σ'αυτό το στάδιο.  1.6.2.2. Κυρίως μελέτη  Για κάθε επίπεδο δόσης που εξετάζεται θα πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 10 ζώα (5 θηλυκά και 5 αρσενικά). Τα θηλυκά θα πρέπει να είναι άτεκνα και όχι έγκυα.  Αρχή της μεθόδου σταθερής δόσης είναι η χρησιμοποίηση μόνο μετρίως τοξικών δόσεων στην κυρίως μελέτη. Η χορήγηση θανατηφόρων δόσεων της πειραματικής ουσίας πρέπει να αποφεύγεται.  Το επίπεδο που θα χρησιμοποιηθεί στο πείραμα θα πρέπει να επιλεγεί μεταξύ επιπέδων σταθερής δόσης, δηλαδή 5, 50, 500 ή 2 000 mg/kg βάρους του σώματος. Το επίπεδο της αρχικής δόσης που επιλέγεται θα πρέπει να είναι αυτό που είναι πιθανό να προκαλέσει έκδηλη τοξικότητα αλλά όχι συνακόλουθη θνησιμότητα (συμπεριλαμβανομένων των ανώδυνων θανατώσεων. Οι τυχαίοι θάνατοι δεν συμπεριλαμβάνονται αλλά θα πρέπει να καταγράφονται). Εφόσον αυτό το επίπεδο δόσης προκαλέσει έκδηλη τοξικότητα αλλά όχι συνακόλουθη θνησιμότητα, δεν χρειάζεται περαιτέρω πειραματισμός.  Αν η χορήγηση του επιπέδου δόσης που επιλέχτηκε δεν προκαλέσει έκδηλη τοξικότητα, θα πρέπει να γίνει νέα δοκιμή της ουσίας στο αμέσως υψηλότερο επίπεδο δόσης. Τα ζώα, ωστόσο, θα πρέπει να παρατηρούνται έως ότου ολοκληρωθεί η περίοδος παρατήρησης. Σε περίπτωση που μια ισχυρή τοξική αντίδραση απαιτεί την ανώδυνη θανάτωση των ζώων ή που επέρχεται συνακόλουθη θνησιμότητα, θα πρέπει να γίνει νέα δοκιμή της ουσίας στο αμέσως χαμηλότερο επίπεδο δόσης. Και πάλι, τα ζώα που δεν χρειάζεται να θανατωθούν ανώδυνα θα πρέπει να παρατηρούνται για όλη την περίοδο παρατήρησης.  Μετά τη χορήγηση, γίνονται παρατηρήσεις οι οποίες και καταγράφονται συστηματικά. Για κάθε ζώο πρέπει να διατηρείται το ατομικό του ιστορικό.  Η περίοδος παρατήρησης πρέπει να είναι τουλάχιστον 14 ημέρες. Ωστόσο, η διάρκεια της παρατήρησης δεν πρέπει να είναι αυστηρά καθορισμένη. Προσδιορίζεται από τις τοξικές αντιδράσεις, το ρυθμό εμφάνισής τους και τη διάρκεια της περιόδου ανάρρωσης. Έτσι μπορεί να επεκταθεί όταν αυτό κριθεί αναγκαίο. Ο χρόνος κατά τον οποίο εμφανίζονται και εξαφανίζονται τα σημάδια τοξικότητας και ο χρόνος θανάτου είναι σημαντικοί, ειδικά αν υπάρχει τάση για καθυστέρηση των ενδείξεων τοξικότητας.  Θα πρέπει να γίνεται μια προσεκτική κλινική εξέταση τουλάχιστον δυο φορές την ημέρα της χορήγησης της δόσης και τουλάχιστον μία φορά για καθεμία από τις επόμενες ημέρες. Τα ζώα που παρουσιάζουν έντονους πόνους ή σοβαρές ενδείξεις δυσφορίας θα πρέπει να θανατώνονται ανώδυνα. Αν τα ζώα συνεχίσουν να εκδηλώνουν ενδείξεις τοξικότητας, θα πρέπει νά γίνουν επιπλέον παρατηρήσεις κατά τη διάρκεια των πρώτων ημερών μετά τη χορήγηση της δόσης. Αν είναι φανερό ότι το επίπεδο της αρχικής δόσης που επιλέχτηκε ήταν υψηλό, το πείραμα μπορεί να τερματιστεί.  Οι παρατηρήσεις θα πρέπει να περιλαμβάνουν τις μεταβολές στο δέρμα και το τρίχωμα, στα μάτια και στους βλεννογόνους καθώς και στο αναπνευστικό, κυκλοφοριακό, αυτόνομο και κεντρικό νευρικό σύστημα, στη σωματοκινητική δραστηριότητα και στον τρόπο συμπεριφοράς. Ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δοθεί στην παρατήρηση σπασμών, σιελόρροιας, διάρροιας, ληθάργου, ύπνου και κώματος.  Το βάρος κάθε ζώου θα πρέπει να προσδιορίζεται λίγο πρίν από τη χορήγηση της πειραματικής ουσίας, μία φορά την ημέρα για τις επόμενες τρείς ημέρες, και μία φορά την εβδομάδα στη συνέχεια. Τα ζώα τα οποία πεθαίνουν κατά τη διάρκεια του πειράματος, καθώς και εκείνα που επιζούν έως τον τερματισμό του πειράματος, ζυγίζονται και υποβάλλονται σε νεκροψία. Όλες οι εμφανείς παθολογικές μεταβολές θα πρέπει να καταγράφονται. Όπου ενδείκνυται, θα πρέπει να λαμβάνονται ιστοί για ιστοπαθολογική εξέταση.  Σε εξαιρετικές περιπτώσεις απαιτείται η διερεύνηση ενός δεύτερου,ή, και ενός τρίτου επιπέδου δόσης, ανάλογα με τα αποτελέσματα του προηγούμενου.  Στην περίπτωση κατά την οποία μια ουσία προκαλεί θνησιμότητα σε  5 mg/kg βάρους σώματος (ή όταν μια μελέτη προσδιορισμού της περιοχής δόσεων δείχνει ότι η θνησιμότητα θα συμβεί σε εκείνο το επίπεδο δόσης) ίσως η οξεία τοξικότητα της ουσίας να χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα τόσο της μελέτης προσδιορισμού όσο και της κυρίως μελέτης θα πρέπει να παρουσιάζονται συνοπτικά σε μορφή πινάκων που να δείχνουν, για κάθε επίπεδο δόσης που εξετάστηκε, τον αριθμό των ζώων κατά την έναρξη του πειράματος G τον αριθμό των ζώων που εμφανίζουν ενδείξεις τοξικότητας G τον αριθμό των ζώων που βρέθηκαν νεκρά κατά τη διάρκεια του πειράματος ή θανατώθηκαν για λόγους ευθανασίας G μια περιγραφή των τοξικών επιδράσεων και, για την κυρίως μελέτη, αν παρατηρήθηκε συνακόλουθη έκδηλη τοξικότητα G τη χρονική εξέλιξη των πιθανών τοξικών επιδράσεων, καθώς και τα συμπεράσματα της νεκροψίας. Σε περίπτωση ζώων που επιβιώνουν παραπάνω από μία ημέρα θα πρέπει να γίνεται υπολογισμός και καταγραφή των μεταβολών του βάρους.  Τα ζώα τα οποία θανατώνονται ανώδυνα λόγω συνακόλουθης δυσφορίας και πόνου, καταγράφονται ως συνακόλουθοι θάνατοι.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. Έκθεση για το πείραμα  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τίς ακόλουθες πληροφορίες τόσο για την μελέτη προσδιορισμού όσο και για την κυρίως μελέτη, όπως ενδείκνυται:  - είδη, ποικιλίες, πηγή, περιβαλλοντικές συνθήκες, διατροφή, κ.λ.τ.,  - συνθήκες πειράματος,  - επίπεδα δόσης (με τον έκδοχο, αν χρησιμοποιήθηκε, και τη συγκέντρωση),- πλήρη αποτελέσματα όλων των επιπέδων δόσης που διερευνήθηκαν,  - πινακοποίηση των αποτελεσμάτων κατά φύλο και επίπεδα δόσης (π.χ. πλήθος των ζώων που χρησιμοποιήθηκαν, μεταβολές στο σωματικό βάρος, εφόσον συνέβησαν θάνατοι, πλήθος των ζώων που πέθαναν ή που θανατώθηκαν κατά τη διάρκεια του πειράματος, πλήθος των ζώων που παρουσιάζουν ενδείξεις τοξικότητας, φύση, σοβαρότητα και διάρκεια των επιδράσεων),  - χρονική εξέλιξη της εμφάνισης των ενδείξεων τοξικότητας και αν αυτές ήταν αναστρέψιμες,  - εφόσον πέθαναν ή θανατώθηκαν ζώα, ώρα του θανάτου μετά τη χορήγηση της δόσης, αίτια και κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την ανώδυνη θανάτωση των ζώων,  - πορίσματα της νεκροψίας,  - ευρήματα της ιστοπαθολογικής εξέτασης, αν υπάρχουν,  - συζήτηση των αποτελεσμάτων,  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων, συμπεριλαμβανομένων των ενδείξεων έκδηλης τοξικότητας και το διακρίνον επίπεδο δόσης που προσδιορίστηκε στο πείραμα.  3.2. Αξιολόγηση και ερμηνεία  >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> Βλέπε επίσης «Γενική Εισαγωγή», μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε «γενική Εισαγωγή», μέρος Β (Ε).  Β.2. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ (ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ) 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Είναι χρήσιμο να έχουμε προκαταρκτικές πληροφορίες για την κατανομή του μεγέθους σωματιδίων, την τάση ατμών, το σημείο τήξεως, το σημείο ζέσεως, το σημείο αναφλέξεως και την εκκρηκτικότητα (αν υπάρχει) της ουσίας.  Βλέπε επίσης Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Β).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Διάφορες ομάδες πειραματοζώων εκτίθενται για ένα ορισμένο χρονικό διάστημα σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις της ελεγχόμενης ουσίας,χρησιμοποιουμένης μιας μόνο συγκεντρώσεως ανά ομάδα. Στη συνέχεια γίνονται παρατηρήσεις για τοξικές επιδράσεις και θανάτους. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας νεκροτομούνται, καθώς και εκείνα που επιζούν στο τέλος της δοκιμασίας.  Τα ζώα που εμφανίζουν έντονα και διαρκή σημεία δυσφορίας και πόνου μπορεί να χρειάζεται να θανατωθούν ανώδυνα. Δεν χρειάζεται να γίνεται χορήγηση των εξεταζόμενων ουσιών με τρόπο ο οποίος είναι γνωστό ότι προκαλεί έντονο πόνο και δυσφορία λόγω διαβρωτικών ή ιδιαίτερα ερεθιστικών ιδιοτήτων. 1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ  1.6.1. Προετοιμασίες  Τα ζώα κρατούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες εγκλωβισμού και διατροφής τουλάχιστον για 5 ημέρες πριν από τη δοκιμασία. Πριν από τη δοκιμασία, ξεχωρίζονται με τυχαία επιλογή υγιή, νεαρά ζώα και κατανέμονται στον απαιτούμενο αριθμό ομάδων. Τα ζώα δεν είναι ανάγκη να υφίστανται παρόμοιες εκθέσεις, εκτός εάν αυτό ενδείκνυται από τον τύπο της χρησιμοποιούμενης συσκευής εκθέσεως.  Οι στερεές εξεταζόμενες ουσίες μπορεί να χρειάζονται κονιοποίηση προκειμένου να ληφθούν σωματίδια ενός κατάλληλου μεγέθους.  Εφ' όσον κριθεί αναγκαίο μπορεί να προστεθεί, ένας κατάλληλος φορέας για να βοηθήσει την παραγωγή κατάλληλης συγκεντρώσεως στην ατμόσφαιρα. αυτή την περίπτωση, πρέπει να χρησιμοποιηθεί και μία ομάδα μάρτυρα με το φορέα. Αν φορέας ή άλλες προσθετικές ουσίες χρησιμοποιούνται για να διευκολύνουν τη χορήγηση, πρέπει να είναι γνωστό ότι δεν προκαλούν τοξικές επιδράσεις. Ιστορικά στοιχεία μπορούν να χρησιμοποιηθούν, εάν είναι κατάλληλα.  1.6.2. Συνθήκες δοκιμής  1.6.2.1. Πειραματόζωα  Εφόσον δεν υπάρχουν αντενδείξεις, ο επίμυς είναι το προτιμώμενο είδος. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται οι συνήθως χρησιμοποιούμενες εργαστηριακές φυλές. Για κάθε φύλο, το εύρος της διακύμανσης βαρών των ζώων στην αρχή της δοκιμής δεν πρέπει να υπερβαίνει το ± 20 % της κατάλληλης μέσης τιμής.  1.6.2.2. Αριθμός και φύλο  Για κάθε επίπεδο συγκεντρώσεως χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 10 τρωκτικά (πέντε θηλυκά και πέντε αρσενικά). Τα θηλυκά θα πρέπει να είναι άτοκα και να μην ευρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης.  Σημείωση: Σε δοκιμές οξείας τοξικότητας με ζώα υcηλότερης τάξης από την τάξη των τρωκτικών, θα πρέπει να εξετάζεται η ενδεχόμενη χρησιμοποίηση μικρότερου αριθμού ζώων. Οι δόσεις θα πρέπει να επιλέγονται με προσοχή ενώ θα πρέπει να καταβάλλεται κάθε προσπάθεια ώστε να μη γίνεται υπέρβαση μετρίως τοξικών δόσεων. Στις δοκιμές αυτές, θα πρέπει να αποφεύγεται η χορήγηση θανατηφόρων δόσεων της εξεταζόμενης ουσίας.  1.6.2.3. Συγκεντρώσεις εκθέσεως  Οι συγκεντρώσεις εκθέσεως θα πρέπει να είναι επαρκείς ως προς τον αριθμό, τουλάχιστον τρεις, και να απέχουν μεταξύ τους αρκετά ώστε να παρέχουν ομάδες πειραματισμού με εύρος τοξικών επιδράσεων και ποσοστών θνησιμότητας. Τα δεδομένα θα πρέπει να είναι αρκετά για τη χάραξη καμπύλης συγκεντρώσεως/θνησιμότητας και, όπου είναι δυνατό, να επιτρέπουν ένα αποδεκτό προσδιορισμό της LC50.  1.6.2.4. Οριακή δοκιμή  Εάν η έκθεση πέντε αρσενικών και πέντε θηλυκών πειραματοζώων σε 5 mg ανά λίτρο μιας αέριας ή αερολύματος υγρής ή στερεάς ουσίας (ή, όπου αυτό δεν είναι δυνατό λόγω των φυσικών ή χημικών, συμπεριλαμβανομένων και των εκρηκτικών, ιδιοτήτων της υπό δοκιμή ουσίας, στη μέγιστη εφικτή συγκέντρωση) για διάστημα τεσσάρων ωρών δεν προκαλεί καμία θνησιμότητα σχετιζόμενη με την ουσία μέσα σε 14 ημέρες, μπορεί να μη θεωρηθεί ως απαραίτητη η περαιτέρω δοκιμασία.  1.6.2.5. Χρόνος εκθέσεως  Το χρονικό διάστημα εκθέσεως θα πρέπει να είναι τέσσερις ώρες.  1.6.2.6. Συσκευές  Η δοκιμή στα ζώα πρέπει να γίνεται με αναπνευστικές συσκευές, σχεδιασμένες να διατηρούν μια δυναμική ροή του αέρα τουλάχιστον 12 αλλαγών την ώρα, να εξασφαλίζουν επάρκεια οξυγόνου και μία ομοιομορφία κατανομής της ατμόσφαιρας εκθέσεως. Όταν χρησιμοποιείται θάλαμος, το σχήμα του πρέπει να είναι τέτοιο ώστε να μειώνεται στο ελάχιστο ο συνωστισμός των πειραματοζώων και να αυξάνεται όσο το δυνατό περισσότερο η αναπνευστική τους έκθεση στην ελεγχόμενη ουσία. Γενικά, για να εξασφαλίζεται σταθερότητα στην ατμόσφαιρα ενός θαλάμου, ο ολικός όγκος των πειραματοζώων δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5 % του όγκου του πειραματικού θαλάμου. Μπορεί να χρησιμοποιείται στοματορρινικός, κεφαλικός ή ολοκλήρου του σώματος ατομικός θάλαμος εκθέσεως. Οι δύο πρώτοι συντελούν στην ελαχιστοποίηση της λήcεως ελεγχόμενης ουσίας από άλλες οδούς.  1.6.2.7. Περίοδος παρατηρήσεως  Η περίοδος παρατηρήσεων πρέπει να είναι τουλάχιστον 14 ημέρες. Εντούτοις, η διάρκεια των παρατηρήσεων δεν θα πρέπει να είναι αυστηρά καθορισμένη. Θα πρέπει να προσδιορίζεται από τις τοξικές αντιδράσεις, την τάξη εμφανίσεώς τους και τη διάρκεια της περιόδου αναρρώσεως. Έτσι, μπορεί να επεκταθεί αν θεωρηθεί αναγκαίο. Ο χρόνος κατά τον οποίο εμφανίζονται και εξαφανίζονται τα συμπτώματα τοξικότητας και ο χρόνος θανάτου είναι σημαντικός, ιδίως αν υπάρχει τάση για αργοπορημένους θανάτους.  1.6.3. Διαδικασία  Λίγο πριν από την έκθεση, τα ζώα ζυγίζονται και κατόπιν εκτίθενται στην υπό μελέτη συγκέντρωση στην καθορισμένη συσκευή για χρονικό διάστημα τεσσάρων ωρών, μετά από την εξισορρόπηση της συγκεντρώσεως στο θάλαμο. Ο χρόνος εξισορρόπησης θα πρέπει να είναι βραχύς. Η θερμοκρασία στην οποία πραγματοποιείται η δοκιμή θα πρέπει να διατηρείται στους 22 ± 3  C. Θεωρητικώς, η σχετική υγρασία θα πρέπει να διατηρείται μεταξύ 30% και 70%, σε ορισμένες όμως περιπτώσεις (π.χ. δοκιμές ορισμένων αερολυμάτων) αυτό μπορεί να μην είναι πρακτικώς δυνατό. Η διατήρηση ελαφρά αρνητικής πίεσης μέσα στο θάλαμο (≤ 5 mm νερού) εμποδίζει τη διαφυγή της εξεταζόμενης ουσίας στον περιβάλλοντα χώρο. Κατά τη διάρκεια της έκθεσης δεν θα πρέπει να χορηγείται τροφή και νερό. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλα συστήματα για τη δημιουργία και παρακολούθηση της πειραματικής ατμόσφαιρας. Το σύστημα θα πρέπει να εξασφαλίζει την όσο το δυνατόν ταχύτερη αποκατάσταση σταθερών συνθηκών εκθέσεως. Ο σχεδιασμός και λειτουργία του θαλάμου θα πρέπει να γίνεται με τέτοιο τρόπο ώστε μέσα στο θάλαμο να διατηρείται μία ομοιογενής κατανομή της πειραματικής ατμόσφαιρας.  Θα πρέπει να γίνονται μετρήσεις ή παρακολούθηση:  (α) της ταχύτητας ροής του αέρα (συνεχώς),  (β) της πραγματικής συγκέντρωσης της εξεταζόμενης ουσίας στη ζώνη αναπνοής τρεις τουλάχιστον φορές κατά τη διάρκεια της έκθεσης (ορισμένες ατμόσφαιρες, π.χ. αερολύματα σε υφηλές συγκεντρώσεις, μπορεί να χρειάζονται συχνότερη παρακολούθηση). Κατά τη διάρκεια της έκθεσης η συγκέντρωση δεν θα πρέπει να διαφέρει περισσότερο από το ± 15 % της μέσης τιμής. Εντούτοις, στην περίπτωση ορισμένων αερολυμάτων, ενδέχεται να μη μπορεί να επιτευχθεί το επίπεδο αυτό ελέγχου οπότε είναι αποδεκτό ένα μεγαλύτερο εύρος αποκλίσεων. Στα αερολύματα, θα πρέπει να διενεργείται με την απαιτούμενη συχνότητα, ανάλυση μεγέθους σωματιδίων (τουλάχιστον μία φορά ανά ομάδα πειραματισμού),  (γ) της θερμοκρασίας και υγρασίας, συνεχώς αν είναι δυνατόν.  Κατά τη διάρκεια και μετά την έκθεση, γίνονται τακτικά παρατηρήσεις και καταχωρούνται συστηματικά G πρέπει να γίνονται ξεχωριστές καταχωρήσεις για κάθε ζώο. Κατά την πρώτη ημέρα οι παρατηρήσεις πρέπει να γίνονται συχνά. Μία φορά την ημέρα πρέπει να γίνεται μια προσεκτική κλινική εξέταση. Πρόσθετες παρατηρήσεις πρέπει να γίνονται καθημερινά και να λαμβάνονται τα απαραίτητα μέτρα για να μειώνεται στο ελάχιστο η απώλεια των ζώων από τη μελέτη G δηλαδή νεκροcίες ή φύξη των ζώων που βρέθηκαν νεκρά και απομόνωση ή θανάτωση των ετοιμοθάνατων και αδύνατων ζώων.  Οι παρατηρήσεις θα πρέπει να περιλαμβάνουν αλλοιώσεις του δέρματος και του τριχώματος, των οφθαλμών, των βλεννογόνων, του αναπνευστικού και του κυκλοcοριακού συστήματος, του αυτόνομου και κεντρικού νευρικού συστήματος καθώς και του τρόπου συμπεριφοράς και της σωματοκινητικής δραστηριότητας. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται στην αναπνευστική συμπεριφορά, στους τρόμους, στους σπασμούς, στη σιελόρροια, στη διάρροια, στο λήθαργο, στον ύπνο και το κώμα. Ο χρόνος θανάτου πρέπει να καταχωρείται όσο το δυνατό ακριβέστερα. Τα ατομικά βάρη των ζώων πρέπει να προσδιορίζονται ανά εβδομάδα μετά την έκθεση και κατά το θάνατο.  Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, όπως και αυτά που επιζούν στο τέλος της, υπόκεινται σε νεκροφία και ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στις αλλοιώσεις του αναπνευστικού συστήματος, ανώτερου και κατώτερου. Όλες οι μακροσκοπικά παρατηρούμενες ανωμαλίες πρέπει να καταχωρούνται. Όπου αυτό ενδείκνυται, οι ιστοί πρέπει να λαμβάνονται για ιστοπαθολογική εξέταση.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα πρέπει να συνοcίζονται σε πίνακα, στον οποίο να φαίνεται, για κάθε πειραματική ομάδα, ο αριθμός των ζώων στην αρχή της δοκιμασίας, ο χρόνος θανάτου χωριστά για κάθε ζώο, ο αριθμός των ζώων που παρουσίασαν άλλα συμπτώματα τοξικότητας και περιγραφή των τοξικών επιδράσεων και των ευρημάτων της νεκροcίας. Αλλαγές στο βάρος πρέπει να υπολογίζονται και να καταχωρούνται όταν τα ζώα επιζούν περισσότερο από μία ημέρα. Τα ζώα που θανατώνονται ανώδυνα λόγω δυσφορίας ή πόνου που έχει σχέση με την ουσία, καταγράφονται ως θάνατοι που σχετίζονται με την ουσία. Η LC50 θα πρέπει να προσδιορίζεται με μια αναγνωρισμένη μέθοδο. Η αξιολόγηση των δεδομένων πρέπει να περιλαμβάνει τη σχέση, αν υπάρχει, μεταξύ της έκθεσης των ζώων στην ελεγχόμενη ουσία και τη συχνότητα και σοβαρότητα όλων των ανωμαλιών, συμπεριλαμβανομένων αυτών της συμπεριφοράς και των κλινικών ανωμαλιών, μακροσκοπικών αλλοιώσεων, αλλαγών του βάρους του σώματος, θνησιμότητας και κάθε άλλης τοξικής επίδρασης.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - είδος, φυλή, πηγή, περιβαλλοντικές συνθήκες, διατροφή, κλπ. G  - συνθήκες δοκιμής: Περιγραφή της συσκευής έκθεσης συμπεριλαμβανομένου του σχεδίου, του τύπου, των διαστάσεων, της πηγής του αέρα, του συστήματος παραγωγής αερολυμάτων, της μεθόδου κλιματισμού του αέρα και της μεθόδου εγκλωβισμού των ζώων στο θάλαμο δοκιμής, όταν χρησιμοποιείται. Θα πρέπει να περιγράφεται ο εξοπλισμός που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της θερμοκρασίας, της υγρασίας, και των συγκεντρώσεων και κατανομής μεγέθους σωματιδίων των αερολυμάτων.  Περιγραφή της συσκευής έκθεσης συμπεριλαμβανομένου του σχεδίου, του τύπου, των διαστάσεων, της πηγής του αέρα, του συστήματος παραγωγής αερολυμάτων, της μεθόδου κλιματισμού του αέρα και της μεθόδου εγκλωβισμού των ζώων στο θάλαμο δοκιμής, όταν χρησιμοποιείται. Θα πρέπει να περιγράφεται ο εξοπλισμός που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της θερμοκρασίας, της υγρασίας, και των συγκεντρώσεων και κατανομής μεγέθους σωματιδίων των αερολυμάτων.  Δεδομένα έκθεσης  Τα δεδομένα αυτά θα πρέπει να καταγράφονται σε πίνακα και να παρουσιάζονται με μέσες τιμές και ένα μέτρο μεταβλητότητας (π.χ. μέση τυπική απόκλιση) και, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνουν:  (α) τις τιμές ροής του αέρα διαμέσου της αναπνευστικής συσκευής,  (β) θερμοκρασία και υγρασία του αέρα,  (γ) ονομαστικές συγκεντρώσεις (ολική ποσότητα της εξεταζόμενης ουσίας που προσάγεται στην αναπνευστική συσκευή διηρημένη δια του όγκου του αέρα),  (δ) φύση του φορέα, αν χρησιμοποιήθηκε,  (ε) πραγματικές συγκεντρώσεις στην πειραματική ζώνη αναπνοής,  (ζ) τη μέση αεροδυναμική διάμετρο μάζας (ΜΑΔΜ) και τη γεωμετρική τυπική απόκλιση (ΓΤΑ),  (η) το χρονικό διάστημα εξισορρόπησης,  (θ) το χρονικό διάστημα έκθεσης,  - καταγραφή σε πίνακα των δεδομένων αποκρίσεως κατά φύλο και επίπεδο έκθεσης (δηλ. ο αριθμός ζώων που πέθαναν ή θανατώθηκαν κατά τη διάρκεια της δοκιμής G αριθμός ζώων που εμφάνισαν συμπτώματα τοξικότητας G αριθμός εκτεθέντων ζώων) G  - χρόνο θανάτου κατά τη διάρκεια ή μετά από την έκθεση, λόγους και κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την ανώδυνη θανάτωση ζώων G  - όλες τις παρατηρήσεις G  - τιμή LC50 για κάθε φύλο προσδιορισμένη στο τέλος της περιόδου παρατηρήσης (με καθορισμένη μέθοδο υπολογισμού) G  - όριο αξιοπιστίας 95% για την LC50 (όπου είναι δυνατόν) G  - καμπύλη δόσης/θνησιμότητας και κλίση (όπου το επιτρέπει η μέθοδος προσδιορισμού) G  - ευρήματα νεκροcίας G  - κάθε ιστοπαθολογικό εύρημα G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων (ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δίνεται στο αποτέλεσμα που μπορεί να έχει στην υπολογιζόμενη τιμή LC50 η ανώδυνη θανάτωση ζώων κατά τη διάρκεια της δοκιμής) G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  Β.3. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ (ΔΕΡΜΑΤΙΚΗ) 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Β).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η εξεταζόμενη ουσία επιτίθεται στο δέρμα σε διαβαθμισμένες δόσεις σε διάφορες ομάδες πειραματοζώων, για κάθε δε ομάδα χρησιμοποιείται και μία δόση. Ακολούθως, γίνονται παρατηρήσεις των επιδράσεων και των θανάτων. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμής υποβάλλονται σε νεκροψία όπως επίσης υποβάλλονται σε νεκροψία και τα ζώα που επιζούν μετά το πέρας της δοκιμής.  Τα ζώα που εμφανίζουν έντονα και διαρκή συμπτώματα δυσφορίας και πόνου μπορεί αν χρειασθεί να θανατωθούν ανώδυνα. Δεν χρειάζεται να γίνεται χορήγηση της εξεταζόμενης ουσίας με τρόπο που είναι γνωστό ότι προκαλεί έντονο πόνο και αγωνία λόγω διαβρωτικών ή ερεθιστικών ιδιοτήτων.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασίες  Τα ζώα κρατούνται μέσα στους πειραματικούς κλωβούς τους, κάτω από τις πειραματικές συνθήκες εγκλωβισμού και διατροφής, για 5 τουλάχιστον ημέρες πριν από τη δοκιμασία. Πριν από τη δοκιμασία υγιή, νεαρά, ενήλικα ζώα ξεχωρίζονται τυχαία και κατανέμονται στις πειραματικές ομάδες. Περίπου 24 ώρες πριν από τη δοκιμασία, το τρίχωμα πρέπει να απομακρύνεται με τη βοήθεια ψαλιδιού ή ξυριστικής μηχανής, από την περιοχή της ράχης του κορμού των ζώων. Κατά το κούρεμα ή ξύρισμα του τριχώματος, προσοχή πρέπει να δίνεται ώστε να αποφεύγεται η απόξηση του δέρματος, πράγμα το οποίο μπορεί να μεταβάλει τη διαπερατότητά του. Η επιφάνεια της εφαρμογής δεν πρέπει να είναι μικρότερη από το 10% της ολικής επιφάνειας του σώματος. Όταν δοκιμάζονται στερεά, τα οποία μπορούν να κονιοποιηθούν αν χρειάζεται, η ελεγχόμενη ουσία πρέπει να υγραίνεται αρκετά με νερό ή, όπου είναι ανάγκη, με έναν κατάλληλο φορέα για να εξασφαλίζεται καλή επαφή με το δέρμα. Όταν χρησιμοποιείται φορέας, η επίδρασή του στη δίοδο της ελεγχόμενης ουσίας πρέπει να λαμβάνεται υπόφη. Οι υγρές ουσίες χρησιμοποιούνται γενικά αδιάλυτες.  1.6.2. Συνθήκες δοκιμής  1.6.2.1. Πειραματόζωα  Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο ενήλικας επίμυς ή το κουνέλι. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα είδη, για τη χρησιμοποίησή τους όμως απαιτείται αιτιολόγηση. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται οι συνήθεις εργαστηριακές φυλές. Για κάθε φύλο, το εύρος της διαφοράς βαρών των ζώων στην αρχή της δοκιμής δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το ± 20% της συνιστάμενης μέσης τιμής.  1.6.2.2. Αριθμός και φύλο  Για κάθε επίπεδο δόσεως χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 5 ζώα. Και τα πέντε πρέπει να είναι του ιδίου φύλου. Αν χρησιμοποιούνται θηλυκά, θα πρέπει να είναι άτοκα και να μην ευρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Όπου υπάρχουν πληροφορίες ότι ένα φύλο είναι πολύ περισσότερο ευαίσθητο, η χορήγηση της ουσίας θα πρέπει να γίνεται στα ζώα αυτού του φύλου.  Σημείωση: Σε δοκιμές οξείας τοξικότητας με ζώα υψηλότερης τάξης από την τάξη των τρωκτικών, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο χρησιμοποίησης μικρότερου αριθμού ζώων. Οι δόσεις θα πρέπει να επιλέγονται με προσοχή ενώ θα πρέπει να καταβάλλεται κάθε προσπάθεια ώστε να μη γίνεται υπέρβαση μετρίως τοξικών δόσεων. Στις δοκιμές αυτές, θα πρέπει να αποφεύγεται να χορηγούνται θανατηφόρες δόσεις της εξεταζόμενης ουσίας.  1.6.2.3. Επίπεδα δόσεων  Τα επίπεδα δόσεων θα πρέπει να είναι επαρκή ως πρός τον αριθμό, τουλάχιστον τρία, και να απέχουν μεταξύ τους αρκετά ώστε να παρέχουν ομάδες πειραματισμού με εύρος τοξικών επιδράσεων και ποσοστών θνησιμότητας. Κατά τη λήψη αποφάσεων σχετικά με τα επίπεδα δόσεων, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κάθε ερεθιστική ή διαβρωτική επίδραση. Τα δεδομένα θα πρέπει να είναι αρκετά για τη χάραξη καμπύλης δόσεως/αποκρίσεως και, όπου είναι δυνατόν, να δίνουν τη δυνατότητα αποδεκτού προσδιορισμού της LD50.  1.6.2.4. Οριακή δοκιμή  Σε ομάδα 5 αρσενικών και 5 θηλυκών ζώων, μπορεί να πραγματοποιηθεί οριακή δοκιμή σε επίπεδο μιας δόσης τουλάχιστον 2 000 mg/kg βάρους σώματος, χρησιμοποιώντας τις διαδικασίες που περιγράφονται ανωτέρω. Αν παρουσιασθεί θνησιμότητα σχετιζόμενη με την ουσία, μπορεί να χρειασθεί η πραγματοποίηση πλήρους μελέτης.  1.6.2.5. Περίοδος παρατήρησης  Η περίοδος παρατήρησης θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 14 ημέρες. Εντούτοις, η διάρκεια των παρατηρήσεων δεν πρέπει να είναι αυστηρά καθορισμένη. Μπορεί να καθορίζεται από τις τοξικές επιδράσεις, την τάξη εμφανίσεώς τους και τη διάρκεια της περιόδου αναρρώσεως G μπορεί έτσι να επεκτείνεται όταν αυτό θεωρηθεί αναγκαίο. Ο χρόνος εμφανίσεως και εξαφανίσεως των τοξικών συμπτωμάτων, η διάρκειά τους και ο χρόνος θανάτου είναι σημαντικά, ιδιαίτερα αν υπάρχει τάση να αργοπορούν οι θάνατοι.  1.6.3. Διαδικασία  Τα ζώα θα πρέπει να εγκλωβίζονται κατ'άτομο. Η εξεταζόμενη ουσία θα πρέπει να επιτίθεται ομοιόμορφα σε μια περιοχή που να αντιστοιχεί στο 10% περίπου του συνολικού εμβαδού της επιφάνειας του σώματος. Στην περίπτωση λίαν τοξικών ουσιών, το εμβαδόν της καλυπτόμενης επιφάνειας μπορεί να είναι μικρότερο, πάντως όμως θα πρέπει να καλύπτεται η μεγαλύτερη δυνατή επιφάνεια με ένα όσο το δυνατόν λεπτότερο και πιο ομοιόμορφο στρώμα.  Η ελεγχόμενη ουσία πρέπει να κρατείται σ'επαφή με το δέρμα καθ'όλη τη διάρκεια της εκθέσεως των 24 ωρών, με τη βοήθεια ενός επιδέσμου από πορώδη γάζα και μια μη ερεθιστική ταινία. Η ελεγχόμενη περιοχή πρέπει, επιπλέον, να καλύπτεται με τον κατάλληλο τρόπο για να συγκρατείται ο επίδεσμος και η ελεγχόμενη ουσία και να εξασφαλίζεται έτσι η αδυναμία καταπόσεως της ουσίας από τα ζώα. Επιτρέπεται η χρήση συσκευών περιορισμού για να εμποδίζεται η κατάποση, αλλά δεν συνιστάται η μέθοδος της απόλυτης ακινησίας.  Στο τέλος της περιόδου εκθέσεως, πρέπει να απομακρύνεται το υπόλειμμα της ελεγχόμενης ουσίας, όταν αυτό είναι δυνατόν, με τη χρήση νερού ή με μια άλλη κατάλληλη μέθοδο καθαρισμού του δέρματος.  Οι παρατηρήσεις πρέπει να καταχωρούνται συστηματικά, όπως γίνονται. Πρέπει να διατηρούνται ατομικά αρχεία για κάθε ζώο. Οι παρατηρήσεις, κατά τη διάρκεια της πρώτης ημέρας, πρέπει να γίνονται συχνά. Τουλάχιστον μια φορά την ημέρα πρέπει να γίνεται μια προσεκτική κλινική εξέταση. Πρόσθετες παρατηρήσεις θα πρέπει να γίνονται καθημερινά και να λαμβάνονται τα απαραίτητα μέτρα ώστε να μειώνεται στο ελάχιστο η απώλεια των ζώων από τη μελέτη. Λ.χ. νεκροψία ή ψύξη εκείνων των ζώων που βρέθηκαν νεκρά και απομόνωση ή θανάτωση των αδύνατων και ετοιμοθάνατων ζώων.  Οι παρατηρήσεις θα πρέπει να περιλαμβάνουν αλλοιώσεις του τριχώματος, του εξεταζόμενου δέρματος, των οφθαλμών και των βλεννογόνων, όπως επίσης του αναπνευστικού, κυκλοφοριακού, αυτόνομου και κεντρικού νευρικού συστήματος, καθώς και αλλοιώσεις στη σωματοκινητική δραστηριότητα και του τρόπου συμπεριφοράς. Με ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να γίνονται οι παρατηρήσεις των τρόμων, σπασμών, σιελόρροιας, διάρροιας, λήθαργου, ύπνου και κώματος. Ο χρόνος θανάτου πρέπει να καταχωρείται όσο το δυνατόν ακριβέστερα. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, όπως και αυτά που επιζούν στη λήξη της, υπόκεινται σε νεκροψία. Όλες οι μακροσκοπικά παρατηρούμενες αλλοιώσεις πρέπει να καταχωρούνται. Όπου ενδείκνυται, οι ιστοί πρέπει να λαμβάνονται για ιστοπαθολογική εξέταση.  Εκτίμηση τοξικότητας στο άλλο φύλο  Αφού συμπληρωθεί η μελέτη σε ένα φύλο, η ουσία χορηγείται σε μία τουλάχιστον ομάδα 5 ζώων του άλλου φύλου για να επιβεβαιωθεί ότι τα ζώα αυτού του φύλου δεν είναι σε σημαντικό βαθμό πιο ευαίσθητα στην εξεταζόμενη ουσία. Σε συγκεκριμένες περιπτώσεις μπορεί να δικαιολογείται η χρήση λιγότερων ζώων. Όπου υπάρχουν σαφείς πληροφορίες ότι τα ζώα του εξεταζόμενου φύλου είναι σε σημαντικό βαθμό πιο ευαίσθητα, μπορεί να μη χρειασθεί η υποβολή σε δοκιμή ζώων του άλλου φύλου.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα, στον οποίο να φαίνεται, για κάθε πειραματική ομάδα, ο αριθμός των ζώων στην αρχή της δοκιμασίας, ο χρόνος θανάτου για κάθε ζώο, ο αριθμός των ζώων που εμφανίζουν άλλα συμπτώματα τοξικότητας, περιγραψή των τοξικών επιδράσεων και τα αποτελέσματα της νεκροψίας. Τα ατομικά βάρη των ζώων πρέπει να προσδιορίζονται και να καταχωρούνται, λίγο πριν την εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας ανά εβδομάδα μετά, και κατά το θάνατο. Αλλαγές στο βάρος θα πρέπει να υπολογίζονται και να καταγράφονται, εφόσον τα ζώα επιζούν περισσότερο από μία ημέρα. Τα ζώα που θανατώνονται ανώδυνα λόγω δυσφορίας και πόνου που οφείλεται στην ουσία, καταγράφονται ως θάνατοι που σχετίζονται με την ουσία. Η LD50 θα πρέπει να προσδιορίζεται με μια αναγνωρισμένη μέθοδο.  Η αξιολόγηση των δεδομένων πρέπει να περιλαμβάνει μια αξιολόγηση της σχέσης, αν αυτή υπάρχει, μεταξύ της έκθεσης των ζώων στην ελεγχόμενη ουσία και της συχνότητας και σοβαρότητας όλων των ανωμαλιών, όπου περιλαμβάνονται ανωμαλίες συμπεριφοράς, κλινικές ανωμαλίες, μακροσκοπικές αλλοιώσεις, αλλαγές του βάρους του σώματος, θνησιμότητα, και κάθε άλλη τοξικολογική επίδραση.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - είδος, φυλή, πηγή, περιβαλλοντικές συνθήκες, διατροφή, κλπ. G  - συνθήκες δοκιμής (συμπεριλαμβανόμενης και της μεθόδου καθαρισμού του δέρματος και του τύπου της επίδεσης: προσροφητικής ή μη προσροφητικής) G  - επίπεδα δόσεων (με φορέα, εφόσον χρησιμοποιήθηκε, και συγκεντρώσεις) G  - φύλο των υποβληθέντων σε δοκιμή ζώων G  - καταγραφή σε πίνακα των δεδομένων απόκρισης κατά φύλο και επίπεδο έκθεσης (δηλ., ο αριθμός ζώων που πέθαναν ή θανατώθηκαν κατά τη διάρκεια της δοκιμής, αριθμός ζώων που εμφάνισαν σημεία τοξικότητας, αριθμός εκτεθέντων ζώων) G  - χρόνο θανάτου μετά από τη χορήγηση, λόγους και κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την ανώδυνη θανάτωση ζώων G  - όλες τις παρατηρήσεις G  - τιμή LD50 για το φύλο που υποβλήθηκε σε πλήρη μελέτη, προσδιορισμένη μετά από 14 ημέρες με την καθορισμένη μέθοδο υπολογισμού G  - όριο αξιοπιστίας 95 % για την LD50 (όπου είναι δυνατόν) G  - καμπύλη δόσης/θνησιμότητας και κλίση (όπου το επιτρέπει η μέθοδος προσδιορισμού) G  - ευρήματα νεκροψίας G  - κάθε ιστοπαθολογικό εύρημα G  - αποτελέσματα οποιασδήποτε δοκιμής στο άλλο φύλο G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων (ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δοθεί στην επίδραση που μπορεί να έχει στην υπολογιζόμενη τιμή LD50 η ανώδυνη θανάτωση των ζώων) G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  Β.4. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ (ΔΕΡΜΑΤΙΚΟΣ ΕΡΕΘΙΣΜΟΣ) 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Β).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ  Αρχικές Θεωρήσεις  Πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή σε κάθε πληροφορία που υπάρχει για μια ουσία προκειμένου να ελαχιστοποιείται η δοκιμασία ουσιών κάτω από συνθήκες που είναι πιθανόν να προκαλέσουν σοβαρές αντιδράσεις. Οι ακόλουθες πληροφορίες μπορεί να είναι πολύ χρήσιμες όταν εξετάζεται η καταλληλότητα εκτέλεσης πλήρους δοκιμής, η μελέτη σε ένα μόνο ζώο ή αν δεν απαιτείται περαιτέρω δοκιμασία.  i) Φυσικοχημικές ιδιότητες και ικανότητα για χημική αντίδραση. Οι ισχυρές όξινες ή αλκαλικές ουσίες (που εμφανίζουν pH λιγότερο του 2 ή μεγαλύτερο του 11,5, αντίστοιχα) μπορεί να μη χρειάζεται να υποβληθούν σε δοκιμασία για πρωτογενή δερματικό ερεθισμό στην περίπτωση που αναμένεται η ύπαρξη διαβρωτικών ιδιοτήτων. Θα πρέπει επίσης να λαμβάνονται υπόψη το αλκαλικό ή όξινο δυναμικό.  ii) Αν υπάρχουν πειστικές αποδείξεις για σοβαρές επιδράσεις σε έγκυρες δοκιμές in vitro, μπορεί να μην απαιτείται πλήρης δοκιμή.  iii) Αποτελέσματα από μελέτες οξείας τοξικότητας. Αν με την ουσία έχει διεξαχθεί δερματική δοκιμή οξείας τοξικότητας στο επίπεδο δόσεως της οριακής δοκιμής (2 000 mg/kg βάρους σώματος), και δεν παρατηρήθηκε κανένας ερεθισμός στο δέρμα, μπορεί να μη χρειάζεται περαιτέρω δοκιμασία για ερεθισμό του δέρματος. Επιπλέον, δεν χρειάζεται να υποβληθούν σε δοκιμασία υλικά που έχει αποδειχθεί ότι είναι λίαν τοξικά απο δερματική οδό.  Η εξεταζόμενη ουσία επιτίθεται σε μία μόνη δόση στο δέρμα ορισμένων πειραματοζώων, κάθε δε ζώο χρησιμεύει ως μάρτυρας του εαυτού του. Μετά από συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, παρατηρείται ο βαθμός ερεθισμού, βαθμολογείται, και περιγράφεται για να υπάρξει πλήρης αξιολόγηση των επιδράσεων. Η χρονική διάρκεια των παρατηρήσεων θα πρέπει να είναι επαρκής για την πλήρη αξιολόγηση της αναστρεψιμότητας των επιδράσεων, που έχουν παρατηρηθεί.  Τα ζώα που εμφανίζουν έντονα και διαρκή συμπτώματα δυσφορίας και πόνου μπορεί να χρειάζεται να θανατωθούν ανώδυνα.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ  1.6.1. Προετοιμασίες  Το τρίχωμα πρέπει να απομακρύνεται, από την περιοχή της ράχης του κορμού του ζώου, ένα 24ωρο περίπου πριν τη δοκιμασία, με τη βοήθεια κοπτικής ή ξυριστικής μηχανής.  Κατά το κούρεμα ή ξύρισμα του τριχώματος, πρέπει να δίνεται προσοχή για να αποφεύγεται η απόξεση του δέρματος. Μόνο ζώα με υγιές ανέπαφο δέρμα πρέπει να χρησιμοποιούνται.  Μερικές φυλές κουνελιών έχουν πυκνές νησίδες τριχώματος που είναι πιο εμφανείς ορισμένες εποχές του έτους. Οι εξεταζόμενες ουσίες δεν θα πρέπει να επιτίθενται στις ζώνες αυτές ανάπτυξης πυκνού τριχώματος.  Όταν δοκιμάζονται στερεές ουσίες (που μπορεί να κονιοποιούνται, αν κριθεί αναγκαίο), η ελεγχόμενη ουσία πρέπει να υγραίνεται αρκετά με νερό ή, όταν απαιτείται, με έναν κατάλληλο φορέα για να εξασφαλίζεται η καλή επαφή της με το δέρμα. Όταν χρησιμοποιείται φορέας, η επίδρασή του στον ερεθισμό του δέρματος πρέπει να λαμβάνεται υπόψη. Υγρές ουσίες χρησιμοποιούνται γενικά αδιάλυτες.  1.6.2. Συνθήκες δοκιμής  1.6.2.1. Πειραματόζωα  Αν και μπορεί να χρησιμοποιηθούν διάφορα είδη θηλαστικών, προτιμόμενο είδος είναι το κουνέλι αλμπίνο.  1.6.2.2. Αριθμός ζώων  Εάν από τα αποτελέσματα in vitro εξετάσεων ή από άλλα στοιχεία υπάρχει η υποψία ότι η ουσία μπορεί να προκαλέσει νέκρωση (δηλ. να είναι διαβρωτική), τότε θα πρέπει να πραγματοποιείται δοκιμή σε ένα μόνο ζώο. Εάν από τα αποτελέσματα της δοκιμής αυτής δεν φαίνεται να υπάρχει διαβρωτικότητα, η δοκιμή θα πρέπει να συμπληρώνεται χρησιμοποιώντας δύο τουλάχιστον ακόμη ζώα.  Στην πλήρη δοκιμή, χρησιμοποιούνται τουλάχιστον τρία υγιή ενήλικα ζώα. Δεν χρειάζονται ξεχωριστά ζώα ως ομάδα μάρτυρας. Μπορεί πάντως να απαιτηθούν πρόσθετα ζώα για τη διασαφήνιση διφορούμενων αποκρίσεων.  1.6.2.3. Επίπεδο δόσεως  Εκτός κι αν υπάρχουν αντενδείξεις, στο σημείο της δοκιμής επιτίθενται 0,5 ml υγρού ή 0,5 g στερεού ή ημιστερεού. Ως μάρτυρες για τη δοκιμή χρησιμποιούνται, παρακείμενες στο σημείο δοκιμής, περιοχές του δέρματος κάθε ζώου.  1.6.2.4. Περίοδος παρατήρησης  Η διάρκεια της περιόδου παρατηρήσεως δεν θα πρέπει να είναι αυστηρά καθορισμένη. Θα πρέπει όμως να είναι επαρκής για την πλήρη αξιολόγηση της αναστρεψιμότητας ή μη αναστρεyιμότητας των παρατηρηθεισών επιδράσεων, κανονικά όμως δεν χρειάζεται να υπερβαίνει τις 14 ημέρες μετά την επίθεση της ουσίας.  1.6.3. Διαδικασία  Τα ζώα θα πρέπει να εγκλωβίζονται ξεχωριστά το καθένα. Η εξεταζόμενη ουσία θα πρέπει να επιτίθεται σε μια μικρή περιοχή (περίπου 6 cm2) του δέρματος και να καλύπτεται με ένα κομμάτι γάζας το οποίο να συγκρατείται στη θέση του με μη ερεθιστική ταινία. Στην περίπτωση των υγρών ή σε ορισμένες αλοιφές μπορεί να χρειάζεται, η εξεταζόμενη ουσία πρώτα να τοποθετηθεί στη γάζα και κατόπιν να επιτεθεί στο δέρμα. Η γάζα θα πρέπει να κρατιέται χαλαρά σε επαφή με το δέρμα με τη βοήθεια κατάλληλου αδιαπέρατου ή ημιδιαπερατού επιδέσμου για όλη τη διάρκεια της περιόδου εκθέσεως. Το ζώο θα πρέπει να μην μπορεί να φθάνει τη γάζα με ενδεχόμενο επακόλουθο να καταπιεί/εισπνεύσει την εξεταζόμενη ουσία.  Όταν τελειώσει η περίοδος εκθέσεως, η εναπομένουσα ουσία θα πρέπει να απομακρύνεται, όπου αυτό είναι πρακτικώς δυνατό, χρησιμοποιώντας νερό ή ένα κατάλληλο διαλύτη, χωρίς να αλλοιώνονται τα υφιστάμενα αποτελέσματα ή η ακεραιότητα της επιδερμίδας.  Η διάρκεια εκθέσεως είναι κανονικά τέσσερις ώρες.  Αν υπάρχει η υποψία ότι η ουσία μπορεί να προκαλέσει νέκρωση (δηλ. ότι είναι διαβρωτική), τότε θα πρέπει να μειώνεται η διάρκεια της εκθέσεως (π.χ. σε μία ώρα ή τρία λεπτά). Στη δοκιμασία αυτή μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ένα μόνο ζώο στην πρώτη περίπτωση και αν δεν αποκλείεται απο την οξεία διαδερμική τοξικότητα της εξεταζόμενης ουσίας, μπορεί να επιτεθούν ταυτόχρονα στο ζώο τρεις γάζες. Η πρώτη γάζα απομακρύνεται μετά από τρία λεπτά. Αν δεν παρατηρηθεί καμία σοβαρή αντίδραση του δέρματος, η δεύτερη γάζα απομακρύνεται μετά απο μία ώρα. Αν οι παρατηρήσεις στο στάδιο αυτό δείχνουν ότι είναι αναγκαία η έκθεση αυτή μπορεί να πραγματοποιηθεί κάτω απο ανθρωπιστικούς όρους, η τρίτη γάζα αφαιρείται μετά από τέσσερεις ώρες και διαβαθμίζονται οι αποκρίσεις. Στην περίπτωση αυτή (δηλ. όταν είναι δυνατή η έκθεση για διάστημα τεσσάρων ωρών), η δοκιμή θα πρέπει κατόπιν να συμπληρώνεται χρησιμοποιώντας δύο τουλάχιστον ακόμα ζώα, εκτός και αν η πράξη αυτή δεν είναι ανθρωπιστική (π.χ. αν κατά τη διάρκεια της τετράωρης έκθεσης παρατηρηθεί νέκρωση).  Αν παρατηρηθεί σοβαρή δερματική αντίδραση (π.χ. νέκρωση) είτε στήν τρίλεπτη έκθεση είτε στην ωριαία έκθεση, η δοκιμή τερματίζεται αμέσως. Κάτω από ορισμένες συνθήκες, π.χ. λόγω του προβλεπόμενου προτύπου χρήσης και έκθεσης του ανθρώπου στην ουσία, μπορεί να ένδείκνυνται και μεγαλύτερης διάρκειας εκθέσεις.  1.6.3.1. Παρατήρηση και βαθμολόγηση  Τα ζώα θα πρέπει να εξετάζονται για τυχόν ύπαρξη σημείων ερυθήματος και οιδήματος και η απόκριση να βαθμολογείται σε 60 λεπτά και κατόπιν σε 24, 48 και 72 ώρες μετά την απομάκρυνση της γάζας. Βαθμολογείται ο δερματικός ερεθισμός και καταγράφεται σύμφωνα με το σύστημα του πίνακα 1. Αν μέσα σε 72 ώρες δεν έχει υπάρξει πλήρης αποκατάσταση της εμφάνισης του δέρματος, μπορεί να χρειάζονται κι άλλες παρατηρήσεις. Εκτός από την παρατήρηση του ερεθισμού, θα πρέπει να περιγράφονται πλήρως και τυχόν σοβαρές αλλοιώσεις όπως διάβρωση (μη αναστρέφιμη καταστροφή του δερματικού ιστού) και άλλες τοξικές επιδράσεις.  Για να διασαφηνισθούν αμφίβολες αντιδράσεις ή αποκρίσεις που σκεπάζονται λόγω χρώσης του δέρματος από την εξεταζόμενη ουσία, μπορεί να χρησιμοποιηθούν τεχνικές όπως η ιστοπαθολογική εξέταση ή η μέτρηση του πάχους των πτυχών του δέρματος.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα πρέπει να συνοyίζονται σε πίνακα, στον οποίο να φαίνεται για κάθε ζώο χωριστά, η διαβάθμιση του ερεθισμού στην περίπτωση ερυθήματος και οιδήματος σε όλη τη διάρκεια της περιόδου της παρατηρήσεως. Θα πρέπει να καταχωρείται κάθε σοβαρή αλλοίωση, μία περιγραφή του βαθμού και της φύσης του ερεθισμού, της αναστρεyιμότητας ή διάβρωσης και κάθε άλλη παρατηρούμενη τοξική επίδραση.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τα ακόλουθα στοιχεία:  - είδος, φυλή, πηγή, περιβαλλοντικές συνθήκες, διατροφή, κλπ. G  - συνθήκες δοκιμής (συμπεριλαμβανομένων και των σχετικών φυσικοχημικών ιδιοτήτων της ουσίας, της τεχνικής προετοιμασίας και καθαρισμού του δέρματος, και του τύπου του επιδέσμου: απορροφητικός ή ημιαπορροφητικός G  - καταχώρηση σε πίνακα των στοιχείων αποκρίσεως του ερεθισμού για κάθε ζώο ξεχωριστά για κάθε χρονική περίοδο παρατηρήσεως (π.χ. 1, 24, 48 και 72 ώρες, κλπ., μετά την απομάκρυνση της γάζας) G  - περιγραφή κάθε σοβαρής παρατηρηθείσας αλλοίωσης, συμπεριλαμβανόμενης και της διαβρωτικότητας G  - περιγραφή του βαθμού και της φύσης του παρατηρηθέντος ερεθισμού και τυχόν ιστοπαθολογικά ευήματα G  - περιγραφή τυχόν τοξικών επιδράσεων εκτός από το δερματικό ερεθισμό G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  Προσάρτημα  >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> Β.5. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ (ΕΡΕΘΙΣΜΟΣ ΟΦΘΑΛΜΟΥ) 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Β).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Αρχικές θεωρήσεις  Πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή σε κάθε διαθέσιμη πληροφορία για μια ουσία προκειμένου να ελαχιστοποιείται η δοκιμασία ουσιών κάτω από συνθήκες που είναι πιθανόν να προκαλέσουν σοβαρές αντιδράσεις. Από την πλευρά αυτή, μπορεί να είναι χρήσιμες οι ακόλουθες πληροφορίες.  i) Φυσικοχημικές ιδιότητες και χημική δραστικότητα. Οι ισχυρές όξινες ή αλκαλικές ουσίες οι οποίες, π.χ., μπορεί να δημιουργήσουν στο οφθαλμικό περιβάλλον ένα pΗ λιγότερο του 2 ή μεγαλύτερο του 11,5, μπορεί να μη χρειάζεται να υποβληθούν σε δοκιμασία αν είναι ενδεχόμενο να προκαλέσουν σοβαρές αλλοιώσεις. Θα πρέπει επίσης να λαμβάνεται υπόψη και το αλκαλικό ή όξινο δυναμικό.  (ii) Αποτελέσματα από έγκυρες εναλλακτικές μελέτες. Υλικά για τα οποία έχει διαπιστωθεί ότι έχουν πιθανές διαβρωτικές ή σοβαρές ερεθιστικές ιδιότητες, δεν θα πρέπει να υποβάλλονται σε δοκιμασία για ερεθισμό των οφθαλμών, δεδομένου ότι θα πρέπει να θεωρείται βέβαιο ότι οι ουσίες αυτές θα προκαλέσουν σοβαρές επιδράσεις στους οφθαλμούς.  (iii) Αποτελέσματα από μελέτες ερεθισμού του δέρματος. Υλικά τα οποία έχει καταδειχθεί ότι έχουν σαφείς διαβρωτικές ή σοβαρές ερεθιστικές επιδράσεις στο δέρμα σε μελέτη δερματικού ερεθισμού, δεν θα πρέπει να εξετάζονται περαιτέρω από πλευράς ερεθιστικότητας για τους οφθαλμούς, δεδομένου ότι θα πρέπει να θεωρείται ως βέβαιο ότι οι ουσίες αυτές μπορεί να προκαλέσουν σοβαρές επιδράσεις στους οφθαλμούς.  Η εξεταζόμενη ουσία επιτίθεται σε μία μόνη δόση στον ένα οφθαλμό καθενός από τα διάφορα πειραματόζωα G ο άλλος οφθαλμός χρησιμεύει ως μάρτυρας. Ο βαθμός ερεθισμού αξιολογείται και βαθμολογείται σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές και περαιτέρω περιγράφεται ώστε να έχουμε μία πλήρη αξιολόγηση των επιδράσεων. Η διάρκεια των επιδράσεων θα πρέπει να είναι επαρκής για την πλήρη αξιολόγηση της αναστρεψιμότητας ή μη αναστρεψιμότητας των παρατηρηθεισών επιδράσεων.  Τα ζώα που εμφανίζουν έντονα και διαρκή συμπτώματα δυσφορίας και πόνου μπορεί να χρειασθεί να θανατωθούν ανώδυνα.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ  1.6.1. Προετοιμασίες  Κάθε πειραματόζωο που επιλέγεται προσωρινά για δοκιμασία θα πρέπει, μέσα σε 24 ώρες πριν από την έναρξη της δοκιμασίας, να υποβάλλεται σε οφθαλμολογική εξέταση και των δύο οφθαλμών. Ζώα που εμφανίζουν ερεθισμένους οφθαλμούς, οφθαλμικές ανωμαλίες ή προϋπάρχουσες βλάβες του κερατοειδούς, δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται.  1.6.2. Συνθήκες δοκιμής  1.6.2.1. Πειραματόζωα  Αν και έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορα πειραματόζωα, συνιστάται η δοκιμή να εκτελείται σε υγιή ενήλικα κουνέλια αλμπίνο.  1.6.2.2. Αριθμός ζώων  Αν προβλέπονται σημαντικές επιδράσεις, θα πρέπει να γίνεται δοκιμή σε ένα μόνο ζώο. Αν τα αποτελέσματα της δοκιμής αυτής σε ένα κουνέλι δείχνουν ότι η ουσία είναι εξαιρετικά ερεθιστική, (αναστρέψιμη επίδραση) ή διαβρωτική (μη αναστρέψιμη επίδραση) στον οφθαλμό, χρησιμοποιώντας την περιγραφόμενη διαδικασία, μπορεί να μη χρειάζεται να πραγματοποιηθεί περαιτέρω δοκιμασία για οφθαλμική ερεθιστικότητα σε άλλα ζώα. Περιστασιακώς, μπορεί να είναι σκόπιμη η διενέργεια δοκιμασίας και σε άλλα ζώα προκειμένου να διερευνηθούν συγκεκριμένες απόψεις.  Σε περιπτώσεις εκτός από εκείνη της δοκιμής με ένα μόνο ζώο, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 3 ζώα. Για τη διασαφήνιση διφορούμενων αποκρίσεων, μπορεί να απαιτηθούν και άλλα ζώα.  1.6.2.3. Επίπεδα δόσεων  Μία δόση από 0,1 ml χρησιμοποείται για τη δοκιμή των υγρών. Για τη δοκιμή των στερεών, αλοιφών και σωματιδίων, η χρησιμοποιούμενη ποσότητα πρέπει να έχει έναν όγκο 0,1 ml ή βάρος περίπου 0,1 g (το βάρος πρέπει πάντα να καταχωρείται). Αν το ελεγχόμενο υλικό είναι στερεό ή κοκκώδες πρέπει να αλέθεται σε λεπτή σκόνη. Ο όγκος των σωματιδίων πρέπει να μετριέται αφού συμπυκνωθούν ελαφρά, π.χ. χτυπώντας το δοχείο μετρήσεως.  Στην περίπτωση ουσιών σε σπρέυ ή αεροζόλ υπό πίεση, το υγρό θα πρέπει να εκβάλλεται από τον περιέκτη, να συλλέγεται ποσότητα 0,1 ml και να ενσταλλάζεται στον οφθαλμό όπως περιεγράφη και για τα υγρά.  1.6.2.4. Περίοδος παρατηρήσεως  Η διάρκεια της περιόδου παρατηρήσεως δεν πρέπει να είναι αυστηρά καθορισμένη. Πρέπει όμως να είναι αρκετή, για την αξιολόγηση της επαναφοράς ή της μη επαναφοράς των επιδράσεων που παρατηρήθηκαν, αλλά κανονικά δεν είναι ανάγκη να υπερβαίνει τις 21 ημέρες μετά την ενστάλλαξη.  1.6.3. Διαδικασία  Τα ζώα πρέπει να εγκλωβίζονται χωριστά. Η ελεγχόμενη ουσία πρέπει να τοποθετείται στο τυφλό άκρο του επιπεφυκότος του ενός ματιού κάθε ζώου, αφού τραβηχθεί απαλά το κάτω βλέφαρο από το βολβό. Τα βλέφαρα τότε κρατιούνται απαλά μαζί για ένα περίπου δευτερόλεπτο, για να αποφευχθεί η απώλεια του υλικού. Το άλλο μάτι, το οποίο παραμένει χωρίς επέμβαση, χρησιμοποιείται για μάρτυρας.  Εάν πιστεύεται ότι η ουσία μπορεί να προκαλέσει υπερβολικό πόνο, πριν ενσταλλαχθεί η εξεταζόμενη ουσία, μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάποιο τοπικό αναισθητικό. Ο τύπος, η συγκέντρωση και ο χρόνος εφαρμογής του τοπικού αναισθητικού θα πρέπει να επιλέγεται προσεκτικά ώστε να εξασφαλίζεται ότι δεν πρόκειται να υπάρξει καμία σημαντική διαφοροποίηση στην αντίδραση απέναντι στην εξεταζόμενη ουσία λόγω της χρήσης του αναισθητικού. Παρόμοια αναισθητοποίηση θα πρέπει να γίνεται και στον οφθαλμό μάρτυρα.  Τα μάτια των πειραματόζωων δεν πρέπει να πλένονται για 24 ώρες μετά την ενστάλλαξη της ελεγχόμενης ουσίας. Σε 24 ώρες μπορεί να γίνει ένα πλύσιμο, αν αυτό θεωρηθεί απαραίτητο.  Για ορισμένες ουσίες που από τη δοκιμή αυτή εμφανίζονται να είναι ερεθιστικές, μπορεί να υποδειχθεί η διενέργεια και άλλων δοκιμών χρησιμοποιώντας κουνέλια που τα μάτια τους πλύθηκαν σύντομα μετά από την ενστάλλαξη της ουσίας. Στις περιπτώσεις αυτές, συνιστάται να χρησιμοποιούνται τρία κουνέλια. Μισό λεπτό μετά την ενστάλλαξη τα μάτια των κουνελιών πλένονται για μισό λεπτό χρησιμοποιώντας όγκο και ταχύτητα ροής που δεν θα προκαλέσει βλάβη.  1.6.3.1. Παρατήρηση και βαθμολόγηση  Οι οφθαλμοί θα πρέπει να εξετάζονται 1, 24, 48 και 72 ώρες μετά την ενστάλλαξη. Αν δεν υπάρχουν ενδείξεις οφθαλμικών βλαβών στις 72 ώρες, η μελέτη μπορεί να τερματισθεί.  Εκτεταμένες παρατηρήσεις μπορεί να χρειαστούν αν υπάρχει έμμονη περιπλοκή του κερατοειδή χιτώνα ή άλλος οφθαλμικός ερεθισμός, ώστε να προσδιοριστεί η πορεία των αλλοιώσεων και η θεραπεία τους ή η μη επαναφορά τους. Επιπλέον των παρατηρήσεων του κερατοειδή χιτώνα, της ίριδας και των επιπεφυκότων, κάθε άλλη αλλοίωση που σημειώθηκε πρέπει να αναφερθεί και να καταχωρηθεί. Οι βαθμοί των οφθαλμικών αντιδράσεων (βλέπε πίνακα του προσαρτήματος) πρέπει να καταγράφονται σε κάθε εξέταση. (Η βαθμολογία των οφθαλμικών αντιδράσεων υπόκειται σε διαφορετικές ερμηνείες. Για να βοηθηθούν τα εργαστήρια που κάνουν τις δοκιμασίες και εκείνοι που κάνουν και ερμηνεύουν τις παρατηρήσεις, πρέπει να χρησιμοποιούν ένα διευκρινιστικό οδηγό ερεθισμού του ματιού).Η εξέταση των αντιδράσεων μπορεί να διευκολυνθεί χρησιμοποιώντας στερεοσκόπιο, σχισμοειδή λυχνία χειρός, βιομικροσκόπιο ή άλλη κατάλληλη διάταξη. Μετά από την καταγραφή των παρατηρήσεων των 24 ωρών, οι οφθαλμοί κάποιου ή και όλων των κουνελιών μπορούν να εξετασθούν περαιτέρω με τη βοήθεια φλουορεσκεϊνης.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα, στον οποίο πρέπει να φαίνονται, για κάθε ζώο χωριστά, οι βαθμοί ερεθισμού στον ορισμένο χρόνο παρατηρήσεως, μια περιγραφή του βαθμού και της φύσεως του ερεθισμού, οι σοβαρές αλλοιώσεις όπως και οποιαδήποτε άλλη επίδραση παρατηρήθηκε εκτός των οφθαλμών.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση ελέγχου πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - στοιχεία ζώων (είδος, φυλή, πηγή, συνθήκες περιβάλλοντος, διατροφή κλπ.) G  - πειραματικές συνθήκες (να περιλαμβάνονται οι σχετικές φυσικοχημικές ιδιότητες της ελεγχόμενης ουσίας) G  - καταχώριση σε πίνακα των δεδομένων της ερεθιστικής/διαβρωτικής αντιδράσεως για κάθε ζώο χωριστά, σε κάθε σημείο του χρόνου παρατηρήσεως (δηλαδή σε 1, 24, 48 και 72 ώρες) G  - περιγραφή κάθε σοβαρής αλλοιώσεως που παρατηρήθηκε G  - περιγραφή του βαθμού και της φύσης του παρατηρηθέντος ερεθισμού ή διαβρώσεως, συμπεριλαμβανομένης και της περιοχής του κερατοειδούς, και της αναστρεψιμότητας G  - περιγραφή της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε για τη διαβάθμιση του ερεθισμού στις 1, 24, 48 και 72 ώρες (π.χ. σχισμοειδής λυχνία χειρός, βιομικροσκόπιο, φλουορεσκεϊνη) G  - περιγραφή κάθε μη οφθαλμικής τοπικής επιδράσεως που σημειώθηκε G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  Προσάρτημα  >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> Β.6. ΕΥΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΣΗ ΔΕΡΜΑΤΟΣ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Παρατηρήσεις:  Η ευαισθησία και ικανότητα δοκιμών για την ανίχνευση πιθανών ευαισθητοποιητών του δέρματος του ανθρώπου θεωρούνται σημαντικά στοιχεία στη διαμόρφωση συστήματος ταξινόμησης της τοξικότητας για τη δημόσια υγεία.  Δεν υπάρχει μία ενιαία μέθοδος δοκιμής που να αναγνωρίζει σωστά όλες τις ουσίες που έχουν πιθανότητα να ευαισθητοποιήσουν το ανθρώπινο δέρμα και που να αναφέρεται σε όλες τις ουσίες.  Στην επιλογή μιας δοκιμής, πρέπει να ληφθούν υπόψη παράγοντες όπως τα φυσικά χαρακτηριστικά μιας ουσίας, συμπεριλαμβανομένης και της ικανότητας διείσδυσης στο δέρμα.  Οι δοκιμές στις οποίες χρησιμοποιούνται ινδικά χοιρίδια μπορούν να υποδιαιρεθούν στις δοκιμές με χρησιμοποίηση βοηθητικής ουσίας, στην οποία ενεργοποιείται η μία αλλεργική κατάσταση με τη διάλυση ή την παρασκευή εναιωρήματος της εξεταζόμενης ουσίας στο Freunds Complete Adjuvant (FCA), και στις δοκιμές όπου δεν χρησιμοποιείται βοηθητική ουσία.  Οι δοκιμές με βοηθητική ουσία είναι πιθανόν να είναι πιο σωστές στην πρόβλεψη πιθανής ευαισθητοποιητικής επίδρασης μιας ουσίας στο δέρμα του ανθρώπου σε σχέση με τις μεθόδους εκείνες στις οποίες δεν χρησιμοποιείται FCA και κατά συνέπεια προτιμούνται.  Η Δοκιμή Μεγιστοποίησης Ινδικών Χοιριδίων (ΔΜΙΧ) είναι μία ευρέως χρησιμοποιούμενη δοκιμή με βοηθητική ουσία. Αν και μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες μέθοδοι για την ανίχνευση της δυνατότητας μιας ουσίας να προκαλέσει αντίδραση ευαισθητοποίησης του δέρματος, η ΔΜΙΧ θεωρείται ότι είναι η προτιμότερη τεχνική με βοηθητική ουσία.  Για πολλές τάξεις χημικών ουσιών, οι δοκιμές χωρίς βοηθητική ουσία (από αυτές προτιμάται η δοκιμή Buehler) θεωρούνται ότι είναι λιγότερο ευαίσθητες.  Σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να υπάρχουν λόγοι σκοπιμότητας να επιλεγεί η δοκιμή Buehler η οποία περιλαμβάνει τοπική επίθεση αντί της διαδερμικής έγχυσης που χρησιμοποιείται στην ΔΜΙΧ. Όταν χρησιμοποιείται η δοκιμή Buehler πρέπει να αιτιολογείται επιστημονικά. Στη μέθοδο αυτή περιγράφονται η Δοκιμή Μεγιστοποίησης Ινδικών Χοιριδίων (ΔΜΙΧ) και η δοκιμή Buehler. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες μέθοδοι με την προϋπόθεση ότι είναι έγκυρες και με επιστημονική αιτιολόγηση.  Άσχετα με τις χρησιμοποιούμενες μεθόδους, σε τακτά διαστήματα (έξι μηνών) πρέπει να ελέγχεται η ευαισθησία της φυλής των ινδικών χοιριδίων που χρησιμοποιούνται στη δοκιμασία ευαισθητοποίησης δέρματος, χρησιμοποιώντας ένα γνωστό ισχυρό έως μέτριο ευαισθητοποιητή και να λαμβάνεται ικανοποιητικός αριθμός θετικών αποκρίσεων.  Βλέπε επίσης Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΣ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Β).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Συνιστώνται σαν ουσίες αναφοράς οι παρακάτω ουσίες, στήν απαιτούμενη αραίωση, όπως επίσης και κάθε άλλη ενεργός ουσία, που προκαλεί ευαισθητοποίηση και που είναι γνωστή είτε από τη βιβλιογραφία είτε ανήκει στην ομάδα της εξεταζόμενης ουσίας.  - ρ-φαινυλενοδιαμίνηCAS αρ. 106-50-3  - 2,4-δινιτροχλωροβενζόλιοCAS αρ. 97-00-7  - διχρωμικό κάλιοCAS αρ. 7778-50-9  - θειική νεομυκίνηCAS αρ. 1405-10-3  - θειικό νικέλιοCAS αρ. 7786-81-4  1.4. ΑΡΧΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΔΟΚΙΜΗΣ  Μετά την αρχική έκθεση στην ελεγχόμενη ουσία (περίοδος «διέγερσης»), τα ζώα υφίστανται, περίπου δύο εβδομάδες μετά την τελευταία έκθεση διέγερσης, μία έκθεση «πρόκλησης», για να διαπιστωθεί αν έχει προκληθεί μια κατάσταση υπερευαισθησίας. Η ευαισθητοποίηση πιστοποιείται με την εξέταση της δερματικής αντίδρασης στην έκθεση πρόκλησης.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΔΟΚΙΜΗΣ  1.6.1. Δοκιμή μεγιστοποίησης σε ινδικό χοιρίδιο (ΔΜΙΧ)  1.6.1.1. Προετοιμασίες  Λαμβάνονται στην τύχη υγιή, νεαρά, λευκά ινδικά χοιρίδια και χωρίζονται σε ομάδες αγωγής και μαρτυρίας. Πριν από τη χορήγηση της ουσίας, το τρίχωμα αφαιρείται, κουρεύοντάς το ή ξυρίζοντάς το, από την περιοχή του ώμου. Πρέπει να δίνεται προσοχή ώστε να αποφεύγεται η βλάβη του δέρματος.  1.6.1.2. Συνθήκες δοκιμής  1.6.1.2.1. Πειραματόζωα  Χρησιμοποιούνται συνήθως χρησιμοποιούμενα στα εργαστήρια λευκά ινδικά χοιρίδια, που ζυγίζουν λιγότερο από 500 γραμμάρια.  1.6.1.2.2. Αριθμός και φύλο  Μπορούν να χρησιμοποιηθούν αρσενικά και/ή θηλυκά ζώα. Αν χρησιμοποιηθούν θηλυκά, αυτά θα πρέπει να είναι άτοκα και να μην ευρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Για την ομάδα αγωγής χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 10 ζώα ενώ για την ομάδα των μαρτύρων χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 5 ζώα. Η τυχόν χρησιμοποίηση λιγότερων ζώων πρέπει να αιτιολογείται. Στην περίπτωση διφορούμενων αποτελεσμάτων, η ιστοπαθολογική εξέταση μπορεί να βοηθήσει για να ληφθεί απόφαση αν θα πρέπει να επαναληφθεί η δοκιμή χρησιμοποιώντας και άλλα ζώα. Όταν δεν είναι δυνατόν να συμπεράνει κανείς ότι η δοκιμαζόμενη ουσία είναι ή όχι ευαισθητοποιητική συνιστάται δοκιμή σε επί πλέον αριθμό ζώων μέχρι τουλάχιστον ενός συνόλου 20 πειραματοζώων και 10 ζώων ελέγχου.  1.6.1.2.3. Επίπεδα δόσεων  Η συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας προσαρμόζεται σε επίπεδο ώστε να παράγονται ικανές ενδείξεις ερεθισμού του δέρματος, αλλά το οποίο είναι καλώς ανεκτό από τα ζώα σε κάθε στάδιο διέγερσης.  Η συγκέντρωση πρόκλησης θα πρέπει να είναι η μέγιστη συγκέντρωση που δεν παρέχει ένδειξη ερεθισμού του δέρματος σε μη ευαισθητοποιημένα ζώα.  Οι συγκεντρώσεις αυτές μπορούν να προσδιορισθούν με μία μελέτη-πιλότο σε μικρή κλίμακα (δύο έως τρία ζώα).  1.6.1.2.4. Περίοδος παρατήρησης  Κατά τη διάρκεια της περιόδου διέγερσης εκτελούνται παρατηρήσεις για να διαπιστωθούν πιθανές ερεθιστικές επιδράσεις. Μετά από την έκθεση πρόκλησης, καταγράφονται δερματικές αντιδράσεις στις 24 και 48 ώρες μετά την απομάκρυνση της γάζας.  1.6.1.3. Διαδικασία  Πριν από την έναρξη και στο τέλος της δοκιμής τα ζώα ζυγίζονται. Αφαιρείται το τρίχωμα από την περιοχή των ώμων. Στη διαδικασία υπάρχουν δύο στάδια:  1.6.1.3.1. Διέγερση  Ημέρα 0 - ομάδα αγωγής  Διενεργούνται στην περιοχή του ώμου τα ακόλουθα ζεύγη ενδοδερμικών ενέσεων, των 0,1 ml, κατά τέτοιο τρόπο ώστε μία από κάθε ζεύγος να είναι από κάθε πλευρά της μέσης γραμμής:  Έγχυση 1:0,1 ml FCA σε μείγμα με νερό ή φυσιολογικό αλατούχο ορό 1:1,  Έγχυση 2:0,1 ml εξεταζόμενης ουσίας, σε κατάλληλο φορέα όταν απαιτείται,  Έγχυση 3:0,1 ml εξεταζόμενης ουσίας σε FCA (βοηθητική ουσία).  Στην έγχυση 3, υδατοδιαλυτές ουσίες διαλύονται σε 0,05 ml νερό και 0,05 ml μη αραιωμένο FCA. Αν πρόκειται να εξετασθούν λιποδιαλυτές ή αδιάλυτες ουσίες, αναμειγνύονται με μη αραιωμένο FCA.  Στην έγχυση 3, η τελική συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας πρέπει να είναι ίση με τη συγκέντρωση στην έγχυση 2.  Οι εγχύσεις 1 και 2 διενεργούνται η μία κοντά στην άλλη και πολύ κοντά στο κεφάλι, ενώ η 3 διενεργείται προς το ουραίο τμήμα της εξεταζόμενης περιοχής.  Ημέρα 0 - ομάδα μάρτυρας  Διενεργούνται τα ακόλουθα ζεύγη ενδοδερμικών εγχύσεων στις ίδιες θέσεις όπως και παραπάνω:  Έγχυση 1:0,1 ml FCA σε μείγμα με νερό ή φυσιολογικό αλατούχο ορό 1:1,  Έγχυση 2:0,1 ml μόνο φορέα,  Έγχυση 3:0,1 ml φορέα σε FCA.  Ημέρα 6 - Ομάδες μαρτυρίας και αγωγής  Αν η ουσία δεν ερεθίζει το δέρμα, η εξεταζόμενη περιοχή, μετά από την κοπή και/ή ξύρισμα του τριχώματος, βάφεται με 0,5 ml 10 % δωδεκυλοθειικού νατρίου σε βαζελίνη, για την πρόκληση τοπικού ερεθισμού.  Ημέρα 7 - ομάδα αγωγής  Η εξεταζόμενη περιοχή καθαρίζεται και πάλι από το τρίχωμα. Η εξεταζόμενη ουσία σε κατάλληλο φορέα (η εκλογή του φορέα πρέπει να αιτιολογείται G τα στερεά κονιοποιούνται καλά και ενσωματώνονται σ´ένα κατάλληλο έκδοχο G τα υγρά, αν είναι σκόπιμο, μπορούν να επιτίθενται άμεσα) απλώνεται σε διηθητικό χαρτί (2 Χ 4 cm) και επιτίθεται στην εξεταζόμενη περιοχή και διατηρείται σε επαφή επί 48 ώρες με ένα αδιαπέρατο επίδεσμο.  Ημέρα 7 - ομάδα μάρτυρας  Η εξεταζόμενη περιοχή καθαρίζεται και πάλι από το τρίχωμα. Στην εξεταζόμενη περιοχή επιτίθενται με παρόμοιο τρόπο μόνον ο φορέας και διατηρείται σε επαφή με ένα αδιαπέραστο επίδεσμο για 48 ώρες.  1.6.1.3.2. Πρόκληση  Ημέρα 21  Οι πλευρές των υπό αγωγή ζώων και των ζώων μαρτύρων καθαρίζονται από τρίχωμα. Στην μια πλευρά των εξεταζόμενων ζώων φέρεται γάζα ή κάψουλα περιέχουσα την εξεταζόμενη ουσία ενώ στη άλλη πλευρά φέρεται γάζα ή κάψουλα περιέχουσα μόνο φορέα.  Οι γάζες κρατιούνται σε επαφή με ένα αδιαπέρατο επίδεσμο επί 24 ώρες.  Η ομάδα μάρτυρας εκτίθεται με παρόμοιο τρόπο.  Ημέρα 23 και 24  - 21 ώρες μετά την απομάκρυνση της γάζας, η περιοχή πρόκλησης, αν χρειάζεται, καθαρίζεται και αποτριχώνεται,  - τρεις ώρες αργότερα (σε 48 ώρες από την έναρξη εφαρμογής της πρόκλησης) παρατηρείται και καταγράφεται η αντίδραση του δέρματος,  - 24 ώρες μετά την παρατήρηση αυτή, εκτελείται και καταγράφεται μία δεύτερη παρατήρηση (72 ώρες).  Για να διευκρινισθούν τα αποτελέσματα που λήφθηκαν στην πρώτη πρόκληση, θα πρέπει να διενεργείται μία περίπου εβδομάδα μετά από την πρώτη, μία δεύτερη πρόκληση, με μία νέα ομάδα μάρτυρα φορέα αν χρειάζεται.  1.6.1.3.3. Παρατήρηση και βαθμολόγηση  Θα πρέπει να καταγράφονται και να αναφέρονται όλες οι δερματικές αντιδράσεις και οποιαδήποτε ασυνήθη ευρήματα που προκύπτουν από τις διαδικασίες διέγερσης και πρόκλησης.  Για τη διασαφήνιση αμφισβητήσιμων αντιδράσεων ή αποκρίσεων που καλύπτονται λόγω της χρώσης του δέρματος, με την εξεταζόμενη ουσία, μπορούν να χρησιμοποιηθούν τεχνικές όπως η ιστοπαθολογική εξέταση ή η μέτρηση του πάχους των πτυχώσεων του δέρματος.  1.6.2. Δοκιμή Buehler  1.6.2.1. Προετοιμασίες  Λαμβάνονται στην τύχη υγιή, νεαρά, ινδικά χοιρίδια και κατανέμονται σε ομάδες αγωγής και μαρτυρίας. Πριν από τη δοκιμασία αφαιρείται με κούρεμα και/ή ξύρισμα, το τρίχωμα από την μία πλευρά. Πρέπει να δίνεται προσοχή ώστε να αποφεύγεται η πρόκληση βλάβης στο δέρμα.  1.6.2.2. Συνθήκες δοκιμής  1.6.2.2.1. Πειραματόζωα  Χρησιμοποιούνται τα συνήθη στα εργαστήρια λευκά ινδικά χοιρίδια, που ζυγίζουν λιγότερο από 500 γρ.  1.6.2.2.2. Αριθμός και φύλο  Μπορούν να χρησιμοποιηθούν αρσενικά και/ή θηλυκά ζώα. Αν χρησιμοποιηθούν θηλυκά, θα πρέπει να είναι άτοκα και να μην ευρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Στην ομάδα αγωγής χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 20 ζώα ενώ στην ομάδα μαρτυρίας χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 10. Η χρήση λιγότερων ζώων πρέπει να αιτιολογείται. Στην περίπτωση διφορούμενων αποτελεσμάτων, η ιστοπαθολογική εξέταση μπορεί να βοηθήσει ώστε να ληφθεί απόφαση αν θα πρέπει να επαναληφθεί η δοκιμή χρησιμοποιώντας μία άλλη ομάδα ζώων.  1.6.2.2.3. Επίπεδα δόσεων  Για κάθε στάδιο διέγερσης, η συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας προσαρμόζεται στο υψηλότερο επίπεδο που μπορεί να είναι καλώς ανεκτό συστηματικά και που, για τις ερεθιστικές ουσίες, προκαλεί ήπιο έως μέτριο ερεθισμό στην πλειοψηφία των εξεταζόμενων ζώων. Η συγκέντρωση πρόκλησης θα πρέπει να είναι η μέγιστη συγκέντρωση με την οποία δεν παρέχονται ενδείξεις δερματικού ερεθισμού σε μη ευαισθητοποιημένα ζώα. Οι συγκεντρώσεις αυτές μπορούν να προσδιορισθούν με μία μελέτη μικρής κλίμακας (δύο έως τρία ζώα).  1.6.2.2.4. Περίοδος παρατήρησης  Κατά τη διάρκεια της περιόδου διέγερσης εκτελούνται στο δέρμα παρατηρήσεις για τη διαπίστωση τυχόν ερεθιστικών επιδράσεων. Μετά την έκθεση πρόκλησης, οι δερματικές αντιδράσεις καταγράφονται στις 24 και 48 ώρες μετά την απομάκρυνση της γάζας, δηλ. 30 και 54 ώρες μετά την έναρξη εφαρμογής.  1.6.2.3. Διαδικασία  Πριν από την έναρξη της δοκιμής και στο τέλος της δοκιμής, τα ζώα ζυγίζονται.  Υπάρχουν δύο στάδια στη διαδικασία:  1.6.2.3.1. Διέγερση  Ημέρα 0 - ομάδα αγωγής  Η μία πλευρά καθαρίζεται από το τρίχωμα (κουρεύεται και ξυρίζεται). 0,5 ml της εξεταζόμενης ουσίας σε κατάλληλο φορέα (η εκλογή του φορέα πρέπει να αιτολογείται G τα υγρά, αν είναι σκόπιμο, μπορούν να επιτίθενται άμεσα) απλώνονται σε μία βαμβακερή γάζα. Η γάζα φέρεται στην εξεταζόμενη περιοχή και κρατιέται σε επαφή με το δέρμα με ένα κατάλληλο επίδεσμο επί 6 ώρες.  Ημέρα 0 - ομάδα μαρτυρίας  Η μία πλευρά καθαρίζεται από το τρίχωμα (κουρεύεται και ξυρίζεται). Στην εξεταζόμενη περιοχή επιτίθεται μόνον ο φορέας με παρόμοιο τρόπο. Κρατιέται σε επαφή με το δέρμα με ένα κατάλληλο επίδεσμο επί 6 ώρες. Ημέρες 7 και 14  Την 7η και 14η ημέρα, πραγματοποιείται η ίδια εργασία όπως και την ημέρα 0 στην ίδια εξεταζόμενη περιοχή (που καθαρίζεται από το τρίχωμα αν απαιτείται).  1.6.2.3.2. Πρόκληση  Ημέρα 28  Καθαρίζεται από το τρίχωμα (κούρεμα και ξύρισμα) η άλλη πλευρά των υπό αγωγή ζώων και των ζώων μαρτύρων. Στην οπίσθια δεξιά πλευρά των υπό αγωγή ζώων φέρεται αδιαπέρατη γάζα ή κάψουλα περιέχουσα 0,5-ml εξεταζόμενης ουσίας, στη μέγιστη συγκέντρωση μη ερεθισμού. Στην εμπρόσθια πλευρά εφαρμόζεται επίσης μία αδιαπέρατη γάζα ή κάψουλα μόνο με φορέα.  Οι αδιαπέρατες γάζες κρατιούνται σε επαφή με το δέρμα με ένα κατάλληλο επίδεσμο επί 6 ώρες.  Η ομάδα μαρτύρων εκτίθεται με τον ίδιο τρόπο.  Ημέρες 29 και 30  - 21 ώρες μετά από την απομάκρυνση της γάζας, η περιοχή πρόκλησης καθαρίζεται και αποτριχώνεται, αν χρειάζεται,  - τρεις ώρες αργότερα (σε 30 ώρες από την έναρξη εφαρμογής της πρόκλησης) παρατηρείται και καταγράφεται η αντίδραση του δέρματος,  - 24 ώρες μετά από την παρατήρηση αυτή, διενεργείται και καταγράφεται μία δεύτερη παρατήρηση (54 ώρες).  1.6.2.3.3. Παρατήρηση και βαθμολόγηση  Θα πρέπει να καταγράφεται και να αναφέρεται κάθε δερματική αντίδραση και οποιοδήποτε ασύνηθες εύρημα από τις διαδικασίες διέγερσης και πρόκλησης.  Για τη διασαφήνιση αμφισβητήσιμων αντιδράσεων ή αποκλίσεων που καλύπτονται εξαιτίας της χρώσης του δέρματος από την εξεταζόμενη ουσία, μπορούν να χρησιμοποιηθούν τεχνικές όπως η ιστοπαθολογική εξέταση ή η μέτρηση του πάχους των πτυχώσεων του δέρματος.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ (ΔΜΙΧ και δοκιμή Buehler)  Τα δεδομένα θα πρέπει να συνοψίζονται με τη μορφή πίνακα, στον οποίο να παρουσιάζονται για κάθε ζώο οι δερματικές αντιδράσεις σε κάθε παρατήρηση.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ (ΔΜΙΧ και δοκιμή Buehler)  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ (ΔΜΙΧ και δοκιμή Buehler)  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - φυλή χρησιμοποιουμένων ινδικών χοιριδίων G  - συνθήκες δοκιμής, φορέα και συγκεντρώσεις εξεταζόμενης ουσίας που χρησιμοποιούνται για διεγέρσεις και προκλήσεις G  - αριθμός, ηλικία και φύλο των ζώων G  - ατομικά βάρη των ζώων στην αρχή και στο τέλος της δοκιμασίας G  - κάθε παρατήρηση που έγινε για κάθε ζώο, συμπεριλαμβανομένου του συστήματος βαθμολόγησης, αν χρησιμοποιήθηκε G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ (ΔΜΙΧ και δοκιμή Buehler)  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  Β.7. ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΗΣ (28 ΗΜΕΡΕΣ) ΔΟΣΗΣ (ΑΠΟ ΤΟ ΣΤΟΜΑ) 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Β).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η εξεταζόμενη ουσία, χορηγείται από το στόμα, σε ημερήσιες διαβαθμισμένες δόσεις, σε διάφορες ομάδες πειραματοζώων, μια δόση ανά ομάδα, για μια περίοδο 28 ημερών. Τα ζώα εξετάζονται καθημερινά κατά τη διάρκεια της περιόδου χορήγησης για τη διαπίστωση τοξικών συμπτωμάτων. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμής, όπως και αυτά που επιζούν στο τέλος της, νεκροτομούνται.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασία  Τα ζώα κρατούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες εγκλωβισμού και διατροφής, τουλάχιστον για 5 ημέρες πριν τη δοκιμή. Πριν από τη δοκιμή, υγιή, νεαρά ζώα λαμβάνονται τυχαία και κατανέμονται στις πειραματικές ομάδες. Οι ελεγχόμενες ουσίες μπορεί να χορηγούνται μέσα στην τροφή, με στομαχική καθετηρίαση, σε κάψουλες ή και στο πόσιμο νερό. Σla ta y´va prιpei na dιxontai thdσsh me thn νdia mιuodo s' όλη τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου. Εάν ένας φορέας ή άλλες προσθετικές ουσίες χρησιμοποιούνται για να διευκολύνουν τη χορήγηση της ουσίας, πρέπει να είναι γνωστό ότι δεν έχουν τοξικές επιδράσεις. Ιστορικά δεδομένα μπορούν να χρησιμοποιηθούν, εάν είναι διαθέσιμα.  1.6.2. Πειραματικές συνθήκες  1.6.2.1. Πειραματόζωα  Εάν δεν υπάρχουν αντενδείξεις, το προτιμότερο είδος είναι ο επίμυς. Πρέπει να χρησιμοποιούνται οι συνήθεις εργαστηριακές φυλές από νεαρά, υγιή ζώα. Στην πιο ιδανική περίπτωση, η χορήγηση πρέπει να αρχίσει προτού οι επίμυες φθάσουν την ηλικία των 6 και, σε ορισμένες περιπτώσεις, των 8 εβδομάδων. Στην αρχή της μελέτης, η διαφορά βάρους των χρησιμοποιουμένων ζώων δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% της μέσης τιμής.  Στην αρχή της μελέτης, το εύρος της διαφοράς βαρών των ζώων που χρησιμοποιούνται στη μελέτη δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το ± 20 % της ενδεδειγμένης μέσης τιμής.  1.6.2.2. Αριθμός και φύλο  Για κάθε επίπεδο δόσεων, πρέπει να χρησιμοποιούνται 10, τουλάχιστον, ζώα (5 θηλυκά και 5 αρσενικά). Τα θηλυκά πρέπει να είναι άτοκα και να μη βρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Εάν έχουν σχεδιαστεί ενδιάμεσες θανατώσεις ζώων, ο αριθμός των ζώων ανά ομάδα πρέπει να αυξηθεί με τον αριθμό των ζώων που προγραμματίστηκε να θανατωθούν πριν από τη συμπλήρωση της μελέτης. Επιπλέον, μια δορυφορική ομάδα από 10 ζώα (5 ζώα ανά φύλο) πρέπει να υποστεί την επέμβαση με την υψηλότερη δόση για 28 ημέρες, ώστε να επιτρέφει παρατηρήσεις για την επαναφορά, εμμονή ή αργοπορημένη εμφάνιση των τοξικών συμπτωμάτων για 14 ημέρες μετά το τέλος των χορηγήσεων. Χρησιμοποιείται επίσης και μία δορυφορική ομάδα από 10 ζώα μάρτυρες (πέντε ζώα κατά φύλο).  1.6.2.3. Επίπεδα δόσεων  Πρέπει να χρησιμοποιούνται τρία, τουλάχιστον, επίπεδα δόσεων και ένας μάρτυρας. Εκτός από τη χορήγηση της ελεγχόμενης ουσίας, τα ζώα της ομάδας του μάρτυρα πρέπει να υφίστανται την ίδια ακριβώς μεταχείριση όπως και οι υπόλοιπες ομάδες. Όταν χρησιμοποιείται έκδοχο για τη διευκόλυνση της χορήγησης, τα ζώα του μάρτυρα πρέπει να λαμβάνουν το έκδοχο με τον ίδιο τρόπο όπως και οι πειραματικές ομάδες και να δέχονται το ίδιο ποσό φορέα που δέχονται τα ζώα της ομάδας των υψηλότερων δόσεων. Το υψηλότερο επίπεδο δόσεων πρέπει μεν να προκαλεί τοξικές επιδράσεις αλλά καθόλου ή πολύ λίγους θανάτους. Το χαμηλότερο επίπεδο δόσεων δεν πρέπει να προκαλεί κανένα τοξικό σύμπτωμα. Όπου υπάρχει δυνατότητα εκτίμησης εκθέσεων του ανθρώπου, το κατώτερο επίπεδο δόσεων πρέπει να υπερβαίνει την εκτίμηση. Στην ιδεώδη περίπτωση, το ενδιάμεσο επίπεδο δόσεων πρέπει να προκαλεί ελάχιστα διακρινόμενα τοξικά συμπτώματα. Εάν χρησιμοποιούνται περισσότερες από μια ενδιάμεσες δόσεις, τα επίπεδα πρέπει να είναι κατανεμημένα με τέτοιο τρόπο ώστε να είναι δυνατή η κλιμάκωση των τοξικών επιδράσεων. Στις ομάδες των χαμηλών και ενδιάμεσων δόσεων, καθώς και στους μάρτυρες, η συχνότητα εμφάνισης θανάτων πρέπει να είναι χαμηλή, έτσι που να επιτρέπεται μια σημαντική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων.  Όταν η ελεγχόμενη ουσία χορηγείται με την τροφή, πρέπει να χρησιμοποιείται είτε η σταθερή συγκέντρωση στην τροφή (ppm ή mg/kg τροφής) είτε το σταθερό επίπεδο δόσεων εκφρασμένο επί του βάρους του σώματος του ζώου. Άλλος εναλλακτικός τρόπος, εάν χρησιμοποιηθεί, πρέπει να οριστεί με λεπτομέρειες. Για ουσίες που χορηγούνται με καθετηρίαση, η χορήγηση πρέπει να γίνεται ακριβώς την ίδια ώρα κάθε ημέρα. Οι δόσεις πρέπει να προσαρμόζονται κατά διαστήματα (μία ή δύο φορές την εβδομάδα), ώστε να διατηρείται ένα σταθερό επίπεδο δόσεων σε αναλογία με το βάρος.  1.6.2.4. Οριακή δοκιμασία  Εάν μία μελέτη 28 ημέρων γίνει σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται παρακάτω, σε ένα επίπεδο δόσεων 1 000 mg/kg βάρους σώματος ανά ημέρα, ή και σε υψηλότερο επίπεδο σχετιζόμενο με τη δυνατή έκθεση του ανθρώπου, εάν είναι γνωστή, και δεν προκαλέσει κανένα τοξικό σύμπτωμα, τότε δεν θεωρείται αναγκαία η περαιτέρω συνέχιση της μελέτης. Για ουσίες με χαμηλή τοξικότητα, είναι σημαντικό να εξασφαλίζεται ότι, όταν η ουσία χορηγείται με την τροφή, οι ποσότητες και οι σχετικές ιδιότητες της ελεγχόμενης ουσίας δεν παρεμβαίνουν στις φυσιολογικές ανάγκες διατροφής.  1.6.2.5. Περίοδος παρατηρήσεων  Όλα τα ζώα πρέπει να παρατηρούνται καθημερινά και να καταγράφονται όλα τα τοξικά συμπτώματα, συμπεριλαμβανομένων του χρόνου εμφάνισής τους, του βαθμού σοβαρότητας και της διάρκειας. Πρέπει να καταγράφονται, επίσης, ο χρόνος θανάτου και οι χρόνοι εμφάνισης και εξαφάνισης των τοξικών συμπτωμάτων.  1.6.3. Διαδικασία  Στην πιο ιδανική περίπτωση, η χορήγηση της ελεγχόμενης ουσίας γίνεται επί 7 ημέρες την εβδομάδα για μια περίοδο 28 ημερών. Τα ζώα μιας δορυφορικής ομάδας σχεδιασμένης για τις επακόλουθες παρατηρήσεις πρέπει να διατηρούνται 14 ακόμα ημέρες χωρίς χορήγηση, ώστε να γίνει δυνατή η εξακρίβωση των φαινομένων της επαναφοράς ή της εμμονής των τοξικών επιδράσεων.  Στις παρατηρήσεις θα πρέπει να περιλαμβάνονται αλλοιώσεις στο δέρμα, στο τρίχωμα, στα μάτια, στους βλεννογόνους, στο αναπνευστικό, κυκλοφορικό, αυτόνομο και κεντρικό νευρικό σύστημα, καθώς και στη σωματοκινητική δραστηριότητα και στη συμπεριφορά. Κάθε εβδομάδα θα πρέπει να γίνονται μετρήσεις κατανάλωσης τροφής (και κατανάλωσης νερού όταν η εξεταζόμενη ουσία χορηγείται μέσα στο πόσιμο νερό) και τα ζώα θα πρέπει να ζυγίζονται κάθε εβδομάδα.  Η τακτική παρατήρηση των ζώων είναι αναγκαία για να αποφεύγονται όσο είναι δυνατόν απώλειες ζώων από τη μελέτη που οφείλονται σε αιτίες όπως ο καννιβαλισμός, η αυτόλυση των ιστών ή η κακή τοποθέτηση. Στο τέλος της μελέτης, όλα τα επιζώντα που ανήκουν σε μη δορυφορικές ομάδες αγωγής, υποβάλλονται σε νεκροψία. Τα ετοιμοθάνατα ζώα και τα ζώα που παρουσιάζουν συμπτώματα έντονου πόνου και δυσφορίας θα πρέπει να απομακρύνονται μόλις αυτό γίνεται αντιληπτό, να θανατώνονται ανώδυνα και να νεκροτομούνται.  Στο τέλος της δοκιμασίας, για όλα τα ζώα ακόμα και του μάρτυρα, πρέπει να γίνουν οι ακόλουθες εξετάσεις:  1. αιματολογικές εξετάσεις που περιλαμβάνουν τουλάχιστον, τις μετρήσεις του δείκτη αιματοκρίτη, τη συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης, αριθμό ερυθροκυττάρων, αριθμό λευκοκυττάρων και λευκοκυτταρικό τύπο και μία μέτρηση της πηκτικότητας του αίματος G  2. κλινικές βιοχημικές δοκιμασίες στο αίμα που περιλαμβάνουν, τουλάχιστον, μία παράμετρο της λειτουργίας του ήπατος και των νεφρών: αλανίνο αμινοτρανσφεράση του ορού (αρχικά γνωστή σαν γλουταμίνη-πυροσταφυλική trans-αμινάση του ορού), ασπαρική αμινοτρανσφεράση του ορού (αρχικά γνωστή σαν γλουταμινική όξαλο- οξική trans-αμινάση του ορού), άζωτο ουρίας, λεύκωμα, κρεατινίνη αίματος, ολική χολερυθρίνη και ολικές πρωτεΎνες ορού.  Άλλοι προσδιορισμοί, οι οποίοι μπορεί να είναι απαραίτητοι για μια ικανοποιητική τοξικολογική αξιολόγηση, περιλαμβάνουν το ασβέστιο, το φωσφόρο, το χλώριο, το νάτριο, το κάλιο, τη δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη, ανάλυση λιπιδίων, ορμόνες, σχέση οξέων/βάσεων, μεθαιμοσφαιρίνη και χολινεστερασική δραστηριότητα.  Πρόσθετες κλινικές βιοχημικές δοκιμασίες μπορεί να χρησιμοποιηθούν όταν υπάρχει ανάγκη επέκτασης της έρευνας των παρατηρηθεισών επιδράσεων.  1.6.3.1. Νεκροψία  Όλα τα ζώα της μελέτης θα πρέπει να υποβάλλονται σε πλήρη νεκροφία. Τουλάχιστον το σηκώτι, τα νεφρά, τα επινεφρίδια και οι όρχεις θα πρέπει να ζυγίζονται νωπά το δυνατόν γρηγορότερα μετά την ανατομή για να αποφεύγεται η ξήρανση. Τα όργανα και οι ιστοί (συκώτι, νεφρά, σπλήνα, όρχεις, επινεφρίδια, καρδιά και κάθε άλλο όργανο που εμψανίζει μακροσκοπικές αλλοιώσεις ή αλλαγές στο μέγεθος) θα πρέπει να διατηρούνται σε κατάλληλο μέσον για πιθανή μελλοντική ιστοπαθολογική εξέταση.  1.6.3.2. Ιστοπαθολογική εξέταση  Η ιστοπαθολογική εξέταση πρέπει να γίνεται σε διατηρημένους ιστούς και όργανα των ζώων των ομάδων υψηλών δόσεων και μάρτυρα. Τα όργανα και οι ιστοί που εμφανίζουν βλάβες αποδιδόμενες στην επίδραση της υψηλότερης δόσης της ελεγχόμενης ουσίας πρέπει να εξετάζονται και σε όλες τις χαμηλότερες δόσεις. Τα ζώα της δορυφορικής ομάδας πρέπει να εξετάζονται ιστολογικά, με ιδιαίτερη έμφαση για εκείνα τα όργανα και ιστούς που εμφάνισαν επιδράσεις στα ζώα άλλων πειραματικών ομάδων.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα, όπου για κάθε ομάδα της δοκιμής θα φαίνονται ο αριθμός των ζώων στην αρχή της δοκιμής και ο αριθμός των ζώων που εμφανίζουν καθέναν από τους τύπους αλλοιώσεων.  Όλα τα παρατηρηθέντα αποτελέσματα πρέπει να επεξεργάζονται με μια κατάλληλη στατιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε αναγνωρισμένη στατιστική μέθοδος.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - είδος, φυλή, πηγή, συνθήκες περιβάλλοντος, τροφή, κλπ. G  - πειραματικές συνθήκες G  - επίπεδα δόσεων (περιλαμβανομένου και του φορέα, εάν χρησιμοποιείται) και συγκεντρώσεις G  - δεδομένα τοξικής αντίδρασης ανά φύλο και δόση G  - επίπεδα μη τοξικά, εάν είναι δυνατόν G  - χρόνο θανάτου κατά τη δοκιμή ή εάν τα ζώα επιζούν στο τέλος της δοκιμής G  - τοξικές και άλλες επιδράσεις G  - το χρόνο παρατήρησης κάθε ανώμαλου συμπτώματος και τη μετέπειτα πορεία του G  - δεδομένα τροφής και βάρους σώματος G  - αιματολογικές δοκιμές και όλα τα αποτελέσματα G  - κλινικές βιοχημικές δοκιμές και όλα τα αποτελέσματα G  - ευρήματα νεκροψίας G  - λεπτομερή περιγραφή όλων των ιστοπαθολογικών αποτελεσμάτων G  - στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, εάν είναι δυνατόν G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  Β.8. ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΗΣ (28 ΗΜΕΡΕΣ) ΔΟΣΗΣ (ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ) 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Χρήσιμο είναι να υπάρχουν προκαταρκτικές πληροφορίες για την κατανομή μεγέθους σωματιδίων, την τάση ατμών, το σημείο τήξεως, το σημείο ζέσεως, το σημείο ανάφλεξης και την εκρηξιμότητα (αν υπάρχει) της ουσίας.  Βλέπε επίσης Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Β).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Διάφορες ομάδες πειραματοζώων εκτίθενται καθημερινά, για μια ορισμένη περίοδο, σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης ουσίας, μια συγκέντρωση ανά ομάδα, για μια χρονική περίοδο 28 ημερών. Όταν χρησιμοποιείται φορέας για να βοηθήσει στην παραγωγή της κατάλληλης συγκέντρωσης της εξεταζόμενης ουσίας, τότε πρέπει να χρησιμοποιείται και μια ομάδα μάρτυρας για το φορέα. Κατά τη διάρκεια της χορήγησης, πρέπει να γίνονται καθημερινές παρατηρήσεις στα ζώα, για τη διαπίστωση συμπτωμάτων τοξικότητας. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας, όπως και αυτά που επιζούν στο τέλος της, πρέπει να νεκροτομούνται.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασίες  Τα ζώα κρατούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες εγκλωβισμού και διατροφής για 5 τουλάχιστον ημέρες πριν από την έναρξη του πειράματος. Πριν από τη δοκιμή υγιή, νεαρά ζώα ξεχωρίζονται τυχαία και κατανέμονται στις απαιτούμενες πειραματικές ομάδες. Ένας κατάλληλος φορέας μπορεί να προστεθεί στην εξεταζόμενη ουσία, όταν χρειαστεί, για να βοηθήσει την παραγωγή της κατάλληλης συγκέντρωσης της ουσίας στην ατμόσφαιρα. Αν ένας φορέας ή άλλες προσθετικές ουσίες χρησιμοποιούνται για να διευκολυνθεί η χορήγηση των δόσεων, πρέπει να είναι γνωστό ότι δεν προκαλούν τοξικές επιδράσεις. Ιστορικά στοιχεία, αν υπάρχουν, μπορεί να χρησιμοποιηθούν.  1.6.2. Πειραματικές συνθήκες  1.6.2.1. Πειραματόζωα  Ο επίμυς είναι το είδος που προτιμάται, εκτός αν υπάρχουν αντενδείξεις. Πρέπει να χρησιμοποιούνται οι συνηθισμένες εργαστηριακές φυλές και νεαρά, υγιή ζώα.  Στην αρχή της μελέτης, το εύρος της διαφοράς βαρών των χρησιμοποιουμένων ζώων δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το ± 20 % της ενδεδειγμένης μέσης τιμής.  1.6.2.2. Αριθμός και φύλο  Για κάθε δοκιμαζόμενη ομάδα πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 10 ζώα (5 θυλυκά και 5 αρσενικά). Τα θηλυκά πρέπει να είναι άτοκα και να μη βρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Εάν έχουν προγραμματιστεί ενδιάμεσες θανατώσεις ζώων, τότε ο αριθμός των ζώων, ανά ομάδα, πρέπει να αυξηθεί με τον αριθμό των ζώων που έχουν προγραμματιστεί να θανατωθούν πριν την ολοκλήρωση της μελέτης. Επιπλέον, μία δορυφορική ομάδα από 10 ζώα (πέντε ζώα κατά φύλο) μπορεί να υποβληθεί σε αγωγή με το επίπεδο υφηλής συγκέντρωσης επί 28 ημέρες και να παρατηρηθεί σε σχέση με την αναστρεψιμότητα, εμμονή ή όψιμη εμφάνιση τοπικών επιδράσεων επί 14 ημέρες μετά την αγωγή. Χρησιμοποιείται επίσης μία δορυφορική ομάδα από 10 ζώα μάρτυρες (πέντε ζώα κατά φύλο).  1.6.2.3. Συγκεντρώσεις έκθεσης  Απαιτούνται τουλάχιστον τρεις συγκεντρώσεις, με ένα μάρτυρα ή ένα μάρτυρα φορέα (που αντιστοιχεί στη συγκέντρωση του φορέα στην υψηλότερη δόση), αν χρησιμοποιείται φορέας. Τα ζώα στην ομάδα του μάρτυρα πρέπει να υφίστανται την ίδια μεταχείριση, της χορήγησης της εξεταζόμενης ουσίας εξαιρουμένης, με τα ζώα της εξεταζόμενης ομάδας. Η υψηλότερη συγκέντρωση πρέπει να προκαλεί τοξικές επιδράσεις, αλλά καθόλου ή λίγους θανάτους. Η χαμηλότερη συγκέντρωση δεν πρέπει να προκαλεί ενδείξεις τοξικότητας. Όπου υπάρχει μια ευχερής εκτίμηση ανθρώπινης έκθεσης, τότε η χαμηλότερη συγκέντρωση πρέπει να την υπερβαίνει. Στην πιο ιδανική περίπτωση, η ενδιάμεση συγκέντρωση πρέπει να προκαλεί ελάχιστα, αλλά φανερά, τοξικά συμπτώματα. Αν χρησιμοποιούνται περισσότερες από μία ενδιάμεσες συγκεντρώσεις, τότε πρέπει να κατανέμονται έτσι που να παράγεται μια διαβάθμιση των τοξικών επιδράσεων. Στα κατώτερα και ενδιάμεσα επίπεδα συγκεντρώσεων, όπως και στους μάρτυρες, η συχνότητα των θανάτων πρέπει να είναι χαμηλή, ώστε να επιτρέπεται μια σημαντική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων.  1.6.2.4. Χρόνος έκθεσης  Η διάρκεια της έκθεσης ανά ημέρα πρέπει να είναι 6 ώρες, αλλά και άλλες χρονικές περίοδοι μπορεί να απαιτηθούν σε ειδικές περιπτώσεις.  1.6.2.5. Συσκευές  Τα ζώα πρέπει να δοκιμάζονται μέσα σε μια αναπνευστική συσκευή σχεδιασμένη για να διατηρεί μια δυναμική ροή αέρα, τουλάχιστον 12 αλλαγών του αέρα ανά ώρα, ώστε να εξασφαλίζεται έτσι μια επάρκεια σε οξυγόνο και μια ομαλά κατανεμημένη ατμόσφαιρα έκθεσης. Όπου χρησιμοποιείται θάλαμος, το σχήμα του πρέπει να μειώνει στο ελάχιστο το συνωστισμό των ζώων και να αυξάνει στο μεγαλύτερο βαθμό την αναπνευστική τους έκθεση στην εξεταζόμενη ουσία. Σαν γενικός κανόνας για να εξασφαλιστεί σταθερότητα στην ατμόσφαιρα ενός θαλάμου, ο ολικός «όγκος» των πειραματοζώων δεν πρέπει να υπερβαίνει το 5% του όγκου του δοκιμαστικού θαλάμου. Μπορεί να χρησιμοποείται στοματορρινικός ή κεφαλικός, ή ολόκληρου του σώματος ατομικός θάλαμος έκθεσης. Οι δύο πρώτοι θα μειώσουν στο ελάχιστο τη λήψη της ουσίας από άλλες οδούς.  1.6.2.6. Περίοδος παρατηρήσεων  Τα πειραματόζωα πρέπει να εξετάζονται καθημερινά για συμπτώματα τοξικότητας σ' όλη τη διάρκεια της δοκιμής, όπως και κατά την περίοδο της θεραπείας. Ο χρόνος θανάτου και ο χρόνος εμφάνισης και εξαφάνισης των τοξικών συμπτωμάτων πρέπει να καταχωρούνται.  1.6.3. Διαδικασία  Τα ζώα εκτίθενται στην ελεγχόμενη ουσία καθημερινά 5 έως 7 ημέρες την εβδομάδα, για μια περίοδο 28 ημερών. Τα ζώα κάθε δορυφορικής ομάδας, προγραμματισμένα για συνεχείς παρατηρήσεις, θα κρατηθούν για 14 επιπλέον ημέρες χωρίς χορήγηση της ουσίας, για να διαπιστωθεί η θεραπεία ή η εμμονή των τοξικών συμπτωμάτων. Η θερμοκρασία στην οποία πρέπει να πραγματοποιείται η δοκιμασία, πρέπει να διατηρείται στους 22  C ± 3  C.  Θεωρητικά, η σχετική υγρασία θα πρέπει να διατηρείται μεταξύ 30%και 70%, σε ορισμένες όμως περιπτώσεις (π.χ. δοκιμές ορισμένων αεροζόλ) αυτό μπορεί να μην είναι πρακτικά δυνατό. Η διατήρηση ελαφράς αρνητικής πίεσης μέσα στο θάλαμο (≤ 5 mm νερού) εμποδίζει τη διαφυγή της εξεταζόμενης ουσίας στον περιβάλλοντα χώρο. Κατά τη διάρκεια της έκθεσης, δεν θα πρέπει να χορηγούνται τροφή και νερό.  Πρέπει να χρησιμοποιείται ένα δυναμικό αναπνευστικό σύστημα εφοδιασμένο με ένα κατάλληλο σύστημα μέτρησης της συγκέντρωσης. Για να διαπιστωθεί η κατάλληλη συγκέντρωση έκθεσης, συνιστάται μια προκαταρκτική δοκιμασία. Η ροή του αέρα πρέπει να προσαρμόζεται για να εξασφαλίζεται η ομοιογένεια των συνθηκών στο θάλαμο έκθεσης. Το σύστημα πρέπει να εξασφαλίζει την όσο το δυνατό γρηγορότερη αποκατάσταση σταθερών συνθηκών έκθεσης.  Θα πρέπει να γίνονται μετρήσεις ή παρακολούθηση:  (α) της ταχύτητας ροής του αέρα (συνεχώς).  (β) της πραγματικής συγκέντρωσης της εξεταζόμενης ουσίας στην αναπνευστική ζώνη. Κατά τη διάρκεια της ημερήσιας έκθεσης, η συγκέντρωση δεν θα πρέπει να κυμαίνεται περισσότερο του ± 15% εκατέρωθεν της μέσης τιμής. Εντούτοις, στην περίπτωση ορισμένων αερολυμάτων, το επίπεδο αυτό ελέγχου μπορεί να μην είναι εφικτό οπότε μπορεί να γίνει αποδεκτή μία ευρύτερη ανοχή. Καθ' όλη τη μελέτη, οι συγκεντρώσεις μέρα προς μέρα θα πρέπει να κρατιούνται όσο το δυνατόν πιο σταθερές. Στα αερολύματα, θα πρέπει να εκτελείται ανά ομάδα κάθε εβδομάδα, μία τουλάχιστον ανάλυση μεγέθους σωματιδίων.  (γ) της θερμοκρασίας και της υγρασίας, συνεχώς αν είναι δυνατόν.  Κατά τη διάρκεια, και στη συνέχεια της έκθεσης, γίνονται συστηματικές παρατηρήσεις. Πρέπει να διατηρείται ατομικό αρχείο για κάθε ζώο. Όλα τα ζώα πρέπει να εξετάζονται καθημερινά και τα συμπτώματα τοξικότητας πρέπει να καταγράφονται, περιλαμβανομένου του χρόνου εμφάνισης της σοβαρότητας και της διάρκειάς τους. Οι παρατηρήσεις πρέπει να περιλαμβάνουν αλλοιώσεις στο δέρμα και στο τρίχωμα, αλλοιώσεις στα μάτια, στους βλεννογόνους, αλλοιώσεις στο αναπνευστικό, κυκλοφοριακό, στο αυτόνομο και κεντρικό νευρικό σύστημα, στη σωματοκινητική δραστηριότητα και στον τρόπο συμπεριφοράς. Τα ζώα πρέπει να ζυγίζονται εβδομαδιαία. Επίσης, συνιστάται να γίνονται μετρήσεις της κατανάλωσης της τροφής μια φορά την εβδομάδα. Οι τακτικές παρατηρήσεις των ζώων είναι απαραίτητες για να εξασφαλίζεται ότι τα ζώα δεν χάνονται από τη μελέτη για λόγους όπως ο καννιβαλισμός, η αυτόλυση των ιστών και η κακή τοποθέτηση. Στο τέλος της περιόδου μελέτης, όλα τα επιζώντα στις μη δορυφορικές ομάδες νεκροτομούνται. Τα ετοιμοθάνατα ζώα και τα ζώα που παρουσιάζουν συμπτώματα έντονου πόνου και δυσφορίας θα πρέπει να απομακρύνονται μόλις αυτό γίνεται αντιληπτό, να θανατώνονται ανώδυνα και να νεκροτομούνται.  Οι ακόλουθες εξετάσεις πρέπει να γίνονται στο τέλος της δοκιμασίας σε όλα τα ζώα, των μαρτύρων συμπεριλαμβανομένων:(i) αιματολογικές, που να περιλαμβάνουν, τουλάχιστον, το δείκτη αιματοκρίτη, συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης, μέτρηση ερυθροκυττάρων, μέτρηση λευκοκυττάρων και λευκοκυτταρικό τύπο και μια μέτρηση της πηκτικότητας του αίματος G  (ii) κλινικοί βιοχημικοί προσδιορισμοί στο αίμα, περιλαμβανομένης, τουλάχιστον, μιας παραμέτρου της λειτουργίας του ήπατος και των νεφρών: αλανίνο αμινοτρανσφεράση του ορού (αρχικά γνωστή σαν γλουταμίνη-πυροσταφυλική trans-αμινάση του ορού), ασπαρτική αμινοτρανσφεράση του ορού (αρχικά γνωστή σαν γλουταμινική οξαλοοξική trans-αμινάση του ορού), άζωτο ουρίας, λεύκωμα, κρεατινίνη αίματος, ολική χολερυθρίνη και ολικές πρωτεϊνες ορού.  λλοι προσδιορισμοί, οι οποίοι μπορεί να είναι απαραίτητοι για μια ικανοποιητική τοξικολογική αξιολόγηση, περιλαμβάνουν: ασβέστιο, φωσφόρο, χλωριούχα, νάτριο, κάλιο, δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη, ανάλυση λιπιδίων, ορμόνες, σχέση οξέων/βάσεων, μεθαιμοσφαιρίνη και δραστικότητα χοληνεστεράσης.  Πρόσθετες κλινικές βιοχημικές δοκιμές μπορεί να χρησιμοποιηθούν όταν υπάρχει ανάγκη επέκτασης της έρευνας των παρατηρηθεισών επιδράσεων.  1.6.3.1 Νεκροψία  Όλα τα ζώα της μελέτης θα πρέπει να υποβάλλονται σε πλήρη νεκροψία. Τουλάχιστον το σηκώτι, τα νεφρά, τα επινεφρίδια, οι πνεύμονες και οι όρχεις θα πρέπει να ζυγίζονται νωπά όσο το δυνατόν γρηγορότερα μετά από την ανατομή, για να αποφεύγεται η ξήρανση. Τα όργανα και οι ιστοί (το αναπνευστικό σύστημα, το συκώτι, τα νεφρά, η σπλήνα, οι όρχεις, τα επινεφρίδια, η καρδιά και κάθε όργανο που εμφανίζει μακροσκοπικές αλλοιώσεις ή αλλαγές στο μέγεθος) θα πρέπει να διατηρούνται σε κατάλληλο μέσον για πιθανή μελλοντική ιστοπαθολογική εξέταση. Οι πνεύμονες θα πρέπει να απομακρύνονται άθικτοι, να ζυγίζονται και να υποβάλλονται σε κατεργασία με κατάλληλο στερεωτικό για να εξασφαλίζεται η συντήρηση της δομής των πνευμόνων.  1.6.3.2. Ιστοπαθολογική εξέταση  Στις ομάδες των υψηλών συγκεντρώσεων και στις ομάδες των μαρτύρων, πρέπει να γίνει ιστολογική εξέταση σε συντηρημένα όργανα και ιστούς. Όργανα και ιστοί που παρουσιάζουν ανωμαλίες στην υψηλότερη δόση και που μπορούν να αποδοθούν στην ελεγχόμενη ουσία, πρέπει να εξετάζονται σε όλες τις ομάδες των χαμηλότερων δόσεων. Τα ζώα κάθ δορυφορικής ομάδας πρέπει να εξετάζονται ιστολογικά, με ιδιαίτερη έμφαση σ'εκείνα τα όργανα και ιστούς που εμφάνισαν επιδράσεις στα ζώα των άλλων ομάδων.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα, στον οποίο να φαίνεται, για κάθε ομάδα δοκιμής, ο αριθμός των ζώων στην αρχή της δοκιμής και ο αριθμός των ζώων που εμφανίζουν κάθε τύπο αλλοίωσης.  Όλα τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν πρέπει να αξιολογηθούν με μια κατάλληλη στατιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάθε αναγνωρισμένη στατιστική μέθοδος.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - είδος, φυλή, πηγή, συνθήκες περιβάλλοντος, διατροφή κλπ. G  - πειραματικές συνθήκες:  περιγραφή της συσκευής έκθεσης συμπεριλαμβανομένου του σχεδίου, του τύπου, των διαστάσεων, της πηγής του αέρα, του συστήματος παραγωγής αερολυμάτων, της μεθόδου κλιματισμού του αέρα, της κατεργασίας του εξερχόμενου αέρα και της μεθόδου στέγασης των ζώων στο δοκιμαστικό θάλαμο, που χρησιμοποιείται. Θα πρέπει να περιγράφεται η διάταξη μέτρησης της θερμοκρασίας, της υγρασίας και, όπου χρειάζεται, της σταθερότητας των συγκεντρώσεων ή κατανομής μεγέθους σωματιδίων των αερολυμάτων.  Δεδομένα έκθεσης:  Αυτά θα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα και να παρουσιάζονται με μέσες τιμές και μέτρηση μεταβλητότητας (π.χ. τυπική απόκλιση) και θα περιλαμβάνουν, αν είναι δυνατόν:  α) ταχύτητες αέρα από τη συσκευή αναπνευστικής έκθεσης G  β) θερμοκρασία και υγρασία του αέρα G  γ) ονομαστικές συγκεντρώσεις (ολικό ποσό της εξεταζόμενης ουσίας που τροφοδοτεί τη συσκευή, διαιρεμένο με τον όγκο του αέρα) Gδ) φύση φορέα, εάν χρησιμοποιείται G  ε) πραγματικές συγκεντρώσεις στην πειραματική αναπνευστική ζώνη G  στ) τη μέση αεροδυναμική διάμετρο μάζας (ΜΑΔΜ) και τη γεωμετρική τυπική απόκλιση (ΓΤΑ) G  - δεδομένα τοξικών αντιδράσεων ανά φύλο και συγκέντρωση G  - χρόνο θανάτου κατά τη διάρκεια της δοκιμής ή, εάν τα ζώα επέζησαν, στο τέλος της δοκιμής G  - περιγραφή τοξικών ή άλλων επιδράσεων, δόσεις χωρίς επίδραση G  - το χρόνο παρατήρησης κάθε ανώμαλου συμπτώματος και την επακόλουθη πορεία του G  - δεδομένα βάρους τροφής και σώματος G - χρησιμοποιηθείσες αιματολογικές εξετάσεις και αποτελέσματα G  - κλινικές βιοχημικές εξετάσεις που χρησιμοποιήθηκαν και αποτελέσματα G  - αποτελέσματα νεκροψίας G  - μια λεπτομερή περιγραφή όλων των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων που βρέθηκαν G  - μια στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, όταν αυτό είναι δυνατό G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  Β.9. ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΗΣ (28 ΗΜΕΡΕΣ) ΔΟΣΗΣ (ΔΕΡΜΑΤΙΚΗ) 1. MEΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή, Μέρος Β (Β).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Oυδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η εξεταζόμενη ουσία εφαρμόζεται καθημερινά στο δέρμα σε διαβαθμισμένες δόσεις, σε διάφορες ομάδες πειραματοζώων, μία δόση ανά ομάδα, για μια χρονική περίοδο 28 ημερών. Κατά τη διάρκεια της περιόδου εφαρμογής, τα ζώα εξετάζονται καθημερινά για τη διαπίστωση τοξικών συμπτωμάτων. Τα ζώα που πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της δοκιμής, όπως και αυτά που επιζούν στη λήξη της, νεκροτομούνται. 1.5. ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασίες  Τα ζώα κρατούνται κάτω από τις πειραματικές συνθήκες εγκλωβισμού και διατροφής για 5 τουλάχιστον ημέρες πριν από τη δοκιμασία. Πριν από τη δοκιμή υγιή, νεαρά ζώα ξεχωρίζονται τυχαία και κατανέμονται στις πειραματικές ομάδες και τις ομάδες μαρτύρων. Λίγο πριν αρχίσει η δοκιμή το τρίχωμα ψαλιδίζεται από την περιοχή της ράχης του κορμού των πειραματοζώων. Μπορεί, επίσης, να χρησιμοποιηθεί το ξύρισμα για την απομάκρυνση του τριχώματος, αλλά αυτό πρέπει να γίνεται 24 ώρες περίπου πριν από τη δοκιμή. Επανάληψη του ψαλιδίσματος ή του ξυρίσματος χρειάζεται συνήθως κάθε εβδομάδα. Το ψαλίδισμα ή ξύρισμα πρέπει να γίνεται με προσοχή, ώστε να αποφεύγεται η απόξεση του δέρματος. Πρέπει να καθαρίζεται μια περιοχή για την εφαρμογή της εξεταζόμενης ουσίας, η οποία δεν πρέπει να είναι μικρότερη απο το 10% της επιφάνειας του σώματος. Όταν αποφασίζονται οι διαστάσεις της περιοχής που πρέπει να καθαριστεί και να καλυφθεί με την εξεταζόμενη ουσία, πρέπει να λαμβάνεται υπόψη το βάρος του ζώου. Όταν ελέγχονται στερεά, τα οποία μπορούν να κονιοποιηθούν, πρέπει να υγραίνονται αρκετά με νερό ή αν χρειαστεί με κατάλληλο φορέα, για να εξασφαλιστεί η καλή επαφή με το δέρμα. Οι υγρές ουσίες χρησιμοποιούνται συνήθως αδιάλυτες. Η εφαρμογή γίνεται καθημερινά 5 έως 7 ημέρες την εβδομάδα.  1.6.2. Πειραματικές συνθήκες  1.6.2.1. Πειραματόζωα  Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ενήλικας επίμυς, κουνέλι ή ινδικό χοιρίδιο. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα είδη, η χρήση τους όμως απαιτεί αιτιολόγηση.  Στην αρχή της μελέτης, το εύρος της διαφοράς βαρών των χρησιμοποιούμενων ζώων δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το ± 20% της ενδεδειγμένης μέσης τιμής.  1.6.2.2. Αριθμός και φύλο  Σε κάθε επίπεδο δόσεων πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον 10 ζώα (5 θηλυκά και 5 αρσενικά) με υγιές δέρμα. Τα θηλυκά πρέπει να είναι άτοκα και να μη βρίσκονται σε κατάσταση εγκυμοσύνης. Εάν έχουν προγραμματιστεί ενδιάμεσες θανατώσεις ζώων, τότε ο αριθμός των ζώων ανά ομάδα πρέπει να αυξηθεί με τον αριθμό των ζώων που είναι προγραμματισμένο να θανατωθούν πριν από τη συμπλήρωση της μελέτης. Επιπλέον, μια δορυφορική ομάδα από 10 ζώα (5 ζώα ανά φύλο) μπορεί να εκτεθεί στην υψηλότερη δόση για 28 ημέρες και να εξετασθεί για επαναφορά, εμμονή ή αργοπορημένη εμφάνιση των τοξικών επιδράσεων για ένα χρονικό διάστημα 14 ημερών μετά το πέρας της δηλητηρίασης. Χρησιμοποιείται επίσης και μία δορυφορική ομάδα από 10 ζώα μάρτυρες (πέντε ζώα κατά φύλο).  1.6.2.3. Eπίπεδα δόσεων  Απαιτούνται τουλάχιστον τρία επίπεδα δόσεων και ένας μάρτυρας ή ένας μάρτυρας του φορέα, αν χρησιμοποιείται φορέας. Η περίοδος έκθεσης πρέπει να είναι τουλάχιστον 6 ώρες την ημέρα. Η εφαρμογή της ελεγχόμενης ουσίας πρέπει να γίνεται την ίδια ώρα κάθε μέρα και να προσαρμόζεται κατά διαστήματα (μια ή δύο φορές την εβδομάδα), έτσι ώστε να διατηρείται ένα σταθερό επίπεδο δόσεων σε σχέση με το βάρος του σώματος των ζώων. Τα ζώα στην ομάδα του μάρτυρα πρέπει να υπόκεινται στην ίδια μεταχείριση με τα πειραματόζωα, εξαιρουμένης της εφαρμογής της εξεταζόμενης ουσίας. Όταν χρησιμοποιείται φορέας για διευκόλυνση της χορήγησης της δόσης, η ομάδα του μάρτυρα πρέπει να παίρνει τη δόση κατά τον ίδιο τρόπο με την ομάδα των πειραματοζώων και η ποσότητα της δόσης να είναι ίδια με την υψηλότερη δόση που παίρνουν τα πειραματόζωα. Η υψηλότερη δόση θα πρέπει να προκαλεί τοξικές επιδράσεις, αλλά λίγους ή καθόλου θανάτους. Η χαμηλότερη δόση δεν θα πρέπει να προκαλεί συμπτώματα τοξικότητας. Όταν υπάρχει μια ευχερής εκτίμηση της ανθρώπινης έκθεσης, η χαμηλότερη δόση θα πρέπει να την υπερβαίνει. Η ενδιάμεση δόση, στην πιο ιδανική περίπτωση, θα πρέπει να προκαλεί ελάχιστα ευδιάκριτα τοξικά συμπτώματα. Εάν χρησιμοποιούνται περισσότερες από μία ενδιάμεσες δόσεις, τότε αυτές πρέπει να απέχουν έτσι μεταξύ τους ώστε να προκαλούν διαβαθμισμένες τοξικές επιδράσεις. Στις χαμηλές και στις ενδιάμεσες ομάδες, όπως και στους μάρτυρες, η συχνότητα των θανάτων θα πρέπει να είναι χαμηλή, ώστε να επιτρέπει μια χρήσιμη αξιολόγηση των αποτελεσμάτων.  Εάν η εφαρμογή της εξεταζόμενης ουσίας προκαλεί σοβαρό δερματικό ερεθισμό, οι συγκεντρώσεις θα πρέπει να ελαττωθούν και αυτό μπορεί να ελαττώσει ή να εξαφανίσει τις άλλες τοξικές επιδράσεις στην υφηλότερη δόση. Επιπλέον, αν το δέρμα έχει υποστεί σοβαρή βλάβη, είναι δυνατόν να χρειαστεί, να ακυρωθεί η μελέτη και να επιχειρηθεί ένα νέο πείραμα με χαμηλότερες συγκεντρώσεις.  1.6.2.4. Οριακή δοκιμή  Αν μια προκαταρκτική μελέτη με μια δόση 1 000 mg/kg ή και μεγαλύτερη, σχετική με το πιθανό όριο έκθεσης του ανθρώπινου πληθυσμού, εάν είναι γνωστό, δεν προκαλεί καμμία τοξική επίδραση, ο περαιτέρω πειραματισμός μπορεί να μη θεωρηθεί αναγκαίος.  1.6.2.5. Περίοδος παρατήρησης  Τα πειραματόζωα πρέπει να παρατηρούνται καθημερινά για φαινόμενα τοξικότητας. Ο χρόνος θανάτου και ο χρόνος κατά τον οποίο εμφανίζονται και εξαφανίζονται τα τοξικά συμπτώματα πρέπει να καταγράφονται.  1.6.3. Διαδικασία  Τα ζώα πρέπει να εγκλωβίζονται μεμονωμένα. Η επέμβαση στα ζώα με την εξεταζόμενη ουσία γίνεται, στην πιο ιδανική περίπτωση, 7 ημέρες την εβδομάδα, για μια περίοδο 28 ημερών. Τα ζώα κάθε δορυφορικής ομάδας που προγραμματίστηκαν για συνεχείς παρατηρήσεις πρέπει να διατηρηθούν για 14 επιπλέον ημέρες χωρίς επέμβαση, για να εξακριβωθεί η ανάρρωση από τις τοξικές επιδράσεις ή η εμμονή τους. Ο χρόνος έκθεσης πρέπει να είναι τουλάχιστον 6 ώρες την ημέρα.  H εξεταζόμενη ουσία πρέπει να εφαρμόζεται ομοιόμορφα σε μια έκταση, η οποία είναι περίπου το 10% της όλης επιφάνειας του σώματος. Με πολύ τοξικές ουσίες η καλυπτόμενη επιφάνεια μπορεί να είναι μικρότερη, αλλά όσο γίνεται περισσότερη από την επιφάνεια πρέπει να καλύπτεται με μία λεπτή και ομοιόμορφη στοιβάδα ουσίας.  Η εξεταζόμενη ουσία, κρατιέται σ' επαφή με το δέρμα κατά τη διάρκεια της έκθεσης, με τη βοήθεια επίδεσμου από πορώδη γάζα και μιας μη ερεθιστικής ταινίας. Η δοκιμαζόμενη περιοχή πρέπει, επιπλέον, να καλύπτεται κατάλληλα, ώστε να συγκρατείται ο επίδεσμος και η εξεταζόμενη ουσία και έτσι να εξασφαλίζεται η μη κατάποσή της από τα πειραματόζωα. Για να αποφευχθεί η κατάποση της εξεταζόμενης ουσίας, μπορεί να χρησιμοποιούνται επίσης συσκευές περιορισμού των ζώων, αλλά δεν συνιστάται η μέθοδος της απόλυτης ακινησίας. Ως εναλλακτική λύση μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα «προστατευτικό κολλάρο».  Η ουσία που μένει σαν υπόλειμμα, στο τέλος της περιόδου έκθεσης, θα πρέπει να απομακρύνεται όταν αυτό είναι δυνατό με νερό ή άλλη κατάλληλη μέθοδο καθαρισμού του δέρματος.  Όλα τα πειραματόζωα πρέπει να εξετάζονται καθημερινά και να καταγράφονται τα τοξικά συμπτώματα, ο χρόνος έναρξής τους, ο βαθμός και η διάρκειά τους. Οι παρατηρήσεις πρέπει να περιλαμβάνουν αλλοιώσεις στο δέρμα και στο τρίχωμα, στα μάτια και στους βλεννογόνους, όπως επίσης στο αναπνευστικό, κυκλοφοριακό, αυτόνομο και κεντρικό νευρικό σύστημα, στη σωματοκινητική δραστηριότητα και στον τρόπο συμπεριφοράς. Πρέπει, επίσης, να γίνονται μετρήσεις της κατανάλωσης τροφής και του βάρους των ζώων μια φορά την εβδομάδα. Η κανονική παρατήρηση των ζώων είναι απαραίτητη για να εξασφαλίζεται ότι δεν υπάρχει απώλεια πειραματοζώων εξαιτίας καννιβαλισμού, αυτόλυσης των ιστών ή κακής στέγασης. Στο τέλος της πειραματικής περιόδου, όλα τα επιζώντα ζώα στις μη δορυφορικές ομάδες νεκροτομούνται. Τα ετοιμοθάνατα ζώα και τα ζώα που παρουσιάζουν συμπτώματα έντονου πόνου και δυσφορίας θα πρέπει να απομακρύνονται, μόλις αυτό γίνεται αντιληπτό, να θανατώνονται ανώδυνα και να νεκροτομούνται.  Οι παρακάτω εξετάσεις θα πρέπει να γίνουν στο τέλος της δοκιμής σε όλα τα ζώα, των μαρτύρων συμπεριλαμβανομένων:  1) αιματολογικές που να περιλαμβάνουν τουλάχιστον μετρήσεις αιματοκρίτη, αιμοσφαιρίνης, μετρήσεις ερυθρών αιμοσφαιρίων, λευκών και λευκοκυτταρικού τύπου, και μια μέτρηση της πηκτικότητας του αίματος G  2) κλινικές βιοχημικές μετρήσεις του αίματος που περιλαμβάνουν τουλάχιστον μια παράμετρο της λειτουργίας του ήπατος και των νεφρών: αλανίνο αμινοτρανσφεράση του ορού (αρχικά γνωστή σαν γλουταμίνη-πυροσταφυλική trans-αμινάση του ορού), ασπαρτική αμινοτρανσφεράση του ορού (αρχικά γνωστή σαν γλουταμινική οξαλοοξική trans-αμινάση του ορού), άζωτο ουρίας, αλβουμίνη, κρεατινίνη αίματος, ολική χολερυθρίνη και ολικές πρωτεΐνες του ορού.  Άλλοι προσδιορισμοί, οι οποίοι μπορεί να είναι αναγκαίοι για την τοξικολογική αξιολόγηση, περιλαμβάνουν: ασβέστιο, φωσφόρο, χλώριο, νάτριο, κάλιο, δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη, ανάλυση λιπιδίων, ορμονών, ισορροπία οξέων/βάσεων, μεθαιμοσφαιρίνη και δραστικότητα χολινεστεράσης.  Μπορεί, επίσης, να χρησιμοποιηθούν και άλλοι βιοχημικοί προσδιορισμοί για την επέκταση της έρευνας των παρατηρηθεισών επιδράσεων.  1.6.4. Μακροσκοπική νεκροψία  Όλα τα ζώα της μελέτης πρέπει να υποβληθούν σε μία πλήρη μακροσκοπική νεκροψία. Το συκώτι, οι νεφροί, τα επινεφρίδια και οι όρχεις πρέπει να ζυγιστούν νωπά, όσο το δυνατό γρηγορότερα μετά την ανατομή για την αποφυγή αποξήρανσης. Τα όργανα και οι ιστοί, δηλ. φυσιολογικό και εκτεθειμένο δέρμα, συκώτι, νεφρά, σπλήνα, όρχεις, επινεφρίδια, καρδιά και όργανα στόχοι (δηλαδή τα όργανα εκείνα που εμφανίζουν μακροσκοπικές αλλοιώσεις ή μεταβολές μεγέθους) θα πρέπει να διατηρούνται σ'ένα κατάλληλο μέσο για την πιθανή, μελλοντική ιστοπαθολογική εξέταση.  1.6.5. Ιστοπαθολογική εξέταση  Η ιστοπαθολογική εξέταση πρέπει να γίνεται στα διατηρηθέντα όργανα των ζώων της ομάδας της υψηλότερης δόσης και των μαρτύρων. Τα όργανα και οι ιστοί που παρουσιάζουν ανωμαλίες, που μπορεί να αποδοθούν στην υψηλότερη δόση της εξεταζόμενης ουσίας, πρέπει να εξετάζονται και σ' όλες τις ομάδες χαμηλοτέρων δόσεων. Τα ζώα της δορυφορικής ομάδας πρέπει να εξετάζονται ιστολογικά με ιδιαίτερη έμφαση για κείνα τα όργανα που διαπιστώθηκε ότι δείχνουν ανωμαλίες στις άλλες ομάδες.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα πρέπει να συνοψίζονται σε πίνακα, στον οποίο να φαίνεται, για κάθε πειραματική ομάδα, ο αριθμός των ζώων που εμφανίζουν κάθε τύπο αλλοίωσης.  Όλα τα παρατηρούμενα αποτελέσματα πρέπει να αξιολογούνται με μια κατάλληλη στατιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάθε αναγνωρισμένη στατιστική μέθοδος.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - δεδομένα ζώων (είδος, φυλή, πηγή, συνθήκες περιβάλλοντος, διατροφή, κλπ.) G  - πειραματικές συνθήκες (συμπεριλαμβανομένου και του τύπου του επιδέσμου: προσροφητικού ή μη προσροφητικού) G  - επίπεδα δόσεων (συμπεριλαμβανομένου του φορέα, αν χρησιμοποιήθηκε) και συγκεντρώσεις G  - μη τοξικά επίπεδα, όταν είναι δυνατόν G  - δεδομένα τοξικών αποκρίσεων ανά δόση και φύλο G  - χρόνο θανάτου των ζώων κατά τη διάρκεια της μελέτης ή αν τα ζώα επιζούν έως το τέλος G  - τοξικές ή άλλες επιδράσεις G  - το χρόνο που παρατηρήθηκε κάθε ανωμαλία και τη διαδοχική πορεία τους G  - δεδομένα βάρους σώματος και κατανάλωσης τροφής G  - αιματολογικές εξετάσεις που χρησιμοποιήθηκαν και αποτελέσματα G  - κλινικές βιοχημικές εξετάσεις που χρησιμοποιήθηκαν και αποτελέσματα G  - ευρήματα νεκροψίας G  - λεπτομερή περιγραφή όλων των ιστοπαθολογικών ευρημάτων G  - στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, όταν αυτό είναι δυνατό G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  Β.10. ΜΕΤΑΛΛΑΞΟΓΕΝΕΣΗ (ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ «IN VITRO») 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΣ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Γ).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η in vitro κυτταρογενετική δοκιμή είναι μια βραχείας διάρκειας δοκιμή μεταλλαξογένεσης για τη διαπίστωση δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών. Χρησιμοποιούνται καλλιέργειες καθορισμένων κυτταρικών σειρών όπως και πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων. Μετά από έκθεση στην εξεταζόμενη ουσία με και χωρίς κατάλληλο σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης, οι καλλιέργειες των κυττάρων υποβάλλονται σε κατεργασία με αναστολείς ατράκτου όπως η κολχικίνη με σκοπό τη συσσώρευση κυττάρων στο στάδιο της μετάφασης κατά την μίτωση (c-μετάφαση). Τα κύτταρα συλλέγονται σε κατάλληλα χρονικά διαστήματα και ετοιμάζονται χρωμοσωμικά παρασκευάσματα. Στη συνέχεια γίνεται η χρώση των παρασκευασμάτων και αναλύονται τα κύτταρα, στο στάδιο της μετάφασης για τη διαπίστωση χρωμοσωμικών ανωμαλιών.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασίες  1.6.1.1. Κύτταρα  Χρησιμοποιούνται καθορισμένες κυτταρικές σειρές ή καλλιέργειες πρωτογενών κυττάρων, π.χ. κύτταρα κινέζικων χάμστερ και ανθρώπινα λεμφοκύτταρα. Οι εξεταζόμενες ουσίες παρασκευάζονται σε μέσον καλλιέργειας ή διαλύονται σε κατάλληλους φορείς πριν από την κατεργασία των κυττάρων.  1.6.1.2. Σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησηςΤα κύτταρα θα πρέπει να εκτίθενται στην εξεταζόμενη ουσία με την παρουσία και την απουσία κατάλληλου συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης. Το σύστημα που χρησιμοποιείται συνηθέστερα είναι ένα μετα-μιτοχονδριακό κλάσμα συνοδευόμενο από ένα συμπαράγοντα το οποίο παρασκευάζεται από το συκώτι τρωκτικών που έχει υποβληθεί σε κατεργασία με παράγοντες διέγερσης ενζύμων.  1.6.2. Πειραματικές συνθήκες  Αριθμός καλλιεργειών  Χρησιμοποιούνται τουλάχιστον δύο καλλιέργειες για κάθε πειραματικό σημείο.  Χρήση αρνητικού και θετικού μάρτυρα:  Σαν αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιούνται ο διαλύτης (όταν ο διαλύτης δεν είναι το θρεπτικό μέσον ή νερό), μείγμα ενεργοποίησης ηπατικών ενζύμων, μείγμα ενεργοποίησης ηπατικών ενζύμων και διαλύτης, και μη υποβληθέντες στη δοκιμασία μάρτυρες.  Σε κάθε πείραμα περιλαμβάνεται και ένας θετικός μάρτυρας G όταν για την ενεργοποίηση της εξεταζόμενης ουσίας χρησιμοποιείται μείγμα ενεργοποίησης ηπατικών ενζύμων, σαν θετικός μάρτυρας πρέπει να χρησιμοποιείται μία ένωση που είναι γνωστό ότι απαιτεί μεταβολική ενεργοποίηση.  Επίπεδο δόσεων:  Χρησιμοποιούνται τρεις τουλάχιστον δόσεις εξεταζόμενης ουσίας από μια λογαριθμική κλίμακα δόσεων. Η υψηλότερη δόση θα πρέπει να αναστέλλει τη μιτωτική δράση κατά 50% περίπου ή να εμφανίζει κάποια άλλη ένδειξη κυτταροτοξικότητας. Εάν δεν είναι τοξική, η εξεταζόμενη ουσία θα πρέπει να υποβάλλεται σε δοκιμασία μέχρι το όριο διαλυτότητας ή μέχρι μία μέγιστη συγκέντρωση των 5 mg/ml.  Συνθήκες καλλιέργειας:  Χρησιμοποιούνται κατάλληλο θρεπτικό υλικό και επωαστικές συνθήκες (π.χ. θερμοκρασία, δοχεία καλλιέργειας, συγκεντρώσεις CO2 και υγρασία).  1.6.3. Διαδικασία  1.6.3.1. Παρασκευή καλλιεργειών  Καθορισμένες κυτταρικές σειρές: τα κύτταρα παράγονται από παρακαταθήκες καλλιεργειών (π.χ. με επεξεργασία με τρυφίνη ή με τίναγμα), τοποθετούνται σε δοχεία καλλιέργειας στην κατάλληλη πυκνότητα και επωάζονται στους 37  C.  Λεμφοκύτταρα ανθρώπου: ολόκληρο το αίμα, μετά την προσθήκη ηπαρίνης, προστίθεται στο θρεπτικό υλικό που περιέχει φυτοαιμογλουτινίνη, ορό εμβρύου βοός και αντιβιοτικά και επωάζεται στους 37  C.  1.6.3.2. Επέμβαση στις καλλιέργειες με την ελεγχόμενη ουσία  (i) Επέμβαση χωρίς προσθήκη μείγματος ενεργοποίησης των ηπατικών ενζύμων  Κάθε επέμβαση πρέπει να καλύπτει, αν είναι δυνατόν, τουλάχιστον την περίοδο ενός ολόκληρου κυτταρικού κύκλου και τα σχήματα στερέωσης πρέπει να εξασφαλίζουν την ανάλυση των πρώτων μεταεπεμβασιακών μιτώσεων κυττάρων που υπέστησαν επέμβαση σε διάφορα στάδια στον κύκλο.  Όταν η επέμβαση δεν καλύπτει το μήκος ενός ολόκληρου κυτταρικού κύκλου, εκλέγονται χρόνοι στερέωσης για τη λήψη κυττάρων που ευρίσκονται σε διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου κατά τη διάρκεια της επέμβασης δηλ.,G1, S και G2.  Η εξεταζόμενη ουσία προστίθεται σε καλλιέργειες καθορισμένων κυτταρικών σειρών όταν αυτές ευρίσκονται στο εκθετικό στάδιο ανάπτυξης. Η επέμβαση στις καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων γίνεται ενώ είναι σε ημισύγχρονη κατάσταση.  (ii) Επέμβαση με προσθήκη μείγματος ενεργοποίησης ηπατικών ενζύμων  Στην επέμβαση, η εξεταζόμενη ουσία σε συνδυασμό με το σύστημα ενεργοποίησης θα πρέπει να παραμένει όσο το δυνατόν περισσότερο χωρίς να ασκεί τοξική επίδραση στα κύτταρα. Εάν για λόγους τοξικότητας η επέμβαση αυτή δεν καλύπτει το μήκος ενός ολόκληρου κυτταρικού κύκλου, επιλέγονται χρόνοι στερέωσης για τη λήψη κυττάρων που είναι σε διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου κατά τη διάρκεια της επέμβασης, δηλ. G1, S και G2.  Συλλογή κυττάρων:  Πριν από τη συλλογή, οι κυτταρικές καλλιέργειες υφίστανται την επέμβαση ατρακτοειδούς αναστολέα για κατάλληλο χρονικό διάστημα. Κάθε καλλιέργεια συλλέγεται και υφίσταται ξεχωριστή επεξεργασία για την παρασκευή χρωμοσωμάτων.  Απαιτούνται τουλάχιστον δύο χρόνοι συλλογής. Συνιστάται ο ένας να αντιστοιχεί περίπου σ'ένα κυτταρικό κύκλο και ο άλλος αργότερα, προκειμένου να εξασφαλίζεται η κάλυψη όλων των σταδίων του κυτταρικού κύκλου και να λαμβάνεται υπόψη η υστέρηση του κυτταρικού κύκλου.  1.6.3.3. Χρωμοσωμική παρασκευή  Η παρασκευή χρωμοσωμάτων περιλαμβάνει την κατεργασία των κυττάρων με υποτονικό διάλυμα, στερέωση, επίθεση σε αντικειμενοφόρες πλάκες και χρώση.  Ανάλυση:  Για τη διαπίστωση χρωμοσωμικών ανωμαλιών, αναλύονται 100 τουλάχιστον καλοστρωμένες μεταφάσεις ανά καλλιέργεια. Πριν από την ανάλυση οι πλάκες κωδικοποιούνται. Στα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα αναλύονται μόνο μεταφάσεις που περιέχουν 46 κεντρομερίδια.  Σε καθορισμένες κυτταρικές σειρές, αναλύονται μόνο μεταφάσεις που περιέχουν ± 2 κεντρομερίδια του υπολογισθέντος αριθμού.Επιπλέον, κατά τη διάρκεια της δοκιμής για κάθε επίπεδο δόσης θα πρέπει να εκτιμάται ο μιτωτικός δείκτης ή κάποια άλλη κατάλληλη ένδειξη κυτταροτοξικότητας.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα παρουσιάζονται σε μορφή πίνακα. Οι ανωμαλίες χρωματιδιακού τύπου (κενά, ρήγματα, αμοιβαίες μετατοπίσεις), οι ανωμαλίες χρωμοσωμικού τύπου (π.χ. κενά, ρήγματα, τεμαχίδια, δακτύλιοι, δικεντρικοί, πολυκεντρικοί) και ο αριθμός των ανωμάλων μεταφάσεων (με ή χωρίς κενά) καταγράφονται ξεχωριστά για κάθε καλλιέργεια που υποβλήθηκε σε αγωγή ή ήταν μάρτυρας.  Τα δεδομένα αξιολογούνται με κατάλληλες στατιστικές μεθόδους.  Τα αποτελέσματα των δοκιμών πρέπει να συγκρίνονται με σύγχρονους αρνητικούς μάρτυρες.  Εκτελούνται δύο τουλάχιστον ανεξάρτητα πειράματα. Παρ'όλα αυτά, αν μπορεί να αιτιολογηθεί επιστημονικά, μπορεί να αρκεί και ένα μόνο πείραμα. Το δεύτερο πείραμα δεν χρειάζεται να εκτελείται με τον ίδιο τρόπο όπως το αρχικό πείραμα. Πράγματι, μπορεί να είναι προτιμότερο να τροποποιηθούν ορισμένες πειραματικές συνθήκες προκειμένου να ληφθούν πιο χρήσιμα δεδομένα.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - χρησιμοποιηθέντα κύτταρα G  - πειραματικές συνθήκες: σύνθεση θρεπτικού υλικού, συγκέντρωση CO2, θερμοκρασία επώασης, διάρκεια επώασης, επίπεδα δόσεων, χρόνο επέμβασης, διάρκεια επέμβασης, με παρεμποδιστή του μιτωτικού δικτύου καθώς και τη χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση αυτού, τύπο μείγματος ενεργοποίησης ηπατικών ενζύμων, θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες G  - αριθμό κυτταρικών καλλιεργειών G  - αριθμό μεταφάσεων που αναλύθηκαν (τα δεδομένα χωριστά για κάθε καλλιέργεια) G  - μιτωτικό δείκτη ή άλλη ένδειξη κυτταροτοξικότητας G  - τύπο και αριθμό ανωμαλιών χωριστά για κάθε καλλιέργεια που υπέστη επέμβαση και των μαρτύρων, τον αναμενόμενο αριθμό χρωμοσωμάτων στις καθορισμένες σειρές κυττάρων G  - στατιστική αξιολόγηση G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  Β.11. ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΜΥΕΛΟΥ ΟΣΤΩΝ ΘΗΛΑΣΤΙΚΩΝ «ΙΝ VIVO» ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Γ).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η in vivo κυτταρογενετική αυτή δοκιμή είναι βραχείας διάρκειας δοκιμή μεταλλαξογένεσης για τη διαπίστωση των ανωμαλιών στη δομή των χρωμοσωμάτων. Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες αξιολογούνται εν γένει στην πρώτη μετά την επέμβαση μίτωση. Με τα χημικά μεταλλαξογόνα η πλειονότητα των προκαλουμένων ανωμαλιών είναι τύπου χρωματίδης.  Η μέθοδος χρησιμοποιεί κύτταρα του μυελού των οστών θηλαστικών, τα οποία έχουν εκτεθεί στις ελεγχόμενες ουσίες δια μέσου της κατάλληλης οδού και θανατώνοται σε διαδοχικά χρονικά διαστήματα. Στα ζώα χορηγείται περαιτέρω, πριν από τη θανάτωση, αναστολέας ατράκτου όπως η κολχικίνη για να συσσωρευθούν τα κύτταρα που βρίσκονται σε ένα στάδιο μετάφασης της μίτωσης (c-μετάφαση). Ξηραμένα στον αέρα χρωμοσωμικά παρασκευάσματα χρωματίζονται και οι μεταφάσεις αναλύονται στο μικροσκόπιο για τη διαπίστωση χρωμοσωμικών ανωμαλιών.  1.5 ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασίες  Οι υπό δοκιμή ουσίες διαλύονται σε φυσιολογικό ορό. Αν είναι αδιάλυτες σ' αυτόν, διαλύονται ή αιωρούνται σε κατάλληλα έκδοχα.  Χρησιμοποιούνται πρόσφατες διαλύσεις της ελεγχόμενης ουσίας. Εάν χρησιμοποείται κάποιο έκδοχο για να διευκολυνθεί η χορήγηση, δεν πρέπει να παρεμποδίζει τη δράση της ελεγχόμενης ουσίας ή να προκαλεί τοξικές επιδράσεις.  1.6.2. Πειραματικές συνθήκες  1.6.2.1. Πειραματόζωα  Χρησιμοποιούνται διάφορα είδη τρωκτικών, όπως επίμυες, μύες και χάμστερς. Υγιή, νεαρά, ενήλικα ζώα λαμβάνονται τυχαία και κατανέμονται στις διάφορες ομάδες πειραματισμού και μαρτύρων.  1.6.2.2. Αριθμός και φύλο  Χρησιμοποιούνται τουλάχιστον πέντε θηλυκά και πέντε αρσενικά ζώα ανά ομάδα πειραματισμού και ανά ομάδα μαρτυρίας. Έτσι, αν στο πειραματικό διάγραμμα περιλαμβάνονται διάφοροι χρόνοι δοκιμασίας μετά την αγωγή, θα θανατώνονται 10 ζώα ανά χρονική περίοδο και ανά ομάδα.  Για την ομάδα θετικών μαρτύρων, αρκεί ένας μόνον χρόνος δειγματοληψίας.  1.6.2.3. Οδός χορήγησης  Οι ελεγχόμενες ουσίες πρέπει γενικά να χορηγούνται εφάπαξ. Επανειλημμένες χορηγήσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν αν αυτό δικαιολογείται απο τοξικολογικές πληροφορίες. Εντούτοις, ένα πρόγραμμα με επανειλημμένες χορηγήσεις μπορεί να εφαρμοστεί μόνο αν η ελεγχόμενη ουσία δεν προκαλεί κυτταροτοξικές επιδράσεις στο μυελό των οστών. Οι συνήθεις οδοί χορήγησης είναι η από το στόμα και η ενδοπεριτοναϊκή. Άλλες επίσης οδοί χορήγησης μπορεί να είναι κατάλληλες.  1.6.2.4. Χρησιμοποίηση θετικών και αρνητικών μαρτύρων  Μια ουσία, γνωστή ότι προκαλεί in vivo χρωμοσωμικές ανωμαλίες, χρησιμοποιείται σαν θετικός μάρτυρας ενώ και ένας αρνητικός με διαλύτη μάρτυρας περιλαμβάνεται, επίσης, στο σχεδιασμό κάθε πειράματος.  1.6.2.5. Επίπεδα δόσεων  Για τη βασική ομάδα, χρησιμοποιείται μία δόση εξεταζόμενης ουσίας, η οποία δόση είναι η μέγιστη ανεκτή ή η δόση που προκαλεί κάποια ένδειξη κυτταροτοξικότητας (π.χ. μερική αναστολή μίτωσης).  Στις «μη τοξικές» ενώσεις, η μέγιστη (οριακή) δόση που χρειάζεται να διερευνηθεί μετά τη μία μοναδική δόση χορήγησης είναι 2 000 mg/kg βάρους σώματος.  Αν χρησιμοποιείται σχέδιο επαναλαμβανόμενης δόσης, η οριακή δόση είναι 1 000 mg/kg βάρους σώματος ανά ημέρα.  Όπου για επιστημονικούς λόγους ενδείκνυται, μπορεί να χρησιμοποιηθούν επιπλέον επίπεδα δόσεων.  Εάν η δοκιμή χρησιμεύει σαν μέθοδος επαλήθευσης, δύο τουλάχιστον επιπλέον επίπεδα δόσεων πρέπει να χρησιμοποιηθούν.  1.6.3. Διαδικασία  Η δοκιμή μπορεί να εκτελείται με δύο τρόπους:  (i) Στα ζώα χορηγείται μία μόνο φορά η μέγιστη ανεκτή δόση της εξεταζόμενης ουσίας. Στην πρώτη περίπτωση, λαμβάνονται δείγματα 24 ώρες μετά τη χορήγηση. Εάν στο στάδιο αυτό τα αποτελέσματα είναι σαφώς θετικά, μπορεί να μη χρειάζεται περαιτέρω δειγματοληψία. Εντούτοις, αν τα αποτελέσματα είναι αρνητικά ή διφορούμενα, αφού η κινητική του κυτταρικού κύκλου μπορεί να επηρεάζεται από την εξεταζόμενη ουσία, διενεργούνται μία προγενέστερη και μία μεταγενέστερη δειγματοληψία που τοποθετούνται χρονικά στο διάστημα μεταξύ 6 και 48 ωρών.  Όταν χρησιμοποιούνται πρόσθετα επίπεδα δόσεων, τα δείγματα θα πρέπει να λαμβάνονται στα ιδιαιτέρως ευαίσθητα χρονικά διαστήματα ή, αν αυτά δεν είναι γνωστά, 24 ώρες μετά τη χορήγηση.  (ii) Εάν οι πληροφορίες που αφορούν το μεταβολισμό και την κινητική του φαρμάκου υποδεικνύουν ένα πρόγραμμα επανειλημμένων χορηγήσεων, τότε επανειλημμένες χορηγήσεις μπορεί να χρησιμοποιηθούν και πρέπει να λαμβάνονται δείγματα 6 και 24 ώρες μετά την τελευταία χορήγηση.  Παρασκευάσματα μυελού των οστών  Πριν από τη θανάτωση, χορηγείται στα ζώα ενδοπεριτοναϊκά κατάλληλη δόση του αναστολέα ατράκτου προκειμένου να ληφθεί επαρκής αριθμός κυττάρων στο στάδιο της c-μετάφασης. Ο μυελός λαμβάνεται και από τα δύο μηριαία οστά πρόσφατα θανατωθέντων ζώων ξεπλένοντας με ισοτονικό διάλυμα. Μετά από την κατεργασία με το υποτονικό διάλυμα τα κύτταρα στερεώνονται και κατόπιν στρώνονται σε πλακίδια. Αφού ξηρανθούν στον αέρα, τα παρασκευάσματα χρωματίζονται.  Ανάλυση:  Πριν από τη μικροσκοπική ανάλυση, τα αντικειμενοφόρα πλακίδια κωδικοποιούνται. Αναλύονται τουλάχιστον 50 καλά παρασκευάσματα μεταφάσεων με τον πλήρη αριθμό κεντρομερών ανά ζώο, για τη διαπίστωση χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Επιπλέον, για κάθε ζώο μπορεί να προσδιορίζονται οι μιτωτικοί δείκτες.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα παρουσιάζονται υπό μορφή πίνακα. Ανωμαλίες τύπου χρωματίδης και ισοχρωματίδης (κενά, θραύσματα, αμοιβαίες μετατοπίσεις) και οι μιτωτικοί δείκτες, όταν προσδιορίζονται, παρατίθενται χωριστά για όλα τα δηλητηριασμένα και μη ζώα. Παρατίθενται, επίσης, οι μέσοι όροι και οι σταθερές αποκλίσεις για κάθε πειραματική ομάδα και ομάδα μαρτύρων. Τα δεδομένα αξιολογούνται με την κατάλληλη στατιστική μέθοδο.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - είδος, φυλή και ηλικία των χρησιμοποιηθέντων ζώων G  - αριθμό ζώων, για κάθε φύλο στις πειραματικές ομάδες και ομάδες μαρτύρων G  - πειραματικές συνθήκες: λεπτομερή περιγραφή της επέμβασης και του προγράμματος δειγματοληψίας, επίπεδα δόσεων, διάρκεια επέμβασης και συγκέντρωση του χρησιμοποιημένου παρεμποδιστή της μιτωτικής ατράκτου G  - αριθμό μεταφάσεων που αναλύθηκαν ανά ζώο G  - μιτωτικούς δείκτες, όταν προσδιορίζονται G  - αριθμό και τύπο ανωμαλιών, χωριστά για κάθε ζώο που υπέστη ή όχι επέμβαση G  - συμπτώματα τοξικότητας κατά τη διάρκεια της μελέτης G  - στατιστική αξιολόγηση G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή, Μέρος Β (Ε).  Β.12. ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΜΙΚΡΟΠΥΡΗΝΩΝ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Γ).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Η δοκιμή του μικροπυρήνα είναι μια in vivo δοκιμή στα θηλαστικά, μικρής διάρκειας, η οποία γίνεται για την εξακρίβωση χρωμοσωμικών ή μιτωτικών ανωμαλιών, που προκλήθηκαν από χημικές ουσίες. Η δοκιμασία αυτή βασίζεται σε μία αύξηση του αριθμού των μικροπυρήνων στα πολυχρωματικά ερυθροκύτταρα των δηλητηριασμένων ζώων, σχετικά με το μάρτυρα.  Οι μικροί πυρήνες σχηματίζονται από κλάσματα ή από ολόκληρα χρωμοσώματα που μειώνονται κατά τη μίτωση. Όταν οι ερυθροβλάστες αναπτύσσονται, ο κύριος πυρήνας εξωθείται, ενώ ο μικροπυρήνας μπορεί να παραμείνει στο κυτταρόπλασμα. Νεαρά πολυχρωματικά ερυθροκύτταρα του μυελού των οστών των πειραματοζώων, που έχουν εκτεθεί στην ελεγχόμενη ουσία με κατάλληλη μέθοδο, χρησιμοποιούνται σ'αυτή τη δοκιμή. Ο μυελός των οστών εξάγεται, γίνεται επίχρισμα σε αντικειμενοφόρους πλάκες που χρωματίζονται. Τα πολυχρωματικά ερυθροκύτταρα εξετάζονται ως προς τα μικροπύρηνα με μικροσκόπιο και γίνεται ο υπολογισμός του λόγου πολυχρωματικών προς τα ορθοχρωματικά ερυθροκύτταρα.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασίες  Οι ελεγχόμενες ουσίες διαλύονται σε ισοτονικό διάλυμα. Αν είναι αδιάλυτες σ' αυτό, διαλύονται ή γίνονται αιωρήματα σε κατάλληλα έκδοχα. Εάν χρησιμοποιηθεί έκδοχο, αυτό δεν πρέπει να επηρεάζει τις ελεγχόμενες ουσίες ή να προκαλεί τοξικότητα. Συνήθως, χρησιμοποιούνται διαλύματα της ελεγχόμενης ουσίας πρόσφατα παρασκευασμένα.  1.6.2. Πειραματικές συνθήκες  1.6.2.1. Πειραματόζωα  Συνιστώνται οι μύες, αλλά μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα θηλαστικά ζώα. Λαμβάνονται τυχαία υγιή, νεαρά, ενήλικα ζώα και κατανέμονται σε ομάδες πειραματισμού και ομάδες μάρτυρα.  1.6.2.2. Αριθμός και φύλο  Χρησιμοποιούνται τουλάχιστον πέντε θηλυκά και πέντε αρσενικά ζώα ανά ομάδα πειραματισμού και μαρτυρίας. Έτσι, αν στο πειραματικό διάγραμμα περιλαμβάνονται διάφοροι χρόνοι δοκιμασίας μετά τη χορήγηση της ουσίας, θανατώνονται 10 ζώα ανά χρονική περίοδο και ανά ομάδα. Για την ομάδα θετικών μαρτύρων, αρκεί ένας μοναδικός χρόνος δειγματοληφίας.  1.6.2.3. Οδός χορήγησης  Γενικά οι ελεγχόμενες ουσίες πρέπει να χορηγούνται εφάπαξ. Επανειλημμένες χορηγήσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν αν αυτό δικαιολογείται απο τοξικολογικές πληροφορίες. Το πρόγραμμα όμως των επανειλημμένων χορηγήσεων μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνον όταν η ελεγχόμενη ουσία δεν προκαλεί κυτταροτοξικές επιδράσεις στο μυελό των οστών. Οι συνηθισμένες οδοί χορήγησης είναι από το στόμα και η ενδοπεριτοναϊκή. Και άλλες οδοί χορήγησης μπορεί να είναι κατάλληλες.  1.6.2.4. Χρησιμοποίηση θετικών και αρνητικών μαρτύρων  Σε κάθε πείραμα μπορούν να χρησιμοποιηθούν θετικοί και αρνητικοί (διάλυμα) μάρτυρες.  1.6.2.5. Επίπεδα δόσεων  Για τη βασική ομάδα, χρησιμοποιείται μία δόση εξεταζόμενης ουσίας, η οποία είναι η μέγιστη ανεκτή δόση ή η δόση που προκαλεί κάποια ένδειξη κυτταροτοξικότητας (π.χ. μεταβολή σχέσης πολυχρωματικών προς ορθοχρωματικά ερυθροκύτταρα).  Στις «μη τοξικές» ενώσεις, η μέγιστη (οριακή) δόση που χρειάζεται να διερευνηθεί μετά τη μία μοναδική δόση χορήγησης, είναι 2 000 mg/kg βάρους σώματος.  Αν χρησιμοποιείται πρόγραμμα επαναλαμβανόμενης δόσης, η οριακή δόση είναι 1 000 mg/kg βάρους σώματος ανά ημέρα.  Όταν ενδείκνυται για επιστημονικούς λόγους μπορεί να χρησιμοποιηθούν και επιπλέον επίπεδα δόσεων.  Εάν η δοκιμή χρησιμεύει σαν μέθοδος επαλήθευσης, δύο τουλάχιστον επιπλέον επίπεδα δόσεων πρέπει να χρησιμοποιηθούν.  1.6.3. Διαδικασία  Η δοκιμή μπορεί να εκτελείται με δύο τρόπους:  (i) Στα ζώα η εξεταζόμενη ουσία χορηγείται μία μόνο φορά. Οι χρόνοι δειγματοληψίας θα πρέπει να συμπίπτουν με τη μέγιστη απόκριση του δοκιμίου, η οποία ποικίλει ανάλογα με την εξεταζόμενη ουσία. Επομένως, τα δείγματα του μυελού των οστών λαμβάνονται τουλάχιστον δύο φορές G με την πρώτη δειγματοληψία όχι νωρίτερα από 12 ώρες μετά τη χορήγηση και με τη δεύτερη όχι πέρα από τις 48 ώρες.  Όταν χρησιμοποιούνται πρόσθετα επίπεδα δόσεων, τα δείγματα θα πρέπει να λαμβάνονται στην πιο ευαίσθητη χρονική περίοδο, ή, αν αυτή δεν είναι γνωστή, 24 ώρες μετά τη χορήγηση της ουσίας.  (ii) Εάν από στοιχεία σχετικά με την φαρμακοκινητική και το μεταβολισμό, ενδείκνυται η χρησιμοποίηση προγράμματος επαναλαμβανόμενης δόσης, μπορεί να εφαρμοστεί επαναλαμβανόμενη χορήγηση και τα δείγματα να λαμβάνονται μία μόνο φορά, όχι ενωρίτερα από 12 ώρες μετά από την τελευταία χορήγηση.  Παρασκευάσματα μυελού των οστών  Ο μυελός οστών λαμβάνεται και από τα δύο οστά του μηρού, λίγο μετά τη θανάτωση των ζώων, με ορό εμβρύου βοός. Με φυγοκέντρηση τα κύτταρα καθιζάνουν και το υγρό που επιπλέει απορρίπτεται. Σταγόνες από το ομοιογενές αιώρημα των κυττάρων τοποθετούνται σε αντικειμενοφόρα πλακίδια και απλώνονται σαν επίχρισμα. Μετά από ξήρανση στον αέρα, τα αντικειμενοφόρα πλακίδια χρωματίζονται.  Ανάλυση:  Τα αντικειμενοφόρα πλακίδια κωδικοποιούνται πριν υποστούν τη μικροσκοπική ανάλυση. Για τη διαπίστωση της συχνότητας των μικροπυρήνων, εξετάζονται τουλάχιστον 1 000 πολυχρωματικά ερυθροκύτταρα ανά ζώο.  Ο λόγος ορθοχρωματικών ερυθροκυττάρων προς τα πολυχρωματικά προσδιορίζεται, για κάθε ζώο, μετρώντας συνολικά 1 000 ερυθροκύτταρα.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Τα δεδομένα παρουσιάζονται σε μορφή πίνακα. Μετριέται ο αριθμός των πολυχρωματικών ερυθροκυττάρων, ο αριθμός των πολυχρωματικών ερυθροκυττάρων με μικροπυρήνα και καταγράφονται σε χωριστές καταστάσεις, για κάθε πειραματική ομάδα και μάρτυρα ζώων το επί τοις εκατό των μικροπυρηνικών κυττάρων καθώς και ο λόγος των ορθοχρωματικών ερυθροκυττάρων προς τα πολυχρωματικά. Καταγράφονται, επίσης, οι μέσοι όροι και οι σταθερές αποκλίσεις για κάθε πειραματική ομάδα και το μάρτυρα. Τα δεδομένα αυτά αξιολογούνται με κατάλληλες στατιστικές μεθόδους.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - είδος, φυλή και ηλικία των χρησιμοποιούμενων ζώων G  - αριθμό ζώων κατά φύλο για κάθε πειραματική ομάδα και το μάρτυρα G  - πειραματικές συνθήκες: λεπτομερή περιγραφή χορήγησης και προγράμματος δειγματοληψίας, επίπεδα δόσεων, δεδομένα τοξικότητας, αρνητικούς και θετικούς μάρτυρες G  - κριτήρια για βαθμολόγηση μικροπυρήνων G  - σχέση δόσης/απόκρισης, εφόσον αυτό είναι δυνατόν G  - συμπτώματα τοξικότητας κατά τη διάρκεια της μελέτης G  - στατιστική αξιολόγηση G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή, Μέρος Β (Ε).  Β.13. ESCHERICHIA COLI - ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΑΝΑΣΤΡΟΦΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Γ).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Το σύστημα επαναφοράς της Escherichia coli τρυπτοφάνης (trp) είναι μια μικροβιακή δοκιμασία, η οποία μετράει την επαναφορά trp   . trp+ με χημικές ουσίες που προκαλούν βασικές μεταβολές στο γένωμα του οργανισμού.  Τα βακτήρια εκτίθενται στην ελεγχόμενη ουσία με ή χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση. Μετά από επαρκή περίοδο επώασης σε ελάχιστο θρεπτικό υλικό, οι αποικίες των επαναφορών μετρούνται και συγκρίνονται με εκείνες των αυθόρμητων επαναφορών σε μια αποικία χωρίς ελεγχόμενη ουσία ή/και σε μια αποικία μάρτυρα με διαλύτη.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Οι ακόλουθες μέθοδοι μπορεί να χρησιμοποιηθούν για την πραγματοποίηση της δοκιμής: (1) η προεπωαστική μέθοδος G και (2) η μέθοδος της απευθείας ενσωμάτωσης, κατά την οποία βακτήρια και ελεγχόμενη ουσία μείγνυνται με το υπερκείμενο άγαρ και χύνονται στην επιφάνεια ενός δίσκου με εκλεκτικό άγαρ.  1.6.1. Προετοιμασία  1.6.1.1. Βακτήρια  Τα βακτήρια αναπτύσσονται στους 37  C μέχρι το πέρας της λογαριθμικής φάσης, ή την αρχή της φάσης  στάσης της ανάπτυξης. Η κατά προσέγγιση πυκνότητα των κυττάρων πρέπει να είναι 108-109 κύτταρα ανά ml.  1.6.1.2. Μεταβολική ενεργοποίηση  Τα βακτήρια θα πρέπει να εκτίθενται στην εξεταζόμενη ουσία με την παρουσία και την απουσία κατάλληλου συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης. Το σύστημα που χρησιμοποιείται συνηθέστερα είναι ένα μετα-μιτοχονδριακό κλάσμα συνοδευόμενο από ένα συμπαράγοντα το οποίο παρασκευάζεται από το συκώτι τρωκτικών που έχει υποστεί την επίδραση παραγόντων διέγερσης ενζύμων.  1.6.2. Πειραματικές συνθήκες  1.6.2.1. Δοκιμαζόμενες φυλές  Πρέπει να χρησιμοποιούνται τρεις φυλές, οι WP2, WP2 uvr A, και WP2 uvr A pKM 101. Πρέπει, επίσης, να χρησιμοποιούνται αναγνωρισμένες μέθοδοι για την παρασκευή των αποθεματικών καλλιεργειών και τη συντήρησή τους. Πρέπει να ελέγχονται οι απαιτήσεις ανάπτυξης και η γενετική ταυτότητα των φυλών, η ευαισθησία τους στις υπεριώδεις ακτίνες ή τη μιτομυκίνη C και η αντίσταση στην αμπικιλλίνη της φυλής WP2 uvr A pKM 101. Οι φυλές πρέπει επίσης, να παράγουν αυθόρμητες επαναφορές μέσα στα αναμενόμενα όρια συχνότητας.  1.6.2.2. Θρεπτικά υποστρώματα  Για την έκφραση και επιλογή των προϊόντων μετάλλαξης, χρησιμοποιείται κατάλληλο θρεπτικό μέσον με το απαραίτητο υπερκείμενο άγαρ.  1.6.2.3. Χρησιμοποίηση αρνητικών και θετικών μαρτύρων  Πρέπει να εκτελούνται μάρτυρες χωρίς ελεγχόμενη ουσία και μάρτυρες του διαλύτη. Οι θετικοί μάρτυρες πρέπει, επίσης, να δοκιμάζονται για δύο λόγους:  (i) Την επιβεβαίωση της ευαισθησίας των βακτηριακών φυλών.  Μπορούν να χρησιμοποιηθούν το σουλφονικό μεθυλομεθάνιο, το οξείδιο της 4-νιτροκινολίνης ή η αιθυλονιτρωδοουρία σαν θετικοί μάρτυρες για τις δοκιμές χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση.  (ii) Την εξασφάλιση της δραστικότητας των κατάλληλων μεταβολικών συστημάτων.  Το 2-αμινοανθρακένιο είναι ένας θετικός μάρτυρας για τη δραστηριότητα ενός μεταβολικού συστήματος για όλες τις φυλές. Ένας θετικός μάρτυρας της ίδιας χημικής τάξης, όπως και η ελεγχόμενη ουσία, πρέπει να χρησιμοποιηθεί, εφόσον είναι διαθέσιμος.  1.6.2.4. Ποσότητα της ελεγχόμενης ουσίας ανά δίσκο  Δοκιμάζονται 5 τουλάχιστον διαφορετικές ποσότητες της ελεγχόμενης ουσίας, με ημιλογαριθμικά διαστήματα μεταξύ των δίσκων. Οι ποσότητες των ουσιών δοκιμάζονται έως τα όρια της διαλυτότητας ή της τοξικότητας. Η τοξικότητα εμφανίζεται με τη μείωση του αριθμού των αυθόρμητων επαναφορών, τη διαύγαση του υποκείμενου στρώματος ή το βαθμό επιβίωσης των δηλητηριασμένων καλλιεργειών. Οι μη τοξικές χημικές ουσίες, πριν χαρακτηρισθούν ως αρνητικές, πρέπει να δοκιμαστούν σε ποσότητα 5 mg ανά δίσκο.  1.6.2.5. Συνθήκες επώασης  Οι δίσκοι επωάζονται για 48 έως 72 ώρες στους 37  C.  1.6.3. Διαδικασία  Για τη μέθοδο της απευθείας ενσωμάτωσης στο δίσκο χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση, η χημική ουσία και 0,1 ml μιας πρόσφατης βακτηριακής καλλιέργειας προστίθενται σε 2,0 ml υπερκείμενου άγαρ. Για δοκιμές με μεταβολική ενεργοποίηση, 0,5 ml μείγματος μεταβολικής ενεργοποίησης των ενζύμων του συκωτιού, που περιέχει μια επαρκή ποσότητα μετα-μιτοχονδριακού κλάσματος, προστίθενται στο υπερκείμενο άγαρ, μετά την προσθήκη της χημικής ουσίας και των βακτηρίων. Το περιεχόμενο κάθε δοκιμαστικού σωλήνα ανακατεύεται και απλώνεται στην επιφάνεια ενός εκλεκτικού δίσκου με άγαρ. Το υπερκείμενο άγαρ αφήνεται να στερεοποιηθεί και οι δίσκοι επωάζονται για 48 έως 72 ώρες σε 37  C. Στο τέλος της επωαστικής περιόδου, μετρούνται οι αποικίες επαναφορών ανά δίσκο.  Για την προεπωαστική μέθοδο, ένα μείγμα από την ελεγχόμενη ουσία, 0,1 ml μιας πρόσφατης βακτηριακής καλλιέργειας, και μια επαρκής ποσότητα από το μείγμα της ενεργοποίησης των ενζύμων του συκωτιού, ή η ίδια ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος, προεπωάζονται πριν προστεθούν τα 2,0 ml του υπερκείμενου άγαρ. Όλες οι άλλες διαδικασίες είναι οι ίδιες όπως και στη μέθοδο ενσωμάτωσης.  Και για τις δύο μεθόδους γίνονται τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις σε δίσκους.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Ο αριθμός των αποικιών επαναφοράς ανά δίσκο καταγράφεται για τους μάρτυρες και τους δίσκους με την ελεγχόμενη ουσία. Μετρήσεις για κάθε δίσκο χωριστά, ο μέσος όρος των αποικιών επαναφοράς ανά δίσκο και οι σταθερές αποκλίσεις πρέπει να παρουσιάζονται για τους δίσκους με ελεγχόμενη και μη ουσία. Όλα τα αποτελέσματα επιβεβαιώνονται σ' ένα ανεξάρτητο πείραμα.  Τα δεδομένα πρέπει να αξιολογούνται χρησιμοποιώντας κατάλληλες στατιστικές μεθόδους.  Πραγματοποιούνται δύο τουλάχιστον ανεξάρτητα πειράματα. Το δεύτερο πείραμα δεν χρειάζεται να εκτελείται με τον ίδιο ακριβώς τρόπο όπως και το αρχικό πείραμα. Πράγματι, μπορεί να είναι προτιμότερο να τροποποιηθούν ορισμένες πειραματικές συνθήκες για να ληφθούν χρησιμότερα δεδομένα.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - βακτήρια, χρησιμοποιηθέν στέλεχος G  - πειραματικές συνθήκες: επίπεδα δόσεων, τοξικότητα, σύνθεση θρεπτικού μέσου G διαδικασίες (προεπώαση - επώαση) G σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης G ουσίες αναφοράς, αρνητικοί μάρτυρες G  - μετρήσεις ανά δίσκο , το μέσο όρο των αποικιών επαναφοράς ανά δίσκο, σταθερή απόκλιση, και όταν είναι δυνατόν τη σχέση δόσης/αποτελέσματος G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  Β.14. SALMONELLA TYPHIMURIUM - ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΑΝΑΣΤΡΟΦΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Α).  1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή, Μέρος Β (Γ).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Ουδεμία.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Το σύστημα επαναφοράς της Salmonella typhimurium histidine (his) είναι μια μικροβιακή δοκιμή, η οποία μετράει την επαναφορά της his   . his+ με χημικές ουσίες που προκαλούν βασικές αντικαταστάσεις ή μεταλλαγές στο γένωμα του οργανισμού αυτού.  Tα βακτήρια εκτίθενται στην ελεγχόμενη χημική ουσία με ή χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση, και τοποθετούνται σε ελάχιστο μέσον. Μετά από μια κατάλληλη περίοδο επώασης, μετρούνται οι αποικίες αναστροφής και συγκρίνονται με τον αριθμό των αυθόρμητων αναστροφών σε μια μη εμβολιασμένη και/ή μόνο με διαλύτη καλλιέργεια μάρτυρα.  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Ουδέν.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  1.6.1. Προετοιμασίες  1.6.1.1. Βακτήρια  Πρόσφατες βακτηριακές καλλιέργειες αναπτύσσονται στους 37  C μέχρι το πέρας της λογαριθμικής φάσης της ή την αρχή της στατικής φάσης της ανάπτυξής τους. Η κατά προσέγγιση πυκνότητα των κυττάρων πρέπει να είναι 108 έως 109 κύτταρα ανά ml.  1.6.1.2. Μεταβολική ενεργοποίηση  Τα βακτήρια θα πρέπει να εκτίθενται στην εξεταζόμενη ουσία και με την παρουσία και την απουσία κατάλληλου συστήματος μεταβολικής ενεργοποίησης. Το σύστημα που χρησιμοποιείται συνηθέστερα είναι ένα μετα-μιτοχονδριακό κλάσμα συνοδευόμενο από ένα συμπαράγοντα το οποίο παρασκευάζεται από το συκώτι τρωκτικών που έχει υποστεί την επίδραση παραγόντων ενεργοποίησης ενζύμων.  1.6.2. Πειραματικές συνθήκες  1.6.2.1. Δοκιμαζόμενα στελέχη  Πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον τέσσερα στελέχη ΤΑ 1535, ΤΑ 1537 ή ΤΑ 97, ΤΑ 98 και ΤΑ 100. Mπορούν να χρησιμοποιηθούν επιπλέον και άλλα στελέχη όπως ΤΑ 1538 και ΤΑ 102. Πρέπει να χρησιμοποιούνται ανεγνωρισμένες μέθοδοι παρασκευής και φύλαξης αποθεματικών καλλιεργειών. Πρέπει να ελέγχονται οι απαιτήσεις ανάπτυξης και η γενετική ταυτότητα των στελεχών, η ευαισθησία τους στην υπεριώδη ακτινοβολία και στο κρυσταλλικό ιώδες όπως και η αντίστασή τους στην αμπικιλλίνη. Τα στελέχη θα πρέπει επίσης να παρέχουν αυθόρμητα προϊόντα αναστροφής μέσα στα αναμενόμενα όρια συχνότητας.  1.6.2.2. Θρεπτικά υποστρώματα  Χρησιμοποιείται ένα κατάλληλο, εκλεκτικό, θρεπτικό υλικό μ' ένα επαρκές στρώμα υπερκείμενου άγαρ.  1.6.2.3. Χρησιμοποίηση θετικών και αρνητικών μαρτύρων  Πρέπει οι συμφωνούντες, χωρίς ελεγχόμενη ουσία, μάρτυρες και οι μάρτυρες διαλύτη να δοκιμάζονται. Επίσης, πρέπει να γίνονται δοκιμές στους θετικούς μάρτυρες για δύο σκοπούς:  (i) την επιβεβαίωση της ευαισθησίας των βακτηριακών φυλών.  Μπορούν να χρησιμοποιηθούν οι ακόλουθες ουσίες για τις δοκιμές χωρίς μεταβολικές ενεργοποιήσεις:  Στελέχη Αναστροφή με  ΤΑ 1535, ΤΑ 100Αζίδιο του νατρίου  ΤΑ 1538, ΤΑ 98, ΤΑ 972-νιτροφλουορένιο  ΤΑ 15379-αμινοακριδίνη  ΤΑ 102Υδροϋπεροξείδιο κουμενίου  (ii) την εξασφάλιση της δραστηριότητας του κατάλληλου μεταβολικού συστήματος.  Το 2-αμινοανθρακένιο είναι ένας θετικός μάρτυρας για τη δραστικότητα ενός μεταβολικού συστήματος για όλες τις φυλές. Ένας θετικός μάρτυρας της ίδιας χημικής τάξης όπως η ελεγχόμενη ουσία μπορεί να χρησιμοποιηθεί, εφόσον είναι διαθέσιμος.  1.6.2.4. Ποσότητα ελεγχόμενης ουσίας ανά δίσκο  Δοκιμάζονται 5 τουλάχιστον διαφορετικές ποσότητες της ελεγχόμενης ουσίας σε ημιλογαριθμικά διαστήματα μεταξύ των δίσκων. Οι ουσίες δοκιμάζονται σε ποσότητες που φτάνουν στα όρια διαλυτότητας ή τοξικότητας. Η τοξικότητα εμφανίζεται με τη μείωση του αριθμού των αυθόρμητων αναστροφών, τη διαύγαση του υποκείμενου στρώματος ή το βαθμό επιβίωσης των εμβολιασμένων καλλιεργειών. Οι μη τοξικές ουσίες πρέπει να δοκιμάζονται σε ποσότητες 5 mg ανά δίσκο, προτού χαρακτηριστούν σαν αρνητικές.  1.6.2.5. Συνθήκες επώασης  Οι δίσκοι επωάζονται στους 37  C για 48 έως 72 ώρες.  1.6.3. Διαδικασία  Για τη μέθοδο της απευθείας ενσωμάτωσης στους δίσκους χωρίς μεταβολική ενεργοποίηση, προστίθεται 0,1 ml πρόσφατης βακτηριακής καλλιέργειας σε 2,0 ml υπερκείμενου άγαρ. Για δοκιμασίες με μεταβολική ενεργοποίηση, 0,5 ml μείγματος ενεργοποίησης ενζύμων του συκωτιού που περιέχει επαρκή ποσότητα μετα-μιτοχονδριακού κλάσματος προστίθεται στο υπερκείμενο άγαρ, μετά την προσθήκη της ελεγχόμενης ουσίας και των βακτηρίων. Το περιεχόμενο κάθε σωλήνα ανακατεύεται και απλώνεται στην επιφάνεια ενός εκλεκτικού δίσκου με άγαρ. Μετά τη στερεοποίηση του υπερκείμενου άγαρ, οι δίσκοι επωάζονται στους 37  C για 48 έως 72 ώρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, μετρούνται οι αποικίες επαναφοράς ανά δίσκο. Για τη μέθοδο προεπώασης, πριν από την προσθήκη των 2,0 ml υπερκείμενου άγαρ, προεπωάζεται μείγμα της ελεγχόμενης ουσίας απο 0,1 ml πρόσφατης βακτηριακής καλλιέργειας και κατάλληλης ποσότητας μείγματος ενεργοποίησης των ενζύμων του συκωτιού ή ίδιας ποσότητας ρυθμιστικού διαλύματος. Όλες οι άλλες διαδικασίες είναι οι ίδιες όπως και για τη μέθοδο της απευθείας ενσωμάτωσης στους δίσκους.  Και για τις δύο μεθόδους γίνονται τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις σε δίσκους.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ  Αναφέρεται ο αριθμός των αποικιών αναστροφής για το μάρτυρα και τις πειραματικές σειρές.  Πρέπει να αναφέρονται οι μετρήσεις για κάθε δίσκο, ο μέσος όρος των αποικιών αναστροφής ανά δίσκο και η σταθερή απόκλιση, για την ελεγχόμενη ουσία και τους μάρτυρες.  Τα αποτελέσματα αξιολογούνται με κατάλληλη στιτιστική μέθοδο.  Πραγματοποιούνται τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. Το δεύτερο πείραμα δεν είναι ανάγκη να εκτελεσθεί με τον ίδιο τρόπο όπως και το αρχικό πείραμα. Πράγματι, μπορεί να είναι προτιμότερο να τροποποιηθούν ορισμένες πειραματικές συνθήκες για να ληφθούν χρησιμότερα δεδομένα.  3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΕΩΣ  3.1. ΕΚΘΕΣΗ ΔΟΚΙΜΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατό, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - βακτήρια, χρησιμοποιηθέν στέλεχος G  - πειραματικές συνθήκες: επίπεδα δόσεων, τοξικότητα, σύνθεση θρεπτικού μέσου, διαδικασίες (προεπώαση, επώαση), σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης, ουσίες αναφοράς, αρνητικοί μάρτυρες G  - μετρήσεις για κάθε δίσκο, ο μέσος αριθμός των αποικιών επαναφοράς ανά δίσκο, σταθερή απόκλιση, σχέση δόσης και επίδρασης, εφόσον είναι δυνατόν G  - συζήτηση των αποτελεσμάτων G  - ερμηνεία των αποτελεσμάτων.  3.2. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Δ).  4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  Βλέπε Γενική Εισαγωγή Μέρος Β (Ε).  ΜΕΡΟΣ Γ: ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΗΣ ΟΙΚΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ Γ.1. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΓΙΑ ΨΑΡΙΑ 1. MEΘΟΔΟΣ  1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ  Σκοπός της δοκιμής αυτής είναι να προσδιορισθεί η οξεία θανατηφόρος τοξικότητα μιας ουσίας στα ψάρια στο νερό. Για την εκλογή της πιο κατάλληλης μεθόδου (στατική, ημιστατική ή συνεχούς ροής), που θα εξασφαλίζει ικανοποιητικές σταθερές συγκεντρώσεις της ουσίας κατά τη διάρκεια της δοκιμής, σκόπιμο είναι να έχουμε, όσο το δυνατό, περισσότερες πληροφορίες για την ουσία αυτή όσον αφορά την υδατοδιαλυτότητα της, την τάση ατμών, τη χημική σταθερότητα, τη σταθερά διαστάσεως και τη βιοδιασπασιμότητά της.  Άλλες απαιτούμενες πληροφορίες (π.χ. συντακτικός τύπος, βαθμός καθαρότητας, φύση και περιεκτικότητα σημαντικών ξένων προσμείξεων, παρουσία και ποσότητα προσθέτων και συντελεστής κατανομής σε n-οκτανόλη/νερό, πρέπει να λαμβάνονται υπόψη και κατά την προετοιμασία της δοκιμής και στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων. 1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ  Οξεία τοξικότητα είναι το εμφανές, δυσμενές αποτέλεσμα που προκαλείται σε έναν οργανισμό μέσα σε μικρό διάστημα (ημέρες) έκθεσής του σε μία ουσία. Σ' αυτή τη δοκιμή, η οξεία τοξικότητα εκφράζεται ως η μέση θανατηφόρα συγκέντρωση (LC50), που είναι η συγκέντρωση σε νερό, η οποία σκοτώνει 50 % από την ομάδα ψαριών του πειράματος, μέσα σε μία συνεχή περίοδο έκθεσης η οποία πρέπει να δηλώνεται.  Όλες οι συγκεντρώσεις της ελεγχόμενης ουσίας δίνονται σε βάρος κατ' όγκο (χιλιοστόγραμμα ανά λίτρο), καθώς επίσης εκφράζονται και σε βάρος κατά βάρος (mg.kg 1).  1.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ  Μία ουσία αναφοράς μπορεί να ελέγχεται με σκοπό να αποδειχτεί ότι, κάτω από τις εργαστηριακές συνθήκες ελέγχου, η ανταπόκριση των ελεγχόμενων ειδών δεν έχει αλλάξει σημαντικά.  Για τον έλεγχο αυτό δεν καθορίζονται ουσίες αναφοράς.  1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Είναι δυνατόν να εκτελείται μία οριακή δοκιμή με 100 mg ανά λίτρο, προκειμένου να διαπιστωθεί αν η LC50 είναι μεγαλύτερη από τη συγκέντρωση αυτή.  Τα ψάρια εκτίθενται στην προστιθέμενη στο νερό εξεταζόμενη ουσία σε μία ορισμένη περιοχή συγκεντρώσεων για διάστημα 96 ωρών. Καταγράφεται η θνησιμότητα για διαστήματα τουλάχιστον 24 ωρών και όπου είναι δυνατόν, υπολογίζονται σε κάθε παρατήρηση οι συγκεντρώσεις που έχουν σαν αποτέλεσμα το θάνατο του 50% των ψαριών (LC50).  1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ  Τα ποιοτικά κριτήρια έχουν εφαρμογή και στην οριακή δοκιμή και στη μέθοδο πλήρους δοκιμής.  Η θνησιμότητα στους ελέγχους δεν πρέπει να υπερβαίνει το 10% (ή  το ένα ψάρι αν χρησιμοποιούνται λιγότερα από δέκα) στο τέλος της δοκιμής.  Η συγκέντρωση διαλελυμένου οξυγόνου πρέπει καθ'όλη τη διάρκεια της δοκιμής να είναι μεγαλύτερη από το 60% της τιμής κορεσμού με αέρα.  Οι συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης ουσίας πρέπει, σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής, να διατηρείται στο 80% των αρχικών συγκεντρώσεων.  Σε ουσίες που διαλύονται εύκολα στο περιβάλλον της δοκιμής, παρέχοντας σταθερά διαλύματα δηλ. εκείνες που δεν εξατμίζονται, αποικοδομούνται, υδρολύονται ή προσροφώνται τουλάχιστον σε σημαντικό βαθμό, η αρχική συγκέντρωση μπορεί να λαμβάνεται σαν ισοδύναμη με την ονομαστική συγκέντρωση. Πρέπει να παρουσιάζονται αποδείξεις ότι οι συγκεντρώσεις διατηρούνται σταθερές σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής και ότι τα ποιοτικά κριτήρια ικανοποιούνται.  Για ουσίες που είναι:  (i) ελάχιστα διαλυτές στο περιβάλλον της δοκιμής,  (ii) ικανές να σχηματίζουν σταθερά γαλακτώματα ή διασπορές,  (iii) μη σταθερές σε υδατικά διαλύματα,  σαν αρχική συγκέντρωση θα λαμβάνεται η συγκέντρωση που μετριέται στο διάλυμα (ή, αν αυτό δεν είναι τεχνικά δυνατό, στη στήλη νερού) στην αρχή της δοκιμής. Η συγκέντρωση θα προσδιορίζεται μετά από μία περίοδο εξισορρόπησης αλλά πριν από την εισαγωγή του εξεταζόμενου ψαριού.  Σε όλες αυτές τις περιπτώσεις, θα πρέπει να γίνονται και άλλες μετρήσεις κατά τη διάρκεια της δοκιμής για να επιβεβαιώνονται οι πραγματικές συγκεντρώσεις έκθεσης ή ότι τηρούνται τα κριτήρια ποιόητος.  Το pH δεν πρέπει να μεταβάλλεται περισσότερο από 1 μονάδα.  1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ  Τρεις τύποι μεθόδων μπορεί να χρησιμοποιηθούν: Στατιστικός έλεγχος:  Έλεγχος τοξικότητας στον οποίο δεν παρουσιάζεται ροή του διαλύματος ελέγχου. (Τα διαλύματα παραμένουν χωρίς να αλλάζουν καθ' όλη τη διάρκεια του ελέγχου.)  Ημιστατιστικός έλεγχος:  Έλέγχος χωρίς ροή του διαλύματος ελέγχου, στον οποίο όμως κατά τακτά διαστήματα γίνεται ομαδικά αλλαγή των διαλυμάτων ελέγχου μετά από παρατεταμένες περιόδους (π.χ. 24 ώρες).  Έλεγχος συνεχούς ροής:  Έλεγχος τοξικότητας στον οποίο το νερό στους θαλάμους ελέγχου ανανεώνεται σταθερά, ενώ η ελεγχόμενη χημική ουσία μεταφέρεται με το νερό που χρησιμοποιείται για την ανανέωση του περιβάλλοντος ελέγχου.  1.6.1. Αντιδραστήρια  1.6.1.1. Διαλύματα των ελεγχόμενων ουσιών  Τα αρχικά διαλύματα της απαιτούμενης συγκέντρωσης παρασκευάζονται με διάλυση της ουσίας σε απιονισμένο νερό ή νερό σύμφωνα με την περιγραφή του σημείου 1.6.1.2.  Οι επιλεγόμενες συγκεντρώσεις για τη δοκιμή, παρασκευάζονται αραιώνοντας το αρχικό διάλυμα. Εάν η δοκιμή αναφέρεται σε υψηλές συγκεντρώσεις, η ουσία μπορεί να διαλύεται στο νερό αραίωσης απ'ευθείας.  Οι ουσίες θα πρέπει κανονικά να εξετάζονται μόνο μέχρι το όριο διαλυτότητας. Για ορισμένες ουσίες (π.χ. ουσίες με μικρή υδατοδιαλυτότητα, ή υψηλό Pow, ή εκείνες που σχηματίζουν μία σταθερή διασπορά παρά αληθινό διάλυμα στο νερό), είναι παραδεκτό να διενεργείται και μία δοκιμή με συγκέντρωση πάνω από το όριο διαλυτότητας της ουσίας για να διασφαλίζεται ότι επιτεύχθηκε πράγματι η μέγιστη διαλυτή/σταθερή συγκέντρωση. Είναι εντούτοις σημαντικό, η συγκέντρωση αυτή να μην παρενοχλεί διαφορετικά το σύστημα δοκιμής (π.χ. δημιουργία μιας μεμβράνης της ουσίας στην επιφάνεια του νερού εμποδίζοντας έτσι την οξυγόνωση του νερού, κ.λπ.).  Για να υποβοηθηθεί η παρασκευή των αρχικών διαλυμάτων ουσιών με μικρή υδατοδιαλυτότητα ή η διασπορά των ουσιών αυτών στο περιβάλλον δοκιμής, μπορούν να χρησιμοποιηθούν υπέρηχοι για την υποβοήθηση της διασποράς, οργανικοί διαλύτες, γαλακτωματοποιητές ή μέσα διασποράς. Όταν χρησιμοποιούνται οι βοηθητικές αυτές ουσίες, όλες οι συγκεντρώσεις δοκιμής θα πρέπει να περιέχουν την ίδια ποσότητα βοηθητικής ουσίας, ενώ επιπλέον ψάρια μάρτυρες θα πρέπει να εκτίθενται στην ίδια συγκέντρωση βοηθητικής ουσίας με εκείνη που χρησιμοποιείται στη σειρά των δοκιμών. Η συγκέντρωση αυτών των βοηθητικών ουσιών θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν μικρότερη και σε καμία περίπτωση να μην υπερβαίνει τα 100 mg ανά λίτρο στο περιβάλλον δοκιμής.  Η δοκιμή θα πρέπει να πραγματοποιείται χωρίς ρύθμιση του pH. Αν υπάρχει ένδειξη αξιοσημείωτης μεταβολής του pH, συνιστάται η δοκιμή να επαναλαμβάνεται με ρύθμιση του pH και να αναφέρονται τα αποτελέσματα. Στην περίπτωση αυτή, η τιμή pH του αρχικού διαλύματος θα πρέπει να ρυθμίζεται στην τιμή pH του νερού αραίωσης, εκτός αν υπάρχουν ειδικοί λόγοι που δεν το επιτρέπουν. Για το σκοπό αυτό προτιμούνται το HCl και NaOH. Η ρύθμιση του pH θα πρέπει να γίνεται με τέτοιο τρόπο ώστε η συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας στο αρχικό διάλυμα να μη μεταβάλλεται τουλάχιστον σημαντικά. Εάν εξαιτίας της ρύθμισης του pH προκληθεί κάποια χημική αντίδραση ή φυσική καθίζηση της εξεταζόμενης ουσίας, αυτή πρέπει να αναφέρεται.  1.6.1.2. Νερό συντήρησης και αραίωσης  Μπορεί να χρησιμοποιηθεί πόσιμο νερό του δικτύου ύδρευσης (απαλλαγμένο από επικίνδυνες ενδεχομένως συγκεντρώσεις χλωρίου, βαρέων μετάλλων ή άλλων ουσιών), καλής ποιότητας φυσικό νερό ή νερό από ανασύσταση (βλέπε Προσάρτημα Ι). Πρέπει να προτιμώνται νερά με ολική σκληρότητα μεταξύ 10 και 250 mg ανά λίτρο (όπως CaCO3) και από pH 6,0 έως 8,5.  1.6.2. Συσκευή  Όλες οι συσκευές πρέπει να είναι φτιαγμένες από χημικά αδρανές υλικό:  - αυτόματο σύστημα αραίωσης (για τον έλεγχο συνεχούς ροής),  - μετρητή οξυγόνου,  - συσκευή προσδιορισμού της σκληρότητας του νερού,  - κατάλληλα όργανα για τον έλεγχο της θερμοκρασίας,  - πεχάμετρο.  1.6.3. Ψάρια ελέγχου  Τα ψάρια θα πρέπει να είναι υγιή και χωρίς καμία εμφανή δυσμορφία.  Τα χρησιμοποιούμενα είδη θα πρέπει να επιλέγονται με βάση πρακτικά κριτήρια, όπως το αν ανευρίσκονται εύκολα σε όλη τη διάρκεια του χρόνου, την εύκολη συντήρηση, την καταλληλότητά για τη δοκιμή, τη σχετική ευαισθησία ως πρός τίς χημικές ουσίες, και οποιοδήποτε άλλο οικονομικό, βιολογικό ή οικολογικό παράγοντα που έχει σχέση με το θέμα. Κατά την επιλογή του είδους των ψαριών θα πρέπει επίσης να λαμβάνεται υπόψη και η ανάγκη συγκρισιμότητας των λαμβανομένων στοιχείων και η υπάρχουσα διεθνής εναρμόνιση (παραπομπή 1).  Ένας πίνακας ειδών που συνιστώνται για την εκτέλεση της δοκιμής αυτής υπάρχει στο προσάρτημα 2 G προτιμούνται η πέστροφα και το είδος Ζέμπρα.  1.6.3.1. Συντήρηση ψαριών  Τα ψάρια ελέγχου προέρχονται, κατά προτίμηση, από μία ποσότητα με παρόμοιο μάκρος και ηλικία. Τα ψάρια πρέπει να κρατηθούν για 12 ημέρες τουλάχιστον στις παρακάτω συνθήκες:  Φορτίο:  Ανάλογο με το σύστημα (ανακυκλοφορία ή συνεχής ροή) και το είδος των ψαριών.  Νερό:  Βλέπε σημείο 1.6.1.2.  Φως:  Περίοδος φωτισμού 12 έως 16 ώρες ημερήσια.  Συγκέντρωση διαλελυμένου οξυγόνου:  80% τουλάχιστον της τιμής κορεσμού με αέρα.  Διατροφή:  Τρεις φορές την εβδομάδα ή καθημερινά που σταματά 24 ώρες πριν αρχίσει ο έλεγχος.  1.6.3.2. Θνησιμότητα  Μετά από μια περίοδο εγκατάστασης 48 ωρών, καταγράφονται οι θάνατοι και εφαρμόζονται τα ακόλουθα κριτήρια:  - για θνησιμότητα μεγαλύτερη του 10% του πληθυσμού σε επτά ημέρες:  απορρίπτεται όλη η ομάδα,  - για θνησιμότητα μεταξύ 5 έως 10 % του πληθυσμού:  η περίοδος συντήρησης συνεχίζεται για επτά ακόμη ημέρες. Αν δεν παρατηρηθούν άλλοι θάνατοι, η ομάδα ψαριών εγκρίνεται, αλλιώς πρέπει να απορριφθεί,  - για θνησιμότητα μικρότερη του 5% του πληθυσμού:  η ομάδα ψαριών εγκρίνεται.  1.6.4. Προσαρμογή  Όλα τα ψάρια πρέπει να εκτεθούν σε νερό της ποιότητας και θερμοκρασίας που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί στον έλεγχο για επτά τουλάχιστον ημέρες πριν να χρησιμοποιηθούν.  1.6.5. Διαδικασία ελέγχου  Ένας προκαταρκτικός έλεγχος μπορεί να προηγηθεί του τελικού, με σκοπό την παροχή πληροφοριών για την περιοχή των συγκεντρώσεων που πρέπει να χρησιμοποιηθούν στον κυρίως έλεγχο.  Εκτός από τη σειρά των δοκιμών, διενεργείται και ένας έλεγχος χωρίς την εξεταζόμενη ουσία και, εφόσον συντρέχει λόγος, και ένας έλεγχος με την βοηθητική ουσία.  Ανάλογα με τις φυσικές και χημικές ιδιότητες της εξεταζόμενης ουσίας, θα πρέπει να επιλέγεται ο στατικός, ημιστατικός ή συνεχούς ροής έλεγχος ώστε να πληρούνται τα ποιοτικά κριτήρια.  Τα ψάρια εκτίθενται στην ουσία όπως περιγράφεται παρακάτω:  - Διάρκεια: 96 ώρες  - Αριθμός ζώων: τουλάχιστον 7 για κάθε συγκέντρωση,  - Δεξαμενές: κατάλληλης χωρητικότητας σε σχέση με το φορτίο που συνιστάται,  - Φορτίο: το μέγιστο φορτίο που συνιστάται είναι 1,0 g ανά λίτρο για τον στατικό και ημιστατικό έλεγχο G για συστήματα συνεχούς ροής γίνονται αποδεκτές υψηλότερες συγκεντρώσεις,  - Συγκεντρώσεις ελέγχου: πέντε τουλάχιστον συγκεντρώσεις που διαφέρουν μεταξύ τους κατά ένα σταθερό παράγοντα που δεν υπερβαίνει το 2,2 και που καλύπτουν κατά το δυνατόν την περιοχή θνησιμότητας από 0 έως 100%,  - Νερό: βλέπε σημείο 1.6.1.2.,  - Φως: περίοδος φωτισμού 12 έως 16 ώρες ημερησίως,  - Θερμοκρασία: κατάλληλη για τα είδη ψαριών (προσάρτημα 2) αλλά με προσέγγιση ± 1  C για κάθε ιδιαίτερο έλεγχο,  - Συγκέντρωση διαλελυμένου οξυγόνου: όχι λιγότερο από 60% της τιμής κορεσμού με αέρα στη θερμοκρασία που έχει επιλεγεί,  - Διατροφή: καθόλου.  Τα ψάρια επιθεωρούνται μετά τις πρώτες 2 έως 4 ώρες και σε διαστήματα 24 ωρών τουλάχιστον. Τα ψάρια θεωρούνται νεκρά όταν άγγιγμα του ουραίου μίσχου δεν προκαλεί αντίδραση και δεν είναι ορατές αναπνευστικές κινήσεις. Τα νεκρά ψάρια απομακρύνονται όταν παρατηρηθούν και οι θάνατοι καταγράφονται.  Κρατούνται σημειώσεις των ορατών ανωμαλιών (π.χ. απώλεια ισορροπίας, αλλαγές συμπεριφοράς στην κολύμβηση, αναπνευστική λειτουργία, χρωματισμός κ.λπ.).  Μετρήσεις του pH, του διαλελυμένου οξυγόνου και της θερμοκρασίας πρέπει να γίνονται καθημερινά.  Οριακή δοκιμασία  Χρησιμοποιώντας τις διαδικασίες που περιγράφονται σ' αυτή τη μέθοδο δοκιμής, μπορεί να εκτελεσθεί μία οριακή δοκιμή με 100 mg ανά λίτρο για να διαπιστωθεί αν η LC50 είναι μεγαλύτερη από τη συγκέντρωση αυτή. Αν η φύση της ουσίας είναι τέτοια ώστε να μην μπορεί να επιτευχθεί στο νερό της δοκιμής συγκέντρωση 100 mg ανά λίτρο, η οριακή δοκιμή θα πρέπει να εκτελείται με συγκέντρωση ίση με τη διαλυτότητα της ουσίας (ή τη μέγιστη συγκέντρωση που οδηγεί σε μια σταθερή διασπορά) στο χρησιμοποιούμενο μέσον (βλ. επίσης 1.6.1.1.).  Η οριακή δοκιμή θα πρέπει να εκτελείται χρησιμοποιώντας 7 έως 10 ψάρια, με τον ίδιο αριθμό και στον ή στις ομάδες μαρτύρων. (Η διωνυμική θεωρία υπαγορεύει ότι όταν χρησιμοποιούνται 10 ψάρια με θνησιμότητα μηδέν, υπάρχει μία τιμή 99,9% εμπιστοσύνης ότι η LC50 είναι μεγαλύτερη από τη χρησιμοποιηθείσα συγκέντρωση στην οριακή δοκιμή. Με 7, 8 ή 9 ψάρια, η απουσία θνησιμότητας παρέχει μία τιμή 99%, τουλάχιστον, εμπιστοσύνης ότι η LC50 είναι μεγαλύτερη από τη χρησιμοποιηθείσα συγκέντρωση.)  Εάν υφίσταται θνησιμότητα, πρέπει να εκτελεσθεί πλήρης μελέτη. Εάν παρατηρηθούν υποθανατηφόρες επιδράσεις, θα πρέπει να καταγραφούν.  2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ  Για κάθε περίοδο για την οποία καταγράφηκαν παρατηρήσεις (24, 48, 72 και 96 ώρες), χαράσσεται καμπύλη ποσοστού θνησιμότητας για κάθε συνιστώμενη περίοδο έκθεσης σαν συνάρτηση της συγκέντρωσης σε λογαριθμικό χαρτί.  Όπου είναι δυνατόν και για κάθε χρόνο παρατήρησης, θα πρέπει να εκτιμώνται η LC50 και τα όρια εμπιστοσύνης (p = 0,05) χρησιμοποιώντας πρότυπες διαδικασίες G οι τιμές αυτές θα πρέπει να στρογγυλοποιούνται σε ένα, ή το πολύ δύο σημαντικά ψηφία (παραδείγματα στρογγυλοποίησης σε δύο ψηφία: 170 για 173,5, 0,13 αντί 0,127, 1,2 αντί 1,21).  Στις περιπτώσεις όπου η κλίση της καμπύλης συγκέντρωσης/ποσοστού απόκρισης είναι πολύ μεγάλη για να μπορεί να υπολογισθεί η LC50, είναι αρκετή η γραφική εκτίμηση της τιμής αυτής.  Όταν δύο διαδοχικές συγκεντρώσεις, με σχέση 2,2 δίνουν μόνο 0 και 100% θνησιμότητα, οι δύο αυτές τιμές αρκούν για να υποδείξουν την περιοχή στην οποία ευρίσκεται η LC50.  Αν παρατηρηθεί ότι η σταθερότητα ή η ομοιογένεια της εξεταζόμενης ουσίας δεν μπορεί να διατηρηθεί, το γεγονός αυτό θα πρέπει να αναφέρεται και να λαμβάνεται υπόψη στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων.3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ  Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιέχει τις ακόλουθες πληροφορίες:  - πληροφορίες για το εξεταζόμενο ψάρι (επιστημονική ονομασία, γένος, προμηθευτή, κάθε τυχόν προκατεργασία, μέγεθος και αριθμό ψαριών που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε συγκέντρωση) G  - πηγή νερού αραίωσης και κυριώτερα χημικά χαρακτηριστικά (pH, σκληρότητα, θερμοκρασία) G  - στην περίπτωση ουσίας με χαμηλή υδατοδιαλυτότητα, τη μέθοδο παρασκευής του αρχικού και του διαλύματος δοκιμής G  - συγκέντρωση κάθε βοηθητικής ουσίας G  - πίνακα των χρησιμοποιηθεισών συγκεντρώσεων και κάθε διαθέσιμη πληροφορία για τη σταθερότητα των συγκεντρώσεων της εξεταζόμενης ουσίας στο διάλυμα δοκιμής G  - αν εκτελούνται χημικές αναλύσεις, τις χρησιμοποιηθείσες μεθόδους και τα ληφθέντα αποτελέσματα G  - αποτελέσματα τυχόν οριακής δοκιμασίας, αν έγινε G  - τους λόγους της εκλογής και λεπτομέρειες για τη χρησιμοποιηθείσα διαδικασία ελέγχου (π.χ. στατικός, ημιστατικός, ταχύτητα χορήγησης, ταχύτητα ροής, αν υπήρχε εξαερισμός, φορτίο ψαριών, κ.λπ) G  - περιγραφή του εξοπλισμού ελέγχου G  - πρόγραμμα φωτισμού G  - συγκεντρώσεις διαλελυμένου οξυγόνου, τιμές pH και θερμοκρασίες των διαλυμάτων δοκιμής κάθε 24 ώρες G  - αποδείξεις τήρησης των ποιοτικών κριτηρίων G  - πίνακα με τη συνολική θνησιμότητα σε κάθε συγκέντρωση και στο μάρτυρα (και μάρτυρα με τη βοηθητική ουσία, αν απαιτείται) σε κάθε χρονική στιγμή των παρατηρήσεων G  - γραφική παράσταση της καμπύλης συγκέντρωσης/ποσοστού απόκρισης στο τέλος της δοκιμής G  - εάν είναι δυνατόν, τις τιμές LC50 σε κάθε συνιστώμενο χρόνο παρατήρησης (με όριο εμπιστοσύνης 95%) G  - στατιστικές μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των τιμών LC50 G  - αν χρησιμοποιήθηκε ουσία αναφοράς, τα ληφθέντα αποτελέσματα G  - μέγιστη τιμή συγκέντρωσης που δεν προκαλεί θνησιμότητα στη διάρκεια της δοκιμής G  - χαμηλότερη τιμή συγκέντρωσης στη δοκιμή που προκαλεί 100% θνησιμότητα στη διάρκεια της δοκιμής.  4. BIBΛΙΟΓΡΑΦΙΑ  (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.  (2) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods - NFT 90-303 June 1985.  (3) AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow Through methods - NFT 90-305 June 1985.  (4) ISO 7346/1, /2 and /3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan - Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.  (5) Eidgenφssisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien fόr Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974.  (6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15). (7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish. (8) NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980. (9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975. (10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978. (11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979. (12) Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975. (13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979. (14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Φkotoxikologie, Grundlagen fόr die Φkotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986. (15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99. (16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978. (17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821. (18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32. (19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84. (20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer programm for calculating an LC50. US EPA. Προσάρτημα 1 Νερό από ανασύσταση Παράδειγμα ενός κατάλληλου νερού αραίωσης Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναλυτικού βαθμού. Το νερό πρέπει να είναι καλής ποιότητας απεσταγμένο νερό ή απιονισμένο νερό με αγωγιμότητα μικρότερη από 5 μScm 1. H συσκευή απόσταξης του νερού δεν πρέπει να περιέχει κανένα κομμάτι κατασκευασμένο από χαλκό. Αρχικό διάλυμα CaCl2. 2H2O (υδροχλωριούχο ασβέστιο) 11,76 g διαλύονται σε νερό και συμπληρώνονται με νερό μέχρι 1 λίτρο MgSO4. 7H2O (επτα-υδροθειικό μαγνήσιο) 4,93 g διαλύονται σε νερό και συμπληρώνονται με νερό μέχρι 1 λίτρο NaHCO3 (όξινο ανθρακικό νάτριο) 2,59 g διαλύονται σε νερό και συμληρώνονται με νερό μέχρι 1 λίτρο KCl (χλωριούχο κάλιο) 0,23 g διαλύονται σε νερό και συμπληρώνονται με νερό μέχρι 1 λίτρο Nερό αραίωσης από ανασύσταση Αναμειγνύονται 25 ml από κάθε ένα από τα τέσσερα αρχικά διαλύματα και συμπληρώνονται με νερό μέχρι 1 λίτρο. Αερίζεται μέχρις ότου η συγκέντρωση του διαλελυμένου οξυγόνου εξισωθεί με την τιμή κορεσμού με αέρα. Το pH πρέπει να είναι 7,8 ± 0,2 Το pH διορθώνεται αν είναι ανάγκη με NaOH (καυστικό νάτριο) ή HCl (υδροχλωρικό οξύ). Το νερό αραίωσης που παρασκευάζεται έτσι αφήνεται για 12 ώρες περίπου και δεν χρειάζεται περαιτέρω αερισμό. Το σύνολο των ιόντων Ca και Μg σ' αυτό το διάλυμα είναι 2,5 mmol/l. Η σχέση των ιόντων Ca:Mg είναι 4:1 και του Νa: Κ είναι 10:1. Η συνολική αλκαλικότητα του διαλύματος είναι 0,8 mmol/l. Oποιαδήποτε εκτροπή στην παρασκευή του νερού αραίωσης δεν πρέπει να αλλάζει τη σύσταση ή τις ιδιότητες του νερού. Προσάρτημα 2 >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> Συλλογή Τα ψάρια που αναφέρονται παραπάνω εκτρέφονται εύκολα ή/και είναι ευρέως διαθέσιμα κατά τη διάρκεια του χρόνου. Είναι δυνατό να τραφούν και καλλιεργηθούν είτε σε ιχθυοτροφεία είτε στο εργαστήριο, με συνθήκες ελεγχόμενες για παθήσεις και παράσιτα, έτσι που τα ζώα ελέγχου να είναι υγιή και από γνωστή καταγωγή. Αυτά τα ψάρια είναι διαθέσιμα σε πολλά μέρη του κόσμου. Προσάρτημα 3 Παράδειγμα συγκέντρωσης: εκατοστιαία θνησιμότητα >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ Παράδειγμα προσδιορισμού LC50 με χαρτί log-probit G.2. ΟΞΕΙΑ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ ΓΙΑ ΔΑΠΗΝΙΑ 1. ΜΕΘΟΔΟΣ 1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σκοπός του ελέγχου αυτού είναι να προσδιοριστεί η μέση αποτελεσματική συγκέντρωση μιας ουσίας για την ακινητοποίηση (EC50) σε Daphnia στο νερό. Η ύπαρξη όσο το δυνατόν περισσότερων πληροφοριών για τη διαλυτότητα στο νερό, την τάση ατμών, τη χημική σταθερότητα, τη σταθερή διάστασης και τη βιοδιασπασιμότητα της ουσίας είναι επιθυμητή πριν την έναρξη του ελέγχου. Συμπληρωματικές πληροφορίες (π.χ. συντακτικός τύπος, βαθμός καθαρότητας, φύση και ποσοστό των σημαντικών ξένων προσμείξεων, παρουσία και ποσότητα προσθέτων, και συντελεστής κατανομής σε n-οκτανόλη/νερό) πρέπει να ληφθούν υπόψη και στο σχεδιασμό του ελέγχου και στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων. 1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Η απαίτηση της οδηγίας για την τιμή LC50 για τη Daphnia πληρούται με τον προσδιορισμό της τιμής EC50 όπως περιγράφεται σ'αυτό τον έλεγχο. Η οξεία τοξικότητα σ'αυτό τον έλεγχο εκφράζεται σαν η μέση αποτελεσματική συγκέντρωση (EC50) για ακινητοποίηση. Η συγκέντρωση αυτή είναι η αρχική εκείνη συγκέντρωση η οποία ακινητοποιεί το 50% των Daphnia σε μια ομάδα ελέγχου για ένα συνεχές χρονικό διάστημα έκθεσης το οποίο πρέπει να δηλώνεται. Aκινητοποίηση: Τα ζώα εκείνα που δεν μπορούν να κολυμπήσουν μέσα σε 15 δευτερόλεπτα μετά την ελαφρά ανάδευση του δοχείου ελέγχου θεωρούνται ότι είναι ακινητοποιημένα. Όλες οι συγκεντρώσεις της ουσίας που εξετάζεται εκφράζονται σε βάρος κατ' όγκο (χιλιοστόγραμμα ανά λίτρο). Μπορούν επίσης να εκφράζονται σε βάρος κατά βάρος (mg.kg 1). 1.3. OΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία ουσία αναφοράς προκειμένου να αποδειχθεί ότι, κάτω από τις εργαστηριακές συνθήκες ελέγχου, η ευαισθησία του εξεταζόμενου είδους δεν άλλαξε σημαντικά. Στο Προσάρτημα 2 δίνεται μία σύνοψη των αποτελεσμάτων ενός διακοινοτικού τεστ, στο οποίο χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις διαφορετικές ουσίες . 1.4. AΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Μπορεί να εκτελεσθεί μία οριακή δοκιμή με 100 mg ανά λίτρο για να διαπιστωθεί αν η EC50 είναι μεγαλύτερη από τη συγκέντρωση αυτή. Τα Daphnia εκτίθενται στην εξεταζόμενη ουσία που προστίθεται στο νερό σε μια σειρά συγκεντρώσεων επί 48 ώρες. Αν ο χρόνος αυτός μειωθεί, θα πρέπει στην έκθεση ελέγχου να παρέχεται μία αιτιολόγηση. Για μια επαρκή σειρά συγκεντρώσεων της ελεγχόμενης ουσίας και κάτω από κατά τα άλλα παρόμοιες συνθήκες ελέγχου, διάφορες συγκεντρώσεις της ελεγχόμενης ουσίας ασκούν διαφορετικούς μέσους βαθμούς αποτελέσματος στην ικανότητα κολύμβησης των Daphnia. Διαφορετικές συγκεντρώσεις έχουν σαν αποτέλεσμα διαφορετικά ποσοστά των Daphnia, που στο τέλος του ελέγχου δεν μπορούν πλέον να κολυμβούν. Οι συγκεντρώσεις που προκαλούν 0 ή 100% ακινητοποίηση εξάγονται απ' ευθείας από τις παρατηρήσεις του ελέγχου ενώ η 48 άωρη EC50 προσδιορίζεται, αν είναι δυνατόν, με υπολογισμό. Στη μέθοδο αυτή χρησιμοποιείται στατικό σύστημα, συνεπώς τα διαλύματα ελέγχου δεν ανανεώνονται κατά τη διάρκεια της περιόδου έκθεσης. 1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Τα ποιοτικά κριτήρια έχουν εφαρμογή και στην οριακή δοκιμή και στην πλήρη δοκιμή. Η ακινητοποίηση στους συγκριτικούς ελέγχους (μάρτυρες) δεν πρέπει να υπερβαίνει το 10% στο τέλος του ελέγχου. Τα Daphnia των ομάδων ελέγχου (μάρτυρες) δεν πρέπει να παγιδεύονται στην επιφάνεια του νερού. Καλό είναι η συγκέντρωση του διαλελυμένου οξυγόνου στα δοχεία δοκιμών να παραμένει πάνω από τα 3 mg ανα λίτρο σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής. Εντούτοις, σε καμία περίπτωση η συγκέντρωση του διαλελυμένου οξυγόνου δεν θα πρέπει να πέφτει κάτω από τα 2 mg ανά λίτρο. Η συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας πρέπει να διατηρείται σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής πάνω από το 80 % της αρχικής συγκέντρωσης. Στις ουσίες που διαλύονται εύκολα στο περιβάλλον της δοκιμής, παρέχοντας σταθερά διαλύματα, δηλ. εκείνες που δεν εξατμίζονται, αποικοδομούνται, υδρολύονται ή προσροφώνται τουλάχιστον σε σημαντικό βαθμό, η αρχική συγκέντρωση μπορεί να λαμβάνεται σαν ισοδύναμη με την ονομαστική συγκέντρωση. Πρέπει να παρουσιάζονται στοιχεία ότι η συγκέντρωση διατηρείται σταθερή σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής και ότι ικανοποιούνται τα ποιοτικά κριτήρια. Για ουσίες που είναι: (i) ελάχιστα διαλυτές στο περιβάλλον της δοκιμής, ή (ii) ικανές να σχηματίζουν σταθερά γαλακτώματα ή διασπορές, ή (iii) μη σταθερές σε υδατικά διαλύματα, σαν αρχική συγκέντρωση θα λαμβάνεται η συγκέντρωση που μετριέται στο διάλυμα (ή, αν αυτό είναι τεχνικά αδύνατο, στη στήλη νερού) στην αρχή της δοκιμής. Η συγκέντρωση θα προσδιορίζεται μετά από μία περίοδο εξισορρόπησης αλλά πριν από την εισαγωγή των εξεταζόμενων οργανισμών. Σε όλες αυτές τις περιπτώσεις, θα πρέπει να γίνονται και άλλες μετρήσεις κατά τη διάρκεια της δοκιμής για να επιβεβαιώνονται οι πραγματικές συγκεντρώσεις έκθεσης ή ότι τηρούνται τα κριτήρια ποιότητος. Το pH δεν πρέπει να μεταβάλλεται περισσότερο από μία μονάδα. 1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 1.6.1. Αντιδραστήρια 1.6.1.1. Διαλύματα των ελεγχομένων ουσιών Αρχικά διαλύματα, της απαιτούμενης συγκέντρωσης, παρασκευάζονται με διάλυση της ουσίας σε απιονισμένο νερό ή νερό σύμφωνα με το σημείο 1.6.1.2. Οι επιλεγόμενες συγκεντρώσεις για τη δοκιμή, επιτυγχάνονται αραιώνοντας το αρχικό διάλυμα. Εάν η δοκιμή αναφέρεται σε υψηλές συγκεντρώσεις, η ουσία μπορεί να διαλύεται στο νερό αραίωσης απ'ευθείας. Oι ουσίες θα πρέπει κανονικά να εξετάζονται μόνο μέχρι το όριο διαλυτότητας. Για ορισμένες ουσίες (π.χ. ουσίες με μικρή υδατοδιαλυτότητα, ή υψηλό Pow, ή εκείνες που σχηματίζουν μία σταθερή διασπορά παρά πραγματικό διάλυμα στο νερό), είναι παραδεκτό να διενεργείται και μία δοκιμή με συγκέντρωση πάνω από το όριο διαλυτότητας της ουσίας για να διασφαλίζεται ότι επιτεύχθηκε πράγματι η μέγιστη σταθερά συγκέντρωση. Είναι εντούτοις σημαντικό, η συγκέντρωση αυτή να μην προκαλεί, για άλλη αιτία, διαταραχή στο σύστημα δοκιμής (π.χ. δημιουργία μιας μεμβράνης της ουσίας στην επιφάνεια του νερού εμποδίζοντας έτσι την οξυγόνωση του νερού, κ.λπ). Για να υποβοηθηθεί η παρασκευή των αρχικών διαλυμάτων των ουσιών με μικρή υδατοδιαλυτότητα ή η διασπορά των ουσιών αυτών στο διάλυμα δοκιμής, μπορούν να χρησιμοποιηθούν υπέρηχοι, οργανικοί διαλύτες, γαλακτωματοποιητές ή μέσα διασποράς. Όταν χρησιμοποιούνται αυτές οι βοηθητικές ουσίες, όλες οι συγκεντρώσεις δοκιμής θα πρέπει να περιέχουν την ίδια ποσότητα βοηθητικών ουσιών, ενώ θα πρέπει να εκτίθενται στην ίδια συγκέντρωση βοηθητικής ουσίας με εκείνη που χρησιμοποιείται στη σειρά των δοκιμών για Daphnia μάρτυρες. Η συγκέντρωση των βοηθητικών αυτών ουσιών θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν μικρότερη και σε καμία περίπτωση να μην υπερβαίνει τα 100 mg ανά λίτρο στο διάλυμα δοκιμής. Ο έλεγχος πρέπει να διενεργηθεί χωρίς ρύθμιση του pH. Αν υπάρχει απόδειξη σημαντικής μεταβολής του pH, συνιστάται επανάληψη του ελέγχου με ρύθμιση του pH και αναφορά των αποτελεσμάτων που θα ληφθούν. Σ'αυτή την περίπτωση, η τιμή pH του αρχικού διαλύματος πρέπει να ρυθμιστεί στο pH του νερού αραίωσης, εκτός αν ειδικοί λόγοι δεν το επιτρέπουν. Για το σκοπό αυτό προτιμούνται το ΗCl και το NaOH. Η ρύθμιση αυτή του pH πρέπει να γίνει έτσι, που να μην αλλάξει σημαντικά τη συγκέντρωση της ελεγχόμενης ουσίας στο αρχικό διάλυμα. Εάν από τη ρύθμιση του pH προκληθεί κάποια χημική αντίδραση ή φυσική καθίζηση της ουσίας, ο έλεγχος πρέπει να επαναληφθεί. 1.6.1.2. Nερό δοκιμής Στη δοκιμή αυτή χρησιμοποιείται νερό από ανασύσταση (βλ. Προσάρτημα 1 και παραπομπή (2): ISO 6341). Για να αποφευχθεί η ανάγκη ρύθμισης πριν από τη δοκιμή, συνιστάται το νερό καλλιέργειας να είναι της ίδιας ποιότητας (pH, σκληρότητα) με το νερό που χρησιμοποιείται για τη δοκιμή. 1.6.2. Συσκευή Πρέπει να χρησιμοποιηθούν κανονικές εργαστηριακές συσκευές και εξοπλισμός. Ο εξοπλισμός που θα έλθει σε επαφή με τα διαλύματα ελέγχου πρέπει, κατά προτίμηση, να είναι όλος από γυαλί: - μετρητής οξυγόνου (με μικροηλεκτρόδιο ή άλλο κατάλληλο εξάρτημα για τη μέτρηση οξυγόνου σε δείγματα μικρού όγκου), - κατάλληλα όργανα για τον έλεγχο της θερμοκρασίας, - πεχάμετρο, - εξοπλισμός για τον προσδιορισμό σκληρότητας του νερού. 1.6.3. Oργανισμοί χρησιμοποιούμενοι στη δοκιμή Προτιμάται το Daphnia magna, αν και είναι αποδεκτό και το Daphnia pulex. Τα ζώα θα πρέπει να είναι ηλικίας λιγότερο των 24 ωρών, στην αρχή της δοκιμής, να έχουν εκτραφεί σε εργαστήριο, να μην παρουσιάζουν οποιαδήποτε φανερή ασθένεια και να έχουν γνωστό ιστορικό (π.χ. διατροφή - τυχόν προετοιμασίες, κ.λπ.). 1.6.4. Διαδικασία ελέγχου Ένας προκαταρκτικός έλεγχος μπορεί να γίνει πριν από τον τελικό. Παρέχει πληροφορίες για την περιοχή συγκεντρώσεων που πρέπει να χρησιμοποιηθούν στον κυρίως έλεγχο. Eκτός από την σειρά των ελέγχων, διενεργείται ένας έλεγχος σύγκρισης χωρίς την εξεταζόμενη ουσία και, αν χρειάζεται, ένας συγκριτικός έλεγχος με τη βοηθητική ουσία. Τα Daphnia εκτίθενται στην ουσία όπως περιγράφεται παρακάτω: - διάρκεια: κατά προτίμηση 48 ώρες, - αριθμός ζώων: 20 τουλάχιστον ζώα για κάθε συγκέντρωση, μοιρασμένα κατά προτίμηση σε τέσσερις ομάδες των πέντε ζώων η καθεμία ή δύο ομάδες των δέκα. - φορτίο: για κάθε ζώο θα έπρεπε να αντιστοιχούν τουλάχιστον 2 ml διαλύματος ελέγχου, - συγκεντρώσεις ελέγχου: το διάλυμα ελέγχου θα πρέπει να παρασκευάζεται αμέσως πριν από την εισαγωγή των Daphnia, κατά προτίμηση χωρίς να χρησιμοποιηθεί οποιοσδήποτε άλλος διαλύτης εκτός από το νερό. Οι συγκεντρώσεις ακολουθούν μία γεωμετρική σειρά, με λόγο συγκεντρώσεων όχι πάνω από 2,2. Συγκεντρώσεις που μπορούν να παράσχουν ποσοστό ακινητοποίησης 0% και 100% μετά από 48 ώρες καθώς και μία περιοχή ενδιάμεσων βαθμών ακινητοποίησης θα πρέπει να δοκιμάζονται μαζί με μάρτυρες, ώστε να μπορεί να υπολογισθεί η LC50 των 48 ωρών. - νερό: βλέπε σημείο 1.6.1.2., - φως: ο κύκλος εναλλαγής φωτός-σκοταδιού είναι προαιρετικός. - θερμοκρασία: η θερμοκρασία ελέγχου πρέπει να είναι μεταξύ 18 και 22  C, αλλά για καθένα έλεγχο ξεχωριστά πρέπει να είναι σταθερή κατά ± 1,0  C. - αερισμός: τα διαλύματα ελέγχου δεν πρέπει να αερίζονται με φυσαλίδες αέρα, - διατροφή: καθόλου. Το pH και η συγκέντρωση οξυγόνου στους μάρτυρες και όλων των ελεγχόμενων συγκεντρώσεων πρέπει να μετριέται στο τέλος του ελέγχου G το pH του διαλύματος ελέγχου δεν πρέπει να τροποποιηθεί. Πτητικές ενώσεις πρέπει να ελεγχθούν σε δοχεία εντελώς γεμάτα κλειστά, αρκετά μεγάλα ώστε να μην παρατηρηθεί έλλειψη οξυγόνου. Τα Daphnia επιθεωρούνται τουλάχιστον μετά από έκθεση 24 ωρών και πάλι μετά από 48 ώρες. Οριακή δοκιμή Χρησιμοποιώντας τις διαδικασίες που περιγράφονται σ'αυτή τη μέθοδο δοκιμής, μπορεί να εκτελεσθεί μία οριακή δοκιμή με 100 mg ανά λίτρο για να διαπιστωθεί αν η LC50 είναι μεγαλύτερη από αυτή τη συγκέντρωση. Αν η φύση της ουσίας είναι τέτοια ώστε να μη μπορεί να επιτευχθεί στο νερό της δοκιμής συγκέντρωση 100 mg ανά λίτρο, η οριακή δοκιμή θα πρέπει να εκτελείται με συγκέντρωση ίση με τη διαλυτότητα της ουσίας (ή τη μέγιστη συγκέντρωση που οδηγεί σε μία σταθερή διασπορά) στο χρησιμοποιούμενο μέσον (βλ. επίσης 1.6.1.1.). Η οριακή δοκιμή θα πρέπει να εκτελείται χρησιμοποιώντας 20 Daphnia, διαιρούμενα σε δύο ή τέσσερις ομάδες, με τον ίδιο αριθμό μαρτύρων. Εάν επέλθει ακινητοποίηση, πρέπει να εκτελεσθεί πλήρης μελέτη. 2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ Για κάθε περίοδο για την οποία καταγράφηκαν παρατηρήσεις (24 και 48 ώρες), χαράσσεται καμπύλη ποσοστού θνησιμότητας σαν συνάρτηση της συγκέντρωσης σε λογαριθμικό χαρτί. Όπου είναι δυνατόν και για κάθε χρονικό σημείο παρατήρησης, θα πρέπει να εκτιμώνται η EC50 και τα όρια εμπιστοσύνης (p = 0,05) χρησιμοποιώντας πρότυπες διαδικασίες G οι τιμές αυτές θα πρέπει να στρογγυλοποιούνται σε ένα, το πολύ δύο σημαντικά ψηφία (παραδείγματα στρογγυλοποίησης σε δύο ψηφία: 170 για 173,5, 0,13 για 0,127, 1,2 για 1,21). Στις περιπτώσεις εκείνες όπου η κλίση της καμπύλης της συγκέντρωσης/ποσοστού απόκρισης είναι πολύ μεγάλη για να επιτρέψει τον υπολογισμό της EC50, είναι αρκετή μια γραφική εκτίμηση της τιμής αυτής. Όταν δύο διαδοχικές συγκεντρώσεις με σχέση 2,2 δίνουν μόνο 0 και 100% ποσοστά ακινητοποίησης, οι δύο αυτές τιμές αρκούν για να υποδείξουν την περιοχή στην οποία ευρίσκεται η EC50. Aν παρατηρηθεί ότι η σταθερότητα ή η ομοιογένεια της εξεταζόμενης ουσίας δεν μπορεί να διατηρηθεί, το γεγονός αυτό θα πρέπει να αναφέρεται και να λαμβάνεται υπόψη στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων. 3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες: - πληροφορίες για τον εξεταζόμενο οργανισμό (επιστημονική ονομασία, φυλή, προμηθευτή ή πηγή, κάθε προετοιμασία, μέθοδος εκτροφής - συμπεριλαμβανομένης της πηγής, είδος και ποσότητα της τροφής, συχνότητα διατροφής) G - πηγή νερού αραίωσης και κυριώτερα χημικά χαρακτηριστικά (pH, σκληρότητα, θερμοκρασία) G - στην περίπτωση ουσίας με χαμηλή υδατοδιαλυτότητα, τη μέθοδο παρασκευής του αρχικού και του διαλύματος δοκιμής G - συγκέντρωση κάθε βοηθητικής ουσίας G - πίνακα των χρησιμοποιηθεισών συγκεντρώσεων και κάθε διαθέσιμη πληροφορία για τη σταθερότητα των συγκεντρώσεων της εξετασθείσης ουσίας στα διαλύματα δοκιμής G - αν εκτελούνται χημικές αναλύσεις, οι χρησιμοποιηθείσες μέθοδοι και τα ληφθέντα αποτελέσματα G - αποτελέσματα της οριακής δοκιμής, αν έγινε G - περιγραφή του εξοπλισμού G - πρόγραμμα φωτισμού G - συγκεντρώσεις διαλελυμένου οξυγόνου, τιμές pH και θερμοκρασίες των διαλυμάτων δοκιμής G - στοιχεία ότι τηρήθηκαν τα ποιοτικά κριτήρια G - πίνακα με την ολική ακινητοποίηση σε κάθε συγκέντρωση και στο μάρτυρα (και στο μάρτυρα με τη βοηθητική ουσία αν απαιτείται) σε κάθε προβλεπόμενο χρονικό σημείο παρατήρησης (24 ώρες και 48 ώρες) G - γραφική παράσταση της καμπύλης συγκέντρωσης/ποσοστού απόκρισης στο τέλος της δοκιμής G - εάν είναι δυνατόν, τις τιμές EC50 σε κάθε ένα από τα προβλεπόμενα χρονικά σημεία παρατήρησης (με 95% όριο εμπιστοσύνης) G - τις στατιστικές μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των τιμών EC50 G - αν χρησιμοποιείται ουσία αναφοράς, τα ληφθέντα αποτελέσματα G - τη μεγαλύτερη από τις συγκεντρώσεις δοκιμής που δεν προκαλεί ακινητοποίηση στο χρονικό διάστημα της δοκιμής G - τη χαμηλότερη από τις συγκεντρώσεις δοκιμής που προκαλεί 100% ακινητοποίηση στο χρονικό διάστημα της δοκιμής. 4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates. (2) International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341- 1989 (3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera - crustacea) NFT 90 301 (January 1983). (4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grundlagen fόr die Okotoxikologisch Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengeset, ecomed 1986. (5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11). (6) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K. (7) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, 99-113. (8) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821. (9) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32. (10) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1978, STP 634, 65-84. (11) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer programm for calculating an LC50. US EPA. Προσάτημα 1 Νερό από ανασύσταση Παράδειγμα κατάλληλου νερού αραίωσης (σύμφωνα με το ISO 6341) Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να είναι αναλυτικού βαθμού. Το νερό πρέπει να είναι καλής ποιότητας απεσταγμένο νερό, ή απιονισμένο νερό, με αγωγιμότητα μικρότερη από 5 μScm 1. H συσκευή για την απόσταξη του νερού, δεν πρέπει να περιλαμβάνει κανένα τμήμα κατασκευασμένο από χαλκό. Αρχικό διάλυμα CaCl2.2H2O (δι-υδροχλωριούχο ασβέστιο) 11,76 g διαλύονται σε νερό και συμπληρώνονται μέχρι 1 λίτρο με νερό MgSO4.7H2O (επτα-υδροθειικό μαγνήσιο) 4,93 g διαλύονται σε νερό και συμπληρώνονται μέχρι 1 λίτρο με νερό NaHCO2 (όξινο ανθρακικό νάτριο) 2,59 g διαλύονται σε νερό και συμπληρώνονται μέχρι 1 λίτρο με νερό KCl (χλωριούχο κάλιο) 0,23 g διαλύονται σε νερό και συμπληρώνονται μέχρι 1 λίτρο με νερό Nερό αραίωσης από ανασύσταση Ανακατεύονται 25 ml από καθένα από τα τέσσερα αρχικά διαλύματα και συμπληρώνονται με νερό μέχρι 1 λίτρο. Αερίζεται μέχρις ότου η συγκέντρωση του διαλελυμένου οξυγόνου εξισωθεί με την τιμή κορεσμού με αέρα. Το pH θα πρέπει να είναι 7,8 ± 0,2. Το pH ρυθμίζεται, αν είναι ανάγκη, με NaOH (καυστικό νάτριο) ή HCl (υδροχλωρικό οξύ). Το νερό αραίωσης που παρασκευάζεται έτσι αφήνεται για 12 περίπου ώρες και δεν χρειάζεται περαιτέρω αερισμό. Το σύνολο των ιόντων Ca και Mg σαυτό το διάλυμα είναι 2,5 mmol/l. Η σχέση των ιόντων Ca: Mg είναι 4:1 και των Na: K 10:1. Η συνολική αλκαλικότητα του διαλύματος είναι 0,8 mmol/l. Οποιαδήποτε εκτροπή στην παρασκευή του νερού αραίωσης δεν πρέπει να αλλάζει τη σύσταση ή τις ιδιότητες του νερού. Προσάρτημα 2 Σύνοψη των αποτελεσμάτων μιας διακοινοτικής δοκιμής που έγινε το 1978 (αναφέρεται επίσης στην παραπομπή 2) Προσοχή: Σκοπός του διακοινοτικού αυτού τεστ ήταν ο προσδιορισμός της EC50 24 h. Xρησιμοποιηθείσες ουσίες: 1) Διχρωμικό κάλιο 2) Τετραπροπυλοβενζολοσουλφονικό οξύ 3) Τετραπροπυλοβενζολοσουλφονικό οξύ, άλας με νάτριο 4) Τριχλωρο-2,4,5,-φαινοξυοξικό οξύ, άλας με κάλιο >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> Προσάρτημα 3 Παράδειγμα συγκέντρωσης: ακινητοποίηση επί τοις εκατό >ΑΡΧΗ ΓΡΑΦΙΚΟΥ>>ΤΕΛΟΣ ΓΡΑΦΙΚΟΥ> Παράδειγμα προσδιορισμού EC50 με log-probit χαρτί Γ.3. ΔΟΚΙΜΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΣΕ ΦΥΚΙΑ 1. MΕΘΟΔΟΣ 1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σκοπός της δοκιμής αυτής είναι να προσδιορισθούν οι επιδράσεις μιας ουσίας στην ανάπτυξη ενός μονοκυτταρικού πράσινου είδους φυκιού. Με σχετικά σύντομες (72 ώρες) δοκιμές μπορούν να εκτιμηθούν οι επιδράσεις σε διάφορες γενεές. Η μέθοδος αυτή μπορεί να προσαρμοσθεί προκειμένου να χρησιμοποιηθεί με διάφορα μονοκύτταρα είδη φυκιών, οπότε στην έκθεση δοκιμής πρέπει να υπάρχει και μία περιγραφή της χρησιμοποιηθείσας μεθόδου. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται ευκολότατα σε υδατοδιαλυτές ουσίες οι οποίες, στις συνθήκες της δοκιμής, είναι πιθανόν να παραμείνουν στο νερό. Η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ουσίες που δεν παρεμβαίνουν άμεσα στη μέτρηση της ανάπτυξης των φυκιών. Είναι σκόπιμο να υπάρχουν, όσο το δυνατόν, στοιχεία σχετικά με την υδατοδιαλυτότητα, την τάση ατμών, τη χημική σταθερότητα, τις σταθερές διάστασης και τη βιοαποικοδομησιμότητα της ουσίας πριν από την έναρξη της δοκιμής. Τόσο στο σχεδιασμό της δοκιμής, όσο και στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη πρόσθετες πληροφορίες (π.χ. ο συντακτικός τύπος, ο βαθμός καθαρότητας, η φύση και το ποσοστό των σημαντικότερων προσμείξεων, η τυχόν ύπαρξη και η ποσότητα προσθέτων και ο συντελεστής κατανομής σε n-οκτανόλη/νερό) 1.2. ΟΡΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΜΟΝΑΔΕΣ Πυκνότητα κυττάρων: ο αριθμός των κυττάρων ανά χιλιοστόλιτρο G Ρυθμός ανάπτυξης: η αύξηση της πυκνότητας των κυττάρων ανά μονάδα χρόνου G EC50: Στη μέθοδο αυτή, σαν EC50 νοείται η συγκέντρωση εκείνη της εξεταζόμενης ουσίας που έχει σαν αποτέλεσμα μία μείωση κατά 50 % είτε της ανάπτυξης (EbC50) είτε του ρυθμού ανάπτυξης (ErC50) σε σχέση με το μάρτυρα G ΣΜΠΕ (συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης): Στη μέθοδο αυτή, σαν ΣΜΠΕ νοείται η μεγαλύτερη δοκιμαζόμενη συγκέντρωση στην οποία δεν παρατηρείται καμία σημαντική αναστολή της ανάπτυξης σε σχέση με το μάρτυρα. Όλες οι συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης ουσίας εκφράζονται σε βάρος κατ' όγκο (χιλιοστόγραμμα ανά λίτρο). Μπορούν επίσης να εκφράζονται σε βάρος κατά βάρος (mg.kg 1). 1.3. OYΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Σαν μέσον απόδειξης ότι στις συνθήκες της εργαστηριακής δοκιμής δεν αλλάζει σημαντικά η ευαισθησία του εξεταζόμενου είδους, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μία ουσία αναφοράς. Αν χρησιμοποιηθεί μια ουσία αναφοράς, τα αποτελέσματα θα πρέπει να περιλαμβάνονται στην έκθεση δοκιμής. Σαν ουσία αναφοράς μπορεί να χρησιμοποιηθεί το διχρωμικό κάλιο, το χρώμα του όμως μπορεί να επηρεάσει την ποιότητα και ένταση του φωτός που φθάνει στα κύτταρα καθώς επίσης και τους φασματοφωτομετρικούς προσδιορισμούς αν περιλαμβάνονται. Το διχρωμικό κάλιο χρησιμοποιείται σε διεθνή διεργαστηριακή δοκιμή (βλ. παραπομπή (3) και Προσάρτημα 2). 1.4. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Μπορεί να πραγματοποιηθεί και μία οριακή δοκιμή με 100 mg ανά λίτρο προκειμένου να διαπιστωθεί αν η EC50 είναι μεγαλύτερη από τη συγκέντρωση αυτή. Καλλιέργειες πράσινων φυκιών που αναπτύσσονται εκθετικά, εκτίθενται σε διάφορες συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης ουσίας για αρκετές γενεές κάτω από καθορισμένες συνθήκες. Τα εξεταζόμενα διαλύματα επωάζονται για 72 ώρες, στη διάρκεια της οποίας μετριέται σε καθένα η πυκνότητα κυττάρων τουλάχιστον κάθε 24 ώρες. Προσδιορίζεται η αναστολή της ανάπτυξης σε σχέση με μια καλλιέργεια-μάρτυρα. 1.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Τα ποιοτικά κριτήρια έχουν εφαρμογή και στην οριακή δοκιμή και στη μέθοδο πλήρους δοκιμής. Η πυκνότητα των κυττάρων στις καλλιέργειες-μάρτυρες θα πρέπει να έχει αυξηθεί μέσα σε τρεις ημέρες κατά 16 τουλάχιστον φορές. Καθ' όλη τη διάρκεια της δοκιμής, οι συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης ουσίας πρέπει να διατηρούνται σε τιμή πάνω από το 80 % των αρχικών συγκεντρώσεων. Σε ουσίες που διαλύονται εύκολα στο διάλυμα δοκιμής, παρέχοντας σταθερά διαλύματα δηλ. εκείνες που δεν εξατμίζονται, αποικοδομούνται, υδρολύονται ή απορροφώνται τουλάχιστον σε σημαντικό βαθμό, η αρχική συγκέντρωση μπορεί να λαμβάνεται ως ισοδύναμη με την ονομαστική συγκέντρωση. Πρέπει να παρουσιάζονται στοιχεία που να δείχνουν ότι οι συγκεντρώσεις διατηρήθηκαν σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής και ότι ικανοποιήθηκαν τα ποιοτικά κριτήρια. Για ουσίες που είναι: (i) πολύ λίγο διαλυτές στο περιβάλλον της δοκιμής, ή (ii) ικανές να σχηματίσουν σταθερά γαλακτώματα ή διασπορές, ή (iii) μη σταθερές σε υδατικά διαλύματα, σαν αρχική συγκέντρωση θα λαμβάνεται η συγκέντρωση που μετριέται στην αρχή της δοκιμής. Η συγκέντρωση πρέπει να προσδιορίζεται μετά από ένα χρονικό διάστημα εξισορρόπησης. Σε όλες αυτές τις περιπτώσεις , θα πρέπει να γίνονται και άλλες μετρήσεις κατά τη διάρκεια της δοκιμής για να επιβεβαιώνονται οι πραγματικές συγκεντρώσεις έκθεσης ή ότι τηρούνται τα κριτήρια ποιότητος. Είναι αναγνωρισμένο ότι κατά τη διάρκεια της δοκιμής σημαντικές ποσότητες της εξεταζόμενης ουσίας μπορεί να ενσωματώνονται στη βιομάζα των φυκιών. Συνεπώς, προκειμένου να καταδειχθεί ότι τηρούνται τα ανωτέρω ποιοτικά κριτήρια, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόφη και η ποσότητα της ουσίας που ενσωματώνεται στη βιομάζα των φυκιών και η ουσία που είναι στο διάλυμα (ή, αν δεν είναι τεχνικά δυνατό, που μετριέται στη στήλη νερού). Εντούτοις, δεδομένου ότι ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της ουσίας στη βιομάζα των φυκιών μπορεί να δημιουργήσει σημαντικά προβλήματα από τεχνικής πλευράς, η συμμόρφωση με τα ποιοτικά κριτήρια μπορεί να καταδειχθεί χρησιμοποιώντας ένα δοχείο δοκιμής με τη μέγιστη συγκέντρωση ουσίας αλλά χωρίς φύκια και μετρώντας τις συγκεντρώσεις στο διάλυμα (ή, αν αυτό δεν είναι τεχνικά δυνατό, στη στήλη νερού) στην αρχή και στο τέλος της περιόδου δοκιμής. 1.6. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 1.6.1. Αντιδραστήρια 1.6.1.1. Διαλύματα των εξεταζόμενων ουσιών Παρασκευάζονται αρχικά διαλύματα της απαιτούμενης συγκέντρωσης, διαλύοντας την ουσία σε απιονισμένο νερό ή νερό σύμφωνο με το 1.6.1.2. Οι επιλεγόμενες συγκεντρώσεις δοκιμής επιτυγχάνονται προσθέτοντας την κατάλληλη ποσότητα σε προκαλλιέργειες φυκιών (βλ. Προσάρτημα 1). Οι ουσίες θα πρέπει κανονικά να εξετάζονται μόνο μέχρι το όριο διαλυτότητας. Σε ορισμένες ουσίες (π.χ. ουσίες με χαμηλή υδατοδιαλυτότητα, ή υψηλό Pow, ή εκείνες που σχηματίζουν σταθερή διασπορά αντί για πραγματικό διάλυμα στο νερό), είναι αποδεκτό να γίνει μια δοκιμή με συγκέντρωση πάνω από το όριο διαλυτότητας της ουσίας για να διασφαλίζεται ότι επιτεύχθηκε η μέγιστη/ σταθερή συγκέντρωση. Είναι εντούτοις σημαντικό, η συγκέντρωση αυτή να μη διαταράσσει με κάποιο άλλο τρόπο το σύστημα δοκιμής (π.χ. με τη δημιουργία μιας μεμβράνης της ουσίας στην επιφάνεια του νερού παρεμποδίζοντας έτσι την οξυγόνωση του νερού, κ.λπ.). Για να υποβοηθεί η παρασκευή των αρχικών διαλυμάτων των ουσιών με χαμηλή υδατοδιαλυτότητα ή η διασπορά των ουσιών αυτών στο περιβάλλον της δοκιμής, μπορούν να χρησιμοποιηθούν υπέρηχοι, οργανικοί διαλύτες, γαλακτωματοποιητές ή μέσα διασποράς. Όταν χρησιμοποιούνται αυτές οι βοηθητικές ουσίες, τα διαλύματα όλων των συγκεντρώσεων θα πρέπει να περιέχουν την ίδια ποσότητα βοηθητικών ουσιών, ενώ στην ίδια συγκέντρωση βοηθητικής ουσίας, με εκείνη που χρησιμοποιείται στη σειρά δοκιμών, θα πρέπει να εκτίθενται και πρόσθετοι μάρτυρες. Η συγκέντρωση αυτών των βοηθητικών ουσιών θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν μικρότερη, σε καμία περίπτωση όμως δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα 100 mg ανά λίτρο στο περιβάλλον της δοκιμής. Η δοκιμή θα πρέπει να πραγματοποιείται χωρίς ρύθμιση του pH. Αν υπάρχουν ενδείξεις ότι επήλθε κάποια αξιοσημείωτη μεταβολή στο pH, συνιστάται η δοκιμή να επαναλαμβάνεται αφού ρυθμισθεί το pH και να αναφέρονται τα αποτελέσματα. Στην περίπτωση αυτή, η τιμή pH του αρχικού διαλύματος θα πρέπει να ρυθμίζεται στην τιμή του pH του νερού αραίωσης, εκτός κι αν υπάρχουν ειδικοί λόγοι που δεν το επιτρέπουν. Για το σκοπό αυτό μπορούν να χρησιμοποιηθούν HCl και NaOH. Η ρύθμιση αυτή του pH θα πρέπει να γίνεται με τέτοιο τρόπο ώστε η συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας στο αρχικό διάλυμα να μη μεταβάλλεται, τουλάχιστον σημαντικά. Εάν με τη ρύθμιση προκληθεί κάποια χημική αντίδραση ή φυσική καθίζηση της εξεταζόμενης ουσίας, αυτό θα πρέπει να αναφέρεται στην έκθεση. 1.6.1.2. Περιβάλλον δοκιμής Το νερό θα πρέπει να είναι απεσταγμένο νερό καλής ποιότητας ή απιονισμένο νερό με αγωγιμότητα μικρότερη από 5 μS.cm 1. Η συσκευή απόσταξης του νερού δεν πρέπει να περιέχει κανένα τμήμα κατασκευασμένο από χαλκό. Συνιστάται το ακόλουθο περιβάλλον. Παρασκευάζονται σύμφωνα με τον πίνακα που ακολουθεί, τέσσερα αρχικά διαλύματα. Τα αρχικά διαλύματα αποστειρώνονται με διήθηση μέσω μεμβράνης ή σε αυτόκλειστο, και φυλάσσονται στο σκοτάδι στους 4  C. Το αρχικό διάλυμα αρ. 4 θα πρέπει να αποστειρώνεται μόνο με διήθηση μέσω μεμβράνης. Τα αρχικά αυτά διαλύματα αραιώνονται ώστε να επιτευχθούν οι τελικές συγκεντρώσεις θρεπτικών ουσιών στα διαλύματα της δοκιμής. >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> Το pH του μέσου μετά τήν εξισορρόπηση με αέρα είναι περίπου 8. 1.6.2. Συσκευή - Συνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός - Φιάλες δοκιμών κατάλληλου όγκου (π.χ. όταν ο όγκος του διαλύματος δοκιμής είναι 100 ml, κατάλληλης eνnai κωνικής φιάλης των 250 ml). Όλες οι φιάλες δοκιμής θα πρέπει να είναι ίδιες όσον αφορά το υλικό και τις διαστάσεις - Συσκευή καλλιέργειας: θάλαμος στον οποίο μπορεί να διατηρηθεί μία θερμοκρασία της τάξης των 21 έως 25  C με ανοχή ± 2  C, και να παρέχεται συνεχής ομοιόμορφος φωτισμός μήκους κύματος 400 έως 700 nm. Εάν τα φύκια στις καλλιέργειες-μάρτυρες επιτύχουν τους αποδεκτούς ρυθμούς ανάπτυξης, μπορεί να θεωρηθεί ότι οι συνθήκες ανάπτυξης, συμπεριλαμβανομένης και της έντασης του φωτός, ήταν σωστές. Στο μέσο επίπεδο των διαλυμάτων δοκιμής, συνιστάται να χρησιμοποιείται ένταση φωτός από 60 έως 120 μΕ.m 2.s 1 (35 έως 70Χ1018 φωτόνια.m 2.s 1) όταν η μέτρηση γίνεται στα 400 έως 700 nm χρησιμοποιώντας κατάλληλο δέκτη. Στην περίπτωση οργάνων μέτρησης φωτός βαθμονομημένων σε lux είναι αποδεκτή μία ισοδύναμη περιοχή 6 000 έως 10 000 lx. Η επιθυμητή ένταση φωτός μπορεί να επιτευχθεί χρησιμοποιώντας τέσσερις έως επτά λάμπες φθορισμού των 30 W διεθνούς λευκού τύπου (θερμοκρασία χρώματος περίπου 4 300 Κ), σε απόσταση 0,35 m από την καλλιέργεια των φυκιών. - Oι μετρήσεις πυκνότητας των κυττάρων θα πρέπει να γίνονται χρησιμοποιώντας μία μέθοδο άμεσης μέτρησης ζώντων κυττάρων, π.χ. ένα μικροσκόπιο με θαλάμους καταμέτρησης. Μπορούν πάντως να χρησιμοποιηθούν και άλλες μέθοδοι (φωτομετρία, στροβιλιδομετρία, ...) αν είναι αρκούντως ευαίσθητες και αν μπορούν να παράσχουν ικανοποιητικό συσχετισμό με την πυκνότητα των κυττάρων. 1.6.3. Οργανισμοί κατάλληλοι για τη δοκιμή Το είδος των χρησιμοποιούμενων πράσινων φυκιών συνιστάται να είναι ένα ταχυαναπτυσσόμενο είδος κατάλληλο για καλλιέργεια και δοκιμή. Προτιμούνται τα ακόλουθα είδη: - Selenastrum capricornutum, π.χ. ΑΤCC 22662 ή CCAP 278/4, - Scenedesmus subspicatus, π.χ. 86.81 SAG Σημείωση: ATCC = American Type Culture Collection (U.S.A.) CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (U.K.) SAG = Collection of algal culture (Gottingen, F.R.G.) Αν χρησιμοποιηθούν άλλα είδη, θα πρέπει να αναφέρονται τα στελέχη. 1.6.4. Διαδικασία δοκιμής Η περιοχή συγκεντρώσεων στην οποία είναι πιθανόν να επέλθουν επιδράσεις, προσδιορίζεται με βάση τα αποτελέσματα προκαταρκτικών διερευνητικών δοκιμών. Οι δύο μετρήσεις σχετικά με την ανάπτυξη (βιομάζα και ρυθμός ανάπτυξης) μπορεί να καταλήξουν σε πολύ διαφορετικές μετρήσεις αναστολής της ανάπτυξης G και οι δύο θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν στη διερευνητική δοκιμή για να εξασφαλισθεί ότι η γεωμετρική πρόοδος των συγκεντρώσεων θα επιτρέψει την εκτίμηση και της ΕbC50 και της ErC50. Αρχική πυκνότητα κυττάρων Η αρχική πυκνότητα των κυττάρων στις καλλιέργειες δοκιμής συνιστάται να είναι περίπου 104 κύτταρα/ml για το Selenastrum capricornutum και το Scenedesmus subspicatus. Όταν χρησιμοποιούνται άλλα είδη η βιομάζα θα πρέπει να είναι συγκρίσιμη. Συγκεντρώσεις εξεταζόμενης ουσίας Για τη δοκιμή, παρασκευάζονται τουλάχιστον πέντε συγκεντρώσεις σε γεωμετρική σειρά με λόγο συγκεντρώσεων όχι μεγαλύτερο του 2,2. Στη δοκιμή με τη μικρότερη συγκέντρωση δεν θα πρέπει να παρατηρείται καμία επίδραση στην ανάπτυξη των φυκιών. Στη δοκιμή με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση θα πρέπει η ανάπτυξη να αναστέλλεται τουλάχιστον κατά 50% σε σχέση με το μάρτυρα και, κατά προτίμηση, να σταματάει τελείως. Eπαναλήψεις και μάρτυρες Το πρόγραμμα δοκιμών θα πρέπει να προβλέπει τρεις επαναλήψεις σε κάθε συγκέντρωση. Διενεργούνται τρεις δοκιμές μαρτυρίας χωρίς την εξεταζόμενη ουσία και, εφόσον χρειάζεται, τρεις δοκιμές μαρτυρίας με τη βοηθητική ουσία. Εφόσον δικαιολογείται, το σχέδιο δοκιμών μπορεί να τροποποιηθεί προκειμένου να αυξηθούν οι συγκεντρώσεις και να μειωθεί ο αριθμός των επαναλήψεων ανά συγκέντρωση. Εκτέλεση της δοκιμής Παρασκευάζονται καλλιέργειες με τις επιθυμητές συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης ουσίας και την επιθυμητή ποσότητα εμβολίου φυκιών προσθέτοντας τις κατάλληλες ποσότητες αρχικών διαλυμάτων της εξεταζόμενης ουσίας σε κατάλληλες ποσότητες προκαλλιεργειών φυκιών (βλ. Προσάρτημα 1). Οι φιάλες καλλιέργειας ανακινούνται και τοποθετούνται στη συσκευή καλλιέργειας. Τα κύτταρα από τα φύκια διατηρούνται σε μορφή εναιωρήματος με ανακίνηση, ανάδευση ή εισαγωγή με αέρα, για να βελτιωθεί η ανταλλαγή αερίων και να μειωθεί η διακύμανση του pH στα διαλύματα δοκιμής. Οι καλλιέργειες θα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία της τάξης των 21 έως 25  C με ανοχή ± 2  C. Η πυκνότητα των κυττάρων σε κάθε φιάλη προσδιορίζεται τουλάχιστον στις 24, 48 και 72 ώρες μετά από την έναρξη της δοκιμής. Για τον προσδιορισμό του υποστρώματος, όταν η μέτρηση της πυκνότητας των κυττάρων δεν γίνεται με τη μέθοδο της άμεσης καταμέτρησης αλλά με κάποια άλλη μέθοδο, χρησιμοποιείται διηθημένο μέσο φυκιών που περιέχει την κατάλληλη συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας. Το pH μετράται στην αρχή της δοκιμής και στις 72 ώρες. Το pH των μαρτύρων δεν θα πρέπει κανονικά να αποκλίνει περισσότερο από 1,5 μονάδες κατά τη διάρκεια της δοκιμής. Δοκιμασία πτητικών ουσιών Μέχρι τώρα δεν υπάρχει κάποιος τρόπος γενικά αποδεκτός για τη δοκιμασία πτητικών ουσιών. Όταν μία ουσία είναι γνωστό ότι έχει την τάση να εξατμίζεται, μπορούν να χρησιμοποιηθούν κλειστές φιάλες δοκιμής με αυξημένο κενό χώρο στο πάνω μέρος. Κατά τον υπολογισμό του κενού χώρου των κλειστών φιαλών, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η πιθανότητα ανεπάρκειας CO2. Στη μέθοδο αυτή έχουν προταθεί διάφορες παραλλαγές [βλ. παραπομπή (4)]. Θα πρέπει να γίνονται προσπάθειες για να προσδιορισθεί η ποσότητα της ουσίας που παραμένει εν διαλύσει, και συνιστάται μέγιστη προσοχή όταν γίνεται ερμηνεία αποτελεσμάτων δοκιμών με πτητικές ουσίες σε κλειστά συστήματα. Οριακή δοκιμή Χρησιμοποιώντας τις διαδικασίες που περιγράφονται σ' αυτή τη μέθοδο , μπορεί να πραγματοποιηθεί οριακή δοκιμή με 100 mg ανά λίτρο για να διαπιστωθεί αν η EC50 είναι μεγαλύτερη από τη συγκέντρωση αυτή. Αν η φύση της ουσίας είναι τέτοια ώστε να μη μπορεί να επιτευχθεί συγκέντρωση 100 mg ανά λίτρο στο νερό δοκιμής, η οριακή δοκιμή θα πρέπει να εκτελείται σε συγκέντρωση ίση με τη διαλυτότητα της ουσίας (ή με τη μέγιστη συγκέντρωση που σχηματίζει σταθερή διασπορά) στο χρησιμοποιούμενο μέσον (βλ. επίσης σημείο 1.6.1.1). Η οριακή δοκιμή θα πρέπει να εκτελείται τουλάχιστον τρεις φορές, με τον ίδιο αριθμό μαρτύρων. Για την οριακή δοκιμή θα πρέπει να χρησιμοποιούνται τα δύο μέτρα ανάπτυξης (βιομάζα και ρυθμός ανάπτυξης). Εάν, σε μια οριακή δοκιμή, διαπιστωθεί μία μέση μείωση 25% ή παραπάνω είτε στη βιομάζα είτε στο ρυθμό ανάπτυξης μεταξύ οριακής δοκιμής και μάρτυρα, τότε θα πρέπει να πραγματοποιείται πλήρης δοκιμή. 2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ Η μετρούμενη πυκνότητα κυττάρων στις εξεταζόμενες καλλιέργειες και στους μάρτυρες καταγράφεται σε πίνακα μαζί με τις συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης ουσίας και τους χρόνους μετρήσεων. Σημειώνεται σε χαρτί η μέση τιμή της πυκνότητας των κυττάρων για κάθε συγκέντρωση της ουσίας δοκιμής και για τους μάρτυρες σε συνάρτηση με το χρόνο (0-72 ώρες) και χαράσσονται οι καμπύλες ανάπτυξης. Για να προσδιορισθεί η σχέση συγκέντρωσης/επίδρασης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν οι ακόλουθες δύο προσεγγίσεις. Ορισμένες ουσίες σε χαμηλές συγκεντρώσεις μπορεί να τονώνουν την ανάπτυξη. Θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη μόνο στοιχεία που εμφανίζουν αναστολή μεταξύ 0 και 100%. 2.1. ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΚΑΤΩ ΑΠΟ ΤΙΣ ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Η περιοχή μεταξύ των καμπύλων ανάπτυξης και της οριζόντιας γραμμής Ν = Ν0 μπορεί να υπολογισθεί σύμφωνα με τον τύπο:  A = N1   N02 Χ t1 + N1 + N2   2N0 2 Χ (t2   t1) + ...2Nn 1 + Nn   2N0 2 Χ (tn   tn 1) όπου A = εμβαδόν, N0 = αριθμός κυττάρων/ml τη χρονική στιγμή t0 (έναρξη της δοκιμής), N1 = μετρούμενος αριθμός κυττάρων/ml τη χρονική στιγμή t1, Nn = μετρούμενος αριθμός κυττάρων/ml τη χρονική στιγμή tn, t1 = χρόνος πρώτης μέτρησης μετά την έναρξη της δοκιμής, tn = χρόνος νιοστής μέτρησης μετά την έναρξη της δοκιμής, n = αριθμός μετρήσεων που ελήφθησαν μετά την έναρξη της δοκιμής. Η εκατοστιαία αναστολή της αναπτύξεως των κυττάρων σε κάθε συγκέντρωση ουσίας κατά τη δοκιμή (IΑ) υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο: IA = Ac   AtAc Χ 100 όπου Ac = εμβαδόν μεταξύ της καμπύλης ανάπτυξης μάρτυρα και της οριζόντιας γραμμής Ν = Ν0. At = εμβαδόν μεταξύ της καμπύλης ανάπτυξης στη συγκέντρωση t και της οριζόντιας γραμμής Ν = Ν0. Οι τιμές ΙΑ σημειώνονται σε ημιλογαριθμικό χαρτί ή σε ημιλογαριθμικό probit χαρτί σε συνάρτηση με τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις. Εάν σημειωθούν σε χαρτί probit, τα σημεία προσαρμόζονται σε ευθεία γραμμή είτε με το μάτι, είτε με αναγωγή διυπολογισμού. Η ΕC50 εκτιμάται από τη γραμμή καμπής βρίσκοντας τη συγκέντρωση που είναι ισοδύναμη με αναστολή 50% (ΙΑ = 50%). Για να υποδηλώνεται αναμφίβολα ότι η τιμή αυτή προέρχεται από αυτή τη μέθοδο υπολογισμού, προτείνεται να χρησιμοποιείται το σύμβολο ΕbC50. Είναι ουσιώδες, η ΕbC50 να προσδιορίζεται με την κατάλληλη χρονική περίοδο έκθεσης, π.χ. ΕbC50 (0-72 ώρες). 2.2. ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΡΥΘΜΩΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (μ) για εκθετικά αναπτυσσόμενες καλλιέργειες μπορεί να υπολογισθεί σαν μ = ln Nn   ln N0tn   t0 όπου t0 είναι ο χρόνος στην έναρξη της δοκιμής. Eναλλακτικά, ο μέσος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μπορεί να βρεθεί από την κλίση της γραμμής καμπής σε γραφική παράσταση της συνάρτησης του ln N πρός τον χρόνο. Η εκατοστιαία αναστολή του ειδικού ρυθμού ανάπτυξης σε κάθε συγκέντρωση ουσίας στη δοκιμή (Ιμt) υπολογίζεται σύμφωνα με τον τύπο: Imt = μc   μtμc Χ 100 όπου μc = μέσος ρυθμός συγκεκριμένης ανάπτυξης μάρτυρα μt = μέσος ρυθμός συγκεκριμένης ανάπτυξης για τη συγκέντρωση δοκιμής t Η εκατοστιαία μείωση του μέσου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης για κάθε συγκέντρωση ουσίας δοκιμής σε σύγκριση με την τιμή μάρτυρα παριστάνεται γραφικά σαν συνάρτηση του λογαρίθμου της συγκέντρωσης. Η ΕC50 μπορεί να βρεθεί από το προκύπτον διάγραμμα. Για να υποδηλώνεται αναμφίβολα ότι η ΕC50 βρέθηκε με τη μέθοδο αυτή, προτείνεται να χρησιμοποιείται το σύμβολο ΕrC50. Πρέπει να υποδεικνύεται οι χρόνοι μέτρησης, π.χ. αν η τιμή αναφέρεται στις 0 και 72 ώρες, το σύμβολο γίνεται ΕrC50 (0-72 h). Σημείωση: ειδικός ρυθμός ανάπτυξης είναι ένας λογαριθμικός όρος και μικρές μεταβολές στο ρυθμό ανάπτυξης μπορεί να οδηγήσουν σε μεγάλες μεταβολές στη βιομάζα. Συνεπώς, οι τιμές ΕbC και ΕrC δεν είναι συγκρίσιμες αριθμητικά. 2.3. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΜΠΕ Η συγκέντρωση μη παρατηρούμενης επίδρασης προσδιορίζεται με μία κατάλληλη στατιστική διαδικασία για σύγκριση πολλαπλών δειγμάτων (π.χ. ανάλυση διακύμανσης και δοκιμή DUNNETT), χρησιμοποιώντας τις ανεξάρτητες επαναληπτικές τιμές των εμβαδών κάτω από τις καμπύλες ανάπτυξης Α (βλ. σημείο 2.1) ή τους συγκεκριμένους ρυθμούς ανάπτυξης μ (βλ. σημείο 2.2). 3. ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες: - εξεταζόμενη ουσία: επακριβείς προδιαγραφές της ουσίας G - οργανισμοί δοκιμής: προέλευση, εργαστηριακή καλλιέργεια, αριθμός στελέχους, μέθοδος καλλιέργειας G - συνθήκες δοκιμής: - ημερομηνία έναρξης και τέλους της δοκιμής και διάρκειά της, - θερμοκρασία, - σύνθεση του περιβάλλοντος μέσου, - συσκευή καλλιέργειας, - pH διαλυμάτων στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής (θα πρέπει να δίνεται μία εξήγηση αν παρατηρούνται αποκλίσεις pH μεγαλύτερες της 1,5 μονάδας), - φορέα και μέθοδο που χρησιμοποιήθηκαν για τη διαλυτοποίηση της εξεταζόμενης ουσίας και συγκέντρωση του φορέα στα διαλύματα δοκιμής, - ένταση και ποιότητα φωτός, - χρησιμοποιηθείσες συγκεντρώσεις (μετρηθείσες ή ονομαστικές). - αποτελέσματα: - πυκνότητα κυττάρων για κάθε φιάλη σε κάθε σημείο μέτρησης και μέθοδος μέτρησης πυκνότητας κυττάρων, - μέσες τιμές πυκνότητας κυττάρων, - καμπύλες ανάπτυξης, - γραφική παράσταση της σχέσης συγκέντρωσης προς επίδραση, - τιμές EC και μέθοδος υπολογισμού, - ΣΜΠΕ, - άλλες παρατηρηθείσες επιδράσεις. 4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final. (2) Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag «Hemmung der Zellvermehrung bei der Grόnalge Scenedesmus subspicatus», in: Rudolph/Boje: Okotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986. (3) ISO 8692 - Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum. (4) S.Galassi and M.Vighi - Chemosphere, 1981, vol.10, 1123-1126. Προσάρτημα 1 Παράδειγμα διαδικασίας για την καλλιέργεια φυκιών Γενικές παρατηρήσεις Σκοπός της καλλιέργειας με βάση τη διαδικασία που ακολουθεί, είναι να ληφθούν καλλιέργειες φυκιών για δοκιμές τοξικότητας. Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλες μέθοδοι για να διασφαλίζεται ότι οι καλλιέργειες δεν θα προσβληθούν από βακτήρια (ISO 4833). Μπορεί να είναι επιθυμητές οι αξενικές καλλιέργειες, είναι βασικές όμως οι μονοφυκώδεις καλλιέργειες. Όλες οι εργασίες θα πρέπει να εκτελούνται κάτω από συνθήκες στείρωσης για να αποφεύγεται η μόλυνση με βακτήρια και άλλα φύκια. Οι προσβεβλημένες καλλιέργειες θα πρέπει να απορρίπτονται. Διαδικασίες για λήφη καλλιεργειών από φύκια Παρασκευή διαλυμάτων θρεπτικών συστατικών (περιβάλλον, μέσον): Το περιβάλλον της καλλιέργειας μπορεί να παρασκευασθεί αραιώνοντας πυκνά αρχικά διαλύματα θρεπτικών συστατικών. Σαν στερεό μέσον, χρησιμοποιείται 0,8% άγαρ. Το χρησιμοποιούμενο μέσον θα πρέπει να είναι στείρο. Η αποστείρωση με αυτόκλειστο μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια ΝΗ3. Αρχική καλλιέργεια: Οι αρχικές καλλιέργειες είναι μικρές καλλιέργειες φυκιών που μεταφέρονται τακτικά σε φρέσκο μέσον για να δράσουν σαν αρχικό υλικό δοκιμής. Αν οι καλλιέργειες δεν χρησιμοποιούνται τακτικά, φέρονται σε σωλήνες με άγαρ υπό κλίση. Αυτές μεταφέρονται σε φρέσκο μέσον μία φορά τουλάχιστον κάθε δύο μήνες. Οι αρχικές καλλιέργειες αναπτύσσονται σε κωνικές φιάλες που περιέχουν το κατάλληλο μέσον (όγκος περίπου 100 ml). Όταν τα φύκια επωάζονται στους 20  C με συνεχή φωτισμό, απαιτείται μεταφορά μία φορά την εβδομάδα. Κατά τη μεταφορά, ποσότητα «παλαιάς» καλλιέργειας μεταφέρεται με αποστειρωμένα σιφώνια σε φιάλη με φρέσκο μέσον, έτσι ώστε με τα ταχυαναπτυσσόμενα είδη η αρχική συγκέντρωση να είναι περίπου 100 φορές μικρότερη από ότι στην παλαιά καλλιέργεια. Ο ρυθμός ανάπτυξης ενός είδους μπορεί να προσδιορισθεί από την καμπύλη ανάπτυξης. Αν είναι γνωστό, είναι δυνατόν να εκτιμηθεί η πυκνότητα υπο την οποία η καλλιέργεια θα πρέπει να μεταφερθεί σε νέο μέσον. Αυτός ο υπολογισμός μπορεί να γίνει προτού η καλλιέργεια φτάσει στη φάση θανάτου. Προκαλλιέργεια: Η προκαλλιέργεια έχει σκοπό να παράσχει μία ποσότητα από φύκια κατάλληλη για τον εμβολιασμό καλλιεργειών δοκιμής. Η προκαλλιέργεια επωάζεται κάτω από τις συνθήκες δοκιμής και χρησιμοποιείται όταν είναι ακόμη υπό εκθετική ανάπτυξη, κανονικά μετά από μία περίοδο επώασης περίπου τριών ημερών. Όταν οι καλλιέργειες των φυκιών περιέχουν παραμορφωμένα ή ανώμαλα κύτταρα, θα πρέπει να απορρίπτονται.ΠΡΟΣΑΡΤΗΜΑ 2 Στο ISO 8692 - Ποιότητα νερού - Δοκιμή αναστολής ανάπτυξης φυκιών γλυκού νερού με Scenedesmus subspicatus και Selenastrum capricornutum αναφέρονται τα ακόλουθα αποτελέσματα για ένα διεργαστηριακό τεστ μεταξύ 16 εργαστηρίων με διχρωμικό κάλιο. >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> Γ.4. ΒΙΟΑΠΟΙΚΟΔΟΤΗΣ «ΑΜΕΣΗΣ» ΒΙΟΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΙΜΟΤΗΤΑΣ ΜΕΡΟΣ Ι. ΓΕΝΙΚΑ ΘΕΜΑΤΑ I.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Περιγράφονται έξι μέθοδοι δοκιμής χημικών ουσιών ως προς την άμεση βιοαποικοδομησιμότητά τους σε αερόβιο υδατικό μέσo: (α) Ελάττωση Διαλελυμένου Οργανικού Άνθρακα (DOC) (Μέθοδος Γ.4-Α) (β) Τροποποιημένη Μέθοδος ΟΟΣΑ - Ελάττωση DOC (Μέθοδος Γ.4-Β) (γ) Έκλυση διοξειδίου του άνθρακα (CO2) (Τροποποιημένη δοκιμή STURM) (Μέθοδος Γ.4-Γ) (δ) Μανομετρική αναπνευσιομετρία (Μέθοδος Γ.4-Δ) (ε) Κλειστή φιάλη (Μέθοδος Γ.4-Ε) (στ) ΜΙΤΙ (Ministry of International Trade and Industry - Ιαπωνία) (Μέθοδος Γ.4-Ζ) Στο Μέρος I της μεθόδου περιλαμβάνονται γενικά θέματα όπως επίσης και θέματα κοινά και για τις έξι δοκιμές. Τα Μέρη II έως VII αναφέρονται ειδικά σε συγκεκριμένες μεθόδους. Τα Παραρτήματα περιέχουν ορισμούς, τύπους και οδηγίες. Από διεργαστηριακή συγκριτική δοκιμή που πραγματοποιήθηκε από τον ΟΟΣΑ το 1988, διαπιστώθηκε ότι οι μέθοδοι παρέχουν συναφή αποτελέσματα. Παρ'όλα αυτά, ανάλογα με τα φυσικά χαρακτηριστικά της εξεταζόμενης ουσίας, μπορεί να προτιμηθεί η μια ή η άλλη μέθοδος. Ι.2. ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΗΣ ΚΑΤΑΛΛΗΛΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Προκειμένου να επιλεγεί η καταλληλότερη μέθοδος, ουσιαστικό ρόλο παίζει η ύπαρξη στοιχείων για τη διαλυτότητα, την τάση ατμών και τα χαρακτηριστικά προσρόφησης της ουσίας. Για τον υπολογισμό των θεωρητικών τιμών και/ή τον έλεγχο των μετρουμένων τιμών παραμέτρων, π.χ. ThOD, ThCO2, DOC, TOC, COD (βλ. Παραρτήματα I και II), θα πρέπει να είναι γνωστή η χημική δομή ή ο μοριακός τύπος της ουσίας. Χημικές ουσίες που η διαλυτότητά τους στο νερό είναι τουλάχιστον 100 mg/l μπορούν να αξιολογηθούν με όλες τις μεθόδους, με την προϋπόθεση ότι δεν είναι πτητικές και προσροφητικές. Για τις χημικές ουσίες που είναι ασθενώς διαλυτές στο νερό, πτητικές ή προσροφητικές, κατάλληλες μέθοδοι είναι εκείνες που παρατίθενται στον Πίνακα 1. Ο τρόπος μεταχείρισης των ασθενώς υδατοδιαλυτών χημικών ουσιών και των πτητικών χημικών ουσιών περιγράφεται στο Παράρτημα III. Οι μετρίως πτητικές χημικές ουσίες μπορούν να υποβάλλονται σε δοκιμή με τη μέθοδο της Ελάττωσης του DOC εφόσον υπάρχει επαρκής χώρος αερίου στα δοχεία δοκιμής (τα οποία πρέπει να είναι κατάλληλα πωματισμένα). Σ' αυτή την περίπτωση πρέπει να γίνεται αβιοτικός έλεγχος προκειμένου να λαμβάνεται υπόψη οποιαδήποτε φυσική απώλεια. >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> Για την ερμηνεία των λαμβανομένων αποτελεσμάτων, ειδικά όταν αυτά είναι μικρά ή οριακά, απαιτούνται στοιχεία για την καθαρότητα ή τις σχετικές αναλογίες των βασικών συστατικών του υλικού δοκιμής. Τυχόν πληροφορίες για την τοξικότητα του εξεταζόμενου χημικού προϊόντος απέναντι στα βακτήρια (Παράρτημα IV) μπορεί να είναι ιδιαίτερα χρήσιμες για την επιλογή των κατάλληλων συγκεντρώσεων για τη δοκιμή ενώ μπορεί να παίζουν βασικό ρόλο στην ερμηνεία χαμηλών τιμών βιοαποικοδόμησης. I.3. ΟΥΣΙΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Για τον έλεγχο της διαδικασίας, ουσίες αναφοράς που πληρούν τα κριτήρια για την άμεση βιοαποικοδομησιμότητα υποβάλλονται σε δοκιμή παρασκευάζοντας το κατάλληλο διάλυμα σε φιάλη που εξετάζεται παράλληλα με την κανονική διαδικασία δοκιμής. Κατάλληλες χημικές ουσίες είναι η ανιλίνη (πρόσφατα απεσταγμένη), το οξικό νάτριο και το βενζοϊκό νάτριο. Όλες αυτές οι ουσίες αποικοδομούνται με τις μεθόδους αυτές ακόμη κι όταν δεν προστεθεί εμβόλιο για το σκοπό αυτό. Πρόταθηκε να αναζητηθεί μια ουσία αναφοράς που να είναι ευκόλως βιοαποικοδομήσιμη αλλά που να χρειάζεται την προσθήκη εμβολίου. Έχει προταθεί το όξινο φθαλικό κάλιο, χρειάζονται όμως ακόμη ορισμένα αποδεικτικά στοιχεία με αυτή την ουσία πριν γίνει αποδεκτή σαν ουσία αναφοράς. Στις αναπνευσιομετρικές δοκιμές, οι ενώσεις που περιέχουν άζωτο μπορεί να επηρεάσουν την ανάλωση οξυγόνου εξαιτίας νιτροποίησης (βλ. Παραρτήματα II και V). I.4. ΑΡΧΗ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΔΟΚΙΜΗΣ Διάλυμα ή εναιώρημα της εξεταζόμενης ουσίας σε ανόργανο μέσον εμβολιάζεται και επωάζεται κάτω από αερόβιες συνθήκες στο σκότος ή σε διάχυτο φως. Η ποσότητα DOC στο διάλυμα αραίωσης λόγω του εμβολίου θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν χαμηλότερη σε σύγκριση με την ποσότητα DOC που οφείλεται στην εξεταζόμενη ουσία. Η ενδογενής δραστικότητα του εμβολίου λαμβάνεται υπόψη εκτελώντας παράλληλα τυφλά πειράματα με εμβόλιο αλλά χωρίς εξεταζόμενη ουσία στο διάλυμα, παρ'όλο ότι η ενδογενής δραστικότητα των κυττάρων με την παρουσία της ουσίας δεν προσομοιάζει ακριβώς με εκείνη του ενδογενή μάρτυρα. Γίνεται παράλληλη δοκιμή μιας ουσίας αναφοράς για τον έλεγχο της εκτέλεσης των διαδικασιών. Γενικά, η αποικοδόμηση παρακολουθείται με τον προσδιορισμό παραμέτρων, όπως DOC, παραγωγή CO2 και εκτελούνται μετρήσεις σε ικανοποιητικά συχνά διαστήματα που επιτρέπουν την αναγνώριση της έναρξης και της περάτωσης της βιοαποικοδόμησης. Με αυτόματα αναπνευσιόμετρα η μέτρηση είναι συνεχής. Ο DOC μετριέται μερικές φορές μαζί με κάποια άλλη παράμετρο αλλά αυτό γίνεται συνήθως μόνο στην αρχή και στο τέλος της δοκιμής. Μπορεί επίσης να γίνει και ειδική χημική ανάλυση για να εκτιμηθεί η πρωταρχική αποικοδόμηση της εξεταζόμενης ουσίας και να προσδιορισθεί η συγκέντρωση οποιασδήποτε σχηματιζόμενης ενδιάμεσης ουσίας (πράγμα υποχρεωτικό στην περίπτωση της δοκιμής ΜΙΤΙ). Κανονικά, η δοκιμή διαρκεί 28 ημέρες. Παρ'όλα αυτά, οι δοκιμές μπορεί να τερματισθούν και πρίν από τις 28 ημέρες, π.χ. αμέσως όταν η καμπύλη βιοαποικοδόμησης έχει φθάσει σε οριακό επίπεδο για τρείς τουλάχιστον προσδιορισμούς. Οι δοκιμές μπορούν επίσης να παραταθούν και πέραν των 28 ημερών όταν από την καμπύλη φαίνεται ότι άρχισε η βιοαποικοδόμηση αλλά δεν έχει ακόμη φθάσει, την 28η ημέρα, σε οριακό επίπεδο. I.5. ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ I.5.1. Αναπαραγωγιμότητα Λόγω της φύσης της βιοαποικοδόμησης και των μεικτών βακτηριακών πληθυσμών που χρησιμοποιούνται σαν εμβόλια, οι προσδιορισμοί θα πρέπει να εκτελούνται τουλάχιστον δύο φορές. Αποτελεί κοινή εμπειρία το ότι όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση των μικροοργανισμών που προστίθενται αρχικά στο μέσον δοκιμής τόσο μικρότερη θα είναι η διακύμανση μεταξύ των επαναληπτικών δοκιμασιών. Από διεργαστηριακές δοκιμές διαπιστώθηκε επίσης ότι μπορεί να υπάρξουν μεγάλες διακυμάνσεις μεταξύ αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από διάφορα εργαστήρια, κανονικά όμως επιτυγχάνεται καλή συμφωνία με εύκολα- βιοαποικοδομήσιμες ουσίες. I.5.2. Εγκυρότητα της δοκιμής Μία δοκιμή θεωρείται έγκυρη αν η διαφορά των ακροτάτων επαναληπτικών τιμών απομάκρυνσης της εξεταζόμενης ουσίας στο οριακό επίπεδο, στο τέλος της δοκιμής ή στο τέλος του παραθύρου των 10 ημερών όπως ενδείκνυται, είναι μικρότερη του 20 % και αν η εκατοστιαία αποικοδόμηση της ουσίας αναφοράς έχει φθάσει το επίπεδο της άμεσης βιοαποικοδομησιμότητας στις 14 ημέρες. Εάν οποιαδήποτε από τις συνθήκες αυτές δεν εκπληρώνεται, η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται. Εξαιτίας της αυστηρότητας των μεθόδων, χαμηλές τιμές δεν σημαίνουν κατ' ανάγκη ότι η εξεταζόμενη ουσία δεν είναι βιοαποικοδομήσιμη κάτω από τις συνθήκες περιβάλλοντος, δείχνουν όμως ότι απαιτείται περισσότερη εργασία για την επίτευξη βιοαποικοδομησιμότητας. Εάν σε μία δοκιμή τοξικότητας, στην οποία συμπεριλαμβάνεται τόσο η εξεταζόμενη ουσία όσο και κάποια ουσία αναφοράς, επέρχεται σε 7-14 ημέρες μικρότερη από 35% αποικοδόμηση (με βάση το DOC) ή μικρότερη από 25% (με βάση το ThOD ή ThCO2), οι εξεταζόμενες χημικές ουσίες μπορούν να θεωρούνται σαν ανασταλτικές (βλ. επίσης Παράρτημα IV). Η σειρά των δοκιμών θα πρέπει να επαναλαμβάνεται, αν είναι δυνατόν χρησιμοποιώντας μικρότερη συγκέντρωση εξεταζόμενης ουσίας και/ή μεγαλύτερη συγκέντρωση εμβολίου, όχι όμως μεγαλύτερη από 30 mg στερεών/λίτρο. I.6. ΓΕΝΙΚΕΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΕΣ Οι γενικοί όροι που ισχύουν για τις δοκιμές συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Ο εξοπλισμός και οι άλλες πειραματικές συνθήκες που αφορούν ειδικά μία συγκεκριμένη δοκιμή, περιγράφονται αργότερα στο κείμενο που αναφέρεται στη δοκιμή αυτή. >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> Ι.6.1 Νερό για αραίωση Το νερό που προορίζεται να χρησιμοποιηθεί γενικά σαν διαλύτης πρέπει να είναι απιονισμένο ή απεσταγμένο, απαλλαγμένο από ανασταλτικές συγκεντρώσεις τοξικών ουσιών (π.χ. ιόντα Cu++). To νερό δεν πρέπει να περιέχει περισσότερο από 10% της ποσότητας του οργανικού άνθρακα που εισάγεται από το εξεταζόμενο υλικό. Το νερό της δοκιμής είναι ανάγκη να είναι υψηλής καθαρότητας ώστε να αποφεύγονται υψηλές τιμές στα τυφλά πειράματα. Η μόλυνση μπορεί να προκύφει από εγγενείς προσμίξεις όπως επίσης και από τις ιοντοανταλλακτικές ρητίνες και από ουσίες που παράγονται απο την λύση βακτηρίων και αλγών. Για κάθε σειρά δοκιμών, χρησιμοποιείται μόνον μία παρτίδα νερού, ελεγμένη προηγουμένως με ανάλυση DOC. Μια τέτοια δοκιμή δεν είναι απαραίτητη για τη δοκιμή κλειστής φιάλης, αλλά η κατανάλωση οξυγόνου από το νερό πρέπει να είναι χαμηλή. I.6.2. Αρχικά διαλύματα ανόργανων συστατικών Για την παρασκευή των διαλυμάτων δοκιμής, παρασκευάζονται αρχικά διαλύματα με την κατάλληλη συγκέντρωση ανόργανων συστατικών. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν τα αρχικά διαλύματα που παρατίθενται παρακάτω (με διαφορετικούς συντελεστές αραίωσης) για τις μεθόδους Ελάττωσης DOC, Τροποποιημένη Δοκιμή ΟΟΣΑ, Έκλυση CO2, Μανομετρική Αναπνευσιομετρία και Δοκιμή Κλειστής Φιάλης. Οι συντελεστές αραίωσης και, για τη δοκιμή ΜΙΤΙ, η ειδική παρασκευή του ανόργανου μέσου, αναφέρονται στα αντίστοιχα κείμενα των συγκεκριμένων δοκιμών. Αρχικά διαλύματα: Παρασκευάζονται τα ακόλουθα αρχικά διαλύματα, χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια αναλυτικής καθαρότητας. (α) Δισόξινο φωσφορικό κάλιο, KH2PO4 8,50 g Μονόξινο φωσφορικό κάλιο, K2HPO4 21,75 g Δίυδρο μονόξινο φωσφορικό νάτριο, Na2HPO4. 2H2O 33,40 g Χλωριούχο αμμώνιο, NH4Cl 0,50 g Διάλυση σε νερό και συμπλήρωση μέχρι 1 λίτρο Το pH του διαλύματος θα πρέπει να είναι 7,4 (β) Χλωριούχο ασβέστιο, άνυδρο, CaCl2 27,50 g ή δίυδρο χλωριούχο ασβέστιο, CaCl2.2 H2O 36,40 g Διάλυση σε νερό και συμπλήρωση μέχρι 1 λίτρο (γ) Επτάυδρο θεϊικό μαγνήσιο, MgSO4. 7H2O 22,50 g Διάλυση σε νερό και συμπλήρωση μέχρι 1 λίτρο (δ) Εξάυδρος χλωριούχος σίδηρος (III), FeCl3.6H2O 0,25 g Διάλυση σε νερό και συμπλήρωση μέχρι 1 λίτρο. Σημείωση: για να αποφεύγεται να παρασκευάζεται το διάλυμα αυτό αμέσως πριν από τη χρήση, προστίθεται μία σταγόνα πυκνού HCl ή 0,4 g δινατρίου άλατος του αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέος (EDTA) ανά λίτρο. I.6.3. Αρχικά διαλύματα χημικών ουσιών Για παράδειγμα, όταν η διαλυτότητα είναι μεγαλύτερη από το 1 g/l, διαλύονται 1-10 g, ανάλογα, εξεταζόμενης ουσίας ή ουσίας αναφοράς σε απιονισμένο νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι 1 λίτρο. Διαφορετικά, παρασκευάζονται αρχικά διαλύματα στο ανόργανο μέσον ή η ουσία προστίθεται απ' ευθείας στο ανόργανο μέσον. Για το χειρισμό λιγότερο ευδιάλυτων χημικών ουσιών, βλ. Παράρτημα III. Πάντως, στη δοκιμή ΜΙΤΙ (Μέθοδος Γ.4-Ε), δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται ούτε διαλύτες ούτε γαλακτωματοποιητές. I.6.4. Εμβόλια Το εμβόλιο μπορεί να προέρχεται από διάφορες πηγές: ενεργοποιημένη λάσπη, αστικά λύματα (μη χλωριομένα), επιφανειακά νερά και χώματα ή από μείγμα αυτών. Στις δοκιμές της Ελάττωσης DOC, της Έκλυσης CO2 και της Μανομετρικής Αναπνευσιομετρίας, αν χρησιμοποιείται ενεργοποιημένη λάσπη, αυτή θα πρέπει να λαμβάνεται από εγκατάσταση κατεργασίας ή μονάδα εργαστηριακής κλίμακας που δέχεται κατά κύριο λόγο οικιακά λύματα. Εμβόλια που προέρχονται από άλλες πηγές διαπιστώθηκε ότι δίνουν μεγαλύτερη διασπορά αποτελεσμάτων. Για την Τροποποιημένη Δοκιμή ΟΟΣΑ και τη Δοκιμή Κλειστής Φιάλης απαιτείται ένα πιο αραιό εμβόλιο χωρίς κροκιδώματα ή συσσωματώματα λάσπης και η πηγή που προτιμάται είναι τα δευτερογενή λύματα από εγκαταστάσεις κατεργασίας ή μονάδα εργαστηριακής κλίμακας οικιακών αποβλήτων. Στη δοκιμή ΜΙΤΙ, το εμβόλιο προέρχεται από μίγμα πηγών και περιγράφεται στο κείμενο της συγκεκριμένης αυτής δοκιμής. I.6.4.1. Εμβόλιο από ενεργοποιημένες λάσπες Δείγμα ενεργοποιημένης λάσπης συλλέγεται από τη δεξαμενή αερισμού μιας εγκατάστασης κατεργασίας λυμάτων ή μονάδας εργαστηριακής κλίμακας στην οποία κατεργάζονται κατά κύριο λόγο οικιακά λύματα. Εάν είναι αναγκαίο, τα χονδρά σωματίδια απομακρύνονται με διήθηση μέσα από λεπτό κόσκινο και η λάσπη φυλλάσσεται σε αερόβιες συνθήκες. Εναλλακτικά, μετά την απομάκρυνση των χονδρών σωματιδίων, η λάσπη αφήνεται να κατακαθίσει ή φυγοκεντρείται (π.χ. σε 1 100 g επί 10 λεπτά). Το υπερκείμενο υγρό απορρίπτεται και η συμπυκνωμένη λάσπη πλένεται με το ανόργανο διάλυμα. Η συμπικνωμένη λάσπη αιωρείται σε ανόργανο μέσον μέχρι συγκέντρωσης 3-5 g εναιωρούμενων στερεών/l και αερίζεται όσο απαιτείται. Η λάσπη πρέπει να λαμβάνεται από συμβατική εγκατάσταση που λειτουργεί κανονικά. Αν η λάσπη λαμβάνεται από εγκαταστάσεις κατεργασίας υψηλής ταχύτητας ή πιστεύεται ότι περιέχει αναστολείς, θα πρέπει να πλένεται. Η επαναφερθείσα σε μορφή εναιωρήματος λάσπη μετά από επισταμένη ανάμειξη, αφήνεται να κατακαθίσει ή φυγοκεντρείται, το υπερκείμενο υγρό απορρίπτεται και η πλυμένη λάσπη επαναφέρεται σε μορφή εναιωρήματος σε πρόσθετο όγκο ανόργανου μέσου. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται μέχρι να κριθεί ότι η λάσπη είναι απαλλαγμένη από υπερβολικό υπόστρωμα ή αναστολέα. Αφού επιτευχθεί η πλήρης επαναιώρηση, ή στη μη κατεργασμένη λάσπη, λαμβάνεται δείγμα ακριβώς πριν χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του ξηρού βάρους των αιωρουμένων στερεών. Μια άλλη εναλλακτική λύση, είναι η ομοιογενοποίηση της ενεργοποιημένης λάσπης (3-5 g αιωρούμενων στερεών/l). Η λάσπη υποβάλλεται σε κατεργασία σε μηχανικό αναμείκτη για δύο λεπτά με μεσαία ταχύτητα. Η αναμεμειγμένη λάσπη αφήνεται να κατακαθίσει για χρονικό διάστημα 30 λεπτών ή και περισσότερο εάν αυτό απαιτείται και το υγρό μεταγγίζεται για να χρησιμοποιηθεί σαν εμβόλιο σε αναλογία 10 ml/l ανόργανου μέσου. I.6.4.2. Άλλες πηγές εμβολίου Το εμβόλιο μπορεί να προέρχεται από τα δευτερογενή απόβλητα εγκαταστάσεων κατεργασίας ή μονάδας εργαστηριακής κλίμακας για οικιακά, κατά κύριο λόγο, λύματα. Συλλέγεται πρόσφατο δείγμα και διατηρείται σε αερόβιες συνθήκες κατά τη διάρκεια της μεταφοράς. Αφήνεται να κατακαθίσει για 1 ώρα ή διηθείται διαμέσου χονδρού διηθητικού χαρτιού και τα μεταγγισθέντα απόβλητα ή το διήθημα διατηρούνται σε αερόβιες συνθήκες για όσο χρόνο απαιτείται. Mπορούν να χρησιμοποιηθούν μέχρι 100 ml αυτού του τύπου εμβολίου ανά λίτρο μέσου. Μία περαιτέρω πηγή για το εμβόλιο είναι τα επιφανειακά νερά. Στην περίπτωση αυτή, συλλέγεται δείγμα από κατάλληλα επιφανειακά νερά, π.χ. ποταμούς, λίμνες και διατηρείται σε αερόβιες συνθήκες όσο απαιτείται. Εφόσον χρειάζεται, το εμβόλιο συμπυκνώνεται με διήθηση ή φυγοκέντρηση. I.6.5. Προεγκλιματισμός εμβολίων Τα εμβόλια μπορούν να προεγκλιματίζονται στις πειραματικές συνθήκες, δεν μπορούν όμως να προσαρμόζονται εκ των προτέρων στην εξεταζόμενη ουσία. Ο προεγκλιματισμός συνίσταται στον αερισμό της ενεργοποιημένης λάσπης σε ανόργανο μέσον ή δευτερογενή απόβλητα επί 5-7 ημέρες σε θερμοκρασία δοκιμής. Ο προεγκλιματισμός βελτιώνει μερικές φορές την ακρίβεια των μεθόδων δοκιμής μειώνοντας τις τιμές του τυφλού. Δεν θεωρείται αναγκαίο να προεγκλιματίζεται το εμβόλιο ΜΙΤΙ. I.6.6. Αβιοτικοί έλεγχοι Όταν απαιτείται, η ενδεχόμενη αβιοτική αποικοδόμηση της εξεταζόμενης ουσίας ελέγχεται προσδιορίζοντας την απομάκρυνση του DOC, την ανάλωση οξυγόνου ή την έκλυση διοξειδίου του άνθρακα σε απoστειρωμένους ελέγχους που δεν περιέχουν εμβόλιο. Η αποστείρωση διενεργείται με διήθηση δια μέσου μεμβράνης (0,2-0,45 μικρόμετρα) ή με προσθήκη μιάς κατάλληλης τοξικής ουσίας σε κατάλληλη συγκέντρωση. Αν χρησιμοποιείται μεμβράνη διήθησης, τα δείγματα λαμβάνονται άσηπτα ώστε να διατηρηθούν αποστειρωμένα. Στις δοκιμές που μετρούν βιοαποικοδόμηση σαν απομάκρυνση του DOC, ειδικότερα με εμβόλιο ενεργοποιημένης λάσπης, πρέπει να περιλαμβάνεται και αβιοτικός έλεγχος που είναι εμβολιασμένος και δηλητηριασμένος, εκτός αν η προσρόφηση της εξεταζόμενης χημικής ουσίας έχει αποκλεισθεί εκ των προτέρων. I.6.7. Αριθμός φιαλών Ο αριθμός των φιαλών σε μια τυπική διαδικασία δοκιμής περιγράφεται κάτω από τους τίτλους κάθε δοκιμής. Πρέπει να χρησιμοποιούνται τουλάχιστον οι ακόλουθοι τύποι φιαλών:  Για εναιώρημα δοκιμής:περιέχονται εξεταζόμενη ουσία και εμβόλιο Για τυφλό εμβολίου:περιέχεται μόνον εμβόλιο Για έλεγχο διαδικασίας:περιέχονται ουσία αναφοράς και εμβόλιο Για αβιοτικό στείρο έλεγχο:στείρο, περιέχεται εξεταζόμενη ουσία (βλέπε 1.6.6) Για έλεγχο προσρόφησης:περιέχονται εξεταζόμενη ουσία, εμβόλιο και φορέας αποστείρωσης Για έλεγχο τοξικότητας:περιέχονται εξεταζόμενη ουσία, ουσία αναφοράς και εμβόλιο Ο προσδιορισμός στο εναιώρημα δοκιμής και το τυφλό εμβόλιο θα πρέπει να υποχρεωτικά να γίνεται παράλληλα. Θεωρείται σκόπιμο να γίνονται παράλληλα επίσης οι προσδιορισμοί στην άλλη φιάλη. Αυτό μπορεί, παρ' όλα αυτά, να μην είναι πάντοτε δυνατόν. Πρέπει να εξασφαλίζεται το ότι λαμβάνονται επαρκή δείγματα ή αναγνώσεις ώστε να μπορεί να εκτιμάται το ποσοστό απομάκρυνσης στο 10 ήμερο παράθυρο. I.7. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ Στον υπολογισμό της Dt, δηλ. του ποσοστού αποικοδόμησης επί τοις εκατό, χρησιμοποιούνται οι μέσες τιμές της διπλής μέτρησης της παραμέτρου τόσο στις φιάλες δοκιμής όσο και στο τυφλό εμβολίου. Οι τύποι παρατίθενται στα κεφάλαια παρακάτω για τις συγκεκριμένες δοκιμές. Η πορεία αποικοδόμησης απεικονίζεται γραφικά και εμφανίζεται το 10 ήμερο παράθυρο. Υπολογίζεται και αναφέρεται η επί τοις εκατό απομάκρυνση που επιτυγχάνεται στο τέλος του 10 ημέρου παραθύρου και η τιμή στο οριζόντιο τμήμα της καμπύλης ή στο τέλος της δοκιμής, ανάλογα με το τι είναι προτιμότερο. Στις αναπνευσιομετρικές δοκιμές, οι ενώσεις που περιέχουν άζωτο μπορεί να επηρεάσουν την ανάλωση οξυγόνου εξαιτίας νιτροποίησης (βλ. Παραρτήματα II και V). I.7.1. Αποικοδόμηση μετρούμενη μέσω προσδιορισμού του DOC H εκατοστιαία αποικοδόμηση (Dt) για κάθε λαμβανόμενο δείγμα πρέπει να υπολογίζεται χωριστά για τις φιάλες που περιέχουν την εξεταζόμενη ουσία χρησιμοποιώντας την μέση τιμή διπλών μετρήσεων DOC ώστε να εκτιμηθεί η εγκυρότητα της δοκιμής (βλέπε Ι.5.2). Ο υπολογισμός γίνεται με βάση την ακόλουθη εξίσωση: Dt = (1    Ct   Cbt Co   Cbo) Χ 100 όπου: Dt = % αποικοδόμηση τη χρονική στιγμή t, Co = μέση αρχική συγκέντρωση DOC στο εμβολιασμένο μέσον καλλιέργειας που περιέχει την εξεταζόμενη ουσία (mg DOC/l), Ct = μέση συγκέντρωση DOC στο εμβολιασμένο μέσον καλλιέργειας που περιέχει εξεταζόμενη ουσία τη χρονική στιγμή t (mg DOC/l), Cbo = μέση αρχική συγκέντρωση DOC στο τυφλό του εμβολιασμένου ανόργανου μέσου (mg DOC/l), Cbt = μέση συγκέντρωση DOC του τυφλού κατά τη χρονική στιγμή t (mg DOC/l). Όλες οι συγκεντρώσεις μετρούνται πειραματικά. I.7.2. Αποικοδόμηση μετρούμενη μέσω ειδικής ανάλυσης Όταν υπάρχουν διαθέσιμα ειδικά αναλυτικά δεδομένα, η βιοαποικοδόμηση υπολογίζεται πρωταρχικά από τον τύπο: Dt = Sb   SaSb Χ 100 όπου: Dt = % αποικοδόμηση τη χρονική στιγμή t, κανονικά 28 ημέρες, Sa = εναπομένουσα ποσότητα εξεταζόμενης ουσίας στο εμβολιασμένο μέσον στο τέλος της δοκιμής (mg), Sb = εναπομένουσα ποσότητα εξεταζόμενης ουσίας στο τυφλό με νερό/μέσον στο οποίο προστέθηκε μόνον η εξεταζόμενη ουσία (mg). I.7.3. Αβιοτική αποικοδόμηση Όταν χρησιμοποιείται ένας στείρος αβιοτικός έλεγχος, στον υπολογισμό της εκατοστιαίας αβιοτικής αποικοδόμησης χρησιμοποιείται % αβιοτική αποικοδόμηση = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) Χ 100 όπου: Cs(o) = DOC Συγκέντρωση στο στείρο έλεγχο την ημέρα 0 Cs(t) = DOC Συγκέντρωση στο στείρο έλεγχο την ημέρα t I.8. ΕΚΘΕΣΗ Η έκθεση δοκιμής πρέπει, αν είναι δυνατόν, να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες: - εξεταζόμενες και ουσίες αναφοράς όπως και την καθαρότητα τους G - συνθήκες δοκιμής G - εμβόλιο: φύση και τόπο (τόπους) δειγματοληψίας, συγκέντρωση και οποιαδήποτε κατεργασία προεγκλιματισμού G - αναλογία και φύση βιομηχανικών αποβλήτων στα λύματα, αν είναι γνωστές G - διάρκεια και θερμοκρασία δοκιμής G - σε περίπτωση ασθενώς διαλυτών εξεταζόμενων ουσιών, πραγματοποιηθείσα κατεργασία G - εφαρμοσθείσα μέθοδο δοκιμής. Για οποιαδήποτε αλλαγή διαδικασίας θα πρέπει να παρέχονται οι επιστημονικοί λόγοι και επεξήγηση G - δελτίο δεδομένων G - οποιοδήποτε φαινόμενο αναστολής που παρατηρήθηκε G - οποιαδήποτε παρατηρηθείσα αβιοτική αποικοδόμηση G - συγκεκριμένα χημικά αναλυτικά δεδομένα, εφόσον υπάρχουν G - αναλυτικά δεδομένα για τα ενδιάμεσα προϊόντα, εφόσον υπάρχουν. - η γραφική παράσταση της επί τοις εκατό αποικοδόμησης σαν συνάρτηση του χρόνου για την εξεταζόμενη ουσία και τις ουσίες αναφοράς G θα πρέπει να εμφαίνονται σαφώς η φάση υστέρησης, η φάση αποικοδόμησης, το 10 ήμερο παράθυρο και η κλίση (Παράρτημα I). Για την γραφική παράσταση, εφόσον η δοκιμή είναι σύμφωνη με τα κριτήρια εγκυρότητας, χρησιμοποιείται ο μέσος όρος της εκατοστιαίας αποικοδόμησης στις φιάλες που περιέχουν την εξεταζόμενη ουσία G - η επί τοις εκατό απομάκρυνση μετά το 10 ήμερο παράθυρο, στο οριζόντιο τμήμα ή στο τέλος της δοκιμής. ΜΕΡΟΣ ΙΙ. ΔΟΚΙΜΗ ΕΛΑΤΤΩΣΗΣ DOC (Μέθοδος Γ.4-Α) II.1. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Μετρημένος όγκος εμβολιασμένου ανόργανου μέσου που περιέχει γνωστή συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας (10-40 mg DOC/l) σαν αποκλειστική πηγή οργανικού άνθρακα αερίζεται στο σκοτάδι ή σε διάχυτο φως στους 22 ± 2  C. Η αποικοδόμηση παρακολουθείται με ανάλυση DOC σε τακτά χρονικά διαστήματα για μία περίοδο 28 ημερών. Ο βαθμός βιοαποικοδόμησης υπολογίζεται εκφράζοντας τη συγκέντρωση του απομακρυνθέντος DOC (διορθωμένη με βάση το τυφλό) σαν το εκατοστιαίο ποσοστό της υπάρχουσας αρχικά συγκέντρωσης. Ο βαθμός πρωταρχικής βιοαποικοδόμησης μπορεί να υπολογισθεί επίσης με συμπληρωματική χημική ανάλυση που πραγματοποιείται στην αρχή και στο τέλος της επώασης. II.2. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ II.2.1. Εξοπλισμός (α) Κωνικές φιάλες, π.χ. 250 mg έως 2 l, ανάλογα με τον όγκο που απαιτείται για την ανάλυση DOC G (β) Συσκευή ανατάραξης που δέχεται τις κωνικές φιάλες, είτε με αυτόματο έλεγχο θερμοκρασίας ή που χρησιμοποιείται σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας, ικανής ισχύος ώστε να διατηρεί αερόβιες συνθήκες σε όλες τις φιάλες G (γ) Συσκευή διήθησης, με κατάλληλες μεμβράνες G (δ) Αναλυτής DOC G (ε) Συσκευή προσδιορισμού διαλελυμένου οξυγόνου G (στ) Φυγόκεντρος. II.2.2. Προετοιμασία ανόργανου μέσου Για την παρασκευή του αρχικού διαλύματος, βλ. I.6.2. Αναμειγνύονται 10 ml διαλύματος (α) με 800 ml νερού αραίωσης, προστίθεται 1 ml από τα διαλύματα (β) έως (δ) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι 1 λίτρο με νερό αραίωσης. II.2.3. Παρασκευή και προεγκλιματισμός εμβολίου Το εμβόλιο μπορεί να παράγεται από μια ποικιλία πηγών: ενεργοποιημένη λάσπη G λύματα αποχετεύσεων G επιφανειακά νερά G χώματα ή ένα μείγμα αυτών. Βλ. I.6.4. I.6.4.1. Ι.6.4.2. και I.6.5. II.2.4. Προετοιμασία των φιαλών Για παράδειγμα, σε δίλιτρες κωνικές φιάλες φέρονται ποσότητες ανόργανου μέσου όγκου 800 ml και προστίθενται επαρκείς όγκοι αρχικών διαλυμάτων της εξεταζόμενης ουσίας και των ουσιών αναφοράς σε ξεχωριστές φιάλες ώστε να επιτευχθεί συγκέντρωση χημικής ουσίας ισοδύναμη με 10-40 ml DOC/l. Ελέγχεται το pH και ρυθμίζεται αν είναι ανάγκη στο 7,4. Οι φιάλες εμβολιάζονται με ενεργοποιημένη λάσπη ή άλλη πηγή εμβολίων (βλ. I.6.4.), έτσι ώστε να επιτευχθεί τελική συγκέντρωση όχι μεγαλύτερη από 30 mg αιωρούμενων στερεών/l. Παρασκευάζονται επίσης με το εμβόλιο τυφλά στο ανόργανο μέσον χωρίς όμως εξεταζόμενη ή ουσία αναφοράς. Εάν χρειάζεται, μία φιάλη χρησιμοποιείται για να ελεγχθεί η πιθανή ανασταλτική επίδραση της εξεταζόμενης ουσίας, εμβολιάζοντας διάλυμα που περιέχει, στο ανόργανο μέσον, συγκρίσιμες συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης και μιας ουσίας αναφοράς. Επίσης, εφόσον απαιτείται, ετοιμάζεται μία ακόμη, αποστειρωμένη φιάλη για να ελεγχθεί αν η εξεταζόμενη ουσία αποικοδομείται αβιοτικώς χρησιμοποιώντας μη εμβολιασμένο διάλυμα της ουσίας (βλ. 1.6,6.). Επιπλέον, αν υπάρχουν υποψίες ότι η εξεταζόμενη χημική ουσία προσροφάται σε σημαντικό βαθμό στο γυαλί, στη λάσπη, κ.λπ., γίνεται μία προκαταρκτική εκτίμηση για να προσδιορισθεί η πιθανή έκταση της προσρόφησης και με τον τρόπο αυτό η καταλληλότητα της δοκιμής για τη χημική ουσία (βλ. Πίνακα 1).Τοποθετείται μιά φιάλη που περιέχει την εξεταζόμενη ουσία, το εμβόλιο και τόν φορέα αποστείρωσης. Τα διαλύματα, σε όλες τις φιάλες, συμπληρώνονται μέχρις όγκου 1 λίτρου με ανόργανο μέσον και, αφού ανακατευτούν, λαμβάνεται από κάθε φιάλη ένα δείγμα για να προσδιορισθεί η αρχική συγκέντρωση DOC (βλ. Παράρτημα II.4). Τα στόμια των φιαλών καλύπτονται, π.χ. με φύλλο αλουμινίου, έτσι ώστε να μπορεί να γίνεται ελεύθερη αναλλαγή αέρα μεταξύ φιάλης και της ατμόσφαιρας που περιβάλλει τη φιάλη. Κατόπιν, οι φιάλες εισάγονται στη συσκευή ανατάραξης για να αρχίσει η δοκιμή. II.2.5. Αριθμός φιαλών σε μια τυπική διαδικασία δοκιμής Φιάλες 1 και 2: εναιώρημα εξεταζόμενης ουσίας Φιάλες 3 και 4: τυφλό εμβολίου Φιάλη 5: έλεγχος διαδικασίας κατά προτίμηση και όταν είναι απαραίτητο Φιάλη 6: στείρος αβιοτικός έλεγχος Φιάλη 7: έλεγχος προσρόφησης Φιάλη 8: έλεγχος τοξικότητας Βλέπε επίσης I.6.7. II.2.6. Εκτέλεση της δοκιμής Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, προσδιορίζονται οι συγκεντρώσεις DOC σε κάθε φιάλη δύο φορές σε καθορισμένα χρονικά διαστήματα αρκετά κοντινά ώστε να μπορεί να προσδιορισθεί η έναρξη του 10 ήμερου παραθύρου και η επί τοις εκατό απομάκρυνση στο τέλος του 10 ήμερου παραθύρου. Για κάθε προσδιορισμό λαμβάνεται μόνον ο ελάχιστος απαιτούμενος όγκος του εναιωρήματος δοκιμής. Πριν από τη δειγματοληψία, οι απώλειες από τις φιάλες εξαιτίας εξάτμισης αναπληρώνονται προσθέτοντας νερό αραίωσης (I.6.1) στην απαιτούμενη ποσότητα εφόσον χρειάζεται. Πριν από τη λήψη ενός δείγματος, το μέσον καλλιέργειας αναμειγνύεται καλά και εξασφαλίζεται ότι τυχόν υλικό προσκολλημένο στα τοιχώματα των δοχείων διαλύεται ή εναιωρείται πριν από τη δειγματοληψία. Αμέσως μετά τη λήψη δείγματος πρέπει να γίνει διήθηση με μεμβράνη ή φυγοκέντρηση (βλ. Παράρτημα II.4). Τα διηθημένα ή φυγοκεντρημένα δείγματα αναλύονται την ίδια ημέρα, διαφορετικά φυλάσσονται στους 2-4  C για 48 ώρες το ανώτερο, ή κάτω από τους  18  C για μεγαλύτερο διάστημα. II.3. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΕΚΘΕΣΗ II.3.1. Επεξεργασία των αποτελεσμάτων Υπολογίζεται η επί τοις εκατό αποικοδόμηση τη χρονική στιγμή t όπως αναφέρεται στο I.7.1. (προσδιορισμός DOC) και, προαιρετικά, στο I.7.2. (ειδική ανάλυση). Όλα τα αποτελέσματα καταγράφονται στα φύλλα δεδομένων. II.3.2. Εγκυρότητα των αποτελεσμάτων Βλ. I.5.2. II.3.3. Έκθεση Βλ. I.8. II.4. ΦΥΛΛΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Ένα παράδειγμα φύλλου δεδομένων δίνεται παρακάτω. ΔΟΚΙΜΗ ΕΛΑΤΤΩΣΗΣ DOC 1. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 2. ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΝΑΡΞΗΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 3. ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΗ ΟΥΣΙΑ Όνομα: Συγκέντρωση αρχικού διαλύματος: ... mg/l, σαν ουσία Αρχική συγκέντρωση στο μέσον αραίωσης, to: ... mg/l, σαν ουσία 4. ΕΜΒΟΛΙΟ Πηγή: ... Πραγματοποιηθείσα κατεργασία: ... Προεγκλιματισμός, εφόσον υπήρξε: ... Συγκέντρωση αιωρούμενων στερεών στο αντιδρόν μείγμα: ... mg/l 5. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΑΝΘΡΑΚΑ Αναλύτης άνθρακα: ... >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 6. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΑΝΑΠΕΞΕΡΓΑΣΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 7. ΑΒΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ (προαιρετικός) >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> % αβιοτική αποικοδόμηση = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) Χ 100 8. ΕΙΔΙΚΗ ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ (προαιρετική) >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> ΜΕΡΟΣ ΙΙΙ. ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΔΟΚΙΜΗ ΟΟΣΑ (Μέθοδος Γ.4-Β) III.1. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Καθορισμένος όγκος ανόργανου μέσου που περιέχει γνωστή συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας (10-40 mg DOC/l) σαν μοναδική πηγή οργανικού άνθρακα εμβολιάζεται με 0,5 ml λυμάτων ανά λίτρο μέσου. Το μείγμα αερίζεται στο σκοτάδι ή σε διάχυτο φως στους 22 ± 2  C. Η αποικοδόμηση παρακολουθείται με αναλύσεις DOC κατά τακτά χρονικά διαστήματα για μία περίοδο 28 ημερών. Ο βαθμός βιοαποικοδόμησης υπολογίζεται εκφράζοντας τη συγκέντρωση του απομακρυνθέντος DOC (διορθωμένη με βάση το αποτέλεσμα του τυφλού) σαν το εκατοστιαίο ποσοστό της υπάρχουσας αρχικής συγκέντρωσης. Ο βαθμός πρωταρχικής βιοαποικοδόμησης μπορεί επίσης να υπολογισθεί με πρόσθετη χημική ανάλυση που πραγματοποιείται στην αρχή και στο τέλος της επώασης. III.2. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ III.2.1. Εξοπλισμός (α) Κωνικές φιάλες, π.χ. 250 ml μέχρι 2 l, ανάλογα με τον όγκο που απαιτείται για την ανάλυση DOC G (β) Συσκευή ανατάραξης που δέχεται τις κωνικές φιάλες, είτε με αυτόματο έλεγχο θερμοκρασίας ή που χρησιμοποιείται σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας, και ικανής ισχύος ώστε να διατηρεί αερόβιες συνθήκες σε όλες τις φιάλες G (γ) Συσκευή διήθησης, με κατάλληλες μεμβράνες G (δ) Αναλύτης DOC G (ε) Συσκευή προσδιορισμού διαλελυμένου οξυγόνου G (στ) Φυγόκεντρος. III.2.2. Προετοιμασία ανόργανου μέσου Για την παρασκευή του αρχικού διαλύματος, βλ. I.6.2. Αναμειγνύονται 10 ml διαλύματος (α) με 800 ml νερού αραίωσης, προστίθεται 1 ml από τα διαλύματα (β) έως (δ) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι 1 λίτρο με νερό αραίωσης. Στη μέθοδο αυτή χρησιμοποιούνται μόνον 0,5 ml λυμάτων/λίτρο σαν εμβόλιο και κατά συνέπεια μπορεί το ανόργανο μέσο να χρειάζεται να ενισχυθεί με ιχνοστοιχεία και παράγοντες ανάπτυξης. Αυτό επιτυγχάνεται προσθέτοντας 1 ml από καθένα από τα ακόλουθα διαλύματα ανά λίτρο τελικού μέσου: Διάλυμα ιχνοστοιχείων: Τετράυδρο θειικό μαγγάνιο, ΜnSO4. 4H2O 39,9 mg Βορικό οξύ, Η3ΒΟ3 57,2 mg Επτάυδρος θειικός ψευδάργυρος, ZnSO4. 7H2O 42,8 mg Επταμολυβδαινικό αμμώνιο (ΝΗ4)6 Μo7Ο24 34,7 mg Χηλική ένωση Fe (FeCl3-αιθυλενοδιαμινο-τετραοξικό οξύ) 100,0 mg Τα ανωτέρω διαλύονται και συμπληρώνονται μέχρι όγκου 1 000 ml με νερό αραίωσης. Διάλυμα βιταμινών: Εκχύλισμα ζύμης 15,0 mg Το εκχύλισμα ζύμης διαλύεται σε 100 ml νερό. Αποστειρώνεται περνώντας το διαμέσου μεμβράνης 0,2 μικρών ή παρασκευάζεται πρόσφατα. III.2.3. Παρασκευή και προεγκλιματισμός εμβολίου Το εμβόλιο παράγεται από δευτερογενή λύματα εγκατάστασης κατεργασίας ή εργαστηριακής μονάδας που δέχεται κύρια οικιακά απόβλητα. Βλ. I.6.4.2. και I.6.5. Χρησιμοποιούνται 0,5 ml ανά λίτρο ανόργανου μέσου. III.2.4. Προετοιμασία των φιαλών Για παράδειγμα, σε δίλιτρες κωνικές φιάλες φέρονται ποσότητες ανόργανου μέσου όγκου 800 ml και προστίθενται επαρκείς ποσότητες αρχικών διαλυμάτων της εξεταζόμενης και της ουσίας αναφοράς σε ξεχωριστές φιάλες ώστε να επιτευχθεί συγκέντρωση χημικής ουσίας ισοδύναμη με 10-40 mg DOC/l. Ελέγχεται η τιμή του pH και ρυθμίζεται, αν είναι ανάγκη, στο 7,4. Οι φιάλες εμβολιάζονται με λύματα αποχετεύσεων σε ποσοστό 0,5 ml/λίτρο (βλ. I.6.4.2.). Παρασκευάζονται επίσης μάρτυρες εμβολίου στο ανόργανο μέσον αλλά χωρίς εξεταζόμενη ουσία ή ουσία αναφοράς. Αν χρειάζεται, χρησιμοποιείται μία φιάλη για να ελέγχεται η πιθανή ανασταλτική επίδραση της εξεταζόμενης ουσίας, εμβολιάζοντας ένα διάλυμα περιέχον, στο ανόργανο μέσον, συγκρίσιμες συγκεντρώσεις της εξεταζόμενης ουσίας και μιας ουσίας αναφοράς. Επίσης, αν απαιτείται, ετοιμάζεται μία ακόμη, αποστειρωμένη φιάλη για να ελεγχθεί αν η εξεταζόμενη ουσία αποικοδομείται αβιοτικά χρησιμοποιώντας μη εμβολιασμένο διάλυμα της ουσίας (βλ. 1.6.6.). Επιπλέον, αν υπάρχουν υποψίες ότι η εξεταζόμενη χημική ουσία προσροφάται σε σημαντικό βαθμό στο γυαλί, στη λάσπη, κ.λπ., γίνεται μία προκαταρκτική εκτίμηση για να προσδιορισθεί η πιθανή έκταση της προσρόφησης και με τον τρόπο αυτό η καταλληλότητα της δοκιμής για την χημική ουσία (βλ. Πίνακα 1). Τοποθετείται μια φιάλη που περιέχει την εξεταζόμενη ουσία, το εμβόλιο και τον φορέα αποστείρωσης. Τα διαλύματα σε όλες τις φιάλες συμπληρώνονται μέχρις όγκου 1 λίτρου με ανόργανο μέσο και, αφού ανακατευτούν, λαμβάνεται από κάθε φιάλη ένα δείγμα για να προσδιορισθεί η αρχική συγκέντρωση DOC (βλ. Παράρτημα II.4). Τα στόμια των φιαλών καλύπτονται, π.χ. με φύλλο αλουμινίου, έτσι ώστε να μπορεί να γίνεται ελεύθερα ανταλλαγή του αέρα μεταξύ φιάλης και ατμόσφαιρας. Κατόπιν, οι φιάλες εισάγονται στη συσκευή αναταράξης για να αρχίσει η δοκιμή. III.2.5. Αριθμός φιαλών σε μια τυπική διαδικασία δοκιμής Φιάλες 1 και 2: εναιώρημα εξεταζόμενης ουσίας Φιάλες 3 και 4: τυφλό εμβολίου Φιάλη 5: έλεγχος διαδικασίας και κατά προτίμηση όταν είναι απαραίτητο Φιάλη 6: στείρος αβιοτικός έλεγχος Φιάλη 7: έλεγχος προσρόφησης Φιάλη 8: έλεγχος τοξικότητας Βλέπε επίσης I.6.7. III.2.6. Εκτέλεση της δοκιμής Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, προσδιορίζονται οι συγκεντρώσεις DOC σε κάθε φιάλη δύο φορές σε καθορισμένα χρονικά διαστήματα αρκετά κοντινά ώστε να μπορεί να προσδιορισθεί η έναρξη του 10 ήμερου παραθύρου και η επί τοις εκατό απομάκρυνση στο τέλος του 10 ήμερου παραθύρου. Για κάθε προσδιορισμό λαμβάνεται μόνον ο ελάχιστος απαιτούμενος όγκος του εναιωρήματος δοκιμής. Πριν από τη δειγματοληφία, οι απώλειες από τις φιάλες εξαιτίας εξάτμισης αναπληρώνονται προσθέτοντας νερό αραίωσης (I.6.1.) στην απαιτούμενη ποσότητα εφόσον χρειάζεται. Πριν από τη λήψη ενός δείγματος, το μέσον καλλιέργειας αναμειγνύεται καλά και διασφαλίζεται ότι τυχόν υλικό προσκολλημένο στα τοιχώματα των φιαλών διαλύεται ή επαναφέρεται σε εναιώρηση πριν από τη δειγματοληψία. Αμέσως μετά τη λήψη δείγματος πρέπει να γίνει διήθηση από μεμβράνη ή φυγοκέντρηση (βλ. Παράρτημα II.4). Τα διηθημένα ή φυγοκεντρημένα δείγματα αναλύονται την ίδια ημέρα, διαφορετικά φυλάσσονται στους 2-4  C για 48 το πολύ ώρες, ή κάτω από τούς  18  C για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. III.3. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ III.3.1. Επεξεργασία των αποτελεσμάτων Υπολογίζεται η επί τοις εκατό αποικοδόμηση τη χρονική στιγμή t όπως αναφέρεται στο I.7.1. (προσδιορισμός DOC) και, προαιρετικά, στο I.7.2. (ειδική ανάλυση). Όλα τα αποτελέσματα καταγράφονται στα φύλλα δεδομένων. III.3.2. Εγκυρότητα των αποτελεσμάτων Βλ. I.5.2. III.3.3. Έκθεση Βλ. Ι.8. III.4. ΦΥΛΛΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Ένα παράδειγμα φύλλου δεδομένων δίνεται παρακάτω. TROPOPOIHMENH DOKIMH OΟΣΑ 1. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 2. ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΝΑΡΞΗΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 3. ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΗ ΟΥΣΙΑ Όνομα: Συγκέντρωση αρχικού διαλύματος: ... mg/l σαν ουσία Aρχική συγκέντρωση στο μέσον αραίωσης, to: ... mg/l σαν ουσία 4. ΕΜΒΟΛΙΟ Πηγή: ... Πραγματοποιηθείσα κατεργασία: ... Προεγκλιματισμός, εφόσον υπήρξε: ... Συγκέντρωση αιωρουμένων στερεών στο αντιδρόν μείγμα: ... mg/l 5. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΑΝΘΡΑΚΑ Αναλυτής άνθρακα: ... >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 6. ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΑΝΑΠΕΞΕΡΓΑΣΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 7. ΑΒΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ (προαιρετικός) >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> % αβιοτική αποικοδόμηση = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) Χ 100 8. ΕΙΔΙΚΗ ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ (προαιρετική) >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> ΜΕΡΟΣ IV. ΔΟΚΙΜΗ ΕΚΛΥΣΗΣ CO2 (Μέθοδος Γ.4-Γ) IV.1. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Καθορισμένος όγκος εμβολιασμένου ανόργανου μέσου με γνωστή συγκέντρωση εξεταζόμενης ουσίας (10-20 mg DOC ή TOC/l) σαν η αποκλειστική πηγή οργανικού άνθρακα αερίζεται διοχετεύοντας με ελεγχόμενη ταχύτητα αέρα απαλλαγμένο από διοξείδιο του άνθρακα στο σκοτάδι ή στο διάχυτο φώς. Η αποικοδόμηση παρακολουθείται για μία περίοδο 28 ημερών προσδιορίζοντας το παραγόμενο διοξείδιο του άνθρακα, το οποίο παγιδεύεται σε υδροξείδιο του βαρίου ή νατρίου και το οποίο μετριέται με ογκομέτρηση του εναπομείνοντος υδροξειδίου ή σαν ανόργανος άνθρακας. Η ποσότητα διοξειδίου του άνθρακα που παράγεται από την εξεταζόμενη χημική ουσία (διορθωμένη με βάση το αποτέλεσμα του τυφλού) εκφράζεται σαν το εκατοστιαίο ποσοστό του ThCO2. Ο βαθμός βιοαποικοδόμησης μπορεί επίσης να υπολογισθεί με πρόσθετη ανάλυση DOC που πραγματοποιείται στην αρχή και στο τέλος της επώασης. IV.2. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ IV.2.1. Εξοπλισμός (α) Φιάλες, 2-5 λίτρων, με σωλήνα προσαγωγής αέρα που σχεδόν αγγίζει τον πυθμένα και αντίστοιχη έξοδο G (β) Μαγνητικοί αναδευτήρες, όταν αξιολογούνται ασθενώς διαλυτικές χημικές ουσίες G (γ) Φιάλες απορρόφησης αερίου G (δ) Διάταξη ελέγχου μέτρησης της ροής του αέρα. (ε) Συσκευή δέσμευσης διοξειδίου του άνθρακα, για την παραγωγή αέρα που να είναι πλήρως απαλλαγμένος από διοξείδιο του άνθρακα G εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μείγμα οξυγόνου απαλλαγμένο από CO2 και αζώτου απαλλαγμένο από CO2, προερχόμενα από κυλίνδρους αερίων, στις σωστές αναλογίες  (20% Ο2: 80% N2) G (στ) Διάταξη προσδιορισμού διοξειδίου του άνθρακα, είτε ογκομετρικά είτε με κάποια μορφή αναλυτού ανόργανου άνθρακα G (ζ) Διάταξη διήθησης με μεμβράνη (προαιρετική) G (η) Αναλυτής DOC (προαιρετικός). IV.2.2. Προετοιμασία ανόργανου μέσου Για την ετοιμασία των αρχικών διαλυμάτων, βλ. I.6.2. Αναμειγνύονται 10 ml διαλύματος (α) με 800 ml νερό αραίωσης, προστίθεται 1 ml από τα διαλύματα (β) έως (δ) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι 1 λίτρο με νερό αραίωσης. IV.2.3. Ετοιμασία και προεγκλιματισμός εμβολίου Το εμβόλιο παράγεται από ποικιλία πηγών: ενεργοποιημένη λάσπη G λύματα αποχετεύσεων G επιφανειακά νερά G χώματα ή από μείγματα αυτών. Βλέπε Ι.6.4., I.6.4.1., Ι.6.4.2. και I.6.5. IV.2.4. Προετοιμασία των φιαλών Σαν παράδειγμα, οι τιμές όγκου και βάρους που αναφέρονται πιο κάτω, αντιστοιχούν σε πεντάλιτρες φιάλες που περιέχουν 3 λίτρα εναιωρήματος. Αν χρησιμοποιηθούν μικρότεροι όγκοι οι τιμές τροποποιούνται ανάλογα, πρέπει όμως να εξασφαλίζεται ότι το σχηματιζόμενο διοξείδιο του άνθρακα θα μπορεί να μετρηθεί σωστά. Σε κάθε πεντάλιτρη φιάλη προστίθενται 2 400 ml ανόργανου μέσου. Προστίθεται ο κατάλληλος όγκος από την παρασκευασθείσα ενεργοποιημένη λάσπη (βλ. I.6.4.1. και I.6.5.) ώστε να ληφθεί συγκέντρωση εναιωρούμενων στερεών όχι μεγαλύτερη από 30 mg/l στον τελικό όγκο των 3 λίτρων του εμβολιασμένου μείγματος. Εναλλακτικά, πρώτα αραιωνεται η παρασκευασμένη λάσπη ώστε να ληφθεί εναιώρημα 500-1 000 mg/l στο ανόργανο μέσον προτού προστεθεί η κατάλληλη ποσότητα στο περιεχόμενο της πεντάλιτρης φιάλης έτσι ώστε να επιτευχθεί συγκέντρωση 30 mg/l G με τον τρόπο αυτό εξασφαλίζεται μεγαλύτερη ακρίβεια. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες πηγές εμβολίου (βλ. I.6.4.2.). Στα εμβολιασμένα αυτά μείγματα εμφυσάται όλη τη νύκτα αέρας απαλλαγμένος από CO2 ώστε να καθαρισθεί το σύστημα από CO2. Προστίθεται η εξεταζόμενη ουσία και η ουσία αναφοράς, ξεχωριστά, σαν γνωστοί όγκοι αρχικών διαλυμάτων, σε αντίστοιχες φιάλες ώστε να επιτευχθούν συγκεντρώσεις, μαζί με τις προστεθείσες ουσίες, από 10 έως 20 mg DOC ή TOC/l G σε ορισμένες φιάλες δεν προστίθεται ουσία ώστε να χρησιμεύσουν σαν εμβολιασμένοι μάρτυρες. Οι ασθενώς διαλυτές εξεταζόμενες ουσίες προστίθενται απ'ευθείας στις φιάλες με βάση τον όγκο ή το βάρος ή ακολουθείται η διαδικασία του Παραρτήματος III. Εφόσον απαιτείται, μία φιάλη χρησιμοποιείται για να ελεγχθεί πιθανή ανασταλτική επίδραση της εξεταζόμενης ουσίας, προσθέτοντας και τις εξεταζόμενες και τις ουσίες αναφοράς στην ίδια συγκέντρωση με εκείνη των άλλων φιαλών. Επίσης, εφόσον απαιτείται, χρησιμοποιείται μία στείρα φιάλη για να ελεγχθεί μήπως η εξεταζόμενη ουσία αποικοδομείται αβιοτικά χρησιμοποιώντας μη εμβολιασμένο διάλυμα της ουσίας (βλ. I.6.6). Αποστειρώνεται με προσθήκη μιας τοξικής ουσίας στην κατάλληλη συγκέντρωση. Ο όγκος των εναιωρημάτων σε όλες τις φιάλες συμπληρώνεται μέχρι τα 3 λίτρα προσθέτοντας ανόργανο μέσον στο οποίο έχει εμφυσηθεί προηγουμένως αέρας απαλλαγμένος από CO2. Προαιρετικά, μπορούν να ληφθούν δείγματα για ανάλυση DOC (βλ. Παράρτημα II.4.) και/ή ειδική ανάλυση. Οι φιάλες προσρόφησης συνδέονται με τις εξόδους αέρα των φιαλών. Αν χρησιμοποιηθεί υδροξείδιο του βαρίου, σε κάθε πεντάλιτρη φιάλη συνδέονται εν σειρά τρεις φιάλες προσρόφησης που κάθε μία περιέχει 100 ml διαλύματος υδροξειδίου του βαρίου 0,0125 Μ. Το διάλυμα δεν πρέπει να περιέχει ίζημα θειικών και ανθρακικών ενώ η ισχύς του πρέπει να προσδιορίζεται αμέσως πριν από τη χρήση του. Αν χρησιμοποιηθεί υδροξείδιο του νατρίου, συνδέονται δύο παγίδες από τις οποίες η δεύτερη προορίζεται για να ελέγχεται αν έχει δεσμευθεί όλο το διοξείδιο του άνθρακα στην πρώτη. Ιδιαίτερα κατάλληλες είναι οι φιάλες προσρόφησης που είναι εφοδιασμένες με πώματα φιαλών ορού. Σε κάθε φιάλη προστίθενται 200 ml υδροξειδίου του νατρίου 0,05 Μ, ποσότητα που αρκεί για την προσρόφηση όλης της ποσότητας διοξειδίου του άνθρακα που εκλύεται όταν αποικοδομηθεί πλήρως η εξεταζόμενη ουσία. Το διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου, ακόμη κι όταν είναι πρόσφατα παρασκευασμένο, περιέχει ίχνη ανθρακικών. Αυτό διορθώνεται αφαιρώντας τα ανθρακικά του τυφλού. IV.2.5. Αριθμός φιαλών σε μία τυπική διαδικασία δοκιμής Φιάλες 1 και 2: εναιώρημα εξεταζόμενης ουσίας Φιάλες 3 και 4: τυφλό εμβολίου Φιάλη 5: έλεγχος διαδικασίας και κατά προτίμηση όταν είναι απαραίτητο Φιάλη 6: στείρος αβιοτικός έλεγχος Φιάλη 7: έλεγχος προσρόφησης Φιάλη 8: έλεγχος τοξικότητας Βλέπε επίσης I.6.7. IV.2.6. Εκτέλεση της δοκιμής Η δοκιμή αρχίζει διοχετεύοντας αέρα απαλλαγμένο από CO2 διαμέσου των εναιωρημάτων με ρυθμό παροχής 30-100 ml/min. Για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας σε CO2 λαμβάνονται περιοδικά δείγματα προσροφημένου διοξειδίου του άνθρακα. Τις πρώτες δέκα ημέρες συνιστάται οι αναλύσεις να πραγματοποιούνται κάθε δεύτερη ή τρίτη ημέρα και κατόπιν κάθε πέμπτη ημέρα μέχρι την 28η ημέρα έτσι ώστε να μπορεί να πιστωποιηθεί η περίοδος του 10 ήμερου παραθύρου. Την 28η ημέρα, λαμβάνονται δείγματα (προαιρετικά) για ανάλυση DOC και/ή ειδική ανάλυση, μετριέται το pH των εναιωρημάτων και προστίθεται 1 ml πυκνού υδροχλωρικού οξέος σε κάθε φιάλη. Στις φιάλες διοχετεύεται όλη τη νύκτα αέρας για να απομακρυνθεί το διοξείδιο του άνθρακα που υπάρχει στα εξεταζόμενα εναιωρήματα. Την 29η ημέρα, πραγματοποιείται η τελευταία ανάλυση του εκλυόμενου διοξειδίου του άνθρακα. Τις ημέρες που πραγματοποιείται η μέτρηση του CO2, η πλησιέστερη στη φιάλη παγίδα υδροξειδίου του βαρίου αποσυνδέεται και το διάλυμα του υδροξειδίου τιτλοδοτείται με HCl 0,05 M χρησιμοποιώντας σαν δείκτη φαινολοφθαλίνη. Οι εναπομένουσες φιάλες προσρόφησης μετακινούνται μία θέση πλησιέστερα στη φιάλη και στο απώτερο άκρο της σειράς τοποθετείται μιά νέα παγίδα περιέχουσα 100 ml πρόσφατα παρασκευασθέντος υδροξειδίου του βαρίου 0,0125 Μ. Οι τιτλοδοτήσεις γίνονται ανάλογα με το πότε κρίνεται απαραίτητο, π.χ., όταν εμφανίζεται σημαντική ποσότητα ιζήματος στην πρώτη παγίδα και προτού εμφανισθεί ίζημα στη δεύτερη, ή τουλάχιστον μιά φορά την εβδομάδα. Εναλλακτικά, όταν χρησιμοποιείται σαν μέσον προσρόφησης το NaOH, λαμβάνεται με σύριγγα μικρό δείγμα (ανάλογα με τα χαρακτηριστικά του χρησιμοποιούμενου αναλυτή άνθρακα) του διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου από τη φιάλη προσρόφησης που είναι πλησιέστερα στη φιάλη δοκιμής. Το δείγμα εισάγεται στο τμήμα IC του αναλυτή άνθρακα για τον απευθείας προσδιορισμό του εκλυθέντος διοξειδίου του άνθρακα. Το περιεχόμενο της δεύτερης παγίδας υποβάλλεται σε ανάλυση στο τέλος μόνον της δοκιμής ώστε να γίνουν τυχόν διορθώσεις εφόσον έχει διαφύγει στη δεύτερη παγίδα ποσότητα διοξειδίου του άνθρακα. IV.3. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ IV.3.1. Επεξεργασία των αποτελεσμάτων Η ποσότητα του CO2 που δεσμεύεται σε φιάλη προσρόφησης μπορεί να υπολογισθεί, μετά την τιτλοδότηση, με τον ακόλουθο τύπο: mg CO2 = (100 Χ CB   0,5 Χ V Χ CA) Χ 44 όπου: V = όγκος HCl που απαιτήθηκε για την ογκομέτρηση των 100 ml στη φιάλη προσρόφησης (ml), CB = συγκέντρωση του διαλύματος υδροξειδίου του βαρίου (Μ), CA = συγκέντρωση του διαλύματος υδροχλωρικού οξέος (Μ), εάν η CB είναι 0,0125 Μ και CA είναι 0,05 Μ, η τιτλοδότηση των 100 ml υδροξειδίου του βαρίου απαιτεί 50 ml και το βάρος του CO2 δίνεται από τον τύπο: 0,052 Χ 44 Χ ml τιτλοδοτούμενου HCl = 1,1 Χ ml HCl Έτσι, στην περίπτωση αυτή, για την μετατροπή του όγκου του απαιτηθέντος HCl σε mg παραχθέντος CO2 ο συντελεστής είναι 1,1. Υπολογίζεται το βάρος του CO2 που παρήχθη μόνο από το εμβόλιο και από το εμβόλιο μαζί με την εξεταζόμενη χημική ουσία χρησιμοποιώντας τις αντίστοιχες τιμές τιτλοδότησης και η διαφορά είναι το βάρος του CO2 που παρήχθη από τη χημική ουσία μόνη της. Για παράδειγμα, άν το εμβόλιο μόνο του παρέχει όγκο τιτλοδότησης 48 ml και το εμβόλιο μαζί με τη χημική ουσία παρέχει 45 ml, τότε CO2 από εμβόλιο = 1,1 Χ (50-48) = 2,2 mg CO2 από το εμβόλιο μαζί με χημική ουσία = 1,1 Χ (50-45) = 5,5 mg και έτσι το βάρος του CO2 που παράγεται από την εξεταζόμενη ουσία είναι 3,3 mg. Η βιοαποικοδόμηση επί τοις εκατό υπολογίζεται με τον τύπο: % αποικοδόμηση = ThCO2 Χ mg προστειθείσας χημικής παραχθένταmg παραχθέντα CO2 Χ 100 h, % αποικοδόμηση = mg προστεθέντος στη δοκιμή TOC Χ 3,67mg παραχθέντα CO2 Χ 100 όπου το 3,67 είναι ο συντελεστής μετατροπής (44/12) του άνθρακα σε διοξείδιο του άνθρακα. Η επί τοις εκατό αποικοδόμηση μετά από ένα ορισμένο χρονικό διάστημα υπολογίζεται προσθέτοντας το ποσοστό των τιμών ThCO2 που υπολογίζονται για κάθε μια από τις ημέρες, μέχρι τη χρονική στιγμή, κατά την οποία έγινε η μέτρηση. Στην περίπτωση φιαλών προσρόφησης με υδροξείδιο του νατρίου, η ποσότητα του παραγομένου διοξειδίου του άνθρακα υπολογίζεται, εκφρασμένη σε IC (mg), πολλαπλασιάζοντας τη συγκέντρωση του IC στο μέσον προσρόφησης επί τον όγκο του μέσου προσρόφησης. Η επί τοις εκατό αποικοδόμηση υπολογίζεται με τον τύπο: % ThCO2 =  mg IC από τη φιάλη δοκιμής   mg IC από το τυφλό mg που προστέθηκαν ως εξεταζόμενη ουσία TOC Χ 100 Οι τιμές του απομακρυνθέντος DOC (προαιρετικά) υπολογίζονται όπως περιγράφεται στο 1.7. Οι τιμές αυτές καθώς και όλα τα άλλα αποτελέσματα καταγράφονται στα φύλλα δεδομένων. IV.3.2. Εγκυρότητα των αποτελεσμάτων Η περιεκτικότητα σε IC του εναιωρήματος της εξεταζόμενης χημικής ουσίας στο ανόργανο μέσον στην αρχή της δοκιμής πρέπει να είναι μικρότερη του 5% του TC και η ολική έκλυση CO2 στο τυφλό στο τέλος της δοκιμής δεν θα πρέπει κανονικά να υπερβαίνει τα 40 mg/l μέσου. Εάν ληφθούν τιμές μεγαλύτερες από 70 mg CO2/l, θα πρέπει να γίνει επανεξέταση των δεδομένων και της πειραματικής τεχνικής. Βλ. επίσης I.5.2. IV.3.3. Έκθεση Βλ. I.8. IV.4. ΦΥΛΛΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Ένα παράδειγμα φύλλου δεδομένων δίνεται παρακάτω. KOHLENDIOXIDENTWICKLUNGSTEST 1. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 2. ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΝΑΡΞΗΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 3. ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΗ ΟΥΣΙΑ Όνομα: Συγκέντρωση αρχικού διαλύματος: ... mg/l σαν ουσία Αρχική συγκέντρωση στο ανόργανο μέσον: ... mg/l σαν ουσία Συνολική ποσότητα C προστειθέμενη στη φιάλη: ... mg C ThCO2: ... mg CO2 4. ΕΜΒΟΛΙΟ Πηγή: ... Πραγματοποιηθείσα κατεργασία: ... Προεγκλιματισμός, εφόσον υπήρξε: ... Συγκέντρωση αιωρούμενων στερεών στο αντιδρόν μείγμα: ... mg/l 5. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΔΙΟΞΕΙΔΙΟΥ ΤΟΥ ΑΝΘΡΑΚΑ ΚΑΙ ΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΙΜΟΤΗΤΑ Mέθοδος: Ba(OH)2/NaOH/άλλα ... >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 6. ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΝΘΡΑΚΑ (προαιρετική) Αναλυτής άνθρακα: ... >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> % DOC-απομακρυνθείς = 1    Ct    Cb(t) Co   Cb(o) Χ 100 7. ΑΒΙΟΤΙΚΗ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ (προαιρετική) % αβιοτική αποικοδόμηση = CO2-Σχηματισθέν στείρα φιάλη μετά 28 ημέρες (mg)ThCO2 (mg) Χ 100 ΜΕΡΟΣ V. ΔΟΚΙΜΗ ΜΑΝΟΜΕΤΡΙΚΗΣ ΑΝΑΠΝΕΥΣΙΟΜΕΤΡΙΑΣ (Μέθοδος Γ.4-Δ) V.1. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Μετρημένος όγκος εμβολιασμένου ανόργανου μέσου με γνωστή συγκέντρωση εξεταζόμενης ουσίας (100 mg/l εξεταζόμενη ουσία ώστε να λαμβάνονται τουλάχιστον 50-100 mg ThOD/l) σαν η μόνη και αποκλειστική πηγή οργανικού άνθρακα, αναδεύεται σε κλειστή φιάλη σε σταθερή θερμοκρασία (± 1  C ή και λιγότερο) για χρονικό διάστημα μέχρι 28 ημέρες. Η κατανάλωση οξυγόνου προσδιορίζεται είτε μετρώντας την ποσότητα οξυγόνου (που παράγεται ηλεκτρολυτικά) που απαιτείται για να διατηρηθεί σταθερός ο όγκος των αερίων στην αναπνευσιομετρική φιάλη είτε από την αλλαγή του όγκου ή της πίεσης (ή και συνδυασμού των δύο) στη συσκευή. Το εκλυόμενο διοξείδιο του άνθρακα προσροφάται σε διάλυμα υδροξειδίου του καλίου ή σε άλλο κατάλληλο προσροφητικό μέσο. Η ποσότητα οξυγόνου που αναλώνεται από την εξεταζόμενη ουσία (διορθωμένη σε σχέση με την ανάλωση στο τυφλό, το οποίο διεξάγεται παράλληλα) εκφράζεται σαν το εκατοστιαίο ποσοστό του ThOD ή COD. Προαιρετικά, πρωτογενής βιοαποικοδόμηση μπορεί επίσης να υπολογισθεί με συμπληρωματική ειδική ανάλυση DOC πραγματοποιούμενη στην αρχή και στο τέλος της επώασης και στη φάση της τελικής βιοαποικοδόμησης. V.2. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ V.2.1. Εξοπλισμός (α) κατάλληλο αναπνευσιόμετρο G (β) διάταξη ελέγχου θερμοκρασίας, με ανοχή ± 1  C ή λιγότερο G (γ) διάταξη διήθησης με μεμβράνη (προαιρετική) G (δ) αναλυτής άνθρακα (προαιρετικός). V.2.2. Προετοιμασία του ανόργανου μέσου Για την ετοιμασία των αρχικών διαλυμάτων, βλ. Ι.6.2. Αναμειγνύονται 10 ml διαλύματος (α) με 800 ml νερό αραίωσης, προστίθεται 1 ml από τα διαλύματα (β) έως (δ) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι το 1 λίτρο με νερό αραίωσης. V.2.3. Παρασκευή και προεγκλιματισμός εμβολίου Το εμβόλιο παράγεται από ποικιλία πηγών: ενεργοποιημένη λάσπη G λύματα αποχετεύσεων G επιφανειακά νερά G χώματα ή από μείγματα αυτών. Βλέπε Ι.6.4., I.6.4.1., Ι.6.4.2. και I.6.5. V.2.4. Προετοιμασία των φιαλών Παρασκευάζονται διαλύματα της εξεταζόμενης ουσίας και της ουσίας αναφοράς, ξεχωριστά, σε ανόργανο μέσον που να αντιστοιχούν σε συγκέντρωση, κανονικά, 100 mg ουσίας/l (που αντιστοιχεί  σε 50-100 mg ThOD/l τουλάχιστον), χρησιμοποιώντας αρχικά διαλύματα. Υπολογίζεται το ThOD βάσει του σχηματισμού αμμωνιακών αλάτων εκτός κι αν αναμένεται νιτροποίηση, οπότε ο υπολογισμός θα πρέπει να βασίζεται στο σχηματισμό νιτρικών (βλ. Παράρτημα II.2.) Προσδιορίζονται οι τιμές pH και, εφόσον χρειάζεται, ρυθμίζονται στο 7,4 ± 0,2. Ασθενώς διαλυτές ουσίες θα πρέπει να προστίθενται σε ένα μεταγενέστερο στάδιο (βλ. παρακάτω). Εάν πρέπει να προσδιορισθεί η τοξικότητα της εξεταζόμενης ουσίας, παρασκευάζεται ένα ακόμη διάλυμα σε ανόργανο μέσον που περιέχει τόσο την εξεταζόμενη ουσία όσο και την ουσία αναφοράς με τις ίδιες συγκεντρώσεις όπως και στα ατομικά διαλύματα. Εάν απαιτείται να μετρηθεί η φυσικοχημική ανάλωση οξυγόνου, παρασκευάζεται διάλυμα της εξεταζόμενης ουσίας που αντιστοιχεί, κανονικά, σε 100 mg ThOD/l και το οποίο αποστειρώνεται με την προσθήκη κατάλληλης τοξικής ουσίας. (βλ. Ι.6.6.). Σε διπλές τουλάχιστον φιάλες, φέρεται ο αναγκαίος όγκος διαλυμάτων εξεταζόμενης ουσίας και της ουσίας αναφοράς. Σε άλλες φιάλες φέρεται μόνον ανόργανο μέσον (σαν μάρτυρας εμβολίου) και, εφόσον απαιτείται, το μεικτό διάλυμα εξεταζόμενης/ουσίας αναφοράς και το στείρο διάλυμα. Εάν η εξεταζόμενη ουσία είναι ασθενώς διαλυτή, η ουσία προστίθεται απ' ευθείας στο στάδιο αυτό με βάση το βάρος ή τον όγκο ή ακολουθείται η διαδικασία που περιγράφεται στο Παράρτημα III. Προστίθεται υδροξείδιο του καλίου, σφαιρίδια νατρασβέστου ή άλλο προσροφητικό μέσον στις φιάλες προσρόφησης του CO2. V.2.5. Αριθμός φιαλών σε μία τυπική διαδικασία δοκιμής Φιάλες 1 και 2: εναιώρημα εξεταζόμενης ουσίας Φιάλες 3 και 4: τυφλό εμβολίου Φιάλη 5: έλεγχος διαδικασίας και κατά προτίμηση όταν είναι απαραίτητο Φιάλη 6: στείρος αβιοτικός έλεγχος Φιάλη 7: έλεγχος τοξικότητας Βλέπε επίσης I.6.7. V.2.6. Εκτέλεση της δοκιμής Οι φιάλες αφήνονται να φθάσουν στην επιθυμητή θερμοκρασία και αυτές που πρέπει εμβολιάζονται με παρασκευασθείσα ενεργοποιημένη λάσπη ή άλλη πηγή εμβολίου έτσι ώστε να ληφθεί συγκέντρωση αιωρουμένων στερεών που να μην είναι μεγαλύτερη από 30 mg/l. Η όλη διάταξη συναρμολογείται, τίθεται σε λειτουργία ο αναδευτήρας και ελέγχεται η στεγανότητα και αρχίζει η μέτρηση της ανάλωσης οξυγόνου. Συνήθως δεν χρειάζεται καμία άλλη ιδιαίτερη πρόνοια εκτός από το να λαμβάνονται οι αναγκαίες μετρήσεις και να γίνονται καθημερινοί έλεγχοι για να διαπιστώνεται αν διατηρούνται η σωστή θερμοκρασία και η κατάλληλη ανάδευση. Η ανάλωση του οξυγόνου υπολογίζεται από τις μετρήσεις που γίνονται σε τακτά χρονικά διαστήματα, χρησιμοποιώντας τις μεθόδους που αναφέρει ο κατασκευαστής του εξοπλισμού. Στο τέλος της επώασης, που είναι κανονικά 28 ημέρες, μετριέται το pH του περιεχομένου των φιαλών, ιδιαίτερα αν οι αναλώσεις οξυγόνου είναι μικρότερες ή μεγαλύτερες από την ThODNH4 (για ενώσεις που περιέχουν άζωτο). Εφόσον απαιτείται, στην αρχή και στο τέλος, λαμβάνονται από τις αναπνευσιομετρικές φιάλες δείγματα, για ανάλυση DOC ή ειδικής χημικής ουσίας (βλ. Παράρτημα II.4). Στην αρχική δειγματολειφία, εξασφαλίζεται ότι ο όγκος του εξεταζόμενου εναιωρήματος που παραμένει στη φιάλη είναι γνωστός. Όταν το οξυγόνο καταναλώνεται από εξεταζόμενη ουσία που περιέχει Ν, προσδιορίζεται η αύξηση στη συγκέντρωση νιτρωδών και νιτρικών σε διάστημα 28 ημερών και υπολογίζεται η διόρθωση για το οξυγόνο που καταναλώνεται με τη νιτροποίηση (Παράρτημα V). V.3. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ V.3.1. Επεξεργασία των αποτελεσμάτων Η ανάλωση οξυγόνου (mg) της εξεταζόμενης ουσίας μετά από δεδομένο χρονικό διάστημα (διoρθωμένη σε σχέση με την ανάλωση του τυφλού για το ίδιο χρονικό διάστημα) διαιρείται με το βάρος της χρησιμοποιούμενης εξεταζόμενης χημικής ουσίας. Το λαμβανόμενο αποτέλεσμα παρέχει το BOD εκφρασμένο σαν mg οξυγόνου/mg εξεταζόμενης ουσίας, δηλ.: BOD = mg O2-ανάλωση από την εξεταζόμενη ουσία   ανάλωση O   mg O2-από το τυφλόmg εξεταζόμενης ουσίας στη φιάλη = mg O2 ανά mg εξεταζόμενης ουσίας. Η επί τοις εκατό βιοαποικοδόμηση υπολογίζεται είτε από: % βιοαποικοδόμηση % ThOD =  BOD (mg O2/mg ουσίας) ThOD (mg O2/mg ουσίας) Χ 100 ή από: % COD =  BOD (mg O2/mg ουσίας)COD (mg O2/mg ουσίας) Χ 100 Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι δύο αυτές μέθοδοι δεν δίνουν κατ' ανάγκη την ίδια τιμή G προτιμότερο είναι να χρησιμοποιείται η πρώτη μέθοδος. Για τις εξερταζόμενες ουσίες που περιέχουν άζωτο, χρησιμοποιείται η κατάλληλη παράμετρος ThOD σύμφωνα με το τι είναι γνωστό ή τι αναμένεται όσον αφορά τη μεσολάβηση νιτροποίησης (Παράρτημα ΙΙ.2). Εάν παρ'όλα αυτά, πέρχεται νιτροποίηση που δεν είναι όμως πλήρης, υπολογίζεται μία ιορθωτική τιμή για το οξυγόνο που καταναλίσκεται για νιτροποίηση από τις αλλαγές στη συγκέντρωση των νιτρωδών και νιτρικών (Παράρτημα V). Όταν εκτελούνται προαιρετικοί προσδιορισμοί οργανικού άνθρακα και/ή ειδικής χημικής ουσίας, η επί τοις εκατό αποικοδόμηση υπολογίζεται όπως περιγράφεται στο I.7. Όλα τα αποτελέσματα καταγράφονται στα φύλλα δεδομένων. V.3.2. Εγκυρότητα των αποτελεσμάτων Η κατανάλωση οξυγόνου από το τυφλό του εμβολίου είναι κανονικά 20-30 mg O2/l και δεν θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 60 mg/l σε 28 ημέρες. Τιμές μεγαλύτερες από 60 mg/l απαιτούν επισταμένη εξέταση των δεδομένων και των πειραματικών τεχνικών. Εάν η τιμή του pH είναι έξω από τα όρια του 6-8,5 και η κατανάλωση οξυγόνου από την εξεταζόμενη ουσία είναι μικρότερη του 60%, η δοκιμή θα πρέπει να επαναληφθεί με μικρότερη συγκέντρωση εξεταζόμενης ουσίας. Βλ. επίσης I.5.2. V.3.3. Έκθεση Βλ. I.8 V.4. ΦΥΛΛΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Ένα παράδειγμα φύλλου δεδομένων δίνεται παρακάτω. ΔΟΚΙΜΗ ΜΑΝΟΜΕΤΡΙΚΗΣ ΑΝΑΠΝΕΥΣΙΟΜΕΤΡΙΑΣ 1. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 2. ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΝΑΡΞΗΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 3. ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΗ ΟΥΣΙΑ Όνομα: Συγκέντρωση αρχικού διαλύματος: ... mg/l σαν ουσία Αρχική συγκέντρωση στο ανόργανο μέσον, Co: ... mg/l σαν ουσία Όγκος στη φιάλη δοκιμής (V): ... ThOD ή COD: ... mgO2/mg ουσίας εξεταζόμενης (NH4, NO3) 4. ΕΜΒΟΛΙΟΠηγή: ... Πραγματοποιηθείσα κατεργασία: ... Προεγκλιματισμός, εφόσον υπήρξε: ... Συγκέντρωση αιωρουμένων στερεών στο αντιδρόν μείγμα: ... mg/l ΑΝΑΛΩΣΗ ΟΞΥΓΟΝΟΥ: ΒΙΟΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΙΜΟΤΗΤΑ >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 6. ΔΙΟΡΘΩΣΗ ΓΙΑ ΝΙΤΡΟΠΟΙΗΣΗ (Βλέπε Παράρτημα V) >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 7. ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΝΘΡΑΚΑ (προαιρετική) Αναλυτής άνθρακα: ... >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> % DOC-απομακρυνθείς = 1    Ct   Cblt Co   Cblo Χ 100 8. ΕΙΔΙΚΗ ΧΗΜΙΚΗ ΟΥΣΙΑ (προαιρετική) Sb = συγκέντρωση σε φυσικοχημικό (στείρο) μάρτυρα στις 28 ημέρες. Sa = συγκέντρωση σε εμβολιασμένη φιάλη στις 28 ημέρες % βιοαποικοδόμηση = Sb   SaSb Χ 100 9. ΑΒΙΟΤΙΚΗ ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ (προαιρετική) a = κατανάλωση οξυγόνου σε στείρες φιάλες μετά από 28 ημέρες (mg) κατανάλωση οξυγόνου ανά mg εξεταζόμενης ουσίας = CoVa (βλέπε τμήματα 1 και 3) % αβιοτική αποικοδόμηση = CoV Χ ThODa Χ 100 ΜΕΡΟΣ VI. ΔΟΚΙΜΗ ΚΛΕΙΣΤΗΣ ΦΙΑΛΗΣ (Μέθοδος Γ. 4-Ε) VI.1. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΔΟΚΙΜΗΣ Το διάλυμα της εξεταζόμενης ουσίας σε ανόργανο μέσο, συνήθως 2-5 mg/l, εμβολιάζεται με σχετικά μικρό αριθμό μικροοργανισμών από μεικτό πληθυσμό και φυλάσσεται σε πλήρως γεμισμένες, κλειστές φιάλες στο σκοτάδι σε σταθερή θερμοκρασία. Η αποικοδόμηση παρακολουθείται με ανάλυση του διαλελυμένου οξυγόνου για χρονικό διάστημα 28 ημερών. Η ποσότητα του οξυγόνου που καταναλίσκεται από την εξεταζόμενη ουσία, διορθωμένη κατά την ανάλωση του τυφλού που διενεργείται παράλληλα, εκφράζεται σαν το εκατοστιαίο ποσοστό του ThOD ή COD. VI.2. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ VI.2.1. Εξοπλισμός α) Φιάλες BOD, με γυάλινα πώματα, π.χ. 250-300 ml. β) Υδρόλουτρο ή επωαστικός θάλαμος, για να διατηρούνται οι φιάλες σε σταθερή θερμοκρασία (± 1  C ή και λιγότερο) μακρυά από το φως G γ) Μεγάλες γυάλινες φιάλες (2-5 λίτρων) για την ετοιμασία των ανόργανων μέσων και για το γέμισμα των φιαλών BOD G δ) Ηλεκτρόδιο και μετρητής οξυγόνου, ή όργανα και αντιδραστήρια για τιτλοδότηση Winkler. VI.2.2. Προετοιμασία του ανόργανου μέσου Για την ετοιμασία του αρχικού διαλύματος, βλ. Ι.6.2. Αναμειγνύεται 1 ml διαλύματος (α) έως (δ) και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι το ένα λίτρο με νερό αραίωσης. VI.2.3. Ετοιμασία του εμβολίου Το εμβόλιο κανονικά παράγεται από δευτερογενή λύματα μονάδας κατεργασίας ή εργαστηριακής μονάδας που δέχεται κυρίως οικιακά λύματα. Εναλλακτική πηγή εμβολίου είναι τα επιφανειακά νερά. Χρησιμοποιούνται κανονικά μιά σταγόνα (0,05 ml) έως 5 ml διηθήματος ανά λίτρο μέσου. Πιθανόν να χρειασθούν δοκιμές για τον καθορισμό του καταλλήλου όγκου για δεδομένα λύματα. (βλέπε Ι.6.4.2. και Ι.6.5.) VI.2.4. Προετοιμασία των φιαλών Στο ανόργανο μέσο διαβιβάζεται για τουλάχιστον 20 λεπτά, ισχυρό ρεύμα αέρα. Κάθε σειρά δοκιμών πραγματοποιείται με ανόργανο μέσο που προέρχεται από την ίδια παρτίδα. Γενικά, το μέσο είναι έτοιμο να χρησιμοποιηθεί αφού παραμείνει επί 20 ώρες στη θερμοκρασία δοκιμής. Προσδιορίζεται η συγκέντρωση του διαλελυμένου οξυγόνου για να χρησιμεύσει σαν μάρτυρας. Η τιμή θα πρέπει να είναι περίπου 9 mg/l στους 20  C. Όλες οι εργασίες μεταφοράς και γεμίσματος του κορεσμένου σε αέρα μέσου διεξάγονται χωρίς να υπάρχουν φυσαλλίδες, π.χ., χρησιμοποιώντας σιφώνια. Ετοιμάζονται παράλληλες ομάδες φιαλών BOD για τον προσδιορισμό της εξεταζόμενης ουσίας και της ουσίας αναφοράς σε ταυτόχρονες πειραματικές σειρές. Επαρκής αριθμός φιαλών BOD, συμπεριλαμβανομένων και φιαλών τυφλού, συνδυάζονται έτσι ώστε να μπορούν να γίνουν διπλές τουλάχιστον μετρήσεις κατανάλωσης οξυγόνου στις επιθυμητές χρονικές στιγμές, π.χ., μετά 0, 7, 14, 21 και 28 ημέρες. Για να εξασφαλισθεί η δυνατότητα αναγνώρισης του 10 ήμερου παραθύρου, μπορεί να απαιτηθούν περισσότερες φιάλες. Ανόργανο μέσο που έχει υποστεί πλήρη αερισμό, φέρεται σε μεγάλες φιάλες έτσι ώστε αυτές να είναι γεμάτες περίπου κατά το ένα τρίτο. Προστίθεται κατόπιν επαρκής ποσότητα των αρχικών διαλυμάτων της εξεταζόμενης ουσίας και της ουσίας αναφοράς σε ξεχωριστές μεγάλες φιάλες έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση των ουσιών να μην είναι κανονικά μεγαλύτερη από 10 mg/l. Στο μέσο που θα παίξει ρόλο τυφλού και περιέχεται σε μία άλλη μεγάλη φιάλη, δεν προστίθεται καμία από τις ουσίες. Προκειμένου να εξασφαλισθεί ο μη περιορισμός της δραστικότητας του εμβολίου, η συγκέντρωση του διαλελυμένου οξυγόνου δεν πρέπει να πέφτει κάτω από τα 0,5 mg/l στις φιάλες BOD. Αυτό περιορίζει τη συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας σε 2 mg/l περίπου. Παρ' όλα αυτά, για ασθενώς αποικοδομήσιμες ενώσεις και για ενώσεις με χαμηλό ThOD, μπορούν να χρησιμοποιηθούν 5-10 mg/l. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μπορεί να είναι επιθυμητό να ετοιμασθούν παράλληλες σειρές εξεταζόμενης ουσίας με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις, για παράδειγμα, 2 και 5 mg/l. Κανονικά, το ThOD υπολογίζεται με βάση τον σχηματισμό αμμωνιακών αλάτων αλλά, αν αναμένεται ή είναι γνωστό ότι επήλθε νιτροποίηση, υπολογίζεται με βάση τον σχηματισμό νιτρικών (ThODNO3: βλέπε Παράρτημα II.2). Παρ'όλα αυτά, αν επέρχεται νιτροποίηση χωρίς να είναι πλήρης, γίνονται διορθώσεις με βάση τις αλλαγές στη συγκέντρωση νιτρωδών και νιτρικών, που προσδιορίζεται με ανάλυση (βλέπε Παράρτημα V). Εάν πρέπει να διερευνηθεί η τοξικότητα της εξεταζόμενης ουσίας (στην περίπτωση, για παράδειγμα, που έχει βρεθεί προηγούμενα χαμηλή τιμή βιοαποικοδομησιμότητας), χρειάζεται μία άλλη σειρά φιαλών. Ετοιμάζεται μια άλλη μεγάλη φιάλη που περιέχει ανόργανο μέσον που έχει υποβληθεί σε εμφύσηση αέρα (στο ένα τρίτο περίπου του όγκου της) μαζί με εξεταζόμενη ουσία και ουσία αναφοράς. Οι τελικές συγκεντρώσεις είναι κανονικά οι ίδιες με τις συγκεντρώσεις στις άλλες μεγάλες φιάλες. Τα διαλύματα στις μεγάλες φιάλες εμβολιάζονται με δευτερογενή λύματα (μία σταγόνα ή περίπου 0,05 ml, έως 5 ml/l) ή με μία άλλη πηγή όπως ποταμίσιο νερό (βλ. I.6.4.2.). Τελικά, τα διαλύματα συμπληρώνονται μέχρι τον όγκο της φιάλης με ανόργανο μέσον που υποβλήθηκε σε εμφύσηση αέρα, χρησιμοποιώντας ένα σωλήνα που φθάνει μέχρι τον πυθμένα της φιάλης για να επιτυγχάνεται η κατάλληλη ανάμειξη. VI.2.5. Αριθμός φιαλών σε μία τυπική διαδικασία δοκιμής Σε μία τυπική διαδικασία, χρησιμοποιούνται οι ακόλουθες φιάλες: τουλάχιστον 10 που περιέχουν εξεταζόμενη ουσία και εμβόλιο (εναιώρημα ουσίας δοκιμής), τουλάχιστον 10 που περιέχουν μόνον εμβόλιο (τυφλό εμβολίου), τουλάχιστον 10 που περιέχουν ουσία αναφοράς και εμβόλιο (έλεγχος διαδικασίας), και, όταν χρειάζεται, 6 φιάλες που περιέχουν εξεταζόμενη ουσία, ουσία αναφοράς και εμβόλιο (έλεγχος τοξικότητας). Παρ' όλα αυτά, για να εξασφαλισθεί η δυνατότητα αναγνώρισης του 10ήμερου παραθύρου, μπορεί να χρειασθούν οι διπλάσιες από αυτές φιάλες. VI.2.6. Εκτέλεση της δοκιμής Κάθε διάλυμα που παρασκευάζεται φέρεται αμέσως στην αντίστοιχη ομάδα φιαλών BOD με σωλήνα που ξεκινά από το κατώτερο τέταρτο (όχι από τον πυθμένα) της κατάλληλης μεγάλης φιάλης, έτσι ώστε να γεμισθούν τελείως όλες οι φιάλες BOD. Οι φιάλες κτυπιώνται ελαφρά ώστε να απομακρυνθεί οποιαδήποτε φυσαλλίδα αέρα. Οι φιάλες που αντιστοιχούν στο χρόνο μηδέν υποβάλλονται σε ανάλυση αμέσως για τον προσδιορισμό διαλελυμένου οξυγόνου με την μέθοδο Winkler ή τη μέθοδο των ηλεκτροδίων. Το περιεχόμενο των φιαλών μπορεί να διατηρηθεί για μετέπειτα ανάλυση με τη μέθοδο Winkler προσθέτοντας θειικό μαγγάνιο (ΙΙ) και υδροξείδιο του νατρίου (το πρώτο αντιδραστήριο του Winkler). Οι πωματισμένες με προσοχή φιάλες που περιέχουν το οξυγόνο που έχει δεσμευθεί με την μορφή καφέ ένυδρου οξειδίου του μαγγανίου (ΙΙΙ), φυλάσσονται στο σκοτάδι στους 10-20  C για 24 το πολύ ώρες πριν υποβληθούν στα επόμενα στάδια της μεθόδου Winkler. Οι παραμένουσες ίδιες φιάλες πωματίζονται ώστε να εξασφαλισθεί ότι δεν θα εμπερικλείονται φυσσαλίδες αέρα και επωάζονται στους 20  C στο σκοτάδι. Κάθε σειρά πρέπει να συνοδεύεται από μία πλήρη παράλληλη σειρά για τον προσδιορισμό του εμβολιασμένου τυφλού. Κατά την διάρκεια των 28 ημερών επώασης, λαμβάνονται τουλάχιστον διπλές φιάλες από όλες τις σειρές για ανάλυση διαλελυμένου οξυγόνου σε ορισμένα χρονικά διαστήματα (τουλάχιστον μιά φορά την εβδομάδα). Με τα εβδομαδιαία δείγματα θα πρέπει να μπορεί να γίνεται εκτίμηση της επί τοις εκατό απομάκρυνσης σε 14ήμερο παράθυρο, ενώ με τη δειγματοληψία κάθε 3-4 ημέρες θα πρέπει να μπορεί να αναγνωρίζεται το 10ήμερο παράθυρο, πράγμα που απαιτεί τις διπλάσιες περίπου φιάλες. Σε εξεταζόμενες ουσίες που περιέχουν άζωτο, θα πρέπει να γίνονται διορθώσεις για να λαμβάνεται υπόφη η ανάλωση οξυγόνου από τυχόν επερχόμενη νιτροποίηση. Για να γίνει αυτό, χρησιμοποιείται η μέθοδος του ηλεκτροδίου οξυγόνου για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του διαλελυμένου οξυγόνου και κατόπιν λαμβάνεται δείγμα από τη φιάλη BOD για ανάλυση των νιτρωδών και νιτρικών. Από την αύξηση της συγκέντρωσης νιτρωδών και νιτρικών, υπολογίζεται το χρησιμοποιηθέν οξυγόνο (βλ. Παράρτημα V). VI.3. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ VI.3.1. Επεξεργασία των αποτελεσμάτων Υπολογίζεται πρώτα το BOD για κάθε χρονική περίοδο αφαιρώντας την ελάττωση του οξυγόνου (mg O2/l) του τυφλού από αυτή που εμφανίζει η εξεταζόμενη ουσία. Η διορθωμένη αυτή ελάττωση διαιρείται με τη συγκέντρωση (mg/l) της εξεταζόμενης ουσίας για να ληφθεί το ειδικό BOD σαν mg οξυγόνου ανά mg εξεταζόμενης ουσίας. Η επί τοις εκατό βιοαποικοδομησιμότητα υπολογίζεται διαιρώντας το ειδικό BOD με το ειδικό ThOD (που υπολογίζεται σύμφωνα με το Παράρτημα II.2) ή COD (που προσδιορίζεται με ανάλυση, βλέπε Παράρτημα II.3), κατά συνέπεια: BOD = mg O2-αναλωμένου απο την εξεταζόμενη ουσία   mg Ο2 αναλωμένου από τυφλόmg εξεταζόμενης ουσίας στη φιάλη = mg O2 ανά mg εξεταζόμενης ουσίας % αποικοδόμηση = ThOD (mg O2/mg εξεταζόμενης ουσίας)BOD (mg O2/mg εξεταζόμενης ουσίας) Χ 100 ή % αποικοδόμηση =  BOD (mg O2/mg εξεταζόμενης ουσίας)COD (mg O2/mg εξεταζόμενης ουσίας) Χ 100 Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι δύο αυτές μέθοδοι δεν δίνουν κατ9 ανάγκη την ίδια τιμή. Προτιμότερο είναι να χρησιμοποιείται η πρώτη μέθοδος. Στην περίπτωση ουσιών που περιέχουν άζωτο, χρησιμοποείται η κατάλληλη παράμετρος ThOD (ΝΗ4 ή ΝΟ3) ανάλογα με το αν αναμένεται ή είναι γνωστό ότι συμβαίνει νιτροποίηση (Παράρτημα II.2). Εάν συμβαίνει νιτροποίηση χωρίς όμως να είναι πλήρης, υπολογίζεται μία διόρθωση για το οξυγόνο που καταναλίσκεται εξαιτίας της νιτροποίησης λαμβάνοντας υπόψη τις αλλαγές στη συγκέντρωση των νιτρωδών και νιτρικών (Παράρτημα V). VI.3.2. Εγκυρότητα των αποτελεσμάτων Η ελάττωση οξυγόνου στο τυφλό δεν θα πρέπει να υπερβαίνει το 1,5 mg διαλελυμένου οξυγόνου/l μετά από 28 ημέρες. Σε περίπτωση τιμών που είναι μεγαλύτερες από αυτή, απαιτείται η διερεύνηση των πειραματικών τεχνικών. Η εναπομένουσα συγκέντρωση οξυγόνου στις φιάλες της δοκιμής δεν πρέπει να πέφτει κάτω από τα 0,5 mg/l σε οποιαδήποτε χρονική στιγμή. Τέτοια χαμηλά επίπεδα οξυγόνου είναι έγκυρα μόνον αν η μέθοδος προσδιορισμού διαλελυμένου οξυγόνου η οποία χρησιμοποιείται, είναι δυνατό να μετρήσει με ορθότητα τέτοια επίπεδα. Βλέπε επίσης I.5.2. VI.3.3. Έκθεση Βλ. I.8. VI.4. ΦΥΛΛΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Ένα παράδειγμα φύλλου δεδομένων δίνεται παρακάτω. 1. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 2. ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΝΑΡΞΗΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 3. ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΗ ΟΥΣΙΑ Όνομα: Συγκέντρωση αρχικού διαλύματος: ... mg/l Aρχική συγκέντρωση στη φιάλη: ... mg/l ThOD ή COD: ... mg O2/mg εξεταζόμενης ουσίας 4. ΕΜΒΟΛΙΟ Πηγή. ... Πραγματοποιηθείσα κατεργασία: ... Προεγκλιματισμός, εφόσον υπήρξε: ... Συγκέντρωση στο αντιδρόν μείγμα: ... ml/l 5. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ DO Μέθοδος: Winkler/ηλεκτρόδιο >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 6. ΔΙΟΡΘΩΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΝΙΤΡΟΠΟΙΗΣΗ (Βλέπε Παράρτημα V) >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 7. ΕΛΑΤΤΩΣΗ DO: %  ΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΗ >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> mto = τιμή στη φιάλη δοκιμής στο χρόνο 0 mtx = τιμή στη φιάλη δοκιμής στο χρόνο x mbo = μέση τιμή τυφλού σε χρόνο 0 mbx = μέση τιμή τυφλού σε χρόνο x Η διόρθωση για τη νιτροποίηση από iii+vi εφαρμόζεται επίσης και στο τμήμα 6. 8. ΕΛΑΤΤΩΣΕΙΣ DO ΣΤΟ ΤΥΦΛΟ Kατανάλωση οξυγόνου στο τυφλό: (mbo   mb28) mg/l. H κατανάλωση αυτή είναι σημαντική για την εγκυρότητα της δοκιμής. Θα πρέπει να είναι μικρότερη από 1,5 mg/l. ΜΕΡΟΣ VII. ΔΟΚΙΜΗ M.I.T.I (Μέθοδος Γ.4-Ζ) VII.1. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Σε σκοτεινό, κλεισμένο αναπνευσιόμετρο και σε θερμοκρασία 25 ± 1  C, μετριέται αυτόματα για μία περίοδο 28 ημερών η ανάλωση οξυγόνου από αναδευόμενο διάλυμα, ή εναιώρημα, της εξεταζόμενης ουσίας σε ανόργανο μέσο, εμβολιασμένο με ειδικά ανεπτυγμένους, μη προσαρμοσμένους μικροοργανισμούς. Το εκλυόμενο διοξείδιο του άνθρακα προσροφάται σε νατράσβεστο. Η βιοαποικοδομησιμότητα εκφράζεται σαν η επί τοις εκατό ανάλωση οξυγόνου (διορθωμένη κατά την ανάλωση του τυφλού) της θεωρητικής ανάλωσης (ThOD). Το εκατοστιαίο ποσοστό πρωταρχικής βιοαποικοδομησιμότητας υπολογίζεται επίσης με συμπληρωματική ειδική χημική ανάλυση που γίνεται στην αρχή και στο τέλος της επώασης και, ενδεχομένως, με ανάλυση DOC. VII.2. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ VII.2.1. Εξοπλισμός α) Αυτόματος ηλεκτρολυτικός μετρητής BOD ή αναπνευσιόμετρο που φέρει κανονικά 6 φιάλες, των 300 ml η καθεμία, και δοχεία που περιέχουν υλικό προσρόφησης CO2 G β) Σταθερή θερμοκρασία δωματίου και/ή υδρόλουτρο στους 25 ± 1  C ή και καλύτερο G γ) Διάταξη διήθησης με μεμβράνη (προαιρετική) G δ) Αναλυτής άνθρακα (προαιρετικός). VII.2.2. Προετοιμασία του ανόργανου μέσου Παρασκευάζονται τα ακόλουθα αρχικά διαλύματα, χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια αναλυτικής καθαρότητας και νερό (Ι.6.1): (α) Δισόξινο φωσφορικό κάλιο, KH2PO48,50 g Μονόξινο φωσφορικό κάλιο, K2HPO421,75 g Δωδεκάυδρο μονόξινο φωσφορικό νάτριο, Na2HPO4 . 12 H2O44,60 g Χλωριούχο αμμώνιο, NH4Cl1,70 g Διαλύεται σε νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι 1 λίτρο. Το pΗ του διαλύματος πρέπει να είναι 7,2 (β) Επτάυδρο θειικό μαγνήσιο, MgSO4.7 H2O22,50 g Διαλύεται σε νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι 1 λίτρο (γ) νυδρο χλωριούχο ασβέστιο, CaCl227,50 g 0Διαλύεται σε νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι 1 λίτρο (δ) Εξάνυδρος τριχλωριούχος σίδηρος, FeCl3.6 H2O0,25 g Διαλύεται σε νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι 1 λίτρο. Λαμβάνονται 3 ml από κάθε διάλυμα (α), (β), (γ) και (δ) και συμπληρώνονται μέχρι 1 λίτρο. VII.2.3. Παρασκευή του εμβολίου Συλλέγονται πρόσφατα δείγματα από δέκα τουλάχιστον σημεία, κυρίως από περιοχές όπου χρησιμοποιούνται και απορρίπτονται πολλών ειδών χημικά. Από σημεία όπως εγκαταστάσεις κατεργασίας λυμάτων αποχετεύσεων, κατεργασίας βιομηχανικών αποβλήτων, ποταμούς, λίμνες, θάλασσες, λαμβάνονται δείγματα λάσπης, επιφανειακού εδάφους, νερού, κ.λπ., όγκου 1 λίτρου, και αναμειγνύονται καλά. Αφού απομακρυνθεί το υλικό που επιπλέει και το υπόλοιπο αφεθεί να κατακαθίσει, ρυθμίζεται το pH του υπερκείμενου υγρού στο 7 ± 1 με υδροξείδιο του νατρίου ή φωσφορικό οξύ. Λαμβάνεται κατάλληλος όγκος διηθημένου υπερκείμενου υγρού και χρησιμοποιείται για την πλήρωση δοχείου ενεργοποιημένης λάσπης. Στο υγρό εμφυσάται αέρας για χρονικό διάστημα περίπου 23,5 ωρών. Τριάντα λεπτά αφού σταματήσει η εμφύσηση αέρα, το ένα τρίτο περίπου του ολικού όγκου του υπερκειμένου απορρίπτεται και προστίθεται ίσος όγκος διαλύματος (pH 7) που περιέχει γλυκόζη, πεπτόνη και δισόξινο φωσφορικό κάλιο σε ποσοστό 0,1 % το καθένα, στο υλικό που έχει παραμείνει και ξαναρχίζει η διαβίβαση αέρα. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται μία φορά την ημέρα. Η μονάδα πρέπει να λειτουργεί σύμφωνα με τους κανόνες ορθής πρακτικής: τα λύματα πρέπει να είναι διαυγή, η θερμοκρασία να κρατείται στούς 25 ± 2  C, το pH 7 ± 1, να γίνεται καλή κατακάθιση της λάσπης, επαρκής αερισμός ώστε να διατηρείται το μείγμα συνεχώς αερόβιο, να υπάρχουν πρωτόζωα και να εξετάζεται η δραστικότητα της λάσπης με βάση την ουσία αναφοράς κάθε τρεις τουλάχιστον μήνες. Λάσπη δεν πρέπει να χρησιμοποιείται σαν εμβόλιο παρά μόνο μετά από ένα τουλάχιστον μήνα διεργασία, όχι όμως αργότερα από τέσσερις μήνες. Συνεπώς, η δειγματοληψία πρέπει να γίνεται από 10 τουλάχιστον σημεία σε τακτά χρονικά διαστήματα, μία φορά κάθε τρεις μήνες. Για να διατηρείται η πρόσφατη και η παλιά λάσπη στην ίδια δραστικότητα, το διηθημένο υπερκείμενο υγρό χρησιμοποιούμενης ενεργοποιημένης λάσπης αναμειγνύεται με ίσο όγκο του διηθημένου υπερκείμενου υγρού πρόσφατα συλλεγέντος μείγματος από δέκα πηγές καΙ το υγρό που προκύπτει από τη συνένωση καλλιεργείται όπως πιο πάνω. Μπορεί να παραληφθεί λάσπη για να χρησιμοποιηθεί σαν εμβόλιο, 18-24 ώρες μετά την τροφοδοσία της μονάδας. VII.2.4. Προετοιμασία των φιαλών Ετοιμάζονται οι ακόλουθες έξι φιάλες: Νο. 1: εξεταζόμενη ουσία σε νερό αραίωσης με συγκέντρωση  100 mg/l. No. 2, 3 και 4: εξεταζόμενη ουσία σε ανόργανο μέσο με συγκέντρωση 100 mg/l. No. 5: ουσία αναφοράς (π.χ. ανιλίνη) σε ανόργανο μέσο με συγκέντρωση 100 mg/l. Νο. 6: μόνον ανόργανο μέσο. Οι ασθενώς διαλυτές εξεταζόμενες ουσίες προστίθενται απ' ευθείας με βάση το βάρος ή τον όγκο ή ακολουθείται η διαδικασία του Παραρτήματος ΙΙΙ, εκτός από το ότι δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί ούτε διαλύτης ούτε γαλακτωματοποιητής. Το υλικό προσρόφησης του CO2 προστίθεται σε όλες τις φιάλες στα ειδικά διατιθέμενα δοχεία. Το pH στις φιάλες 2, 3 και 4 ρυθμίζεται στο 7,0. VII.2.5. Εκτέλεση της δοκιμής Οι φιάλες 2, 3 και 4 (εναιωρήματα εξεταζόμενης ουσίας), 5 (έλεγχος δραστικότητας) και 6 (τυφλό) εμβολιάζονται με μικρή ποσότητα εμβολίου ώστε να ληφθεί συγκέντρωση 30 mg/l εναιωρούμενων στερεών. Στη φιάλη 1 που χρησιμεύει για τον αβιοτικό έλεγχο δεν προστίθεται καθόλου εμβόλιο. Η διάταξη συναρμολογείται, ελέγχεται σε σχέση με το αν είναι αεροστεγής, τίθενται σε λειτουργία οι αναδευτήρες και αρχίζει η μέτρηση της ανάλωσης οξυγόνου σε συνθήκες σκότους. Ελέγχεται καθημερινά η θερμοκρασία, ο αναδευτήρας και ο κουλομετρικός καταγραφέας ανάλωσης οξυγόνου, σημειώνεται δε κάθε αλλαγή στο χρώμα του περιεχομένου των φιαλών. Οι αναλώσεις οξυγόνου από τις έξι φιάλες διαβάζονται απευθείας με μια κατάλληλη μέθοδο, για παράδειγμα, από το διάγραμμα καταγραφέα εξαπλής καταγραφής, ο οποίος παρέχει την καμπύλη BOD. Στο τέλος της επώασης, 28 ημέρες κανονικά, μετριέται το pH του περιεχομένου των φιαλών και προσδιορίζεται η συγκέντρωση της εναπομείνασας εξεταζόμενης ουσίας και κάθε ενδιάμεσου προϊόντος και, στην περίπτωση υδαταδιαλυτής ουσίας, η συγκέντρωση DOC (Παράρτημα II.4). Ιδιαίτερη μέριμνα λαμβάνεται στην περίπτωση πτητικών ουσιών. Εάν προβλέπεται νιτροποίηση, προσδιορίζεται αν είναι δυνατό, η συγκέντρωση νιτρικών και νιτρωδών. VII.3. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ VII.3.1. Επεξεργασία των αποτελεσμάτων Η ανάλωση οξυγόνου (mg) μετά από ορισμένο χρόνο, διορθωμένη κατά την ανάλωση του τυφλού για τον ίδιο χρόνο, διαιρείται με το χρησιμοποιούμενο βάρος της εξεταζόμενης ουσίας. Έτσι λαμβάνεται το BOD εκφρασμένο ως mg οξυγόνου/mg εξεταζόμενης ουσίας, δηλαδή: BOD = mg O2-αναλισκόμενα από εξεταζόμ.   mg O2-ουσία   mgO αναλισκόμενα στο τυφλόmg εξεταζόμενης ουσίας στη φιάλη = mg O2 εξεταζόμενης ουσίας. Η επί της εκατό βιοαποικοδόμηση λαμβάνεται από τον τύπο: % βιοαποικοδόμηση = % ThOD =    BOD (mg O2/mg ουσίας   ThOD (mg O2/mg ουσίας) Χ 100 Στην περίπτωση μειγμάτων, το ThOD υπολογίζεται από τη στοιχειακή ανάλυση, όπως για μία απλή ένωση. Ανάλογα με το αν δεν επέρχεται ή επέρχεται πλήρης νιτροποίηση (Παράρτημα ΙΙ.2), χρησιμοποιείται η κατάλληλη παράμετρος ThOD (ThODNH4 ή ThODNO3). Εάν παρ' όλα αυτά επέρχεται νιτροποίηση χωρίς όμως να είναι πλήρης, γίνεται μία διόρθωση για το οξυγόνο που καταναλίσκεται με τη νιτροποίηση που υπολογίζεται από τις αλλαγές στη συγκέντρωση νιτρωδών και νιτρικών (Παράρτημα V). Η επί της εκατό πρωταρχική βιοαποικοδόμηση υπολογίζεται από την απώλεια ειδικής (μητρικής) ουσίας (βλ. Ι.7,2.). Dt = Sb   SaSb Χ 100 % Εάν υπάρχει απώλεια εξεταζόμενης ουσίας στη φιάλη 1 όπου μετριέται η φυσικοχημική απομάκρυνση, αυτό αναφέρεται στην έκθεση και η συγκέντρωση της εξεταζόμενης ουσίας (Sb) μετά από 28 ημέρες στη φιάλη αυτή, χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της επί της εκατό βιοαποικοδόμησης. Όταν εκτελούνται προσδιορισμοί DOC (προαιρετικό), η επί τοις εκατό τελική βιοαποικοδόμηση υπολογίζεται με τον τύπο: Dt = 1    Ct    Cbt Co   Cbo Χ 100 % όπως περιγράφεται στο Ι.7.1. Εάν υπάρχει απώλεια DOC στη φιάλη 1, στην οποία μετριέται η φυσικοχημική απομάκρυνση, η συγκέντρωση DOC στη φιάλη αυτή χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της επί τοις εκατό βιοαποικοδόμησης. Όλα τα αποτελέσματα καταγράφονται στα φύλλα δεδομένων. VII.3.2. Εγκυρότητα των αποτελεσμάτων Η ανάλωση οξυγόνου από το τυφλό είναι κανονικά 20-30 mg O2/l και δεν θα πρέπει να είναι μεγαλύτερη από 60 mg/l σε 28 ημέρες. Στην περίπτωση τιμών μεγαλύτερων από 60 mg/l, απαιτείται να πραγματοποιηθεί κριτική εξέταση των δεδομένων και των πειραματικών τεχνικών. Εάν το pH είναι έξω από τα όρια 6-8,5 και η κατανάλωση οξυγόνου από την εξεταζόμενη ουσία είναι μικρότερη από το 60%, η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται με μικρότερη συγκέντρωση εξεταζόμενης ουσίας. Βλέπε επίσης I.5.2. Εάν η επί τοις εκατόν αποικοδόμηση της ανιλίνης υπολογιζόμενη από την κατανάλωση οξυγόνου δεν υπερβαίνει το 40 % μετά από 7 ημέρες και το 65 % μετά από 14 ημέρες, η δοκιμή θεωρείται σαν μη έγκυρη. VII.3.3. Έκθεση Βλ. I.8. VII.4. ΦΥΛΛΟ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Ένα παράδειγμα φύλλου δεδομένων δίνεται παρακάτω. ΔΟΚΙΜΗ MITI (I) 1. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 2. ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΝΑΡΞΗΣ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ 3. ΕΞΕΤΑΖΟΜΕΝΗ ΟΥΣΙΑ Όνομα: Συγκέντρωση αρχικού διαλύματος: ... mg/l σαν ουσία Aρχική συγκέντρωση στο μέσον, Co: ... mg/l σαν ουσία Όγκος του μείγματος αντίδρασης, V: ... ml ThOD: ... mg O2/l 4. ΕΜΒΟΛΙΟ Σημεία δειγματοληψίας λάσπης: 1) ...2) ...3) ...4) ...5) ...6) ...7) ...8) ...9) ...10) ...Συγκέντρωση εναιωρούμενων στερεών σε ενεργοποιημένη λάσπη μετά από εγκλιματισμό με συνθετικά λύματα = ... mg/l Όγκος ενεργοποιημένης λάσπης ανά λίτρο τελικού μέσου =...ml Συγκέντρωση λάσπης στο τελικό μέσο = ...mg/l 5. ΑΝΑΛΩΣΗ ΟΞΥΓΟΝΟΥ: ΒΙΟΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΙΜΟΤΗΤΑ Tύπος χρησιμοποιημένου αναπνευσιομέτρου: .... >ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>6. ANALZSH ANURAKA (προαιρετική) Αναλυτής άνθρακα: ... >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> % DOC-απομακρυνθείς: a   (b   c)a Χ 100 7. ΕΙΔΙΚΑ ΧΗΜΙΚΑ ΑΝΑΛΥΤΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 8. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ Πρέπει να επισυνάπτεται, αν υπάρχει, καμπύλη BOD σαν συνάρτηση του χρόνου. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I  ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΙΣΜΟΙ DO: Διαλελυμένο οξυγόνο (mg/l) είναι η συγκέντρωση του διαλελυμένου οξυγόνου σε ένα υδατικό δείγμα. BOD: Βιοχημικώς απαιτούμενο οξυγόνο (g) είναι η ποσότητα του οξυγόνου που καταναλώνεται από μικροοργανισμούς κατά το μεταβολισμό μιας εξεταζόμενης ουσίας G εκφράζεται επίσης και σαν g ανάλωσης οξυγόνου ανά g εξεταζόμενης ουσίας. (βλέπε μέθοδο Γ.5.) COD: Χημικώς απαιτούμενο οξυγόνο (g) είναι η ποσότητα του οξυγόνου που καταναλώνεται κατά την οξείδωση μιας εξεταζόμενης ουσίας εν θερμώ με όξινο διχρωμικό άλας G αποτελεί μέτρο της ποσότητας του υπάρχοντος οξειδώσιμου υλικού G εκφράζεται επίσης και σαν g οξυγόνου καταναλισκόμενα ανά g εξεταζόμενης ένωσης. (βλέπε μέθοδο  Γ.6.) DOC: Διαλελυμένος οργανικός άνθρακας είναι ο οργανικός άνθρακας που υπάρχει σε διάλυμα ή ο άνθρακας που διέρχεται διαμέσου φίλτρου 0,45 μικρομέτρων ή ο άνθρακας που παραμένει στο υπερκείμενο υγρό ± 4 000 g) επί 15 λεπτά. ThOD: Θεωρητικώς απαιτούμενο οξυγόνο (mg) είναι η ολική ποσότητα οξυγόνου που απαιτείται για να οξειδωθεί πλήρως μία χημική ουσία G υπολογίζεται από τον μοριακό τύπο (βλέπε Παράρτημα ΙΙ.2) και εκφράζεται επίσης σαν mg οξυγόνου απαιτούμενου ανά mg εξεταζόμενης ένωσης. ThCO2: Θεωρητικό διοξείδιο του άνθρακα (mg) είναι η ποσότητα διοξειδίου του άνθρακα που υπολογίζεται ότι παράγεται από τη γνωστή ή μετρούμενη ποσότητα άνθρακα της εξεταζόμενης ουσίας όταν μετατρέπεται πλήρως σε ανόργανη μορφή G εκφράζεται επίσης σαν mg διοξειδίου του άνθρακα που εκλύονται ανά mg εξεταζόμενης ουσίας. TOC: Ολικός οργανικός άνθρακας ενός δείγματος είναι το άθροισμα του ευρισκόμενου υπό μορφή διαλύματος και εναιωρήματος οργανικού άνθρακα. IC: Ανόργανος άνθρακας. TC: Ολικός άνθρακας είναι το άθροισμα του οργανικού και ανόργανου άνθρακα που υπάρχει σε ένα δείγμα. Πρωταρχική αποικοδόμηση: είναι η μεταβολή στη χημική δομή μιας ουσίας που προέρχεται από βιολογική δράση και έχει σαν αποτέλεσμα την απώλεια χαρακτηριστικών ιδιοτήτων της ουσίας αυτής. Τελική βιοαποικοδόμηση (αερόβια): είναι ο βαθμός αποικοδόμησης που επιτυγχάνεται όταν η εξεταζόμενη ένωση καταναλίσκεται καθ'ολοκληρία από μικροοργανισμούς καταλήγοντας στην παραγωγή διοξειδίου του άνθρακα, νερού, ανόργανων αλάτων και νέων μικροβιακών κυτταρικών συστατικών (βιομάζα). Ευκόλως βιοαποικοδομήσιμη: αυθαίρετη κατάταξη χημικών ουσιών που έχουν περάσει ορισμένες συγκεκριμένες επιλεκτικές δοκιμές τελικής βιοαποικοδομησιμότητας G οι δοκιμές αυτές είναι τόσο περιοριστικές που να εκτιμάται ότι οι ενώσεις αυτές βιοαποικοδομούνται ταχέως και πλήρως σε υδατικό περιβάλλον κάτω από αερόβιες συνθήκες. Εγγενώς βιοαποικοδομήσιμη: κατάταξη χημικών ουσιών για τις οποίες υπάρχουν αναμφίβολες αποδείξεις βιοαποικοδόμησης (πρωταρχική ή τελική) σε οποιαδήποτε αναγνωρισμένη δοκιμή βιοαποικοδόμησης. Κατεργασιμότητα: ο όρος χαρακτηρίζει την ευκολία με την οποία μια ένωση μπορεί να απομακρυνθεί κατά την βιολογική κατεργασία λυμάτων χωρίς να επηρεασθεί δυσμενώς η κανονική λειτουργία των μεθόδων κατεργασίας. Γενικά, οι ευκόλως βιοαποικοδομήσιμες ενώσεις είναι κατεργάσιμες όχι όμως και όλες οι εγγενώς βιοαποικοδομήσιμες ενώσεις. Μπορεί επίσης να λάβουν χώρα και αβιοτικές διεργασίες. Χρόνος υστέρησης είναι ο χρόνος που μεσολαβεί από τον εμβολιασμό, σε μια δοκιμή ελάττωσης, μέχρι τη χρονική στιγμή που το ποσοστό αποικοδόμησης αυξάνεται στο 10% τουλάχιστον. Ο χρόνος υστέρησης παρουσιάζει συχνά μεγάλες διακυμάνσεις και μικρή αναπαραγωγιμότητα. Χρόνος αποικοδόμησης είναι ο χρόνος που μεσολαβεί από τη λήξη του χρόνου υστέρησης μέχρι τη χρονική στηγμή κατά την οποία επιτυγχάνεται το 90% του μέγιστου βαθμού αποικοδόμησης. 10 ήμερο παράθυρο είναι οι δέκα ημέρες που ακολουθούν αμέσως μετά την επίτευξη αποικοδόμησης 10%. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II  ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΤΑΛΛΗΛΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ Ανάλογα με την επιλεγόμενη μέθοδο απαιτούνται και ορισμένες μοριακές παράμετροι. Στα επόμενα περιγράφεται η εξαγωγή των τιμών αυτών. Η χρήση των παραμέτρων αυτών περιγράφεται στις συγκεκριμένες μεθόδους. 1. Περιεκτικότητα σε άνθρακα Η περιεκτικότητα σε άνθρακα υπολογίζεται από τη γνωστή στοιχειακή σύσταση ή προσδιορίζεται με στοιχειακή ανάλυση της εξεταζόμενης ουσίας. 2. Θεωρητικώς απαιτούμενο οξυγόνο (ThOD) Το θεωρητικώς απαιτούμενο οξυγόνο (ThOD) μπορεί να υπολογισθεί αν η στοιχειακή σύσταση είναι γνωστή ή προσδιορισθεί με στοιχειακή ανάλυση. Για την ένωση: CcHhClclNnNanaOoPpSs χωρίς νιτροποίηση, ThODNH4 = 16 (2 c + 1/2 (h   cl   3 n) + 3 s + 5/2 p + 1/2 na   o)MB mg/mg ή με νιτροποίηση, ThODNO3 = 16 (2 c + 1/2 (h   cl) + 5/2 n + 3 s + 5/2 p + 1/2 na   o)MB mg/mg 3. Χημικώς απαιτούμενο οξυγόνο (COD) Το χημικώς απαιτούμενο οξυγόνο (COD) προσδιορίζεται με τη μέθοδο Γ.6. 4. Διαλελυμένος οργανικός άνθρακας (DOC) Διαλελυμένος οργανικός άνθρακας (DOC) είναι εξ ορισμού ο οργανικός άνθρακας κάθε χημικής ουσίας ή μείγματος σε νερό που διέρχεται διαμέσου φίλτρου 0,45 μικρομέτρων. Λαμβάνονται δείγματα από τις δοκιμαστικές φιάλες και διηθούνται αμέσως στη διηθητική συσκευή χρησιμοποιώντας την κατάλληλη διηθητική μεμβράνη. Τα πρώτα 20 ml (η ποσότητα αυτή μπορεί να ελαττωθεί όταν χρησιμοποιούνται μικρά φίλτρα) του διηθήματος απορρίπτονται. Για την ανάλυση του άνθρακα χρησιμοποιούνται όγκοι 10-20 ml ή και μικρότεροι για περίπτωση ένεσης (ο όγκος εξαρτάται από την ποσότητα που απαιτείται για τον αναλυτή άνθρακα). Η συγκέντρωση του DOC προσδιορίζεται με αναλυτή οργανικού άνθρακα, που μπορεί να κάνει ακριβείς μετρήσεις για συγκεντρώσεις άνθρακα ίσες ή και μικρότερες του 10% της αρχικής συγκέντρωσης DOC που χρησιμοποιείται στη δοκιμή. Τα διηθημένα δείγματα που δεν μπορούν να αναλυθούν την ίδια ημέρα μπορούν να φυλάσσονται σε φυγείο σε θερμοκρασία 2-4  C επί 48 ώρες ή σε θερμοκρασία  18 C για μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα. Παρατηρήσεις: Οι διηθητικές μεμβράνες διαποτίζονται συχνά με τασιενεργά για υδροφιλίωση. Έτσι το φίλτρο μπορεί να περιέχει ορισμένα mg διαλυτού οργανικού άνθρακα που μπορούν να παρεμβληθούν στους προσδιορισμούς βιοαποικοδομησημότητα. Τα τασιενεργά και οι άλλες διαλυτές οργανικές ενώσεις απομακρύνονται από τα φίλτρα βάζοντάς τα σε απιονισμένο νερό τρεις φορές για μία ώρα. Τα φίλτρα μπορούν κατόπιν να φυλάσσονται σε νερό για μία εβδομάδα. Εάν χρησιμοποιούνται φίλτρα μιας χρήσης κάθε παρτίδα πρέπει να ελέγχεται ότι δεν ελευθερώνει διαλυτό οργανικό άνθρακα. Ανάλογα με τον τύπο της διηθητικής μεμβράνης η εξεταζόμενη χημική ουσία μπορεί να κατακρατείται με προσρόφηση. Κατά συνέπεια, ενδέχεται να απαιτείται να ελεγχθεί μήπως η εξεταζόμενη χημική ουσία κατακρατείται από το φίλτρο. Φυγοκέντρηση με 40 000 m.sec 2 (4 000 g) επί 15 λεπτά για τη διαφοροποίηση του TOC από τον DOC, μπορεί να χρησιμοποιηθεί αντί διήθησης. Η μέθοδος δεν είναι αξιόπιστη για αρχική συγκέντρωση ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> 0,05 Μ βόραξ + 0,1 N NaOH >ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ> (1) ΕΕ αριθ. L 383 της 29. 12. 1992, σ. 113.