Avis juridique important

|

32000L0033

Οδηγία 2000/33/ΕΚ της Επιτροπής, της 25ης Απριλίου 2000, σχετικά με την προσαρμογή, για εικοστή έβδομη φορά, στην τεχνική πρόοδο της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ του Συμβουλίου περί προσεγγίσεως των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων που αφορούν την ταξινόμηση, συσκευασία και επισήμανση των επίκινδυνων ουσιών (Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ.)

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 136 της 08/06/2000 σ. 0090 - 0107

Οδηγία 2000/33/ΕΚ της Επιτροπήςτης 25ης Απριλίου 2000σχετικά με την προσαρμογή, για εικοστή έβδομη φορά, στην τεχνική πρόοδο της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ του Συμβουλίου περί προσεγγίσεως των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων που αφορούν την ταξινόμηση, συσκευασία και επισήμανση των επικίνδυνων ουσιών(1)(Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ)Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,Έχοντας υπόψη:τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας,την οδηγία 67/548/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 27ης Ιουνίου 1967, περί προσεγγίσεως των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων που αφορούν στην ταξινόμηση, συσκευασία και επισήμανση των επικινδύνων ουσιών(2), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 1999/33/ΕΚ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου(3), και ιδίως το άρθρο 28,Εκτιμώντας τα ακόλουθα:(1) Επιβάλλεται να προσαρμοστεί στην τεχνική πρόοδο το παράρτημα V της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ για τον καθορισμό των μεθόδων προσδιορισμού των φυσικο-χημικών ιδιοτήτων, της τοξικότητας και της οικοτοξικότητας των ουσιών και των σκευασμάτων.(2) Το άρθρο 7 παράγραφος 2 της οδηγίας 86/609/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 24ης Νοεμβρίου 1986, για την προσέγγιση των νομοθετικών, κανονιστικών και διοικητικών διατάξεων των κρατών μελών σχετικά με την προστασία των ζώων που χρησιμοποιούνται για πειραματικούς και άλλους επιστημονικούς σκοπούς(4), προβλέπει ότι δεν εκτελούνται πειράματα με πειραματόζωα εφόσον το επιδιωκόμενο αποτέλεσμα δύναται να επιτευχθεί με άλλη επιστημονικά αποδεκτή μέθοδο που είναι εύλογα και πρακτικά διαθέσιμη.(3) Έχουν αναπτυχθεί εναλλακτικές πειραματικές μέθοδοι που δεν περιλαμβάνουν τη χρήση ζώων για τον έλεγχο των χημικών. Αυτές οι μέθοδοι θα πρέπει να εισαχθούν στο παράρτημα V της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ.(4) Τα μέτρα που προβλέπει η παρούσα οδηγία είναι σύμφωνα με τη γνώμη της επιτροπής για την προσαρμογή στην τεχνική προόοδο των οδηγιών που σχετίζονται με την εξάλειψη των τεχνικών φραγμών στο εμπόριο επικινδύνων ουσιών και παρασκευασμάτων,ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:Άρθρο 1Τα κείμενα στα παραρτήματα Ι και ΙΙ της παρούσας οδηγίας προστίθενται στο μέρος Β του παραρτήματος V της οδηγίας 67/548/ΕΟΚ.Άρθρο 21. Τα κράτη μέλη θέτουν σε ισχύ τις νομοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις που είναι απαραίτητες προκειμένου να συμμορφωθούν προς την παρούσα οδηγία έως την 1η Οκτωβρίου 2001 το αργότερο. Ενημερώνουν την Επιτροπή σχετικά.Τα κράτη μέλη μεριμνούν ώστε οι διατάξεις που θεσπίζουν σχετικά να περιέχουν ή να συνοδεύονται από παραπομπή στην παρούσα οδηγία κατά την επίσημη δημοσίευσή τους. Τα κράτη μέλη καθορίζουν την μορφή της ως άνω αναφοράς.2. Τα κράτη μέλη κοινοποιούν στην Επιτροπή τις κύριες διατάξεις της εθνικής νομοθεσίας που θεσπίζουν στον τομέα της παρούσας οδηγίας παρέχοντας παράλληλα πίνακα συσχετισμού μεταξύ των διατάξεων της οδηγίας και των αντιστοίχως θεσπιζόμενων εθνικών διατάξεων.Άρθρο 3Η παρούσα οδηγία αρχίζει να ισχύει την τρίτη ημέρα από τη δημοσίευσή της στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.Άρθρο 4Η παρούσα οδηγία απευθύνεται στα κράτη μέλη.Βρυξέλλες, 25 Απριλίου 2000.Για την ΕπιτροπήMargot WallströmΜέλος της Επιτροπής(1) Εκδόθηκε πριν την εικοστή έκτη προσαρμογή.(2) ΕΕ 196 της 16.8.1967, σ. 1.(3) ΕΕ L 199 της 30.7.1999, σ. 57.(4) ΕΕ L 358 της 18.12.1986, σ. 1.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι"B.40. ΔΙΑΒΡΩΣΗ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ1. ΜΕΘΟΔΟΣ1.1. ΕισαγωγήΤο Ευρωπαϊκό Κέντρο Επικύρωσης Εναλλακτικών Μεθόδων (ΕΚΕΕΜ, Κοινό Κέντρο Ερευνών, Ευρωπαϊκή Επιτροπή) έχει εγκρίνει ως επιστημονικά έγκυρες δύο in vitro δοκιμές δερματικής διαβρωτικότητας, τη δοκιμασία διαδερμικής ηλεκτρικής αντίστασης (TER - transcutaneous electrical resistance) δέρματος επίμυος και δοκιμή που χρησιμοποιεί ομοίωμα ανθρωπίνου δέρματος (1) (2) (3). Η μελέτη επικύρωσης του ΕΚΕΕΜ κατέδειξε ότι και οι δύο δοκιμές είναι σε θέση να διακρίνουν με αξιόπιστο τρόπο γνωστές διαβρωτικές από μη διαβρωτικές ουσίες του δέρματος. Πέραν τούτου, το πρωτόκολλο της δοκιμής με ομοίωμα ανθρώπινου δέρματος, επέτρεψε ορθή διάκριση μεταξύ των διαφόρων βαθμών διαβρωτικών επιδράσεων (γνωστά ισχυρά διαβρωτικά του δέρματος, R35, και άλλα διαβρωτικά του δέρματος R34) (2). Η περιγραφή των δύο μεθόδων και η διαδικασία της δοκιμής παρέχονται κατωτέρω. Η επιλογή της μεθόδου γίνεται με βάση τις ειδικές απαιτήσεις και τις προτιμήσεις του χρήστη.Βλέπε επίσης γενική εισαγωγή μέρος Β.1.2. ΟρισμοίΔιάβρωση του δέρματος: είναι η πρόκληση μη αντιστρεπτής βλάβης στο δερματικό ιστό μετά την εφαρμογή ελεγχόμενης ουσίας.1.3. Ουσίες αναφοράςΟυδεμία, αλλά βλέπε σημεία 1.5.3.4 και 1.7.2.3.1.4. Αρχή της μεθόδου - Δοκιμασία διαδερμικής ηλεκτρικής αντίστασης (TER) δέρματος επίμυοςΤο ελεγχόμενο υλικό εφαρμόζεται επί 24 ώρες κατ' ανώτατο όριο στις επιδερμικές επιφάνειες δίσκων δέρματος που έχουν ληφθεί από τις δορές νεαρών επιμυών οι οποίοι έχουν θανατωθεί με μη βάναυσο τρόπο. Τα διαβρωτικά υλικά προσδιορίζονται βάσει της ικανότητάς τους να προκαλούν απώλεια της ακεραιότητας της κερατίνης στιβάδας και της φρακτικής λειτουργίας, η οποία μετράται ως μείωση της εγγενούς διαδερμικής ηλεκτρικής αντίστασης (TER) σε επίπεδα χαμηλότερα ενός κατώτατου ορίου (5 kΩ) (4) (5). Ερεθιστικά και μη ερεθιστικά υλικά δεν προκαλούν μείωση της TER σε επίπεδα χαμηλότερα του κατωτάτου ορίου. Στη διαδικασία της δοκιμής μπορεί να ενσωματωθεί ένα στάδιο δέσμευσης χρωστικής για τις τασιενεργές ουσίες και τις ουδέτερες οργανικές ενώσεις (για τους ορισμούς βλέπε υποσημείωση 6) ώστε να μειωθεί ο αριθμός των ψευδοθετικών αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με χημικές ουσίες αυτού του τύπου συγκεκριμένα (2) (7).1.5. Περιγραφή της μεθόδου δοκιμής - δοκιμασία TER δέρματος επίμυος1.5.1. ΠειραματόζωαΓια την προετοιμασία των δίσκων δέρματος απαιτούνται νεαροί (20-23 ημερών) επίμυες (στέλεχος Wistar ή παρόμοιο). Αφαιρείται επιμελώς το τρίχωμα από την περιοχή της ράχης και των πλευρών με μικρή ξυριστική μηχανή για ζώα. Τα πειραματόζωα εκπλύνονται και σφουγγίζονται επιμελώς ενώ η περιοχή εμβαπτίζεται σε αντιβιοτικό διάλυμα (που περιέχει, επί παραδείγματι, στρεπτομυκίνη, πενικιλίνη, χλωραμφαινικόλη ή αμφοτερικίνη, σε κατάλληλες συγκεντρώσεις για την αναστολή της βακτηριακής ανάπτυξης). Τα πειραματόζωα εκπλύνονται εκ νέου με αντιβιοτικά την τρίτη ή τέταρτη ημέρα με την πρώτη έκπλυση και χρησιμοποιούνται εντός τριών ημερών (η ηλικία των πειραματόζωων δεν πρέπει να υπερβαίνει τις 31 ημέρες για την προετοιμασία της δοράς).1.5.2. Προετοιμασία των δίσκων δέρματοςΤα πειραματόζωα θανατώνονται με μη βάναυσο τρόπο. Αφαιρείται το δέρμα από τη ράχη κάθε ζώου και απαλλάσσεται από την περίσσεια λίπους με προσεκτική απομάκρυνσή του από το δέρμα. Η δορά τοποθετείται επάνω από το άκρο σωλήνα πολυτετραφθωροαιθυλενίου (PTFE) με τρόπο ώστε η επιφάνεια της επιδερμίδας να βρίσκεται σε επαφή με το σωλήνα. Το δέρμα συγκρατείται στη θέση του με τη βοήθεια ελαστικού δακτυλίου Ο ο οποίος στερεώνεται με πίεση στο άκρο του σωλήνα, ενώ η περίσσεια ιστών αποκόπτεται. Οι διαστάσεις του σωλήνα και του δακτυλίου παρέχονται στο σχήμα 1. Στη συνέχεια, η ένωση του ελαστικού δακτυλίου Ο με το άκρο του σωλήνα PTFE στεγανοποιείται με τη βοήθεια βαζελίνης Ο σωλήνας στηρίζεται με ελατηριωτό σφιγκτήρα ενός υποδοχέα που περιέχει διάλυμα θειικού μαγνησίου (154 mM) (σχήμα 2).1.5.3. Διαδικασία δοκιμής1.5.3.1. Εφαρμογή του ελεγχόμενου υλικούΟι υγρές ελεγχόμενες ουσίες (150 µl) εφαρμόζονται στην επιδερμική επιφάνεια που βρίσκεται στο εσωτερικό του σωλήνα (σχήμα 2). Όταν εξετάζονται στερεά υλικά, εφαρμόζεται επαρκής ποσότητα στερεού υλικού στο δίσκο ώστε να καλύπτεται το σύνολο της επιφάνειας της επιδερμίδας. Στη συνέχεια, 150 µl απιονισμένου νερού προστίθενται στο στερεό υλικό και οι σωλήνες αναδεύονται ήπια. Οι ελεγχόμενες ουσίες πρέπει να είναι σε μέγιστη δυνατή επαφή με το δέρμα. Για ορισμένα στερεά αυτό μπορεί να επιτευχθεί με θέρμανση στους 30 °C κατ' ανώτατο όριο και τήξη της ελεγχόμενης ουσίας ή με άλεσμα ώστε να ληφθεί κοκκοποιημένο υλικό ή σκόνη.Για κάθε ελεγχόμενη ουσία χρησιμοποιούνται τρεις δίσκοι δέρματος. Οι ελεγχόμενες ουσίες διατηρούνται σε επαφή με το δέρμα επί 24 ώρες (βλέπε επίσης 1.5.3.4). Στη συνέχεια εκπλύνονται με εκτόξευση τρεχούμενου νερού θερμοκρασίας έως 30 °C έως ότου απομακρυνθούν πλήρως. Η απομάκρυνση ελεγχόμενων ουσιών που έχουν στερεοποιηθεί στο εσωτερικό του σωλήνα είναι δυνατόν να διευκολυνθεί με εκτόξευση θερμού νερού θερμοκρασίας 30 °C περίπου.1.5.3.2. Μετρήσεις TERΗ TER μετράται με τη βοήθεια γέφυρας δεδομένων (databridge) που λειτουργεί με εναλλασσόμενο ρεύμα και χαμηλή τάση (π.χ. ΑΙΜ 401 ή 6401 ή αντίστοιχη). Πριν από τη μέτρηση της ηλεκτρικής αντίστασης, ελαττώνεται η επιφανειακή τάση του δέρματος με την προσθήκη αιθανόλης 70 % στην ποσότητα που απαιτείται για να καλυφθεί η επιδερμίδα. Λίγα λεπτά αργότερα, ο σωλήνας αντιστρέφεται για να απομακρυνθεί η αιθανόλη και ο ιστός ενυδατώνεται με την προσθήκη 3 ml διαλύματος θειικού μαγνησίου (154 mM). Τα ηλεκτρόδια της γέφυρας δεδομένων τοποθετούνται σε μια από τις δύο πλευρές του δίσκου δέρματος για τη μέτρηση της αντίστασης σε kΩ/δίσκο δέρματος (σχήμα 2). Οι διαστάσεις των ηλεκτροδίων και το μήκος του ηλεκτροδίου που βρίσκεται κάτω από τους σφιγκτήρες τύπου κροδοδείλου παρέχονται στο σχήμα 1. Ο σφιγκτήρας του εσωτερικού (χονδρού) ηλεκτροδίου τοποθετείται στην κορυφή του σωλήνα PTFE κατά τη μέτρηση της αντίστασης ώστε να εξασφαλίζεται η εμβάπτιση σταθερού τμήματος του ηλεκτροδίου στο διάλυμα θειικού μαγνησίου. Το εξωτερικό (λεπτό) ηλεκτρόδιο τοποθετείται εντός του υποδοχέα με τρόπο ώστε να ακουμπάει στον πυθμένα του. Η απόσταση μεταξύ βάσης του ελητηριωτού σφιγκτήρα και της βάσης του σωλήνα PTFE διατηρείται σταθερή (σχήμα 1) δεδομένου ότι επηρεάζει τη λαμβανόμενη τιμή της αντίστασης.Σημειώνεται ότι αν η μετρούμενη τιμή της αντίστασης υπερβαίνει τα 20 kΩ, αυτό μπορεί να οφείλεται στην ελεγχόμενη ουσία που επικαλύπτει την επιδερμική επιφάνεια του δίσκου δέρματος. Μπορεί να επιχειρηθεί απομάκρυνση της ουσίας αυτής με ανάδευση του σωλήνα PTFE επί 10 δευτερόλεπτα περίπου αφού καλυφθεί το στόμιό του με τον προστατευόμενο με γάντι αντίχειρα. Το διάλυμα θειικού μαγνησίου αποχύνεται και επαναλαμβάνεται η μέτρηση της αντίστασης με νέο διάλυμα θειικού μαγνησίου.Οι μέσες μετρούμενες τιμές TER γίνονται αποδεκτές εφόσον οι σύγχρονές τους θετικές και αρνητικές τιμές που έχουν προκύψει για την ουσία μάρτυρα περικλείονται στις αποδεκτές για τη μέθοδο περιοχές ημών. Οι υποδεικνυόμενες ουσίες μάρτυρες και οι αντίστοιχες αποδεκτές περιοχές ημών ηλεκτρικής αντίστασης για την περιγραφόμενη μεθοδολογία και συσκευή έχουν ως εξής:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>1.5.3.3. Τροποποιημένη διαδικασία για τασιενεργές ουσίες ουδέτερες οργανικές ενώσειςΕάν οι τιμές TER ελεγχόμενων ουσιών που εμπίπτουν στην κατηγορία των τασιενεργών ουσιών ή των ουδέτερων οργανικών ενώσεων είναι μικρότερες από ή ίσες με 5 kΩ, μπορεί να πραγματοποιηθεί εκτίμηση της διείσδυσης χρωστικής στους ιστούς. Με τη διαδικασία αυτή θα προσδιοριστεί κατά πόσο τα αποτελέσματα είναι ψευδοθετικά (2).1.5.3.3.1. Εφαρμογή και απομάκρυνση της χρωματικής ουσίας σουλφοροδαρίνης ΒΜετά την αρχική κατεργασία με την ελεγχόμενη ουσία εφαρμόζονται στην επιδερμική επιφάνεια κάθε δίσκου δέρματος για δύο ώρες, 150 µl διαλύματος σουλφοροδαμίνης Β σε απεσταγμένο νερό 10 % (w/v). Στη συνέχεια, οι δίσκοι δέρματος εκπλύνονται με εκτόξευση τρεχούμενου νερού θερμοκρασίας δωματίου επί 10 δευτερόλεπτα περίπου ώστε να απομακρυνθεί τυχόν περίσσεια ή αδέσμευτη χρωστική. Έκαστος των δίσκων δέρματος αφαιρείται από τον σωλήνα PTFE και τοποθετείται με φιαλίδιο (π.χ. γυάλινο φιαλίδιο σπινθηρισμού των 20 ml) που περιέχει απιονισμένο νερό (8 ml). Τα φιαλίδια αναδεύονται ήπια επί 5 λεπτά ώστε να απομακρυνθεί τυχόν επιπλέον περίσσεια ή αδέσμευτη χρωστική. Επαναλαμβάνεται η έκπλυση με τρεχούμενο νερό και, στη συνέχεια, οι δίσκοι δέρματος αφαιρούνται και τοποθετούντα σε φιαλίδια που περιέχουν 5 ml διαλύματος δωδεκυλοσουλφονικού νατρίου (SDS) σε αποσταγμένο νερό 30 % (w/v). Τα φιαλίδια αφήνονται προς επώαση στους 60 °C επί μια νύχτα. Μετά την επώαση, οι δίσκοι δέρμτος αφαιρούνται από τα φιαλίδια και απορρίπτονται ενώ το εναπομένον διάλυμα φυγοκεντρείται επί 8 λεπτά στους 21 °C (σχετική φυγόκεντρος δύναμη [sim     ] 175). Από την υπερκείμενη στιβάδα λαμβάνεται 1 ml και αραιώνεται σε αναλογία 1 προς 5 (v/v) [δηλ. 1 ml + 4 ml] με διάλυμα 30 % (w/v) SDS σε απεσταγμένο νερό. Η οπτική πυκνότητα του διαλύματος μετράται στα 565 nm περίπου.1.5.3.3.2. Υπολογισμός της περιεκτικότητας σε χρωστικήΗ περιεκτικότητα κάθε δίσκου σε σουλφοροδαμίνη Β υπολογίζεται με βάση τις τιμές οπτικής πυκνότητας (συντελεστής μοριακής απόσβεσης της σουλφοροδαμίνης Β στα 565 nm = 8,7 × 104 μοριακό βάρος = 580). Προσδιορίζεται η περιεκτικότητα εκάστου δίσκου δέρματος σε σουλφοροδαμίνη Β και κατόπιν υπολογίζεται η μέση περιεκτικότητα σε χρωστική για τις επαναλήψεις. Οι μέσες τιμές δέσμευσης χρωστικής γίνονται αποδεκτές εφόσον οι σύγχρονες τιμές που έχουν προκύψει για την ουσία μάρτυρα περικλείονται στις αποδεκτές για τη μέθοδο περιοχές τιμών. Οι υποδεικνυόμενες αποδεκτές περιοχές τιμών περιεκτικοτήτων σε χρωστική για τις ουσίες μάρτυρες, για τη μεθοδολογία και για τη συσκευασία που περιγράφονται έχουν ως εξής:>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>1.5.3.4. Πρόσθετες πληροφορίεςΟι ελεγχόμενες ουσίες μπορούν να εφαρμόζονται στους δίσκους δέρματος για βραχύτερα χρονικά διαστήματα (π.χ. 2 ώρες) προκειμένου να εντοπίζονται υλικά που προκαλούν ισχυρή διάβρωση. Η μελέτη επικύρωσης, ωστόσο, κατέδειξε ότι η δοκιμασία TER οδήγησε σε υπερεκτίμηση του διαβρωτικού δυναμικού διαφόρων ελεγχόμενων χημικών ουσιών μετά τη διατήρησή τους σε επαφή με τους δίσκους δέρματος επί δύο ώρες (2), ενώ με την εικοσιτετράωρη διαδικασία επέτρεψε τον ορθό προσδιορισμό των διαβρωτικών και μη διαβρωτικών ουσιών.Τα χαρακτηριστικά και οι διαστάσεις της χρησιμοποιούμενης συσκευής καθώς και η ακολουθούμενη πειραματική διαδικασία μπορούν να επηρεάσουν τις λαμβανόμενες τιμές TER. Το κατώτατο όριο διάβρωσης των 5 kΩ υπολογίστηκε με βάση τα δεδομένα που ελήφθησαν με τη συγκεκριμένη συσκευή και διαδικασία που περιγράφονται στην παρούσα μέθοδο. Σε περίπτωση σημαντικής μεταβολής των συνθηκών της δοκιμής είναι δυνατόν να ισχύουν διαφορετικά όρια και τιμές για τους μάρτυρες. Ως εκ τούτου, συνιστάται διακρίβωση της μεθοδολογίας και του κατωτάτου ορίου αντίστασης μέσω της διεξαγωγής δοκιμών με σειρά προτύπων διαλυμάτων αναφοράς τα οποία θα επιλεγούν μεταξύ των χημικών ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη επικύρωσης (3).1.6. Αρχή της μεθόδου δοκιμής - Δοκιμασία με ομοίωμα ανθρώπινου δέρματοςΤο ελεγχόμενο υλικό εφαρμόζεται τοπικά επί 4 ώρες κατ' ανώτατο όριο, στο τρισδιάστατο ομοίωμα ανθρώπινου δέρματος το οποίο περιλαμβάνει αναπλασθείσα επιδερμίδα με λειτουργική κερατίνη στιβάδα. Τα διαβρωτικά υλικά ταυτοποιούνται με βάση την ικανότητά τους να προκαλούν μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας (όπως προσδιορίζεται π.χ. με τη δοκιμασία αναγωγής του ΜΤΤ) σε επίπεδα χαμηλότερα των καθορισθέντων κατωτάτων ορίων σε συγκεκριμένες περιόδους έκθεσης. Η αρχή της δοκιμασίας στηρίζεται στο σκεπτικό ότι διαβρωτικές χημικές ουσίες είναι εκείνες που μπορούν να διεισδύσουν στην κερατίνη στοιβάδα (με διάχυση ή διάβρωση) και είναι αρκούντως κυτταροτοξικές ώστε να προκαλούν το θάνατο των κυττάρων στις υποκείμενες κυτταρικές στοιβάδες.1.7. Περιγραφή της μεθόδου δοκιμής - Δοκιμασία με ομοίωμα ανθρώπινου δέρματος1.7.1. Ομοιώματα ανθρωπίνου δέρματοςΤα ομοιώματα ανθρώπινου δέρματος είναι δυνατόν να προέρχονται από διάφορες πηγές, αλλά πρέπει να ικανοποιούν ορισμένα κριτήρια. Το ομοίωμα πρέπει να έχει μια λειτουργική κερατίνη στοιβάδα με υπόστρωμα ζώντων κυττάρων. Η φρακτική λειτουργία της κερατίνης στοιβάδας πρέπει να είναι επαρκής. Αυτό μπορεί να αποδειχθεί καταδεικνύοντας την αντοχή του ομοιώματος στην κυτταροτοξικότητα μετά την εφαρμογή ουσιών οι οποίες είναι γνωστές ως κυτταροτοξικές αλλά δεν διαπερνούν την κερατίνη στοιβάδα. Πρέπει επίσης να καταδεικνύεται ότι με το ομοίωμα αυτό λαμβάνονται αναπαραγώγιμα αποτελέσματα υπό καθορισμένες πειραματικές συνθήκες.Η βιωσιμότητα των ζώντων κυττάρων του ομοιώματος πρέπει να είναι αρκετά υψηλή ώστε να γίνεται σαφής διάκριση μεταξύ των θετικών και αρνητικών μαρτύρων. Η κυτταρική βιωσιμότητα (όπως προκύπτει, επί παραδείγματι, από τη μέτρηση των επιπέδων του αναχθέντος ΜΤΤ, δηλαδή σε τιμή οπτικής πυκνότητας) μετά την έκθεση σε αρνητικό μάρτυρα πρέπει να εμπίπτει στα αποδεκτά όρια για το συγκεκριμένο ομοίωμα. Ομοίως, οι τιμές κυτταρικής βιωσιμότητας που λαμβάνονται με θετικό μάρτυρα (έναντι των αντίστοιχων που λαμβάνονται με αρνητικό μάρτυρα) πρέπει να βρίσκονται εντός καθορισμένων ορίων. Το χρησιμοποιούμενο προγνωστικό μοντέλο πρέπει να ανταποκρίνεται απαραιτήτως στα διεθνή πρότυπα επικύρωσης (2).1.7.2. Διαδικασία δοκιμής1.7.2.1. Εφαρμογή του ελεγχόμενου υλικούΠροκειμένου για υγρά υλικά, χρησιμοποιείται επαρκής ποσότητα ελεγχόμενης ουσίας ώστε να καλύπτει την επιφάνεια του δέρματος (τουλάχιστον 25 µl/cm2. Προκειμένου για στερεά υλικά, χρησιμοποιείται επαρκής ποσότητα ελεγχόμενης ουσίας ώστε να καλύπτει το δέρμα και στη συνέχεια η στερεά ουσία υγραίνεται για να εξασφαλιστεί καλή επαφή με το δέρμα. Εφόσον απαιτείται, τα στερεά κονιοποιούνται πριν από την χρησιμοποίησή τους. Η μέθοδος εφαρμογής πρέπει να είναι κατάλληλη για ένα ευρύ φάσμα χημικών ουσιών (2). Στο τέλος της περιόδου έκθεσης το ελεγχόμενο υλικό εκπλύνεται επιμελώς από την επιφάνεια του δέρματος με αλατούχο διάλυμα.1.7.2.2. Μετρήσεις της κυτταρικής βιωσιμότηταςΓια τη μέτρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας μπορεί να χρησιμοποιηθεί οιαδήποτε επικυρωμένη ποσοτική μέθοδος. Η πλέον χρησιμοποιούμενη δοκιμασία είναι η αναγωγή ΜΤΤ η οποία παρείχε ακριβή και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα σε διάφορα εργαστήρια (2). Ο δίσκος δέρματος εμβαπτίζεται σε διάλυμα ΜΤΤ συγκεντρώσεως 0,3 mg/ml στους 20-28 °C επί 3 ώρες. Το προκύπτον κυανούν ίζημα formazan εκχυλίζεται (εκχύλιση με διαλύτη) και η συγκέντρωση της formazan υπολογίζεται με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας σε περιοχή μήκους κύματος μεταξύ 545 και 595 nm.1.7.2.3. Πρόσθετες πληροφορίεςΤο είδος του χρησιμοποιηθέντος ομοιώματος δέρματος και το ακριβές πρωτόκολλο του χρόνου έκθεσης και των διαδικασιών έκπλυσης κ.λπ. επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό τα σχετικά με την κυτταρική βιωσιμότητα αποτελέσματα. Συνίστάται διακρίβωση της μεθοδολογίας και του προγνωστικού μοντέλου μέσω της διεξαγωγής δοκιμών με σειρά προτύπων διαλυμάτων αναφοράς τα οποία επιλέγονται μεταξύ των χημικών ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη επικύρωσης του ΕΚΕΕΜ (3). Η χρησιμοποιηθείσα μέθοδος είναι απαραίτητο να έχει αποδειχθεί αναπαραγώγιμη εντός και μεταξύ των διαφόρων εργαστηρίων για ένα ευρύ φάσμα χημικών ουσιών, σύμφωνα με τα διεθνή πρότυπα. Η μέθοδος πρέπει να ανταποκρίνεται τουλάχιστον στα κριτήρια επιστημονικής επικύρωσης που καθορίζονται προηγουμένως (2) και τα αποτελέσματα της μελέτης επικύρωσης να δημοσιεύονται σε έγκυρο επιστημονικό περιοδικό του οποίου τα άρθρα εγκρίνονται από ομότιμους αξιολογητές.2. ΔΕΔΟΜΕΝΑ2.1. Επεξεργασία των αποτελεσμάτων2.1.1. Δοκιμασία TER δέρματος επίμυοςΟι τιμές ηλεκτρικής αντίστασης σε kΩ του ελεγχόμενου υλικού, των θετικών και αρνητικών μαρτύρων και τυχόν προτύπων χημικών ουσιών αναφοράς πρέπει να παρουσιάζονται υπό μορφή πίνακα, όπου θα περιλαμβάνονται επίσης δεδομένα για τα επαναληπτικά πειράματα, μέσες τιμές και η προκύπτουσα ταξινόμηση.2.1.2. Δοκιμασία με ομοιώματα ανθρώπινου δέρματοςΟι τιμές οπτικής πυκνότητας και τα υπολογισθέντα δεδομένα εκατοστιαίας κυτταρικής βιωσιμότητας για το ελεγχόμενο υλικό, τους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες και τυχόν πρότυπες χημικές ουσίες αναφοράς πρέπει να παρουσιάζονται υπό μορφή πίνακα, όπου περιλαμβάνονται επίσης δεδομένα για τα επαναληπτικά πειράματα, μέσες τιμές και η προκύπτουσα ταξινόμηση.2.2. Αξιολόγηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων2.2.1. Δοκιμασία TER δέρματος επίμυοςΌταν η μέση τιμή TER που λαμβάνεται για την ελεγχόμενη ουσία υπερβαίνει τα 5 kΩ τότε η συγκεκριμένη ουσία δεν θεωρείται διαβρωτική. Εάν η τιμή TER είναι μικρότερη ή ίση των 5 kΩ, η ελεγχόμενη ουσία θεωρείται διαβρωτική εφόσον δεν πρόκειται για τασιενεργό ουσία ή ουδέτερη οργανική ένωση.Για τασιενεργές ουσίες ή ουδέτερες οργανικές ενώσεις για τις οποίες λαμβάνονται τιμές TER μικρότερες ή ίσες των 5 kΩ, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί η μέθοδος της διείσδυσης χρωστικής. Εάν η μέση περιεκτικότητα του δίσκου σε χρωστική υπερβαίνει ή ισούται με την αντίστοιχη μέση περιεκτικότητα σε χρωστική που προκύπτει ταυτόχρονα για το θετικό μάρτυρα 36 % υδροχλώριο, τότε το λαμβανόμενο αποτέλεσμα για την ελεγχόμενη ουσία είναι πραγματικά θετικό και η ουσία εωρείται επομένως διαβρωτική. Εάν η μέση περιεκτικότητα του δίσκου σε χρωστική είναι μικρότερη από την αντίστοιχη μέση περιεκτικότητα σε χρωστική που προκύπτει ταυτόχρονα για το θετικό μάρτυρα 36 % υδροχλώριο, τότε το λαμβανόμενο αποτέλεσμα για την ελεγχόμενη ουσία είναι ψευδοθετικό και η ουσία δεν είναι επομένως διαβρωτική.2.2.2. Δοκιμασία με ομοίωμα ανθρώπινου δέρματοςΗ τιμή οπτικής πυκνότητας του αρνητικού μάρτυρα αντιπροσωπεύει κυτταρική βιωσιμότητα 100 %. Ως εκ τούτου οι λαμβανόμενες για το ελεγχόμενο δείγμα τιμές οπτικής πυκνότητας μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον υπολογισμό της εκατοστιαίας βιωσιμότητας σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα. Η διαχωριστική τιμή εκατοστιαίας κυτταρικής βιωσιμότητας βάσει της οποίας γίνεται διάκριση μεταξύ διαβρωτικών και μη διαβρωτικών ελεγχόμενων υλικών (ή μεταξύ των διαφόρων βαθμών διάβρωσης) πρέπει να καθορίζεται σαφώς στο προγνωστικό μοντέλο πριν από την επικύρωση της μεθόδου, και η πραγματοποιούμενη στη συνέχεια μελέτη επικύρωσης πρέπει να καταδεικνύει την καταλληλότητα της διαχωριστικής αυτής τιμής (2).3. ΕΚΘΕΣΕΙΣΈκθεση της δοκιμήςΗ έκθεση της δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τουλάχιστον τις ακόλουθες πληροφορίες:Ελεγχόμενη ουσία:- ταυτοποίηση, φυσική κατάσταση και, κατά περίπτωση, φυσικοχημικές ιδιότητες. Ανάλογες πληροφορίες πρέπει να παρέχονται για τις τυχόν χρησιμοποιούμενες ουσίες αναφοράς.Συνθήκες δοκιμής:- λεπτομερής περιγραφή της διαδικασίας δοκιμής που ακολουθήθηκε,- περιγραφή και αιτιολόγηση τυχόν τροποποιήσεων.Αποτελέσματα:- παρουσίαση σε πίνακα των τιμών ηλεκτρικής αντίστασης (δοκιμασία TER) ή των τιμών εκατοσταίας κυτταρικής βιωσιμότητας (δοκιμασία με ομοίωμα ανθρώπου δέρματος) που ελήφθησαν για το ελεγχόμενο υλικό, τους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες και τυχόν πρότυπες χημικές ουσίες αναφοράς, συμπεριλαμβανομένων των δεδομένων που προέκυψαν από τη επαναληπτικά πειράματα και των μέσων τιμών,- περιγραφή τυχόν άλλων επιπτώσεων που παρατηρήθηκαν.Σχολιασμός των αποτελεσμάτωνΣυμπεράσματα4. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ(1) ECVAM (1998), ECVAM News &  Views, ATLA 26, σσ. 275-280.(2) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H-G. &  Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, σσ. 483-524.(3) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P. &  Worth, A.P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, σσ. 471-482.(4) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A. &  Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test - modifications and validation, Food &  Chemical Toxicology 24, σσ. 507-512.(5) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J. &  Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, σσ. 191-194.(6) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J. &  Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, σσ. 709-720.(7) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P. &  Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, σσ. 219-255.Σχήμα 1>PIC FILE= "L_2000136EL.009601.TIF">Σχήμα 2>PIC FILE= "L_2000136EL.009701.TIF">"ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ"B.41. ΦΩΤΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ - IN VITRO 3T3 NRU ΔΟΚΙΜΗ ΦΩΤΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ1 ΜΕΘΟΔΟΣ1.1 ΕισαγωγήΩς φωτοτοξικότητα ορίζεται η τοξική απόκριση που εμφανίζεται μετά την πρώτη έκθεση του δέρματος σε ορισμένες χημικές ουσίες και την εν συνεχεία έκθεση στο φως ή που επάγεται ομοίως από ακτινοβόληση του δέρματος έπειτα από συστεμική χορήγηση μιας χημικής ουσίας.Τα στοιχεία που λαμβάνονται από την in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας χρησιμεύουν για τον προσδιορισμό της φωτοτοξικής δυνατότητας μιας υπό δοκιμή ουσίας, δηλαδή της ύπαρξης ή απουσίας πιθανών κινδύνων που μπορεί να εμφανιστούν από μια υπό δοκιμή ουσία σε συνδυασμό με έκθεση στο υπεριώδες και το ορατό φως.Δεδομένου ότι το τοξικολογικό τελικό αποτέλεσμα της in vitro δοκιμής είναι ο προσδιορισμός της φωτοκυτεαροτσξικότητας, που προκαλείται από τη συνδυασμένη δράση χημικής ουσίας και φωτός, ενώσεις που είναι φωτοτοξικές in vivo έπειτα από συστεμική εφαρμογή και κατανομή στο δέρμα, καθώς επίσης και ενώσεις που δρουν ως φωτοερεθιστικά έπειτα από τοπική εφαρμογή στο δέρμα, μπορούν να ταυτοποιηθούν με τη δοκιμή.Η in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε σε κοινό πρόγραμμα EE/COLIPA από το 1992-1997 (123) που απέβλεπε στην καθιέρωση μιας έγκυρης in vitro εναλλακτικής λύσης αντί των διαφόρων in vivo χρησιμοποιούμενων δοκιμών. Το 1996 σε συνάντηση εργασίας του ΟΟΣΑ προτάθηκε μια in vitro προσέγγιση διαδοχικών σταδίων ελέγχου για την εκτίμηση της φωτοτοξικότητας (4).Τα αποτελέσματα της in vitro 3T3 NRU δοκιμής φωτοτοξικότητας συγκρίθηκαν με τις in vivo οξείες φωτοτοξικές/φωτοερεθιστικές επιδράσεις σε ζώα και ανθρώπους, και η δοκιμή αποδείχθηκε ότι παρείχε εξαιρετικές προβλέψεις ως προς τις επιδράσεις αυτές. Η δοκιμή δεν έχει σχεδιαστεί για την πρόβλεψη άλλων δυσμενών επιδράσεων που μπορεί να προκύψουν από τη συνδυασμένη δράση χημικής ουσίας και του φωτός, π.χ. φωτογονιδιοτοξικότητας, φωτοαλλεργίας και φωτοκαρκινογένεσης, αν και πολλές ουσίες που παρουσιάζουν τα ειδικά αυτά χαρακτηριστικά αντιδρούν θετικά στην in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας. Επιπλέον, η δοκιμή δεν έχει σχεδιαστεί κατά τρόπο που να μπορεί να γίνεται εκτίμηση της φωτοτοξικής ισχύος.Στο προσάρτημα δίνεται μια προσέγγιση διαδοχικών σταδίων ελέγχου της φωτοτοξικότητας χημικών ουσιών.1.2 ΟρισμοίΈνταση ακτινοβολίας: η ένταση του προσπίπτοντος σε μια επιφάνεια υπεριώδους (UV) ή ορατού φωτός, μετρούμενη σε W/m2 ή mW/cm2.Δόση φωτός: η ποσότητα (= ένταση × χρόνος) υπεριώδους (UV) ή ορατής ακτινοβολίας προσπίπτουσας σε επιφάνεια, εκφραζόμενη σε Joules (= W × s) ανά μονάδα επιφανείας, π.χ. J/m2 ή J/cm2.Ζώνες UV φωτός: οι χαρακτηρισμοί που προτείνονται από την CIE (Commision Internationale de L'Eclairage) είναι: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) και UVC (100-280 nm). Χρησιμοποιούνται επίσης και ορισμένοι άλλοι χαρακτηρισμοί: το διαχωριτικό σημείο μεταξύ UVB και UVA τοποθετείται συχνά στα 320 nm, ενώ η UVA μπορεί να χωρίζεται σε UV-A1 και UV-Α2 με την υποδιαίρεση στα 340 nm περίπου.Κυτταρική βιωσιμότητα: παράμετρος που μετράει τη συνολική δραστικότητα ενός κυτταρικού πληθυσμού (π.χ. πρόσληψη της ζωτικής χρωστικής Neutral Red σε κυτταρικά λυσοσώματα) η οποία, ανάλογα με το μετρούμενο τελικό αποτέλεσμα και τον χρησιμοποιούμενο σχεδιασμό της δοκιμής, συσχετίζεται με το συνολικό αριθμό ή/και ζωτικότητα των κυττάρων.Σχετική κυτταρική βιωσιμότητα: η κυτταρική βιωσιμότητα εκφραζόμενη σε σχέση με αρνητικούς (διαλύτες) μάρτυρες που έχουν περάσει από όλη τη διαδικασίας δοκιμής (είτε + UV είτε - UV), αλλά δεν έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία με υπό δοκιμή ουσία.Μοντέλο πρόβλεψης: αλγόριθμος που χρησιμοποιείται για τη μετατροπή των αποτελεσμάτων μιας δοκιμής τοξικότητας σε πρόβλεψη της τοξικής δυνατότητας. Στα πλαίσια των κατευθυντηρίων γραμμών της παρούσας δοκιμής, για τη μετατροπή των αποτελεσμάτων της in vitro 3T3 NRU δοκιμής φωτοτοξικότητας σε πρόβλεψη των φωτοτοξικών δυνατοτήτων μπορούν να χρησιμοποιηθούν οι PIF και MPE.PIF (photo irritation factor - συντελεστής φωτοερεθισμού): συντελεστής που λαμβάνεται συγκρίνοντας δύο εξίσου αποτελεσματικές κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις (EC50) της υπό δοκιμή ουσίας απουσία (- UV) και παρουσία (+ UV) μη κυτταροτοξικής ακτινοβόλησης με UVA/ορατό φως.MPE (mean photo efect - μέση φωτοεπίδραση): νέο μέτρο που προέρχεται από μαθηματική ανάλυση του πλήρους σχήματος δύο καμπύλων συγκέντρωσης απόκρισης απουσία (- UV) και παρουσία (+ UV) μη κυτταροτοξικής ακτινοβόλησης με UVA/ορατό φως.Φωτοτοξικότητα: οξεία τοξική απόκριση που εμφανίζεται μετά την πρώτη έκθεση του δέρματος σε ορισμένες χημικές ουσίες και την εν συνεχεία έκθεση στο φως, ή η οποία επάγεται ομοίως από ακτινοβόληση του δέρματος έπειτα από συστεμική χορήγηση μιας χημικής ουσίας.Φωτοερεθισμός: υποδιαίρεση του όρου 'φωτοτοξικότητα', που χρησιμοποιείται για να περιγράψει μόνον τις φωτοτοξικές εκείνες αντιδράσεις που προκαλούνται στο δέρμα έπειτα από έκθεση σε χημικές ουσίες (τοπικά ή από το στόμα). Οι φωτοτοξικές αυτές αντιδράσεις έχουν πάντοτε ως αποτέλεσμα τη μη εξειδικευμένη καταστροφή κυττάρων (αντιδράσεις όπως τα ηλιακά εγκαύματα).Φωτοαλλεργία: επίκτητη ανοσολογική αντίδραση, που δεν εμφανίζεται στην πρώτη επαφή με χημική ουσία και φως, και χρειάζεται επαγωγικό χρονικό διάστημα μιας ή δύο εβδομάδων πριν να εμφανιστεί δερματική αντίδραση.Φωτογονιδιοτοξικότητα: παρατηρούμενη γονιδιοτοξική απόκριση με γενετικό τελικό αποτέλεσμα, που εμφανίζεται μετά την έκθεση κυττάρων σε μη γονιδιοτοξική δόση UV/ορατού φωτός και μη γονιδιοτοξική χημική ουσία.Φωτοκαρκινογένεση: καρκινογένεση προκαλούμενη από επανειλημμένη χρήση φωτός και χημικής ουσίας. Εφόσον τυχόν από UV προκαλούμενη ογκογένεση ενισχύεται από χημική ουσία, τότε χρησιμοποιείται ο όρος 'φωτοσυγκαρκινογένεση'.1.3 Ουσίες αναφοράςΕκτός από τον θετικό χημικό μάρτυρα χλωροπρομαζίνη, που θα πρέπει να δοκιμάζεται ταυτόχρονα σε κάθε δοκιμή, σε περιπτώσεις πρώτης εφαρμογής της δοκιμής φωτοτοξικότητας 3T3 NRU συνιστάται να χρησιμοποιούνται ως ουσίες αναφοράς και ορισμένες από τις ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν σε διεργαστηριακές δοκιμές με την παρούσα δοκιμή (1) (3) (13).1.4 Αρχικές θεωρήσειςΥπάρχουν διάφοροι τύποι χημικών ουσιών που έχουν αναφερθεί ως φωτοτοξικές (5) (6) (7) (8). Το μόνο κοινό χαρακτηριστικό τους είναι η ικανότητά τους να απορροφούν φωτεινή ενέργεια ση περιοχή του ηλιακού φωτός. Σύμφωνα με τον πρώτο νόμο της φωτοχημείας (Grotthaus-Draper's Law) η φωτοαντίδραση απαιτεί επαρκή απορρόφηση κβάντων φωτός. Έτσι, πριν από το βιολογικό έλεγχο σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της παρούσας δοκιμής, θα πρέπει να προσδιορίζεται το φάσμα απορρόφησης UV/ορατού της υπό δοκιμή ουσίας (π.χ. σύμφωνα με την OECD Test Guideline 101). Εάν ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης/απορρόφησης είναι μικρότερος από 10 λίτρα × mol- 1 × cm- 1 η χημική ουσία δεν έχει φωτοαντιδραστικές δυνατότητες και δεν χρειάζεται να ελεγχθεί με την in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας ή οποιαδήποτε άλλη βιολογική δοκιμή για δυσμενείς φωτοχημικές επιδράσεις (Προσάρτημα).1.5 Αρχή της μεθόδου δοκιμήςΈχουν εντοπιστεί τέσσερις μηχανισμοί με τους οποίους η απορρόφηση φωτός από μια χρωμοφόρο χημική ένωση μπορεί να οδηγήσει σε φωτοτοξική απόκριση (7). Όλοι απολήγουν σε καταστροφή των κυττάρων. Συνεπώς, η in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας βασίζεται σε σύγκριση της κυτταροτοξικότητας μιας χημικής ουσίας όταν υποβάλλεται σε δοκιμή με και χωρίς έκθεση σε μη κυτταροτοξική δόση UVA/ορατού φωτός. Η κυτταροτοξικότητα σε αυτή τη δοκιμή εκφράζεται με τη μορφή εξαρτώμενης από τη συγκέντρωση μείωσης της πρόσληψης της ζωτικής χρωστικής neutral red (NR) (9), 24 ώρες μετά την αγωγή με την υπό δοκιμή ουσία και ακτινοβόληση.Κύτταρα Balb/c 3T3 διατηρούνται σε καλλιέργεια για 24 ώρες για το σχηματισμό μονοστιβάδων. Στη συνέχεια, δύο τρυβλία με 96 κοιλότητες ανά δοκιμαζόμενη ουσία προεπωάζονται με οκτώ διαφορετικές συγκεντρώσεις της ουσίας για 1 h. Στη συνέχεια, ένα από τα δύο τρυβλία εκτίθεται σε μη κυτταροτοξική δόση UVA/ορατό φωτός 5 J/cm2 UVA (πείραμα + UV), ενώ το άλλο τρυβλίο διατηρείται στο σκοτάδι (πείραμα - UV). Και στα δύο τρυβλία, το μέσον αγωγής αντικαθίσταται κατόπιν από μέσον καλλιέργειας και έπειτα από 24 ακόμη ώρες επώασης, προσδιορίζεται η κυτταρική βιωσιμότητα neutrald red uptake (NRU) για 3 h. Η σχετική κυτταρική βιωσιμότητα, εκφραζόμενη ως ποσοστό μη υποβληθέντων σε αγωγή αρνητικών μαρτύρων, υπολογίζεται για κάθε μία από τις οκτώ συγκεντρώσεις δοκιμής. Για την πρόβλεψη της φωτοτοξικής δυνατότητας, οι κατά συγκέντρωση αποκρίσεις που λαμβάνονται με (+ UV) και χωρίς (- UV) ακτινοβόληση συγκρίνονται, συνήθως στα επίπεδα EC50, δηλαδή στη συγκέντρωση που αναστέλει την κυτταρική βιωσιμώτητα κατά 50 % σε σύγκριση με τους μη υποβληθέντες σε αγωγή μάρτυρες.1.6 Ποιοτικά κριτήριαΚυταρική ευαισθησία σε UVA, ιστορικά στοιχεία: Τα κύτταρα θα πρέπει κανονικά να ελέγχονται ως προς την ευαισθησία τους σε UVA. Κύτταρα διασπείρονται υπό πυκνότητα που χρησιμοποιείται και στην in vίtro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας, την επόμενη ημέρα ακτινοβολούνται με δόσεις UVA από 1-9 J/cm2, και η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίζεται μια ημέρα αργότερα χρησιμοποιώντας τη δοκιμή NRU. Τα κύτταρα πληρούν τα κριτήρια ποιότητας, εάν η βιωσιμότητά τους μετά την ακτινοβόληση με 5 J/cm2 UVA δεν είναι μικρότερη από το 8 % της βιωσιμότητας των διατηρηθέντων στο σκοτάδι μαρτύρων. Στη μέγιστη δόση UVA των 9 J/cm2 η βιωσιμότητα δεν θα πρέπει να είναι μικρότερη από το 50 % εκείνης των διατηρηθέντων στο σκότος μαρτύρων. Ο έλεγχος αυτός θα πρέπει να επαναλαμβάνεται έπειτα από κάθε 10 περίπου διελεύσεις των κυττάρων.Ευαισθησία στο UVA των αρνητικών κυτταρικών μαρτύρων τρέχουσα δοκιμή: Η δοκιμή πληροί τα ποιοτικά κριτήρια εάν οι αρνητικοί μάρτυρες (κύτταρα σε Earl's balanced salt solution (EBSS) με ή χωρίς 1 % διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) ή 1 % αιθανόλη (EtOH)) στο + UVA πείραμα εμφανίζουν βιωσιμότητα όχι μικρότερη από το 8 % εκείνης μη ακτινοβολημένων κυττάρων στον ίδιο διαλύτη του συμπαρομαρτούντος πειράματος στο σκοτάδι (- UVA).Βιωσιμότητα αρνητικών μαρτύρων: Η απόλυτη οπτική πυκνότητα (OD540 NRU) μετρούμενη στο εκχύλισμα NR των αρνητικών μαρτύρων δείχνει αν τα 1 × 104 κύτταρα ανά κοιλότητα αναπτύχθηκαν με κανονικό χρόνο διπλασιασμού κατά τη διάρκεια των δύο ημερών της δοκιμής. Μια δοκιμή πληροί τα κριτήρια αποδοχής εάν η μέση OD540 NRU των μη υποβληθέντων σε αγωγή μαρτύρων είναι >= 0,2.Θετικός μάρτυρας: Σε κάθε in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας πρέπει να εξετάζεται συγχρόνως και μια γνωστή φωτοτοξική χημική ουσία. Στη μελέτη επικύρωσης των EE/COLIPA ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε χλωροπρομαζίνη (CPZ) η οποία και επομένως προτείνεται. Στην περίπτωση CPZ που εξετάζεται με το τυπικό πρωτόκολλο στην in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας, ορίστηκαν τα ακόλουθα κριτήρια αποδοχής-δοκιμής: CPZ ακτινοβολημένη (+ UVA): EC50 = 0,1 έως 2,0 μg/ml, CPZ μη ακτινοβολημένη (- UVA): EC50 = 7,0 έως 90,0 μg/ml. Ο συντελεστής φωτοερεθισμού (PIF), δηλαδή η μεταβολή της EC50 θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 6.Ως συμπαρομαρτούντες θετικοί μάρτυρες, αντί της (CPZ), μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλες γνωστές φωτοτοξικές χημικές ουσίες, κατάλληλες για τη χημική τάξη ή τα χαρακτηριστικά διαλυτότητας της αξιολογούμενης υπό δοκιμή ουσίας. Στην περίπση αυτή, με βάση ιστορικά δεδομένα, θα πρέπει να οριστούν κατάλληλα οι περιοχές των τιμών EC50 και ο PIF ή η ΜΡΕ (mean photo elfeet) ως κριτήρια αποδοχής για τη δοκιμή.1.7 Περιγραφή της μεθόδου δοκιμής1.7.1 Παρασκευάσματα1.7.1.1 ΚύτταραΣτη μελέτη επικύρωσης χρησιμοποιήθηκε μόνιμη κυτταρική σειρά ινοβλαστών ποντικού -Balb/c 3T3, κλώνος 31- είτε από την ATCC είτε από την ECACC, η οποία επομένως και προτείνεται. Στο ίδιο πρωτόκολλο δοκιμής μπορούν να χρησιμοποιηθούν εξίσου επιτυχώς και άλλα κύτταρα ή κυτταρικές σειρές, εφόσον οι συνθήκες καλλιέργειας είναι προσαρμοσμένες στις ειδικές ανάγκες των κυττάρων, πρέπει όμως να καταδεικνύεται η ισοδυναμία.Τα κύτταρα θα πρέπει κανονικά να ελέγχονται μήπως είναι μολυσμένα από μυκόπλασμα και να χρησιμοποιούνται μόνον εφόσον τα αποτελέσματα του ελέγχου αυτού είναι ικανοποιητικά.Επειδή η ευαισθησία των κυττάρων σε UVA μπορεί να αυξάνεται με τον αριθμό των διελεύσεων, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κύτταρα Balb/c 3T3 με τον χαμηλότερο δυνατόν αριθμό διελεύσεων, κατά προτίμηση κάτω των 100. Έχει ιδιαίτερη σημασία, η ευαισθησία σε UVA των κυττάρων Balb/c 3T3 να ελέγχεται τακτικά σύμφωνα με τη διαδικασία ποιοτικού ελέγχου που περιγράφεται στις παρούσες κατευθυντήριες γραμμές.1.7.1.2 Μέσα και συνθήκες καλλιέργειαςΓια τη συνήθη διέλευση κυττάρων και κατά τη διάρκεια της διαδικασίας δοκιμής θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλα μέσα καλλιέργειας και συνθήκες επωάσεως. Για κύτταρα Balb/c 3T3 τα μέσα αυτά είναι DMEM με προσθήκη 10 % ορού νεογέννητου μοσχαριού, 4 mM γλουταμίνη, πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη, και επώαση με υγρασία στους 37 °C/7,5 % CO2. Είναι ιδιαίτερα σημαντικό, οι συνθήκες της κυτταρικής καλλιέργειας να διασφαλίζουν χρόνο κυτταρικού κύκλου στα κανονικά ιστορικά πλαίσια των χρησιμοποιούμενων κυττάρων ή κυτταρικών σειρών.1.7.1.3 Ετοιμασία των καλλιεργειώνΚύτταρα από κατεψυγμένες αρχικές καλλιέργειες εμβολιάζονται σε μέσον καλλιέργειας στην κατάλληλη πυκνότητα και χωρίζονται σε υποκαλλιέργειες τουλάχιστον μια φορά πριν να χρησιμοποιηθούν στην in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας.Για τη δοκιμή φωτοτοξικότητας, τα κύτταρα εμβολιάζονται σε μέσον καλλιέργειας σε πυκνότητα τέτοια ώστε οι καλλιέργειες να μη φθάνουν σε κατάσταση συρροής μέχρι το τέλος της δοκιμής, δηλαδή όταν η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίζεται 48 ώρες μετά τη διασπορά των κυττάρων. Στην περίπτωση κυττάρων Balb/c 3T3 καλλιεργούμενων σε τρυβλία 96 κοιλοτήτων, η συνιστώμενη κυτταρική πυκνότητα είναι 1 × 104 κύτταρα ανά κοιλότητα.Για κάθε δοκιμαζόμενη χημική ουσία, τα κύτταρα εμβολιάζονται με τον ίδιο τρόπο σε δύο χωριστά τρυβλία των 96 κοιλοτήτων, τα οποία περνούν στη συνέχεια ταυτόχρονα από όλη τη διαδικασία δοκιμής υπό ταυτόσημες συνθήκες καλλιέργειας, εκτός από τη χρονική περίοδο όπου ένα από τα τρυβλία ακτινοβολείται (+ UVA/ορατό) και το άλλο διατηρείται στο σκοτάδι (- UVA/ορατό).1.7.1.4 Μεταβολική ενεργοποίησηΑν και η χρήση μεταβολικών συστημάτων αποτελεί γενική απαίτηση για όλες τις in vitro δοκιμές για την πρόβλεψη γονιδιοτοξικών και καρκινογόνων δυνατοτήτων, μέχρι σήμερα, στην περίπτωση της φωτοτοξικολογίας, δεν υπάρχει καμιά γνωστή χημική ουσία για την οποία να χρειάζεται μεταβολικός μετασχηματισμός προκειμένου η ουσία να δράσει ως φωτοτοξίνη in vivo ή in vitro. Έτσι, ούτε θεωρείται αναγκαίο ούτε δικαιολογείται επιστημονικά η εκτέλεση της παρούσας δοκιμής με κάποιο σύστημα μεταβολικής ενεργοποίησης.1.7.1.5 Υπό δοκιμή ουσία/παρασκευήΟι υπό δοκιμή ουσίες πρέπει να είναι πρόσφατα παρασκευασμένες λίγο πριν από τη χρήση τους, εκτός κι αν τα υφιστάμενα στοιχεία σταθερότητας επιτρέπουν την αποθήκευση. Στην περίπτωση που υπάρχει πιθανότητα ταχείας φωτοαποικοδόμησης, μπορεί να απαιτείται παρασκευή με ερυθρό φως.Οι υπό δοκιμή ουσίες θα πρέπει να διαλύονται σε ρυθμιστικά αλατούχα διαλύματα, π.χ. Earl's balanced salt solution, (EBSS) ή phosphate buffered saline (PBS), τα οποία, για λόγους αποφυγής παρεμβατικών φαινομένων κατά τη διάρκεια της ακτινοβόλησης, πρέπει να είναι απηλλαγμένα πρωτεϊνικών συστατικών και χρωστικών δεικτών ρΗ που απορροφούν το φως.Ουσίες με περιορισμένη υδατοδιαλυτότητα θα πρέπει να διαλύονται σε κατάλληλους διαλύτες στο εκατονταπλάσιο της επιθυμητής τελικής συγκέντρωσης και κατόπιν να αραιώνονται 1:100 με το ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα. Εφόσον χρησιμοποιείται διαλύτης, αυτός πρέπει να υπάρχει σε σταθερό όγκο 1 % (v/v) σε όλες τις καλλιέργειες, δηλαδή τόσο στους αρνητικούς μάρτυρες όσο και σε όλες τις συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή ουσίας.Ως διαλύτες συνιστώνται το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και η αιθανόλη (EtOH). Κατάλληλοι μπορεί να είναι και άλλοι διαλύτες με χαμηλή κυτταροτοξικότητα (π.χ. ακετόνη), πρέπει όμως να ελέγχονται προσεκτικά μήπως τυχόν εμφανίζουν κάποιες ειδικές ιδιότητες, π.χ. αντιδρούν με την υπό δοκιμή ουσία, παγώνουν την φωτοτοξική επίδραση, ενώνονται με ρίζες, κ.λπ.Προς υποβοήθηση της υποβοήθησης της διαλυτοποίησης να χρησιμοποιηθεί, εφόσον απαιτείται, ανάμειξη με vortex ή/και επίδραση υπερήχων ή/και θέρμανση στους 37 °C.1.7.1.6 Αντινοβολία UV προετοιμασίαΦωτεινή πηγή: ο κρισιμότερος παράγοντας στη δοκιμή φωτοτοξικότητας είναι η επιλογή κατάλληλης φωτεινής πηγής και κατάλληλου φίλτρου. Η ζώνη UVA και οι ορατές περιοχές σχετίζονται συνήθως με φαινόμενα φωτοευαισθητοποίησης (7) (10), ενώ η UVB σχετίζεται λιγότερο και είναι απευθείας λίαν κυτταροτοξική, η δε κυτταροτοξικότητά της αυξάνεται μέχρι το χιλιαπλάσιο στην περιοχή από 313 έως 280 nm (11). Στα κριτήρια για την επιλογή κατάλληλης φωτεινής πηγής θα πρέπει να περιλαμβάνεται ως βασική απαίτηση, τα κύματα που εκπέμπονται από τη φωτεινή πηγή να έχουν μήκος κύματος απορροφούμενο από την υπό δοκιμή ουσία ενώ η φωτεινή δόση (που πρέπει να επιτυγχάνεται μέσα σε λογικό χρονικό διάστημα) θα πρέπει να είναι επαρκής για την ανίχνευση γνωστών φωτοευαισθητοποιητικών ουσιών. Περαιτέρω, τα χρησιμοποιούμενα μήκη κύματος και οι δόσεις δεν θα πρέπει να έχουν ανεπίτρεπτες επιδράσεις στο σύστημα δοκιμής, συμπεριλαμβανομένης και της εκπομπής θερμότητας (περιοχή υπερύθρου).Ως άριστη φωτεινή πηγή θεωρείται η προσομοίωση του ηλιακού φωτός με ηλιακούς προσομοιωτές. Στους ηλιακούς προσομοιωτές χρησιμοποιούνται τόσον τόξα Xenon όσο και (επιχρισμένα) τόξα υδραργύρουμεταλλοαλογονιδίων. Τα τελευταία έχουν το πλεονέκτημα ότι εκπέμπουν λιγότερη θερμότητα και είναι φθηνότερα, δεν ταιριάζουν όμως απόλυτα με το ηλιακό φως. Επειδή όλοι οι ηλιακοί προσομοιωτές εκπέμπουν σημαντικές ποσότητες UVB, θα πρέπει να φιλτράρονται κατάλληλα ώστε να εξασθενεί η υψηλής κυτταροτοξικότητας ακτινοβολία UVB.Για την in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας θα πρέπει να χρησιμοποιείται φάσμα ακτινοβολίας απηλλαγμένο πρακτικά από UVB (UVA:UVB [sim     ] 1:20). Έχει δημοσιευτεί παράδειγμα της κατανομής της φασματικής ακτινοβολίας του φιλτραρισμένου ηλιακού προσομοιωτή που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη επίσης της in vitro 3T3 NRU δοκιμής φωτοτοξικότητας (3).Δοσομετρία: Η ένταση του φωτός (ένταση ακτινοβολίας) θα πρέπει να ελέγχεται κανονικά πριν από κάθε δοκιμή φωτοτοξικότητας, χρησιμοποιώντας κατάλληλο ευρύζωνο υπεριωδιόμετρο. Το UV-μέτρο πρέπει να διακριβώνεται ως προς την πηγή. Η λειτουργία του UV-μέτρου θα πρέπει να ελέγχεται, και για το σκοπό αυτό, συνιστάται η χρήση ενός δεύτερου UV-μέτρου αναφοράς του ίδιου τύπου και με ταυτόσημη διακρίβωση. Θεωρητικά, κατά μεγάλα διαστήματα, θα πρέπει να χρησιμοποιείται φασματοακτινόμετρο για να μετριέται η φασματική ακτινοβολία της φιλτραρισμένης φωτεινής πηγής και να ελέγχεται η βαθμονόμηση του ευρύζωνου UV-μέτρου, τα όργανα αυτά όμως απαιτούν χειρισμό μόνον από κατάλληλα εκπαιδευμένα άτομα.Στη μελέτη επικύρωσης προσδιορίστηκε ότι δόση 5 J/cm2 (UVA) δεν παρουσιάζει κυτταροτοξικότητα για τα κύτταρα Balb/c 3T3, είναι όμως επαρκής για τη διέγερση έστω και ασθενών φωτοτοξικών χημικών ουσιών. Για την επίτευξη 5 J/cm2 εντός χρονικού διαστήματος 50 min, η ένταση της ακτινοβολίας πρέπει να προσαρμόζεται στα 1,666 mW/cm2. Εφόσον χρησιμοποιηθεί άλλη κυτταρική σειρά ή διαφορετική φωτεινή πηγή, η δόση UVA μπορεί να πρέπει να προσαρμοστεί ελαφρώς, με βάση τα κριτήρια της μη δυσμενούς επίδρασης στα κύτταρα και της επάρκειας για την ανίχνευση συνήθων φωτοτοξινών. Ο χρόνος της φωτεινής έκθεσης υπολογίζεται με τον ακόλουθο τρόπο:>PIC FILE= "L_2000136EL.010101.EPS">1.7.2 Συνθήκες δοκιμήςΗ μέγιστη συγκέντρωση μιας υπό δοκιμή ουσίας δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα 100 µg/ml, αφού όλες οι φωτοτοξικές ουσίες ανιχνεύθηκαν σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις, ενώ σε υψηλότερες συγκεντρώσεις αυξάνει η πιθανότητα εμφάνισης εσφαλμένων θετικών αποτελεσμάτων (υπερβολικών προβλέψεων) (13). Το ρH της υψηλότερης συγκέντρωσης της υπό δοκιμή ουσίας θα πρέπει να είναι ικανοποιηπκό (περιοχή ρH: 6,5-7,8).Οι περιοχές συγκεντρώσεων μιας χημικής ουσίας που υποβάλλεται σε δοκιμή παρουσία (+ UVA) και απουσία (- UVA) φωτός θα πρέπει να προσδιορίζονται κατάλληλα με προηγούμενα πειράματα για εύρεση της περιοχές. Το εύρος και το διάστημα μιας σειράς συγκεντρώσεων πρέπει να προσαρμόζονται έτσι ώστε οι καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης να υποστηρίζονται από επαρκή πειραματικά δεδομένα. Θα πρέπει να χρησιμοποιείται γεωμετρική σειρά συγκεντρώσεων (με σταθερό συντελεστή αραίωσης).1.7.3 Διαδικασία δοκιμή(1)1.7.3.1 Πρώτη ημέραΠαρασκευάζεται εναιώρημα κυττάρων με 1 × 105 κύτταρα/ml σε μέσον καλλιέργειας και προστίθενται 100 µl μέσου καλλιέργειας στις περιφερειακές μόνον κοιλότητες ενός μικροτιτλοδοτικού τρυβλίου με 96 κοιλότητες (= λευκά). Στις εναπομένουσες κοιλότητες, προστίθενται 100 µl κυτταρικού εναιωρήματος με 1 × 105 κύτταρα/ml (= 1 × 104 κύτταρα/κοιλότητα). Για κάθε δοκιμαζόμενη ουσία, ετοιμάζονται δύο τρυβλία: ένα για τον προσδιορισμό της κυτταροτοξικότητας (- UVA), και το άλλο για τον προσδιορισμό της φωτοκυτταροτοξικότητας (+ UVA).Τα κύτταρα επωάζονται για 24 h (7,5 % CO2, 37 °C) έως ότου σχηματίζουν μονοστιβάδα σε επίπεδα ημισυρροής. Η περίοδος αυτή επώασης επιτρέπει την επαναφορά σε κανονική κατάσταση και πρόσφυση των κυττάρων και την εκθετική τους αύξηση.1.7.3.2 Δεύτερη ημέραΜετά την επώαση, το μέσον καλλιέργειας απομακρύνεται από τα κύτταρα και ακολουθεί διπλή έκπλυση με 150 µl EBSS/PBS ανά κοιλότητα. Προστίθενται 100 µl EBSS/PBS με την κατάλληλη συγκέντρωση ουσίας ή απλώς διαλύτη (αρνητικός μάρτυρας). Χρησιμοποιούνται 8 διαφορετικές συγκεντρώσεις της υπό δοκιμή ουσίας. Τα κύτταρα επωάζονται με την υπό δοκιμή ουσία στο σκοτάδι για 60 λεπτά (7,5 % CO2, 37 °C).Για την εκτέλεση του (+ UVA) τμήματος της δοκιμής, τα κύτταρα ακτινοβολούνται μέσα από το καπάκι του τρυβλίου με 96 κοιλότητες με 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2). Για την αποφυγή συμπύκνωσης υδρατμών κάτω από το καπάκι χρησιμοποιείται ένας ανεμιστήρας. Διπλά τρυβλία (- UVA) διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου μέσα σε ένα σκοτεινό κουτί για 50 min (= χρόνος έκθεσης UVA).Το υπό δοκιμή διάλυμα μεταγγίζεται και ακολουθεί έκπλυση δύο φορές με 150 µl EBSS/PBS. Το EBSS/PBS αντικαθίσταται με μέσον καλλιέργειας και ακολουθεί επώαση (7,5 % CO2, 37 °C) όλη τη νύκτα (18-22 h).1.7.3.3 Τρίτη ημέραΜικροσκοπική αξιολόγησηΤα κύτταρα εξετάζονται σε μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων. Καταγράφονται οι μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων που οφείλονται στην κυτταροτοξική επίδραση της υπό δοκιμή ουσίας. Ο έλεγχος αυτός συνίσταται για την αποφυγή πειραματικών λαθών, τα στοιχεία όμως αυτά δεν χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας ή της φωτοτοξικότητας.Δοκιμή neutral red uptakeΤα κύτταρα εκπλύνονται με 150 µl προθερμασμένο EBSS/PBS. Το διάλυμα εκπλύσεως απομακρύνεται με ήπια άντληση. Προστίθενται 100 µl μέσου NR και ακολουθεί επώαση στους 37 °C, σε ένυγρη ατμόσφαιρα με 7,5 % CO2 για 3 h.Μετά την επώαση, το μέσον NR απομακρύνεται και τα κύτταρα εκπλένονται με 150 µl EBSS/PBS. Ακολουθεί ολοκληρωτική μετάγγιση και στύπωση του EBSS/PBS. (Προαιρετικώς: ανάστροφη φυγοκέντρηση)Προστίθενται ακριβώς 150 µl διάλυμα εκρόφησης NR (προσφάτως παρασκευασθέν διάλυμα αιθανόλης/οξικού οξέος)Το μικροτιτλοδοτικό τρυβλίο ανακινείται με ταχύτητα με τη βοήθεια αναταράκτη (σέικερ) μικροτιτλοδοτικών τρυβλίων επί 10 min, μέχρις ότου εκχυλιστεί το NR από τα κύτταρα και σχηματιστεί ομοιογενές διάλυμα.Μετριέται η οπτική πυκνότητα του εκχυλίσματος NR στα 540 nm με φασματοφωτόμετρο, χρησιμοποιώντας τα λευκά ως σημεία αναφοράς. Τα δεδομένα σώζονται σε κατάλληλη μορφή (π.χ. ASCII) για μεταγενέστερη ανάλυση.2 ΔΕΔΟΜΕΝΑ2.1 Ποιότητα και ποσότητα δεδομένωνΤα δεδομένα θα πρέπει να είναι τέτοια ώστε να μπορεί να γίνει ουσιαστική ανάλυση της σχέσης συγκέντρωσης-απόκρισης παρουσία και απουσία UVA/ορατής ακτινοβολίας. Εφόσον διαπιστωθεί κυτταροτοξικότητα, τόσο το εύρος των συγκεντρώσεων όσο και το μεταξύ των επιμέρους συγκεντρώσεων διάστημα θα πρέπει να ρυθμίζονται έτσι ώστε να μπορεί να χαραχθεί καμπύλη σύμφωνα με τα πειραματικά δεδομένα. Λόγω του ότι μια υπό δοκιμή ουσία μπορεί να μην είναι κυτταροτοξική μέχρι την καθορισμένη οριακή συγκέντρωση των 100 µg/ml στο σκοτεινό πείραμα (- UVA), αλλά λίαν τοξική όταν ακτινοβολείται (+ UVA), τα προς έλεγχο εύρη των συγκεντρώσεων και στα δύο μέρη του πειράματος μπορεί να χρειάζεται να διαφέρουν κατά τάξεις μεγέθους ώστε να πληρούται η απαίτηση της κατάλληλης ποιότητας των δεδομένων. Εφόσον δεν διαπιστωθεί κυτταροτοξικότητα και στα δύο μέρη του πειράματος (- UVA και + UVA)), αρκεί έλεγχος με μεγάλη απόσταση μεταξύ μεμονωμένων δόσεων μέχρι την υψηλότερη συκέντρωση.Δεν χρειάζεται οποιαδήποτε επαλήθευση με επαναληπτικό πείραμα στην περίπτωση σαφούς θετικού αποτελέσματος. Επιπλέον, δεν χρειάζεται να επαληθεύονται ούτε τα σαφή αρνητικά αποτελέσματα, υπό την προϋπόθεση ότι η υπό δοκιμή ουσία εξετάστηκε σε επαρκώς υψηλές συγκεντρώσεις. Στις περιπτώσεις αυτές, αρκεί ένα κύριο πείραμα, επικουρούμενο από ένα ή περισσότερα προκαταρκτικά πειράματα ανεύρεσης εύρους συγκεντρώσεων.Δοκιμές με οριακά αποτελέσματα κοντά στη γραμμή τομής του μοντέλου πρόβλεψης θα πρέπει να επαναλαμβάνονται για επαλήθευση.Εφόσον θεωρηθεί αναγκαία η επανάληψη της δοκιμής τότε, για τη λήψη σαφούς αποτελέσματος, μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο η διακύμανση των πειραματικών συνθηκών. Μια βασική μεταβλητή στη δοκιμή αυτή είναι η παρασκευή των διαλυμάτων της υπό δοκιμή ουσίας. Συνεπώς, η διακύμανση αυτών των συνθηκών (συνδιαλύτης, λειοτρίβηση, εφαρμογή υπερήχων) μπορεί να έχει ουσιαστική σημασία στην επανάληψη της δοκιμής. Εναλλακτικώς, μπορεί να εξεταστεί και η διακύμανση του προ της ακτινοβολήσεως χρόνου επωάσεως. Η βράχυνση του χρόνου μπορεί να έχει ιδιαίτερη σημασία στην περίπτωση υδατοασταθών χημικών ουσιών.2.2 Επεξεργασία των αποτελεσμάτωνΌπου είναι δυνατόν, προσδιορίζεται η συγκέντρωση μιας υπό δοκιμή ουσίας που παρουσιάζει 50 % αναστολή της κυτταρικής NRU (EC50). Αυτό μπορεί να γίνει εφαρμόζοντας οποιαδήποτε κατάλληλη διαδικασία μη γραμμικής αναγωγής (κατά προτίμηση Hill ή λογιστική αναγωγή) στα δεδομένα συγκέντρωσης-απόκρισης, ή χρησιμοποιώντας άλλες διαδικασίες προσαρμογής (14). Πριν χρησιμοποιηθεί κάποια τιμή EC50 για περαιτέρω υπολογισμούς, θα πρέπει να ελέγχεται κατάλληλα η ποιότητα της προσαρμογής. Εναλλακτικώς, για τον υπολογισμό της EC50 μπορούν να χρησιμοποιηθούν γραφικές μέθοδοι προσαρμογής. Στην περίπτωση αυτή, συνιστάται η χρήση χάρτου πιθανοτήτων (×-κλίμακα: log, y-κλίμακα: probit), καθώς σε πολλές περιπτώσεις η συνάρτηση συγκέντρωσης-απόκρισης καθίσταται σχεδόν γραμμική μετά το μετασχηματισμό αυτό.2.3 Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων (μοντέλα πρόβλεψης)2.3.1 Μοντέλο πρόβλεψης έκδοση 1: συντελεστής φωτοερεθισμού (PIF)Εάν τόσο παρουσία (+ UVA) όσο και απουσία (- UVA) φωτός, λαμβάνονται πλήρεις καμπύλες συγκέντρωσης απόκρισης, ο συντελεστής φωτοερεθισμού (PIF) υπολογίζεται με τον ακόλουθο τύπο:>PIC FILE= "L_2000136EL.010301.EPS">Τιμή PIF <  5, óçìáßíåé ìç öùôïôïîéêÞ äõíáôüôçôá, ôéìÞ PIF >= 5 σημαίνει φωτοτοξική δυνατότητα.Εάν μια χημική ουσία είναι κυτταροτοξική μόνο υπό συνθήκες + UVA και μη κυτταροτοξική όταν δοκιμάζεται υπό συνθήκες - UVA ο PIF δεν μπορεί να υπολογιστεί, αν και αυτό είναι ένα αποτέλεσμα που δείχνει φωτοτοτοξική δυνατότητα. Στις περιπτώσεις αυτές, μπορεί να υπολογιστεί μια τιμή 'PIF' εάν η δοκιμή κυτταροτοξικότητας (-) εκτελεστεί μέχρι την ανώτατη συγκέντρωση δοκιμής (Cmax) οπότε αυτή η τιμή χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της 'PIF':>PIC FILE= "L_2000136EL.010302.EPS">Εάν μπορεί να ληφθεί μόνον τιμή '< PIF', τότε κάθε τιμή > 1 προλέγει φωτοτοξική δυνατότητα.Εάν δεν μπορούν να υπολογιστούν ούτε η EC50 (- UV) ούτε η EC50 (+ UV) λόγω του ότι η χημική ουσία δεν δείχνει καμμία κυτταροτοξικότητα μέχρι τη μέγιστη συγκέντρωση δοκιμής, αυτό δείχνει την μη ύπαρξη φωτοτοξικής δυνατότητας. Στις περιπτώσεις αυτές, για τον χαρακτηρισμό του αποτελέσματος χρησιμοποιείται ένα τυπικό 'PIF = * 1':>PIC FILE= "L_2000136EL.010303.EPS">Εάν μπορεί να ληφθεί μόνο η τιμή 'PIF = * 1' αυτό σημαίνει τη μη ύπαρξη φωτοτοξικής δυνατότητας.Στις περιπτώσεις (β) και (γ), θα πρέπει να λαμβάνονται σοβαρά υπόψη οι συγκεντρώσεις που λαμβάνονται στην in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας προκειμένου να προβλεφθεί η φωτοτοξική δυνατότητα2.3.2 Μοντέλο πρόβλειψης έκδοση 2: μέση φωτοεπίδραση (MPE)Εναλλακτικά, μπορεί να εφαρμοστεί και μια νέα έκδοση του μοντέλου για την πρόβλεψη της φωτοτοξικής δυνατότητας, που έχει αναπτυχθεί χρησιμοποιώντας δεδομένα της μελέτης επικύρωσης των ΕΕ/COLIPA (15) και δοκιμαστεί υπό τυφλές συνθήκες σε μεταγενέστερη μελέτη για την in vitro φωτοτοξικότητα χημικών φίλτρων UV (13). Το μοντέλο αυτό υπερπηδά τον περιορισμό του μοντέλου PIF στις περιπτώσεις που δεν μπορεί να ληφθεί τιμή EC50. Το μοντέλο χρησιμοποιεί τη 'μέση φωτοεπίδραση' (MPE), μέτρο το οποίο βασίζεται σε σύγκριση των πλήρων καμπυλών συγκέντρωσης απόκρισης. Για την εφαρμογή του μοντέλου MPE, αναπτύχθηκε στο Humboldt University (Berlin, D) ένα ειδικό λογισμικό που μπορεί να παραληφθεί δωρεάν.2.4 Ερμηνεία των αποτελεσμάτωνΘετικό αποτέλεσμα στην in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας (PIF >= 5 ή MPE >= 0,1) σημαίνει ότι η υπό δοκιμή ουσία έχει φωτοτοξική δυνατότητα. Εάν το αποτέλεσμα αυτό λαμβάνεται σε συγκεντρώσεις κάτω των 10 µg/ml, η υπό δοκιμή ουσία είναι επίσης πιθανόν να δρα και ως φωτοτοξίνη και υπό ποικίλες συνθήκες έκθεσης in vivo. Εάν ληφθεί θετικό αποτέλεσμα μόνο στη μέγιστη συγκέντρωση δοκιμής των 100 µg/ml, για την εκτίμηση των κινδύνων ή της φωτοτοξικής ισχύος μπορεί να απαιτείται να ληφθούν υπόψη και άλλα στοιχεία. Σε αυτά μπορεί να περιλαμβάνονται στοιχεία για τη διείσδυση, την απορρόφηση και πιθανή συσσώρευση της ουσίας στο δέρμα, ή έλεγχος της ουσίας σε επιβεβαιωτική εναλλακτική δοκιμή, π.χ. χρησιμοποιώντας μοντέλο ανθρώπινου δέρματος in vitro.Αρνητικό αποτέλεσμα από την in vitro 3T3 NRU δοκιμή φωτοτοξικότητας (PIF <  5 Þ MPE <  0,1) óçìáßíåé üôé ç õðü äïêéìÞ ïõóßá äåí åßíáé öùôïôïîéêÞ óôá êáëëéåñãçìÝíá êýôôáñá èçëáóôéêþí õðü ôéò ÷ñçóéìïðïéïýìåíåò óõíèÞêåò. Óôéò ðåñéðôþóåéò üðïõ ç ïõóßá ìðüñåóå íá äïêéìáóôåß ìÝ÷ñé ôç ìÝãéóôç óõãêÝíôñùóç ôùí 100 µg/ml, ôõ÷üí áñíçôéêü áðïôÝëåóìá óçìáßíåé üôé ç ïõóßá äåí Ý÷åé öùôïôïîéêÞ äõíáôüôçôá, ç äå öùôïôïîéêüôçôá in vivo ìðïñåß íá èåùñçèåß ùò áðßèáíç. Óôéò ðåñéðôþóåéò üðïõ åëÞöèçóáí ôáõôüóçìåò áðïêñßóåéò óõãêÝíôñùóçò-ôïîéêüôçôáò (EC50 + UV êáé EC50 - UV) óå ÷áìçëüôåñåò óõãêåíôñþóåéò ç åñìçíåßá ôùí áðïôåëåóìÜôùí ìðïñåß íá åßíáé ç ßäéá. ÁíôéèÝôùò, áí äåí êáôáäåß÷èçêå ôïîéêüôçôá (+ UV êáé - UV) áëëÜ ëüãù ìåéùìÝíçò õäáôïäéáëõôüôçôáò ôçò ïõóßáò ïé óõãêåíôñþóåéò ðåñéïñßóôçêáí óå ôéìÝò ÷áìçëüôåñåò ôùí 100 µg/ml, ôüôå ìðïñåß íá ôåèåß åí áìöéâïëßá ç óõìâáôüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò ìå ôç äïêéìÞ êáé èá ðñÝðåé íá åîåôáóôåß ôï åíäå÷üìåíï äéåîáãùãÞò åðéâåâáéùôéêÞò äïêéìáóßáò (ð.÷., ÷ñçóéìïðïéþíôáò ìïíôÝëï äÝñìáôïò in vitro, Þ ìïíôÝëï äÝñìáôïò ex vivo or äïêéìÞ in vivo).3 ÁÍÁÖÏÑÁ¸êèåóç äïêéìÞòÇ Ýêèåóç äïêéìÞò ðñÝðåé íá ðåñéëáìâÜíåé ôá áêüëïõèá óôïé÷åßá:Õðü äïêéìÞ ïõóßá:- óôïé÷åßá ôáõôïðïßçóçò êáé áñéèìüò CAS, åÜí åßíáé ãíùóôÜ,- öõóéêÞ ìïñöÞ êáé êáèáñüôçôá,- öõóéêï÷çìéêÝò éäéüôçôåò ó÷åôéêÝò ìå ôç äéåîáãùãÞ ôçò ìåëÝôçò,- óôáèåñüôçôá êáé öùôïóôáèåñüôçôá, åÜí åßíáé ãíùóôÝò.Äéáëýôçò:- áéôéïêüãçóç ôçò åðéëïãÞò ôïõ äéáëýôç,- äéáëõôüôçôá ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò óôïí äéáëýôç,- ðïóïóôü äéáëýôç åõñéóêüìåíï óôï ìÝóï êáôåñãáóßáò (EBSS Þ PBS).Êýôôáñá:- ôýðïò êáé ðçãÞ êõôôÜñùí- áðïõóßá ìõêïðëÜóìáôïò,- áñéèìüò êõôôáñéêþí äéåëåýóåùí, áí åßíáé ãíùóôÝò,- åõáéóèçóßá ôùí êõôôÜñùí óå UVA, ðñïóäéïñéæüìåíç ìå ôïí åîïðëéóìü áêôéíïâüëçóçò ðïõ ÷ñçóéìïðïéåßôáé óôçí in vitro 3T3 NRU äïêéìÞ öùôïôïîéêüôçôáò.ÓõíèÞêåò äïêéìÞò (á)/åðþáóç ðñéí êáé ìåôÜ ôçí êáôåñãáóßá:- ôýðïò êáé óýóôáóç ôïõ ìÝóïõ êáëëéÝñãåéáò,- óõíèÞêåò åðþáóçò (óõãêÝíôñùóç CO2, èåñìïêñáóßá, õãñáóßá),- äéÜñêåéá ôçò åðþáóçò (ðñïêáôåñãáóßá, ìåôáêáôåñãáóßá).ÓõíèÞêåò äïêéìÞò (â)/êáôåñãáóßá ìå ôçí ÷çìéêÞ ïõóßá:- óêåðôéêü ôçò åðéëïãÞò ôùí óõãêåíôñþóåùí ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò ðïõ ÷ñçóéìïðïéïýíôáé ìå êáé ÷ùñßò áêôéíïâüëçóç UV/ïñáôïý,- óå ðåñßðôùóç ðåñéïñéóìÝíçò äéáëõôüôçôáò ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò êáé áðïõóßáò êõôôáñïôïîéêüôçôáò, óêåðôéêü ôçò ÷ñçóéìïðïéçèåßóáò õøçëüôåñçò óõãêÝíôñùóçò,- ôýðïò êáé óýóôáóç ôïõ ìÝóïõ êáôåñãáóßáò (ñõèìéóôéêü áëáôïý÷ï äéÜëõìá),- äéÜñêåéá ôçò ÷çìéêÞò êáôåñãáóßáò.ÓõíèÞêåò äïêéìÞò (ã)/áêôéíïâüëçóç:- óêåðôéêü åðéëïãÞò ôçò ÷ñçóéìïðïéïýìåíçò öùôåéíÞò ðçãÞò,- ÷áñáêôçñéóôéêÜ öáóìáôéêÞò áíôéíïâïëßáò ôçò öùôåéíÞò ðçãÞò,- ÷áñáêôçñéóôéêÜ äéáöÜíåéáò/áðïññüöçóçò ôïõ Þ ôùí ÷ñçóéìïðïéïýìåíùí ößëôñùí,- ÷áñáêôçñéóôéêÜ ôïõ áêôéíïìÝôñïõ êáé ëåðôïìÝñåéåò äéáêñßâùóÞò ôïõ,- áðüóôáóç ôçò öùôåéíÞò ðçãÞò áðü ôï óýóôçìá äïêéìÞò,- Ýíôáóç áêôéíïâïëßáò UVA óôçí áðüóôáóç áõôÞ, åêöñáæüìåíç óå mW/cm2,- äéÜñêåéá Ýêèåóçò óå UV/ïñáôü öùò,- äüóç UVA (Ýíôáóç áêôéíïâïëßáò × ÷ñüíïò), åêöñáæüìåíç óå J/cm2,- èåñìïêñáóßá ÷ñçóéìïðïéïýìåíç óôéò êõôôáñéêÝò êáëëéÝñãåéåò êáôÜ ôç äéÜñêåéá ôçò áêôéíïâüëçóçò êáé óôéò ôáõôï÷ñüíùò äéáôçñïýìåíåò óôï óêïôÜäé êõôôáñéêÝò êáëëéÝñãåéåò.ÓõíèÞêåò äïêéìÞò (ä)/äïêéìÞ NRU:- óýóôáóç ôïõ ìÝóïõ NR,- äéÜñêåéá åðþáóçò NR,- óõíèÞêåò åðþáóçò (óõãêÝíôñùóç CO2, èåñìïêñáóßá, õãñáóßá),- óõíèÞêåò åê÷ýëéóçò NR (åê÷õëéóôéêü, äéÜñêåéá),- ìÞêïò êýìáôïò ÷ñçóéìïðïéïýìåíï ãéá ôçí öáóìáôïöùôïìåôñéêÞ áíÜãíùóç ôçò ïðôéêÞò ðõêíüôçôáò NR,- äåýôåñï ìÞêïò êýìáôïò (áíáöïñÜò), åöüóï ÷ñçóéìïðïéåßôáé,- ðåñéå÷üìåíï ëåõêïý ôïõ öáóìáôïöùôïìÝôñïõ, åöüóïí ÷ñçóéìïðïéåßôáé.ÁðïôåëÝóìáôá:- êõôôáñéêÞ âéùìüôçôá ëáìâáíüìåíç óå êÜèå óõãêÝíôñùóç ôçò õðü äïêéìÞ ïõóßáò, åêöñáæüìåíç óå ðïóïóôéáßá ìÝóç âéùóéìüôçôá ôùí ìáñôýñùí,- êáìðýëåò óõãêÝíôñùóçò - áðüêñéóçò (óõãêÝíôñùóç õðü äïêéìÞ ïõóßáò óå óõíÜñôçóç ìå ôç ó÷åôéêÞ êõôôáñéêÞ âéùóéìüôçôá), ëáìâáíüìåíåò óå ôáõôü÷ñïíá ðåéñÜìáôá + UVA êáé - UVA,- áíÜëõóç äåäïìÝíùí êáìðõëþí óõêÝíôñùóçò - áðüêñéóçò: åöüóïí åßíáé äõíáôüí, åêôßìçóç/õðïëïãéóìüò ôùí EC50 (+ UVA) êáé EC50 (- UVA),- óýãêñéóç ôùí äýï êáìðõëþí óõãêÝíôñùóçò - áðüêñéóçò ðïõ ëáìâÜíïíôáé ìå êáé ÷ùñßò áêôéíïâüëçóç UVA/ïñáôïý åßôå ìå õðïëïãéóìü ôïõ óõíôåëåóôÞ öùôïåñåèéóìïý (PIF) åßôå ìå õðïëïãéóìü ôçò ìÝóçò öùôïåðßäñáóçò (MPE),- ôáîéíüìçóç ôçò öùôïôïîéêÞò äõíáôüôçôáò,- êñéôÞñéá áðïäï÷Þò äïêéìÞò (á)/ôáõôü÷ñïíïò áñíçôéêüò ìÜñôõñáò:- áðüëõôç âéùóéìüôçôá (ïðôéêÞ ðõêíüôçôá åê÷õëßóìáôïò NR) áêôéíïâïëçìÝíùí êáé ìç êõôôÜñùí,- éóôïñéêÜ óôïé÷åßá áñíçôéêïý ìÜñôõñá, ìÝóç ôéìÞ êáé ôõðéêÞ áðüêëéóç,êñéôÞñéá áðïäï÷Þò äïêéìÞò (â)/ôáõôü÷ñïíïò èåôéêüò ìÜñôõñáò:- EC50 (+ UVA) êáé EC50 (- UVA) êáé PIF èåôéêïý ìÜñôõñá,- éóôïñéêÜ óôïé÷åßá èåôéêïý ìÜñôõñá: EC50 (+ UVA) êáé EC50 (- UVA) êáé PIF, ìóç ôéìÞ êáé ôõðéêÞ áðüêëéóçÓõæÞôçóç ôùí áðïôåëåóìÜôùíÓõìðåñÜóìáôá4 ÐÁÑÁÐÏÌÐÅÓ(1) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer, F., Moore, L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, óó. 793-796.(2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, óó. 7-8.(3) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pechovitch, G., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA 'In vitro phototoxicity' validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, óó. 305-327.(4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996.(5) Lovell, W.W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology in Vitro 7, óó. 95-102.(6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, óó. XI-XXXV.(7) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, óó. 314-348.(8) Spikes, J.D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, óó. 79-110.(9) Borenfreund, E. and Puerner, J.A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, óó. 119-124.(10) Lambert L. A, Warner W.G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor &  Francis, Washington DC, 5th Edition, óó. 515-530.(11) Tyrrell R.M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, óó. 1825-1829.(12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project 'In Vitro Photoirritation'.(13) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, óó. 679-708.(14) Holzhütter, H.G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, óó. 127-138.(15) Holzhütter, H.G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, óó. 445-462.ÐñïóÜñôçìá>PIC FILE= "L_2000136EL.010702.TIF">"(1) Πρόσθετες λεπτομέρειες μπορούν να βρεθούν στην παραπομπή 12.


Avis juridique important

|

32004L0042

Οδηγία 2004/42/ΕΚ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 21ης Απριλίου 2004, για τον περιορισμό των εκπομπών πτητικών οργανικών ενώσεων που οφείλονται στη χρήση οργανικών διαλυτών σε χρώματα διακόσμησης και βερνίκια και σε προϊόντα φανοποιΐας αυτοκινήτων και για την τροποποίηση της οδηγίας 1999/13/ΕΚ

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 143 της 30/04/2004 σ. 0087 - 0096

Οδηγία 2004/42/ΕΚ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίουτης 21ης Απριλίου 2004για τον περιορισμό των εκπομπών πτητικών οργανικών ενώσεων που οφείλονται στη χρήση οργανικών διαλυτών σε χρώματα διακόσμησης και βερνίκια και σε προϊόντα φανοποιΐας αυτοκινήτων και για την τροποποίηση της οδηγίας 1999/13/ΕΚΤΟ ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ ΚΟΙΝΟΒΟΥΛΙΟ ΚΑΙ ΤΟ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟ ΤΗΣ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗΣ ΕΝΩΣΗΣ,Έχοντας υπόψη:τη Συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Κοινότητας, και ιδίως το άρθρο 95,την πρόταση της Επιτροπής,τη γνώμη της Ευρωπαϊκής Οικονομικής και Κοινωνικής Επιτροπής(1),Αποφασίζοντας σύμφωνα με τη διαδικασία που προβλέπεται στο άρθρο 251 της Συνθήκης(2),Εκτιμώντας τα εξής:(1) Η οδηγία 2001/81/ΕΚ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 23ης Οκτωβρίου 2001, σχετικά με εθνικά ανώτατα όρια εκπομπών για ορισμένους ατμοσφαιρικούς ρύπους(3) καθορίζει εθνικά ανώτατα όρια εκπομπών για ορισμένους ρύπους, συμπεριλαμβανομένων των πτητικών οργανικών ενώσεων (εφεξής "ΠΟΕ"), τα οποία θα πρέπει να έχουν επιτευχθεί έως το 2010 ως τμήμα της ολοκληρωμένης στρατηγικής της Κοινότητας για την καταπολέμηση της οξίνισης και του τροποσφαιρικού όζοντος, αλλά δεν περιλαμβάνει οριακές τιμές για τις εκπομπές των ρύπων αυτών από συγκεκριμένες πηγές.(2) Προκειμένου να συμμορφωθούν προς το εθνικό ανώτατο όριο για τις εκπομπές ΠΟΕ, τα κράτη μέλη πρέπει να εστιάσουν τις προσπάθειές τους σε ορισμένες διαφορετικές κατηγορίες πηγών προέλευσης των εν λόγω εκπομπών.(3) Η παρούσα οδηγία συμπληρώνει τα μέτρα που λαμβάνονται σε εθνικό επίπεδο με στόχο να διασφαλιστεί η συμμόρφωση προς το ανώτατο όριο για τις εκπομπές ΠΟΕ.(4) Ελλείψει κοινοτικών διατάξεων, οι διατάξεις των κρατών μελών οι οποίες επιβάλλουν οριακές τιμές για τις ΠΟΕ σε ορισμένες κατηγορίες προϊόντων ενδέχεται να διαφέρουν. Οι διαφορές αυτές, σε συνδυασμό με την έλλειψη σχετικής νομοθεσίας σε ορισμένα κράτη μέλη, ενδέχεται να δημιουργήσουν περιττούς φραγμούς στο εμπόριο και στρεβλώσεις του ανταγωνισμού εντός της εσωτερικής αγοράς.(5) Οι εθνικοί νόμοι και διατάξεις που καθορίζουν οριακές τιμές για την περιεκτικότητα σε ΠΟΕ των προϊόντων που εμπίπτουν στο πεδίο εφαρμογής της παρούσας οδηγίας, με στόχο την καταπολέμηση του στρατοσφαιρικού όζοντος, θα πρέπει συνεπώς να εναρμονιστούν, ώστε να διασφαλιστεί ότι δεν περιορίζουν την ελεύθερη κυκλοφορία των προϊόντων αυτών.(6) Δεδομένου ότι ο στόχος της προτεινόμενης δράσης, ήτοι η μείωση των εκπομπών ΠΟΕ, δεν μπορεί να επιτευχθεί ικανοποιητικά από τα κράτη μέλη διότι οι εκπομπές ΠΟΕ σε κράτος μέλος επηρεάζουν την ποιότητα του αέρα σε άλλα κράτη μέλη, και οι μειώσεις των εκπομπών ΠΟΕ μπορούν, επομένως, να επιτευχθούν καλύτερα σε κοινοτικό επίπεδο λόγω της κλίμακας και των αποτελεσμάτων της δράσης, η Κοινότητα δύναται να θεσπίσει μέτρα, σύμφωνα με την αρχή της επικουρικότητας του άρθρου 5 της Συνθήκης. Σύμφωνα με την αρχή της αναλογικότητας του ίδιου άρθρου, η παρούσα οδηγία δεν υπερβαίνει τα αναγκαία προς επίτευξη των στόχων αυτών.(7) Η περιεκτικότητα σε ΠΟΕ των χρωμάτων διακόσμησης, των βερνικιών και των προϊόντων φανοποιίας αυτοκινήτων έχει ως συνέπεια να εκπέμπονται σημαντικές ποσότητες ΠΟΕ στον ατμοσφαιρικό αέρα, γεγονός που συντελεί στον τοπικό και διασυνοριακό σχηματισμό φωτοχημικών οξειδωτικών παραγόντων στην οριακή στοιβάδα της τροπόσφαιρας.(8) Η περιεκτικότητα σε ΠΟΕ ορισμένων χρωμάτων διακόσμησης και βερνικιών και προϊόντων φανοποιίας αυτοκινήτων θα πρέπει συνεπώς να περιοριστεί καθόσον είναι εφικτό από τεχνική και οικονομική άποψη, λαμβανομένων υπόψη των κλιματικών συνθηκών.(9) Για να επιτευχθεί υψηλό επίπεδο προστασίας του περιβάλλοντος, απαιτείται να καθοριστούν και να εφαρμοστούν οριακές τιμές περιεκτικότητας για ΠΟΕ που χρησιμοποιούνται σε προϊόντα που εμπίπτουν στο πεδίο εφαρμογής της παρούσας οδηγίας.(10) Θα πρέπει να προβλεφθούν μεταβατικά μέτρα για τα προϊόντα που έχουν παραχθεί πριν την έναρξη ισχύος των απαιτήσεων της παρούσας οδηγίας.(11) Τα κράτη μέλη θα πρέπει να μπορούν να χορηγούν μεμονωμένες άδειες για την πώληση και αγορά, για ειδικούς σκοπούς, αυστηρώς περιορισμένων ποσοτήτων προϊόντων που δεν τηρούν τις οριακές τιμές διαλυτών που καθορίζει η παρούσα οδηγία.(12) Η παρούσα οδηγία συμπληρώνει τις κοινοτικές διατάξεις για την επισήμανση των χημικών ουσιών και παρασκευασμάτων.(13) Η προστασία της υγείας καταναλωτών και/ή εργαζομένων καθώς και η προστασία του περιβάλλοντος εργασίας τους δεν θα πρέπει να εμπίπτουν στο πεδίο εφαρμογής της παρούσας οδηγίας και τα μέτρα που λαμβάνονται από τα κράτη μέλη για το σκοπό αυτό δεν θα πρέπει, συνεπώς, να επηρεάζονται από την παρούσα οδηγία.(14) Οι οριακές τιμές περιεκτικότητας πρέπει να παρακολουθούνται για να προσδιορίζεται εάν οι συγκεντρώσεις μάζας των ΠΟΕ που διαπιστώνονται σε κάθε κατηγορία χρωμάτων διακόσμησης, βερνικιών και προϊόντων φανοποιίας αυτοκινήτων που εμπίπτει στο πεδίο εφαρμογής της παρούσας οδηγίας τηρούν τα επιτρεπόμενα όρια.(15) Δεδομένου ότι η περιεκτικότητα σε ΠΟΕ προϊόντων που χρησιμοποιούνται σε ορισμένες δραστηριότητες φανοποιίας αυτοκινήτων ρυθμίζεται πλέον βάσει της παρούσας οδηγίας, η οδηγία 1999/13/ΕΚ του Συμβουλίου, της 11ης Μαρτίου 1999, για τον περιορισμό των εκπομπών πτητικών οργανικών ενώσεων που οφείλονται στη χρήση οργανικών διαλυτών σε ορισμένες δραστηριότητες και εγκαταστάσεις(4) θα πρέπει να τροποποιηθεί αναλόγως.(16) Τα κράτη μέλη θα πρέπει, ωστόσο, να μπορούν να διατηρήσουν ή να θεσπίσουν εθνικά μέτρα για τον έλεγχο των εκπομπών από εργασίες φανοποιίας αυτοκινήτων κατά τις οποίες πραγματοποιείται επίστρωση οδικών οχημάτων, όπως ορίζεται με την οδηγία 70/156/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 6ης Φεβρουαρίου 1970, περί προσεγγίσεως των νομοθεσιών των κρατών μελών που αφορούν στην έγκριση των οχημάτων με κινητήρα και των ρυμουλκουμένων τους(5), ή τμήματος αυτών που πραγματοποιείται ως μέρος της επισκευής του οχήματος, της συντήρησής του ή της διακόσμησής του εκτός των εγκαταστάσεων παραγωγής.(17) Η παρούσα οδηγία δεν θα πρέπει να εφαρμόζεται σε προϊόντα που πωλούνται για αποκλειστική χρήση σε εγκαταστάσεις εγκεκριμένες σύμφωνα με την οδηγία 1999/13/ΕΚ, στις οποίες τα μέτρα περιορισμού των εκπομπών παρέχουν εναλλακτικά μέσα για την επίτευξη τουλάχιστον ισοδύναμων μειώσεων των εκπομπών ΠΟΕ.(18) Τα κράτη μέλη θα πρέπει να θεσπίσουν κανόνες για τις κυρώσεις που εφαρμόζονται σε περίπτωση παράβασης των διατάξεων της παρούσας οδηγίας και να εξασφαλίσουν την επιβολή τους. Οι εν λόγω κυρώσεις θα πρέπει να είναι αποτελεσματικές, αναλογικές και αποτρεπτικές.(19) Τα κράτη μέλη θα πρέπει να υποβάλλουν στην Επιτροπή έκθεση σχετικά με την πείρα που αποκτούν από την εφαρμογή της παρούσας οδηγίας.(20) Θα πρέπει να επανεξετάζεται η σκοπιμότητα μείωσης της περιεκτικότητας σε ΠΟΕ προϊόντων που δεν εμπίπτουν στο πεδίο εφαρμογής της παρούσας οδηγίας και η δυνατότητα περαιτέρω μείωσης των ήδη προβλεπόμενων οριακών τιμών ΠΟΕ.(21) Τα μέτρα για την εφαρμογή της παρούσας οδηγίας θα πρέπει να εκδοθούν σύμφωνα με την απόφαση 1999/468/ΕΚ του Συμβουλίου, της 28ης Ιουνίου 1999, για τον καθορισμό των όρων άσκησης των εκτελεστικών εξουσιών που ανατίθενται στην Επιτροπή(6),ΕΞΕΔΩΣΑΝ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΟΔΗΓΙΑ:Άρθρο 1Σκοπός και πεδίο εφαρμογής1. Η παρούσα οδηγία αποσκοπεί στον περιορισμό της συνολικής περιεκτικότητας πτητικών οργανικών ενώσεων (ΠΟΕ) σε ορισμένα χρώματα και βερνίκια και σε προϊόντα φανοποιίας αυτοκινήτων για την πρόληψη ή τον περιορισμό της ρύπανσης του αέρα που οφείλονται στη συμβολή των ΠΟΕ στο σχηματισμό τροποσφαιρικού όζοντος.2. Για την επίτευξη του στόχου της παραγράφου 1, η παρούσα οδηγία επιφέρει την προσέγγιση των τεχνικών προδιαγραφών για ορισμένα χρώματα και βερνίκια και τα προϊόντα φανοποιίας αυτοκινήτων.3. Η παρούσα οδηγία εφαρμόζεται στα προϊόντα του παραρτήματος I.4. Η παρούσα οδηγία δεν θίγει ούτε επηρεάζει τα μέτρα, περιλαμβανομένων των απαιτήσεων επισήμανσης, που λαμβάνονται σε κοινοτικό ή εθνικό επίπεδο για την προστασία της υγείας των καταναλωτών και των εργαζομένων και του περιβάλλοντος της εργασίας τους.Άρθρο 2ΟρισμοίΓια τους σκοπούς της παρούσας οδηγίας, εφαρμόζονται οι ακόλουθοι ορισμοί:1. "αρμόδια αρχή":: η αρχή (ή αρχές) ή οι οργανισμοί που, βάσει των νομοθετικών διατάξεων των κρατών μελών, φέρουν την ευθύνη για την εκπλήρωση των υποχρεώσεων που απορρέουν από την παρούσα οδηγία,2. "ουσίες":: τα χημικά στοιχεία και οι ενώσεις τους, στη φυσική τους κατάσταση ή ως βιομηχανικά προϊόντα, σε στερεά, υγρή ή αέρια μορφή,3. "παρασκεύασμα":: μίγμα ή διάλυμα που αποτελείται από τουλάχιστον δύο ουσίες,4. "οργανική ένωση":: κάθε ένωση που περιέχει τουλάχιστον άνθρακα και μία ή περισσότερες από τις εξής ουσίες: υδρογόνο, οξυγόνο, θείο, φώσφορος, πυρίτιο, άζωτο, ή αλογόνα, εκτός από τα οξείδια του άνθρακα και τα ανόργανα ανθρακικά και διττανθρακικά,5. "πτητική οργανική ένωση":: κάθε οργανική ένωση της οποίας το αρχικό σημείο βρασμού, μετρούμενο σε σταθερή πίεση 101,3 kPa, είναι μικρότερο ή ίσο των 250 °C,6. "περιεκτικότητα σε ΠΟΕ":: η μάζα των ΠΟΕ, εκφρασμένη σε γραμμάρια ανά λίτρο(g/l), στη σύνθεση του προϊόντος έτοιμου για χρήση. Η μάζα των ΠΟΕ σε δεδομένο προϊόν οι οποίες αντιδρούν χημικά ενώ στεγνώνουν για να αποτελέσουν μέρος του επιχρίσματος δεν θεωρούνται ως τμήμα της περιεκτικότητας σε ΠΟΕ,7. "οργανικός διαλύτης":: κάθε ΠΟΕ που χρησιμοποιείται, μόνη ή σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες, για τη διάλυση ή την αραίωση πρώτων υλών, προϊόντων ή απορριμμάτων ή ως μέσο καθαρισμού για τη διάλυση ξένων προσμίξεων ή ως μέσο διασποράς ή ως ρυθμιστής του ιξώδους ή της επιφανειακής τάσης ή ως πλαστικοποιητής ή ως συντηρητικό,8. "επίχρισμα":: κάθε παρασκεύασμα, συμπεριλαμβανομένων όλων των οργανικών διαλυτών ή παρασκευασμάτων που περιέχουν οργανικούς διαλύτες που είναι αναγκαίοι για την ορθή εφαρμογή του, το οποίο χρησιμοποιείται για τον σχηματισμό υμενίου με διακοσμητικό, προστατευτικό ή άλλο λειτουργικό αποτέλεσμα σε μία επιφάνεια,9. "υμένιο":: συνεχές στρώμα που προκύπτει από την εφαρμογή ενός ή περισσοτέρων στρώσεων σε επιφάνεια προς βαφή,10. "επιχρίσματα σε υδατική φάση (Υ)":: επιχρίσματα των οποίων το ιξώδες προσαρμόζεται με χρήση ύδατος,11. "επιχρίσματα με διαλύτη (Δ)":: επιχρίσματα των οποίων το ιξώδες προσαρμόζεται με χρήση οργανικού διαλύτη,12. "διάθεση στην αγορά":: η διάθεση σε τρίτους, επί πληρωμή ή όχι. Για τους σκοπούς της παρούσας οδηγίας, η εισαγωγή στο τελωνειακό έδαφος της Κοινότητας θεωρείται διάθεση στην αγορά.Άρθρο 3Απαιτήσεις1. Τα κράτη μέλη μεριμνούν ώστε τα προϊόντα τα οποία περιλαμβάνονται στο παράρτημα Ι να διατίθενται στην αγορά της επικρατείας τους μετά τις ημερομηνίες που καθορίζονται στο παράρτημαII μόνον εάν έχουν περιεκτικότητα σε ΠΟΕ η οποία δεν υπερβαίνει τις προβλεπόμενες στο παράρτημαII οριακές τιμές, και πληρούν τις διατάξεις του άρθρου 4.Για να διαπιστώνεται η τήρηση των οριακών τιμών περιεκτικότητας σε ΠΟΕ που προβλέπονται στο ΠαράρτημαII χρησιμοποιούνται οι μέθοδοι ανάλυσης του ΠαραρτήματοςIII.Όσον αφορά τα προϊόντα του παραρτήματος Ι στα οποία πρέπει να προστεθούν διαλύτες ή άλλα συστατικά που περιέχουν διαλύτες, προκειμένου το προϊόν να είναι έτοιμο για χρήση, οι οριακές τιμές του παραρτήματοςII ισχύουν για τις ΠΟΕ που περιέχονται στο έτοιμο για χρήση προϊόν.2. Κατά παρέκκλιση από τις διατάξεις της παραγράφου 1, τα κράτη μέλη μπορούν να απαλλάσσουν από την υποχρέωση συμμόρφωσης προς τις ανωτέρω απαιτήσεις τα προϊόντα που πωλούνται προκειμένου να χρησιμοποιηθούν αποκλειστικώς για δραστηριότητα η οποία καλύπτεται από την οδηγία 1999/13/ΕΚ και ασκείται σε εγκατάσταση καταχωρισμένη σε μητρώο ή για την οποία έχει εκδοθεί άδεια, σύμφωνα με τα άρθρα 3 και 4 της εν λόγω οδηγίας.3. Προκειμένου να αποκατασταθούν και να συντηρηθούν κτίρια και αυτοκίνητα αντίκες που έχουν χαρακτηριστεί από τις αρμόδιες αρχές ως ιδιαίτερης ιστορικής και πολιτιστικής αξίας, τα κράτη μέλη μπορούν να χορηγούν ατομικές άδειες για την πώληση και αγορά αυστηρώς περιορισμένων ποσοτήτων προϊόντων τα οποία δεν τηρούν τις οριακές τιμές περιεκτικότητας σε πτητικές οργανικές ενώσεις που ορίζονται στο Παράρτημα II.4. Τα προϊόντα που εμπίπτουν στο πεδίο εφαρμογής της παρούσας οδηγίας τα οποία κατά τρόπο αποδεδειγμένο έχουν παραχθεί πριν από τις ημερομηνίες του ΠαραρτήματοςII και δεν πληρούν τις απαιτήσεις της παραγράφου 1 μπορούν να διατίθενται στην αγορά για διάστημα 12 μηνών μετά την ημερομηνία κατά την οποία αρχίζει να ισχύει η απαίτηση που αφορά το κάθε προϊόν.Άρθρο 4ΕπισήμανσηΤα κράτη μέλη μεριμνούν ώστε τα προϊόντα που παρατίθενται στο παράρτημα Ι να επισημαίνονται πριν διατεθούν στην αγορά. Η επισήμανση περιλαμβάνει τα εξής στοιχεία:α) την υποκατηγορία του προϊόντος και τη σχετική οριακή τιμή περιεκτικότητας σε ΠΟΕ σε g/l όπως αναφέρονται στο παράρτημαII,β) την μεγίστη περιεκτικότητα σε ΠΟΕ την οποία έχει το προϊόν έτοιμο για χρήση.Άρθρο 5Αρμόδια αρχήΤα κράτη μέλη ορίζουν αρμόδια αρχή υπεύθυνη για την εκπλήρωση των υποχρεώσεων που προβλέπονται στην οδηγία, και ενημερώνουν την Επιτροπή σχετικά το αργότερο έως την 30 Απριλίου 2005.Άρθρο 6ΠαρακολούθησηΤα κράτη μέλη προβλέπουν πρόγραμμα παρακολούθησης για να εξακριβώσουν τη συμμόρφωση προς την παρούσα οδηγία.Άρθρο 7Υποβολή εκθέσεωνΤα κράτη μέλη υποβάλλουν έκθεση σχετικά με τα αποτελέσματα του προγράμματος παρακολούθησης, για να αποδείξουν τη συμμόρφωσή τους προς την οδηγία και τις κατηγορίες και τις ποσότητες προϊόντων για τα οποία χορηγήθηκε άδεια σύμφωνα με το άρθρο 3, παράγραφος 3. Οι δύο πρώτες εκθέσεις υποβάλλονται στην Επιτροπή 18 μήνες μετά τις ημερομηνίες για τη συμμόρφωση με τις οριακές τιμές περιεκτικότητας σε πτητικές οργανικές ενώσεις που καθορίζονται στο Παράρτημα II· εν συνεχεία, οι εκθέσεις υποβάλλονται ανά πενταετία. Η Επιτροπή καταρτίζει εκ των προτέρων κοινό πρότυπο παρουσίασης των στοιχείων παρακολούθησης, με τη διαδικασία του άρθρου 12, παράγραφος 2. Ετήσια δεδομένα τίθενται στη διάθεση της Επιτροπής κατόπιν αιτήματός της.Άρθρο 8Ελεύθερη κυκλοφορίαΤα κράτη μέλη δεν μπορούν, επικαλούμενα λόγους που εκτίθενται στην παρούσα οδηγία, να απαγορεύσουν, να περιορίσουν ή να παρεμποδίσουν τη διάθεση στην αγορά προϊόντων που εμπίπτουν στο πεδίο εφαρμογής της παρούσας οδηγίας και τα οποία, όταν είναι έτοιμα προς χρήση, ανταποκρίνονται στις απαιτήσεις της παρούσας οδηγίας.Άρθρο 9ΕπανεξέτασηΗ Επιτροπή καλείται να υποβάλει στο Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο και στο Συμβούλιο:1. έως το 2008 το αργότερο, έκθεση βασισμένη στα αποτελέσματα της επανεξέτασης που αναφέρεται στο άρθρο 10 της οδηγίας 2001/81/ΕΚ. Στην έκθεση θα εξετάζονται:α) οι ευρείες προοπτικές και οι δυνατότητες περιορισμού της περιεκτικότητας σε ΠΟΕ προϊόντων εκτός του πεδίου εφαρμογής της παρούσας οδηγίας συμπεριλαμβανομένων των αεροζόλ για χρώματα και βερνίκια,β) την ενδεχόμενη καθιέρωση περαιτέρω (φάση II) περιορισμού της περιεκτικότητας σε ΠΟΕ προϊόντων φανοποιίας αυτοκινήτων,γ) οποιοδήποτε νέο στοιχείο σχετιζόμενο με τις κοινωνικές και οικονομικές επιπτώσεις της εφαρμογής της φάσηςII κατά τα προβλεπόμενα για τα χρώματα και τα βερνίκια.2. το αργότερο 30 μήνες μετά την ημερομηνία εφαρμογής των οριακών τιμών περιεκτικότητας για τις πτητικές οργανικές ενώσεις που περιέχονται στο Παράρτημα II φάση II, έκθεση όπου συγκεκριμένα λαμβάνονται υπόψη οι εκθέσεις που προβλέπονται στο άρθρο 7 καθώς και ενδεχόμενες τεχνολογικές εξελίξεις στον τομέα της παρασκευής των χρωμάτων, βερνικιών και προϊόντων φανοποιίας αυτοκινήτων. Στην έκθεση θα εξετάζονται οι ευρείες προοπτικές και οι δυνατότητες περιορισμού της περιεκτικότητας σε πτητικές οργανικές ενώσεις προϊόντων εκτός του πεδίου εφαρμογής της παρούσας οδηγίας συμπεριλαμβανομένης της ενδεχόμενης διάκρισης μεταξύ χρωμάτων για εσωτερική και για εξωτερική χρήση στις υποκατηγορίες δ) και ε) των παραρτημάτων Ι, σημείο 1, παράγραφος 1, και II, τμήμα Α.Οι εν λόγω εκθέσεις συνοδεύονται, εφόσον απαιτείται, από προτάσεις τροποποίησης της παρούσας οδηγίας.Άρθρο 10ΚυρώσειςΤα κράτη μέλη καθορίζουν τις κυρώσεις που επιβάλλονται σε περίπτωση παράβασης των εθνικών διατάξεων που θεσπίζονται κατ' εφαρμογή της παρούσας οδηγίας και λαμβάνουν όλα τα αναγκαία μέτρα για να εξασφαλίσουν την εφαρμογή τους. Οι προβλεπόμενες κυρώσεις πρέπει να είναι αποτελεσματικές, αναλογικές και αποτρεπτικές. Τα κράτη μέλη κοινοποιούν τις σχετικές διατάξεις στην Επιτροπή το αργότερο την 30 Οκτωβρίου 2005 και την ενημερώνουν αμελλητί για κάθε μεταγενέστερη τροποποίησή τους.Άρθρο 11Προσαρμογή στην τεχνική πρόοδοΌλες οι αναγκαίες τροποποιήσεις για την προσαρμογή του Παραρτήματος IIΙ στην τεχνική πρόοδο εγκρίνονται από την Επιτροπή σύμφωνα με τη διαδικασία της παραγράφου 2 του άρθρου 12.Άρθρο 12Επιτροπή1. Η Επιτροπή των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων επικουρείται από την επιτροπή η οποία έχει συσταθεί με βάση το άρθρο 13 της οδηγίας 1999/13/ΕΚ του Συμβουλίου, εφεξής καλούμενη "επιτροπή".2. Στις περιπτώσεις όπου γίνεται αναφορά στην παρούσα παράγραφο, εφαρμόζονται τα άρθρα 5 και 7 της απόφασης 1999/468/ΕΚ, λαμβανομένων υπόψη των διατάξεων του άρθρου 8.Η προβλεπόμενη στο άρθρο 5, παράγραφος 6, της απόφασης 1999/468/ΕΚ προθεσμία είναι τρίμηνη.3. Η επιτροπή θεσπίζει τον εσωτερικό της κανονισμό.Άρθρο 13Τροποποίηση της οδηγίας 1999/13/ΕΚ1. Η οδηγία 1999/13/ΕΚ τροποποιείται ως εξής:Στο παράρτημα Ι στον τίτλο "φινίρισμα οχημάτων" (φανοποιία αυτοκινήτων), η ακόλουθη περίπτωση διαγράφεται:"- την επίστρωση οδικών οχημάτων όπως ορίζονται στην οδηγία 70/156/ΕΟΚ ή μέρους αυτών, που πραγματοποιείται ως μέρος της επισκευής του οχήματος, της συντήρησής του ή της διακόσμησής του εκτός των εγκαταστάσεων παραγωγής, ή".2. Ανεξαρτήτως της παραγράφου 1, τα κράτη μέλη δύνανται να διατηρούν ή να θεσπίζουν εθνικά μέτρα για τον έλεγχο των εκπομπών από δραστηριότητες (φανοποιίας αυτοκινήτων) που διαγράφονται από το πεδίο εφαρμογής της οδηγίας 1999/13/ΕΚ.Άρθρο 14Μεταφορά στο εσωτερικό δίκαιο1. Τα κράτη μέλη θέτουν σε ισχύ τις νομοθετικές, κανονιστικές και διοικητικές διατάξεις που είναι αναγκαίες για τη συμμόρφωση προς την παρούσα οδηγία το αργότερο·έως την 30 Οκτωβρίου 2005 ενημερώνουν αμέσως την Επιτροπή σχετικά.Όταν τα κράτη μέλη θεσπίζουν τις ανωτέρω διατάξεις, αυτές περιέχουν αναφορά στην παρούσα οδηγία ή συνοδεύονται από παρόμοια αναφορά κατά την επίσημη δημοσίευσή τους. Ο τρόπος της αναφοράς αποφασίζεται από τα κράτη μέλη.2. Τα κράτη μέλη διαβιβάζουν στην Επιτροπή το κείμενο των διατάξεων εσωτερικού δικαίου που θεσπίζουν στο πεδίο που διέπεται από την παρούσα οδηγία καθώς και πίνακα στον οποίον εμφαίνεται η αντιστοιχία μεταξύ των διατάξεων της παρούσας οδηγίας και των εθνικών διατάξεων οι οποίες έχουν θεσπιστεί.Άρθρο 15Έναρξη ισχύοςΗ παρούσα οδηγία αρχίζει να ισχύει την ημέρα της δημοσίευσής της στην Επίσημη Εφημερίδα της Ευρωπαϊκής Ένωσης.Άρθρο 16ΑποδέκτεςΗ παρούσα οδηγία απευθύνεται στα κράτη μέλη.Στρασβούργο, 21 Απριλίου 2004.Για το Ευρωπαϊκό ΚοινοβούλιοΟ ΠρόεδροςP. CoxΓια το ΣυμβούλιοΟ ΠρόεδροςD. Roche(1) ΕΕ C 220 της 16.9.2003, σ. 43.(2) Γνώμη του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου της 25ης Σεπτεμβρίου 2003 (δεν έχει ακόμη δημοσιευθεί στην Επίσημη Εφημερίδα), κοινή θέση του Συμβουλίου της 7ης Ιανουαρίου 2004 (ΕΕ C 79 Ε, 30.3.2004, σ. 1) και θέση του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου της 30ής Μαρτίου 2004 (δεν έχει ακόμη δημοσιευθεί στην Επίσημη Εφημερίδα).(3) ΕΕ L 309 της 27.11.2001, σ. 22.(4) ΕΕ L 85, 29.3.1999, σ. 1. Οδηγία όπως τροποποιήθηκε με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθ. 1882/2003 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου (ΕΕ L 284,31.10.2003, σ. 1).(5) ΕΕ L 42, 23.2.1970, σ. 1. Οδηγία όπως τροποποιήθηκε τελευταία με την οδηγία 2004/3/ΕΚ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου (ΕΕ L 49, 19.2.2004, σ. 36).(6) ΕΕ L 184 της 17.7.1999, σ. 23.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ1. Για τους σκοπούς της παρούσας οδηγίας νοούνται ως χρώματα διακόσμησης και βερνίκια προϊόντα που περιλαμβάνονται στις υποκατηγορίες που ακολουθούν, πλην των αεροζόλ. Πρόκειται για επιχρίσματα που εφαρμόζονται για διακοσμητικούς σκοπούς, για λειτουργικούς σκοπούς και για σκοπούς προστασίας σε κτίρια, στα τελειώματα και τις επενδύσεις τους και στις συναφείς κατασκευές.1.1. Υποκατηγορίες:α) "Ματ επιχρίσματα εσωτερικής χρήσης για τοίχους και οροφές": επιχρίσματα για εφαρμογή σε εσωτερικούς τοίχους και οροφές με στιλπνότητα <= 25@60°.β) "Στιλπνά επιχρίσματα εσωτερικής χρήσης για τοίχους και οροφές": επιχρίσματα για εφαρμογή σε εσωτερικούς τοίχους και οροφές με στιλπνότητα  > 25@60°.γ) "Επιχρίσματα για εξωτερικούς τοίχους ορυκτού υποστρώματος": επιχρίσματα για εφαρμογή σε εξωτερικούς τοίχους από λιθοδομή, πλινθοδομή ή γυψομαρμαροκονίαμα.δ) "Χρώματα εσωτερικής/εξωτερικής χρήσης για τελειώματα και επενδύσεις από ξύλο, μέταλλο ή πλαστικό": επιχρίσματα για εφαρμογή σε τελειώματα και επενδύσεις τα οποία σχηματίζουν αδιαφανές υμένιο. Αυτά τα επιχρίσματα εφαρμόζονται σε επιφάνειες προς βαφή από ξύλο, μέταλλο ή πλαστικό. Η παρούσα υποκατηγορία περιλαμβάνει τα υποστρώματα και τα ενδιάμεσα επιχρίσματα.ε) "Εσωτερικής/εξωτερικής χρήσης βερνίκια και προϊόντα χρώσης ξύλου για τελειώματα": επιχρίσματα για εφαρμογή στα τελειώματα τα οποία σχηματίζουν διαφανές ή ημιδιαφανές υμένιο για διακόσμηση και προστασία ξύλου, μετάλλου και πλαστικού. Στην υποκατηγορία αυτή περιλαμβάνονται τα αδιαφανή προϊόντα χρώσης ξύλου. Αδιαφανή προϊόντα βαφής ξύλου είναι τα επιχρίσματα που δημιουργούν αδιαφανές υμένιο για τη διακόσμηση και προστασία του ξύλου κατά της διαβρώσεως, όπως ορίζεται στο πρότυπο EN 927-1 στην κατηγορία των ημισταθερών προϊόντων.στ) "Εσωτερικής/εξωτερικής χρήσης προϊόντα χρώσης ξύλου χωρίς σχηματισμό υμενίου": προϊόντα χρώσης τα οποία, σύμφωνα με το πρότυπο EN 927-1:1996, σχηματίζουν υμένιο μέσου πάχους κατώτερου των 5µm, καθοριζόμενο σύμφωνα με τη μέθοδο 5Α του προτύπου ISO 2808: 1997.ζ) "Αστάρια": επιχρίσματα με στεγανοποιητικές ή/και σφραγιστικές ιδιότητες για χρήση σε ξύλο ή τοίχους και οροφές.η) "Συνδετικά αστάρια": επιχρίσματα προοριζόμενα να σταθεροποιήσουν χαλαρά σωματίδια του προς βαφή υποστρώματος ή να προσδώσουν υδρόφοβες ιδιότητες ή/και να προστατεύσουν το ξύλο από την κυάνωση.θ) "Ειδικά επιχρίσματα ενός συστατικού": ειδικά επιχρίσματα βασιζόμενα σε υμενογενές υλικό. Προορίζονται για εφαρμογές ειδικού τύπου, όπως για αστάρωμα ή τελική στρώση πλαστικού, αστάρωμα σιδηρούχων υποστρωμάτων, αστάρωμα ευπρόσβλητων μετάλλων όπως ο ψευδάργυρος και το αλουμίνιο, αντιδιαβρωτικό φινίρισμα, επίχριση δαπέδων, περιλαμβανομένων των ξύλινων και τσιμεντένιων δαπέδων, προστασία κατά της αναγραφής συνθημάτων (tag), επιβράδυνση φλόγας, και για συμμόρφωση προς τα πρότυπα υγιεινής στη βιομηχανία τροφίμων ή ποτών ή στον τομέα των υπηρεσιών υγείας.ι) "Ειδικά επιχρίσματα δύο συστατικών": επιχρίσματα για τις ίδιες χρήσεις με τα ειδικά επιχρίσματα ενός συστατικού τα οποία όμως περιλαμβάνουν ένα δεύτερο συστατικό (π.χ. τριτοταγείς αμίνες) το οποίο προστίθεται πριν από την επίστρωση.ια) "Πολύχρωμα επιχρίσματα": επιχρίσματα τα οποία δίνουν αποτέλεσμα δύο ή πολλών χρωμάτων, απευθείας από την πρώτη επίστρωση.ιβ) "Επιχρίσματα διακοσμητικού αποτελέσματος": επιχρίσματα τα οποία δίνουν ειδικό αισθητικό αποτέλεσμα όταν εφαρμόζονται σε προς βαφή επιφάνειες οι οποίες έχουν υποστεί ειδική προετοιμασία και προβαφή ή σε μια αρχική στρώση και στη συνέχεια υφίστανται ειδική επεξεργασία με διάφορα εργαλεία κατά τη φάση ξήρανσης.2. Για τους σκοπούς της παρούσας οδηγίας, ως "προϊόντα φανοποιίας αυτοκινήτων" νοούνται τα προϊόντα που περιέχονται στις παρακάτω υποκατηγορίες, τα οποία χρησιμοποιούνται για επίχριση οδικών οχημάτων όπως αυτά ορίζονται στην οδηγία 70/156/ΕΟΚ, ή μέρους αυτών, η οποία πραγματοποιείται είτε ως μέρος της επισκευής, διατήρησης ή διακόσμησης του οχήματος είτε για την επίχριση του οχήματος εκτός των εγκαταστάσεων κατασκευής του.2.1. Υποκατηγορίες:α) "Προετοιμασία και καθαρισμός": προϊόντα χρησιμοποιούμενα για την απομάκρυνση παλαιών επιχρισμάτων και σκωρίας, με μηχανικό ή χημικό τρόπο, ή για να καταστεί δυνατή η πρόσφυση νέων επιχρισμάτων.i) "Προϊόντα προετοιμασίας": περιλαμβάνουν καθαριστικό για πιστόλι (προϊόν για καθαρισμό πιστολιού ψεκασμού βαφής και άλλου εξοπλισμού), προϊόντα αφαίρεσης παλαιών χρωματισμών (διαβρωτικά), προϊόντα απολίπανσης (συμπεριλαμβανομένου του αντιστατικού τύπου για πλαστικό) και προϊόντα αφαίρεσης σιλικόνης.ii) "Προκαθαριστικά": προϊόντα καθαρισμού για την αφαίρεση των ρύπων από την προς βαφή επιφάνεια, κατά την προετοιμασία και πριν από την στρώση των επιχρισμάτων.β) "Μαστίχες πλήρωσης πόρων και πλήρωσης πόρων αμαξώματος/προϊόντα στεγανοποίησης": ουσίες πυκνής υφής προοριζόμενες για ψεκασμό ή για εφαρμογή με σπάτουλα για την κάλυψη των βαθιών ατελειών της επιφανείας, πριν από την στρώση του συστήματος βαφής.γ) "Αστάρια": κάθε επίχρισμα για στρώση σε γυμνό μέταλλο ή σε υφιστάμενα φινιρίσματα με σκοπό την παροχή προστασίας κατά της διαβρώσεως πριν από την στρώση ενός ασταριού επιφανείας.i) "Αστάρια επιφανείας": επιχρίσματα για στρώση πριν από την τελική στρώση, με σκοπό την αντίσταση στη διάβρωση, την αύξηση της πρόσφυσης της τελικής στρώσης και το σχηματισμό ομοιόμορφης επιφανείας, με πλήρωση των μικρών ατελειών της επιφάνειας.ii) "Αστάρια μετάλλου γενικής χρήσης": επιχρίσματα για αστάρωμα, όπως υποβοηθητικά πρόσφυσης, προϊόντα στεγανοποίησης, βελτιωτικά επιφανείας, υποστρώματα, αστάρια για πλαστικό, υγρός στόκος για εφαρμογή σε υγρές επιφάνειες, στόκοι που δεν απαιτούν λείανση και στόκοι ψεκασμού.iii) "Αστάρια αντίδρασης": επιχρίσματα που περιέχουν τουλάχιστον 0,5 % κατά βάρος φωσφορικού οξέος προοριζόμενα να εφαρμοστούν απευθείας σε επιφάνειες γυμνού μετάλλου για να προσδώσουν αντισκωριακές ιδιότητες και πρόσφυση· επιχρίσματα χρησιμοποιούμενα ως αστάρια επιδεχόμενα ηλεκτροσυγκόλληση·και διαβρωτικά διαλύματα για επιφάνειες από γαλβανισμένο μέταλλο και ψευδάργυρο.δ) "Επικαλυπτικά": επιχρίσματα με χρώση τα οποία εφαρμόζονται σε μία ή πολλές στρώσεις για να προσδώσουν στιλπνότητα και αντοχή. Περιλαμβάνουν όλα τα σχετικά προϊόντα όπως επιχρίσματα βάσης και άχρωμα επιχρίσματα:i) "Επιχρίσματα βάσης": επιχρίσματα με χρώση τα οποία δίνουν χρώμα ή άλλο επιθυμητό οπτικό αποτέλεσμα αλλά όχι στιλπνότητα ή επιφανειακή αντοχή του συστήματος επίχρισης.ii) "Άχρωμα επιχρίσματα": διαφανή επιχρίσματα τα οποία δίνουν την τελική στιλπνότητα και αντοχή του συστήματος επίχρισης.ε) "Ειδικά προϊόντα φινιρίσματος": επιχρίσματα για τελικές στρώσεις τα οποία προσδίδουν ειδικές ιδιότητες, όπως μεταλλική ή περλέ όψη, σε μονή στρώση, επιχρίσματα υψηλών επιδόσεων ενιαίας χρώσης ή άχρωμα (όπως μη χαρασσόμενα και φθοριωμένα βερνίκια), ανακλώντα επιχρίσματα βάσης, τελική στρώση ειδικής υφής (π.χ. σφυρηλατημένο), αντιολισθητικά, στεγανοποιητικά για το κάτω μέρος του αμαξώματος, επιχρίσματα ανθεκτικά στα χτυπήματα, για εσωτερικό φινίρισμα· και αεροζόλ.ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IIIΜΕΘΟΔΟΙ ΠΟΥ ΑΝΑΦΕΡΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΑΡΘΡΟ 3.1>ΘΕΣΗ ΠΙΝΑΚΑ>