Avis juridique important

|

31984L0449

Kommissionens direktiv 84/449/EØF af 25. april 1984 om sjette tilpasning til den tekniske udvikling af Rådets direktiv 67/548/EØF om tilnærmelse af lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer

EF-Tidende nr. L 251 af 19/09/1984 s. 0001 - 0223 den finske specialudgave: kapitel 15 bind 5 s. 0003  den spanske specialudgave: Kapitel 13 bind 17 s. 0003  den svenske specialudgave: kapitel 15 bind 5 s. 0003  den portugisiske specialudgave: Kapitel 13 bind 17 s. 0003

++++  KOMMISSIONENS DIREKTIV  af 25 . april 1984  om sjette tilpasning til den tekniske udvikling af Raadets direktiv 67/548/EOEF om tilnaermelse af lovgivning om klassificering , emballering og etikettering af farlig stoffer   ( 84/449/EOEF )  KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -  under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab ,  under henvisning til Raadets direktiv 67/548/EOEF af 27 . juni 1967 om tilnaermelse af lovgivning om klassificering , emballering og etikettering af farlige stoffer ( 1 ) , aendret for sjette gang ved Raadets direktiv 79/831/EOEF ( 2 ) , navnlig artikel 19 , 20 og 21 , og  ud fra foelgende betragtninger :  I artikel 3 , stk . 1 , i Raadets direktiv 79/831/EOEF er det fastsat , at bestemmelsen af stoffernes og praeparaternes fysisk-kemiske egenskaber , deres toksicitet og deres oekotoksicitet foretages efter de metoder , der er fastlagt i bilag V ;  i artikel 19 i direktiv 79/831/EOEF af 18 . september 1979 er det fastsat , at bilag V omfattes af fremgangsmaaden for udvalget for tilpasning til den tekniske udvikling , og der boer navnlig tages hensyn til metoder , som internationale organisationer har anerkendt og eventuelt rettet henstillinger om ;  bestemmelserne i dette direktiv er i overensstemmelse med udtalelse fra Udvalget for tilpasning til den tekniske udvikling af direktiverne om fjernelse af tekniske hindringer for samhandelen med farlige Stoffer og Praeparater -  UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV :  Artikel 1  Teksten i bilag V til direktiv 67/548/EOEF erstattes af teksten , der er anfoert i bilaget til dette direktiv .  Artikel 2  Medlemsstaterne vedtager og offentliggoer inden den 1 . juli 1985 de bestemmelser , der er noedvendige for at efterkomme dette direktiv , og underretter straks Kommissionen herom . De anvender disse bestemmelser senest fra den 1 . juli 1986 .  Artikel 3  Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne .  Udfaerdiget i Bruxelles , den 25 . april 1984 .  Paa Kommissionens vegne  Karl-Heinz NARJES  Medlem af Kommissionen  ( 1 ) EFT nr . L 196 af 16 . 8 . 1967 , s . 1 .  ( 2 ) EFT nr . L 259 af 15 . 10 . 1979 , s . 10 .  BILAG  I bilaget anfoeres undersoegelsesmetoder til bestemmelse af fysisk-kemiske , toksikologiske og oekotoksikologiske egenskaber , der er opregnet i bilag VII og i bilag VIII til direktiv 79/831/EOEF .  Metoderne er baseret paa saadanne , der er anerkendt og anbefalet af kompetente internationale organisationer  ( navnlig OECD ) .  Hvor der ikke har foreligget saadanne metoder , er der valgt nationale standardmetoder eller videnskabeligt anerkendte metoder . I almindelighed skal undersoegelserne foretages med stoffet , som det markedsfoeres . Man boer vaere opmaerksom paa , at urenheder kan paavirke undersoegelsesresultaterne .  Hvis metoderne i bilaget til direktiv 79/831/EOEF ikke er anvendelige til undersoegelse af en given egenskab , skal anmelderen eftervise berettigelsen af , at en alternativ metode er anvendt .  Dyreforsoeg og -undersoegelser skal udfoeres i overensstemmelse med de nationale bestemmelser og boer tage hensyn til humane principper og den internationale udvikling i spoergsmaalet om dyrenes velbefindende .  Hvor undersoegelsesmetoder er ligevaerdige , boer kun de metoder anvendes , som bruger det mindste antal forsoegsdyr .  INDHOLD  AFSNIT A : Metoder til bestemmelse af fysisk-kemiske egenskaber * 4 *  A . 1 . Smeltepunkt/smeltepunktsinterval * 4 *  A . 2 . Kogepunkt/kogepunktsinterval * 13 *  A . 3 . Relativ massefylde * 20 *  A . 4 . Damptryk * 25 *  A . 5 . Overfladespaending * 37 *  A . 6 . Vandoploeselighed * 44 *  A . 7 . Fedtoploeselighed * 53 *  A . 8 . Fordelingskoefficient * 57 *  A . 9 . Flammepunkt * 61 *  A . 10 . Antaendelighed ( faste stoffer ) * 63 *  A . 11 . Antaendelighed ( gasser ) * 66 *  A . 12 . Antaendelighed ( stoffer og praeparater , der i kontakt med vand eller fugtig luft udvikler let antaendelige gasser i farlige maengder ) * 68 *  A . 13 . Antaendelighed ( faste stoffer og vaesker ) * 72 *  A . 14 . Eksplosive egenskaber * 74 *  A . 15 . Selvantaendelighed ( bestemmelse af selvantaendelsestemperaturen for flygtige vaesker og for gasser ) * 84 *  A . 16 . Selvantaendelighed ( faste stoffer - bestemmelse af relativ selvantaendelsestemperatur ) * 86 *  A . 17 . Oxiderende egenskaber * 89 *  AFSNIT B : Metoder til bestemmelse af toksicitet * 94 *  Generel indledning  B . 1 . Akut toksicitet , oral indgift * 96 *  B . 2 . Akut toksicitet , inhalation * 99 *  B . 3 . Akut toksicitet , optagelse gennem huden * 103 *  B . 4 . Akut toksicitet , hudirritation * 106 *  B . 5 . Akut toksicitet , oejenirritation * 109 *  B . 6 . Akut toksicitet , hudsensibilisering * 113 *  B . 7 . Subakut toksicitet , oral indgift * 118 *  B . 8 . Subakut toksicitet , inhalation * 122 *  B . 9 . Subakut toksicitet , optagelse gennem huden * 127 *  B . 10 . Andre virkninger , mutagenicitet - in vitro  ( cytogenisk test , pattedyrceller ) * 131 *  B . 11 . Andre virkninger , mutagenicitet - in vitro - cytogenisk test ( knoglemarv fra pattedyr , kromosomanalyse ) * 134 *  B . 12 . Andre virkninger , mutagenicitet  ( mikronucleustest ) * 137 *  B . 13 . Andre virkninger , mutagenicitet - Escherischia Coli , tilbagemutationstest * 140 *  B . 14 . Andre virkninger , mutagenicitet - Salmonella Typhimurium , tilbagemutationstest * 143 *  AFSNIT C : Metedor til bestemmelse af oekotoksicitet * 146 *  C . 1 . Akut toksicitet for fisk * 146 *  C . 2 . Akut toksicitet for dafnier * 155 *  C . 3 . Nedbrydning - biologisk nedbrydning : modificeret OECD screening test * 160 *  C . 4 . Nedbrydning - biologisk nedbrydning modificeret ANFOR-test NF T 90/302 * 170 *  C . 5 . Nedbrydning - biologisk nedbrydning : modificeret Sturm-test * 179 *  C . 6 . Nedbrydning - biologisk nedbrydning : Closed bottle test ( langtids BOD-proeve ) * 188 *  C . 7 . Nedbrydning - biologisk nedbrydning : modificerede MITI-test * 199 *  C . 8 . Nedbrydning - biokemisk oxygen-behov * 212 *  C . 9 . Nedbrydning - kemisk oxygen-forbrug * 214 *  C . 10 . Nedbrydning - abiotisk nedbrydning : hydrolyse som funktion af pH * 216 *  AFSNIT A : METODER TIL BESTEMMELSE AF FYSISK-KEMISKE EGENSKABER  A.1 . SMELTEPUNKT / SMELTEPUNKTSINTERVAL  1 . METODE  De beskrevne metoder er baseret paa OECD retningslinje for undersoegelse af kemikalier ( 1 ) .  1.1 . INDLEDNING  De beskrevne metoder og apparater kan anvendes til bestemmelse af smeltepunktet for kemiske stoffer uden renhedsbegraensninger .  Valg af metode afhaenger af arten af det stof , der skal undersoeges .  Det er saaledes afgoerende , om stoffet let , vanskeligt eller slet ikke kan pulveriseres .  For nogle stoffer er bestemmelse af fryse - eller stoerkningspunkt mere hensigtsmaessigt , og standarder for disse bestemmelser er ogsaa optaget i retningslinjen .  1.2 . Definitioner og enheder  Smeltepunktet defineres som den temperatur , ved hvilken faseovergangen fra fast til flydende tilstand finder sted ved normalt atmosfaeretryk .  I det ideale tilfaelde svarer denne temperatur til temperaturen ved stoeknings - eller frysepunktet .  Da faseovergangen for mange stoffer finder sted over et stoerre temperaturinterval , beskrives den ofte som smeltepunktintervallet .  Enhedsomregning ( K til * C ) :  t = T - 273,15 hvor t er * C . og T er K .  1.3 . Referencestoffer  Det er ikke noedvendigt at anvende referencestoffer i alle tilfaelde , naar et nyt stof skal undersoeges . Referencestoffer skal foerst og fremmest anvendes til lejlighedsvist at korrigere metoden og til at muliggoere sammenligning af resultater , naar en anden metode anvendes .  Nogle referencestoffer er angivet i referencerne ( 2 ) .  1.4 . Metodeprincip  Temperaturen ( temperaturintervallet ) for faseovergangen fra fast til flydende tilstand bestemmes . I praksis bestemmes temperaturen ved begyndende smeltning og ved endelig smeltning under opvarmning af en proeve af stoffet ved atmosfaeretryk .  Tre typer metoder er beskrevet : kapillarmetoder , varmebordsmetoder og frysepunktsbestemmelser  1.4.1 . Kapillarmetoder  1.4.1.1 . Smeltepunktsapparater med vaeskebad .  En lille maengde af det findelte stof fyldes i et kapillarroer og pakkes taet . Roeret opvarmes sammen med et termometer , og temperaturforoegelsen indstilles til mindre end ca . 1 K/min under den egentlige smeltning . Temperaturen ved begyndende og endelig smeltning bestemmes .  1.4.1.2 . Metalblok  Som beskrevet under 1.4.1.1 bortset fra , at kapillarroeret og termometret er anbragt i en opvarmet metalblok og kan iagttages gennem huller i blokken .  1.4.1.3 . Bestemmelse med fotocelle .  Proeven i kapillarroeret opvarmes automatisk i en metalcylinder . En lysstraale sendes gennem stoffet via et hul i cylinderen og ind paa en noejagtigt indstillet fotocelle . De fleste stoffers optiske egenskaber aendres under smeltning fra at vaere ugennemsigtige til gennemsigtige . Lysintensiteten , som naar fotocellen , oeges herved , og der sendes et stopsignal til en digitalindikator , som viser temperaturen af et platinmodstandstermometer anbragt i varmekammeret . Denne metode kan ikke anvendes for visse staerkt farvede stoffer .  1.4.2 . Varmeborde  1.4.2.1 . Koflers varmebaenk  Koflers varmebaenk bestaar af to elektrisk opvarmede metalstykker med forskellig varmeledningsevne og er udformet saadan , at dens temperaturgradient i laengderetningen er naesten lineaer . Varmebaenken kan spaende over temperaturomraadet fra 283 K til 543 K og er forsynet med en saerlig anordning til temperaturaflaesning , som omfatter en skyder med en viser og en fane , der er saerligt udformet til den enkelte baenk . Smeltepunktet bestemmes ved , at det paagaeldende stof laegges i et tyndt lag direkte paa baenkens overflade , hvorefter der paa faa sekunder opstaar en skarp skillelinje mellem flydende og fast fase . Temperaturen paa skillelinjen aflaeses ved at indstille viseren paa denne .  1.4.2.2 . Smeltemikroskop .  Adskillige varmeborde med mikroskop er i anvendelse til smeltepunktbestemmelser paa meget smaa proevemaengder . I de fleste varmeborde maales temperaturen med en termofoeler , men undertiden anvendes ogsaa kviksoelvtermometre . Et typisk smeltepunktsapparat bestaaende af varmebord med mikroskop er udstyret med et varmekammer indeholdende en metalplade , hvorpaa proeven anbringes i en slaede . I midten af metalpladen er der et hul , hvorigennem der kan sendes lys fra mikroskopets belysningsspejl . Naar apparatet er i brug , er kammeret lukket med en glasplade for at forhindre luftens adgang til arbejdsfeltet . Opvarmningen af proeven reguleres med en rheostat . Kraeves meget noejagtige maalinger , kan der for optisk anisotrope stoffer anvendes polariseret lys .  1.4.2.3 . Meniskmetoden  Denne metode anvendes kun for polyamider .  Der bestemmes den temperatur , ved hvilken forskydningen af en silikonoliemenisk , som er indesluttet mellem et varmebord og et daekglas hvilende paa det undersoegte polyamid , iagttages visuelt .  1.4.3 . Metode til bestemmelse af frysepunkt  Proeven fyldes i en saerlig type reagensglas og anbringes i et apparat til bestemmelse af krystallisationspunktet . Proeven afkoeles under konstant , svag omroering , og temperaturen aflaeses og noteres med 30 sekunders mellemrum . Naar temperaturen er konstant ved flere aflaesninger , anfoeres denne temperatur  ( korrigeret for termometerfejl ) som krystallisationspunktet .  1.5 . Kvalitetskriterier  Anvendelighed og noejagtighed for de forskellige metoder til bestemmelse af smeltepunkt/smeltepunktsinterval er angivet i tabel 1 .  TABEL : METODERNES ANVENDELIGHED  A . Kapillarmetoder  Maalemetode * For stoffer , som kan pulveriseres * For stoffer , som ikke let pulveriseres * Temperatur omraade * Omtr . maksim . noejagt . ( 1 ) * Bemaerkninger *  Smeltepunktsapparater med vaeskebad * ja * enkelte * 273 K til 573 K * mere aller mindre 0,3 K * standard forefindes JIS K 0064 *  Smeltepunktsapparatur med metalblok * ja * enkelte * 293 K til 573 K * mere aller mindre 0,5 K * standard forefindes ISO 1218 ( E ) *  Bestemmelse med fotocelle * ja * adskillige , v.hj.a . saerligt udstyr * 253 K til 573 K * mere aller mindre 0,1 K * *  ( 1 ) Afhaengig af instrumenttype og proevens renhed .  B . Varmeborde og frysemetoder  Maalemetode * For stoffer , som kan pulveriseres * For stoffer , som ikke let pulveriseres * Temperatur omraade * Omtr . maksim . noejagt . ( 1 ) * Bemaerkninger *  Koflers varmebaenk * ja * nej * 283 K til 533 K * mere aller mindre 1,0 K * standard forefindes ANSI/ASTM D 3451/76 *  Smeltemikroskop * ja * enkelte * 273 K til 573 K ( op til 1773 K ) * mere aller mindre 0,2 K * standard forefindes DIN 53736 *  Mekanisk metode * nej * kun for polyamider * 293 K til 573 K * mere aller mindre 0,5 K * standard forefindes ISO 1218 ( E ) *  Frysepunktsmetoder * for vaesker * for vaesker * 223 K til 573 K * mere aller mindre 0,5 K * standard forefindes f.eks . BS 4699 *  ( 1 ) Afhaengig af instrumenttype og proevens renhed .  1.6 . Beskrivelse af metoderne  Fremgangsmaaden ved naesten alle undersoegelsesmetoderne er beskrevet i internationale og nationale standarder  ( se tillaeg ) .  1.6.1 . Kapillarroersmetoder  Fint pulveriserede stoffer udviser ved langsom opvarmning saedvanligvis et smeltningsforloeb som vist paa fig . 1 .  Figur 1  Trin A ( betydenden smeltning , vaadpunkt ) : Smaa draaber fordeler sig jaevnt over kapillarroerets indervaeg : JFR . EFT  Trin B ( indskrumpningspunkt ) : Der opstaar et mellemrum mellem proeven og indervaeggen som foelge af proevens indskrumpning under smeltning : JFR . EFT  Trin C ( sammensynkningspunkt ) : Den indskrumpne proeve begynder at synke ned mod bunden og blive flydende : JFR . EFT  Trin D ( flydepunkt ) : Der dannes en ubrudt vaeskeoverflade , men en vaesentlig del af proeven udgoeres stadig af fast stof : JFR . EFT  Trin E ( endelig smeltning ) : Der er ingen faste partikler . Under smeltepunktsbestemmelsen noteres temperaturerne ved begyndende og endelig smeltning : JFR . EFT  1.6.1.1 . Smeltepunktsapparater med vaeskebad .  Fig . 2 viser et eksempel paa et standardiseret smeltepunktsapparat ( JIS K 0064 ) . Apparatet er fremstillet af glas , og alle maal er angivet i mm .  Figur 2  TEGNING : JFR . EFT  Badvaeske : En passende vaeske vaelges blandt de nedennaevnte paa baggrund af smeltepunktet . Flydende paraffin for smeltepunkter op til 473 K , konc . svovlsyre eller silikonolie for smeltepunkter op til 573 K . For smeltepunkter over 523 K kan anvendes en blanding af 3 dele svovlsyre og 2 dele kaliumsulfat ( massedele ) .  Termometer  Man boer kun anvende termometre , som opfylder kravene i de foelgende eller tilsvarende standarder : ASTM E 1-71 , DIN 12770 , JIS K 8001 .  Fremgangsmaade  Det toerre stof pulveriseres fint i en morter og fyldes i kapillarroeret , som er lukket i den ene ende , saaledes at fyldningshoejden er ca . 3 mm efter taet pakning . For at opnaa en ensartet pakket proeve lader man kapillarroeret falde fra en hoejde af ca . 700 mm gennem et lodret glasroer ned paa et urglas . Det fyldte kapillarroer anbringes i badet , saaledes et den midterste del af termometrets kviksoelvkugle beroerer den del af kapilarroeret , hvor proeven befinder sig . Saedvanligvis anbringes kapillarroeret i apparatet , naar badets temperatur er ca . 10 K under smeltepunktet .  Badvaesken opvarmes med en temperaturstigning paa ca . 3 K/min under omroering af vaesken . Naar temperaturen er ca . 10 K under det forventede smeltepunkt , indstilles temperaturstigningen til hoejst 1 K/min .  Beregning  Smeltepunktet beregnes saaledes :  T = T D + 0,00016 ( T D - T E ) n ,  hvor :  T = korrigeret smeltepunktstemperatur ( K ) ,  T D = temperaturaflaesning af termometer D ( K ) ,  T E = temperaturaflaesning af termometer E ( K ) ,  n = antallet af gradinddelinger paa den udestaaende del af termometer D's kviksoelvsoejle .  1.6.1.2 . Metalblok  Apparatet bestaar af foelgende :   - en cylindrisk metalblok , hvis oeverste del er hul og danner et kammer ( se figur 3 ) ,   - en metalprop med to eller flere huller som muliggoer anbringelse af roer i metalklodsen ,   - et opvarmningssystem for metalklodsen , f.eks . i form af en elektrisk modstand indbygget i blokken ,   - en rheostat til regulering af energitilfoerslen  ( hvis der anvendes elektrisk opvarmning ) ,   - fire vinduer af varmeresistent glas i kammerets sidevaegge , anbragt diametralt og vinkelret paa hinanden . Foran et af disse vinduer er anbragt en lup til iagttagelse af kapillarroeret . De tre andre vinduer tjener til belysning af indersiden af kammeret ved hjaelp af lamper ,   - et kapillarroer af varmeresistent glas lukket i den ene ende ( se 1.6.1.1 ) .  Termometer  Se standarderne i 1.6.1.1 . Termoelektriske instrumenter med tilsvarende noejagtighed kan ogsaa anvendes .  TEGNING : JFR . EFT  Fremgangsmaade  Se 1.6.1.1 . Termometerkorrektion foretages ikke i dette tilfaelde . Den aflaeste temperatur angiver smeltepunktet .  1.6.1.3 . Bestemmelse med fotocelle .  Apparat og fremgangsmaade .  Apparatet bestaar af et metalkammer med et automatisk opvarmningssystem . Tre kapillarroer fyldes som i 1.6.1.1 og anbringes i ovnen .  Fem lineaere temperaturforoegelser kan anvendes til korrektion af apparatet , og den egnede temperaturstigning indstilles elektrisk paa en forudvalgt konstant og lineaer hastighed . Skrivere viser den oejeblikkelige ovntemperatur og smeltepunktet af stoffet i kapillarroerene .  1.6.2 . Varmeborde  1.6.2.1 . Koflers varmebaenk  Se tillaeg  1.6.2.2 . Smeltemikroskop  Se tillaeg  1.6.2.3 . Meniskmetode ( for polyamider )  Se tillaeg  Opvarmningshastigheden ved smeltepunktet skal vaere mindre end 1 K/min .  1.6.3 . Metoder til bestemmelse af frysepunkt  Se tillaeg  2 . DATA  I visse tilfaelde er termometerkorrektion noedvendig .  3 . Rapportering  Den anvendte metode skal anfoeres .  Det angivne smeltepunkt skal vaere gennemsnittet af mindst to bestemmelser , som ligger inden for den omtrentlige noejagtighed ( se tillaeg ) . Der gives et skoen over noejagtigheden . Hvis forskellen mellem temperaturen ved begyndende og endelig smeltning ligger inden for metodens noejagtighed , angives temperaturen ved den endelige smeltning som smeltepunktet ; i modsat fald angives begge temperaturer .  Nogle stoffer nedbrydes eller sublimerer , inden smeltepunktstemperaturen er naaet , Hvis dette er tilfaeldet , skal det anfoeres .  Alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for vurdering af resultaterne isaer vedroerende urenheder og stoffets fysiske tilstand skal anfoeres .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 102 - Decision of the Council C(81)30 Final .   ( 2 ) IUPAC , Physicochemical Measurements : Catalogue of Reference Materials from National Laboratories , Pure and Applied Chemistry , Vol . 48 , 1976 , p . 505-515 .  Tillaeg  Til opnaaelse af yderligere tekniske detaljer kan foelgende standarder tjene som eksempler .  1 . Kapillarmetoder  1.1 . Smeltepunktsapparater med vaeskebad  ASTM E 324-69 : Standard Test Method for Relative Initial and Final Melting Points and The Melting Range of Organic Chemicals .  BS 4634 : Method for the Determination of Melting Point and/or Melting Range .  DIN 53181 : Bestimmung der Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren .  JIS K 00-64 : Testing Methods for Melting Point of Chemical Products .  1.2 . Smeltepunktsapparater med metalblok  DIN 53736 : Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen .  ISO 1218 ( E ) : Plastics-Polyamides-Determination of  " Melting Point " ,  2 . Varmeborde  2.1 . Koflers varmebaenk  ANSI/ASTM D 3451-76 : Standard Recommended Practices for Testing Polymeric Powder Coatings .  2.2 . Smeltemikroskop  DIN 53736 : Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen  2.3 . Meniskmetode ( for polyamider )  ISO 1218 ( E ) : Plastics-Polyamides-Determination of  " Melting Point " .  ANSI/ASTM D 2133-66 : Standard Specification for Acetal Resin Injection Moulding and Extrusion Materials ,  NF T 51-050 : Resines de Polyamides Determination du  " Point de Fusion " , Methode du menisque .  3 . Metoder til bestemmelse af frysepunkt  BS 4633 : Method for the Determination of Crystallizing Point .  BS 4695 : Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax ( Cooling Curve ) .  DIN 10319 : Bestimmung des Gefrierpunktes von Milch .  DIN 51421 : Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen , Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen .  DIN 51556 : Bestimmung des Erstarrungspunktes am rotierenden Thermometer .  DIN 53175 : Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsaeuren .  NF T 60-114 : Point de Fusion des Paraffines .  A . 2 . KOGEPUNKT/KOGEPUNKTSINTERVAL  1 . METODE  De beskrevne metoder er baseret paa OECD retningslinje for undersoegelse af kemikalier . ( 1 )  1.1 . Indledning  De her beskrevne metoder og instrumenter kan anvendes for alle vaesker , forudsat at disse ikke reagerer kemisk under kogepunktet ( f.eks . autooxidation ) , omlejring , nedbrydning o.l . ) . Metoderne kan anvendes for alle vaesker uden renhedsbegraensninger .  Specielt boer den metode bemaerkes , som benytter sig af bestemmelse med fotocelle , fordi saavel smeltesom kogepunkter kan bestemmes ved denne metode . Desuden kan disse maalinger udfoeres automatisk .  Den dynamiske metode har den fordel , at den ogsaa kan benyttes til bestemmelse af damptryk , og det er ikke noedvendigt at korrigere kogepunktstemperaturen for afvigelser fra normaltrykket ( 101,325 kPa ) , fordi trykket kan reguleres under maalingen . Denne metode er dog ikke paa nuvaerende tidspunkt automatiseret .  Bemaerkninger :  Urenheders indflydelse paa bestemmelsen af kogepunktet afhaenger i hoej grad af urenhedens art . Effekten kan vaere betydelig , hvis et letflygtigt oploesningsmiddel er til stede i proeven .  Sammensaetninger af den undersoegte proeve aendres fra maaling til maaling paa grund af fordampning af lavtkogende komponenter . Under saadanne omstaendigheder faas stadigt stigende vaerdier .  1.2 . Definitioner og enheder  Standardkogepunktstemperaturen beskrives som den temperatur , hvorved en vaeskes maettede damptryk er det samme som standardtrykket .  Det maalte kogepunkt afhaenger af atmosfaeretrykket . Denne afhaengighed kan beskrives kvantitativt ved hjaelp af Clausius-Clapeyrons ligning : JFR . EFT  Temperaturen ved kogepunktet ( kogepunktstemperaturen ) opgives i forhold til det aktuelle tryk under maalingen .  Omregninger :  Tryk ( enhed - kPa )  100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa   ( " bar " -enheden er stadig tilladt , men anbefales ikke )  133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr ( enhederne mm Hg og Torr er ikke tilladt )  Temperatur ( enhed - K )  t = T - 273,15  t er i * C og T er i K .  1.3 . Referencestoffer  Det er ikke noedvendigt at anvende referencestoffer i alle tilfaelde , naar et nyt stof skal undersoeges . Referencestoffer skal foerst og fremmest anvendes til lejlighedsvist at korrigere metoden og til at muliggoere sammenligning af resultater .  Nogle referencestoffer kan findes under de metoder , som er angivet i tillaeg .  1.4 . Metodeprincip  Alle metoder til kogepunktsbestemmelse  ( kogepunktsinterval ) er baseret paa maaling af den temperatur , hvorved proeven koger . Der er beskrevet fem metoder .1.4.1 . Bestemmelse ved hjaelp af ebulliometer  Ebulliometre blev oprindeligt udviklet til molekylevaegtsbestemmelser via kogepunktsforhoejelse , men de er ogsaa velegnede til noejagtige kogepunktsbestemmelser . Et meget enkelt apparat er beskrevet i ASTM D 1120-72  ( tillaeg ) . I dette apparat opvarmes vaesken under ligevaegtsbetingelser ved atmosfaeretryk indtil den koger .  1.4.2 . Dynamisk metode  Ved denne metode maales dampenes fortaetningstemperatur ved hjaelp af en termofoeler under kogning med tilbagesvaling . Trykket kan reguleres ved denne metode .  1.4.3 . Destillationsmetode til bestemmelse af kogepunkt og kogepunktsinterval .  Ved denne metode destilleres vaesken , og dampens fortaetningstemperatur samt destillatmaengden maales .  1.4.4 . Siwoloboff's metode  En proeve opvarmes i et proeveroer , som er nedsaenket i et varmebad . Et tilsmeltet kapillarroer med en luftboble i den nederste ende er nedsaenket i proeveroeret .  Man bestemmer den temperatur , ved hvilken en jaevn stroem af bobler undviger fra kapillarroeret eller den temperatur , ved hvilken bobleraekken standser ved momentvis afkoeling og vaesken pludseligt stiger op i kapillarroeret .  1.4.5 . Bestemmelse med fotocelle  Ved at foelge Siwoloboff's princip kan der foretages automatisk fotoelektrisk maaling ved hjaelp af de opstigende bobler .  1.5 . Kvalitetskriterier  Anvendeligheden og noejagtigheden af de forskellige metoder som anvendes til bestemmelse af kogepunkt/kogepunktsinterval , er opstillet i tabel 1 .  1.6 . Beskrivelse af metoderne  Fremgangsmaaden ved nogle undersoegelsesmetoder er beskrevet i internationale og nationale standarder  ( se tillaeg ) .  1.6.1 . Ebulliometer  Se tillaeg 1 .  1.6.2 . Dynamisk metode  Se undersoegelsesmetode A.4 til bestemmelse af damptryk .  Kogepunktstemperaturen , som iagttages ved et tryk paa 101,325 kPa , noteres .  1.6.3 . Destillationsforloeb ( kogepunktsinterval )  Se tillaeg .  TABEL 1 : SAMMENLIGNING AF METODERNE  Maalemetode * Omtrentlig noejagtighed * Bemaerkninger *  Ebulliometer * mere aller mindre 1,4 K ( op til 373 K ) ( 1 ) ( 2 ) * eksisterende standard ASTM D 1120-72 ( 1 ) *   * mere aller mindre 2,5 K ( over 373 K ) ( 1 ) ( 2 ) * *  Dynamisk metode * mere aller mindre 0,5 K ( 2 ) * *  Destillationsforloeb ( kogepunktsinterval ) * mere aller mindre 0,5 K * eksisterende standard f.eks . ISO/R 918 DIN 53171 BS 4591/71 *  Siwoloboff's metode * mere aller mindre 1 til mere aller mindre 2 K ( 2 ) * *  Paavisning ved fotocelle * mere aller mindre 0,3 K  ( ved 373 K ) ( 2 ) * *  ( 1 ) Denne noejagtighed gaelder kun for det simple apparat , som er beskrevet f.eks . ASTM D 1120-72 ; den kan forbedres med mere raffinerede ebulliometre .  ( 2 ) Gaelder kun for rene stoffer .  1.6.4 . Siwoloboff's metode  Proeven opvarmes i et smeltepunktsapparat i et proeveroer med en diameter paa ca . 5 mm ( figur 1 ) .  Figur 1 viser en model af et standardiseret smelte - og kogepunktsapparat ( JIS K 0064 ) ( fremstillet af glas , alle maal i mm ) .  Figur 1 , Figur 2 og Figur 3  TEGNING : JFR . EFT  Vaesken til varmebadet vaelges ud fra kogepunktet . Ved en temperatur op til 573 K kan svovlsyre eller silikoneolie bruges . Flydende paraffinolier kan kun anvendes op til 473 K . Opvarmningen af vaesken i varmebadet maa i begyndelsen indstilles , saa temperaturforoegelsen er 3 K/min . Vaesken i badet skal vaere under omroering . Ca . 10 K under det forventede kogepunkt mindskes temperaturforoegelsen til under 1 K/min .  Naar man naermer sig kogepunktstemperaturen , begynder der at komme bobler fra kapillarroeret .  Kogepunktet er naaet , naar bobleraekken standser ved momentvis afkoeling , og vaesken pludseligt begynder at stige op i kapillarroeret . Den hertil svarende termometeraflaesning er stoffets kogepunktstemperatur . I det modificerede princip ( fig . 3 ) bestemmes kogepunktet i smeltepunktskapillaret . Det traekkes ud til en tynd traad paa ca . 2 cm's laengde ( a ) , og en lille proevemaengde suges op . Den aabne ende af det tynde kapillar tilsmeltes , saaledes at der bliver en lille luftboble i enden . Ved opvarmning i smeltepunktsapparatet  ( b ) udvider luftboblen sig , kogepunktet svarer til den temperatur , ved hvilken stofproppen naar op til samme hoejde som vaeskeoverfladen i badet ( c ) .  1.6.5 . Bestemmelse med fotocelle  Proeven opvarmes i et kapillarroer i en opvarmet metalblok .  En lysstraale ledes via passende huller i blokken gennem stoffet mod en noejagtig indstillet fotocelle .  Naar proevens temperatur foroeges , kommer der enkelte bobler fra kogekapillaret . Naar kogepunktstemperaturen naas , oeges antallet af bobler voldsomt . Dette foraarsager en intensitetsaendring af det lys , som fotocellen modtager , og der gives et stopsignal til en indikator , som viser temperaturen af et platinmodstandstermometer i blokken .  Denne metode er saerlig anvendelig , fordi den tillader bestemmelser under stuetemperatur ned til 253,15 K  ( - 20 * C ) uden aendringer ved apparaturet ; instrumentet skal blot anbringes i et koelerum eller et kuldebad . Den noejagtige udfoerelse af kogepunktsbestemmelsen fremgaar af instrumenthaandbogen .  2 . DATA  Ved smaa afvigelser fra normaltryk ( maks . mere aller mindre 5 kPa ) omregnes kogepunktstemperaturerne til T n ved hjaelp af foelgende ligning af Sidney-Young :  T n = T + f T gange Dp  Hvor  Dp = ( 101,325 - p ) ( bemaerk fortegnet )  p = trykket maalt i kPa  f T = kogepunktets aendring med trykket i K/kPa  T = aflaest kogepunktstemperatur i K  T n = kogepunktstemperatur i K , korrigeret til normaltryk .  Temperaturkorrektionsfaktorerne f T og tilnaermede ligninger for disse er angivet i overnaevnte internationale og nationale standarder for mange stoffer .  F.eks . naevner DIN 53171 foelgende tilnaermede korrektioner for oploesningsmidler , som anvendes i maling .  Tabel 2 indeholder temperaturkorrektionsfaktorer for organiske oploesningsmidler ( se ISO/DIS 4626 ) .  TABEL 2 : TEMPERATURKORREKTIONSFAKTORER ( f T )  temperatur T i K * korrektionsfaktor f T i K/kPa *  323,15 * 0,26 *  348,15 * 0,28 *  373,15 * 0,31 *  398,15 * 0,33 *  423,15 * 0,35 *  448,15 * 0,37 *  473,15 * 0,39 *  498,15 * 0,41 *  523,15 * 0,44 *  548,15 * 0,45 *  573,15 * 0,47 *  3 . RAPPORTERING  Det skal anfoeres , hvilken metode der er anvendt . Det rapporterede kogepunkt er gennemsnittet af mindst 2 maalinger , som ligger indenfor den usikkerhed der er angivet i tabel 1 . Hvis bestemmelserne ikke er reproducerbare , boer andre metoder overvejes .  De maalte kogepunkter og deres gennemsnit skal angives tillige med de tryk i kPa , hvorved disse maalinger er foretaget . Trykket skal helst ligge taet paa normaltrykket . Hvor et stof koger over et temperaturinterval , skal dette interval opgives . For alle resultater skal der gives skoen over usikkerheden .  Alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for fortolkningen af resultaterne skal anfoeres , isaer hvad angaar urenheder og stoffets fysiske tilstand .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 103 - Decision of the Council C(81 ) 30 Final .  Tillaeg  For yderligere tekniske detaljer kan henvises til foelgende standarder som eksempler :  1 . Ebulliometer  ASTM D 1120-72 : Standard Test Method for Boiling Point of Engine Antifreezes .  2 . Destillationsforloeb ( kogepunktsinterval )  ISO/R 918 : Test Method for Distillation ( Distillation Yield and Distillation Range ) ,  BS 4349/68 : Method for the Determination of Distillation of Petroleum Products .  BS 4591/71 : Method for the Determination of Distillation Characteristics .  DIN 53171 : Loesungsmittel fuer Anstrichstoffe , Bestimmung des Siederverlaufes .  A . 3 . RELATIV MASSEFYLDE  1 . METODE  De beskrevne metoder er baseret paa OECD retningslinje for undersoegelse af kemikalier ( 1 ) .  1.1 . Indledning  De beskrevne metoder til bestemmelse af relativ massefylde kan anvendes for faste stoffer og vaesker uden renhedsbegraensninger . De forskellige metoder , som kan anvendes , er anfoert i tabel 1 .  1.2 . Definitioner og enheder  Den relative massefylde ( D ( 20,4 ) ) af faste stoffer og vaesker er forholdet mellem massen af et rumfang af det undersoegte stof bestemt ved 20 * C og massen af det samme rumfang vand bestemt ved 4 * C . Den relative massefylde har ingen enhed .  Massefylden , ( r ) , af et stof er dets masse , m , divideret med dets rumfang , v .  Massefylden opgives i kg/m3 ( SI-enheder ) .  1.3 . Referencestoffer ( 1 ) , ( 2 )  Det er ikke noedvendigt at anvende referencestoffer i alle tilfaelde , naar et nyt stof undersoeges . Referencestoffer skal foerst og fremmest anvendes til lejlighedsvist at korrigere metoden og til at muliggoere sammenligning af resultater .  1.4 . Metodeprincip  Der kan anvendes fire forskellige metoder .  1.4.1 . Opdriftsmetoder  1.4.1.1 . Arometer ( for vaesker )  Der kan opnaas tilstraekkelig noejagtige og hurtige massefyldebestemmelser med arometre . Ved hjaelp af disse kan massefylden af en vaeske udledes af nedsaenkningsdybden ved aflaesning paa en skala .  1.4.1.2 . Hydrostatisk vaegt ( for vaesker og faste stoffer )  Forskellen mellem massen af en proeve i henholdsvis atmosfaerisk luft og vand kan anvendes til at bestemme dens massefylde . For faste stoffer er den fundne massefylde kun repraesentativ for den bestemte proeve , som er anvendt til bestemmelsen . Til bestemmelse af vaeskers massefylde vejes et legeme med kendt rumfang , V , foerst i atmosfaerisk luft og dernaest i vaesken .  1.4.1.3 . Metode med nedsaenket kugle ( for vaesker ) ( 3 )  Ved denne metode bestemmes en vaeskes massefylde ud fra forskellen mellem resultaterne af vejning af vaesken foer og efter nedsaenkning af en kugle med rumfang heri .  1.4.2 . Pyknometermetoder  Pyknometre af forskellig udformning og med kendt rumfang kan anvendes for faste stoffer og vaesker . Massefylden beregnes ud fra masseforskellen mellem det fulde og det tomme pyknometer og dets kendte rumfang .  1.4.3 . Luftsammenligningspyknometer ( for faste stoffer )  Massefylden af et fast stof i enhver form kan bestemmes ved stuetemperatur med et gassammenligningspyknometer . Rumfanget af en proeve af stoffet maales i atmosfaerisk luft eller i en inaktiv luftart i en beholder med korrigeret rumfangsinddeling . Til beregning af massefylden foretages efter rumfangsbestemmelsen en bestemmelse af proevens masse .  1.4.4 . Oscillerende densitometer ( 4 ) , ( 5 ) , ( 6 )  Massefylden af en vaeske kan bestemmes med et oscillerende densitometer . En mekanisk oscillator i form af et U-roer saettes i svingninger med en specifik frekvens , som afhaenger af oscillatorens masse . Naar der indfoeres en proeve , aendres oscillatorens resonansfrekvens . Apparatet skal indstilles ved hjaelp af to vaesker med kendte massefylder . Disse stoffer skal fortrinsvis vaelges saaledes , at deres massefylder spaender over det paagaeldende maaleomraade .  1.5 . Kvalitetskriterier  Anvendeligheden af de forskellige metoder , som anvendes til bestemmelse af den relative massefylde , er opstillet i tabel 1 .  Den i ISO-standarden anfoerte noejagtighed gaelder kun for rene stoffer .  1.6 . Beskrivelse af metoderne  Tillaegget indeholder en liste over standarder , der kan tjene som eksempler , og hvorfra yderligere tekniske detaljer kan hentes .  Maalingerne skal udfoeres ved 20 * C , og der foretages mindst to bestemmelser .  2 . DATA  Se standarderne .  3 . RAPPORTERING  Den anvendte metode i standard skal angives . Den relative massefylde D ( 20,4 ) angives som defineret i 1.2 tillige med den fysiske tilstand af det undersoegte stof , den anvendte metode og referencestoffet .  Alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for vurdering af resultaterne isaer vedroerende urenheder og stoffets fysiske tilstand skal anfoeres .  Der skal redegoeres for den anvendte metode/standard og mulige afvigelser herfra .  TABEL 1 : METODERNES ANVENDELIGHED  Maalemetode * Massefylde * Maksimale dynamiske viskositet * Bemaerkninger *   * fast stof * vaeske * * *  1.4.1.1 . Arometer * * X * 5 Pa s * ISO 387 *   * * * * ISO/R 649 *  1.4.1.2 . Hydrostatisk * * * * *  a ) Faste stoffer * X * * * ISO/R 1185 ( A ) *  b ) Vaesker * * X * 5 Pa s * ISO/R 91 og R 758 *  1.4.1.3 . Metode med nedsaenket kugle * * X * 20 Pa s * DIN 53217 *  1.4.2 . Pyknometer * * * * ISO/R 3507 *  a ) Faste stoffer * X * * * ISO/R 1183 ( B ) *  b ) Vaesker * * X * 500 Pa s * ISO/R 758 *  1.4.3 . Luftsammenligningspyknometer * X * * * DIN 55990 Teil 3 *   * * * * DIN 53243 *  1.4.4 . Oscillerende densitometer * * X * 5 Pa s * *  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris 1981 , Test Guideline 109 - Decision of the Council C(81 ) 30 Final .   ( 2 ) IUPAC , Recommended reference materials for realisation of Physico-chemical Properties .   - Pure and Applied Chemistry , Vol . 48 , 1976 , p . 508 .   ( 3 ) Wagenbreth , H . , Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Fluessigkeiten , Technisches Messen tm , vol . 11 , 1979 , S . 427-430 .   ( 4 ) Leopold , H . , Die digitale Messung von Fluessigkeiten , Elektronik , Vol . 19 , 1970 , S . 297-302 .   ( 5 ) Baumgarten , D . , Fuellmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen - Verfahren zur Dichtebestimmung bei fluessigen Produkten und ihre praktische Anwendung . Die Pharmazeutische Industrie , Vol . 37 , 1975 , S . 717-726 .   ( 6 ) Riemann , J . , Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium , Brauwissenschaft , Vol . 9 , 1976 , S . 253-255 .  Tillaeg  Til opnaaelse af yderligere tekniske detaljer kan foelgende standarder tjene som eksempler .  1 . Opdriftsmetoder  1.1 . Arometer  DIN 12790 : Hydrometer ; general instructions .  ISO 387 .  DIN 12791  Part I : Density hydrometers ; construction , adjustment and use  Part II : Density hydrometers ; standardised sizes , designation .  ISO/R 649 .  DIN 12793  Laboratory glassware : range find hydrometers .  1.2 . Hydrostatisk vaegt  For faste stoffer :  ISO/R 1183 : Method , A , Methods for determining the density and relative density of plastics excluding cellular plastics .  ASTM-D-792 : Specific Gravity and Density of Plastics by Displacement .  DIN 53479 : Testing of plastics and elastomers ; determination of density .  For vaesker :  ISO/R 91 , ISO/R 758 .  DIN 51757 : Testing of mineral oils and related materials ; determination of density .  ASTM D 941-55 , ASTM D 129-67 og ASTM D 1481-62 .  ASTM D 1298 : Density , Specific gravity or API gravity of crude Petroleum and liquid Petroleum Products by Hydrometer Method .  BS 4714  Titel : samme som ASTM D 1298 .  1.3 . Metode med nedsaenket kugle  DIN 5317 : Testing of paints , varnishes and similar products ; determination of density by pycnometer  ( Tilfoejelse vedroerende metode med nedsaenket kugle vil blive udgivet i 1981 ) .  2 . Pyknometermetoder  2.1 . For vaesker  ISO 3507 : Pycnometers .  ISO/R 758 : Liquid chemical products ; determination of density at 20 * C .  DIN 12797 : Gay-Lussac pyknometer ( for ikke-flygtige vaesker , som ikke er for tyktflydende ) .  DIN 12798 : Lipkin pyknometer ( for vaesker med kinematisk viskositet under 100.10 -6 m2 s-1 ved 15 * C ) .  DIN 12800 : Sprengel pyknometer ( for vaesker , som i DIN 12798 ) .  DIN 12801 : Reischauer pyknometer ( for vaesker med kinematisk viskositet under 100.10 -6 m2 s-1 ved 20 * C ; desuden saerligt egnet til kulbrinter og vandige oploesninger samt vaesker med hoejere damptryk , ca . 1 bar ved 90 * C ) .  DIN 12806 : Hubbard pyknometer ( for alle tyktflydende vaesker , som ikke har for hoejt damptryk , specielt ogsaa for malinger , lakker og asfalt ) .  DIN 12807 : Bingham pyknometer ( for vaesker , som i DIN 12801 ) .  DIN 12808 : Jaulmes , pyknometer ( hovedsagelig for ethanol/vandblandinger ) .  DIN 12809 : Pycnometer with ground-in thermometer and capillary side tube ( for vaesker , som ikke er for tyktflydende ) .  DIN 53217 : Testing of paints , varnishes and similar products ; determination of density by pycnometer .  DIN 51757 : Point 7 ; Testing of mineral oils and related materials ; determination of density .  ASTM D 297 : Section 15 ; Rubber Products-Chemical Analysis .  ASTM D 2111 : Method C ; Halogenated organic compounds .  BS 4699 : Method for Determination of Specific Gravity and Density of Petroleum Products ( Graduated Bicapillary Pycnometer Method ) .  BS 5903 : Method for Determination of Relative Density and Density of Petroleum Products by the Capillary-Stoppered Pycnometer Method .  2.2 . For faste stoffer  ISO/R 1183 : Method for Determining the Density and Relative Density of Plastics excluding Cellular Plastics .  DIN 19683 : Determination of the Density of Soils .  3 . Luftsammenligningspyknometer  DIN 55990 : Teil 3 Pruefung von Anstrichstoffen und aehnlichen Beschichtungsstoffen ; Pulverlack ; Bestimmung der Dichte .  DIN 53243 : Anstrichstoffe ; chlorhaltige Polymere ; pruefung .  A . 4 . DAMPTRYK  1 . METODE  De beskrevne metoder er baseret paa OECD retningslinie for undersoegelse af kemikalier ( 1 ) .  1.1 . Inledning  Det er vaerdifuldt at have forhaandskundskab til stoffets struktur smeltepunkt og kogepunkt for at udfoere denne proevning .  Der findes ikke en enkelt metode , som er anvendelig i hele damptryksomraadet . Derfor anbefales flere metoder til anvendelse ved maaling af damptryk fra < 10 -3 Pa til 10 5 Pa .  Urenheder vil normalt paavirke damptrykket . Urenhedens indflydelse paa maalingen af damptrykket afhaenger staerkt af urenhedens art . Paavirkningen kan vaere betydelig , hvis der er staerkt flygtigt oploesningsmiddel i proeven .  1.2 . Definitioner og enheder  Et stofs damptryk defineres som maetningstrykket over et fast eller flydende stof . Ved den termodynamiske ligevaegt er damptrykket af et rent stof alene en funktion af temperaturen .  Den SI-enhed for tryk , som boer anvendes er Pascal  ( Newton/m2 ) .  Enheder , som har vaeret anvendt tidligere sammen med deres omregningsfaktorer , er :  1 Torr ( mm Hg ) = 1,333 gange 10 2 Pa  1 atmosfaere ( fysisk atm ) = 1,013 gange 10 5 Pa  1 atmosfaere ( teknisk at ) = 9,81 gange 10 4 Pa  1 bar = 10 5 Pa  SI-enheden for temperaturen er Kelvingrader ( K ) .  1.3 . Referencematerialer  Det er ikke noedvendigt at anvende referencematerialer i alle tilfaelde ved undersoegelsen af et nyt stof . De skal fortrinsvis tjene til at kontrollere metodens ydeevne fra tid til anden og for at give mulighed for at sammenligne resultater , opnaaet ved andre metoder .  1.4 . Proevningsmetodens principper  Der foreslaas fem metoder til bestemmelse af damptryk , som kan bruges i forskellige damptryksomraader . Ved hver metode bestemmes damptrykket ved forskellige temperaturer . I et begraenset temperaturomraade er logaritmen til et damptryk af et rent stof en lineaer funktion af den reciprokke vaerdi af temperaturen .  1.4.1 . Dynamisk metode  Ved den dynamiske metode maales kogetemperaturen , der svarer til et specificeret tryk .  Anbefalet omraade :  10 3 Pa op til 10 5 Pa , mellem 20 * C og 100 * C . Denne metode er ogsaa anbefalet til kogepunktsbestemmelse og kan anvendes til dette formaal op til 350 * C .  1.4.2 . Statisk metode  Ved den statiske proces , ved termodynamisk ligevaegt , bestemmes det damptryk , der dannes i et lukket system ved en specificeret temperatur .  Denne metode er egnet for en - og flerkomponent faste stoffer og vaesker .  Anbefalet omraade :  10 Pa op til 10 5 Pa , mellem 0 * C og 100 * C .  1.4.3 . Isoteniskop  Denne standardiserede metode er ogsaa en statisk metode , men den er normalt ikke anvendelig til flerkomponentsystemer . Yderligere information kan faas i ASTM metode D-2879-75 .  Anbefalet omraade :  Fra 100 Pa til 10 5 Pa mellem 0 * C og 100 * C .  1.4.4 . Damptryksvaegt  Den stofmaengde , der forlader en celle pr . tidsenhed gennem en aabning af kendt stoerrelse bestemmes under vakuum , saaledes at den maengde stof , der vender tilbage til cellen , er ubetydelig ( f . eks . ved maaling af den impuls , som en dampstraale fremkalder paa en foelsom vaegt eller ved at maale vaegttabet ) .  Anbefalet omraade :  10 -3 Pa til 1 Pa , mellem 0 * C og 100 * C .  1.4.5 . Gasmaetningsmetode  En stroem af inaktiv baeregas foeres hen over stoffet paa en saadan maade , at den maettes med dets dampe , og dampene opsamles derefter i en passende faelde . Maaling af den maengde materiale , der transporteres med en kendt maengde baeregas , bruges til beregning af damptrykket ved en given temperatur .  Anbefalet omraade :  Op til 1 Pa .  1.5 . Kvalitetskriterier  De forskellige metoder til bestemmelse af damptrykket er sammenlignet med hensyn til anvendelse , repeterbarhed , reproducerbarhed , maaleomraade , eksisterende standard . Dette er gjort i tabellen .  TABEL : KVALITETSKRITERIER  Maalemetode * Stoffer * Skoennet repeterbarhed ( 1 ) * Skoennet reproducerbarhed ( 1 ) * Anbefalet omraade * Eksisterende Standard *   * Faste * Vaesker * * * * *  1.4.1 . Dynamisk metode * * X * Op til 25 % * Op til 25 % * 10 3 Pa til 2 * 10 3 Pa * - *   * * * 1 - 5 % * 1 - 5 % * 2 * 10 3 Pa til 10 5 Pa * - *  1.4.2 . Statisk metode * X * X * 5 - 10 % * 5 - 10 % * 10 Pa til 10 5 Pa * - *  1.4.3 . Isoteniskop * X * X * 5 - 10 % * 5 - 10 % * 10 2 Pa til 10 5 Pa * ASTM-D 2879-75 *  1.4.4 . Damptryksvaegt * X * X * 5 - 20 % * Op til 50 % * 10 -3 Pa til 1 Pa * - *  1.4.5 . Gasmaetningsmetode * X * X * 10 - 30 % * Op til 50 % * < 10 -3 Pa op til 1 Pa * - *  ( 1 ) Afhaengig af renhedsgraden .  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Dynamisk maaling  1.6.1.1 . Apparatur Maaleinstrumentet bestaar typisk af en kogebeholder med tilsluttet koeler fremstillet af glas eller metal  ( figur 1 ) , udstyr til regulering og maaling af temperaturen og udstyr til regulering og maaling af trykket . Et typisk maaleudstyr , vist paa skitsen , fremstilles af varmefast glas og bestaar af fem dele :  Et stort , delvis dobbeltvaegget roer bestaaende af en slibsamling , en koeler , en koelebeholder og et indloeb .  Glascylinderen med en Cottrell-pumpe monteres paa roerets kogesektion og har en ru overflade for at undgaa stoedkogning .  Temperaturen maales ved anvendelse af et termoelement eller et modstandstermometer , som indesluttes i en lille smule olie . Det indsaettes i proeveroeret , som har udvendige slib og er forseglet paa bunden .  Krydsstykket udgoer de noedvendige forbindelser til udstyret til regulering og maaling af trykket .  Bulben , som fungerer som stoedpudevolumen , forbindes med maaleudstyret ved hjaelp af et kapillarroer .  Et varmeelement , som indsaettes udvendig i glasapparatet nedefra bruges til opvarmning af kogebeholderen . Den oenskede opvarmningsstroem indstilles ved hjaelp af en spaendingsregulerende transformer , og registreres ved hjaelp af et amperemeter .  En oliepumpe bruges til at indstille det oenskede vakuum mellem 10 2 Pa og rundt regnet 10 5 Pa .  En nitrogentrykflaske bruges til at indstille det oenskede tryk og forbindes via en ventil , som ogsaa bruges til udluftning af apparatet .  Et praecisionsmanometer , som er tilsluttet krydsstykket , bruges til trykmaalingen .  1.6.1.2 . Fremgangsmaade ved maalingen  Damptrykket maales ved at bestemme proevens kogepunkt ved forskellige specificerende tryk mellem rundt regnet 10 3 Pa og 10 5 Pa . En ikke-stigende temperatur ved konstant tryk viser , at kogepunktet  ( ligevaegtskogepunktet , hvis det er en blanding ) er naaet . Skummende stoffer kan ikke maales ved denne metode .  Foer maalingen skal alle glasdele rengoeres og toerres omhyggeligt og derefter evakueres under gasballast . Derefter indfoeres stoffet i apparatet . Hvis faste stoffer ikke er pulverformige , kan der opstaa problemer under paafyldningen , men disse kan undgaas ved at opvarme koelevandskappen . Efter paafyldning , samles apparatet og stoffet afgasses . Derpaa indstilles paa det laveste af de oenskede tryk , og opvarmningssystemet taendes . Samtidig forbindes termoelementet eller modstandstermometret til en skriver . Der er naaet ligevaegt , naar der aflaeses en konstant kogetemperatur ved et givet tryk . Naar dette ligevaegtspunkt er registreret , saettes et hoejere tryk . Der fortsaettes paa denne maade , indtil 10 5 Pa er naaet ( i alt omkring 5 til 10 maalepunkter ) . Som kontrol skal ligevaegtspunkterne gentages ved aftagende tryk .  1.6.2 . Statisk maaling  1.6.2.1 . Apparatur  Et typisk maaleudstyr ( figur 2 ) omfatter saavel et opvarmnings - og et koelesystem , bestaaende af glas og metal , til at bibringe proeven en reguleret temperatur , som et udstyr til fastsaettelse og maaling af trykket og temperaturen .  Proevekammeret har paa den ene side en hoejvakuumventil af rustfast staal , og paa den anden side et roer indeholdende en passende manometervaeske , roerets anden ende forbindes med et krydsstykke , hvis ene gren foeres til en vakuumpumpe , den anden til nitrogentrykflasken og den tredje til trykmaaleren .  For at bibringe stoffet en reguleret temperatur , placeres hele proevekammeret , inklusive ventilklodsen og en tilstraekkelig stor del af roeret ( af praktiske grunde op til ventilklodsens hoejde ) i et egnet termostatbad . Temperaturen maales med et termoelement eller et modstandstermometer meget taet paa proevekammerets yderside , den kan registreres loebende .  Flydende nitrogen eller toeris-alkohol blanding er velegnet til kraftig afkoeling af proeven . Til maaling ved lave temperaturer bruges en ultrakryostat .  Der benyttes en passende pumpe til at evakuere apparatet til det kraevende tryk .  Et stofs damptryk maales normalt indirekte via en nul-indikator . Denne nul-indikator kan vaere et roer indeholdende en vaeske , som specificeret nedenfor , eller blandt andre et differens trykmanometer . Damptrykket flytter vaesken i roeret ud af ligevaegt i en termostat . Nitrogen ledes nu ind i apparatet fra en tilsluttet nitrogen-trykflaske via en ventil for at kompensere for damptrykkets virkning og bringe trykmaaleren tilbage til nul . Det hertil kraevede nitrogentryk aflaeses paa en praecisionstrykmaaler , som befinder sig ved stuetemperatur , og svarer til stoffets damptryk ved den tilsvarende konstante temperatur . Forskellige vaesker som kviksoelv , silikonolie , phthalater , kan afhaengigt af trykomraadet og stoffets kemiske adfaerd , bruges som vaeske i roeret til nul-ligevaegtsstilling .  Kviksoelv kan bruges fra atmosfaeretryk ned til 10 2 Pa , silikonolier og phthanalater ogsaa under 10 2 Pa ned til 10 Pa ; membranmanometeret kan endog anvendes under 10 -1 Pa .  1.6.2.2 . Fremgangsmaade ved maalingen  Foer maalingen renses alle dele af det paa figur 2 viste apparat omhyggeligt med oploesningsmidler og toerres derpaa i vakuum . U-roeret fyldes derpaa med den oenskede vaeske , som boer afgasses ved forhoejet temperatur foer paafyldningen .  Efter at stoffet er fyldt i apparatet , samles dette og proevekammeret underafkoeles passende . Derefter pumpes den indesluttede luft ud af apparatet i flere minutter med ventilen over proevekammeret staaende aaben . Derefter lukkes ventilen over stoffet . Proeven bibringes den valgte temperatur og herunder iagttages den deraf foelgende forskydning af soejlerne , og der kompenseres om noedvendigt til nul-stilling med kvaelstof , indtil konstant temperatur er opnaaet . Derefter afkoeles proevekammeret igen . Hvis der observeres et resstryk i den underafkoelede tilstand , skyldes dette enten at luft , indeholdt i proeven , kan frigoeres ved opvarmningen , og kan traekkes ud , eller at koeletemperaturen ikke er tilstraekkeligt lav . Der maa da benyttes flydende nitrogen som koelemiddel .  Efter at proeven er blevet tilstraekkeligt afgasset , bestemmes damptrykkets afhaengighed af temperaturen med tilstraekkelig smaa temperatur intervaller .  1.6.3 . Isoteniskop  En fuldstaendig beskrivelse af denne metode findes i  ( 2 ) . Maaleudstyrets princip ses paa figur 3 . I lighed med den under 1.6.2 beskrevne statiske metode er isoteniskopet egnet til undersoegelse af faste stoffer og vaesker .  I tilfaelde af vaesker tjener stoffet selv som vaeske i hjaelpemanometret . I tilfaelde af faste stoffer anvendes , afhaengigt af tryk - og temperaturomraadet , de i 1.6.2 oplistede manometervaesker . For vaesker fyldes kuglen i isoteniskopet med det stof , som skal undersoeges , det afgasses ved kogning ved forhoejet temperatur .  Samtidig destilleres en del af vaesken ud af kuglen og kondenseres i den oeverste afkoelede kugle og vender tilbage til roeret . Naar dette er tilstraekkelig fyldt med afgasset vaeske , bringes den underste kugle med roeret i en termostat op paa den valgte temperatur og det resulterende damptryk maales indirekte paa noejagtig samme maade som ved den i 1.6.2 beskrevne metode .  I tilfaelde af faste stoffer paafyldes den afgassede manometervaeske gennem udbulingen paa isoteniskopets lange arm . Derpaa fyldes det faste stof , der skal undersoeges , ind i den nederste kugle og afgasses ved forhoejet temperatur . Derefter haeldes isoteniskopet saaledes , at manometervaesken kan fyldes ind i roeret . Maaling af damptrykket som funktion af temperaturen foretages i henhold til 1.6.2 .  1.6.4 . Damptryksvaegt  1.6.4.1 . Apparatur  Der er beskrevet forskellige apparaturudformninger i litteraturen ( 1 ) . Den her beskrevne illustrerer det anvendte princip . Et antal dele er vist paa figur 4 . Disse er grundplade og glasklokke , en pumpe med en vakuummaaler og udstyr til maaling af damptrykket ved viserudslag . Foelgende indbygget udstyr er monteret paa grundpladen .   - En fordampningsovn med flange og rotationsfoedning . Fordampningsovnen er et fladt , cylinderisk kobberkar  ( ovnen kan ogsaa vaere af glas omgivet af en kobbervaeg ) . Den sidder i en kobberholder , som er skruet paa et stykke rustfrit staal ved dens nedre udragende kant . Det rustfri staalstykke er igen monteret paa grundpladen ved hjaelp af en flange , saaledes at det kan roteres omkring ovnens akse . Opvarmningen tilvejebringes ved hjaelp af en varmevikling , der sidder indvendigt i det rustfrie staalstykke , og saaledes er adskilt fra vakuumkammeret .   - Ovnlaaget er fremstillet af kobber , og har tre fordampningsaabninger med forskelligt tvaersnit , som er forskudt 90 * i forhold til hinanden . Ved drejning af ovnen kan en oensket ovnaabning eller en mellemstilling placeres under spalten i koeleren , som er placeret ekscentrisk i forhold til ovnen , saaledes at molekylstraalen rettes mod vaegtskaalen eller afboejes . Et termoelement eller modstandstermometer er monteret i ovnvaeggen til temperaturmaaling .   - Vaegten er et drejespoleinstrument . Viseren er erstattet med et lille roer , som vaegtbjaelken og modvaegt er monteret paa . Vaegtbjaelken har en udskiftelig vaegtskaal fremstillet af et tyndt stykke guldplateret aluminium . En 0,1 mm tyk konstartantraad , hvorpaa der kan anbringes justeringsvaegte , er fastgjort til vaegtbjaelkens omtrentlige center . Damptrykket kan registreres ved anvendelse af et fotoelektrisk nulpunktsinstrument .   - En cylinderisk messingbeholder omgiver vaegtskaalen til alle sider med undtagelse af de to spalter for vaegtbjaelkens bevaegelse og en snaever aabning til indfoering af molekylstraalen . Varmeafgivelse til omgivelserne tilvejebringes med en kobberstang , paa messingbeholderens top , og foeres via et rustfrit staalroer , som gaar gennem grundpladen og er varmeisoleret fra denne . Kobberstangen neddyppes i en Dewarflaske , som indeholder flydende nitrogen , under grundpladen .  1.6.4.2 . Maalemetode  Kobberovnen fyldes med stoffet , laaget lukkes og pladeaabningen , afskaermningen og koeleren foeres ned over ovnen . Klokken monteres , og vakuumpumperne startes . Sluttrykket foer maalingen begyndes , er ca . 10 -4 Pa . Fra 10 -2 Pa og nedefter startes koelingen af koeleboksen .  Efter et tidsrum vil vaegten have naaet en tilstraekkelig lav temperatur , saaledes at den udslippende dampstraale kan kondensere paa vaegtsaalen . Denne kondensation frembringer et signal paa den tilsluttede skriver . Signalet kan bruges paa to maader : med det specielle apparat , der beskrives her , bestemmes damptrykket direkte fra trykket paa vaegtskaalen ( molekylvaegten kraeves ikke ) . Samtidig bestemmes den kondenserede masse , og fordampningshastigheden kan derfor beregnes ud fra deponeringstiden . Dette gaelder for mere generelle apparater . Damptrykket kan ogsaa beregnes ud fra fordampningshastigheden og molekylvaegten under anvendelse af Herz' ligning : JFR . EFT  Efter at det noedvendige vakuum er naaet , begyndes maaleraekken startende ved den laveste af de oenskede maaletemperaturen . Den noedvendige aabning aabnes og dampstraalen passerer afskaermningen , som er direkte monteret over daekslet , og rammer derpaa den afkoelede vaegtskaal . Vaegtskaalen er dimensioneret saaledes , at hele straalen opsamles i dens cosinusformede fordeling . Dampstraalens moment fremkalder en kraft paa vaegtskaalen , hvor kondensationen sker paa dens afkoelede overflade . Som foelge af dampstraalens kraft vil vaegtbjaelken afvige fra ligevaegtstilstanden . Vaegtbjaelkens ende har en lille tap , som registreres optisk via et prismesystem og to fotodioder . Et tilsluttet reguleringskredsloeb regulerer og tilbagestiller momentant vaegtbjaelken til den balancerede stilling . Det noedvendige vridningsmoment registreres og svarer efter en kontrolvejning til stoffets damptryk .  Til yderligere maalinger haeves temperaturen med smaa intervaller indtil den hoejest oenskede temperaturvaerdi er naaet . Derefter koeles proeven igen og der kan registreres en anden kurve for damptrykket . De to maaleraekker vil kun vaere reproducerbare , hvis den maalte proeve er tilstraekkelig ren . Hvis den tredje forsoegsraekke ikke bekraefter resultaterne fra den anden raekke , er det sandsynligt , at stoffet soenderdeles i det maalte temperaturomraade .  1.6.5 . Gasmaetningsmetode  1.6.5.1 . Apparatur  Et typisk apparatur omfatter en raekke komponenter , som er vist paa figur 5 og beskrevet i det foelgende ( 1 ) .  Inaktiv gas  Baere-gassen maa ikke reagere kemisk med proevestoffet . Det er normalt tilstraekkeligt at anvende nitrogen til dette formaal , men lejlighedsvis kan der kraeves andre gasser . Den anvendte gas skal vaere toer ( se figur 5 ( 4 ) : Foeler . Relativ fugtighed ) .  Stroemningsregulering  Der kraeves et velegnet gasreguleringssystem for at sikre en konstant og valgbar stroemhastighed gennem maetningskolonnen .  Faelder til opsamling af damp  Disse afhaenger af den aktuelle proeves egenskaber og af den valgte analysemetode . Dampen boer indfanges kvantitativt og i en form , som tillader efterfoelgende analyse . Til visse stoffer vil faelder , som indeholder vaesker som hexan eller ethylenglycol , vaere velegnede . Til andre vil der kunne anvendes faste absorptionsmidler .  Varmeveksler  Til maalinger ved forskellige temperaturer kan det vaere noedvendigt at tilfoeje en varmeveksler i opstillingen .  Maetningskolonne  Stoffet coates i oploesning paa et egnet inaktivt baeremateriale . Det coatede baeremateriale pakkes i maetningskolonnen , hvis dimensioner samt stroemningshastigheden skal vaere saaledes , at en fuldstaendig maetning af baere-gassen sikres . Maetningskolonnen skal vaere termostateret . For maalinger ved temperaturer over 20 * C skal stykket mellem maetningskolonnen og faelderne vaere opvarmet for at undgaa kondensation af stoffet .  1.6.5.2 . Maalemetode  Klargoering af maetningskolonnen  En oploesning af proeven i et meget letflygtigt oploesningsmiddel saettes til en passende maengde af baerematerialet . Der skal tilsaettes tilstraekkeligt med proeve til opretholdelse af maetning under hele proevningens varighed . Oploesningsmidlet afdampes fuldstaendigt i luft eller i en rotationsfordamper , og det omhyggeligt blandede materiale tilfoeres maetningskolonnen . Efter at proeven er blevet termostateret , ledes toer nitrogen gennem apparatet .  Maaling  Faelderne forbindes med kolonnesystemet , og tiden registreres . Stroemningshastigheden kontrolleres i begyndelsen og med regelmaessige mellemrum under forsoeget ved anvendelse af en boblemaaler ( eller kontinuerligt med en massestroemningsmaaler ) .  Trykket ved tilledningen til maetningskolonnen skal maales . Dette kan goeres enten :  a ) ved at indsaette en trykmaaler mellem maetningskolonnen og faelderne ( dette paa grund af foroeget doedvolumen og adsorberende overflade ) ;  eller  b ) ved at bestemme tryktabene over det aktuelt anvendte system af faelder som funktion af stroemningshastigheden ved et separat forsoeg ( kan vaere lidet tilfredtillende for vaeskefaelder ) .  Den tid , der kraeves , til opsamling af den maengde proevestof , som er noedvendig for de forskellige analysemetoder , bestemmes ved et forhaandsforsoeg eller ved skoen . Foer beregning af damptrykket ved en given temperatur skal der udfoeres forhaandsforsoeg til bestemmelse af den maksimale stroemningshastighed , som maetter baere-gassen fuldstaendigt med stofdampe . Dett sikres , hvis baere-gassen foeres langsomt nok gennem maetningskolonnen til , at en endnu lavere hastighed ikke giver et stoerre beregnet damptryk .  Den specifikke analysemetode vil vaere bestemt af arten af det stof , der proeves ( f.eks . gaschromatografi eller gravimetri ) .  Stofmaengden , som transporteres med et kendt volumen baeregas , bestemmes .  1.6.5.3 . Beregning af damptryk  Damptrykket beregnes ud fra dampens massefylde W/V , efter ligningen : JFR . EFT  De maalte rumfang skal korrigeres for tryk - og temperaturforskelle mellem stroemningsmaaleren og den termostaterede maetningskolonne . Hvis stroemningsmaaleren , i stroemforloebet er placeret efter dampfaelden , kan det vaere noedvendigt at foretage korrektioner , der tager hensyn til eventuelle fordampede bestanddele fra faeldesystemet ( 1 ) .  2 . DATA  Damptrykket bestemt ved en hvilken som helst af de ovenfor beskrevne metoder boer bestemmes ved mindst to temperaturer . Tre eller flere er oenskelige i omraadet 0 * C til 50 * C , for at kontrollere damptrykkurvens liniaritet .  3 . RAPPORTERING  Foelgende oplysninger skal , om muligt , indeholdes i rapporten :   - praecis specifikation af stoffet ( identitet og urenheder ) ;   - mindst to vaerdier for damptrykket og temperatur helst i omraadet 0 * C - 50 * C . Den skal ogsaa indeholde alle de oprindelige resultater og en kurve over log p , som funktion af 1/T . Desuden skal en beregning af damptrykket ved 20 * C eller 25 * C anfoeres .  Hvis der forekommer overgange ( tilstandsaendring , soenderdeling ) boer foelgende oplysninger noteres :   - aendringens natur ;   - den temperatur , hvor aendringen sker ved atmosfaeretryk ;   - damptrykket ved 10 * C og 20 * C under overgangstemperaturen og 10 * C og 20 * C over denne temperatur ( med mindre overgangen er fra fast stof til gas ) .  Alle oplysninger og bemaerkninger , der er af betydning for fortolkningen af resultaterne , skal anfoeres .  Den anvendte metode skal anfoeres .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 104 . Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .   ( 2 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 104 ref .  ( 4 ) . Decision of the Council C ( 81 ) 30 Final .  Tillaeg  Figur 1  Apparat til bestemmelse af damptrykskurven ved den dynamiske metode : JFR . EFT  Figur 2  Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter den statiske metode : JFR . EFT  Figur 3  Isoteniskop ( ref . 2 ) : JFR . EFT  Figur 4  Apparat til bestemmelse af damptrykskurven efter dampstraalemetoden : JFR . EFT  Figur 5  Eksempel paa et stroemningssystem til bestemmelse af damptryk ved gasmaetningsmetoden : JFR . EFT  A . 5 . OVERFLADESPAENDING  1 . METODE  De beskrevne metoder er baseret paa OECD retningslinje for undersoegelse af kemikalier ( 1 ) .  1.1 . Indledning  De beskrevne metoder anvendes til maaling af vandige oploesningers overfladespaending .  Det er nyttigt at skaffe sig forhaandskendskab om stoffets vandoploeselighed , molekylestruktur , hydrolyseegenskaber samt den kritiske koncentration for micelledannelse , inden disse undersoegelser foretages .  De foelgende metoder kan anvendes for de fleste kemiske stoffer uden renhedsbegraensninger .  Maaling af overfladespaending ved ringtensiometermetoden er begraenset til vandige oploesninger med en dynamisk viskositet paa mindre end ca . 200 m Pa s .  1.2 . Definitioner og enheder  Den frie overfladeenthalpi pr . overfladearealenhed betegnes som overfladespaendingen . Overfladespaendingen angives som  N/m ( SI-enhed )  eller mN/m ( SI-underenhed ) .  1 N/m = 10 3 dyn/cm  1 mN/m = 1 dyn/cm i det gamle cgs-system .  1.3 . Referencestoffer  Det er ikke noedvendigt at anvende referencestoffer i alle tilfaelde , naar et nyt stof skal undersoeges .  Referencestoffer skal foerst og fremmest anvendes til lejlighedsvist at korrigere metoden , og til at muliggoere sammenligning af resultater fra andre maalemetoder .  Referencestoffer , som daekker et bredt udvalg af overfladespaendinger , er angivet i ref . ( 1 ) og ( 2 ) .  1.4 . Metodeprincipper  Metoden er baseret paa maaling af den stoerste kraft , der skal udoeves lodret paa en stigboejle eller ring i kontakt med vaeskeoverfladen af en proeve i et maalekar for at bryde denne kontakt , eller den lodrette kraft , som skal udoeves paa en plade , hvis ene kant er i kontakt med proeveoverfladen for at bryde den dannede hinde .  1.5 . Kvalitetskriterier  Disse metoder kan give stoerre noejagtighed , end der formentlig kraeves ved undersoegelser af miljoemaessig karakter .  1.6 . Beskrivelse af metoderne  1.6.1 . Plademetoden  Se ISO 304 ( " Surface Active Agents - Determination of Surface Tension by Drawing up Liquid Films " ) .  1.6.2 . Stigboejlemetoden  Se ISO 304 ( " Surface active Agents - Determination of Surface Tension by Drawing Up Liquid Films " ) .  1.6.3 . Ringmetoden  Se ISO 304 ( " Surface Active Agents - Determination of Surface Tension by Drawing Up liquid Films " ) .  1.6.4 . OECD-harmoniseret ringmetode  1.6.4.1 . Apparatur  Kommercielt tilgaengelige tensometre er tilstraekkelige til denne maaling . De bestaar af foelgende dele :   - bevaegeligt proevebord ,   - kraftmaalingssystem ,   - maalelegeme ( ring ) ,   - maalekar .  1.6.4.1.1 . Bevaegeligt proevebord  Det bevaegelige proevebord anvendes til understoettelse af det termostaterede maalekar , som rummer den vaeske , der skal undersoeges . Sammen med kraftmaalingssystemet er det monteret paa et stativ .  1.6.4.1.2 . Kraftmaalingssystem  Kraftmaalingssystemet ( se figur 1 ) er placeret over proevebordet . Usikkerheden ved kraftmaalingen maa ikke overstige mere aller mindre 10 -6 N , svarende til en usikkerhed paa mere aller mindre 0,1 mg ved en afvejning . Oftest er maaleskalaen paa de kommercielt tilgaengelige tensometre inddelt mN/m , saaledes at overfladespaendingen direkte kan aflaeses i mN/m med en noejagtighed paa 0,1 mN/m .  1.6.4.1.3 . Maalelegeme ( ring )  Ringen er saedvanligvis fremstillet af en platin-iridium traad med en tykkelse paa ca . 0,4 mm og en middelomkreds paa 60 mm . Traadringen er ophaengt vandret fra en metalstang og en traadbaerearm , som danner forbindelsen til kraftmaalingssystemet ( se figur ) .  Figur  Maalelegeme : JFR . EFT  1.6.4.1.4 . Maalekar  Maalekarret , som rummer proeveoploesningen , skal vaere et termostateret glaskar . Det skal vaere udformet saaledes , at temperaturen af proeveoploesningen og den overstaaende gasfase er konstant under maalingen , saaledes at proeven ikke kan fordampe . Cylindriske glaskar med en indre diameter paa mindst 45 mm er acceptable .  1.6.4.2 . Klargoering af apparatet  1.6.4.2.1 . Rengoering  Glaskar skal rengoeres omhyggeligt . Om noedvendigt skal de foerst vaskes med varm kromsvovlsyre og dernaest med en viskoes phosphorsyre oploesning ( 83 til 98 w/w % H3PO4 ) .  Herefter skylles omhyggeligt i ledningsvand og endeligt vaskes i redestilleret vand til neutral reaktion . Til sidst toerres karrene , eller de skylles i noget af den proevevaeske , som skal maales .  Ringen skal foerst renses grundigt i vand for at fjerne alle vandoploeselige stoffer . Derefter nedsaenkes den et oejeblik i kromsvovlsyre , vaskes i redestilleret vand til neutral reaktion og til sidst et oejeblik over en methanolflamme .  Bemaerk :  Forurening med stoffer , som ikke oploeses eller destrueres af kromsvovlsyre eller phosphorsyre , som f . eks . silikoner , skal fjernes ved hjaelp af et passende organisk oploesningsmiddel .  1.6.4.2.2 . Kalibrering af apparatet  Apparatet klargoeres ved at nulpunktet justeres , og apparatet indstilles til paalidelig aflaesning i mN/m .   - opstilling : Apparatet skal stilles i vater , f . eks . ved hjaelp af en spritlibelle paa tensiometrets fod , idet man justerer stilleskruerne .   - nulpunktsindstilling : Efter montering af ringen i apparatet , men inden den nedsaenkes i vaesken , skal tensometervisningen indstilles paa nul , og man kontrollerer , at ringen er parallel med vaeskeoverfladen . Til dette kan vaeskeoverfladen anvendes som et spejl .   - kalibreringer : proevekalibreringen kan udfoeres ved en af de foelgende to metoder :  a ) ved hjaelp af lodder : dette er en fremgangsmaade , hvor ryttere af kendt masse mellem 0,1 og 1,0 g anbringes paa ringen . Kalibreringsfaktoren a , som alle instrumentaflaesninger skal multipliceres med , bestemmes ifoelge ligning ( 1 ) : JFR . EFT  b ) ved hjaelp af vand : dette er en fremgangsmaade , hvor der anvendes rent vand , hvis overfladespaending ved f.eks . 23 * C er 72,3 mN/m . Denne fremgangsmaade er hurtigere at udfoere end vaegtkalibreringen , men der er altid en risiko for , at vandets overfladespaending er aendret ved forurening med spor af overfladeaktive stoffer .  Kalibreringsfaktoren F b , som alle instrumentaflaesninger skal multipliceres med , bestemmes ifoelge ligning  ( 2 ) : JFR . EFT  1.6.4.3 . Proeveforberedelse  Der fremstilles vandige oploesninger med passende koncentrationer af de stoffer , som skal undersoeges . Oploesningerne maa ikke indeholde uoploest stof .  Oploesningerne holdes ved konstant temperatur ( mere aller mindre 0,5 * C ) . Idet en oploesnings overfladespaending aendres i maalekarret med tiden , maa der foretages adskillige maalinger paa forskellige tidspunkter , og der laves en kurve , der viser overfladespaendingen som funktion af tiden . Naar overfladespaendingen ikke aendres yderligere , er ligevaegtstilstanden naaet .  Stoev og gasformig forurening med andre stoffer forstyrrer maalingen , hvorfor arbejdet boer udfoeres under et beskyttende daekke .  1.6.5 . Proevebetingelser  Maalingerne foretages ved ca . 20 * C og skal holdes inden for mere aller mindre 0,5 * C .  1.6.6 . Undersoegelsens udfoerelse  De oploesninger , som skal maales , fyldes i det omhyggeligt rengjorte maalekar , idet man undgaar skumning . Maalekarret anbringes paa apparatets proevebord . Bordet med maalekarret haeves , indtil ringen er nedsaenket fuldstaendigt i den oploesning , som skal maales . Derefter saenkes bordet jaevnt og gradvist med en hastighed paa ca . 0,5 cm/min , for at loesrive ringen fra overfladen indtil den stoerste kraft er naaet . Det vaeskelag som haenger ved ringen , maa ikke fjernes fra denne . Naar maalingen er udfoert , nedsaenkes ringen atter i vaesken , og maalingen gentages , indtil der opnaas konstante vaerdier for overfladespaendingen . Den tid , der er gaaet fra overfoering af oploesningen til maalekarret og til selve maalingen udfoeres , noteres ved hver bestemmelse . Aflaesningerne skal foretages ved den stoerste kraft , som kraeves til loesrivning af ringen fra vaeskeoverfladen .  2 . DATA  For at beregne overfladespaendingen skal den vaerdi , som er aflaest i mN/m paa apparatet , foerst multipliceres med kalibreringsfaktoren F a eller F b ( afhaengigt af den anvendte kalibreringsmetode ) . Dette giver en vaerdi , som kun gaelder tilnaermelsesvist , og som derfor kraever korrektion .  Harkins og Jordan ( 3 ) har empirisk bestemt korrektionsfaktorer for vaerdier af overfladespaendingen , som er bestemt med ringmetoden ; disse faktorer afhaenger af ringens dimensioner , vaeskens massefylde og dens overfladespaending .  Da det er besvaerligt for hvert enkelt maaling at bestemme korrektionsfaktoren ud fra Harkins og Jordans tabeller for at beregne overfladespaending , kan man for vandige oploesninger benytte en forenklet metode , hvor de korrigerede vaerdier for overfladespaendingen direkte aflaeses i den nedenstaaende tabel ( der anvendes interpolation til aflaesninger , som ligger mellem tabelvaerdierne ) .  TABEL : KORREKTION AF DEN MAALTE OVERFLADESPAENDING  Kun for vandige oploesninger , p = 1 g/cm3  R = 9,55 mm ( gennemsnitlig ringradius )  r = 0,185 mm ( ringtraadens radius )  Eksperimentel vaerdi ( mN/m ) * Korrigeret vaerdi  ( mN/m ) *   * kalibrering ( se 1.6.4.2.2 . a ) * kalibrering  ( se 1.6.4.2.2 . b ) *  20 * 16,9 * 18,1 *  22 * 18,7 * 20,1 *  24 * 20,6 * 22,1 *  26 * 22,4 * 24,1 *  28 * 24,3 * 26,1 *  30 * 26,2 * 28,1 *  32 * 28,1 * 30,1 *  34 * 29,9 * 32,1 *  36 * 31,8 * 34,1 *  38 * 33,7 * 36,1 *  40 * 35,6 * 38,2 *  42 * 37,6 * 40,3 *  44 * 39,5 * 42,3 *  46 * 41,4 * 44,4 *  48 * 43,4 * 46,5 *  50 * 45,3 * 48,6 *  52 * 47,3 * 50,7 *  54 * 49,3 * 52,8 *  56 * 51,2 * 54,9 *  58 * 53,2 * 57,0 *  60 * 55,2 * 59,1 *  62 * 57,2 * 61,3 *  64 * 59,2 * 63,4 *  66 * 61,2 * 65,5 *  68 * 63,2 * 67,7 *  70 * 65,2 * 69,9 *  72 * 67,2 * 72,0 *  74 * 69,2 * - *  76 * 71,2 * - *  78 * 73,2 * - *  Denne tabel er udarbejdet paa basis af Harkins-Jordan korrektioner , og lignes den i DIN standarden ( DIN 53914 ) for vand og vandige oploesninger ( massefylde p = 1 g/cm3 ) og for en kommerciel tilgaengelig ring med dimensionerne R = 9,55 mm ( middelringradius ) og r = 0,185 mm  ( ringtraadens radius ) . Tabellen angiver korrigerede vaerdier for overfladespaendingen , maalt efter kalibrering med lodder eller vand .  Alternativt kan overfladespaending uden forudgaaende kalibrering beregnes efter foelgende formel : JFR . EFT  3 . RAPPORTERING  Undersoegelsesrapporten skal , om muligt , mindst indeholde foelgende oplysninger :   - Anvendt metode : ISO eller OEDC-harmoniseret ringtensometermetode .   - Anvendte type vand eller oploesning .   - Noejagtig specifikation af stoffet ( identitet og urenheder )   - Maaleresultater : Overfladespaending ( aflaesning ) med angivelse af baade de enkelte maalinger , deres middelvaerdi og den korrigerede middelvaerdi ( med hensyn til apparatfaktoren og korrektionstabellen ) .   - Proeveoploesningens koncentration .   - Undersoegelsestemperaturen .   - Den anvendte oploesnings alder , og specielt den forloebne tid mellem fremstillingen og maalingen af oploesningen .   - Beskrivelse af overfladespaendingens tidsafhaengighed efter overfoering til maalekarret .   - Alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for vurdering af resultaterne skal anfoeres , herunder specielt hvad angaar urenheder og stoffets fysiske tilstand .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 115 - Decision of the Council C(81 ) 30 Final .   ( 2 ) Pure and Applied Chem , Vol . 48 , 1976 , p . 511 .   ( 3 ) Harkins , W . D . , Jordan , H . F . , J Amer . Chem . Soc . , Vol . 52 , 1930 , p . 1751 .  A . 6 . VANDOPLOESELIGHED  1 . METODE  De beskrevne metoder er baseret paa OECD retningslinje for undersoegelse af kemikalier ( 1 ) .  1.1 . Indledning  Det er vaerdifuldt at have forhaandsinformation om stoffets struktur formel , damptryk , dissociationskonstant og hydrolyseegenskaber ( som funktion af pH ) for at udfoere denne proevning .  Der findes ikke tilgaengeligt én enkelt metode , der daekker hele omraadet af oploeseligheder i vand .  Metoden egner sig ikke til flygtige stoffer .  De to proevningsmetoder , der er beskrevet nedenfor , daekker hele omraadet af oploeseligheder :   - en der kan anvendes til stoffer , som i det vaesentlige , er rene , med lave oploeseligheder  ( < 10 -2 g/l ) og som er stabile i vand , betegnet  " kolonne-eluerings-metoden " ,   - den anden , der kan anvendes til hovedsagligt rene stoffer med stoerre oploeseligheder ( < 10 -2 g/l ) , og som er stabile i vand , betegnet " kolbe-metoden " .  De undersoegte stoffers vandoploeselighed kan i betragtelig grad afhaenge af tilstedevaerelsen af urenheder .  1.2 . Definitioner og enheder  Et stofs oploeselighed i vand angives ved maetningskoncentrationen af stoffet i vand ved en given temperatur . Oploeseligheden i vand angives i enheden masse pr . rumfang oploesning . SI-enheden er kg/m3 ( g/l kan ogsaa anvendes ) .  1.3 . Referencematerialer  Referencematerialer behoever ikke anvendes i alle tilfaelde naar et nyt stof undersoeges . De boer fortrinsvis tjene som kontrol af metodens ydeevne fra tid til anden og for at give mulighed for sammenligning af resultater opnaaet med andre metoder .  1.4 . Proevningsmetodens princip  Den omtrentlige maengde af proeven og tiden , der er noedvendig til at opnaa maetningskoncentrationen , boer bestemmes ved en simpel foreloebig undersoegelse .  1.4.1 . Kolonne-eluerings-metoden  Denne metode er baseret paa eluering af det undersoegte stof med vand fra en mikrokolonne , der er fyldt med et inert baeremateriale saasom glaskugler , silicagel eller sand og et overskud af det undersoegte stof . Vandoploeseligheden bestemmes , naar koncentrationen i eluatet bliver konstant . Dette fremkommer som et koncentrationsplateau som en funktion af tiden .  1.4.2 . Kolbe-metoden  Ved denne metode oploeses stoffet ( faste stoffer skal pulveriseres ) i vand ved en temperatur noget over proevningstemperaturen . Naar maetning er opnaaet , afkoeles blandingen til proevningstemperatur og holdes der under omroering saa laenge , som det er noedvendigt for at opnaa ligevaegt ( 2 ) . Derefter bestemmes vaegt-koncentrationen af stoffet i den vandige oploesning , der ikke maa indeholde uoploeste partikler , ved en passende analysemetode .  1.5 . Kvalitetskriterier  1.5.1 . Repeterbarhed  For kolonne-eluerings-metoden er < 30 % opnaaelig ; for kolbe-metoden boer den vaere < 15 % .  1.5.2 . Foelsomhed  Denne afhaenger af analysemetoden , men massekoncentrationsbestemmelser ned til mindst 10 -6 g/l kan foretages .  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Proevningsbetingelser  Proevningen udfoeres helst ved 20 * C mere aller mindre 0,5 * C . Hvis der er mistanke om , at oploeseligheden er temperaturafhaengig ( > 3 % / * C ) , der ogsaa udfoeres undersoegelser ved to andre temperaturer , der er mindst 10 * C over og under den foerst valgte temperatur . I saa tilfaelde maa temperaturkontrollen vaere mere aller mindre 0,1 * C . Den valgte temperatur boer holdes konstant i alle relevante dele af udstyrret ( inklusive niveaubeholderen ) .1.6.2 . Foreloebig undersoegelse  Til ca . 0,1 g af proeven ( faste stoffer maa vaere pulveriserede ) i et 10 ml gradueret maaleglas med glasprop saettes stigende maengder destilleret vand ved stuetemperatur , efter de i tabellen nedenfor angivne trin .  0,1 g stof oploeselig i " x " ml vand * 0,1 * 0,5 * 1 * 2 * 10 * 100 * > 100 *  anslaaet oploeselighed ( g/l ) * > 1 000 * 1 000 - 200 * 200 - 100 * 100 - 50 * 50 - 10 * 10 - 1 * < 1 *  Efter hver tilsaetning af den angivne maengde vand til blandingen , omrystes kraftigt i 10 minutter , og det undersoeges visuelt , om der er noget uoploest af proeven tilbage . Hvis proeven eller dele af proeven forbliver uoploest , efter at 10 ml er tilsat , overfoeres indholdet i maaleglasset til et 100 ml maaleglas , som derefter fyldes op til 100 ml med vand og omrystes . Ved lavere oploeseligheder kan den tid , der kraeves til oploesning af et givet stof , vaere betragteligt laengere ( der boer tillades 24 timer ) . Den anslaaede oploeselighed er angivet i tabellen under det rumfang af tilsat vand , der netop foraarsagede en fuldstaendig oploesning af proeven . Hvis stoffet stadig er tilsyneladende uoploest , boer der foretages yderligere fortynding for at sikre at hverken kolonne-eluerings - eller kolbe-metoden kan anvendes .  1.6.3 . Kolonne-eluerings-metoden  1.6.3.1 . Baeremateriale , oploesningsmiddel og elueringsmiddel  Baerematerialet til kolonne-eluerings-metoden skale vaere inert . Mulig materialer , der kan anvendes , er glaskugler og siliciumdioxyd . Et passende flygtigt oploesningsmiddel af analyse kvalitet boer anvendes til at overfoere det undersoegte stof til baerematerialet . Dobbelt destilleret vand fra glas - eller kvartsapparatur boer anvendes som oploesnings - og elueringsmiddel .  Bemaerk :  Vand direkte fra en organisk ionbytter maa ikke anvendes .  1.6.3.2 . Afsaetning paa baerematerialet  Ca . 600 mg baeremateriale afvejes og overfoeres til en 50 ml rundbundet kolbe .  En passende , afvejet maengde af proeven oploeses i det valgte oploesningsmiddel . En passende maengde af proeveoploesningen saettes til baerematerialet . Oploesningsmidlet skal afdampes fuldstaendigt , f.eks . i en rotationsinddamper : i modsat fald vil der ikke kunne opnaas en maetning af baerematerialet med vand som foelge af fordelingseffekter paa overfladen af baerematerialet .  Afsaetningen paa baerematerialet kan give problemer  ( fejlagtige resultater ) , hvis det undersoegte stof afsaettes som en olie eller i en anden krystalstruktur . Dette problem maa undersoeges eksperimentelt .  Det behandlede baeremateriale henstilles til kvaeldning i ca . to timer i ca . 5 ml vand , hvorefter suspensionen overfoeres til mikrokolonnen . Alternativt kan det toerre behandlede baeremateriale haeldes i mikrokolonnen , der er fyldt med vand , og derefter henstaa i ca . to timer til opnaaelse af ligevaegt .  Proevningsprocedure :  Elueringen af stoffet fra baerematerialet kan udfoeres paa en af de to forskellige maader :   - med cirkulationspumpe ( se figur 1 )   - med niveaubeholder ( se figur 4 ) .  1.6.3.3 . Kolonne-eluerings-metoden med recirkulationspumpe  Apparatur  En skematisk gengivelse af et typisk system er vist i figur 1 . En egnet mikrokolonne er vist i figur 2 , omend en hvilken som helst stoerrelse kan anvendes , forudsat , at den opfylder kriterierne for reproducerbarhed og foelsomhed . Kolonnen boer have et head-space paa mindst fem bed-volumen vand plus mindst fem proever . Alternativt kan stoerrelsen reduceres , hvis der anvendes tilsaetning af oploesningsmiddel som erstatning for de foerste fem bed-rumfang , der fjernes med urenheder .  Kolonnen skal forbindes til en recirkulationspumpe , der er i stand til at kontrollere stroemninger paa ca . 25 ml/h . Pumpen forbindes med tilslutning af polytetrafluoroethylen og/eller glas . Kolonnen og pumpen skal , naar de er forbundet , give mulighed for at udtage proever af den eluerede vaeske og for aekvilibrering af head-space ved atmosfaeretryk . Kolonnematerialet holdes oppe med en lille ( 5 mm ) prop af glasuld , der ogsaa fungerer som filter for partikler . Recirkulationspumpen kan f.eks . vaere en slangepumpe ( man maa vaere omhyggelig med ikke at faa kontaminering af og/eller sorption paa slangematerialet ) eller en membranpumpe .  Maaleprocedure  Stroemningen gennem kolonnen startes . Det anbefales at bruge en stroemningshastighed paa ca . 25 ml/h  ( ca . ti bed-rumfang pr . time for den beskrevne kolonne ) . De foerste fem bed-rumfang ( minimum ) bortkastes for at fjerne vandoploeselige urenheder . Derefter koerer recirkulationspumpen til der er opnaaet ligevaegt , defineret ved , at fem paa hinanden foelgende proever giver koncentrationer , der ikke afviger mere end mere aller mindre 30 % paa tilfaeldig maade . Disse proever boer vaere adskilt fra hinanden ved tidsintervaller , der svarer til et gennemloeb af mindst ti bed-rumfang af oploesningsmiddel .  1.6.3.4 . Kolonne-eluerings-metoden med niveaubeholder  Apparatur - ( se figur 4 og 3 )  Niveaubeholder : Forbindelsen til niveaubeholderen etableres ved at anvende et glasslibovergangsstykke , der tilsluttes med en PTFE-slange . Det anbefales , at der anvendes en gennemstroemningshastighed paa ca . 25 ml/h . Successive fraktioner af eluatet opsamles og analyseres efter den valgte metode .  Maaleprocedure .  Fraktioner fra det midterste elueringsomraade , hvor koncentrationerne er konstante ( mere aller mindre 30 % ) i mindst fem paa hinanden foelgende proever , anvendes til at bestemme oploeseligheden i vand .  Et andet forsoeg udfoeres med halvt saa hoej gennem-stroemningshastighed som det foerste . Hvis resultaterne fra de to forsoeg stemmer overens , er analysen tilfredsstillende ; hvis der er en stoerre oploeselighed ved den lavere hastighed , maa halveringen af gennem-stroemningshastigheden fortsaettes , indtil to paa hinanden foelgende proevninger giver den samme oploeselighed .  I begge tilfaelde ( anvendelse af recirkulationspumpe eller niveaubeholder ) boer fraktionerne kontrolleres for tilstedevaerelsen af kolloidt materiale ved undersoegelse for Tyndall-effekt ( lysspredning ) . Tilstedevaerelsen af saadanne partikler oedelaegger resultaterne , og proevningen boer gentages med forbedring af kolonnens filtreringsformaaen . pH i hver proeve skal registreres . Endnu et forsoeg skal udfoeres ved samme temperatur .  1.6.4 . Kolbe-metoden  1.6.4.1 . Apparatur  Til kolbe-metoden kraeves foelgende udstyr :   - normalt laboratorieglasudstyr og -instrumentering ,   - udstyr til bevaegelse af oploesninger ved kontrolleret konstant temperatur ,   - en centrifuge ( helst termostateret ) , om noedvendigt ved emulsioner , og   - udstyr til analytisk bestemmelse .  1.6.4.2 . Maaleprocedure  Maengden af materiale , der er noedvendig for at maette det oenskede rumfang vand , er anslaaet ved den foreloebige undersoegelse . Det fornoedne rumfang vand vil afhaenge af den analytiske metode og oploeselighedsomraadet . Ca . fem gange maengden af stof , der er bestemt ovenfor , afvejes i hver af tre beholdere med glaspropper ( f.eks . centrifugeglas , kolber ) . Det valgte rumfang vand saettes til hver beholder , og beholderne lukkes helt taet . De lukkede beholdere bevaeges derefter ved 30 * C .   ( Ryste - eller omroererudstyr , der kan operere ved konstant temperatur , boer anvendes , f.eks . magnetomroering i et termostatbad ) . Efter en dag fjernes én af beholderne , og den henstilles til opnaaelse af ligevaegt i 24 timer ved den oenskede temperatur og lejlighedsvis omrystning . Indholdet i beholderen centrifugeres derfter ved proevningstemperaturen , og koncentrationen af forbindelsen i den klare vandige fase bestemmes med en passende analysemetode . De andre to kolber behandles paa samme maade efter forudgaaende opnaaelse af ligevaegt ved 30 * C i henholdsvis to og tre dage . Hvis koncentrationsresultaterne fra mindst to af beholderne er i overensstemmelse med den forlangte reproducerbarhed , er proevningen tilfredsstillende . Hele forsoeget boer gentages under anvendelse af laengere tider til opnaaelse af ligevaegt , hvis resultaterne fra beholder 1 , 2 og 3 viser en stigende tendens .  pH i hver proeve boer noteres .  1.6.5 . Analyser  En stofspecifik analysemetode foretraekkes til disse bestemmelser , eftersom smaa maengder af oploeselige urenheder kan foraarsage store fejl i den maalte oploeselighed . Eksempler paa saadanne metoder er : gas - eller vaeskechromatografi , titreringsmetoder , photometriske metoder , voltametriske metoder .  2 . DATA  2.1 . Kolonne-eluerings-metoden  Middelvaerdien samt standardafvigelsen for mindst fem paa hinanden foelgende proever taget ved maetningsplateauet boer udregnes for hvert forsoeg .  2.2 . Kolbe-metoden  De enkelte resultater skal angives for hver af de tre kolber , og for de resultater , der skoennes at vaere konstante ( repeterbarhed mindre end 15 % ) , beregnes gennemsnittet og det angives i masseenheder pr . oploesningsvolumen . Dette kan kraeve en omsaetning af masseenheder til volumen , under anvendelse af densitete , hvis oploeseligheden er meget hoej ( > 100 g/1 ) .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Kolonne-eluerings-metoden  Rapporten skal , om muligt , omfatte en angivelse af resultater fra den foreloebige undersoegelse samt foelgende oplysninger :   - praecis specifikation af stoffet ( identitet og urenheder ) ,   - de enkelte koncentrationer , gennem stroemningshastigheder og pH for hver proeve ,   - middelvaerdier og standardafvigelser for mindst fem proever fra maetningsplateauet fra hvert forsoeg ,   - gennemsnittet for to successive , acceptable forsoeg ,   - vandtemperaturen under maetningsprocessen ,   - den anvendte analysemetode ,   - arten af det anvendte baeremateriale ,   - afsaetning paa baerematerialet ,   - anvendt oploesningsmiddel ,   - tegn paa eventuel kemisk instabilitet af stoffet under proevningen og den anvendte metode ,   - alle oplysninger , der er af betydning for fortolkningen af resultaterne .  3.2 . Kolbe-metoden  Rapporten skal omfatte foelgende oplysninger :   - praecis specifikation af stoffet ( identitet og urenheder ) ,   - de enkelte analytiske bestemmelser og gennemsnittet , naar der er bestemt mere end en vaerdi for hver kolbe ,   - pH i hver proeve ,   - gennemsnitsvaerdien for de forskellige kolber , der stemte overens ,   - analysetemperaturen ,   - den anvendte analysemetode ,   - beviser for kemiske ustabiliteter af stoffet under forsoeget og den anvendte metode .   - alle oplysninger , der er af betydning for fortolkningen af resultaterne .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris 1981 , Test Guideline 105 . Decision of the Council C(81 ) 30 Final .   ( 2 ) OECD , Paris 1981 , Test Guideline 116 . Decision of the Council C(81 ) 30 Final .  Tillaeg  Figur 1  Skematisk forsoegsopstilling : JFR . EFT  Figur 2  En typisk mikrokolonne : JFR . EFT  Figur 3  En typisk mikrokolonne : JFR . EFT  Figur 4  Proevningsopstilling til bestemmelse af oploeseligheden i vand af tungt oploeselige , svagt flygtige stoffer : JFR . EFT  A . 7 . FEDTOPLOESELIGHED  1 . METODE  De beskrevne metoder er baseret paa OECD retningslinje for undersoegelse af kemikalier ( 1 ) .  1.1 . Indledning  Det er vaerdifuldt at have forhaandsinformation om stoffets fordelingskoefficient , vandoploeselighed , strukturformel og stabilitet ved 50 * C for at udfoere denne proevning . Denne metode er kun anvendelig til saadanne stoffer , som i det vaesentlige er rene , som er stabile ved 50 * C og som ikke er naevnevaerdigt flygtige under de samme betingelser .  Metoden er uegnet til stoffer , som reagerer med triglycerider .  1.2 . Definitioner og enheder  Den vaegtfraktion af et stof , som danner en homogen fase med et flydende fedtstof ( olie ) uden at give anledning til kemiske reaktioner , defineres som fedtoploeseligheden . Den stoerste af saadanne vaegtfraktioner kaldes maetnings-vaegtfraktionen , og denne er en funktion af temperaturen .  Et stofs maetnings-vaegtfraktion boer angives i mg/100 g af standardfedt ved 37 * C mere aller mindre 0,5 * C .  Der eksisterer foelgende sammenhaeng mellem oploeseligheden i g pr . 100 g oploesning ( S' ) og oploeseligheden i g pr . 100 g oploesningsmiddel ( S ) : JFR . EFT  Multiplikation af S-vaerdien med 1 000 giver mg/100 g standardfedtstof .  1.3 . Referencematerialer  Referencematerialer behoever ikke at anvendes i alle tilfaelde ved undersoegelsen af et nyt stof . De skal primaert tjene til at kontrollere metodens ydeevne fra tid til anden og for at give mulighed for sammenligning med resultater opnaaet med andre metoder .  1.4 . Metodens princip  Stoffet saettes til et flydende " standardfedtstof " og omroeres . Der tilsaettes saa meget af stoffet , at der med sikkerhed er overskud . Den oploeste stofmaengde bestemmes ved en egnet analysemetode .  1.5 . Kvalitetskriterier  1.5.1 . Specificitet  Repeterbarheden af maalingen er endnu ukendt .  Resultaterne boer gaelde for standardfedtstoffer , og er relevante for relativt rene stoffer . Selv ved 37 * C kan fedtstoffer danne fine emulsioner eller fine suspensioner med faste stoffer . Eftersom disse vil forstyrre den efterfoelgende bestemmelse af vaegtfraktionen , maa dannelsen af saadanne undgaas .  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Forberedelse  1.6.1.1 . Apparatur  Foelgende udstyrsdele er noedvendige :   - normalt laboratorieglasudstyr ,   - vaegt ,   - termostateret centrifuge ,   - omroerer der kan anvendes i kombination med temperaturkontrolsystem ,   - termostat .  1.6.1.2 . Standardfedtstoffer  Det er noedvendigt at anvende standardfedtstoffer . Disse standardfedtstoffer boer vaere lette at definere , og et eksempel paa et saadant standardfedtstof er angivet i bilaget .  1.6.1.3 . Foreloebig undersoegelse  En simplificeret foreloebig undersoegelse boer udfoeres , for at kunne bestemme den omtrentlige maengde af stof , der er noedvendig for at opnaa maetnings-vaegtfraktionen ved proevningstemperaturen ( 37 * C ) .  Bemaerk :  Hastigheden , hvormed maetningsligevaegten opnaas , kan vaere staerkt afhaengig af partikelstoerrelsen , for saa vidt angaar faste stoffer . Derfor boer saadanne materialer pulveriseres .  1.6.1.4 . Forberedelse af stoffet  Afvej 8 proever i 50 ml kolber . Normalt boer hver portion vaere den dobbelte maengde af , hvad der er fundet noedvendigt til maetning ved den foreloebige undersoegelse .  Efter tilsaetning af afvejet maengde paa omtrent 25 g flydende og blandet standardfedtstof udstyres kolberne med omroerere , og lukkes taet til med glaspropper . Halvdelen ( gruppe I ) omroeres ved 30 * C og den anden halvdel ( gruppe II ) ved ca . 50 * C , begge i mindst en time .  1.6.2 . Proevningsbetingelser  Bestemmelsen af fedtoploeseligheden udfoeres ved 37 * C mere aller mindre 0,5 * C .  1.6.3 . Maaleprocedure  Omroer indholdet af kolberne i begge grupper ved 37 * C mere aller mindre 0,5 * C indtil de er omhyggeligt opblandet .  Den omroeringstid , der kraeves for at opnaa ligevaegt , kan ikke forudsiges generelt . Ved flydende stoffer kan maetning opnaas paa faa minutter ; ved faste stoffer kan det tage timer . Almideligvis vil det ikke vaere noedvendigt med mere end tre timers omroering ; derefter kan omroeringen standses for to kolber i begge grupper , og disse kolber skal henstaa i mindst en time ved 37 * C for at skille det uoploeselige stof fra og for at tillade dannelse af en homogen fase . Emulsions - eller suspensionsdannelse  ( f.eks . Tyndall-effekt ) maa forhindres ved en passende metode , saasom termostateret centrifugering .  Den tredje og den fjerde kolbe i begge grupper boer omroeres i mindst 24 timer , foer de henstaar en time ved 37 * mere aller mindre 0,5 * C .  Bemaerk :  Hvis der ikke dannes bundfald ( for faste stoffer ) , eller der ikke sker faseadskillelse ( for flydende stoffer ) efter denne periode , maa proevningen gentages med en stoerre maengde stof .  1.6.4 . Analyse  Der udtages én proeve fra hver maettet fedtfase til analyse . Denne proeve vejes , og vaegtfraktionen bestemmes . Enhver egnet analysemetode kan anvendes , enten direkte eller efter ekstraktion med vand eller et organisk oploesningsmiddel , eller enhver anden seperationsmetode .  Eksempler paa saadanne metoder er :   - spektrofotometri ,   - gas - eller vaeskechromatografi ,   - voltametri .  2 . DATA  Hvis der er signifikante forskelle i resultaterne fra enten over-/undermaetningsforsoegene eller kort-/langtidsperioderne , maa proeven gentages med laengere omroeringstider .  3 . RAPPORTERING  Foelgende oplysninger skal , om muligt , omfattes af rapporten :   - praecis specifikation af stoffet ( identitet og urenheder ) ,   - praecis specifikation af fedtstoftet ( f.eks . beskrivelse , karakteristika , oprindelse , sammensaetning ) ,   - analysemetode , afvigelser og specielle traek .  Resultaterne maa vurderes som beskrevet ovenfor , og de udgoer en del af forsoegsrapporten . Hvis der ikke er nogen signifikante forskelle mellem de forskellige observerede vaerdier i mg pr . 100 g , boer de individuelle resultater , middelvaerdien og standardafvigelsen rapporteres . Hvis der er signifikante forskelle , selv efter fornyet proevning , anfoeres kun de individuelle resultater .  Alle oplysninger og bemaerkninger , der er af betydning for fortolkningen af resultaterne , skal anfoeres .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD Paris 1981 . Test-Guideline 116 . Decision of the Council C(81 ) 30 . Final .  Bilag  EKSEMPEL PAA ET STANDARDFEDTSTOF  Nedenstaaende tabel viser sammensaetningen af et typisk standardfedtstof .  Fedtsyrefordeling  Antal C-atomer i fedtsyredelen * 6 * 8 * 10 * 12 * 14 * 16 * 18 * andre *  GLC-arealer ( % ) * 0,5 * 7,5 * 10,3 * 50,4 * 13,9 * 7,6 * 8,6 * 1 *  Glyceridfordeling  Antal C-atomer i fedtsyredelen * 22 * 24 * 26 * 28 * 30 * 32 * 34 * 36 * 38 * 40 * 42 * 44 * 46 * 48 * 50 *  GLC-arealer ( % ) * 0,1 * 0,3 * 1,0 * 2,3 * 4,9 * 10,9 * 13,9 * 21,1 * 16,1 * 11,7 * 9,8 * 4,4 * 2,2 * 1,1 * 0,2 *  Renhed  Monoglyceridindhold ( enzymatisk ) * 0,1 %  Diglyceridindhold ( enzymatisk ) * 0,4 %  Uforsaebeligt indhold * 0,1 %  Wijstal * 0,5 %  Syretal 0,02  Vandindhold ( K . Fischer ) * 0,1 %  Klart smeltepunkt 28,5 * C  Typisk absorptionsspektrum ( lagtykkelse d = 1 cm , reference : vand , 35 * C )  Boelgelaengde ( nm ) * 290 * 310 * 330 * 350 * 370 * 390 * 430 * 470 * 510 *  Transmission ( % ) * 2 * 15 * 37 * 64 * 80 * 88 * 95 * 97 * 98 *  Mindst 10 % lystransmission ved 303 nm  Dette fedtstof er en syntetisk blanding af maettede triglycerider med en fedtsyre og triglyceridfordeling , der svarer til kokosfedt .  A . 8 . FORDELINGSKOEFFICIENT  1 . METODE  De beskrevne metoder er baseret paa OECD retningslinje for undersoegelse af kemikalier ( 1 ) .  1.1 . Indledning  Det er vaerdifuldt at have forhaandsinformation om stoffets dissociationskonstant , vandoploeselighed og overfladespaending for at udfoere denne proevning .  Denne metoder er kun anvendelig til stoffer , der i det vaesentlige er rene , og som kan oploeses i vand og n-octanol . Den kan ikke anvendes til overfladeaktivt materiale .  1.2 . Definitioner og enheder  Fordelingskoefficienten ( P ) defineres som forholdet mellem ligevaegtskoncentrationerne ( c i ) for et stof oploest i et to-fasesystem bestaaende af to stort set ublandbare oploesningsmidler .  I tilfaeldet n-octanol og vand : JFR . EFT  Fordelingskoefficienten ( P ) defineres som forholdet mellem ligevaegtskoncentrationerne ( c i ) for et stof oploest i et to-fasesystem bestaaende af to stort set ublandbare oploesningsmidler .  1.3 . Referencematerialer  Referencematerialer behoever ikke anvendes i alle tilfaelde ved undersoegelsen af et nyt stof . De skal primaert tjene til at kontrollere metodens ydeevne fra tid til anden og for at give mulighed for at sammenligne resultater opnaaet ved andre metoder .  1.4 . Metodens princip  For at fordelingskoefficienten kan bestemmes , maa der opnaas ligevaegt mellem alle de medvirkende komponenter i systemet , og de oploeste stoffers koncentrationer i de to faser , skal bestemmes . En gennemgang af litteraturen om dette emne antyder , at der er mange forskellige teknikker , som kan bruges til at loese dette problem , det vil sige den omhyggelige blanding af de to faser efterfulgt af deres adskillelse for bestemmelse af ligevaegtskoncentrationerne for det undersoegte stof .  1.5 . Kvalitetskriterier  1.5.1 . Repeterbarhed  For at sikre fordelingskoefficientens noejagtighed skal der udfoeres dobbeltbestemmelser under tre forskellige proevningsbetingelser , hvorunder saavel maengden af det angivne stof som forholdet mellem volumen af oploesningsmidlerne kan varieres . De fundne vaerdier for fordelingskoefficienten udtrykt ved almindelige logaritmer boer falde indenfoer mere aller mindre 0,3-logaritmeenheder .  1.5.2 . Foelsomhed  Metodens maaleomraade bestemmes af analysemetodens detektionsgraense . Denne skal vaere tilstraekkelig til at tillade bestemmelsen af vaerdier af P ov op til 10 5 , naar koncentrationen af det oploeste stof i én af faserne ikke er stoerre end 0,01 mol/l .  1.5.3 . Specificitet  Nernst's fordelingslov gaelder kun ved konstant temperatur , tryk og pH og for tynde oploesninger . Den kan alene anvendes paa et rent stof , der fordeles mellem to rene oploesningsmidler . Hvis der forekommer flere oploeste stoffer i den ene eller i begge faser samtidig , kan dette paavirke resultaterne .  Dissociation eller association af de oploeste molekyler resulterer i afvigelser fra Nernst's fordelingslov . Saadanne afvigelser indiceres af det faktum , at fordelingskoefficienten bliver afhaengig af koncentrationen i oploesningen .  Paa grund af de mange ligevaegte der er involveret i naervaerende proevningsmetode , boer den ikke anvendes paa ioniserbare stoffer , uden at der foretages korrektioner . ( Anvendelsen af pufferoploesninger i stedet for vand boer tages i overvejelse for saadanne stoffer . )  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Foreloebigt skoen for fordelingskoefficienten  Fordelingskoefficientens vaerdi kan estimeres enten ved simple beregninger ( 2 ) eller ved anvendelse af proevens oploeselighed i de rene oploesningsmidler ( 1 ) .  Herved faas : JFR . EFT  Alternativt kan den bestemmes groft ved en simplificeret foreloebig undersoegelse .  1.6.2 . Forberedelser  n-octanol : Bestemmelsen af fordelingskoefficienten boer bestemmes under anvendelse af meget rene reagenser af analysekvalitet . Vand : Destilleret eller dobbeltdestilleret vand fra glas - eller kvartsapparatur boer anvendes .   ( Bemaerk :  Vand taget direkte fra en ionbytter boer ikke anvendes . )  1.6.2.1 . Formaetning af oploesningsmidlerne  Foer en fordelingskoefficient bestemmes , maettes de to faser gensidigt ved omrystning ved forsoegstemperaturen . Herved er det praktisk at omryste to store standflasker med meget ren n-octanol af analysekvalitet eller vand hver for sig med en tilstraekkelig maengde af det andet oploesningsmiddel i 24 timer paa et mekanisk rysteapparat , og derefter at lade flaskerne staa laenge nok til at sikre en fuldstaendig adskillelse af de to faser og en fuldstaendig maetning .  1.6.2.2 . Proevningsforberedelse  Det samlede rumfang af to fasesystemet skal fylde naesten hele analysebeholderen . Dette vil hjaelpe til at forhindre tab af materiale som foelge af fordampning . Forholdet mellem de to rumfang og maengden af stof , der skal anvendes , fastsaettes ud fra foelgende :   - den foreloebige bestemmelse af fordelingskoefficienten  ( se ovenfor ) ;   - den mindste proevemaengde der kraeves til den analytiske metode ;  og   - begraensningen ved en maksimal koncentration i én af faserne paa 0,01 mol/l .  Der udfoeres tre proevninger . I den foerste tilsaettes det beregnede volumenforhold ; i den anden tilsaettes det dobbelte volumen n-octanol ; og i den tredie tilsaettes det halve volumen n-octanol .  1.6.2.3 . Proeven  For at kunne lave en massebalance under forsoeget , fremstilles der en stamoploesning i n-octanol med en massekoncentration paa mellem 1 og 100 mg/ml . Den aktuelle massekoncentration i denne stamoploesning skal bestemmes praecist , inden den anvendes til bestemmelse af fordelingskoefficienten . Denne oploesning skal opbevares under stabile betingelser .  1.6.3 . Proevningsbetingelser  Proevningstemperaturen boer holdes konstant  ( mere aller mindre 1 * C ) og ligge i omraadet 20 * C - 25 * C .  1.6.4 . Maaleprocedure  1.6.4.1 . Opnaaelse af fordelingsligevaegt  To proevningsbeholdere , der indeholder de kraevede noejagtigt afmaalte maengder af de ro oploesningsmidler sammen med den noedvendige maengde af stamoploesningen , skal forberedes for hvert saet proevningsbetingelser .  Octanofaserne afmaales volumetrisk . Proevningsbeholderne boer enten placeres i et passende rysteapparat eller omrystes med haandkraft . En anbefalet metode er , at dreje et centrifugeglas hurtigt ca . 180 * om en akse vinkelret paa dets laengdeakse , saaledes at alt indespaerret luft stiger op gennem de to faser .  1.6.4.2 . Faseadskillelse  For at adskille faserne boer blandingen centrifugeres . Dette boer goeres i en laboratoriecentrifuge , holdt paa stuetemperatur , eller hvis der ikke benyttes en temperaturreguleret centrifuge , boer centrifugeglassene bringes i temperaturligevaegt ved proevningstemperatur i mindst 1 time foer analysen .  1.6.5 . Analyse  Til bestemmelse af fordelingskoefficienten er det noedvendigt at bestemme koncentrationerne af det undersoegte stof i begge faser . Dette kan goeres ved at udtage en aliquot fra hver af de to faser fra hver beholder fra hver proevningsbetingelse og analysere dem ved den valgte fremgangsmaade . Den totale maengde af stof , der findes i hver af faserne skal beregnes og sammenlignes med den maengde stof , der oprindelig blev tilsat .  Fra den vandige fase boer proevetagningen ske paa en saadan maade , at risikoen for at medtage spor af octanol minimeres : en glassproejte med en aftagelig kanyle kan anvendes til at udtage proever fra vandfasen . Sproejten fyldes foerst delvis med luft . Luften boer forsigtigt presses ud , mens kanylen foeres gennem octanolfasen . Et passende rumfang af vandfasen traekkes op i sproejten . Sproejten fjernes hurtigt fra oploesningen og kanylen tages af . Indholdet i sproejten kan da anvendes som den vandige proeve . Koncentrationen i de to adskilte faser skal helst bestemmes ved en stof-specifik metode . Eksempler paa fysisk-kemiske bestemmelser , der kan anvendes er :   - fotometriske metoder ,   - gaschromatografi ,   - hoejtryksvaeskechromatografi .  2 . DATA  Hvis den maalte P OV er stoerre end 10 4 , anbefales det , at resultaterne sammenlignes med beregnede P OV vaerdier , som for eksempel er fremkommet ved metoden angivet i ( 3 ) .  Paalideligheden af de bestemte vaerdier af P kan afproeves ved sammenligning af gennemsnitsvaerdierne for dobbeltbestemmelserne med det samlede gennemsnit .  3 . RAPPORTERING  Foelgende oplysninger skal , om muligt , omfattes af rapporten :   - Praecis specifikation af stoffet ( identitet og urenheder ) .   - Temperatur , hvorved bestemmelserne er udfoert .   - Data for de analytiske metoder , der er anvendt ved bestemmelsen af koncentrationerne .   - De maalte koncentrationer i begge faser for hver bestemmelse . ( Dette betyder , at i alt tolv koncentrationer skal angives . )   - Vaegten af det undersoegte stof , rumfanget af hver fase , der er anvendt i hver proevningsbeholder og den totale beregnede maengde proeve , der findes i hver fase efter ligevaegten er opnaaet .   - De beregnede vaerdier for fordelingskoefficienten  ( P ) og gennemsnittet skal anfoeres for hvert saet proevningsbetingelser , ligesom gennemsnittet for alle bestemmelserne . Hvis der er tegn paa koncentrationsafhaengighed for fordelingskoefficienten , boer dette anfoeres i rapporten .   - Standardafvigelsen for de individuelle P-vaerdier omkring deres middelvaerdi boer anfoeres .   - Middelvaerdien for P for alle bestemmelser skal ogsaa udtrykkes ved dens logaritme ( basis 10 ) .   - Den beregnede teoretiske P OV , naar denne vaerdi er bestemt , eller naar den maalte vaerdi er stoerre end 10 4 .   - pH i vandet , der er anvendt , og i vandfasen under forsoeget .   - Alle oplysninger og bemaerkninger , der er relevante for fortolkningen af resultaterne .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 107 . Decision of the Council C(81 ) 30 Final .   ( 2 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 107 . ref ( 2 ) Decision of the Council C(81 ) 30 Final .   ( 3 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 107 . ref ( 10 ) Decision of the Council C(81 ) 30 Final .  A . 9 . FLAMMEPUNKT  1 . METODE  1.1 . Indledning  Det er vaerdifuldt at have forhaandskendskab til stoffets antaendelighed for at udfoere denne proevning . Proevningsmetoden kan anvendes til flydende stoffer , som markedsfoert , hvis dampe kan antaendes af en antaendelseskilde . De i denne tekst beskrevne proevningsmetoder er kun paalidelige i de flammepunktsomraader , der er anfoert i de enkelte metoder .  1.2 . Definitioner og enhederFlammepunktet er den laveste temperatur , korrigeret til et tryk paa 101,325 kPa , ved hvilken den undersoegte maengde vaeske i en lukket proevningsbeholder , under de i proevningsmetoden definerede betingelser , udvikler dampe i et saadant omfang , at der dannes en braendbar damp/luft blanding i proevningsbeholderen .  Enheder : * C  t = T - 273,15   ( ti * C og T i K ) .  1.3 . Referencematerialer  Det er ikke noedvendigt at anvende referencematerialer i alle tilfaelde ved en undersoegelse af nye stoffer . De skal primaert tjene til at kalibrere metoden fra tid til anden og for at frembyde en mulighed for at sammenligne resultater , naar andre metoder anvendes .  1.4 . Metodens princip  Stoffet anbringes i en proevningsbeholder , som gradvis opvarmes , indtil dampene naar en tilstraekkelig hoej koncentration i luft til at danne en braendbar blanding , som kan antaendes .  1.5 . Kvalitetskriterier  1.5.1 . Repeterbarhed  Repeterbarheden varierer med flammepunktsomraadet og den anvendte proevningsmetode ; max . mere alle mindre 2 * C .  1.5.2 . Foelsomhed  Foelsomheden afhaenger af den anvendte proevningsmetode .  1.5.3 . Specificitet  Visse proevningsmetoders specificitet er begraenset til visse flammepunktsomraader og er afhaengig af stoffernes egenskaber ( f.eks . hoej viskositet ) .  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Forberedelse  En proeve af stoffet udtages og anbringes i et proevningsudstyr i henhold til 1.6.3.1 og/eller 1.6.3.2 .  1.6.2 . Proevingsbetingelser  Apparatet anbringes saa vidt muligt traekfrit .  1.6.3 . Udfoerelse af proevningen  1.6.3.1 . Ligevaegtsmetoden  se : ISO 1516 , ISO 3680 , ISO 1523 , ISO 3679 .  1.6.3.2 . Ikke-ligevaegtsmetoden  Abel apparat :  se : BS 2000 part 170 , NF M07-011 , NF T66-009 .  Abel-Pensky apparat :  se : ( EN 57 ) , DIN 51755 part 1 ( for temperaturer fra 5 til 65 * C ) og DIN 51755 part 2 ( for temperatur under 5 * C ) , NF M07-036 .  Tag apparat :  se : ASTM D 56 , ISO 2719 .  Pensky-Martens apparat :  se : ISO 2719 , ( EN 11 ) , DIN 51758 , ASTM 8013 , ASTM D 93 , BS 2000 part 34 , NF M07-019 .  Bemaerkninger :  Naar flammepunktet , bestemt ved ikke-ligevaegtsmetode i 1.6.3.2 , findes at vaere :  0 mere aller mindre 2 * C , 21 mere aller mindre 2 * C , 55 mere aller mindre 2 * C ,  boer det bekraeftes ved en ligevaegtsmetode under anvendelse af det samme apparat .  Kun de metoder , der kan give temperaturen for flammepunktet , kan bruges ved en anmeldelse .  Til bestemmelse af flammepunktet for tyktflydende vaesker ( malinger , lim og lignende ) indeholdende oploesningsmidler , maa der kun anvendes apparater og proevningsmetoder , som er velegnede til bestemmelse af tyktflydende vaeskers flammepunkt . Se : ISO 3679 , ISO 3680 , ISO 1523 , DIN 53213 , del 1 .  2 . DATA  3 . RAPPORTERING  Rapporten skal , om muligt , omfatte foelgende oplysninger :   - noejagtig specifikation af stoffet  ( identifikation og urenheder ) ,   - metoden skal anfoeres saavel som eventuelle afvigelser ,   - resultaterne og alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for fortolkningen af resultaterne maa rapporteres .  4 . REFERENCER  Ingen .  A . 10 . ANTAENDELIGHED - FASTE STOFFER  1 . METODE  1.1 . Indledning  Det er nyttigt at have forhaandskendskab til stoffets mulige eksplosive egenskaber foer proevningens udfoerelse .  Denne proevning boer kun anvendes paa pulverformige , granulaere og pastaagtige stoffer .  For ikke at medtage alle stoffer , der kan antaendes , men kun de stoffer , som braender hurtigt , eller som paa den ene eller den anden maade har saerligt farlige egenskaber ved forbraending , betragtes kun stoffer , hvis forbraendingshastighed overstiger en vis graensevaerdi , for at vaere letantaendelige . Desuden boer metalpulvere , som kan forgloede , ogsaa anses for at vaere let antaendelige , hvis forgloedningen forsaetter gennem proeven .  Saadan forgloedning og de dermed forbundne vanskeligheder ved at bekaempe en brand er hovedaarsagen til , at metalpulver er saerligt farlige . Normale slukningsmidler saasom kuldioxid og/eller vand kan foroege faren betydeligt .  1.2 . Definitioner og enheder  Forbraendingstiden udtrykkes i sekunder .  1.3 . Referencematerialer  Ikke specificeret .  1.4 . Metodens princip  Stoffet i dets kommercielle tilstand formes til en vold paa 250 mm . Derefter forsoeges proeven antaendt under de i 1.6.3 definerede betingelser og forbraendingstiden maales .  1.5 . Kvalitetskriterier  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Forberedelser  Hvis stoffet foreligger som pulver eller granulat , fyldes produktet i den tilstand , hvori det forhandles , loest i en form . Formen er fremstillet af metal , har en laengde paa 250 mm og triangulaert tvaersnit med indvendig hoejde paa 10 mm og indvendig bredde 20 mm . Paa hver side af formen i laengderetningen er monteret en metalplade , der rager 2 mm op over den oeverste kant af det triangulaere tvaersnit ( figur 1 ) . Formen bringes derefter til fald tre gange fra 2 cm's hoejde ned paa en fast overflade . Om noedvendigt efterfyldes formen . Derefter fjernes sidestykkerne og overskydende stof skrabes af . En ubraendbar og ikke-poroes plade anbringes oven paa formen , apparatet vendes og formen fjernes .  Pastaagtige stoffer bredes ud paa en ubraendbar overflade i form af en 250 mm lang poelse med et tvaersnitsareal paa ca . 1 cm2 .  En passende antaendingskilde saasom en lille flamme eller en gloedetraad med en temperatur paa mindst 1 000 * C anvendes til at taende volden i den ene ende .  1.6.2 . Proevningsbetingelser  Hvis stoffet er foelsomt overfor fugt , skal proevningen udfoeres saa hurtigt som muligt efter at stoffet er fjernet fra beholderen .  1.6.3 . Udfoerelse af proevningen  Antaend den ene ende af volden . Naar 80 mm af volden er braendt , maales forbraendingshastigheden over de naeste 100 mm . Proevningen udfoeres seks gange under anvendelse af et rent koldt underlag hver gang .  2 . DATA  Vaerdierne af forbraendingstiden , bestemt ved seks proevninger , er noedvendige for vurderingen .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Proevningsrapport  Rapporten skal , om muligt , indeholde foelgende oplysninger :   - praecis specifikation af stoffet ( identifikation og urenheder )   - en beskrivelse af det undersoegte materiale , dets fysiske tilstandsform inklusive indhold af fugtighed ,   - maaleresultaterne ,   - alle yderligere oplysninger , der er relevante for fortolkningen af resultaterne .  3.2 . Fortolkningen af resultaterne  Pulvere , granulater eller pastaagtige stoffer anses for at vaere letantaendelige , naar forbraendingstiden i en af de seks proevninger , udfoert i overensstemmelse med fremgangsmaaden , beskrevet i 1.6 . , er mindre end 45 sekunder . Pulvere af metaller eller metallegeringer anses for at vaere letantaendelige , hvis de kan antaendes , og flammen eller reaktionszonen udbredes over hele proeven .  4 . REFERENCER  Ingen  Tillaeg  Figur 1  Form og tilbehoer til tilberedning af proevevold : JFR . EFT  A . 11 . ANTAENDELIGHED - GASSER  1 . METODE  1.1 . Indledning  Denne metode goer det muligt at bestemme , om gasser i blanding med luft ved stuetemperatur og atmosfaeretryk har et antaendelsesomraade . Blandinger med stigende koncentrationer af proevegassen i luft udsaettes for en elektrisk gnist , og det iagttages , om der sker en antaendelse .  1.2 . Definitioner og enheder  Antaendelsesomraadet er koncentrationsomraadet mellem den nedre og den oevre eksplosionsgraense . Den nedre og den oevre eksplosionsgraense er de koncentrationsgraenser for den antaendelige gas i blanding med luft ved hvilke der ikke sker en flammeudbredelse .  1.3 . Referencemateriale  Ikke specificeret .  1.4 . Metodens princip  Koncentrationen af gas i luft oeges trinvis , og blandingen udsaettes ved hvert trin for en elektrisk gnist .  1.5 . Kvalitetskriterier  Ikke anfoert .  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Apparatur  Proevningsbeholderen er en opretstaende glascylinder med en indre diameter paa mindst 50 mm og en hoejde paa mindst 300 mm . Antaendelseselektroderne er placeret 60 mm over cylindernes bund med en indbyrdes afstand paa 3 til 5 mm . Cylinderen er forsynet med en trykudloesningsaabning . Apparatet skal afskaermes for at begraense eventuel eksplosionsskade .  Som antaendingskilde anvendes en staaende induktionsgnist med en varighed paa 0,5 sek . Den dannes af en hoejspaendingstransformator med udgangsspaending 10 til 15 kV ( hoejeste indgangseffekt 300 W ) .  1.6.2 . Proevningsbetingelser  Proevningen skal udfoeres ved stuetemperatur .  1.6.3 . Udfoerelse af proevningen  Under anvendelse af proportionalpumper indfoeres en bestemt koncentration af gas i luft i glascylinderen . En gnist foeres gennem blandingen , og det iagttages , om en flamme udskiller sig uafhaengigt . Gaskoncentrationen varieres i trin paa 1 vol % , indtil der sker antaendelse som beskrevet ovenfor .  2 . DATA  Forekomsten af en flammeudbredelse er det eneste relevante data for bestemmelsen af denne egenskab .  3 . RAPPORTERING  Rapporten skal , om muligt , omfatte foelgende oplysninger :   - noejagtig specifikation af stoffet ( identifikation og urenheder ) ;   - en beskrivelse , med dimensioner , af det anvendte apparat ;   - stuetemperaturen , hvorved proeven er udfoert ;   - de proevede koncentrationer og de opnaaede resultater ;   - proevningsresultatet : ubraendbar gas eller letantaendelig gas ;   - i tilfaelde af konklusionen : " ubraendbar " , skal det anfoeres , at alle koncentrationer er undersoegt ved at oege koncentrationen i trin paa 1 % fra 0 til 100 % ;   - alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for fortolkningen af resultaterne maa rapporteres .  4 . REFERENCER  Ingen .  A . 12 . ANTAENDELIGHED - STOFFER OG PRAEPARATER , DER I KONTAKT MED VAND ELLER FUGTIG LUFT UDVIKLER LET ANTAENDELIGE GASSER I FARLIGE MAENGDER  1 . METODE  1.1 . Indledning  Denne proevningsmetode kan bruges til at bestemme , om et stofs reaktion med vand kan medfoere udvikling af farlige maengder gas eller gasser , som kan vaere letantaendelige eller giftige . Proevningsmetoden kan anvendes baade til faste og flydende stoffer . Metoden kan ikke anvendes til stoffer , som antaender spontant ved kontakt med luft .  1.2 . Definitioner og enheder  Let antaendelig :  Stoffer og praeparater , som , ved kontakt med vand eller fugtig luft , udvikler let antaendelige gasser i farlige maengder med en mindste hastighed paa 1 liter/kg.h . Denne graense tager ikke hensyn til giftighed af gassen .  1.3 . Metodens Princip  Stoffet proeves i den nedenfor anfoerte trinvise raekkefoelge ; hvis der sker antaendelse paa noget trin , er yderligere proevning unoedvendig .  1.3.1 . Trin 1  Proeven anbringes i en beholder indeholdende destilleret vand ved 20 * C og det noteres , om den udviklede gas antaendes eller ikke .  1.3.2 . Trin 2  Proeven anbringes paa et filtrerpapir , som flyder paa overfladen af en skaal indeholdende destilleret vand ved 20 * C og det noteres , om den udviklede gas antaendes eller ikke . Filtrerpapiret tjener kun til at holde stoffet paa ét sted for at oege muligheden for antaendelse .  1.3.3 . Trin 3  Proeven formes til en vold ca . 2 cm hoej og 3 cm i diameter . Nogle faa draaber vand tilsaettes til volden og det noteres , om den udviklede gas antaendes eller ikke .  1.3.4 . Trin 4  Proeven blandes med destilleret vand ved 20 * C og gasudviklingens hastighed maales over en periode af syv timer med en times intervaller . Hvis udviklingshastigheden er ujaevn eller stigende efter syv timer , boer maaletiden udvides til i det hoejeste fem dage . Proevningen kan standses , hvis hastigheden paa noget tidspunkt overstiger 1 l/kg * h .  1.4 . Referencemateriale  Ikke specificeret .  1.5 . Kvalitetskriterier  Ikke angivet .  1.6 . Metodebeskrivelser  1.6.1 . Trin 1  1.6.1.1 . Proevningsbetingelser  Stoffet proeves som det er markedsfoert og proevningen udfoeres ved stuetemperatur ( ca . 20 * C ) .  1.6.1.2 . Udfoerelse af proevningen  En lille maengde ( ca . 2 mm i diameter ) proeve anbringes i en beholder indeholdende destilleret vand . Det noteres , om ( i ) der udvikles gas , og ( ii ) om der sker antaendelse af gassen . Hvis der sker antaendelse af gassen , er yderligere proevning af stoffet unoedvendig , idet stoffet betragtes som farligt .  1.6.2 . Trin 2  1.6.2.1 . Apparatur  Et filtrerpapir anbringes fladt flydende paa overfladen af destilleret vand i en egnet beholder , f.eks . en 100 mm afdampningsskaal .  1.6.2.2 . Proevningsbetingelser  Stoffet proeves som det er markedsfoert og proevningen udfoeres ved stuetemperatur ( ca . 20 * C ) .  1.6.2.3 . Udfoerelse af proevningen  En lille maengde ( ca . 2 mm i diameter ) proeve anbringes midt paa filtrerpapiret . Det noteres , om ( i ) der udvikles gas , og ( ii ) om der sker antaendelse af gassen . Hvis der sker antaendelse af gassen , er yderligere proevning af stoffet unoedvendig , idet stoffet betragtes som farligt .  1.6.3 . Trin 3  1.6.3.1 . Proevningsbetingelser  Stoffet proeves som det er markedsfoert og proevningen udfoeres ved stuetemperatur .  1.6.3.2 . Udfoerelse af proevningen  Proeven formes som en vold , ca . 2 cm hoej og 3 cm i diameter med en fordybning i toppen . Nogle faa draaber vand tilsaettes i fordybningen , og det noteres , om ( i ) der udvikles gas , og ( ii ) om der sker antaendelse af gassen . Hvis der sker antaendelse af gassen , er yderligere proevning af stoffet unoedvendig , idet stoffet betragtes som farligt .  1.6.4 . Trin 4  1.6.4.1 . Apparatur  Apparatet opstilles som vist i figur ( se tillaeg )  1.6.4.2 . Proevningsbetingelser  Undersoeg den beholder , hvori stoffet befinder sig , for pulver < 500 mm ( partikkelstoerrelse ) . Hvis pulveret udgoer mere end 1 vaegtprocent af den samlede maengde , eller hvis proeven er sproed , boer alt stoffet males til pulver foer proevning for at tillade en formindskelse af partikkelstoerrelse under lagring og haandtering ; ellers anvendes stoffet i den form , hvori det forhandles . Proevningen boer udfoeres ved stuetemperatur ( 20 * C ) og atmosfaeretryk .  1.6.4.3 . Udfoerelse af proevningen  Der haeldes vand i skilletragten paa apparatet , og der afvejes tilstraekkeligt af stoffet , maksimalt 25 g , til at udvikle mellem 100 og 250 ml gas . Stoffet anbringes i den koniske kolbe . Rumfanget af den udviklede gas kan maales ved en hvilken som helst egnet metode . Skilletragtens hane aabnes for at lede vand ned i den koniske kolbe , og et stopur startes . Den tid , det tager al gassen at udvikles , noteres , og om muligt foretages maalinger ind imellem . Denne proevning boer udfoeres tredobbelt .  Hvis gassens kemiske identitet er ukendt , skal gassen analyseres . Hvis gassen ideholder let antaendelige bestanddele og det ikke vides , om hele blandingen er letantaendelig , skal der fremstilles en blanding med samme sammensaetning , som proeves efter proevningsmetoden ( A . 11 . ) .  2 . DATA  En antaendelse eller udvikling af letantaendelig gas med en hastighed over 1 l/kg * h i tre forsoeg er nok til at anse et stof for farligt ( 1.6.1 ) ,  ( 1.6.2 ) og ( 1.6.3 ) .  3 . RAPPORT  Rapporten skal , om muligt , omfatte foelgende oplysninger :   - praecis specifikation og beskrivelse af stoffet som modtages ( f.eks . farve , konstoerrelse og fysisk tilstandsform ) ;   - enhver indledende behandling af proeven ;   - resultater af proevningerne ;   - kemisk identitet af den udviklede gas ;   - gassens udviklingshastighed ( 1.6.4 ) ;   - eventuelle yderligere bemaerkninger af betydning for fortolkning af resultaterne .  4 . REFERENCER   ( 1 ) ISO 1773 .   ( 2 ) OECD , Paris , Preliminary Test Guideline for the Determination of Substances which give off Highly Inflammable Gases in Dangerous Amounts on Contact with Water A 80/28 - Final report of the OECD chemical testing programme .   ( 3 ) U.N . doc . No ST/SG/AC 10/1 rev 1  TEGNING : JFR . EFT  A . 13 . ANTAENDELIGHED - FASTE STOFFER OG VAESKER  1 . METODE  1.1 . Indledning  Det er vaerdifuldt at have forhaandskendskab til et stofs selvantaendelighed . Proevningsmetoden kan anvendes til faste og flydende stoffer , som markedsfoert , som i smaa maengder vil antaende spontant kort tid efter , at de er kommet i kontakt med luft ved stuetemperatur .  Stoffer , der ikke omfattes af denne metode , er saadanne , som behoever timer eller dage ved stuetemperatur foer selvantaendelse forekommer , eller saadanne , som skal udsaettes for betydeligt hoejere temperatur , foer der sker selvantaendelse .  1.2 . Definitioner og enheder  Vaesker og faste stoffer betragtes som let antaendelige , hvis de taender ved mindst én ud af seks proevninger under de i 1.6 beskrevne betingelser .  Det kan tillige vaere noedvendigt at proeve vaeskers selvantaendelighed ved metoden A . 15 : Selvantaendelighed : bestemmelse af selvantaendelsestemperaturen for flygtige vaesker og gasser .  1.3 . Referencematerialer  Ikke specificeret .  1.4 . Metodens princip  Stoffet bringes i kontakt med luft ved en temperatur paa 25 mere aller mindre 10 * C i en periode paa fem minutter . Hvis der sker antaendelse , betragtes stoffet som letantaendeligt .  1.5 . Kvalitetskriterier  Repeterbarhed : Af sikkerhedsmaessige aarsager er bare ét positivt resultat ud af seks proevninger tilstraekkeligt til at stoffet bedoemmes som letantaendeligt .  1.6 . Beskrivelse af proevningsmetoden  1.6.1 . Apparatur  En porcelaensskaal med ca . 10 cm diameter fyldes med diatoméjord til ca . 5 mm's hoejde ved stuetemperatur .  Bemaerk :  Diatoméjord eller ethvert andet inaktivt stof , der er alment tilgaengeligt , skal anses for repraesentativt for jord , som stoffet er spildt paa i uheldstilfaelde .  1.6.2 . Udfoerelse af proevningen  a ) Pulverformige faste stoffer  1 til 2 cm3 af den pulverformige proeve haeldes fra ca . 1 m's hoejde ned paa en ubraendbar overflade , og det iagttages , om stoffet antaender under faldet eller inden der er gaaet fem minutter efter at det har lagt sig .  b ) Vaesker  Ca . 5 cm3 af den flydende proeve haeldes i den klargjorte porcelaensskaal , og det iagttages , om stoffet antaendes indenfor fem minutter .  2 . DATA  Resultaterne af seks proevninger er relevante ved vurderingen .  3 . RAPPORTERING  Rapporten skal , om muligt , omfatte foelgende oplysninger :   - en beskrivelse af stoffet , der skal proeves ,   - proevningsresultaterne .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , Preliminary Test Guideline for the Determination of Pyrophoric Behaviour of Solids and Liquids . A80/23 - Final report of the OECD chemical testing programme .  A . 14 . EKSPLOSIVE EGENSKABER  1 . METODE  1.1 . Indledning  Metoden opstiller et proevningsskema til bestemmelse af , om et fast , flydende eller pastaagtigt stof eller praeparat frembyder fare for eksplosion , naar det udsaettes for flammepaavirkning ( varmefoelsomhed ) eller stoed - eller friktionspaavirkning ( foelsomhed overfor mekanisk paavirkning ) .  Metoden bestaar af tre dele :  a ) en proevning for termisk foelsomhed ;  b ) en proevning for mekanisk foelsomhed med hensyn til stoed ;  c ) en proevning for mekanisk foelsomhed med hensyn til friktion .  Metoden giver data til vurdering af sandsynligheden for at initiere en eksplosion ved hjaelp af visse almindelige paavirkninger . Metoden tilsigter ikke at fastslaa , om et stof er i stand til at eksplodere eller ikke under hvilke som helst betingelser ; den tilsigter hellen ikke at bestemme i hvilket omfang den begyndende dekomponering kan udvikle sig til at foraarsage eksplosion af hele proeven .  Metoden er egnet til at bestemme , om et stof eller praeparat vil frembyde fare for eksplosion ( termisk eller mekanisk foelsomhed ) under de saerlige betingelser , der er specificeret i direktivet . Proevningerne er irrelevante , naar foreliggende termodynamiske oplysninger ( dannelsesvarme , dekomponeringsvarme , fravaer af visse reaktive grupper ( 1 ) i strukturformlen ) , haevet over rimelig tvivl fastslaar , at stoffet eller praeparatet er ude af stand til at nedbrydes , at danne gasser eller vaere tilboejelig til hastig varmeafgivelse . Det erkendes , at metoden ikke er definitiv . Den omfatter et antal udvalgte , specificerede apparater , som i vidt omfang anvendes internationalt , og som saedvanligvis giver meningsfyldte resultater .  Den person , som udfoerer proevningerne , kan vaelge at bruge alternativt apparatur i de tre naevnte metoder , forudsat , at det kan begrundes videnskabeligt , og at apparaturet er internationalt anerkendt . I saa faldt skal han bestemme korrelationen mellem sine resultater og dem , der opnaas med det beskrevne apparatur .  1.2 . Definitioner og enheder  Eksplosiv :  Stoffer og praeparater , som kan eksplodere under flammepaavirkning , eller som er mere foelsomme over for chok end dinitrobenzen .  1.3 . Referencemateriale  Meta-dinitrobenzen , teknisk krystallinsk produkt , til friktions - og chokmetoden .  1.4 . Metodens princip  En indledende screeningsproevning er noedvendig for at fastslaa sikre betingelser for udfoerelse af de tre foelsomhedsproevninger :  1.4.1 . Indledende screeningsproevning  Meget smaa prover ( ca . 10 mg ) af stoffet eller praeparatet underkastes opvarmning , uden at vaere indesluttet , med en bunsenbraender , for stoed i et eller andet egnet apparat og for friktion ved anvendelse af en hammer mod en ambolt eller en hvilken som helst form for friktionsmaskine . Formaalet er at fastslaa , om stoffet er saa foelsomt og eksplosivt , at de foreskrevne foelsomhedsproevninger skal udfoeres med specielle forholdsregler for at undgaa , at eksperimentatoren kommer til skade .  1.4.2 . Termisk foelsomhed  Metoden indebaerer opvarmning af stoffet eller praeparatet i en staalbeholder med varierende grader af indeslutning , som tilvejebringes af hulplader med aabninger af forskellig diameter , for at bestemme , om stoffet eller praeparatet er tilboejeligt til at eksplodere under termisk belastning .  1.4.3 . Mekanisk foelsomhed ( stoed )  Metoden indebaerer , at stoffet eller praeparaetet udsaettes for stoed fra en faldhammer paa en staalambolt .  1.4.4 . Mekanisk foelsomhed ( friktion )  Metoden indebaerer , at stoffet eller praeparatet udsaettes for friktion mellem standardoverflader under specificerede betingelser for belastning og relativ bevaegelse .  1.5 . Kvalitetskriterier  Ikke angivet .  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Apparatur  1.6.1.1 . Termisk foelsomhed ( virkningen af en flamme )  Staalbeholderen er fremstillet af dybtrukket staalplade  ( se tillaeg ) . Den har en indvendig diameter paa 24 mm , en laengde paa 75 mm og en vaegtykkelse paa 0,5 mm . I den aabne ende er beholderen forsynet med en flange til lukning af beholderen ( figur 1 ) . Beholderen er forsynet med en trykmodstandsdygtig rund hulplade med et centralt hul , og denne plade fastholdes paa beholderen ved hjaelp af en todelt forskruning ( moetrik og haettemoetrik ) . Hulpladen ( se figur 1 ) er 6 mm tyk og fremstillet af varmebestandigt chromstaal ( se tillaeg ) .  Til raadighed for proevningen findes en raekke hulplader med forskellige aabningsdiameter ( 1 , 1,5 , 2 , 2,5 , 3 , 4 , 5 , 6 , 8 , 10 , 12 , 14 , 16 , 18 , 20 ... mm ) til at bestemme den grad af eksplosionsfare , der frembydes af stoffet eller praeparatet . Moetrikken og haettemoetrikken  ( i figur 1 ) bestaar af chrom-mangan staal ( se tillaeg ) , som er gnistfrit op til 800 * C . Staalbeholderne bruges kun til ét forsoeg .  1.6.1.2 . Mekanisk foelsomhed ( stoed )  Et typisk faldhammerapparat bestaar i det vaesentlige af en stoebejernsblok ( graat stoebejern ) med fod og ambolt , soejle , styr , faldvaegt og udloesningsmekanisme . Staalblokken 230 mm ( dybde ) gange 250 mm  ( bredde ) gange 200 mm ( hoejde ) med stoebt fod 450 mm ( dybde ) gange 450 mm ( bredde ) gange 60 mm ( hoejde ) baerer staalambolten 100 mm diameter gange 70 mm hoejde , som er skruet paa . Paa staalblokkens bagside fastskrues soejlen , i denne fastgoeres soejlen , der bestaar af et heltrukket staalroer med 90 mm udvendig og 70 mm indvendig diameter . Fire skruer forankret i en massiv betonblok 60 cm gange 60 cm gange 60 cm holder faldhammeren paa en saadan maade , at skinnerne er absolut lodrette og faldvaegten let kan styres .  Faldhammerens vaegt skal vaere 10 kg . Massen bestaar af massivt staal . Den skal have en slagflade af anloebet staal , HRC 60 til 63 , og en mindste diameter paa 25 mm . Proevningerne skal udfoeres med faldhoejde paa 0,4 m .  Proeven , der skal undersoeges , anbringes i en matrice bestaaende af to massive koaksiale staalcylindre , den ene ovenpaa den anden , og en hul staalcylinder som styrering . De massive staalcylindre skal vaere 10 ( - 0,003 , - 0,005 ) mm i diameter og 10 mm hoeje samt have polerede overflader , afrundede kanter ( rundingsradius 0,5 mm ) og en haardhed paa HRC 58 til 65 . Den hule cylinder skal have en udvendig diameter paa 16 mm , en poleret udboring paa 10 ( + 0,005 , + 0,010 ) mm og en hoejde paa 13 mm .  Hvis der forekommer en eksplosion , maa staalcylinderen ikke bruges til yderligere proevninger .  For at fjerne eksplosionsdampene stilles matriceanordningen oven paa en mellemambolt med diameter 26 mm og 26 mm hoejde , fremstillet af staal , og centreret ved hjaelp af en centreringsring med en opspaendingsring .  1.6.1.3 . Mekanisk foelsomhed ( friktion ) Friktionsapparatet bestaar af en stoebt staalbundsplade  ( graat stoebejern ) , paa hvilken selve friktionsanordningen er monteret , bestaaende af en fastsiddende porcelaensstang og bevaegelige porcelaensplader . Porcelaenspladen er fastgjort i en slaede , der bevaeger sig mellem to skinner . Slaeden drives gennem en drivstang , en eksentrik og et transmissionsgear af en elektromotor paa en saadan maade , at porcelaenspladen bevaeges under porcelaensstangen med frem - og tilbagegaaende bevaegelse paa 10 mm . Porcelaensstangen skal belastes med ca . 360 N .  Porcelaenspladerne er fremstillet af hvidt teknisk porcelaen , og har dimensionerne 25 mm ( laengde ) gange 25 mm ( bredde ) gange 5 mm  ( hoejde ) . Begge friktionsoverfladerne paa pladerne er foer braending gjort ( ruhedsdybde 9 til 32 mm ) ved gnidning med en svamp .  Den cylindriske porcelaensstang er ligeledes fremstillet af hvidt teknisk porcelaen . Den er 15 mm lang , har diameteren 10 mm og halvkugleformede endeflader med krumningsradius 10 mm .  1.6.2 . Proevningsbetingelser  1.6.2.1 . Termisk foelsomhed ( virkningen af en flamme )  Stoffet , i den fysiske tilstandsform , det skal leveres i , fyldes i staalbeholderen til en hoejde af 60 mm i tre lige store portioner . Hver portion sammenpresses forsigtigt ved at paafoere overfladen en kraft paa 80 N ved hjaelp af et egnet traestempel , der er lidt mindre end beholderen . Ved geleagtige stoffer drages der omsorg for at undgaa luftbobler under fyldningen .  1.6.2.2 . Mekanisk foelsomhed ( stoed )  Stoffet proeves i toer tilstand . Proeven skal have et volumen paa 40 mm3 , eller et volumen , der passer til det beskrevne apparat . For faste stoffer , med undtagelse af pastaer , gaelder foelgende :  a ) pulverformige stoffer sigtes ( sigtestoerrelse 0,5 mm ) ; alt , hvad der passerer gennem sigten , bruges til proevningen ;  b ) pressede , stoebte eller paa anden maade sammenpressede stoffer soenderdeles og sigtes ; sigtefraktionen fra 0,5 til 1 mm diameter bruges til proevningen .  Ved flydende stoffer presses den oeverste staalcylinder ned , til den befinder sig i en afstand af 1 mm fra den nederste cylinder , og fastholdes i denne stilling .  1.6.2.3 . Mekanisk foelsomhed ( friktion )  Stoffet proeves i toer tilstand . Proeven skal have et volumen paa 10 mm3 . For faste stoffer , med undtagelse af pastaer , gaelder foelgende :  a ) pulverformige stoffer sigtes ( sigtestoerrelse 0,5 mm ) ; alt , hvad der passerer gennem sigten , bruges til proevningen ;  b ) pressede , stoebte eller paa anden maade sammentrykte stoffer soenderdeles og sigtes ; sigtefraktionen  < 0,5 mm diameter bruges til proevningen .  1.6.3 . Udfoerelse af proevningerne  1.6.3.1 . Termisk foelsomhed ( virkningen af en flamme )  Opvarmningen sker med propan fra en industriel trykflaske , forsynet med en trykregulator ( 500 mbar ) , gennem en maaler og fordelt ved en manifold til de fire braendere . De fire braendere bruger 3,2 l propan i minuttet .  Hvis der bruges andre gasser til opvarmningen , skal der vaelges passende braendere , gasforbrug og luftindtag , saaledes at sammenlignende maalinger paa beholdere fyldt med inerte materialer ( sand , dibutylphalat ) viser lignende temperatur/tid kurver som opvarmning med propan .  Braenderne placeres rundt om proevningskammeret som vist i figur 2 .  Braenderne justeres paa en saadan maade , at spidsen af den indre blaa kegle i flammen naesten beroerer beholderen . Proevningen udfoeres i et staalkammer med de i figur 2 angivne dimensioner . Braendernes dimensioner ses i figur 3a og 3b .  To serier paa tre proevninger er obligatorisk , i den foerste serie bruges en hulplade med et hul paa 2 mm i diameter , i den anden bruges et hul stoerre end 2 mm  ( f.eks . 6 mm ) i diameter .  Hvis der sker en eksplosion i foerste serie ( 2 mm hul ) , er det unoedvendigt at gaa videre til den naeste serie . Hvis der ikke er sket en eksplosion efter fem minutter , er proevningen slut .  1.6.3.2 . Mekanisk foelsomhed ( stoed )  I det beskrevne slagapparat udfoeres seks proevninger ved at lade 10 kg-loddet falde fra 0,4 m . I andre apparater sammenlignes proeven med m-dinitrobenzen under anvendelse af anerkendt metode ( op - og nedteknikken osv . ) .  1.6.3.3 . Mekanisk foelsomhed ( friktion )  Porcelaensstangen anbringes paa den proeve , der skal undersoeges , og belastningen haenges paa . Under proevningens udfoerelse skal slibemaerkerne paa porcelaenspladen ligge paa tvaers af bevaegelsesretningen . Der skal passes paa , at stangen hviler paa proeven , at der er tilstraekkeligt proevemateriale under stangen , og at pladen bevaeges korrekt under stangen . Porcelaenspladen skal bevaeges frem og tilbage under porcelaensstangen , en afstand paa 10 mm hver vej i loebet af 0,44 sekunder . Hver del af overfladen maa kun bruges til en proevning .  2 . DATA  2.1 . Behandling af resultaterne  Proevningen kan afbrydes , saa snart der opnaas et positivt resultat i én af proevningerne .  2.2 . Vurdering  Principielt anses et stof eller praeparat for at frembyde eksplosionsfare i direktivets forstand , hvis :  a ) der sker en eksplosion ( dvs . beholderen spraenger i tre eller flere fragmenter ) indenfor det fastsatte antal proevninger for termisk foelsomhed ;  eller  b ) en eksplosion ( at bryde i brand svarer til eksplosion ) sker mindst én gang under seks proevninger med det beskrevne slagapparat , eller proeven er mere foelsom end m-dinitrobenzen i en alternativ slagproevning ;  eller  c ) en eksplosion ( knitren eller brand svarer til eksplosion ) sker mindst én gang under seks proevninger med det beskrevne friktionsapparet , eller proeven er mere foelsom end m-dinitrobenzen i en alternativ friktionsproevning .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Proevningsrapport  Proevningsrapporten skal , om muligt , omfatte foelgende oplysninger :   - identitet , sammensaetning , renhed , fugtighedsindhold osv . for stoffet eller praeparatet , der skal undersoeges ;   - proevens fysiske tilstandsform , og om der er foretaget sigtning eller ikke ;   - iagttagelser under proevningerne ( reaktionstype , gnister , flamme , eksplosion , antal fragmenter osv . ) ;   - resultater af hver proevning :   - hvis der har vaeret anvendt alternativt apparat , skal der gives videnskabelig begrundelse , saavel som dokumentation for sammenlignelighed mellem de resultater , der opnaas med det beskrevne apparatur , og de som opnaas med det tilsvarende apparatur ;   - alle brugbarer oplysninger som referencer til proevninger med lignende produkter , som kan vaere relevante for den rette fortolkning af resultaterne .  3.2 . Fortolkning og vurdering af resultater  Proevningsrapporten boer naevne ethvert resultat , som betragtes som forkert , afvigende eller ikke-repraesentativt . Hvis nogle af resultaterne lades ude af betragtning , boer der gives en forklaring tillige med resultater af eventuel alternativ eller supplerende proevning .  Undertiden kan resultatet vaere en teknisk fejl , som staar i forbindelse med stoffets eller praeparatets flygtige karakter eller fysiske tilstandsform under proevningen ; i saa fald er det vaerd at vide , hvilket resultat man ville opnaa , naar stoffet eller praeparatet har den tilstandsform , som det har , naar det bringes paa markedet . Alternativ proevning kan muligvis oplyse herom . Med mindre et afvigende resultat kan forklares paa denne maade , maa det tages for gode varer , og i overensstemmelse hermed bruges ved klassifikationen af stoffet eller praeparatet .  4 . REFERENCER   ( 1 ) Bretherick , L . , Handbook of Reactive Chemical Hazards , London . Butterworths , 1979 , p . 60-63 .   ( 2 ) Koenen , H . , Ide , K.H . , Ueber die Pruefung explosiver Stoffe , I . Ermittlung der Reibempfindlichkeit , Explosive Stoffe , Vol . 3 , 1955 , S . 57-65 und S . 89-93 .   ( 3 ) Koenen , H . , Ide , K.H . , Ueber die Pruefung explosiver Stoffe , III . Ermittlung der Empfindlichkeit explosiver Stoffe gegen thermische Beanspruchung in einer Erhitzungskammer mit verschiedenen definierten Oeffnungen  ( Stahlhusenverfahren ) , Explosive Stoffe , Vol . 4 , 1956 , S . 119-125 , 143-148 .   ( 4 ) Koenen , H . , Ide , K.H . , Haupt , W . , Ueber die Pruefung explosiver Stoffe , IV . Ermittlung der Schlagempfindlichkeit explosiver Stoffe von fester , fluessiger und gelatinoser Beschaffenheit , explosive Stoffe , Vol . 6 , 1958 , S . 178-189 , 202-214 und 223-235 .   ( 5 ) ONU 1980 , December , United Nations Committee of Experts on the Transport of Dangerous Goods , ( document ST/SG/AC / . 10/5/Add . 3 , Table 4.3 ) .  Tillaeg  Eksempel paa materialespecifikation   ( 1 ) Materialespecification No 1.0336.505 g , i overensstemmelse med DIN 1623 sheet 1 .   ( 2 ) Materialespecification No 1.4873 , i overensstemmelse med sheet " Stahl-Eisen-Werkstoff " 490-52 .  490-52 .   ( 3 ) Materialespecification No 1.3817 , i overensstemmelse med sheet " Stahl-Eisen-Werkstoff " 490-52 .  Figur 1  Tegning : JFR . EFT  Figur 2  Tegning : JFR . EFT  Figur 3a  TEGNING : JFR . EFT  Figur 3b  TEGNING : JFR . EFT  A . 15 . SELVANTAENDELIGHED - BESTEMMELSE AF SELVANTAENDELSESTEMPERATUREN FOR FLYGTIGE VAESKER OG GASSER  1 . METODE  1.1 . Indledning  Det er vaerdifuldt at have forhaandskendskab til et stofs selvantaendelighed . Proevningsmetoden kan anvendes paa markedsfoerte stoffer i form af gasser eller flygtige vaesker , som enten i sig selv eller ved afgivne dampe kan antaendes af en hed overflade under tilstedevaerelsen af luft . Selvantaendelsestemperaturen kan reduceres betragteligt ved tilstedevaerelsen af katalytiske urenheder .  1.2 . Definitioner og urenheder  Graden af selvantaendelighed udtrykkes ved selvantaendelsestemperaturen . Selvantaendelsestemperaturen er den laveste temperatur , ved hvilken proeven vil antaende i blanding med luft under de i proevningsmetoden definerede betingelser .  1.3 . Referencematerialer  Ikke specificeret .  1.4 . Metodens princip  Gassers og dampes tilboejelighed til selvantaendelse bestemmes under anvendelse af det i IEC 79-4 beskrevne apparatur .  1.5 . Kvalitetskriterier  Reperterbarheden varierer afhaengigt af omraadet for selvantaendelsestemperaturen , og af den anvendte proevningsmetode ; hoejst mere aller mindre 5 * C .  Foelsomheden afhaenger af den anvendte proevningsmetode .  Specificiteten afhaenger af den anvendte proevningsmetode .  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Apparatur  Apparaturet er beskrevet i den i 1.6.3 refererede metode .  1.6.2 . Proevningsbetingelser  En proeve af stoffet proeves i overensstemmelse med den i 1.6.3 refererede metode .  1.6.3 . Udfoerelse af proevningen  Se IEC 79-4 , DIN 51794 , ASTM-E 659-78 , BS 4056 .  2 . DATA  Noter proevningstemperaturen , atmosfaeretryk , anvendt proevemaengde tidsinterval indtil antaendelse sker .  3 . RAPPORTERING  Rapporten skal , om muligt , omfatte foelgende oplysninger :   - praecis specifikation af stoffet ( identifikation og urenheder ) .   - anvendt maengde , atmosfaeretryk ;   - proevningsresultaterne ( proevningstemperaturer , resultater vedroerende antaendelse , tilhoerende tidsintervaller ) ;   - alle yderligere bemaerkninger af betydning for fortolkningen af resultaterne .  4 . REFERENCER  Ingen .  A . 16 . SELVANTAENDELIGHED - FASTE STOFFER - BESTEMMELSE AF RELATIV SELVANTAENDELSESTEMPERATUR  1 . METODE  1.1 . Indledning  Eksplosive stoffer og stoffer , som antaender spontant ved kontakt med luft ved stuetemperatur , boer ikke underkastes denne proevning .  Formaalet med denne proevning er at tilvejebringe forhaandsoplysninger om et stofs selvstaendelighed ved forhoejede temperaturer . Hvis den varme som udvikles , enten ved stoffets reaktion med oxygen eller ved exotermisk nedbrydning , ikke hurtigt nok afgives til omgivelserne , sker der selvopvarmning , der foerer til selvantaendelse . Selvantaendelse optraeder derfor , naar hastigheden af varmeproduktionen overstiger hastigheden af varmetabet .  Proevningsmetoden er vaerdifuld som foreloebig screeningsproevning for faste stoffer . I betragtning af de komplicerede forhold ved antaendelse og forbraending af faste stoffer boer selvantaendelsestemperaturen , bestemt efter denne metode , kun anvendes til sammenligningsformaal .  1.2 . Definitioner og enheder  Den selvantaendelsestemperatur , der opnaas ved denne metode , er den mindste rumtemperatur udtrykt i * C , ved hvilken et bestemt volumen af et stof vil antaende under definerede betingelser .  1.3 . Referencematerialer  Ingen .  1.4 . Metodens princip  Et bestemt volumen af proeven anbringes i en ovn ved stuetemperatur ; temperatur-tidskurven i proevens midte relativt til omgivelserne optegnes , medens ovnens temperatur oeges till 400 * C med en hastighed paa 0,5 * C/min . Den ovntemperatur , ved hvilken proevens temperatur naar 400 * C ved selvopvarmning , benaevnes selvantaendelsestemperaturen i henseende til denne proevning .  1.5 . Kvalitetskriterier  Ingen .  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Apparatur  1.6.1.1 . Ovn  En temperaturprogrammeret laboratorieovn ( volumen ca . 2 l ) udstyret med naturlig luftcirkulation og eksplosionssikring . Det maa paases , at ingen nedbrydningsgasser kan komme i kontakt med det elektriske varmelegeme , for at indgaa eventuel eksplosionsfare .  1.6.1.2 . Terning af staaltraadsnet  Et stykke rustfast staaltraadsnet med 0,045 mm huller klippes til efter moensteret i fig . 1 ( se tillaeg ) . Nettet foldes og lukkes med traad til terninger , der er aabne foroven .  1.6.1.3 . Termoelementer  Egnede termoelementer .  1.6.1.4 . Skriver  Enhver to-kanalsskriver der er kalibreret til 600 * C eller tilsvarende spaending .  1.6.2 . Proevningsbetingelser  Stoffer proeves i deres handelsmaessige form .  1.6.3 . Proevningens udfoerelse  Terningen fyldes med det stof , der skal proeves , og bankes let , idet der tilfoejes yderligere materiale , indtil terningen er helt fyldt . Proeven ophaenges derefter i ovnens midte ved stuetemperatur . Et termoelement placeres i terningens midte og et andet mellem terningen og ovnvaeggen for at registrere ovntemperaturen . Temperaturerne i ovnen og proeven registreres kontinuert , mens ovntemperaturen haeves til 400 * C eller til det faste stofs smeltepunkt , hvis det er lavere , med en hastighed paa 0,5 * C/min . Naar stoffet antaender , vil termoelementet i proeven vise en meget skarp temperaturstigning over ovntemperaturen .  2 . DATA  Den ovntemperatur , ved hvilken proevetemperaturen naar 400 * C ved selvopvarmning er relevant for vurderingen  ( se figur 2 i tillaegget ) .  3 . RAPPORT  Rapporten skal , om muligt , omfatte foelgende oplysninger :   - en beskrivelse af det stof der skal proeves ,   - maaleresultaterne , herunder temperatur/tidskurve ,   - alle yderligere bemaerkninger af betydning for vurderingen af resultaterne .  4 . REFERENCER  Ingen .  Tillaeg  Figur 1  TEGNING : JFR . EFT  A . 17 . OXIDERENDE EGENSKABER  1 . METODE  1.1 . Indledning  Det er nyttigt paa forhaand at have kendskab til stoffets mulige eksplosive og giftige egenskaber for at udfoere denne proevning .  Proevningen er uegnet for eksplosive eller letantaendelige stoffer , organiske peroxider og for braendbare faste stoffer , som er tilboejelige til at smelte under proevningsbetingelserne .  Denne proevning er irrelevant , naar en undersoegelse af strukturformlen uden for enhver tvivl fastslaar , at stoffet eller praeparatet er ude af stand til at reagere eksotermt med et braendbart materiale .  For at fastslaa , om proevningen boer udfoeres under iagttagelse af saerlige forholdsregler , boer der udfoeres en forhaandsproevning .  1.2 . Definitioner og enheder  Reaktionstid : Den reaktionstid , i sekunder , der kraeves for at reaktionszonen vandrer langs en proevevold , efter den procedure , der er beskrevet i 1.6 .  Reaktionshastigheden udtrykkes i mm/s .  Stoerste reaktionshastighed : Den stoerste reaktionshastighed , bestemt ved blandinger indeholdende fra 10 til 90 vaegtprocent af det oxiderende stof .  1.3 . Referencemateriale  Bariumnitrat ( analysevare ) bruges almindeligvis til proeven og forhaandsproevningen som referencemateriale .  Kaliumdichromat boer kun bruges til forhaandsproevningen . Der boer tages saerlige forholdsregler ved haandteringen af kaliumdichromat . Referenceblandingen er den blanding af bariumnitrat med cellulosepulver , fremstillet efter 1.6 , som har den stoerste reaktionshastighed . ( Normalt en blanding indeholdende 60 vaegtprocent bariumnitrat ) .  1.4 . Metodens princip  Der udfoeres af sikkerhedshensyn en forhaandsproevning . Denne forhaandsproevning vil vaere tilstraekkelig , naar den klart viser , at stoffet eller praeparatet har oxiderende egenskaber . Naar dette ikke er tilfaeldet , skal stoffet eller praeparatet underkastes yderligere proevning .  Ved den yderligere proevning blandes det stof , der skal proeves , og et defineret braendbart materiale i forskellige forhold . Hver blanding formes derefter til en vold , som antaendes i den ene ende . Den stoerste reaktionshastighed bestemmes derefter , og sammenlignes med den stoerste reaktionshastighed for referencematerialet .  1.5 . Kvalitetskriterier  Hvis det oenskes , kan en hvilken som helst metode til knusning og blanding anvendes , forudsat , at forskellen mellem den stoerste reaktionshastighed for de 6 individuelle proevninger afviger mindre end 10 % fra den aritmetriske middelvaerdi .  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Forhaandsproevning  Det toerrede stof i den form , hvori det forhandles , blandes groft med det toerrede cellulosepulver eller savsmuld i vaegtforholdet 2 dele af det stof , der skal proeves , til 1 del toerret cellulose eller savsmuld , og blandingen formes til en lille kegleformet bunke med en grunddiameter paa 3,5 cm og en hoejde paa 2,5 cm , ved at fylde , uden at banke , en form ( f.eks . en kegleformet laboratorietragt , hvis stilk er tilstoppet ) .  Bunken placeres paa en kold , modstandsdygtig , ikke ledende overflade ovenpaa antaendelseskilden , som bestaar af inaktiv metaltraad , som f.eks . en platin - eller nikkeltraad ( som kan opvarmes elektrisk til ca . 1 000 * C ) . Denne metaltraad anbringes ca . 1 mm over proevefladen , og den spaender over keglens grundflade . Denne proevning skal udfoeres i et stinkskab , som omtalt i 1.6.3 . Antaendelseskilden tilsluttes og forbliver tilsluttet . Reaktionens styrke og varighed iagttages og registreres .  Stoffet eller praeparatet skal betragtes som oxiderende , hvis reaktionen er voldsom .  I alle tilfaelde , hvor resultatet er tvivlsomt , er det noedvendigt at fuldfoere hele proevningsraekkefoelgen som beskrevet nedenfor .  1.6.2 . Tilberedning  1.6.2.1 . Stoffet der skal proeves  Knus proeven til en partikelstoerrelse < 0,125 mm ved foelgende fremgangsmaade :  Sigt stoffet i den form , hvori det forhandles .  Knus den tilbagevaerende del . Gentag fremgangsmaaden , indtil alt det oxiderende stof er kommet igennem sigten .  Enhver knusnings - og sigtemetode kan anvendes , hvis den opfylder kvalitetskriteriet .  Foer stofferne blandes , toerres de ved 105 * C til konstant vaegt . Hvis det stof , der skal proeves , dekomponerer ved temperaturer under 105 * C , skal det toerres ved en passende lav temperatur .  1.6.2.2 . Braendbart stof  Cellulosepulver anvendes som braendbart materiale . Cellulosen skal vaere af en type , som kan anvendes til tyndtlags - eller soejlechromatografi . En type , hvor mere end 85 % af fiberlaengderne ligger mellem 0,075 og 0,020 mm , har vist sig at vaere egnet . Cellulosepulveret skal kunne passere en sigte med en maskestoerrelse paa 0,125 mm .  Foer blandingen skal cellulosepulveret toerres ved 105 * C til konstant vaegt .  Hvis der bruges savsmuld i den indledende proevning , tilberedes naaletraessavsmuld ved at samle den del , der passerer gennem en sigte med maskevidde 1 600 mm , bland omhyggeligt , og toer derefter ved 105 * C i fire timer i et hoejst 25 mm tykt lag .  Lad det afkoele og opbevar det i en lufttaet beholder , saa fyldt som muligt , til det skal bruges , helst indenfor 24 timer efter toerring .  1.6.2.3 . Blanding  Fremstil blandinger af oxiderende stof og cellulose indeholdende fra 10 til 90 vaegtprocent af det oxiderende stof i trin paa 10 % .  I graensetilfaelde boer mellemliggende blandinger af oxiderende stof og cellulose anvendes for at finde den stoerste reaktionshastighed mere praecist .  Note :  Blandinger af oxiderende stoffer med cellulose skal betragtes som potentielle eksplosiver og behandles med tilsvarende forsigtighed .  Volden dannes ved hjaelp af en form . Formen fremstilles af metal en laengde paa 250 mm og et trekantet tvaersnit med en indre hoejde paa 10 mm og en indvendig bredde paa 20 mm . Paa begge sider af formen er i laengderetningen monteret to metalplader som langsgaaende skinner , som rager 2 mm over det trekantede tvaersnits oeverste kant ( figur ) .  Ned i denne opstilling drysses saa meget af blandingen , at der dannes en lille top . Efter at man har ladet formen falde fra en hoejde paa 2 cm mod en fast overflade , skrabes det tilbagevaerende overskud vaek med en skraatstillet plade . Derefter fjernes de langsgaaende skinner , og det resterende pulver jaevnes med en rulle . Nu placeres en ubraendbar plade ovenpaa formen , apparatet vendes , og formen fjernes .  1.6.2.4 . Antaendelseskilde  En platintraad , der er elektrisk opvarmet til ca . 1 000 * C , eller en gasflamme bruges som antaendelseskilde .  1.6.3 . Proevningens udfoerelse  Volden anbringes paa tvaers af traekket i et stinkskab . Lufthastigheden boer vaere tilstraekkelig til at forhindre gasser i at undslippe ud i laboratoriet . Lufthastigheden boer ikke aendres under proevningen . En laeskaerm boer placeres rundt om opstillingen .  Da cellulosen og stofferne , der skal proeves , er hygroskopiske , boer proevningen udfoeres saa hurtigt som muligt .  Antaend den ene ende af volden ved at beroere den med en flamme eller den gloedende platintraad .  Maal reaktionstiden over 200 mm efter at reaktionszonen har vandret de foerste 30 mm .  Proevningen udfoeres derefter med referencematerialet . Proevningen udfoeres derefter mindst en gang med hver af raekken af blandinger af proevematerialet og cellulosen .  Hvis den stoerste reaktionshastighed er betydelig stoerre end referencematerialets , kan proevningen afbrydes , ellers skal de tre blandinger , som har givet de tre stoerste reaktionshastigheder , hver proeves yderligere fem gange .  2 . DATA  Af sikkerhedsmaessige grunde skal den stoerste enkeltvaerdi af reaktionshastighederne - ikke middelvaerdien - betragtes som vaerende stoffets karakteristiske oxiderende egenskab .  Den stoerste vaerdi af reaktionshastigheden ud af seks proevninger for en given blanding er relevant for vurderingen .  Tegn en kurve for den stoerste reaktionshastighed for hver blanding som funktion af indholdet af oxiderende stof .  Bestem den stoerste reaktionshastighed ud fra kurven .  De seks maalte enkeltvaerdier af reaktionshastigheden i den blanding , som indeholder den stoerste reaktionshastighed , maa ikke afvige mere end 10 % fra den aritmetriske middelvaerdi , ellers skal knuse - og blandemetoderne forbedres .  Sammenlign den fundne stoerste reaktionshastighed med den stoerste reaktionshastighed for referenceblandingen  ( se 1.3 ) .  3 . RAPPORT  3.1 . Proevningsrapport  Rapporten skal , om muligt , omfatte foelgende oplysninger :   - en beskrivelse af det stof , der skal proeves ,   - enhver behandling af proeven ( f.eks . knusning , toerring ... ) ,   - maaleresultaterne ,   - reaktionsforloebet ( f.eks . forbraending med flammer fra overfladen , gennembraending , enhver oplysning om forbraendingsprodukter , ... ) ,   - alle yderligere oplysninger , som er relevante for fortolkningen af resultaterne , herunder en beskrivelse af reaktionens styrke ( flammer , gnister , roeg , langsom ulmen , osv . ) og tilnaermelsesvis varighed fundet ved forhaandsproevningen for saavel proeven som for referencematerialet .  3.2 . Fortolkning af resultaterne  Et stof skal betragtes som et oxiderende stof naar :  a ) der ved den indledende proevning finder en voldsom reaktion sted ,  eller  b ) det ved den yderligere proevning findes , at den stoerste reaktionshastighed for de blandinger , der skal proeves , er stoerre end eller lig med den stoerste reaktionshastighed for blandingerne af cellulose og bariumnitrat .  4 . REFERENCER  Ingen .  Tillaeg  Figur  Form og tilbehoer til tilberedning af proevevold : JFR . EFT  AFSNIT B : METODER TIL BESTEMMELSE AF TOKSICITET GENEREL INDLEDNING : DEL B  A . INDLEDNING  Se den generelle indledning  B . DEFINITIONER   ( I ) Akut toksicitet omfatter de sundhedsmaessigt uoenskede virkninger , der optraeder indenfor et givet tidsrum ( saedvanligvis 14 dage ) efter udsaettelse for en enkelt dosis af et teststof .   ( II ) LD50 ( middel letal dosis ) er en statistisk fastlagt enkelt dosis af et teststof , som kan forventes at forarsage 50 % af forsoegsdyrenes doed .  En LD50-vaerdi udtrykkes som vaegt af teststof pr . vaegtenhed af forsoegsdyr ( mg/kg ) .   ( III ) LC50 ( middel letal koncentration er en statistisk fastlagt koncentration af et stof , som kan forventes at foraarsage 50 % af forsoegsdyrenes doed under eksponering eller inden for et fastsat tidsrum efter eksponering i en fastlagt periode . LC50 udtrykkes som vaegt af teststof pr . enhed luftvolumen  ( mg/1 ) .   ( IV ) Ikke-toksisk dosis er den stoerste dosis eller det hoejeste ekspositionsniveau i en test , som ikke foraarsager erkendbare sundhedsmaessig uoenskede virkninger .   ( V ) Subakut/subkronisk toksicitet omfatter de sundhedsmaessige uoenskede virkninger , som ses paa forsoegsdyr som resultat af dagligt gentagen indgift af eller eksponering for et kemikalie for en kort tid af dyrenes forventede levetid .   ( VI ) Maksimal tole * abel dosis ( MTD ) er den hoejeste dosis som frembringer en toksisk virkning uden samtidig i vaesentlig grad at paavirke overlevelsesgraden i det forsoeg hvor den anvendes , i kraeftforsoeg for eks . en toksisk virkning , som ikke skyldes svulstdannelser .   ( VII ) Hudirritation er dannelsen af reversible inflammatoriske forandringer i huden som foelge af applikation af et teststof .   ( VIII ) Oejenirritation er dannelsen af reversible forandringer i oejet som foelge af applikation af et teststof til den indre overflade af oejet .   ( IX ) Hudsensibilisering ( allergisk kontakt dermatitis ) er en immunologisk udloest kutan reaktion paa et teststof .  C . VURDERING OG FORTOLKNING  Det er kun i begraenset omfang muligt at ekstrapolere resultater af dyreforsoeg og in vitro-tests direkte til mennesker , hvilket skal tages i betragtning ved vurdering og fortolkning af forsoeg .  For saa vidt de foreligger , betragtes human data som mere relevante ved vurdering af kemiske stoffers potentielle virkninger paa mennesker .  MUTAGENICITET ( inklusiv prae-screening test for carcinogenicitet )  Den indledende vurdering af mulig mutagenicitet kraever informationer om to typer af mutationer , nemlig genmutationer og kromosomforandringer .  Disse to typer vurderes ved hjaelp af foelgende tests :   ( I ) proeve for dannelse af gen(punkt)mutationer i prokaryotiske celler som Salmonella typhimurium . Test der anvender Escherichia coli kan ogsaa anvendes . Valget mellem disse to testorganismer kan afhaenge af , hvilken slags kemikalie der testes .   ( II ) Proeve for dannelse af kromosomforandringer i pattedyrceller , som er dyrket in vitro . Der kan ogsaa anvendes en in vivo metode ( mikro-nucleustest eller metafase analyse af knoglemarvsceller ) .  D . LITTERATURHENVISNINGER  Toksikologi er en eksperimentel videnskab under udvikling , og der foreligger en omfattende litteratur om de forskellige emner , den behandler . Relevante henvisninger findes i OECD's retningslinier for forsoegsvirksomhed .  Supplerende bemaerninger  Pasning af dyr  Ved toksicitetstest er det afgoerende , at der foeres noeje kontrol med testmiljoeet , og at dyrene passes korrekt .   ( I ) Miljoe  Miljoeet i forsoegsstalde saavel som i forsoegsdyrsbure skal afpasses efter dyrearten . Passende betingelser for gnavere er en rumtemperatur paa 22 * C ( mere aller mindre 3 * C ) med en relativ luftfugtighed paa 30 til 70 % . For kaniner og marsvin boer temperaturen holdes paa 20 * C  ( mere aller mindre 3 * C ) med en relativ luftfugtighed paa 30 til 70 % .  Visse forsoegsteknikker er saerlig foelsomme for temperatursvingninger . I disse tilfaelde omfatter beskrivelse af forsoegsmetoden detaljerede retningslinjer for testmetode .  Temperatur og luftfugtighed boer kontrolleres , registreres og anfoeres i den afsluttende forsoegsrapport i forbindelse med alle undersoegelser for toksisk effekt .  Naar der anvendes kunstigt lys , boer almindeligvis en rytme med 12 timers lys og 12 timers moerke foelges . Oplysninger om belysningsrytmen registreres og anfoeres i den afsluttende forsoegsrapport .  I rapporter over dyreforsoeg er det vigtigt at anfoere , hvilken type bure der er anvendt og antallet af dyr i hvert bur baade under eksponering med et kemikalie og i en efterfoelgende observationsperiode .   ( II ) FodringFoderet skal opfylde alle de ernaeringskrav , forsoegsdyrsarten stiller . Hvis teststofferne indgives i foderet kan naeringsvaerdien formindskes som foelge af reaktion mellem teststoffet og foderets bestanddele .  Muligheden for en saadan reaktion boer tages i betragtning , naar forsoegsresultaterne fortolkes .  Forureninger i foderet , som vides at influere paa toksiciteten , maa ikke forefindes i forstyrrende koncentrationer .  B . 1 . AKUT TOKSICITET , ORAL INDGIFT  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  Teststoffet indgives med mavesonde i graduerede doser til grupper af forsoegsdyr , idet der gives en bestemt dosis til hver gruppe . Der foretages derefter observationer af virkninger , herunder doed . Dyr , der doer under forsoeget obduceres . Ved slutningen af forsoeget aflives og obduceres overlevende dyr . Denne testmetode er hovedsagelig beregnet til undersoegelser paa gnavere .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  Dyrene holdes under forsoegsbetingelser mht . miljoe og fodring i mindst fem dage , inden forsoeget begyndes . Unge , sunde , koensmodne dyr skal fordeles randomiseret i grupper inden forsoeget begyndes . Teststoffet oploeses eller opslaemmes i et passende vehikel . Det anbefales , at der saa vidt muligt anvendes en vandig oploesning , og hvis dette ikke er muligt , en oploesning i vegetabilsk olie , en oploesning i andre vehikler eller eventuelt en suspension . Ved ikke-vandige vehikler boer vehiklets relevante karakteristika vaere kendt eller , hvis de ikke kendes , blive bestemt forud for eller i forbindelse med forsoeget . Hos gnavere boer volumen normalt ikke overstige 10 ml/kg legemsvaegt , undtagen ved anvendelse af vandige oploesninger , hvor op til 20 ml/kg kan anvendes . Forskelle i volumen skal goeres mindst mulig ved at justere koncentrationen , og saaledes sikre , at volumen er konstant ved alle doser .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Forsoegsdyr  Rotter er de fortrukne forsoegsdyr , medmindre der foreligger kontraindikationer . Der benyttes rotter af almindeligt anvendte stammer . For saavel han - som hunrotter gaelder det , at vaegten af de dyr , som anvendes ved et forsoeg , ikke maa variere mere end mere aller mindre 20 % fra en rimelig gennemsnitsvaegt .  1.6.2.2 . Antal og koen  Der anvendes mindst ti gnavere ( fem hun - og fem handyr ) til hvert dosisniveau . Hundyrene maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige .  1.6.2.3 . Dosisniveauer  til forsoeget anvendes et tilstraekkeligt antal dosisniveauer , mindst tre , og disse skal vaere valgt saaledes , at der opnaas en graduering i de toksiske virkninger i testgrupperne og i doedeligheden . Der skal vaere tilstraekkelige data til , at der kan fremstilles en dosisvirkningskurve , og til , om muligt , at foretage en rimelig bestemmelse af LD50 .  1.6.2.4 . Graensetest  En tilstraekkelig vurdering af et teststofs orale akutte toksicitet vil i de fleste tilfaelde vaere opnaaet , saafremt der ikke optraeder doedsfald som foelge af indgift af teststoffet i op til 14 dage efter indgivelse af en dosis paa 5 000 mg/kg legemsvaegt . ( fem dyr af hvert koen pr . gruppe ) .  1.6.2.5 . Observationsperiode  Observationsperioden skal vaere mindst 14 dage . Observationsperiodens varighed boer dog ikke fastsaettes rigoristisk . Den boer bestemmes udfra toksiske reaktioner , hvornaar disse indtraeder , og af restitutionsperiodens laengde ; den boer udvides , saafremt det anses for noedvendigt . Tidspunktet for , hvornaar symptomer paa toksicitet erkendes og forsvinder , samt doedstidspunktet er vigtigt , navnlig hvis der er tendens til , at der indtraeffer sene doedsfald .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Dyrene fastes inden teststoffet indgives . Rotter maa ikke faa foder natten foer teststoffet indgives ; for dyr med hurtigere stofskifte vil en kortere fasteperiode vaere hensigtsmaessig , der skal vaere fri adgang til drikkevand . Den foelgende dag vejes dyrene , og teststoffet indgives gruppevis i en enkelt dosis med mavesonde . Hvis det ikke er muligt at give hele dosis paa een gang , kan den gives fraktioneret over en periode , der ikke maa overstige 24 timer . Naar teststoffet er indgivet , kan man undlade at give dyrene foder i yderligere tre til fire timer . Hvis en dosis indgives fraktioneret over en periode , kan det vaere noedvendigt at give dyrene foder og vand afhaengig af , hvor lang en periode der er tale om . Efter indgivelse af teststoffet foretages der systematisk observation , som registreres for hvert enkelt dyr . Observationerne skal foretages hyppigt i loebet af den foerste dag .  Der skal foretages en grundig klinisk undersoegelse mindst een gang hver arbejdsdag . Herudover boer dyrene dagligt observeres med henblik paa , at det mindst mulige antal dyr gaar tabt for undersoegelsen , dvs . dyr , der findes doede obduceres eller nedfryses , og svage eller doeende dyr isoleres eller aflives . Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels , oejne og slimhinder , derudover aandedraet og kredsloeb , det autonome og centrale nervesystem , den motoriske aktivitet og adfaerdsmoensteret . Der boer navnlig foretages en omhyggelig observation for forekomst af rystelser , kramper , spytflaad , diarré , apati , soevn og bevidstloeshed . Doedstidspunktet noteres med stoerst mulig noejagtighed .  De dyr , der doer under forsoeget , og de dyr , der overlever til slutningen af forsoeget , obduceres . Alle makroskopisk patologiske forandringer registreres . Paa indikation udtages der vaevsproever til histopatologisk undersoegelse .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform , som for hver gruppe viser : antal dyr ved begyndelsen af forsoeget , doedstidspunkt for de enkelte dyr , antal dyr , der udviser andre tegn paa toksicitet , beskrivelse af toksiske virkninger og obduktionsresultater . Forsoegsdyrenes individuelle vaegt bestemmes og registreres kort foer teststoffet gives , derefter ugentligt og endeligt paa doedstidspunktet . AEndringer i vaegt skal beregnes og registreres , naar et dyr lever mere end een dag efter indgivelsen af teststoffet . LD50 bestemmes efter en anerkendt metode . Evaluering af data boer omfatte sammenhaeng mellem dyrenes eksposition for teststoffet og hyppighed og grad af alle forandringer , herunder adfaerdsmaessige og kliniske symptomer , makroskopisk patologiske forandringer , aendringer i legemsvaegt , doedelighed og eventuelle andre toksiske virkninger .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst mulig omfang indeholde foelgende informationer :   - dyreart/stamme , herkomst , miljoebetingelser , foder osv . ;   - forsoegsbetingelser ;   - dosisniveauer ( med angivelse af typen af vehikel , hvor et saadant er anvendt samt koncentration ) ;   - tabelopstilling over reaktioner efter koen og dosis  ( dvs . antal doserede dyr , antal doede dyr under forsoeget , antal dyr der har vist tegn paa toksicitet ) ;   - doedstidspunktet efter doseringen ;   - kliniske observationer ;   - LD50 for hvert koen bestemt efter 14 . dag ( med angivelse af beregningsmetode ) ;   - 95 % konfidensinterval for LD50 ;   - dosis/doedsfaldskurve og haeldning ( hvor beregningsmetoden muliggoer det ) ;   - obduktionsfund ;   - eventuelle histopatologiske fund ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  B . 2 . AKUT TOKSICITET , INHALATION  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  Flere grupper forsoegsdyr udsaettes i en defineret periode for teststoffet i graduerede koncentrationer , idet der anvendes en bestemt koncentration til hver enkelt gruppe . Der foretages observationer af virkningerne , herunder doed . Dyr , der doer under forsoeget obduceres . Ved slutningen af forsoeget aflives og obduceres overlevende dyr .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  Dyrene holdes under forsoegsbetingelser mht . miljoe og fodring i mindst fem dage , foer forsoeget indledes . Unge , sunde , koensmodne rotter skal fordeles randomiseret i det noedvendige antal grupper . De behoever ikke udsaettes for simuleret eksposition , medmindre dette indiceres af den type ekspositionsudstyr , der anvendes . Om noedvendigt kan der tilsaettes et egnet vehikel til teststoffet , saaledes at der opnaas en passende koncentration af teststoffet i luften . I saa tilfaelde skal der i forsoeget indgaa en kontrolgruppe , der udsaettes for vehiklet . Hvis der anvendes et vehikel eller andre tilsaetningsstoffer for at lette doseringen , skal det vaere paavist , at de ikke har nogen toksisk virkning . Her kan tidligere opsamlede data benyttes .  1.6.2 . Testbetingelser  1.6.2.1 . Forsoegsdyr  Rotter er den foretrukne dyreart , medmindre der foreligger kontraindikationer . Der benyttes rotter af almindeligt anvendte rottestammer . For saavel han - som hunrotter gaelder det , at variationen i forsoegsdyrenes vaegt ikke maa overskride mere end mere aller mindre 20 % fra en rimelig gennemsnitsvaegt .  1.6.2.2 . Antal og koen  Der anvendes mindst ti gnavere ( fem hunner og fem hanner ) til hvert koncentrationsniveau af stoffet . Hunnerne maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige .  1.6.2.3 . Ekspositionskoncentrationer  Der skal vaere tilstraekkelig mange koncentrationsniveauer og mindst tre . De skal ligge saa langt fra hinanden , at der opnaas testgrupper med en saa stor variation i den toksiske virkning og i doedelighed , at der kan tegnes en koncentrations-doedsfaldskurve og foretages en acceptabel bestemmelse af LC50 .  1.6.2.4 . Graensetest  Hvis en eksposition af fem han - og fem hundyr paa 20 mg/l af en luftart eller 5 mg/l af en aerosol eller et fint fordelt stof i fire timer , eller - hvis dette ikke kan lade sig goere som foelge af fysiske eller kemiske egenskaber ( herunder eksplosive ) ved teststoffet - den hoejeste opnaaelige koncentration ikke har teststofrelateret doedelig virkning inden for 14 dage , kan yderligere forsoeg betragtes som overfloedige .  1.6.2.5 . Ekspositionstid  Den korteste ekspotionsperiode er fire timer .  1.6.2.6 . Udstyr  Dyrene testes med inhalationsudstyr , der er udformet saaledes , at der kan opretholdes en dynamisk luftcirkulation paa mindst 12 luftskift pr . time , samtidig med at der sikres et adaekvat iltindhold og en jaevnt fordelt ekspositionsluft . Benyttes et ekspositionskammer , boer det vaere saaledes indrettet , at der undgaas sammenklumpning af forsoegsdyrene og sikres en saa stor eksponering for teststoffet ved inhalation som muligt . Den generelle regel er , at for at sikre en stabil atmosfaere , maa dyrenes totale " volumen " ikke overstige 5 % af ekspositionskammerets volumen . Ekspositionen kan foregaa gennem mund-naese , hovedet alene eller ved kamre til hele kroppen ; ved anvendelse af de to foerste muligheder opnaar man , at indtagelsen af testtoffet ad andre veje reduceres .  1.6.2.7 . Observationsperiode  Observationsperioden skal vaere mindst 14 dage . Observationsperiodens varighed boer dog ikke fastsaettes rigoristisk . Den boer bestemmes udfra toksiske reaktioner , hvornaar disse indtraeder og af restitutionsperiodens laengde ; den boer udvides , saafremt det anses for noedvendigt . Tidspunktet for , hvornaar symptomer paa toksicitet erkendes og forsvinder , samt doedstidspunktet er vigtige , navnlig hvis der er tendens til , at der indtraeffer sene doedsfald .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Kort foer ekspositionen vejes dyrene , hvorefter de udsaettes for testkoncentrationen i det paagaeldende ekspositionsudstyr i mindst fire timer , efter at koncentrationen i kammeret er aekvilibreret . AEkvilibreringsperioden boer vaere af kort varighed . Temperaturen under forsoeget boer holdes paa 22 * C mere aller mindre 3 * C . Under ideelle forhold skal den relative luftfugtighed holdes paa mellem 30 % og 70 % , men i visse tilfaelde ( f.eks . ved testning af aerosoler ) kan det vaere praktisk uigennemfoerligt . Der gives hverken foder eller vand under ekspositionen . Der anvendes et dynamisk inhalationssystem med et passende analytisk kontrolsystem til sikring af ekspositionskoncentrationen . Det anbefales at foretage en proevetest for at finde frem til passende ekspositionskoncentrationer .  Systeme boer vaere af en saadan kvalitet , at der saa hurtigt som muligt opnaas stabile ekspositionsbetingelser . Lufthastigheden skal tilpasses , saaledes at der er ensartede forhold i hele ekspositionskammeret .  Maalinger eller kontrol skal foretages af :  a ) Lufthastighed ( kontinuerligt )  b ) Den faktiske koncentration af teststoffet maalt i opholdsarealet . Koncentrationen maa under ekspositionsperioden ikke variere mere end mere aller mindre 15 % fra den gennemsnitlige koncentration . Det kan dog vaere umuligt at opnaa en saadan grad af kontrol med fint fordelt stof og aerosoler , i saa tilfaelde kan stoerre udsving accepteres . For partikler og aerosoler skal der foretages analyser saa ofte , som det er noedvendigt , og mindst én gang , for at fastslaa om partikelstoerrelsen er jaevnt fordelt .  c ) Temperatur og luftfugtighed .  d ) Under og efter eksposition foretages der systematisk observationer , som registreres for hvert enkelt dyr . Observationerne skal foretages hyppigt i loebet af den foerste dag . Der skal foretages en grundig klinisk undersoegelse mindst een gang hver arbejdsdag . Herudover boer dyrene dagligt observeres med henblik paa , at det mindst mulige antal dyr gaar tabt for undersoegelsen , dvs . dyr der findes doede obduceres eller nedfryses , og svage eller doeende dyr isoleres eller aflives . Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels , oejne og slimhinde , derudover aandedraet og kredsloeb , det autonome og centrale nervesystem , den motoriske aktivitet og adfaerdsmoenstret . Der boer navnlig foretages en omhyggelig observation af respiration , rystelser , kramper , spytflaad , diarre , apati , soevn og bevidstloeshed . Doedstidspunktet noteres med stoerst mulig noejagtighed . Forsoegsdyrenes vaegt bestemmes ugentlig og paa doedstidspunktet .  De dyr , der doer under forsoeget , og de , der overlever til forsoegets slutning , obduceres med saerlig opmaerksomhed rettet mod eventuelle aendringer i oevre og nedre del af luftvejene . Alle makroskopiske patologiske forandringer registreres . Paa indikation udtages der vaevsproever til histopatologisk undersoegelse .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform , som for hver gruppe viser : antal dyr ved begyndelsen af forsoeget , doedstidspunkt for de enkelte dyr , antal dyr , der udviser andre tegn paa toksicitet , beskrivelse af toksiske virkninger og obduktionsresultater . AEndringer i vaegt skal beregnes og registreres , naar et dyr lever ud over foerste dag . LC50 bestemmes efter en anerkendt metode . Evaluering af data boer omfatte sammenhaeng , hvis et saadant findes , mellem dyrenes eksposition for teststof og hyppighed og grad af alle forandringer , herunder adfaerdsmaessige og kliniske symptomer , makroskopisk patologiske forandringer , aendringer i legemsvaegt , doedelighed og eventuelle andre toksiske virkninger .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationen   - dyreart/stamme , herkomst , miljoebetingelser , foder osv . ;   - Forsoegsbetingelser :  Beskrivelse af ekspositionsudstyret ; herunder udformning , type , dimensionering , luftkilde , system til frembringelse af partikler og aerosoler , metode til konditionering af luften og den maade hvorpaa dyrene holdes i et ekspositionskammer , naar et saadant benyttes .  Apparatur til maaling af temperatur , fugtighed og partikulaere aerosolers koncentration skal beskrives .  Ekspositionsdata :  Disse skal opstilles i tabelform og angive middelvaerdi og variation ( standardafvigelse ) og boer i videst mulig omfang omfatte :  a ) lufthastigheden gennem inhalationsudstyret ;  b ) luftens temperatur og fugtighed ;  c ) nominelle koncentrationer ( total maengde teststof tilfoert inhalationsudstyret , divideret med luftvolumen ) ;  d ) type vehikel hvor et saadant er anvendt ;  e ) faktiske koncentrationer i opholdsarealet under forsoeget ;  f ) middelvaerdi af patikelstoerrelse ;  g ) ekvilibreringsperiode ;  h ) ekspositionsperiode ;   - tabelopstilling af data over virkninger efter koen og ekspositionsniveau ( dvs . antal dyr eksponeret , antal dyr doede under forsoeget , antal dyr , der har vist tegn paa toksicitet ) ;   - doedstidspunktet under eller efter eksposition ;   - kliniske observationer af dyrene ;   - LC50 for hvert koen bestemt ved afslutningen af observationsperioden ( med angivelse af beregningsmetode ) ;   - dosis-doedsfaldskurve og haeldning ( hvor beregningsmetoden muliggoer det ) ;   - obduktionsfund ;   - eventuelle histopatologiske fund ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne ;  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  B . 3 . AKUT TOKSICITET , OPTAGELSE GENNEM HUDEN  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  Teststoffet paafoeres huden paa flere grupper af forsoegsdyr i graduerede doser , idet der gives en bestemt dosis til hver enkelt gruppe . Der foretages observationer af virkningerne , herunder doed . Dyr , som doer under forsoeget obduceres . Ved slutningen af forsoeget aflives og obduceres overlevende dyr .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  Dyrene holdes under forsoegsbetingelser mht . miljoe og fodring i mindst fem dage , foer forsoeget indledes . Unge , sunde , koensmodne dyr fordeles randomiseret i forsoegsgrupper . Ca . 24 timer foer forsoeget begyndes , fjernes pelsen paa ryggen af forsoegsdyrene ved klipning eller barbering . Under denne procedure maa man passe paa ikke at beskadige huden , da det kan aendre dens permeabilitet . Mindst 10 % af kroppens overflade skal goeres klar til paafoering af teststoffet . Ved testning af faste stoffer , som - hvis det er hensigtsmaessigt - kan pulveriseres , skal teststoffet fugtes tilstraekkeligt med vand eller om noedvendigt med et passende vehikel for at sikre god kontakt med huden . Hvis der anvendes et vehikel , boer man tage hensyn til , om vehiklet har indflydelse paa hudens permeabilitet for teststoffet . Flydende teststoffer paafoeres normalt ufortyndet .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Forsoegsdyr  Der kan anvendes voksne rotter eller kaniner . Der kan anvendes andre dyrearter , men i saa fald skal dette vaere begrundet . Der benyttes dyr af almindeligt anvendte stammer . For begge koen af forsoegsdyr gaelder det , at variationen i deres vaegt ikke maa overskride mere aller mindre 20 % af en rimelig gennemsnitsvaegt .  1.6.2.2 . Antal og koen  Der anvendes mindst ti dyr ( fem hunner og fem hanner ) med sund , intakt hud til hvert dosisniveau . Hunnerne maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige . Det kan i nogle tilfaelde begrundes at vaelge et mindre antal forsoegsdyr , navnlig naar der er tale om kaniner .  1.6.2.3 . Dosisniveauer  Til forsoeget anvendes et tilstraekkeligt antal dosisniveauer , mindst tre . De skal ligge saa langt fra hinanden , at der opnaas testgrupper med variation i den toksiske virkning og i doedelighed . Der boer ved doseringen tages hensyn til en eventuel hudirriterende eller aetsende virkning . Der skal vaere tilstraekkeligt med data til , at der kan tegnes en dosis-virkningskurve , og til , hvor det er muligt , at foretage en acceptabel bestemmelse af LD50 .  1.6.2.4 . Graensetest  Hvis en dosis paa 2 000 mg/kg legemsvaegt eller mere , som paafoeres intakt hud paa mindst fem dyr pr . koen som led i en foreloebig test , ikke medfoerer teststofrelaterede doedsfald inden for 14 dage , kan yderligere forsoeg med andre doser betragtes som unoedvendige .  1.6.2.5 . Observationsperiode  Observationsperioden skal vaere mindst 14 dage . Observationsperiodens varighed boer dog ikke fastsaettes rigoristisk . Den boer bestemmes udfra toksiske reaktioner , hvornaar disse indtraeder og af restitutionsperiodens laengde ; den boer udvides , saafremt det anses for noedvendigt . Tidspunktet for hvornaar symptomer paa toksicitet erkendes og forsvinder samt doedstidspunktet er vigtige , navnlig hvis der er tendens til , at der indtraeffer sene doedsfald .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Dyrene skal holdes i hver sit bur . Teststoffet skal paafoeres jaevnt over et omraade , som svarer til ca . 10 % af den samlede kropsoverflade . Med staerkt toksiske stoffer kan der anvendes et mindre omraade , men stoffet boer paafoeres saa tyndt og ensartet og over saa stor en del af omraadet som muligt .  Teststoffet skal holdes i kontakt med huden ved hjaelp af en poroes gazeforbinding og en ikke-hudirriterende klaebestrimmel i en ekspositionsperiode paa 24 timer . Teststedet skal desuden daekkes paa en saadan maade , at gazeforbindingen og teststoffet holdes sikkert paa plads , saa det sikres , at dyrene ikke indtager teststoffet . Der kan anvendes andre foranstaltninger , som forhindrer indtagelse af teststoffet . Fuldstaendig immobolisering kan ikke anbefales .  Ved ekspositionsperiodens slutning fjernes eventuelt tilbagesiddende teststof , idet der f.eks . anvendes vand eller en anden egnet metode til at rense huden .  Der foretages systematisk observationer , som registreres for hvert enkelt dyr . Dyrene observeres hyppigt i loebet af den foerste dag . Der skal foretages en grundig klinisk undersoegelse mindst een gang hver arbejdsdag . Herudover boer dyrene daglig observeres med henblik paa , at det mindst mulige antal dyr gaar tabt for undersoegelsen , dvs . dyr der findes doede obduceres eller nedfryses , og svage eller doeende dyr isoleres eller aflives . Inspektionen af dyrene skal omfatte forandringer i pels , behandelt hud , oejne og slimhinder , derudover aandedraet og kredsloeb , det autonome og centrale nervesystem , den motoriske aktivitet samt adfaerdsmoensteret . Der boer foretages omhyggelig observation af rystelser , kramper , spytflaad , diarré , apati , soevn og bevidstloeshed . Doedstidspunktet skal noteres saa praecist som muligt . De dyr , der doer under forsoeget , og de , der overlever til forsoegets slutning , aflives og obduceres . Alle makroskopiske patologiske forandringer registreres . Paa indikation udtages der vaevsproever til histopatologisk undersoegelse .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform , som for hver gruppe viser antal dyr ved begyndelsen af forsoeget , doedstidspunkt for de enkelte dyr , antal dyr , der udviser andre tegn paa toksicitet , beskrivelse af toksiske virkninger og obduktionsresultater . Dyrenes individuelle vaegt registreres kort foer teststoffet paafoeres derefter hver uge og endelig paa doedstidspunktet ; aendringer i vaegt skal beregnes og registreres , hvis dyrene lever mere end en dag efter paafoeringen af teststoffet LD50 bestemmes efter en anerkendt metode .  Evaluering af data boer omfatte sammenhaeng , hvis et saadant findes , mellem dyrenes eksposition for teststof og hyppighed og grad af alle forandringer herunder adfaerdsmaessige og kliniske symptomer , makroskopisk patologiske forandringer , aendringer i legemsvaegt , doedelighed og eventuelle andre toksiske virkninger .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationer :   - dyreart/stamme , herkomst , miljoebetingelser , foder osv . ;   - forsoegsbetingelser ( herunder arten af hudrensningsmetoden ) ;   - dosisniveauer ( med angivelse af typen af vehikel , hvor et saadant er anvendt samt koncentration ) ;   - tabelopstilling over virkninger efter koen og dosisniveau ( dvs . antal doserede dyr , antal dyr doede under forsoeget , antal dyr , der har vist tegn paa toksicitet ) ;   - doedstidspunktet efter doseringen ;   - kliniske observationer af dyrene ;   - LD50 bestemt den 14 . dag for hvert koen med angivelse af beregningsmetoden ;   - 95 % konfidensinterval for LD50 ( hvor dette kan angives ) ;   - dosis-doedsfaldskurve og haeldning , hvor beregningsmetoden muliggoer det ;   - obduktionsfund ;   - eventuelle histopatologiske fund ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  B . 4 . AKUT TOKSICITET , HUDIRRITATION  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  Teststoffet paafoeres huden i en enkelt dosis paa en raekke forsoegsdyr , der hver isaer fungerer som sin egen kontrol . Efter et fastlagt tidsrum vurderes og noteres graden af irritation . Effekten beskrives detaljeret med henblik paa en fuldstaendig vurdering af virkningerne . Observationerne boer straekke sig over et saa langt tidsrum , at de fuldt ud giver mulighed for at vurdere en eventuel tilbagevenden til normal tilstand .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  Ca . 24 timer foer forsoeget begyndes , fjernes pelsen paa ryggen af forsoegsdyrene ved klipning eller barbering . Under denne procedure maa man passe paa ikke at beskadige huden . Der boer kun benyttes dyr med sund og intakt hud .  Ved testning af faste stoffer som - hvis det er hensigtsmaessigt - kan pulveriseres , skal teststoffet fugtes tilstraekkeligt med vand eller om noedvendigt med et passende vehikel , for at sikre god kontakt med huden . Hvis der anvendes et vehikel , boer man tage hensyn til , om vehiklet har indflydelse paa teststoffets hudirriterende virkning . Flydende teststoffer paafoeres normalt ufortyndet .  Det er ikke noedvendigt at undersoege teststoffer , som er staerkt sure eller alkaliske for akut hudirriterende virkning , da deres aetsende virkning er forudseelig . Det er ogsaa unoedvendigt at teste stoffer , der har vist en hoej grad af toksicitet ved optagelse gennem huden .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Forsoegsdyr  Det fortrukne forsoegsdyr er albino kaninen , selv om mange andre pattedyrarter ogsaa kan anvendes .  1.6.2.2 . Antal dyr  Der anvendes mindst tre sunde koensmodne dyr . Det kan vaere noedvendigt at anvende flere dyr , for at afklare usikre responser .  1.6.2.3 . Dosisniveauer  Medmindre der foreligger kontraindikationer paafoeres testarealet 0,5 ml flydende eller 0,5 g fast eller halvflydende teststof . Det er ikke noedvendigt at anvende ubehandlede dyr som kontrolgruppe . Tilstoedende , ubehandelede hudomraader paa hvert enkelt dyr fungerer som kontrol .  1.6.2.4 . Observationsperiode  Observationsperiodens varighed boer ikke fastsaettes rigoristisk . Den skal vaere tilstraekkelig lang til fuldt ud at give mulighed for at vurdere den observerede virkning og en eventuel tilbagevenden til en normal tilstand , men behoever i almindelighed ikke at overskride 14 dage efter paafoeringen .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Dyrene skal holdes i hvert sit bur . Teststoffet paafoeres et lille hudomraade ( ca . 6 cm2 ) og daekkes med et stykke gaze , som holdes paa plads med en ikke-hudirriterende klaebestrimmel . Hvis der anvendes flydende eller pastaagtige teststoffer , kan det vaere noedvendigt at paafoere gazestoffet teststoffet , og derefter placere gazestykket paa huden . I ekspositionsperioden boer gazestykket holdes i loes kontakt med huden ved hjaelp af en passende semi-okklusiv forbinding . Der kan imidlertid vaere tilfaelde , hvor en okklusiv forbinding er paakraevet . Man skal sikre sig . at dyrene ikke kan komme til at loesne gazestykket og derved indtage/inhalere teststoffet .  Ekspositionperioden er fire timer . Hvis det forventes , at teststoffet vil give en alvorlig hudreaktion  ( laetsning ) maa ekspositionsperioden forkortes  ( eks . til en time eller tre minutter ) .  Hvis der anvendes en ekspositionsperiode , som er mindre end fire timer , og en alvorlig hudreaktion i agttages , behoever man ikke gentage forsoeget med en fire timers ekspositionsperiode . Der kan under visse omstaendigheder vaere indikation for laengere ekspositionsperioder , f.eks . naar den humane anvendelse berettiger det . Ved ekspositionsperiodens slutning fjernes tilbagesiddende teststof , saa vidt muligt ved hjaelp af vand eller et egnet oploesningsmiddel , idet man skal undgaa at paavirke det fremkomne respons eller beskadige epidermis .  1.6.3.1 . Observation og klassificering  Dyrene observeres for erytem og oedem , og respons noteres efter 30 - 60 minutter og derpaa 24 , 48 og 72 timer efter , at forbindingen er fjernet . Hudirritation klassificeres i overensstemmelse med tabellen . Det kan vaere noedvendigt at foretage yderligere observationer for at undersoege eventuel opheling til normal tilstand . I forbindelse med observering for hudirritation boer der gives en fuld beskrivelse af eventuelle alvorlige laesioner f.eks . aetsninger ( irreversibel destruktion af hudvaev ) eller andre toksiske virkninger .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform , som for hvert enkelt dyr angiver klassificering af erytem og oedem i hele observationsperioden . Man skal beskrive alle alvorlige laesioner , graden og arten af irritation , opheling eller aetsning og eventuelle andre observerede toksiske effekter .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationer :   - dyreart/stamme , herkomst , miljoebetingelser , foder osv . ;   - forsoegsbetingelser ( herunder kemikaliets relevante fysisk-kemiske egenskaber og den anvendte teknik ved forberedelse og rensning af hud ) ;   - tabelopstilling over hvert enkelt dyrs irritationsrespons i hver enkel observationsperiode ( f.eks . 1 , 24 , 48 , 72 osv . timer efter fjernelse af forbindingen ) ;   - beskrivelse af alle alvorlige laesioner , inklusiv aetsning ;   - beskrivelse af arten og graden af den observerede irritation og eventuelle histopatologiske fund ;   - beskrivelse af eventuelle toksiske virkninger udover hudirritation ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  TABEL  KLASSIFICERING AF HUDENS REAKTION  Erytem og skorpedannelse   * Vaerdi *  Intet erytem * 0 *  Let erytem ( knapt diagnosticerbart ) * 1 *  Veldefineret erytem * 2 *  Moderat til svaert erytem * 3 *  Svaert erytem ( roedbedefarvet ) til let skorpedannelse ( dyberegaaende beskadigelse ) * 4 *  Oedemer  Intet oedem * 0 *  Let oedem ( knapt diagnosticerbart ) * 1 *  Oedem ( veldefineret omraade afgraenset at konstaterbar haevelse ) * 2 *  Moderat oedem ( afgraenset af ca . 1 mm haevelse ) * 3 *  Svaert oedem ( mere end 1 mm haevelse og udstraekning ud over ekspositionsomraadet ) * 4 *  B . 5 . AKUT TOKSICITET , OEJENIRRITATION  1 . METODER  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .1.4 . Princip for testmetoden  Et antal forsoegsdyr paafoeres det ene oeje hele teststofdosis . Det ubehandlede oeje benyttes som kontrol . Graden af irritation vurderes og klassificeres med bestemte intervaller . Der udarbejdes en udfoerlig beskrivelse med henblik paa en fuldstaendig vurdering af virkningerne . Observationerne boer straekke sig over saa langt et tidsrum , at de fuldt ud giver mulighed for at vurdere regeneration eller persistens af virkningerne .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  Inden for de sidste 24 timer , foer forsoeget begyndes , undersoeges oejnene paa de dyr , der foreloebigt er udtaget til forsoeget . Dyr , som lider af oejenirritation , oejendefekter eller som tidligere har haft hornhindebeskadigelser anvendes ikke .  Staerkt alkaliske eller staerkt sure teststoffer og stoffer , som i en hudirritationstest eller i andre tests har vist sig at vaere udpraeget aetsende , er det ikke noedvendigt at teste for oejenirritation .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Forsoegsdyr  Det anbefales at anvende sunde , koensmodne albinokaniner , selv om mange andre forsoegsdyr har vaeret anvendt .  1.6.2.2 . Antal dyr  Der anvendes mindst tre dyr . Det kan vaere noedvendigt at anvende flere dyr , for at afklare usikre responser .  1.6.2.3 . Dosisniveauer  Ved undersoegelse af flydende stoffer anvendes 0,1 ml . Ved undersoegelse af faste stoffer , pastaer og fintfordelte faste stoffer , anvendes et volumen paa 0,1 ml eller en maengde paa ca . 0,1 g ( vaegten registreres under alle omstaendigheder ) . Faste og granulerede teststoffer knuses til fine stoevpartikler . Partiklernes volumen maales efter let sammenpresning f . eks . frembragt ved smaa slag paa maalebeholderen .  1.6.2.4 . Observationsperiode  Observationsperiodens varighed boer ikke fastsaettes rigoristisk . Den boer vaere tilstraekkelig lang til at give mulighed for at vurdere , om observerede virkninger forsvinder eller persisterer , men behoever normalt ikke overskride 21 dage efter instillation .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Dyrene skal holdes i hvert sit bur . Teststoffet instilleres hos hvert enkelt dyr i det ene oejes nederste oejenlaag , ved forsigtigt at traekke det lidt ud fra oejeaeblet . Derefter holdes oejenlaagene sammen i ca . et sek . for at forhindre , at noget af stoffet loeber ud . Det ubehandlede oeje fungerer som kontrol .  I 24 timer efter instillation af teststoffet maa der ikke foretages skylning af forsoegsdyrenes oejne . Efter 24 timers forloeb kan der , hvis det skoennes rimeligt , foretages skylning .  Naar et stof i denne test har vist sig at foraarsage oejenirritation , kan det undersoeges , om oejenudskylning kan reducere irritationen eller andre skadevirkninger . I saa tilfaelde anbefales det at anvende seks kaniner . Tre kaniner faar foretaget en oejenskylning fire sek . efter instillation af teststoffet , og de oevrige tre kaniner faar foretaget skylning efter 30 sek . Skylningen varer for begge gruppers vedkommende fem minutter og foregaar med et vaeskevolumen og vaesketryk , som ikke beskadiger oejet .  1.6.3.1 . Observation og klassificering  Oejnene undersoeges efter 1 , 24 , 48 og 72 timers forloeb . Hvis der ikke er tegn paa irritation efter 73 timer , kan undersoegelsen afsluttes .  Saafremt der forekommer vedvarende beskadigelse af hornhinden eller anden oejenirritation , kan det vaere noedvendigt at udvide observationerne for at kunne bestemme udviklingen af laesionerne , om de forsvinder eller persisterer . Samtidig med observation af hornhinde , iris og bindehinder registreres og rapporteres eventuelle andre laesioner . Oejets reaktionsgrad ( tabellen ) skal registreres ved hver enkelt undersoegelse . ( Inddeling af oejets responser i grader kan goeres til genstand for forskellige fortolkninger . Til hjaelp for forsoegslaboratorier og personale , der foretager og fortolker observationer , kan en illustreret vejledning om oejenirritationer anvendes . )  Undersoegelse af oejenreaktionerne kan lettes ved anvendelse af binokulaer lup , haandspaltelampe , binokulaert mikroskop eller andre egnede instrumenter . Efter de foerste 24 timers observationer kan en eller flere kaniners oejne undersoeges yderligere ved hjaelp af fluorescein .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform , som for hvert enkelt dyr angiver klassificering af oejenirritation paa et givet observationstidspunkt . En beskrivelse af arten og graden af irritation og tilstedevaerelse af alvorlige laesioner og enhver observeret virkning ud over virkningen paa selve oejet skal indgaa i rapporten .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationer :   - dyreart/stamme , herkomst , miljoebetingelser , foder osv . ;   - forsoegsbetingelser ( herunder teststoffets relevante fysisk-kemiske egenskaber ) ;   - tabelopstilling over irritations/aetsningsrespons hos hvert enkelt dyr paa hvert enkelt observationstidspunkt f . eks . 1 , 24 , 48 og 72 timer ) ;   - beskrivelse af alle alvorlige laesioner ;   - beskrivelse af arten og graden af observeret irritation og aetsning , herunder regeneration til normal tilstand ;   - beskrivelse af den anvendte metode til klassificering af irritation efter 1 , 24 , 48 og 72 timers forloeb  ( f . eks . haandspaltelampe , binokulaert mikroskop , fluorescein ) ;   - beskrivelse af eventuelle registrerede lokale virkninger uden for selve oejet ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  TABEL  KLASSIFICERING AF OEJENLAESIONER  Hornhinden ( Corena )  Opacitet : graden af uklarhed ( vurdering baseres paa det omraade , der udviser en stoerste uklarhed ) .  Ingen saardannelse eller opacitet * 0 *  Spredte eller diffuse omraader med opacitet ( ud over let taage i stedet for normal glans ) , iris klart og detaljeret synlig * 1 *  Umiddelbart skelneligt gennemskinneligt omraade , let sloering af detaljerne i iris * 2 *  Omraade med ardannelse , detaljerne i iris ikke synlige , pupilstoerrelsen knapt synlig * 3 *  Fuldstaendig opacitet , iris ikke synlig gennem opacitet * 4 *  Iris  Normal * 0 *  Markant dybere rugae , kongestion , opsvulmning , moderat hypermaemi omkring hornhinden eller injicerede conjunctiva eller flere af disse symptomer , iris stadig lysfoelsom ( traeg reaktion er positiv ) * 1 *  Ingen lysfoelsomhed , haemorragi , makroskopisk synlig beskadigelse ( et eller flere af disse symptomer ) * 2 *  Bindehinder ( conjunctiva )  Roedme ( af oejenlaagets og oejenaeblets bindehinder , hornhinden og iris ) .  Normale blodkar * 0 *  Nogle blodkar tydeligt hyperaemiske  ( injicerede ) * 1 *  Spredt hoejroed farvning , de enkelte kar ikke klart skelnelige * 2 *  Spredt moerkeroed farvning * 3 *  Chemosis : oejenlaag og/eller blinkhinde  Ingen opsvulmning * 0 *  Unormal opsvulmning ( omfattende blinkhinden ) * 1 *  Tydelig opsvulmning med partiel udkraengning af oejenlaagene * 3 *  Opsvulmning med halvt lukkede oejenlaag * 3 *  Opsvulmning med oejenlaagene mere end halvt lukkede * 4 *  B . 6 . AKUT TOKSICITET , HUDSENSIBILISERING  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden/Guinea Pig Maximisation Test  Efter den foerste eksposition for teststoffet  ( " induktionsperioden " ) udsaettes dyrene to uger efter den sidste eksposition for en provokationsmaengde af teststoffet med henblik paa at konstatere , om der er opstaaet hypersensibilitet . Sensibilisering konstateres ved at undersoege hudens reaktion ved provokation med teststoffet .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  Unge , sunde dyr ( under et aar gamle ) fordeles randomiseret i forsoegs - og kontrolgrupper . Foer forsoeget begyndes fjernes pelsen paa skuldrene af forsoegsdyrene ved klipning eller barbering . Man maa passe paa ikke at beskadige huden .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Forsoegsdyr  Som forsoegsdyr anvendes albinomarsvin .  1.6.2.2 . Antal og koen  Der anvendes han - og/eller hundyr . Saafremt der benyttes hundyr , maa de ikke have foedt , og de maa ikke vaere draegtige . Der benyttes tyve dyr i forsoegsgruppen og mindst ti i kontrolgruppen . Anvendes der faerre dyr , skal det begrundes .  1.6.2.3 . Dosisniveauer  Koncentrationen af teststoffet bestemmes i forhold til den hoejeste dosis , der i induktionsfasen ikke har vist sig at have toksisk effekt .  Provokationsmaengden maa ikke foraarsage hudirritation hos ikke-sensibiliserede dyr . Koncentrationen kan bestemmes i en forundersoegelse f.eks to til tre dyr .  1.6.2.4 . Observationsperiode  Under induktionsperioden observeres for eventuel hudirritation . Efter provokationen registreres hudens reaktion efter 48 og 72 timer .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Dyrene vejes foer induktionsperioden og efter forsoegets afslutning . Pelsen klippes paa ryggens skulderregion . Der er to stadier i fremgangsmaaden :  1.6.3.1 . Induktion  Dag 0-Forsoegsgruppe .  Foelgende intradermale injektioner gives parvis i skulderregionen . Hvert injektionspar placeres paa hver side af midterlinjen .  1 ) 0,1 ml af Freunds komplette adjuvant ( FCA ) ,  2 ) 0,1 ml af teststoffet , eventuelt i vehikel ,  3 ) 0,1 ml teststof i FCA .  De under 1 ) og 2 ) naevnte injektioner placeres taet paa hinanden og naermest ved hovedet . Den under 3 ) naevnte placeres i den bageste del af testomraadet .  Dag 0-Kontrolgruppe .  Foelgende intradermale injektioner foretages parvis paa samme steder som ovenfor naevnt .  1 ) 0,1 ml FCA ,  2 ) 0,1 ml vehikel ,  3 ) 0,1 ml vehikel i FCA .  Dag 7-Forsoegsgruppe .  Haarene fjernes igen fra testomraadet . Teststoffet , i passende vehikel , fordeles over et stykke filtrerpapir , placeres paa testomraadet og holdes paa plads med en passende forbinding i 48 timer .  ( Vaesker kan , hvis det skoennes rimeligt paafoeres direkte ) .  Dag 7-Kontrolgruppe .  Haarene fjernes igen fra testomraadet . Vehikel paafoeres huden paa den tidligere naevnte maade og holdes paa plads med en passende forbinding i 48 timer .  1.6.3.2 . Provokation  Dag 21 .  Pelsen fjernes fra flanken af dyr i forsoegs - og i kontrolgruppen . Paa forsoegsdyrenes venstre side fastgoeres en lap eller et kammer indeholdende teststoffet , og paa deres hoejre side fastgoeres en lap eller et kammer med vehikel . Lapperne holdes i kontakt med huden ved hjaelp af passende forbindinger i 24 timer . Kontrolgruppen behandles paa samme maade .  Dag 23 og 24 .  21 timer efter at lappen er fjernet , renses provokationsomraadet , og barberes om noedvendigt .  3 timer senere ( 48 timer efter provokationseksponeringen begyndte ) registreres og klassificeres hudens reaktio .  24 timer efter denne observation ( 72 timer ) observeres og klassificeres paa ny .  Resultaterne fra den foerste provokationseksposition kan om noedvendigt uddybbes ved en fornyet provokationseksposition , med en ny vehikelkontrolgruppe , ca . en uge efter den foerste eksposition .  1.6.3.3 . Observation og klassificering  Enhver hudreaktion og enhver usaedvanlig virkning af induktionen og provokationsekspositionen skal registreres og klassificeres .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform , som for hvert enkelt dyr angiver hudens reaktion i forbindelse med hver enkelt observation .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationer :   - anvendt marsvinstamme ;   - forsoegsbetingelser ;   - dyrenes antal , alder og koen ;   - hvert dyrs individuelle vaegt ved forsoegets begyndelse og slutning ;   - hver enkelt observation af hvert enkelt dyr inklusive klassificeringssystemet , hvis et saadant er anvendt ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  Bemaerkninger  Maksimeringstest paa marsvin ( GPMT ) er en meget anvendt test af adjuvanttypen , skoent der kan benyttes en raekke andre metoder ( anfoert i vedlagte oversigt ) til at undersoege et stofs potentielle sensibiliserende effekt . Maksimeringstesten er den normalt foretrukne ( reference ) metode .  Testens sensitivitet og dens evne til at afsloere potentielle sensibiliserende stoffer for menneskets hud anses for at vaere af stor betydning i et klassifikationssystem for toksicitet med relevans for en befolknings sundhed . Et eventuelt valg af en anden test maa begrundes , og der maa anfoeres kriterier for dens validitet . Et af kriterierne maa vaere en forventet reaktion paa standardallergener saasom 2,4-dinitrochlorbenzen eller p-fenylendiamin eller et andet staerktvirkende sensibiliserende stof , der passer til den gruppe af stoffer , der testes .  Der findes ikke nogen enkelt testmetode , hvorved man med sikkerhed kan identificere alle stoffer , som besidder mulighed for at sensibilisere menneskets hud , og som kan anvendes til alle stoffer .  Faktorer som et stofs fysiske egenskaber , herunder dets evne til at traenge igennem huden , og den maade , hvorpaa mennesker , som formodes at kunne blive udsat for det , kommer i kontakt med stoffet , maa tages i betragtning ved valget af test . Forsoeg med marsvin kan underopdeles i adjuvant-typen , hvor en allergisk tilstand forstaerkes , naar forsoegsstoffet oploeses eller opslaemmes i Freunds komplette adjuvant  ( FCA ) , og non-adjuvant-typerne . I visse tilfaelde kan der vaere god grund til at vaelge en test , hvor der benyttes lokal applikation fremfor intradermal injektion , som ved maksimeringstesten paa marsvin .  Ogsaa her boer der tages hensyn til forsoegsstoffets fysiske egenskaber og de betingelser , hvorunder mennesker formodes at kunne blive udsat for det .  Sensibiliteten hos den marsvinestamme , der anvendes til hudsensibiliseringstests , maa kontrolleres med regelmaessige mellemrum ( hvert halve aar ) ved anvendelse af kendte , staerke og moderat sensibiliserende stoffer , og der skal opnaas et tilfredsstillende antal positive reaktioner .  Tabel  Test * Draize * Freunds komplette adjuvant  ( FCA ) * Maurer optimering * Buehler * Aaben epikutan test * Split adjuvant *  Dyreart * marsvin * marsvin * marsvin * marsvin * marsvin * marsvin *  Administrationsmaade * intradermal ( id ) * intradermal  ( id ) * intradermal ( id ) * epikutan ( ec ) * epikutan  ( ec ) * id og ec *  Antal i testgruppe * 20 * 8 - 10 * 10 - 10 * 10 - 20 * 6 - 8 * 10 - 20 *  Antal testgrupper * 1 * 1 * 1 * 1 * 1 - 6 * 1 *  Antal i kontrolgruppe * 20 * 8 - 10 * 10 - 10 * 10 - 20 * 6 - 8 * 10 - 20 *  Induktionseksposition * * * * * * *  Administrationsmaade * id * id * id * dermal * dermal * id og dermal *  Antal ekspositioner * 10 * 5 * 9 * 3 * 20 eller 21 * 4 *  Ekspositionsperiode * - * - * 24 timer * 6 timer hver * fortloebende * 48 timer hver *  Laptype * - * - * - * lukket * aaben * lukket *  Testgruppe(r ) * TS ( 1 ) * TS i FCA * TS i FCA * TS * TS * TS *  Kontrolgruppe * - * kun FCA * - * - * kun vehikel * - *  Placering * v . side * h . side * ryg * v . side * h . side * skulder *  Frekvens * hver anden dag * hver anden dag * hver anden dag * hver 7 . dag * daglig * 0 , 2 , 4 , 7 . dag *  Varighed * 0 - 18 dage * 0 - 8 dage * 0 - 21 dage * 0 - 14 dage * 0 - 20 dage * 0 - 7 dage *  Koncentration * 2 - 10 dobbelt saa meget som foerste * samme hele tiden * 0,1 ml à 0,1 % * samme hele tiden * samme pr . gruppe forskellig for grupperne * samme hele tiden *  Provokations eksposition * * * * * * *  Administrationsmaade * id * dermal * id * dermal * dermal * dermal *  Antal ekspositioner * 1 * 2 * 1 * 1 * 2 * 1 *  Dag(e ) * 35 * 22 og 35 * 14 og 28 * 28 * 21 og 35 * 20 *  Ekspositionsperiode * - * - * 24 timer * 6 timer * - * 24 timer *  Laptype * - * aaben * - * lukket * aaben * lukket *  Testgruppe(r ) * TS * TS * TS * TS * TS * TS *  Kontrolgruppe * TS * TS * TS * TS * TS * TS *  Placering * h . side * v . side * ryg , nyt sted * h . side * v . side * skulder *  Koncentration * samme som foerste * 4 forskellige * 0,1 ml à 0,1 % * samme som induktion * 4 forskellige * halv induktion *  Evaluering ( timer efter provokation ) * 24 , 48 * 24 , 48 , 72 * 24 * 24 , 48 * 24 , 48 og/eller 72 * 24 , 48 *  ( 1 ) TS = Teststoffer .  B . 7 . SUBAKUT TOKSICITET , ORAL INDGIFT  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  Teststoffet indgives oralt dagligt i graduerede doser til grupper af forsoegsdyr . Der gives en dosis pr . gruppe gennem en periode paa 28 dage . Dyrene observeres dagligt i doseringsperioden . Eventuelle tegn paa en toksisk virkning registreres . Dyr , der doer under forsoeget obduceres , og dyr , der overlever til forsoegte afslutning , aflives og obduceres .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  Dyrene holdes under forsoegsbetingelser mht . miljoe og fodring i mindst fem dage inden forsoeget begyndes . Unge , sunde , dyr fordeles randomiseret i grupper . Teststoffet kan indgives med foderet , med mavesonde , i kapsler eller i drikkevandet . Alle dyr boer underkastes samme administrationsform i hele forsoegsperioden . Hvis der anvendes et vehikel eller andre tilsaetningsstoffer med henblik paa at lette doseringen , skal det vaere vist , at de ikke har nogen toksisk virkning . Her kan tidligere opsamlede data benyttes .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Forsoegsdyr  Rotten er det foretrukne forsoegsdyr , medmindre der foreligger kontraindikationer . Der benyttes unge sunde rotter af almindeligt anvendte stammer . Doseringen boer ideelt paabegyndes inden rotterne er seks uger , og under alle omstaendigheder inden de er otte uger gamle . Ved forsoegets begyndelse maa vaegten af de anvendte dyr ikke afvige mere end mere aller mindre 20 % fra gennemsnitsvaegten .  1.6.2.2 . Antal og koen  Der anvendes mindst ti dyr ( fem hun - og fem handyr ) til hver dosisniveau . Hundyrene maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige . Hvis der paaregnes aflivning af dyr under forsoeget , boer det oprindelige antal foroeges med det antal dyr , man paaregner at aflive i loebet af forsoeget . Man kan samtidig indgive en satellitgruppe paa ti dyr ( fem af hvert koen ) den hoejeste dosis i 28 dage og observere , i en periode paa 14 dage efter forsoeget . hvorvidt toksiske virkninger er reversible , persisterende eller indtraeder forsinket .  1.6.2.3 . Dosisniveauer  Der skal anvendes mindst tre dosisniveauer samt en kontrolgruppe . Dyrene i kontrolgruppen behandles noejagtigt som dyrene i forsoegsgrupperne , bortset fra indgiften af teststoffet . Hvis der anvendes et vehikel for at lette doseringen , boer kontrolgruppen indgives vehiklet paa samme maade som forsoegsgrupperne , og der boer indgives samme maengde vehikel som til forsoegsgruppen , der modtager den stoerste dosis . Den hoejeste dosis boer have toksisk effekt , men kun faa eller ingen doedsfald . Det laveste dosisniveau boer ikke have nogen toksisk virkning overhovedet . Hvis der foreligger en anvendelig vurdering af menneskers eksponering for stoffet , boer det laveste dosisniveau overskride denne eksponering . Ideelt set boer middeldosis frembringe de mindste observerbare toksiske effekter . Hvis der anvendes mere end tre dosisniveauer , boer de vaelges saaledes , at der opnaas graduering af de toksiske virkninger . I den lavt doserede og middel doserede gruppe og i kontrolgruppen boer doedeligheden holdes paa et lavt niveau for at give mulighed for en meningsfuld vurdering af resultaterne .  Hvis teststoffet indgives med foderet , kan man enten anvende en konstant koncentration ( ppm eller mg/kg i foderet ) eller en konstant dosering i forhold til dyrenes vaegt . Det benyttede alternativ specificeres . Hvis teststoffet indgives med mavesonde , boer doseringen finde sted paa samme tidspunkt hver dag . Doserne boer justeres med jaevne mellemrum ( hver eller hveranden uge ) for at dosis kan vaere konstant i forhold til dyrets legemsvaegt .  1.6.2.4 . Graensetest  Hvis der ikke i et 28 dages forsoeg udfoert efter nedenstaaende retningslinier kan konstateres toksisk virkning af en dosis paa 1000 mg/kg legemsvaegt , eller en stoerre dosis fastsat udfra kendskabet til den eventuelle eksponering mennesker udsaettes for , kan yderligere testning betragtes som unoedvendig . Det er vigtigt at sikre sig , at stoffer med lav toksicitet , som indgives med foderet , ikke paa grund af deres maengde eller andre egenskaber griber ind i ernaeringsmaessige krav .  1.6.2.5 . Observationsperiode  Alle dyr observeres dagligt , og det registreres , om der optraeder tegn paa toksisk virkning , hvornaar disse tegn optraeder foerste gang , hvor laengde de varer , og hvor kraftige de er . Doedstidspunkt og toksicitetstegns optraeden og forsvinden boer noteres .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Den ideelle dosering er , at teststoffet indgives dagligt , syv dage om ugen i en periode paa 28 dage . En eventuel satellitgruppe beregnet til laengerevarende undersoegelser holdes under observation i yderligere 14 dage , uden indgift af teststof , saaledes at man har mulighed for at registrere , om toksiske virkninger forsvinder , eller om de persisterer .  Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels , oejne og slimhinder , derudover aandedraet og kredsloeb , det autonome og centrale nervesystem , den motoriske aktivitet og adfaerdsmoenstret . Det ugentlige foderforbrug beregnes ( vandforbrug , hvis teststoffet indgives via drikkevandet ) . Dyrene vejes een gang om ugen .  Dyrene observeres med jaevne mellemrum for at det mindst mulige antal dyr gaar tabt for undersoegelsen paa grund af f.eks . kannibalisme , autolyse af vaev eller forveksling . Ved forsoegets slutning aflives og obduceres dyrene med undtagelse af satellitgruppen . Doeende dyr boer fjernes og obduceres , saa snart de registreres . Ved forsoegets slutning skal alle dyr inklusive kontrolgruppen underkastes foelgende undersoegelse .  1 ) Haematologisk undersoegelse omfattende mindst haematokrit , haemoglobinkoncentration , erythrocyttaelling , total og differential leucocyttaelling og et maal for koaguleringsevne .  2 ) Klinisk biokemisk analyse af blodet omfattende mindst een lever - og nyrefunktionsparameter : serum alanin aminotransferase ( ALAT ) , serum aspartat aminotransferase ( ASAT ) og total serumprotein , albumin , creatinin , total bilirubin og urinstof .  Andre bestemmelser , der kan vaere paakraevet for en adaekvat toksikologisk vurdering er calcium , fosfor , klorid , natrium , kalium , glucose efter faste , lipidanalyser , hormoner , syre/basebalance , methaemoglobin og cholinesteraseaktivitet .  Der kan udfoeres yderligere klinisk biokemiske analyser , hvor det skoennes noedvendigt for en videre undersoegelse af de observerede virkninger .  1.6.3.1 . Makroskopisk undersoegelse  Alle forsoegsdyrene skal underkastes en fuldstaendig makroskopisk vurdering . Lever , nyrer , binyrer testes og vejes saa hurtigt som muligt efter dissektionen for at undgaa udtoerring . Vaev og organer ( lever , nyrer , milt , binyrer og hjerte samt andre organer , der udviser alvorlige laesioner eller forandringer i stoerrelse ) opbevares i et passende medium med henblik paa en eventuel senere histopatologisk undersoegelse .  1.6.3.2 . Histopatologisk undersoegelse  Der skal foretages en histologisk undersoegelse af praepareret vaev og organer fra dyrene i kontrolgruppen samt i den gruppe , der er indgivet den hoejeste dosis . Vaev og organer , der udviser defekter , som kan tilskrives teststoffet i den gruppe , der er indgivet en hoejeste dosis , boer ogsaa undersoeges i de oevrige grupper . Dyrene i den eventuel satellitgruppe boer underkastes en histopatologisk undersoegelse isaer for de vaev og organer , der har vist en toksisk virkning i de oevrige grupper .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform , som for hver gruppe viser antal dyr ved begyndelsen af forsoeget , og for hver type af laesion det antal dyr , der udviser den paagaeldende laesion .  Evaluering af samtlige observationer skal baseres paa en passende statistisk metode . Alle anerkendte statistiske metoder kan anvendes .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationer :   - dyreart/stamme , herkomst , miljoebetingelser , foder osv . ;   - forsoegsbetingelser ;   - dosisniveauer ( med angivelse af vehikel , hvor et saadant er anvendt ) samt koncentrationer ;   - oplysninger om toksisk reaktion opdelt efter koen og dosis ;   - ikke toksisk dosis , hvis en saadan er konstateret ;   - doedstidspunkt under forsoeget eller overlevelse af forsoegsdyr til forsoegets slutning ;   - toksiske eller andre virkninger ;   - observationsperiode for hvert enkelt abnormitetstegn og den senere udvikling af abnormiteten ;   - foder - og legemsvaegt ;   - haematologiske undersoegelser og samtlige resutlater ;   - klinisk biokemiske undersoegelser og samtlige resultater ;   - obduktionsfund ;   - detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund ;   - eventuel statistisk behandling af resultaterne ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  B . 8 . SUBAKUT TOKSICITET , INHALATION  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  Flere grupper af forsoegsdyr udsaettes i 28 dage dagligt i en defineret periode for teststoffet i graduerede koncentrationer , idet hver gruppe eksponeres for en bestemt koncentration . Anvendes der et vehikel til at frembringe en passende koncentration af teststoffet i luften , boer der i forsoeget indgaa en kontrolgruppe , der udsaettes for vehiklet alene . Dyrene observeres dagligt for toksicitetstegn . Dyr , der doer under forsoeget obduceres , og ved slutningen af forsoeget aflives og obduceres de overlevende dyr .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden 1.6.1 . Forberedelse  Dyrene holdes under forsoegsbetingelser med hensyn til miljoe og fodring i mindst fem dage foer forsoeget begyndes . Unge , sunde , rotter fordeles randomiseret i det noedvendige antal grupper . Om noedvendigt kan der tilsaettes et egnet vehikel til teststoffet , saaledes at der opnaas en passende koncentration af teststoffet i luften . Hvis der anvendes et vehikel eller andre tilsaetningsstoffer med henblik paa at lette doseringen , skal det vaere paavist , at de ikke har nogen toksisk virkning . Her kan tidligere opsamlede data benyttes .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Forsoegsdyr  Rotter er den foretrukne dyreart , medmindre der foreligger kontraindikationer . Der benyttes rotter af almindeligt anvendte stammer . Ved forsoegets begyndelse gaelder det , at variationen i forsoegsdyrenes vaegt ikke maa vaere mere end mere aller mindre 20 % fra en rimelig gennemsnitsvaegt .  1.6.2.2 . Antal og koen  Der anvendes mindst ti dyr ( fem hun - og fem handyr ) i hver forsoegsgruppe . Hundyrene maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige . Hvis der paaregnes aflivning af dyr under forsoeget , boer det oprindelige antal dyr foroeges med det antal dyr , man paaregner at aflive i loebet af forsoeget . Man kan samtidig dosere en satellitgruppe paa ti dyr ( fem af hvert koen ) med den hoejeste koncentration i 28 dage og observere i en periode paa 14 dage efter forsoeget hvorvidt toksiske virkninger er reversible , persisterende eller optraeder forsinket .  1.6.2.3 . Ekspositionskoncentrationer  Der skal anvendes mindst tre forskellige koncentrationsniveauer og en kontrolgruppe eller en vehikelkontrolgruppe , ( svarende til koncentrationen af vehiklet i hoejeste dosisniveau ) , saafremt der benyttes vehikel . Dyrene i kontrolgruppen behandles noejagtig som dyrene i forsoegsgrupperne bortset fra inhalation af teststoffet . Den hoejeste koncentration boer have toksisk effekt , men kun faa eller ingen doedsfald . Det laveste dosisniveau boer ikke have nogen toksisk effekt overhovedet . Hvis der foreligger en anvendelig vurdering af menneskers eksponering for stoffet , boer den laveste dosis overskride denne eksponering . Ideelt boer middelkoncentrationen frembringe de mindste observerbare toksiske effekter . Hvis der anvendes mere end een middelkoncentration , boer de gradueres med henblik paa at opnaa en spredning af den toksiske virkning . I de grupper , der udsaettes for den lave koncentration og middelkoncentrationen og i kontrolgrupperne , boer doedeligheden holdes paa et lavt niveau for at give mulighed for en meningsfuld vurdering af resultaterne .  1.6.2.4 . Ekspositionstid  Den daglige ekspositionsperiode er seks timer , men det kan vaere noedvendigt at benytte kortere eller laengere perioder for at imoedekomme specielle krav .  1.6.2.5 . Udstyr  Dyrene testes med inhalationsapparatur , der er saaledes udformet , at der kan opretholdes en dynamisk luftgennemstroemning paa mindst 12 luftskift pr . time , samtidig med , at der sikres et adaekvat iltindhold og en jaevn fordelt ekspositionsluft . Benyttes et ekspositionskammer , boer det vaere saaledes indrettet , at der undgaas sammenklumpning af forsoegsdyrene og sikre en saa stor eksposition for teststoffet ved inhalation som muligt . Den generelle regel er , at for at sikre en stabil atmosfaere , maa dyrenes totale " volumen " ikke overstige 5 % af ekspositionskammerets volumen . Ekspositionen kan foregaa gennem mund-naese , hovedet alene eller ved kamre til hele kroppen ; ved anvendelse af de to foerste muligheder opnaar man , at indtagelsen af teststoffet ad andre veje reduceres .  1.6.2.6 . Observationsperiode  Dyrene observeres dagligt for tegn paa toksiske virkninger i hele forsoegsperioden og restitutionsperioden . Doedstidspunkt og toksicitetstegns optraeden og forsvinden boer registreres .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Dyrene eksponeres for teststoffet dagligt seks til syv dage om ugen i en periode paa 28 dage . En eventuel satellitgruppe beregnet til laengerevarende observationer skal holdes under observation i yderligere 14 dage , efter at eksponering for teststoffet er sluttet , for at registrere om en toksisk virkning er reversibel eller persisterer . Temperaturen under forsoeget boer holdes paa 22 * C mere aller mindre 3 * . Under ideelle forhold skal den relative luftfugtighed holdes paa mellem 30 % og 70 % , men i visse tilfaelde ( f . eks . ved testning af aerosoler ) kan dette vaere praktisk uigennemfoerligt . Der gives hverken foder eller vand under ekspositionen .  Der anvendes et dynamisk inhalationssystem med et passende analytisk kontrolsystem til sikring af ekspositionskoncentrationen . Det anbefales at foretage en proevetest for at finde frem til passende ekspositionskoncentrationer . Lufthastigheden skal tilpasses , saaledes at der er ensartede forhold i hele ekspositionskammeret . Systemet boer vaere af en saadan beskaffenhed , at der saa hurtigt som muligt opnaas stabile ekspositionsbetingelser .  Der skal foretages maaling og kontrol af :  a ) Lufthastighed ( kontinuerlig ) .  b ) Den faktiske koncentration af teststoffet maalt i vejrtraekningszonen . Koncentrationen maa under den daglige ekspositionsperiode ikke variere mere end mere aller mindre 15 % fra gennemsnitskoncentrationen . Det kan vaere umuligt at opnaa en saadan grad af kontrol med stoevpartikler og aerosoler , og i saa tilfaelde kan stoerre udsving accepteres . Koncentrationerne boer fra dag til dag holdes saa konstante som muligt under hele forsoegets forloeb . For partikler og aerosoler skal der foretages analyser saa ofte som det er noedvendigt for at fastslaa , om partikelstoerrelsen er jaevnt fordelt .  c ) Temperatur og luftfugtighed .  d ) Under og efter eksposition foretages der systematiske observationer , som registreres for hvert enkelt dyr . Alle dyr observeres dagligt , og det registreres , om der optraeder tegn paa toksicitet , hvornaar disse tegn optraeder foerste gang , hvor laenge de varer , og hvor kraftige de er . Inspektionen af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels , oejne og slimhinder , derudover aandedraet og kredsloeb , det autonome og det centrale nervesystem , den motoriske aktivitet og adfaerdsmoensteret . Der holdes ugentligt regnskab med foedeindtagelse , og dyrene vejes een gang om ugen . Dyrene observeres med jaevne mellemrum med henblik paa at det mindst mulige antal dyr gaar tabt for undersoegelsen paa grund af ( f . eks . ) kannibalisme , autolyse af vaev eller forveksling . Ved forsoegets slutning aflives og obduceres alle tilbagevaerende dyr med undtagelse af satellitgruppen . Doende dyr boer fjernes og obduceres , saa snart de registreres .  Ved forsoegets slutning skal alle dyr inklusiv kontrolgruppen underkastes foelgende undersoegelser :   ( i ) Haematologisk analyse omfattende mindst haematokrit , kaemoglobinkoncentration , taelling af erytrocytter , total og differential leucocyttaelling og et maal for koagulationsevnen .   ( ii ) Klinisk biokemisk analyse af blodet omfattende mindst een lever - og nyrefunktionsparameter : serum alanin aminotransferase * ( ALAT ) , serum aspartat aminotransferase ** ( ASAT ) , urinstof , albumin , kreatinin , total bilirubin og total serumprotein . Andre bestemmelser , der kan vaere paakraevet i en adaekvat toksikologisk vurdering , omfatter kalcium , fosfor , klorid , natrium , kalium , glucose efter faste , lipidanalyser , hormoner , syre/basebalance , methaemoglobin og cholinesteraseaktivitet osv . Der kan udfoeres yderligere klinisk biokemisk analyse , hvor det skoennes noedvendigt for en videre undersoegelse af de observerede virkninger .  1.6.3.1 . Makroskopisk vurdering  Alle forsoegsdyrene boer underkastes en fuldstaendig makroskopisk undersoegelse , Lever , nyrer , binyrer og testes vejes vaade saa hurtigt som muligt efter dissektion for at undgaa udtoerring . En raekke vaev og organer , luftveje , leveren , nyrerne , milten , binyrerne , hjertet samt andre organer , der udviser alvorlige laesioner eller forandringer i stoerrelse , boer praepareres i et passende medium med henblik paa en eventuel senere histopatologisk undersoegelse . Naso-Farynx ( oevreluftveje ) og lunger skal udtages hele og intakte ved dissektionen , vejes og behandles med et passende fixativ for at sikre , at lungestrukturen bibeholdes . Perfusion med et fixativ regnes for en effektiv fremgangsmaade .  1.6.3.2 . Histopatologisk undersoegelse  Der boer foretages en histopatologisk undersoegelse af praeparerede vaev og organer fra dyrene i kontrolgruppen samt i den gruppe , der har vaeret udsat for den hoejeste koncentration . Vaev og organer , der udviser defekter som kan henfoeres til teststoffet i gruppen , der har vaeret eksponeret for den hoejeste koncentration , skal ogsaa undersoeges i de oevrige grupper paa lavere dosisniveau . Dyrene i en eventuel satellitgruppe boer underkastes en histologisk undersoegelse med saerligt henblik paa de vaev og organer , der udviser toksisk paavirkning i de oevrige grupper .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform , som for hver gruppe viser antal dyr ved begyndelse af forsoeget , og for hver type af laesion det antal dyr , der udviser den paagaeldende laesion .  Evaluering af samtlige observationer , kvantitative saavel som tilfaeldige , skal baseres paa en rimelig statistisk metode . Alle anerkendte statistiske metoder kan anvendes .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationer :   - dyreart/stamme , herkomst , miljoebetingelser , foder osv . ;   - forsoegsbetingelser ;   - Beskrivelse af ekspositionsapparatur , herunder udformning , type , dimensionering , luftkilde , system til frembringelse af partikler og aerosoler , metode til konditionering af luften , behandling af udpumpet luft og den maade , hvorpaa dyrene holdes i et ekspositionskammer , naar et saadant benyttes . Apparaturet til maaling af temperatur , fugtighed og , naar det skoennes hensigtsmaessigt , aerosolkoncentrationens eller partikelstoerrelsens stabilitet skal beskrives .  Ekspositionsdata  Disse skal opstilles i tabelform og angive middelvaerdi og variation ( f.eks . standardafvigelser ) og i videst mulig omfang omfatte :  a ) lufthastighed gennem inhalationsudstyret ;  b ) luftens temperatur ;  c ) nominelle koncentrationer ( total maengde teststof tilfoert inhalationsapparaturet divideret med luftmaengden ) ;  d ) type vehikel , hvor et saadant er anvendt ;  e ) faktiske koncentrationer i opholdsarealet under forsoeget ;  f ) middelvaerdi af partikelstoerrelse ( for saa vidt den er relevant ) ;   - oplysninger om toksisk reaktion inddelt efter koen og dosis ;   - doedstidspunkt under forsoeget eller overlevelse til forsoegets slutning ;   - minimal virkningsfuld koncentration ; toksiske og andre virkninger ;   - observationstidspunkt for hvert enkelt abnormitetstegn og den senere udvikling af abnormitet ;   - data vedroerende foder og legemsvaegt ;   - de anvendte haematologiske analyser og samtlige resultater ;   - de anvendte klinisk biokemiske analyser og samtlige resultater ;   - obduktionsfund ;   - en detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund ;   - eventuel statistisk behandling af resultaterne ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  B . 9 . SUBAKUT TOKSICITET , OPTAGELSE GENNEM HUDEN  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  Teststoffet paafoeres dagligt huden i graduerede doser paa grupper af forsoegsdyr , idet der gives en bestemt dosis til hver gruppe gennem en periode paa 28 dage . Dyrene observeres dagligt i forsoegsperioden , og eventuelle tegn paa toksicitet registreres . Dyr , der doer under forsoeget obduceres , og dyr , der overlever til slutningen af forsoeget , aflives og obduceres .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  Dyrene holdes under forsoegsbetingelser med hensyn til miljoe og fodring i mindst fem dage , foer forsoeget begyndes . Unge , sunde , dyr fordeles randomiseret i forsoegsgrupper . Kort foer forsoeget indledes , klippes pelsen paa ryggen af forsoegsdyrene . Saafremt pelsen barberes bort , boer det ske ca . 24 timer inden forsoeget indledes , Klipningen eller barberingen maa som regel gentages med en uges mellemrum . Man maa ved klipning og barbering passe paa ikke at beskadige huden . Mindst 10 % af kroppens overflade klargoeres til paafoering af teststoffet . Ved afgoerelse af , hvilket og hvor stort et omraade , der skal klippes , boer der tages hensyn til dyrets vaegt . Ved testning af faste stoffer , som - hvis det er hensigtsmaessigt - kan pulveriseres , skal teststoffet fugtes tilstraekkeligt med vand eller om noedvendigt med et passende vehikel for at sikre god kontakt med huden . Flydende teststoffer paafoeres normalt udfortyndet . Teststoffet paafoeres dagligt fem til syv dage om ugen .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Forsoegsdyr  Der kan anvendes voksne rotter , kaniner eller marsvin . Der kan ogsaa anvendes andre dyrearter , men i saa fald skal det vaere begrundet . Ved forsoegets begyndelse boer dyrenes vaegt ikke variere mere end mere aller mindre 20 % fra gennemsnitsvaegten .  1.6.2.2 . Antal og koen  Der anvendes mindst ti dyr ( fem hun - og fem handyr ) med sund hud til hvert dosisniveau . Hunnerne maa ikke have foedt og maa ikke vaere draegtige . Hvis der paaregnes aflivning af dyr under forsoeget , boer det oprindelige antal dyr foroeges med det antal , man paaregner at aflive i loebet af forsoeget . Man kan herudover give en satellitgruppe paa ti dyr ( fem af hvert koen ) den hoejeste dosis gennem 28 dage og observere , hvorvidt de toksiske virkninger er reversible eller persisterende , eller indtraeder forsinket i en periode paa 14 dage efter forsoeget .  1.6.2.3 . Dosisniveauer  Der skal anvendes mindst tre forskellige dosisniveauer i mindst seks timer daglig samt en kontrolgruppe eller en vehikelkontrolgruppe , saafremt der benyttes et vehikel . Teststoffet skal paafoeres paa ca . samme tidspunkt hver dag , og doserne justeres med jaevne mellemrum ( hver eller hveranden uge ) for at dosis kan vaere konstant i forhold til dyrenes legemsvaegt . Dyrene i kontrolgruppen behandles noejagtigt som dyrene i forsoegsgrupperne bortset fra teststoffet . Hvis der anvendes et vehikel til at lette doseringen , boer vehikelkontrolgruppen doseres paa samme maade som forsoegsgrupperne og paafoeres samme maengde vehikel , som den gruppe , der modtager den hoejeste dosis . Det hoejeste dosisniveau boer give toksisk effekt , men kun faa eller ingen doedsfald . Det laveste dosisniveau boer ikke have nogen toksisk effekt overhovedet . Hvis der foreligger en anvendelig vurdering af menneskers eksponering for stoffet , boer det laveste dosisniveau overskride denne eksponering . Ideelt boer middeldosis frembringe de mindste observerbare toksiske effekter . Hvis der anvendes mere end een middeldosis , boer de gradueres med henblik paa at opnaa en spredning af toksiske virkninger . I den lavt doserede og middel doserede gruppe og i kontrolgrupperne boer doedeligheden holdes paa et lavt niveau for at give mulighed for en meningsfuld vurdering af resultaterne .  Hvis applikation af teststoffet foraarsager alvorlig hudirritation , boer koncentrationen saenkes . Dette kan medfoere en reduktion eller et fuldstaendigt bortfald af oevrige toksiske effekter paa det hoejeste dosisniveau . Hvis huden er blevet alvorligt beskadiget , kan det vaere noedvendigt at slutte forsoeget og foretage et nyt forsoeg med lavere koncentrationer .  1.6.2.4 . Graensetest  Hvis en dosis paa 1 000 mg/kg legemsvaegt i et forforsoeg eller en stoerre dosis bestemt af en eventuel vurdering af menneskers eksponering ikke giver nogen toksisk virkning , kan yderligere forsoeg betragtes som unoedvendige .  1.6.2.5 . Observationsperiode  Dyrene observeres dagligt , og det registreres , om der optraeder tegn paa toksicitet . Doedstidspunkt og tidspunkt for toksicitetstegns optraeden og forsvinden skal registreres .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Dyrene skal holdes i hvert sit bur . Den ideelle dosering er paafoering af teststoffet syv dage om ugen i en periode paa 28 dage . Eventuelle satellitgrupper beregnet til efterfoelgende observationer boer holdes under observation i yderligere 14 dage , uden paafoering af teststof , saaledes at man har mulighed for at registrere om toksiske virkninger er reversible eller om de persisterer . Ekspositionsperioden er seks timer dagligt .  Teststoffet skal paafoeres jaevnt over et omraade , som svarer til ca . 10 % af den samlede kropsoverflade . Med staerkt toksiske stoffer kan der anvendes et mindre omraade , men stoffet skal paafoeres saa tyndt og ensartet over en saa stor del omraadet som muligt .  Teststoffet skal holdes i kontakt med huden ved hjaelp af en poroes gazeforbinding og en ikke-hudirriterende klaebestrimmel . Teststedet skal desuden daekkes paa en saadan maade , at gazeforbindingen og teststoffet holdes sikkert fast , og at dyrene ikken kan komme til at indtage teststoffet . Der kan anvendes andre foranstaltninger , som forhindrer dyrene i at indtage teststoffet , men man boer ikke immobilisere dyrene fuldstaendigt .  Ved ekspositionsperiodens slutning fjernes eventuelt tilbagesiddende teststof , idet der anvendes vand eller en anden egnet metode til at rense huden .  Alle dyr observeres dagligt , og det registreres , om der optraeder tegn paa toksicitet , hvornaar disse tegn optraeder foerste gang , hvor laenge de varer , og hvor kraftige de er . Inspektion af dyrene skal omfatte forandringer i hud og pels , oejne og slimhinder , derudover aandedraet og kredsloeb , det autonome og centrale nervesystem , den motoriske aktivitet og adfaerdsmoenstret . Der holdes ugentligt regnskab med foedeindtagelsen , og dyrene vejes en gang om ugen . Dyrene observeres med jaevne mellemrum med henblik paa , at dyr ikke gaar tabt for undersoegelsen paa grund af f.eks . kannibalisme , autolyse af vaev eller forveksling . Ved forsoegets slutning aflives og obduceres alle tilbagevaerende dyr med undtagelse af satellitgrupperne . Doeende dyr skal fjernes og obduceres , saa snart de registreres .  Ved forsoegets slutning skal alle dyr inklusive kontrolgruppen underkastes foelgende undersoegelse :  1 ) Haematologisk analyse omfattende mindst haematokrit , haemoglobinkoncentration , taelling af erythrocytter , total og differentialtaelling af leucocytter og et maal for koaguleringsevne .  2 ) Klinisk biokemisk analyse af blodet omfattende mindst een lever - og nyrefunktionsparameter : Serum alanin aminotransferase * ( ALAT ) , serum aspartat aminotransferase ** ( ASAT ) og total serumprotein .  Andre bestemmelser , der kan vaere paakraevet i en adaekvat toksikologisk vurdering omfatter calcium , fosfor , klorid , natrium , kalium , glucose efter faste , lipidanalyser , hormoner , syre/basebalance , methaemoglobin og cholinesteraseaktivitet .  Der kan udfoeres yderligere klinisk biokemiske analyser , hvor det skoennes noedvendigt for videre undersoegelse af observerede virkninger .  1.6.4 . Makroskopisk vurdering  Alle forsoegsdyrene boer underkastes en fuldstaendig makroskopisk vurdering . Lever , nyrer , binyrer testes og vejes saa hurtigt som muligt efter dissektionen for at undgaa udtoerring . Vaev og organer , dvs . normal og behandlet hud , lever , nyrer og maalorganer ( dvs . organer der viser alvorlige laesioner eller forandringer i stoerrelse ) , opbevares i et passende medium med henblik paa en eventuel senere histopatologisk undersoegelse .  1.6.5 . Histopatologiske undersoegelser  Der skal foretages en histologisk undersoegelse af praeparerede vaev og organer fra dyrene i kontrolgruppen samt i den gruppe , der har faaet den stoerste dosis . Vaev og organer , der har vist defekter som kan tilskrives teststoffet i den hoejest doserede gruppe , skal ogsaa undersoeges i de oevrige doserede grupper . Dyrene i en satellitgruppe boer underkastes en histologisk undersoegelse , saerligt de vaev og organer , hvor der er iagttaget paavirkninger i de oevrige grupper .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform , som for hver gruppe viser : antal dyr ved begyndelse af forsoeget , og for hver type af laesion det antal dyr , der udviser den paagaeldende laesion .  Evaluering af samtlige observationer , kvantitative og tilfaeldige , skal baseres paa en passende statistisk metode . Alle anerkendte statistiske metoder kan anvendes .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationer :   - dyreart/stamme , herkomst , miljoebetingelser , foder osv . ;   - forsoegsbetingelser ;   - dosisniveauer ( med angivelse af vehikel , hvor et saadant er anvendt ) samt koncentration ;   - ikke toksisk dosis , hvis en saadan er konstateret ;   - oplysninger om toksiske reaktioner inddelt efter koen og dosis ;   - doedstidspunkt under forsoeget eller overlevelse til forsoegets slutning ;   - toksiske eller andre virkninger ;   - observationsperiode for hvert enkelt abnormitetstegn og den senere udvikling af abnormiteten ;   - data vedroerende foder - og legemsvaegte ;   - anvendte haematologiske analyser og samtlige resultater ;   - anvendte klinisk biokemiske analyser og samtlige resultater ;   - obduktionsfund ;   - detaljeret beskrivelse af alle histopatologiske fund ;   - statistisk behandling af resultaterne , hvis det er muligt ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  B . 10 . ANDRE VIRKNINGER , MUTAGENICITET , IN VITRO - CYTOGENETISK TEST ( PATTEDYRCELLER )  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  Denne in vitro cytogenetiske test er en korttids mutagenicitetstest til konstatering af strukturelle kromosomforandringer i dyrkede pattedyrceller . Der kan anvendes baade primaerkulturer og kulturer af etablerede cellelinjer . Efter at cellekulturerne har vaeret eksponeret for teststoffet baade med og uden et leverenzymaktiveringssystem ( co-faktor tilsat den mikrosomholdige supernatant fra leverhomogenat ) behandles kulturerne med en tentraadsinhibitor , som for eks . tolchicin med henblik paa et akkumulere celler i et metafasestadie i mitosen ( c-metafase ) . Cellerne hoestes paa egnede tidspunkter og praepareres med henblik paa kromosomanalyse . Praeparaterne farves og celler i metafase underkastes analyse med henblik paa konstatering af eventuelle kromosomforandringer .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  Teststoffet tilsaettes kulturmediet direkte eller oploeses i et passende vehikel , inden cellerne eksponeres . Der anvendes primaerkulturer eller kulturer af etablerede cellelinjer , f.eks . celler fra kinesiske hamstere eller humane lymfocytter .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  Antal af kulturer  Der anvendes mindst to kulturer for hvert dosisniveau og kontrol .  Negative og positive kontrolkulturer  Som negativ kontrol anvendes oploesningsmiddel ( saafremt dette ikke er kulturmediet eller vand ) , leverenzymaktiveringsblanding , leverenzymaktiveringsblanding plus oploesningsmiddel samt helt ubehandlede kulturer .  Der anvendes en positiv kontrol i hvert enkelt forsoeg . Anvendes der en leverenzymaktiveringsblanding til at aktivere teststoffet , skal der som positiv kontrol benyttes et stof , der vides at kraeve metabolisk aktivering .  Dosisniveau  Der anvendes mindst tre dosisniveauer af teststoffet over mindst eet logaritmisk dosisinterval , og saaledes at den hoejeste dosis nedsaetter den mitotiske aktivitet med ca . 50 % .  Dyrkningsbetingelser  Der anvendes et passende kulturmedium og passende inkubationsbetingelser ( temperatur , dyrkningsflasker , CO2-koncentration , fugtighed , osv . ) .  1.6.3 . Fremgangsmaade  1.6.3.1 . Fremstilling af kulturer  Etablerede cellelinjer : cellerne tages fra stamkulturer  ( f.eks . ved hjaelp af trypsinbehandling eller afrystning ) , hvorefter de udsaas med passende taethed paa dyrkningsplader og inkuberes ved 37 * C .  Humane lymfocytter : hepariniseret fuldblod tilsaettes kulturmedium , indeholdende phyto-haemagglutinin , foetalt kalveserum og antibiotika . Blandingen inkuberes ved 37 * C .  1.6.3.2 . Behandling af kulturerne med teststof   ( i ) Behandling uden leverenzymaktiveringsblanding .  Behandling skal mindst have samme varighed som en hel cellecyklus , og der skal fastlaegges fikseringstidspunkter for at sikre , at celler , der er blevet underkastet behandling paa forskellige trin i deres cyklus , analyseres under den foerste mitose efter behandlingen .  Hvis behandlingen har kortere varighed end en hel cellecyklus , skal der fastlaegges serier af fikseringstidspunkter for at sikre , at der udtages celler , som er paa forskellige cykliske trin ( G1 , S og G2 ) under behandlingen .  Teststoffet tilsaettes kulturer af etablerede cellelinjer , mens de er i den eksponentielle vaekstfase . Humane lymfocytkulturer behandles , mens de stadig befinder sig i en semisynkron tilstand . Hvis teststoffet aendrer varigheden af cellernes cyklus , skal fikseringsintervallet aendres tilsvarende .   ( ii ) Behandling med leverenzymaktiveringsblanding .  Kulturerne boer behandles med teststoffet plus aktiveringssystemet saa laenge som muligt uden at der optraeder toksiske virkninger i cellerne . Hvis behandlingen som foelge af toksisk virkning maa begraenses til mindre varighed end en hel cellecyklus , skal der fastlaegges serier af fikseringstidspunkter for at sikre , at der udtages celler , som er paa forskellige cykliske trin  ( G1 , S og G2 ) under behandling .  Hoest af celler .  Cellekulturerne behandles med tentraadsinhibitoren 1 til 2 timer foer de hoestes . Hoest og kromosompraeparering skal foregaa saerkilt for hver enkelt kultur .  1.6.3.3 . Kromosompraeparering .  Kromosompraeparering omfatter hypotonisk behandling af cellerne , fiksering , spredning paa objektglas og farvning .  Analyse :  Der undersoeges mindst 100 velpraeparerede metafaser pr . kultur for eventuelle kromosomforandringer . Objektglas kodes foer analyse . Ved humane lymfocytter undersoeges kun metafaser , der indeholder 46 centromerer . Ved etablerede cellelinjer undersoeges kun metafaser , som indeholder mere aller mindre 2 centromerer i forhold til normaltallet for stammen ( modaltallet ) .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform . Forandringer af kromatider  ( gaps , brud , translokationer ) og af kromosomer  ( gaps , brud , bruddele , ringe , dicentromerer , polycentromerer ) samt antallet af afvigende metafaser  ( inklusive og eksklusive gaps ) registreres separat for alle behandlede kulturer og kontrolkulturer . Evaluering af data baseres paa passende statistiske metoder .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationer :   - anvendt celletype ;   - forsoegsbetingelser : sammensaetning af mediet , CO2-koncentration , inkubationstemperatur , inkubationstid , dosisniveauer , behandlingstid , varigheden af behandling med og koncentrationen af den anvendte tentraadsinhibitor , den anvendte leverenzymaktiveringsblanding , positive og negative kontroller ;   - antal cellekulturer ;   - antal undersoegte metafaser ( der angives data for hver enkelt kultur ) ;   - mitotisk indeks ;   - type og antal af kromosomforandringer oplyst saerskilt for hver enkelt behandlet kultur og kontrolkultur , og de etablerede cellelinjers modaltal ;   - statistisk evaluering ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  B . 11 . ANDRE VIRKNINGER MUTAGENICITET  IN VIVO - CYTOGENETISK TEST ( KNOGLEMARV FRA PATTEDYRKROMOSOMANALYSE )  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  Denne in vivo cytogenetiske test er en korttids mutagenicitetstest til paavisning af strukturelle kromosomforandringer . Vurdering af kromosomforandringer foregaar oftest i forbindelse med den foerste mitose efter eksponering . Stoerstedelen af de forandringer , der induceres af kemiske mutagener , er kromatidforandringer .  Der anvendes knoglemarvsceller fra pattedyr , som eksponeres for teststofferne paa hensigtsmaessig maade , hvorefter de aflives med regelmaessige intervaller . Foer aflivningen behandles dyrene med en tentraadsinhibitor som for eks . colchicin med henblik paa at akkumulere celler i metafasen i mitosen ( c-metafase ) . Der fremstilles lufttoerrede kromosompraeparationer fra cellerne , og praeparaterne farves og undersoeges mikroskopisk for kromosomforandringer .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  Teststoffet oploeses i isotonisk saltvand . Hvis dette ikke lader sig goere , oploeses eller opslemmes det i et passende vehikel . Oploesning af teststoffet foretages umiddelbart inden anvendelse .  Hvis der anvendes et vehikel , for at lette doseringen , maa det ikke indvirke paa teststoffet eller foraarsage toksiske effekter .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Forsoegsdyr  Der anvendes gnavere som f.eks . rotter , mus eller kinesiske hamstere . Unge , sunde , koensmodne dyr fordeles randomiseret i forsoegs - og kontrolgrupper .  1.6.2.2 . Antal og koen  Der anvendes mindst fem hun - og fem handyr i hver forsoegsgrupe og hver kontrolgruppe . Dvs . , at der aflives ti dyr pr . interval pr . gruppe , ogsaa hvis forsoeget omfatter flere testintervaller efter doseringen .  1.6.2.3 . Administrationsmaade  Teststoffet skal i almindelighed gives i een dosis . Saafremt der foreligger en toksikologisk begrundelse , kan doseringen opdeles i mindre doser . Denne fremgangsmaade kan imidlertid kun anvendes , saafremt teststoffet ikke har cytotoksisk effekt paa knoglemarv . Saedvanligvis administreres teststoffet oralt eller ved intraperitoneal injektion . Andre administrationsformer kan dog ogsaa anvendes .  1.6.2.4 . Negative og positive kontroller  Som positiv kontrol anvendes en kemisk forbindelse , der vides at foraarsage kromosomforandringer in vivo , og der inkluderes ogsaa en negativ kontrolgruppe  ( oploesningsmiddel ) i hvert forsoeg .  1.6.2.5 . Dosisniveau  I den basale forsoegsbeskrivelse anvendes een ( 1 ) dosis , som skal vaere den maksimale ikke-toksiske dosis eller den dosis , der viser en vis cytotoksisk effet ,  ( dvs . delvist mitosehaemning ) .  Der kan anvendes flere dosisniveauer , saafremt der er videnskabeligt grundlag herfor .  I tilfaelde , hvor testen anvendes som verifikation , boer der yderligere anvendes mindst to andre dosisniveauer .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Testen kan gennemfoeres paa to maader :  i ) Forsoegsdyrene eksponeres for teststoffet i een dosis paa det maksimale ikke-toksiske niveau . Der udtages herefter proever tre gange . Den vigtigste proeveudtagning foregaar efter 24 timer . Eftersom teststoffet kan have indflydelse paa cellecykluskinetikken anvendes herudover eet kortere og eet laengere proeveudtagningsinterval af passende laengde mellem 6 og 48 timer .  Hvis der benyttes mere end een dosis , boer der udtages proever i den periode , hvor effekten er stoerst , eller , saafremt denne ikke kendes , efter 24 timer .   ( ii ) Dersom der foreligger farmakokinetiske og metaboliske begrundelser herfor , kan eksponeringen opdeles i flere doser , og proeveudtagningen boer i saa fald foregaa 6 og 24 timer efter sidste eksponering .  Knoglemarvspraeparation  Inden aflivning faar forsoegsdyrene en intraperitoneal injektion af en tentraadsinhibitor for at akkumulere et tilstraekkeligt antal celler i c-metafase . Knoglemarven vaskes ud af begge femora paa nyligt aflivede dyr ved hjaelp af en isotonisk oploesning . Efter hypotonisk behandling fikseres cellerne og spredes paa objektglas , lufttoerres og farves .  Analyse  Inden mikroskopisk undersoegelse kodes objektglassene . For hvert dyr undersoeges mindst 50 velpraeparerede metafaser med det komplette antal centromerer for strukturelle kromosomforandringer . Samtidig kan det mitotiske indeks for hvert dyr registreres .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform . Kromatidforandringer og isokromatidforandringer ( gaps , brud , translokationer ) , antallet af afvigende metafaser  ( inklusiv og eksklusiv gaps ) samt det eventuelt registrerede mitotiske indeks angives for alle forsoegs - og kontroldyr . Der anfoeres ogsaa middeltal og standardafvigelser for de enkelte forsoegs - og kontrolgrupper . Evaluering af de fremkomme data boer baseres paa passende statistiske metoder .  3 . Rapportering  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationen :   - dyreart/stamme samt dyrenes alder ;   - antal dyr af hvert koen i forsoegs - og kontrolgrupperne ;   - forsoegsbetingelser : detaljeret beskrivelse af administrationsmaade , proeveudtagning , dosisniveauer , varighed af behandling med tentraadsinhibitor samt koncentration heraf ;   - antal undersoegte metafaser pr . dyr ;   - mitotisk indeks hvis der er registreret ;   - antal og type af forandringer opgivet separat for hvert enkelt forsoegs - og kontroldyr ;   - statistisk evaluering ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  B . 12 . ANDRE VIRKNINGER  MUTAGENICITET ( MICRONUCLEUSTEST )  1 . METODE1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  Mikronucleustesten er en in vivo korttidstest i pattedyrsceller . Den anvendes til bestemmelse af kromosomskader eller beskadigelser af det mitotiske apparat foraarsaget af kemikalier . Grundlaget for denne test er en foroegelse af antallet af mikronuclei i forsoegsdyrenes polykromatiske erytrocytter i forhold til kontroldyrenes .  Mikronuclei dannes af kromosomdele eller hele kromosomer , som forsinkes i mitosen . Naar erytroblaster udvikles til erytrocytter , udstoedes cellekernen , mens mikronuclei kan forblive i cytoplasmaet . I denne test anvendes unge polyromatiske erythrocytter fra knoglemarven hos forsoegsdyr , der har vaeret eksponeret for teststoffer paa en passende maade . Knoglemarven ekstraheres og anvendes til udstrygningspraeparater , som farves . Polykromatiske erythrocytter undersoeges i mikroskop , mikronuclei taelles , og forholdet mellem polykromatiske og normokromatiske erytrocytter bestemmes .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  Teststoffer oploeses i isotonisk saltvand . Hvis dette ikke lader sig goere , oploeses eller opslemmes det i et passende vehikel . Hvis der anvendes et vehikel , maa det ikke indvirke paa teststoffet eller foraarsage toksiske effekter . Oploesningen af teststoffet foretages normalt umiddelbart inden anvendelsen .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Forsoegsdyr  Det anbefales at anvende mus , men andre pattedyr kan ogsaa anvendes . Unge , sunde , koensmodne dyr fordeles randomiseret i forsoegs - og kontrolgrupper .  1.6.2.2 . Antal og koen  Der anvendes mindst fem hun - og fem handyr i hver forsoegsgruppe og hver kontrolgruppe . Dvis . at der aflives ti dyr pr . interval pr . gruppe , ogsaa hvis forsoeget omfatter flere tidsintervaller efter dosering .  1.6.2.3 . Administrationsmaade  Teststoffet skal i almindelighed gives i een dosis . Saafremt der foreligger en toksikologisk begrundelse , kan doseringen opdeles i flere doser . Denne fremgangsmaade kan imidlertid kun anvendes , saafremt teststoffet ikke har cytotoksisk effekt paa knoglemarv . Saedvanligvis administreres teststoffet oralt eller ved intraperitoneal injektion . Andre administrationsformer kan dog ogsaa anvendes .  1.6.2.4 . Negative og positive kontroller  Der anvendes baade positiv og negativ ( oploesningsmiddel ) kontrol i forbindelse med hvert enkelt forsoeg .  1.6.2.5 . Dosisniveau  I den basale forsoegsbeskrivelse anvendes een ( 1 ) dosis , som skal vaere den maksimale ikke-toksiske dosis eller den dosis der har en vis toksisk effekt , f.eks . aendring af forholdet mellem polykromatiske og normokromatiske erytrocytter .  Der kan anvendes flere dosisniveauer , saafremt der er videnskabeligt grundlag herfor .  I de tilfaelde , hvor testen anvendes som verifikation , boer der yderligere anvendes mindst to andre dosisniveauer .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Testen kan gennemfoeres paa to maader :   ( i ) Forsoegsdyrene eksponeres for teststoffet i een dosis paa det maksimale ikke-toksiske niveau . Proeveudtagning boer foretages paa de tidspunkter , hvor der kan forventes maksimal respons , hvilket varierer med teststoffet . Naar der anvendes maksimal dosis , udtages der derfor proever af knoglemarven mindst tre gange , foerste gang ikke tidligere end 12 timer efter dosering og herefter med passende intervaller , som dog ikke maa overstige 72 time i alt .  Hvis der benyttes mere end et dosisniveau skal der udtages proever i den periode , hvor effekten er stoerst , eller , saafremt denne ikke kendes , efter 24 timer .   ( ii ) Dersom der foreligger farmakokinetiske og metaboliske begrundelser herfor , kan eksponeringen opdeles i flere doser . Der udtages i saa fald proever mindst tre gange , foerste gang ikke tidligere end 12 timer efter sidste dosering og herefter med passende intervaller , som dog ikke maa overstige 72 timer i alt .  Knoglemarvspraeparation  Knoglemarven vaskes ud af begge femora paa nyligt aflivede dyr med foetalt kalveserum . Cellerne sedimenteres ved centrifugering og supernatanten fjernes . Den homogene cellesuspension dryppes paa objektglas og der fremstilles udstrygningspraeparater . Efter lufttoerring farves praeparaterne .  Analyse  Inden mikroskopisk undersoegelse kodes objektglassene . For hvert dyr undersoeges mindst 1 000 polykromatiske erytrocytter for forekomst af mikronuclei .  Forholdet mellem normokromatiske og polykromatiske erytrocytter bestemmes for hvert dyr ved taelling af sammenlagt 1 000 erytrocytter .  2 . DATA  Data opstilles i tabelform . Antallet af polykromatiske erytrocytter samt antallet af polykromatiske erytrocytter med mikronuclei og procentdelen af celler med mikronuclei anfoeres for hvert enkelt forsoegs - og kontroldyr sammen med forholdet mellem normokromatiske og polykromatiske erytrocytter . Der anfoeres ogsaa middeltal og standardafvigelser for de enkelte forsoegs - og kontrolgrupper . Evaluering af de fremkomne data boer baseres paa passende statistiske metoder .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst mulig omfang indeholde foelgende informationer :   - dyreart/stamme samt dyrenes alder ;   - antal dyr af hvert koen i forsoegs - og kontrolgrupperne ;   - forsoegsbetingelser : detaljeret beskrivelse af administrationsmaade , proeveudtagning , dosisniveauer , toksiske reaktioner , negative og positive kontroller ;   - kriterier for registrering af mikronuclei ;   - dosis-virkningskurve , hvor det er muligt ;   - statistisk evaluering ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  B . 13 . ANDRE VIRKNINGER , MUTAGENICITET .  ESCHERISCHIA COLI TILBAGEMUTATIONSTEST  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  En tilbagemutation hos Escherichia coli i tryptophan  ( trp ) operonet trp - * trp+ , er grundlaget for , at kemiske stoffer kan foraarsage baseparsubstitutioner i genomet hos denne mikroorganisme .  Bakterier eksponeres for teststoffet baade med og uden metabolisk aktivering . Efter en passende inkubationstid i minimalmedium taelles tilbagemuterede kolonier  ( revertanter ) , og der sammenlignes med antallet af spontane revertanter paa en ubehandlet udsaaet plade og/eller paa en plade tilsat oploesningsmiddel som kontrol .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  Der kan benyttes foelgende metoder ved denne bestemmelse :  1 . forinkubationsmetoden , og  2 . direkte inkorporering , hvorved bakterier og teststof blandes i topager og haeldes ud over en selektiv agarplade .  1.6.1 . Forberedelser  1.6.1.1 . Bakterier  Bakterierne dyrkes ved 37 * C , til de naar slutningen af den eksponentielle fase eller begyndelsen af den stationaere fase . Celletaetheden boer ligge omkring 10 8 til 10 9 celler pr . ml .  1.6.1.2 . Metabolisk aktivering  Bakterierne eksponeres for teststoffet baade med og uden en passende leverenzymaktiveringsblanding ( en co-faktor tilsat den mikrosomholdige supernatant fra leverhomogenatet ) fremstillet fra mus eller rotter , som er forbehandlet med enzyminducerende stoffer .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Teststammer  Der skal anvendes tre stammer , WP2 , WP2 uvrA pkM 101 . Der benyttes anerkendte metoder ved dyrkning og opbevaring af stamkulturer . Stammernes vaekstkrav og genetiske identitet samt deres foelsomhed over for ultraviolet lys eller mitomycin C skal undersoeges . WP2 uvr A pKM 101's modstandsdygtighed over for ampicillin skal undersoeges . Stammerne boer ogsaa producere spontane revertanter indenfor det interval , der kan forventes .  1.6.2.2 . Medier  Der anvendes et passende selektivt medium , som fremmer mutanternes udvikling , og en egnet topagar .  1.6.2.3 . Negative og positive kontrolkulturer  Der skal anvendes baade ubehandlet kontrol og kontrol med oploesningsmiddel . Positiv kontrol skal anvendes til to formaal :   ( i ) Til at bekraefte foelsomheden af bakteriestammerne . Ved tests uden metabolisk aktivering kan anvendes metyl-metan-sulfonat , 4-nitroquinolinoxid eller etylnitrosourinstof som positiv kontrol .   ( ii ) Til at sikre , at det anvendte metaboliske system har aktivitet . En positiv kontrol for et metabolisk system til alle stammer er 2-aminoantracen . Hvis det er muligt , boer der som positiv kontrol anvendes en kemisk forbindelse af samme type som teststoffet .  1.6.2.4 . Maengde af teststof pr . plade  Mindst fem forskellige maengder af teststoffer proeves med semilogaritmiske dosisintervaller . Stoffet proeves i maengder op til graensen for oploeselighed eller toksicitet . Toksicitet erkendes ved en reduktion i antal af spontane revertanter , pladens dybdegennemskinnelighed , eller i overlevelsesgraden af behandlede kulturer . Ikke-toksiske stoffer skal testes op til fem mg pr . plade foer de betragtes som negative .  1.6.2.5 . Inkubationsbetingelser  Pladerne inkuberes ved 37 * C i 48 til 72 timer .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Ved direkte pladetest ( uden enzymaktivering ) tilsaettes teststoffet og 0,1 ml frisk bakteriekultur 2,0 ml af topagar . Hvis testen udfoeres med metabolisk aktivering , tilsaettes der 0,5 ml leverenzymaktiveringsblanding indeholdende en passende maengde mikrosomer til topagaren , efter at testoffet og bakterierne er tilsat . Proeveglassets indhold blandes og haeldes ud over en plade med en selektiv agar . Topagaren faar lov til at stoerkne , og pladerne inkuberes ved 37 * C i 48 til 72 timer . Ved inkubationsperiodens slutning taelles antallet af tilbagemuterede kolonier pr . plade .  Ved forinkubationsmetoden forinkuberes en blanding af teststoffet , 0,1 ml frisk bakteriekultur og en passende maengde leverenzymaktiveringsblanding eller en tilsvarende maengde buffer , foer de 2,0 ml topagar tilsaettes . De oevrige dele af denne metode er identisk med den direkte pladetest .  Ved begge metoder foretages al udsaaning parallelt paa mindst tre plader .  2 . DATA  Antallet af tilbagemuterede kolonier pr . plade registreres baade for de behandlede kulturers og for kontrolkulturernes vedkommende .  Alle optaellinger paa enkeltplader , det gennemsnitlige antal tilbagemuterede kolonier pr . plade samt standardafvigelser skal angives baade for de plader , der har vaeret eksponeret for teststoffet og for kontrolpladerne . Alle resultater skal efterproeves i et uafhaengigt forsoeg . Evaluering af de fremkomne data boer foretages under anvendelse af passende statistiske metoder .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationer :   - anvendte bakteriestammer ;   - forsoegsbetingelser : doser , toksicitet , sammensaetning af medier , fremgangsmaader , leverenzymaktiveringsblanding , negative kontroller ;   - optaellingen paa de enkelte plader , det gennemsnitlige antal tilbagemuterede kolonier pr . plade , standardafvigelse , om muligt en dosis-virkningskurve ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNING  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  B . 14 . ANDRE VIRKNINGER , MUTAGENICITET  SALMONELLA TYPHIMURIUM - TILBAGEMUTATIONSTEST  1 . METODE  1.1 . Indledning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt A ) .  1.2 . Definitioner  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt B ) .  1.3 . Referencestoffer  Ingen .  1.4 . Princip for testmetoden  En tilbagemutation hos Salmonella typhimurium i histidin ( his ) opertonet his - * his+ er grundlaget for , at kemiske stoffer kan foraarsage baseparsubstitutioner eller frameshiftmutationer i genomet hos denne mikroorganisme .  Bakterier eksponeres for teststoffet baade med og uden metabolisk aktivering og udsaas paa plader med minimalmedium . Efter en passende inkubationstid taelles tilbagemuterede kolonier ( revertanter ) , og der sammenlignes med antallet af spontane revertanter paa en ubehandlet udsaaet plade og/eller paa en plade tilsat oploesningsmiddel som kontrol .  1.5 . Kvalitets kriterier  Ingen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Forberedelser  1.6.1.1 . Bakterier  Nyfremstillede bakteriekulturer dyrkes ved 37 * C til de naar slutningen af den eksponentielle fase eller begyndelsen af den stationaere fase . Celletaetheden boer ligge omkring 10 8 til 10 9 celler pr . ml .  1.6.1.2 . Metabolisk aktivering  Bakterierne eksponeres for teststoffet med og uden en passende leverenzymaktiveringsblanding ( en co-faktor tilsat den mikrosomholdige supernatant fra leverhomogenatet ) fremstillet fra mus eller rotter , som er forbehandlet med enzyminducerende stoffer .  1.6.2 . Forsoegsbetingelser  1.6.2.1 . Teststammer  Der anvendes mindst fire stammer TA 1535 , TA 1537 , TA 98 og TA 100 . Andre stammer som TA 1538 kan anvendes supplerende . Der benyttes anerkendte metoder ved dyrkning og opbevaring af stamkulturer . Stammernes vaekstkrav og genetiske identitet samt deres foelsomhed over for ultraviolet lys og krystalviolet og deres modstandsdygtighed over for ampicillin skal undersoeges . Stammerne boer ogsaa producere spontane revertanter indenfor det interval , der kan forventes .  1.6.2.2 . Medier  Der anvendes et passende selektiv medium og en egnet topagar .  1.6.2.3 . Negative og positive kontroller  Der anvendes baade ubehandlet kontrol og kontrol med oploesningsmiddel . Positiv kontrol skal anvendes til to formaal :   ( i ) Til at bekraefte foelsomheden af bakteriestammerne . Foelgende stoffer kan anvendes i tests uden metabolisk aktivering .  Stamme * Reverteres med *  TA 1535 TA 100 * Natriumazid *  TA 1538 TA 98 * 2-nitrofluoren *  TA 1537 * 9-aminoacridin . *   ( ii ) For at sikre , at det anvendte metaboliske system har aktivitet . En positiv kontrol for et metabolisk system til alle stammer er to-aminoanthracen . Hvis det er muligt , boer der som positiv kontrol anvendes en kemisk forbindelse af samme type som teststoffet .  1.6.2.4 . Maengde af teststof pr . plade  Mindst fem forskellige maengder af teststoffet proeves med semilogaritmiske dosisintervaller . Stoffet proeves i maengder op til graensen for oploeselighed eller toksicitet .  Toksicitet erkendes ved en reduktion i antal af spontane revertanter , pladens dybdegennemskinnelighed , eller i overlevelsesgraden af behandlede kulturer .  Ikke - toksiske stoffer skal testes op til fem mg pr . plade foer de betragtes som negative .  1.6.2.5 . Inkubationsbetingelser  Pladerne inkuberes ved 37 * C i 48 til 72 timer .  1.6.3 . Fremgangsmaade  Ved den direkte pladetest ( uden enzymaktivering ) tilsaettes teststoffet og 0,1 ml frisk bakteriekultur 2,0 ml af topagar . Hvis testen udfoeres med metabolisk aktivering , tilsaettes der 0,5 ml leverenzymaktiveringsblanding indeholdende en passende maengde mikrosomer til topagaren efter at teststoffet og bakterierne er tilsat . Proeveglassets indhold blandes og haeldes ud over en plade med en selektiv agar . Topagaren faar lov at stoerkne og pladerne inkuberes ved 37 * C i 48 til 72 timer . Ved inkubationsperiodens slutning taelles antallet af tilbagemuterede kolonier pr . plade .  Ved forinkubationsmetoden forinkuberes en blanding af teststoffet , 0,1 ml frisk bakteriekultur og en passende maengde buffer , foer de 2,0 ml topagar tilsaettes . De oevrige dele af denne metode er identiske med den direkte pladetest .  Ved begge metoder foretages udsaaning parallelt paa mindst tre plader .  2 . DATA  Antallet af tilbagemuterede kolonier pr . plade registreres baade for de behandlede kulturers og for kontrolkulturernes vedkommende .  Alle optaellinger paa enkelte plader , det gennemsnitlige antal tilbagemuterede kolonier pr . plade samt standardafvigelser skal angives baade for de plader , der har vaeret eksponeret for teststoffet og for kontrolpladerne .  Alle resultater skal efterproeves i et uafhaengigt forsoeg . Evaluering af de fremkomne data boer foretages under anvendelse af passende statistiske metoder .  3 . RAPPORTERING  3.1 . Forsoegsrapport  Forsoegsrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende informationer :   - anvendte bakteriestammer ;   - forsoegsbetingelser : doser , toksicitet , sammensaetning af medier , fremgangsmaader , leverenzymaktiveringsblanding , positive kontroller , negative kontroller ;   - optaelling paa de enkelte plader , det gennemsnitlige antal tilbagemuterede kolonier pr . plade , standardafvigelse , om muligt en dosis-virkningskurve ;   - diskussion af resultaterne ;   - fortolkning af resultaterne .  3.2 . Vurdering og fortolkning  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt C ) .  4 . LITTERATURHENVISNINGER  Se den generelle indledning til afsnit B ( punkt D ) .  AFSNIT C : METODER TIL BESTEMMELSE AF OEKOTOKSICITET  C . 1 . AKUT TOKSICITET FOR FISK  1 . METODE  1.1 . Indledning  Saa vidt muligt er det oenskeligt at have oplysninger om teststoffets vandoploeselighed , damptryk , kemiske stabilitet , dissociationskonstanter og bionedbrydelighed til hjaelp ved valg af den mest hensigtsmaessige testmetode ( statisk , semistatisk eller gennemloeb ) for at sikre tilfredsstillende konstante koncentrationer af teststoffer under proevens forloeb .  Andre paabudte oplysninger , som f . eks . strukturformel , renhedsgrad , art og procentdel af betydende urenheder , tilstedevaerelse og maengde af tilsaetningsstoffer , samt n-octanol/vand-fordelingskoefficienten , boer tages i betragtning baade ved planlaegningen og fortolkningen af resultaterne fra testen .  1.2 . Definitioner og enheder  Akut toksicitet er erkendbar uoensket virkning , der fremkaldes hos en organisme inden for kort tid ( dage ) ved eksponering med et stof . I denne test udtrykkes akut toksicitet som den mediane doedelige koncentration  ( LC50 ) , det vil sige den koncentration i vand , som draeber 50 % af fiskene i en forsoegsgruppe under eksponering i en sammenhaengende periode . Eksponeringstiden skal angives .  Alle koncentrationer af teststoffet er angivet i vaegt/volumenforhold ( mg:l ) og ogsaa udtrykkes som vaegt/vaegforhold ( parts pr . million ) .  1.3 . Referencestoffer  Et referencestof kan testes for at vise , at testdyrenes foelsomhed ikke har aendret sig vaesentligt under laboratoriets forsoegsbetingelser .  Der er ikke specificeret referencestoffer til denne test .  1.4 . Metodens princip  Fiskene udsaettes for teststoffet ( -stofferne ) i vand i en raekke koncentrationer og i en periode paa mindst 48 timer , men helst 96 timer . Doedeligheden registreres med hoejst 24 timers mellemrum , og man beregner , hvor det er muligt , de koncentrationer , der paa hvert observationstidspunkt draeber 50 % af fiskene ( LC50 ) .  1.5 . Kvalitetskriterier   - Doedeligheden i kontrolgruppen maa ikke overstige 10 % ved proevens afslutning .   - Oxygenkoncentrationen skal vaere > 60 % maetning gennem hele forsoeget .   - Det maa godtgoeres , at teststoffets koncentration har vaeret holdt tilfredsstillende i forsoegsperioden  ( f . eks . mindst 80 % af den initiale koncentration ) enten ved analyse eller ud fra stoffets kemiske egenskaber eller ved hjaelp af det anvendte testsystem .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  Tre typer procedurer kan anvendes :  Statisk test :  Toksicitetstest med akvatiske organismer , hvor der ikke foregaar gennemloeb af testoploesning .  ( Oploesningerne udskiftes ikke under testens forloeb . )  Semi-statisk test :  Test uden gennemloeb af testoploesning , men med regelmaessig total udskiftning af testoploesning med laengere tidsintervaller ( f . eks . 24 timer ) .  Gennemloebstest :  Toksicitetstest , hvor vandet konstant fornys i testkamrene , og hvor teststoffet transporteres med det vand , der fornyr testmediet .  1.6.1 . Reagenser  1.6.1.1 . Teststofoploesninger  Stamoploesninger af den paakraevede styrke fremstilles ved oploesning af stoffet i afioniseret vand eller vand beskrevet i 1.6.1.2 .  Stamoploesninger af stoffer med lav vandoploeselighed kan fremstilles gennem ultrasonisk dispersion eller , om noedvendigt , ved brug af organiske oploesningsmidler , emulgatorer eller dispergeringsmidler . Naar saadanne hjaelpestoffer anvendes , skal kontrolfiskene udsaettes for samme koncentration af disse stoffer , som anvendes ved den hoejeste koncentration af teststoffet . Koncentrationen af hjaelpestoffer boer ikke overstige 0,1 g/l .  De valgte testkoncentrationer fremstilles ved fortynding af stamoploesningen . Hvis hoeje koncentrationer testes , kan stoffet oploeses direkte i det vand som ellers anvendes til fortynding .  Proeven skal udfoeres uden justering af pH . Hvis der konstateres en vaesentligt pH-aendring , anbefales det , at gentage testen med justeret pH , og disse resultater rapporteres . I saa tilfaelde skal stamoploesningen justeres til pH af det vand som anvendes til fortynding , hvis der ikke er saerlige grunde til at undlade dette . Til justering af pH boer HCl og NaOH foretraekkes . Justering af pH skal foregaa paa en saadan maade , at koncentrationen af teststof i stamoploesningen ikke aendres signifikant . Saafremt der sker en kemisk reaktion eller en udfaeldning af teststoffet ved justeringen , boer dette rapporteres .  1.6.1.2 . Vand til opbevaring og fortynding  Drikkevand ( ikke forurenet med skadelige koncentrationer af klor , tungmetaller eller andre stoffer ) , naturligt forekommende vand af god kvalitet , eller kunstigt fremstillet ferskvand ( se tillaeg 1 ) kan bruges . Vand med en total haardhed mellem 50 og 250 mg/l ( som CaCO3 ) og med pH 6,0 - 8,5 boer foretraekkes .  1.6.2 . Apparatur  Alt apparatur skal vaere af kemisk inert materiale .   - Automatisk fortyndingssystem  ( til gennemloebstesten ) .   - Oxygenmaalingsudstyr .   - Udstyr til haardhedsbestemmelse af vand .   - Passende apparatur til temperaturkontrol .   - pH-meter .  1.6.3 . Testfisk  En eller flere arter kan bruges - og vaelges af det afproevende laboratorium .  Det foreslaas , at arterne vaelges paa basis af vigtige , praktiske kriterier som , hvorvidt de er til raadighed hele aaret , hvor let de er at holde , deres egnethed til testning , deres relative foelsomhed og andre oekonomiske , biologiske eller oekologiske faktorer af betydning . Fiskene skal vaere i god helbredstilstand og uden nogen synlige misdannelser .  Fiskearter , som anbefales til denne test , er angivet i bilag 2 .  1.6.3.1 . Opbevaring  Testfisk skal fortrinsvis komme fra en enkelt bestand og vaere af samme laengde og alder . Fiskene skal holdes i mindst 12 til 15 dage under foelgende betingelser :  Kar :  Der anbefales mindst 300 l til koldtvandsfisk , mindst 100 l til varmtvandsfisk .  Belastning :  Passende for systemet ( recirkulation eller gennemloeb ) og fiskearten .  Vand :  Se 1.6.1.2 .  Lys :  12 til 16 timers lys dagligt .  Koncentration af oploest oxygen :  Mindst 80 % maetning .  Fodring :  Dagligt eller tre gange ugentligt , sidste gang 24 time foer testen begyndes .  1.6.3.2 . Doedelighed  Efter en 48 timers tilvaenningsperiode registreres doedeligheden og foelgende kriterier anvendes :   - Stoerre end 10 % af populationen paa syv dage : hele partiet kasseres .   - Mellem 5 og 10 % af populationen : observationsperioden forlaenges med yderligere syv dage . Hvis der ikke sker flere doedsfald , kan partiet accepteres , i modsat fald maa det kasseres .   - Mindre end 5 % af populationen : partiet accepteres .  1.6.4 . Tilvaenning  Alle fisk skal udsaettes for vand af den kvalitet og med den temperatur , som skal anvendes i testen , i mindst syv dage , foer de skal tages i anvendelse .  1.6.5 . Proevens udfoerelse  Forud for en endelig test kan foretages en indledende proeve med det formaal at faa oplysninger om det koncentrationsinterval , som skal anvendes i hovedtesten .  Udover testserien skal medtages en kontrolgruppe uden teststoffet , men med de behoerige hjaelpestoffer .  Koncentrationerne maa ikke falde mere end 20 % i forsoegsperioden . Afhaengig af teststoffets fysiske og kemiske egenskaber , vaelges en statisk eller semi-statisk test eller en gennemloebstest som den mest hensigstmaessige , for at opfylde dette krav .  Fiskene udsaettes for stoffet som beskrevet nedenfor .  Varighed :  Mindst 48 timer , men helst 96 timer .  Antal dyr :  Mindst ti pr . koncentration .  Kar :  Af passende kapacitet i relation til den anbefalede belastning .  Belastning :  For statiske og semi-statiske tests , anbefales 1,0 g/l som den maksimale belastning . For gennemloebssystemer kan en stoerre belastning accepteres .  Testkoncentration :  En kontrol og mindst fem koncentrationer , som afviger med en konstant faktor paa hoejst 1,8 , og som daekker intervallet 0 - 100 % doedelighed .  Vand :  1.6.1.2 .Lys :  12 til 16 timers lys dagligt .  Temperatur :  Passende for arten ( Bilag II ) men indenfor mere aller mindre 1 * C i testperioden .  Koncentration af oploest oxygen :  Ikke mindre en 60 % maetning ved den valgte temperatur .  Fodring :  Ingen .  Fiskene inspiceres efter de foerste to til fire timer og med hoejst 24 timers mellemrum . Fisk betragtes som doede , hvis beroering af haleroden ikke giver nogen reaktion og ingen respirationsbevaegelser er synlige . Doede fisk fjernes , naar de observeres , og doedeligheden noteres .  Synlige abnormaliteter ( f . eks . tab af ligevaegt , aendringer i svoemmeadfaerd , respirationsbevaegelse , pigmentering osv . ) noteres .  Maaling af pH , oploest oxygen og temperatur skal foretages dagligt .  2 . DATA OG BEDOEMMELSE  Den procentvise doedelighed aftegnes for hver anbefalet eksponeringsperiode mod koncentrationen paa logaritmisk sandsynlighedspapir . Paa oejemaal tilpasses en kurve til punkterne og koncentrationen svarende til 50 % respons aflaeses ( se figur i tillaeg 3 ) .  Dette er LC50 for den paagaeldende eksponeringsperiode .  Naar de opnaaede data er daekkende , kan den mediane koncentration , LC50 og dens konfidensgraenser ( p = 0,05 ) beregnes ved hjaelp af standarprocedurer .  LC50-vaerdien afrundes til eet ( eller hoejst to ) betydende cifre .  I de tilfaelde , hvor haeldningen af koncentration / % responskurven er for stejl til at LC50 kan beregnes , er en grafisk bestemmelse tilstraekkelig .  Naar to paa hinanden foelgende koncentrationer med et forhold paa 1,8 kun giver 0 og 100 % mortalitet , er disse to vaerdier tilstraekkelige som angivelse for LC50 intervallet .  Hvis man bemaerker , at teststoffet ikke kan holdes stabilt eller homogent , skal dette anfoeres , og man maa vaere forsigtig ved fortolkningen af resultaterne .  3 . RAPPORTERING  Testrapporten boer om muligt indeholde :   - Oplysninger om testorganismen ( videnskabeligt navn , stamme , leverandoer , enhver forbehandling samt antal og stoerrelse , der er brugt ved hver testkoncentration ) .   - En liste over de anvendte koncentrationer og alle tilgaengelige oplysninger vedroerende stabiliteten af testkemikaliet ved de anvendte koncentrationer .   - Beskrivelse af testudstyret .   - Hvis kemiske analyser er udfoert , skal metoder og resultater angives .   - Oprindelsen af vand brugt til fortynding og dets vigtigste kemiske egenskaber ( pH , haardhed og temperatur ) .   - Koncentrationen af hjaelpestoffer .   - I tilfaelde af tungtoploeselige stoffer angives metoden til fremstilling af stam - og testoploesninger .   - Grunde for valg af og detaljer vedroerende den anvendte testprocedure , ( f . eks . varighed , statisk , semi-statisk , tilsaetningshastighed , gennemloebshastighed : beluftning , antal af fisk osv . ) .   - Lysforhold .   - Hoejeste testkoncentration , der ikke foraarsager doedsfald inden for testperioden .   - Laveste testkoncentration , der foraarsager 100 % doedelighed inden for testperioden .   - Kumulative doedelighed for hver koncentration og i kontrolproeven ( eller kontrol med hjaelpestoffet , hvis paakraevet ) paa de anbefalede observationstidspunkter .   - Vaerdier for LC50 paa hvert af de anbefalede observationstidspunkter ( om muligt med 95 % konfidensgraenser ) .   - Statistiske metoder , som er anvendt til bestemmelse af LC50 .   - Afbildning af koncentrations - % responskurve ved slutningen af testen .   - Om muligt haeldning af koncentrations - % responskurven ved afslutningen af testen og dens 95 % konfidensgraenser .   - Koncentration af oploest oxygen , pH og temperatur for hver 24 timer .   - Hvis der er anvendt referencestof , skal de opnaaede resultater anfoeres .   - Det maa godtgoeres at kvalitetskriterierne er opfyldt .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris 1981 , Test Guideline 203 , Decision of the Council C(81 ) 30 , Final .  Tillaeg 1  Kunstigt fremstillet ferskvand  Eksempel paa brugbart vand til fortynding  Alle kemikalier skal vaere af analystisk renhedsgrad . Vandet skal vaere destilleret vand af god kvalitet eller afioniseret vand med en ledningservne paa mindre end 5 mScm-1 .  Stamoploesning  CaCl2 : 2H2O Calciumchlorid dihydrat * 11,76 g , *  oploest i vand ad 1 liter . * *  MgSO4 : 7H2O Magnesiumsulfat heptahydrat * 4,93 g , *  samme procedure * *  NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat * 2,59 g , *  samme procedure . * *  KCl Kaliumchlorid * 0,23 g . *  samme procedure * *  Kunstigt fremstillet ferskvand til fortynding  Bland 25 ml af hver af de fire stamoploesninger og fortynd til en liter med vand .  Beluft indtil koncentrationen af oploest oxygen svarer til maetningsvaerdien .  pH skal vaere 7,9 mere aller mindre 0,3 . Om noedvendigt justeres med NaOH ( Natriumhydroxid ) eller HCl ( Hydrogenchlorid ) .  Det saaledes fremstillede vand til fortynding hestaar i ca . 12 timer og behoever ikke at blive beluftet yderligere .  Summen af Ca - og Mg-ioner i denne oploesning er 2,5 mmol/l . Forholdet mellem Ca - Mg-ioner er 4 : 1 og mellem Na-K-ioner 10 : 1 . Den totale basestyrke af denne oploesning er 0,8 mmol/l .  Afvigelser ved fremstillingen af fortyndingsvandet maa ikke medfoere aendringer i vandets sammensaetning eller egenskaber .  Tillaeg 2  Fiskearter , der anbefales til testning  Anbefalede arter * Anbefalet temperatur interval  ( * C ) * Anbefalet laengde af testdyr ( cm ) *  Brachydanio rerio ( Teleostei , Cyprinidae )  ( Hamilton-Buchanan ) Zebrafisk * 20 til 24 * 3,0 mere aller mindre 0,5 *  Pimephales promelas ( Teleostei , Cyprinidae ) * 20 til 24 * 5,0 mere aller mindre 2,0 *  Cyprinus latipes ( Teleostei , Cyprinidae ) ( Linne 1758 ) Karpe * 20 til 24 * 6,0 mere aller mindre 2,0 *  Oryzias latipes ( Teleostei , Poeciliidae ) ( Schlegel 1850 ) * 20 til 24 * 3,0 mere aller mindre 1,0 *  Poecilia reticulata ( Teleostei , Poeciliidae ) ( Peters 1859 ) Guppy * 20 til 24 * 3,0 mere aller mindre 1,0 *  Lepomis macrochirus ( Teleostei , Centrarchidae )  ( Linnaeus 1758 ) * 20 til 24 * 5,0 mere aller mindre 2,0 *  Salmo gairdneri ( Teleostei , Salmonidae ) ( Richardson 1836 ) Regnbueoerred * 13 til 17 * 6,0 mere aller mindre 2,0 *  Leuciscus idus ( Teleostei , Cyprinidae ) ( Linne 1758 ) * 20 til 24 * 6,0 mere aller mindre 2,0 *  Opdraetsbetingelser  De ovenfor naevnte fisk er lette at opdraette og eller let tilgaengelige hele aaret rundt . De kan opdraettes enten i dambrug eller i laboratoriet under sygdoms - og parasitkontrollerede betingelser , saadan at testdyrene er sunde og af kendt afstamning . Disse fisk er tilgaengelige i store dele af verden .  Tillaeg 3  TEGNING : JFR . EFT  Tillaeg 4  Liste over eksempler paa standardprocedurer   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 203 , Decision of the Council C(81 ) 30 , Final .   ( 2 ) ISO/TC/147/SC 5/WG/3 . - Draft proposal for screening chemicals and products for acute toxicity to fish using a static , semi-static or flow-through method . - Document 7346/I , II , III , 1980/06/15 ISO/DP .   ( 3 ) Eidgenoessiches Department des Innern , Schweiz : Richtlinien fuer Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974 .   ( 4 ) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen . 38 412 ( L1 ) und L ( 15 ) .   ( 5 ) AFNOR . Determination de la toxicite aigue d'une substance vis-à-vis de Brachydanio rerio . T90 - 303 .   ( 6 ) JIS K 0102 . Acute toxicity test for fish .   ( 7 ) Degradability , Ecotoxicity and Bioaccumulation . The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment , Volume I and II , Government Publishing Office , The Hague , The Netherlands 1980 .   ( 8 ) Environmental Protection Agency 1975 . Methods for the Acute Toxicity Tests with fish , Macroinvertebrates and Amphibians . The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms . Ecological Research Series EPA-660-75-009 .   ( 9 ) Environmental Protection Agency . January 1978 . Environmental Monitoring and Support Laboratory , Office of Research and Development . EPA-600/4-78-012 .   ( 10 ) Environmental Protection Agency : Toxic Substance Control , March 16 1979 , Part IV .   ( 11 ) Standard methods for the Examination of Water and Wastewater . 14th edition 1975 APHA-AWWA-WPCF .   ( 12 ) Commission of the European Communities . Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish . CEE Study D.8368 , 22 March 1979 .   ( 13 ) Litchfield , J . T . and Wilcoxon , F . A simplified method for Evaluating dose Effects Experiments , J . Pharm . Exp . Therap . , Vol . 96 , 1949 , p . 99 .  C . 2 . AKUT TOKSICITET FOR DAFNIER  1 . METODE  1.1 . Indledning  Inden undersoegelsen begyndes er det oenskeligt saa vidt muligt at have oplysninger om stoffets vandoploeselighed , damptryk , kemisk stabilitet , dissociationskonstanter og bionedbrydelighed .  Yderligere oplysninger ( f . eks . strukturformel , renhedsgrad , art og maengde af signifikante urenheder , tilstedevaerelse og maengde af tilsaetningsstoffer , og fordelingskoefficienten for n-octanol/-vand ) boer indgaa saavel i forsoegsplanlaegningen som i fortolkningen af resultaterne fra undersoegelsen .  1.2 . Definitationer og enheder  Direktivets oenske om LC50 for dafnier opfyldes ved bestemmelsen af EC50 , som beskrevet i denne metode .  Den akutte toksicitet udtrykkes ved naervaerende undersoegelse som den mediane effektive koncentration  ( EC50 ) , som immobiliserer . Dette er den koncentration ( udtrykt ved initiale vaerdier ) , der immoboliserer 50 % af dafnierne i en testgruppe i loebet af en 24 timers forsoegsperiode . 48 timers EC50 for immobilisering kan ogsaa bestemmes , hvis det er praktisk muligt .  Immobilisering  De dyr , der ikke er i stand til at svoemme i loebet af en periode paa 15 sekunder efter en forsigtig omroering i proeveglasset , anses for at vaere immobile .  Alle koncentrationer af det undersoegte stof udtrykkes som vaegt/-vaegtforhold ( parts pr . million ) .  1.3 . Referencestoffer  Et referencestof kan afproeves til en demonstration af , at foelsomheden hos de anvendte forsoegsdyr under laboratoriebetingelserne ikke er aendret signifikant .  Der angives ingen referencestoffer til naervaerende metode .  1.4 . Testmetodens principper  Dafnierne udsaettes for stoffet , der skal undersoeges , tilsat vand i forskellige koncentrationer i 24 timer . Om noedvendigt kan dette udstraekkes til 48 timer .  Under i oevrigt ens forsoegsbetingelser og i et passende koncentrationsomraade , vil de forskellige koncentrationer af et teststof , give forskellige gennemsnitlige grader af paavirkning af dafniernes svoemmedygtighed . Forskellige koncentrationer resulterer i , at forskellige procentdele af dafnierne ikke er i stand til at svoemme ved afslutningen af forsoeget . Koncentrationerne , der foraarsager 0 og 100 % immobilisering udledes direkte af de ved forsoeget gjorte observationer , hvorimod 24 timers EC50  ( respektive 48 timers EC50 ) om muligt bestemmes ved beregning .  I naervaerende metode anvendes et statisk system . De anvendte oploesninger udskiftes saaledes ikke i testperioden .  1.5 . Kvalitetskriterier   - Immobiliseringen i kontrolproeverne maa ikke overskride 10 % ved afslutning af undersoegelsen .   - oxygenkoncentrationen maa ikke vaere under 2 mg/l ved afslutningen af undersoegelsen .   - Dafnier , der anvendes til undersoegelsen , boer i det mindste i kontrolgruppen ikke vaere fanget af vandets overflade .  1.6 . Metodebeskrivelse  1.6.1 . Reagenser  1.6.1.1 . Oploesninger af teststofferne  Stamoploesninger af den oenskede styrke fremstilles ved at oploese stoffet i afioniseret vand eller vand beskrevet i 1.6.1.2 .  Stamoploesninger af stoffer med lav vandoploeselighed kan fremstilles ved ultrasonisk dispergering eller om noedvendigt ved anvendelse af organiske oploesningsmidler , emulgatorer eller dispergeringsmidler . Naar saadanne hjaelpestoffer anvendes , boer kontroldafnierne udsaettes for disse hjaelpestoffer i de koncentrationer , der anvendes ved den hoejeste koncentration af teststoffet der undersoeges . Koncentrationen af saadanne hjaelpestoffer boer ikke overstige 0,1 g/l .  De udvalgte testkoncentrationer fremstilles ved fortynding af stamoploesningerne . Hvis hoeje koncentrationer skal testes kan stoffet oploeses direkte i vandet der anvendes til fortynding .  Undersoegelsen boer udfoeres uden justering af pH . Hvis der observeres store aendringer i pH , tilraades det at gentage forsoeget med pH-justering og rapportere resultaterne . I saa tilfaelde skal pH-vaerdien i stamoploesningen justeres til pH-vaerdien i oploesningsvandet , medmindre der er specifikke grunde til ikke at goere dette . HCl og NaOH boer foretraekkes til dette formaal . Denne pH-justering boer foretages saaledes , at koncentrationen af teststoffet i stamoploesningen ikke aendres signifikant . Sker der kemiske reaktioner eller udfaeldninger af teststoffet som foelge af denne justering , skal dette rapporteres .  1.6.1.2 . Opbevarings - og fortyndingsvand  Alt vand , der kan anvendes til dyrkning af dafnier , hvad enten det er naturligt vand eller kunstigt fremstillet ferskvand ( se tillaeg ) , kan anvendes ved undersoegelsen . For at undgaa at skulle tilvaenne forud for undersoegelsen , anbefales det , at bruge samme vand til testen , som er anvendt ved dyrkning af kulturen .  1.6.2 . Apparatur  Normalt laboratorieapparatur og -udstyr boer anvendes . Udstyr , der kommer i kontakt med testoploesningerne , boer fortrinsvis vaere fremstillet helt af glas :   - oxygenmaaler ( med mikroelektroder eller andet passende udstyr til maaling af oploest oxygen i proever med lille rumfang ) ;   - passende apparatur til temperaturkontrol ;   - pH-meter ;   - udstyr til bestemmelse af vandets haardhed .  1.6.3 . Testorganisme  Daphnia magna eller Daphnia pulex , der er mere end seks timer og mindre end 24 timer gammel ved forsoegets start , dyrket i laboratoriet , fri for aabenbare sygdomme og med en kendt historie ( f.eks . dyrkning - alle forbehandlinger osv . ) .  1.6.4 . Fremgangsmaade  En forproeve kan gaa forud for den endelige undersoegelse for af opnaa viden om det koncentrationsomraade , der skal anvendes ved hovedundersoegelsen . En kontrolproeve med alle hjaelpestoffer , men uden det undersoegte stof , boer udfoeres ud over forsoegsserierne .  Dafnierne udsaettes for stoffet som beskrevet nedenfor :  Varighed :  Mindst 24 timer .  Antal dyr :  Mindst 20 dyr ved hver testkoncentration , helst delt op i fire hold med fem dyr i hver eller to med ti i hver .  Belastning :  Mindst 2 ml af proeveoploesningen boer vaere til raadighed for hvert dyr .  Testkoncentration :  Testoploesningen skal fremstilles umiddelbart foer tilsaetningen af dafnier , og helst uden brug af andre oploesningsmidler end vand . Koncentrationerne laves i geometriske serier , med en koncentrationsratio paa 1,8 . Der medtages tilstraekkelige mange koncentrationer til at opnaa 0 og 100 % immobilisering efter 24 timer og til at faa passende antal grader af immobiliseringer til bestemmelse af 24 timers EC50 . EC50-bestemmelsen boer udfoeres samtidig med kontroltesten .  Vand :  Se 1.6.1.2 .  Lys :  En lys-moerke cyklus kan anvendes , men fuldstaendigt moerke er acceptabelt .  Temperatur :  Proevetemperaturen boer ligge mellem 18 og 22 * C , men i den enkelte test boer temperaturen holdes inden for mere aller mindre 1,0 * C .  Beluftning :  Testoploesningerne maa ikke beluftes ved luftgennembobling .  Fodring :  Ingen .  pH og oxygenkoncentrationen i kontrolproeverne og i alle testkoncentrationerne maales ved slutningen af forsoeget . pH i testoploesningerne boer ikke aendres .  Flygtige forbindelser boer undersoeges i helt fyldte og helt tillukkede beholdere , der er store nok til , at oxygenmangel undgaas .  Dafnierne undersoeges i det mindste efter 24 timers inkubering og igen efter 48 timer , saafremt forsoegstiden forlaenges .  2 . DATA OG VURDERING  Afbild den cumulative procentvise immobilisering ved hver koncentration efter 24 timers eksponering , som funktion af koncentrationerne og paa et logaritmisk sandsynlighedspapier . Tilpas en linje til punkterne og aflaes den koncentration , der svarer til 50 % reaktion .  Naar de opnaaede data er daekkende , kan den mediane koncentration og dens konfidensgraenser  ( p = 0,05 ) beregnes ved hjaelp af standardprocedurer .  EC50-vaerdien boer rundes af til en ( eller hoejst to ) betydende ciffer .  I de tilfaelde , hvor haeldningen af kurven over koncentrations / % responskurven er for stejl , til at en beregning af EC50 er mulig , er et grafisk estimat tilstraekkeligt .  Naar to paa hinanden foelgende koncentrationer med en ratio paa 1,8 kun giver 0 og 100 % immobilisering , er disse to vaerdier tilstraekkelige som angivelse for EC50 intervallet .  Hvis det observeres , at stabiliteten eller homogeniteten af det undersoegte stof ikke kan opretholdes , boer man vaere forsigtig med tolkningen af resultaterne , og det boer rapporteres .  3 . RAPPORTERING  Forsoegsrapporten skal , om muligt , indeholde :   - Oplysninger om den anvendte organisme ( videnskabeligt navn , stamme , herkomst , forbehandlinger , dyrkningsmetoder - inklusive kilde , art og maengde af foder og fodringsfrekvens ) .   - Antal dafnier anvendt ved hver testkoncentration .   - Liste over de anvendte koncentrationer og tilgaengelige oplysninger om stabiliteten af teststoffet ved de koncentrationer , der er anvendt i testoploesningerne .   - Beskrivelse af forsoegsbeholdere , testoploesningernes rumfang i hver beholder , antal af dyr i hver beholder .   - Hvis der er udfoert kemiske analyser : de anvendte metoder og opnaaede resultater .   - Oprindelse af vand anvendt til fortynding og dets vaesentligste kemiske karakteristika .   - Metode til fremstilling af stam - og testoploesninger .   - Koncentrationer af alle anvendte hjaelpestoffer  ( organiske oploesningsmidler , dispergeringsmidler osv . ) .   - Lysforhold .   - Hoejeste testkoncentration , som ikke giver immobilisering i undersoegelsesperioden .   - Laveste testkoncentration , som giver 100 % immobilisering i undersoegelsesperioden .   - Kumulativ immobilisering i blindproeven , i kontrolproeven med hjaelpestofferne og i hver afproevet koncentration i de(n ) anbefalede observationstid(er ) ( 24 eller 24 og 48 timer ) .   - EC50-vaerdier for hver af de anbefalede observationstider ( med 95 % konfidensinterval om muligt ) .   - Afbildning af den tilhoerende koncentration / % responskurve opnaaet ved slutningen af forsoeget .   - Statistiske metoder , der er anvendt ved bestemmelsen af EC50-vaerdien .   - Om muligt haeldningen af koncentration -/ % responskurven ved 24 timer med tilhoerende 95 % konfidensinterval .   - Koncentration af oploest oxygen , pH-vaerdier , temperatur af proeveoploesningerne .   - Hvis der anvendes et referencestof , maa dets navn og opnaaede resultater anfoeres .   - Opfyldelse af kvalitetskriterierne .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 202 . Decision of the Council C(81 ) 30 . Final .   ( 2 ) ISO Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus ( Cladocera - crustacea ) ISO/6341 .   ( 3 ) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus ( Cladocera - crustacea ) NFT 90 301 .   ( 4 ) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 ( L1 ) und ( L11 ) .  Tillaeg  Kunstigt fremstillet ferskvand  Eksempel paa egnet vand til fortynding  Alle kemikalier skal vaere af analytisk renhedsgrad .  Vandet skal vaere destilleret vand af god kvalitet eller afioniseret vand med en ledningsevne paa under 5 mScm-1 .  Stamoploesning  CaCl2 * 2H2O Calciumchlorid dihydrat * 11,76 g , *  oploest i 1 l vand * *  MgSO4 * 7H2O Magnesiumsulfat heptahydrat * 4,93 g , *  samme procedure * *  NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat * 2,59 g , *  samme procedure * *  KCl Kaliumchlorid * 0,23 g . *  samme procedure * *  Kunstigt fremstillet ferskvand til fortynding  Bland 25 ml af hver af de fire stamoploesninger og fyld op til 1 liter med vand .  Beluft indtil koncentrationen af oploest ilt svarer til maetningsvaerdien .  pH skal vaere 7,9 mere aller mindre 0,3 . Om noedvendigt justeres pH med NaOH ( natriumhydroxid ) eller HCl  ( hydrogenchlorid ) .  Det paa denne maade fremstillede vand til fortynding , stilles til side i ca . 12 timer og behoever ikke beluftes yderligere .  Summen af Ca - og Mg-ioner i denne oploesning er 2,5 mmol/l . Forholdet mellem Ca - og Mg-ioner er 4 : 1 og mellem Na - og K-ioner er det 10 : 1 . Den totale alkalinitet af denne oploesning er 0,8 mmol/l .  AEndringer i fremstillingen af fortyndingsvandet maa ikke aendre sammensaetningen eller egenskaberne af vandet .  C . 3 . NEDBRYDNING  BIOLOGISK NEDBRYDNING : MODIFICERET OECD SCREENING TEST  1 . METODE  1.1 . Indledning  Formaalet med metoden er at maale bionedbrydeligheden af vandoploeselige , ikke flygtige organiske stoffer i et aerobt , vandigt miljoe ved en begyndelseskoncentration svarende til 5 til 40 mg DOC/l ( DOC = dissolved organic carbon , dvs . oploest organisk kulstof pr . liter ) . Hvis detektionsgraensen for maaleapparater til bestemmelse af organisk kulstof forbedres , kan brugen af lavere testkoncentrationer vaere fordelagtig , isaer for toksiske stoffer . Indholdet af organisk kulstof i teststoffet maa vaere kendt .  Metoden er kun anvendelig for de organiske teststoffer , der ved den anvendte testkoncentration ,   - i det mindste er oploeselige i vand ved testkoncentrationerne ( 5 til 40 mg DOC/l ) ,   - har et ubetydeligt damptryk ,   - ikke er haemmende over for bakterier , og som   - ikke adsorberes vaesentligt til glasoverflader .  Oplysninger om stoffets toksicitet over for mikroorganismer kan vaere nyttig for fortolkningen af lave resultater og ved valget af passende testkoncentrationer .  Oplysninger om stoffets toksicitet over for mikroorganismer kan vaere nyttig for fortolkningen af lave resultater og ved valget af passende testkoncentrationer .  1.2 . Definitioner og enheder  Nedbrydningen er defineret som den del af teststoffet , som forsvinder , udtrykt i procent DOC-fjernelse : JFR . EFT  1.3 . Referencestoffer  Det er oenskeligt at bruge passende kontrolkemikalier til at kontrollere aktiviteten af inoculum . F . eks . kan anilin , natriumacetet eller natriumbenzoat bruges hertil og de skal udvise en DOC-fjernelse paa mere end 70 % inden for ti dage , regnet fra den dag , hvor det observerede niveau af bionedbrydning foerst overskrider 10 % . Hvis ikke disse resultater opnaas inden for en testperiode af 28 dage , anses testen for ugyldig og skal gentages med et inoculum fra en anden kilde .  1.4 . Metodens princip  En forudbestemt maengde af stoffet oploeses i et uorganisk medium ( mineralsk naeringsoploesning , tilsat sporelementer og essentielle vitaminer ) til en koncentration svarende til 5 til 40 mg DOC/l . Oploesningen inokuleres med et lille antal mikroorganismer fra en blandet population og gennemluftes ved 20 til 25 * C i moerke eller i kun diffust lys .  Nedbrydningen foelges ved hjaelp af DOC analyse gennem en 28 dages periode .  Proceduren efterproeves ved hjaelp afet kontrolstof . En DOC-blindproeve gennemfoeres i en parallel test , der hverken indeholder teststof eller kontrolstof .  1.5 . Kvalitetskriterier  Metodens reproducerbarhed er efterproevet i OECD - og EOEF-ringtests og fundet passende for en screening-test .  Den laveste koncentration af teststoffer , ved hvilken denne metode kan bruges er stort set bestemt af foelsomhedsgraensen for organisk kulstof  ( 0,5 mg C/l paa nuvaerende stade ) og af koncentrationen af oploest organisk kulstof i naeringsoploesningen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Reagenser  1.6.1.1 . Vand  Deioniseret eller destilleret vand uden indhold af toksiske stoffer ( specielt kobber ) til alment brug som oploesningsmiddel . Vand , som er blevet deioniseret ved destillation eller ved ionbytning , er passende .  Det destillerede ( eller deioniserede ) vand maa ikke indeholde mere end 10 % af det organiske kulstof , som tilfoeres med teststoffet .  En hoej renhed af vandet er noedvendig i betragtning af , at DOC analyserne foretages i koncentrationsintervallet 0 til 40 mg/l . Forureningerne stammer fra uundgaaelige urenheder , men ogsaa fra ionbytterresiner og mikrobiel vaekst ( bakterier , alger under indflydelse af lys , osv . ) . Kun vand fra samme beholdning maa anvendes til hver testserie , og vandet skal kontrolleres forud ved DOC analyser . Om noedvendigt kan passende vand fremstilles ved UV-bestraaling eller paa anden maade .  1.6.1.2 . Naeringsoploesning  Naeringsoploesningen indeholder 1 ml af hver af de foelgende oploesninger ( a ) til ( f ) pr . liter vand  ( 1.6.1.1 ) ( Pa betyder at reagenserne er af analytisk renhedsgrad = AR ) .  a ) KH2PO4 kaliumdihydrogenphosphat * PA 8,5 g , *  K2HPO4 Kaliumhydrogenphosphat * PA 21,75 g , *  Na2HPO4 * 2 H2O natriumhydrogenphosphat dihydrat PA * PA 33,4 g , *  NH4Cl ammoniumchlorid * PA 20,0 g *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml . * *  pH skal vaere 7.2 ; * *  b ) MgSO4 * 7H2O magnesiumsulfat haeptahydrat * PA 22,50 g , *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml ; * *  c ) CaCl2 calciumchlorid * PA 27,50 g *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml ; * *  d ) FeCl3 * 6 H2O jern(III)chlorid hexahydrat * PA 0,25 g *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml ; * * denne oploesning laves foerst umiddelbart foer brug ; * *  e ) sporstofoploesning * *  MnSO4 * 4 H2O Mangan(II)sulfat tetrahydrat ( = 30,23 mg , MnSO4 , 2H2O ) * PA 39,9 mg *  H3BO3borsyre * PA 57,2 mg *  ZnSO4 * 7H2O zinksulfat heptahydrat * PA 42,8 mg *  ( NH4)6Mo7O24 hexaammoniumheptamolybdat(IV ) ( = 36,85 mg ( NH4)6Mo7O24 * 4H2O ) * PA 34,7 mg *  Fe-chelat ( FeCl3 * EDTA ) * PA 100 mg *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml ; * *  sterilisation af stamoploesningen af sporstoffer kan ske ved 120 * C , 2 atm . , 20 min . * *  f ) Vitaminoploesning * *  Biotin * Pa 0,2 mg *  Nikotinsyre * Pa 2,0 mg *  Thiamin * PA 1,0 mg *  p-Aminobenzoesyre * PA 1,0 mg *  Pantothensyre * PA 1,0 mg *  Pyridoxamin * PA 5,0 mg *  Cyanocobalamin * PA 2,0 mg *  Folinsyre * PA 5,0 mg *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 100 ml . * *  Oploesningen sterilfiltreres gennem 0,2 mm membranfiltre . I stedet for oploesning 1.6.1.2 ( f ) kan 15 mg gaerekstrakt bruges pr . 100 ml vand ( 1.6.1.1 ) .  1.6.1.3 . Kontrolstoffer  Anilin ( frisk destilleret ) , natriumacetat , natriumbenzoat .  1.6.1.4 . Mercurichloridoploesning  1 % ( w/v ) HgCl2 i vand ( 1.6.1.1 ) .  1.6.2 . Apparatur  1.6.2.1 . Rystemaskine til to liter Erlenmeyerkolber med automatisk temperaturkontrol eller anvendt i et rum med konstant temperatur ved 20 til 25 * C .  1.6.2.2 . Tyndhalsede to liter Erlenmeyerkolber ,  ( foldede , rillede kolber anbefales ) . Kolberne skal renses omhyggeligt med f . eks . alkoholisk saltsyre foer brugen , skylles og toerres for at undgaa forurening med rester fra tidligere proever . Kolberne skal ogsaa renses , foer de bruges foerste gang , da de kan vaere forurenede .  1.6.2.3 . Membranfiltreringsapparatur  1.6.2.4 . Membranfiltre 0,2 mm  1.6.2.5 . Kulstofanalysator  1.6.3 . Forberedelse af inoculum  Inoculum kan faas fra en af foelgende fire kilder , forudsat at dets aktivitet kontrolleres ved hjaelp af et kontrolstof ( 1.6.1.3 ) .  1.6.3.1 . Inoculum fra et sekundaert afloeb  Inoculum tages fortrinsvis fra et sekundaert afloeb af god kvalitet ved et rensningsanlaeg , der hovedsagelig behandler husholdningsspildevand . Proeven skal holdes under aerobe betingelser indtil brugen . Som forberedelse af inoculum filtreres proeven gennem et groft filter , idet de foerste 200 ml bortkastes . Filtratet holdes aerobt indtil brugen . Inoculum skal anvendes samme dag , som proeven er taget .  1.6.3.2 . Inoculum fra jord  100 g jord ( frugtbar , ikke steril ) opslemmes i 1 000 ml chlorfrit drikkevand ( jord med et ekstremt hoejt indhold af ler , sand eller organisk kulstof er ikke egnet ) . Efter omroering henstaar suspensionen i 30 minutter til bundfaeldning .  Supernatanten filtreres gennem et groft filtrerpapir , idet de foerste 200 ml bortkastes . Udluftning af filtratet begyndes straks og fortsaettes indtil brugen . Inokulering skal foretages samme dag , som proeven er taget .  1.6.3.3 . Inoculum fra overfladevand  Et inoculum kan tages fra et passende overfladevand . Proeven filtreres gennem groft filtrerpapir , idet de foerste 200 ml bortkastes . Filtratet holdes aerobt indtil brugen . Inokulering skal foretages samme dag , som proeven er taget .  1.6.3.4 . Blandet inoculum  Lige dele af de tre inoculumproever blandes godt , og det endelige inoculum tages fra denne blanding .  Anvendeligheden af dette inoculum kontrolleres ved hjaelp af et kontrolstof ( 1.6.1.3 ) .  1.6.4 . Testprocedure  Teststofferne bedoemmes samtidigt , som dobbeltbestemmelser sammen med kontrolstoffet ( 1.6.1.3 ) . Der udfoeres tillige en blindproeve med inokulering uden test - eller kontrolstof til bestemmelse af DOC-blindvaerdierne .  Der tilberedes en stamoploesning af teststof i vand  ( 1.6.1.1 ) . Der tilsaettes saa meget af denne stamoploesning til naeringsoploesningen ( 1.6.1.2 ) , at der opnaas en kulstofkoncentration paa 5 til 40 mg DOC/l . Kontrolstoffet ( 1.6.1.3 ) testes ved en startkoncentration svarende til 20 mg DOC/l .  To kolber ( 1.6.2.2 ) paafyldes 900 ml naeringsoploesning og inokuleres med 0,5 ml/l af inoculum ( 1.6.3 ) . Kolbens munding daekkes f.eks . med aluminiumfolie , saaledes at udveksling af luft mellem kolben og den omgivende atmosfaere ikke er unoedvendigt hindret .  ( Bomuldsvat er uanvendeligt , paa grund af DOC-analysen ) . Kolberne anbringes i rystemaskinen . Temperaturen holdes aendret paa 20 til 25 * C under testen , og kolberne afskaermes fra lys . Luften maa vaere fri for forurening og toksiske stoffer  ( chlorerede oploesningsmidler osv . ) .  I loebet af bionedbrydningstesten dobbelbestemmes DOC-koncentrationerne paa den foerste dag , paa dag 27 og dag 28 . Mindst tre analyser skal yderligere udfoeres for at foelge nedbrydningen ( omkring dag 7 , dag 14 og dag 21 ) .  Kun det noedvendige volumen af kulturmedium maa udtages til hver bestemmelse . For forskelligt apparatur , f.eks . contrifugering eller membranfiltrering forud for kulstofanalyen kraeves forskellige volumina for analysens gennemfoerelse . Tab ved fordampning kompenseres ved tilsaetning af vand  ( 1.6.1.1 ) i rette maengde . Kulturmediet skal blandes godt foer der udtages en proeve . Hvis der haenger stof fast paa kolbens inderside , maa det oploeses eller bringes i opslemning foer proeven udtages . Membranfiltrering eller centrifugering maa foretages omgaaende . Den filtrerede eller centrifugerede proeve skal analyseres samme dag , ellers skal den konserveres med 0,05 ml merkurichlorid ( 1.6.1.4 ) for hver ti ml naeringsmedium , eller opbevares ved to til fire * C i hoejst 24 timer , eller under - 18 * C ved laengere perioder .  Hvis et plateau observeres foer den 28 . dag , kan testen sluttes . Hvis nedbrydningen tydeligt er startet , men ikke har naaet et plateau ved den 28 . dag , anses det for fornuftigt at forlaenge forlaenge forsoeget en til to uger .  Alle trin forudsaetter stor omhu og hoej renhedsgrad af kolber , pipetter osv . ( men ikke sterilitet ) .  1.6.5 . DOC-bestemmelserne  Membranfiltre er egnede , hvis det godtgoeres , at de hverken frigoer kulstof eller adsorberer stoffet ved filtreringen .  Hvis proeverne centrifugeres , maa dette goeres ved 40 000 m s-2 ( * 4 000 g ) i 15 min . , helst i en koelecentrifuge og under alle omstaendigheder under 40 * C .   ( Bemaerk : Differentieringen mellem TOC og DOC ved centrifugering ved meget lave koncentrationer synes ikke at virke godt , da enten ikke alle bakterier fjernes , eller da kulstof genoploeses fra bakterieplasmaet . Ved hoejere testkoncentrationer  ( stoerre end eller lig 10 mg C/l ) og ved den samme lille inokulation synes , centrifugeringsfejlen at vaere relativt lille .  Proeven , der er udtaget fra kulturmediet ( omkring 30 ml ) , centrifugeres eller membranfiltreres straks i filtreringsapparatet ( 1.6.2.3 ) , idet der bruges filtre ifoelge 1.6.2.4 . De foerste 20 ml af filtratet bortkastes .  DOC-koncentrationen i det resterende filtrat ( ca . ti ml ) dobbelbestemmes ved hjaelp af TOC/DOC instrumentet  ( 1.6.2.5 ) . Hvis filtratet ikke kan analyseres samme dag , skal det konserveres ifoelge 1.6.4 .  2 . DATA OG BEDOEMMELSE  De analytiske resultater registreres paa det vedlagte skema ( tillaeg 1 ) og vaerdien for den biologiske nedbrydning beregnes som angivet i 1.2 .  DOC-koncentrationerne beregnes til naermeste 0,1 mg/l . Gennemsnittet af D t-vaerdierne rundes op til naermeste hele procent .  Forloebet af nedbrydningstesten foelges grafisk i et diagram som vist vedlagt ( tillaeg 2 ) .  Resultaterne af nedbrydningstesten er gyldige , hvis foelgende betingelse er opfyldt :   - Saafremt kontrolstoffet i den samme testserie udviser en DOC-fjernelse paa * 70 % inden for ti dage , regnet fra den dag , hvor niveauet af bionedbrydning foerst overskrider 10 % . Hele serien maa forkastes , saafremt dette resultat ikke opnaas inden for testperiodens 28 dage .  3 . RAPPORT  3.1 . Testrapporter  Testrapporten skal i videst mulige omfang indeholde foelgende :   - data skal rapporteres paa skema ( tillaeg 1 ) ;   - forloebet af nedbrydningen afbildes grafisk i et diagram , der viser lag-fase , nedbrydningsfase , haeldning og " tidsvindue " , - dvs . en ti dages periode begyndende fra den dag bionedbrydningen foerst overskrider 10 % ;   - bevis for testens gyldighed ( nemlig at kontrolstoffet udviser * 70 % DOC-fjernelse paa ti dage , regnet fra den dag , hvor nedbrydningen overskrider 10 % , og opnaaet inden for testperiodens 28 dage . )  3.2 . Fortolkning af resultater  Paa grund af denne tests stramme forsoegsbetingelser betyder et lavt resultat ikke noedvendigvis , at teststoffet ikke er bionedbrydeligt under miljoebetingelser , men indicerer , at mere arbejde vil vaere paakraevet for at afgoere dette .  Testkemikalier , der udviser et stort DOC-tab i denne test , anses for let bionedbrydelige , forudsat at dette niveau er naaet inden for ti dage , regnet fra den dag , hvor det observerede niveau af bionedbrydning foerst overskrider 10 % .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 301E . Decision of the Council C(81 ) 30 . Final .   ( 2 ) Gerike , P . , Fischer , W . K . , A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests , Ecotoxicology and Environmental Safety , Vol . 3 , No 2 , 1979 , p . 159 til 173 .   ( 3 ) Gerike , P . , Fischer , W . K . , A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests II . Additional results and conclusions , Exotoxicology and Environmental Safety , Vol . 5 , No 1 , 1981 , p . 45 - 55 .  Tillaeg 1  Biologisk nedbrydning : JFR . EFT  Biologisk nedbrydning ( Skema ) : JFR . EFT  Tillaeg 2  Tabeller : JFR . EFT  C . 4 . NEDBRYDNING  BIOLOGISK NEDBRYDNING : MODIFICERET AFNOR-TEST NFT 90/302  1 . METODE  1.1 . Indledning  Formaalet med metoden er at maale bionedbrydeligheden af vandoploeselige , ikke-flygtige organiske stoffer i et aerobt vandigt miljoe ved en begyndelseskoncentration svarende til 40 mg DOC/l ( DOC = dissolved organic carbon , oploest organisk kulstof ) . Hvis maalegraensen for apparater til bestemmelse af organisk kulstof forbedres , kan brugen af lavere test-koncentrationer vaere fordelagtig , isaer for toksiske stoffer .  Indholdet af organisk kulstof i teststoffet maa vaere kendt .  Metoden er kun anvendelig for de organiske teststoffer , der ved den anvendte testkoncentration :   - i det mindste er oploeselige i vand ved testkoncentrationen ( 40 mg DOC/l ) ,   - har et ubetydeligt damptryk ,   - ikke er haemmende over for bakterier , og som   - ikke adsorberes vaesentligt til glasoverflader .  Oplysninger om de relative maengder af teststoffets hovedkomponenter vil vaere nyttig for fortolkningen af de opnaaede resultater , specielt i de tilfaelde , hvor resultaterne er lave .  Oplysninger om stoffets toksicitet over for mikroorganismer kan vaere nyttig for fortolkningen af lave resultater .  1.2 . Definitioner og enheder  Nedbrydningen er defineret som den del af teststoffet som forsvinder udtrykt i procent DOC fjernelse : JFR . EFT  1.3 . Referencestoffer  Det er oenskeligt at bruge passende kontrolkemikalier til at kontrollere aktiviteten af inoculum . F . eks . kan anilin , natriumacetat eller natriumbenzoat bruges hertil , og de skal udvise en DOC fjerneb paa * 70 % inden for 28 dage . Hvis dette ikke er tilfaeldet , anses testen for ugyldig og skal gentages med et inoculum fra en anden kilde .  I denne specifikke test finder glucose specielt anvendelse i haemningstesten og for at kontrollere aktiviteten af inoculum , hvilket ogsaa kan goeres med anilin , natriumacetat og natriumbenzoat .  1.4 . Metodens princip  Kemo-organotrofe mikroorganismer bionedbryder organiske stoffer , der er oploest i vand , idet disse udgoer den eneste kulstof - og energikilde . Stofferne undersoeges ved en saadan koncentration , at det initiale indhold af organisk kulstof er 40 mg/l . Tilbageblivende organisk kulstof i oploesningen maales mindst efter 3 , 7 , 14 og 28 dage . Samtidig kontrolleres teststoffet for mulige haemmende virkninger over for inoculum , Proceduren kontrolleres ved hjaelp af et kontrolstof .  1.5 . Kvalitetskriterier  Metodens reproducerbarhed er efterproevet i OECD og EOEF-ringtests og fundet passende for en screening-test .  Den laveste koncentration af teststoffer , ved hvilken denne metode kan bruges , er stort set bestemt af foelsomhedsgraensen for organisk kulstofanalyse , som paa nuvaerende stade er 0,5 mg C/l , og af koncentrationen af oploest organisk kulstof i naeringsoploesningen .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Reagenser  De reagenskemikalier der bruges , maa vaere af anerkendt analytisk renhed .  1.6.1.1 . Destilleret vand  Destilleret vand maa ikke indeholde mere end 10 % af det organiske kulstof , som tilfoeres med teststoffet .  1.6.1.2 . Naeringsoploesning  Fremstil testmediet som anfoert nedenfor ved brug af sterilt materiale . Til brug for en liter oploesning oploeses foelgende i destilleret vand : ( PA betyder , at reagenserne er af analytisk renhedsgrad = AR ) .   - ( NH4)2SO4 ammoniumsulfat * PA 0,300 g *   - NH4NO3 ammoniumnitrat * PA 0,150 g *   - KH2PO4 kaliumdihydrogenphosphat * PA 0,300 g *   - Na2HPO4 * 12H20 natriumhydrogenphosphat dodecahydrat * PA 2,000 g *   - MgSO4 * 7H2O magnesiumsulfat heptahydrat * PA 0,050 g *   - CaCl2 * 2H2O calciumchlorid dihydrat * PA 0,050 g *   - Gaerekstrakt * 0,005 g *  pH er 7,5 mere aller mindre 0,1 .  Tilsaet en ml af foelgende sportstofoploesning :   - FeSO4 * 7H2O jern(II)sulfat heptahydrat * PA 0,100 g *   - MnSO4 * H2O mangan(II)sulfat monohydrat * PA 0,100 g *   - K2MoO4 Kaliummolybdat * PA 0,025 g *   - Na2B4O7 * 10H2O dinatriumtetraborat decahydrat * PA 0,025 g *   - Co(NO3)2 * 6H2O cobalt(II)nitrat hexahydrat * PA 0,025 g *   - CuCl2 * 2H2O kobber(II)chlorid dihydrat * PA 0,025 g *   - ZnCl2 zinkchlorid * PA 0,025 g *   - NH4VO3 Ammoniumvanadat * PA 0,010 g . *  Destilleret vand til 100 ml   ( sporstofoploesningen kan holde sig i en maaned ved en temperatur paa mellem 1 og 4 * C ) .  Fortynd op til en liter og bland . Mediet skal bruges inden for 12 timer .  1.6.1.3 . Kontrolstoffer  Anilin ( frisk destilleret ) , natriumacetat , natriumbenzoat , glucose .  1.6.2 . Apparatur  Saedvanlig laboratorieudstyr samt :   - apparatur til maaling af organisk kulstof ;   - spektrofotometer ;   - centrifuge , 4 000 g ;   - rysteapparat , der muliggoer passende udluftning og rystning ,   - apparatur til maaling af oploest oxygen , pH-meter , 500 ml bredhalsede koniske kolber , sterile ;   - apparatur til sterilfiltrering ( membranfiltre med 0,22 mm porer ) .  Glasudstyret skal vaere omhyggeligt renset og helt fri for alle spor af organisk eller toksisk materiale .  1.6.3 . Fremstilling af inoculum  Tag et passende volumen af en blanding af tre proever fra forurenet overfladevand og afloeb fra kommunale rensningsanlaeg , der er fri for stoerre specifikke forureninger . Bakterietaelling for hver proeve skal vise mindst 10 5 bakterier/ml . Proeverne skal bruges som inoculum inden for 12 timer , inklusive transport , og de maa ikke henstaa mere end seks timer uden udluftning .  Der filtreres gennem papir for at fjerne stoerre uoploeselige partikler . Filtratet opsamles og passeres gennem et membranfilter med 0,22 mm porer .  Vask med en egnet isoton oploesing . Overfoer de paa membranen aflejrede bakterier til et lille volumen isoton oploesning . Der blandes godt . Maal adsorbansen ved 620 nm , og udled heraf koncentrationen af bakterier i relation til en standardkurve , som tidligere er fremkommet ved hjaelp af taelling paa fast medium af Pseudemonas fluorescens , stamme ATCC 15453 . Tilsaet et saadant rumfang af oploesning , at koncentrationen af bakterier bliver 5 mere aller mindre 3 gange 10 7 pr . ml . Brug inoculum inden for den naeste time .  1.6.4 . Testprocedure  Inkuberingen udfoeres uden tilstedevaerelse af intenst lys i en inkubator holdt ved 20 til 25 * C , og fri for toksiske dampe .  Forbered foelgende oploesninger :  1 . Oploesning af teststoffet i testmediet med en koncentration paa 40 mg organisk kulstof/l .  2 . Oploesning af glucose i testmediet med en koncentration paa 40 mg organisk kulstof/l .  3 . Oploesning af teststof og glucose i testmediet med de samme koncentrationer som ovenfor .  4 . Hav ligeledes en passende maengde testmedium klar .  Bland de fire oploesninger hver for sig og sterilfiltrer dem gennem membranfilter .  Membranfiltre er egnede , hvis det godtgoeres , et de hverken frigoer kulstof eller absorberer stoffet ved filtreringen .  Alle noedvendige manipulationer skal udfoeres med sterile metoder . Fordel oploesningerne i test-kolber , der i forvejen er steriliserede , efter foelgende skema :  kolbe nr . 1 ( forsoeg ) * 150 ml oploesning 1 , *  kolbe nr . 2 ( forsoeg ) * 150 ml oploesning 1 , *  kolbe nr . 3 ( forsoeg ) * 150 ml oploesning 1 , *  kolbe nr . 4 ( steril kontrol ) * 150 ml oploesning 1 , *  kolbe nr . 5 ( glucosekontrol ) * 150 ml oploesning 2 , *  kolbe nr . 6 ( kontrol af haemning ) * 150 ml oploesning 3 , *  kolbe nr . 7 ( blindproeve ) * 150 ml oploesning 4 . *  Tilsaa kolberne 1 , 2 , 3 , 5 , 6 og 7 med 1,5 ml inokulum og bland godt ved manuel rystning .  Tag en proeve paa tre til fem ml fra hver kolbe . Centrifuger proeverne ved 4 000 g i 15 minutter , idet temperaturen holdes under 26 * C . Udtag supernatanterne til maaling af organisk kulstof til tiden 0 .  Anbring kolberne paa rysteapparatet og lad dem staa der i hele testperioden : koncentrationen af oploest oxygen paa dag 3 i flaske fem skal vaere mindst 5 mg/l . Paa samme maade som til tiden 0 udfoeres maaling af organisk kulstof for kolberne ( en , to , tre , fem , seks og syv mindst efter 3 , 7 , 14 og 28 dages inkubation . Dog kan testen betragtes som afsluttet , hvis reduktionen i kulstofindhold i kolberne en , to og tre naar 95 % i forhold til initialindholdet .  Testen kan sluttes foer den 28 . dag , hvis et plateau observeres forinden .  Hvis en nedbrydning tydeligt er startet , men ikke har naaet et plateau ved den 28 . dag , anses det for fornuftigt at forlaenge forsoeget en eller to uger .  Ved slutningen af testen udfoeres en maaling af organisk kulstof i kolbe fire paa samme maade som til tiden 0 , samt en kontrol for sterilitet ved udsaaning i et glas med flydende medium og inkubering ved 25 * C i fem dage .  Kulturmedium :  toerret gaerekstrakt * 3 g , *  pancreas casein pepton * 6 g , *  vand * 1 000 ml . *  Oploes de toerre komponenter til det komplette medium i kogende vand . Om noedvendigt justeres pH , saaledes at det efter steriliseringen er 7,2 mere aller mindre 0,2 ved 20 * C .  Hvis maalingerne af organisk kulstof maa udskydes , opbevares supernatanten ved 4 * C i moerke i hermetisk forseglede glas i hoejst 24 timer . Hvis analysen ikke kan udfoeres inden for 24 timer , nedfryses proeven til under - 18 * C . I hver kolbe kontrolleres vaeskestanden af mediet for hver proeveudtagning , og som kompensation for vandtabet ved fordampning tilsaettes destilleret vand , som er sterifiltreret gennem membranfilter med 0,22 mm porer , til samme volumen som efter foregaaende proeveudtagning .  2 . DATA OG BEDOEMMELSE  De analytiske resultater angives paa det vedlagte skema ( tillaeg 1 ) og vaerdien for den biologiske nedbrydning beregnes som angivet i 1.2 .  Resultaterne af nedbrydningstesten er gyldige , hvis foelgende betingelser er opfyldt :   - niveauet af glucosenedbrydning i kolbe fem skal vaere mindst 80 % paa dag syv ;   - ved afslutningen af testen skal kolbe fire stadig vaere steril .   - Koncentrationen af oploest oxygen i kolbe fem skal vaere mindst 5 mg/l paa dag tre .  Niveauet af glucosebionedbrvdning i kolbe seks skal paa dag syv vaere mindst 75 % af , hvad der er observeret i kolbe fem . Hvis denne graense ikke er naaet , antages teststoffet at have haemmende virkning paa de tilstedevaerende bakterier , og metoden kan derfor ikke anvendes ved den specificerede koncentration .  Bemaerkninger  Ved sammenligning af den procentvise eliminering af kulstof i kolberne en , to og tre paa den ene side med kolbe fire paa den anden side , kan der skelnes mellem aarsagerne til den iagttagne nedbrydning :   - de fysisk-kemiske mekanismer i kolbe fire ,   - de fysisk-kemiske samt de biologiske mekanismer i kolberne en , to og tre .  3 . RAPPORT  3.1 . Testrapport  Testrapporten skal i videst mulige omfang indeholde foelgende :  Alle de eksperimentelle resultater vedroerende teststoffet , referencestoffet og blindproeverne skal anfoeres .  Specielt naevnes foelgende punkter :   - forsvindingsgraden for produktet i kolbe fire ved slutningen af testen ;   - alle iagttagne haemningsfaenomener ;   - bevis for gyldighed ;   - forloebet af nedbrydningen afbildes grafisk i et diagram , der viser lag-fase , nedbrydningsfase , haeldning og " tidsvindue " , - dvs . en ti-dages periode begyndende fra den dag bionedbrydningen foerst overskrider 10 % .  3.2 . Fortolkning af resultaterne  Paa grund af denne tests stramme forsoegsbetingelser betyder et lavt resultat ikke noedvendigvis , at teststoffet ikke er bionedbrydeligt under miljoebetingelser , men indicerer , at mere arbejde vil vaere paakraevet for at afgoere dette .  Testkemikalier , der giver et stort DOC tab i denne test , anses for let bionedbrydelige , forudsat at dette niveau er naaet inden for ti dage , regnet fra den dag , hvor det observerede niveau af bionedbrydning foerst overskrider 10 % .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test guideline 301A . Decision of the Council C(81 ) 30 . Final .   ( 2 ) Gerike , P . , Fischer . W . K . , A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests , Ecotoxicology and Environmental Safety , Vol . 3 , No 2 , 1979 , p . 159 to 173 .   ( 3 ) Gerike , P . , Fischer W . K . , A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests . II . Additional results and conclusions , Ecotoxicology and Environmental Safety , Vol . 5 , No 1 , 1981 , p . 45 to 55 .   ( 4 ) AFNOR : Method for the evaluation in aqueous medium of the biodegradability of so called " total " of organic products . T 90 to 302 .  Tillaeg 1  Skema : JFR . EFT  Tillaeg 2  Tabeller : JFR . EFT  C . 5 . NEDBRYDNING  BIOLOGISK NEDBRYDNING : MODIFICERET STURM-TEST  1 . METODE  1.1 . Indledning  Formaalet med denne metode er at maale bionedbrydeligheden af ikke-flygtige organiske stoffer i et aerobt , vandigt miljoe ved to startkoncentrationer , 10 og 20 mg/l ( standardkoncentrationer ) .  Indholdet af organisk kulstof i teststoffet skal vaere kendt ( fra TOC analyse eller skoennet ud fra den empiriske formel , saaledes at det teoretiske kuldioxyd-udbytte kan beregnes ) .  Metoden er kun anvendelig for de teststoffer , der ved den anvendte testkoncentration   - har et forsvindende damptryk , og   - ikke er haemmende over for bakterier .  Denne metode kan , i det mindste principielt , anvendes for stoffer , der er tungtoploeselige ved testkoncentrationerne .  Oplysninger om de relative maengder af teststoffets hovedkomponenter vil vaere nyttige for fortolkningen af de opnaaede resultater , specielt i de tilfaelde , hvor resultaterne er lave .  Oplysninger om stoffets toksicitet over for mikroorganismer kan vaere nyttig for fortolkningen af lave resultater og ved valget af passende testkoncentrationer .  1.2 . Definitioner og enheder  Nedbrydningen defineres som den maengde CO2 , der produceres af stoffet , udtrykt i procent af den teoretiske CO2-maengde , det efter beregning ud fra stoffets indhold af organisk stof skulle have produceret  ( " ThCO2 " ) .  1.3 . Referencestoffer  Det er oenskeligt at bruge et passende kontrolkemikalium til at kontrollere aktiviteten af inoculum . F . eks . , kan anilin , natriumacetat eller natriumbenzoat , bruges hertil og de skal udvise en CO2-produktion , der er stoerre end eller lig 60 % inden for 28 dage . Hvis dette ikke er tilfaeldet , anses testen for ugyldig og skal gentages med et inoculum fra en anden kilde .  1.4 . Metodens princip  Teststoffet saettes til et kemisk defineret flydende medium inokuleret med kloak-mikroorganismer og udluftet ved 20 til 25 * C . Temperaturen registreres under testforloebet .  Det frigjorte CO2 fanges som BaCO3 , og nedbrydningen foelges med CO2-analyser gennem en 28 dages periode . Efter sammenligning med passende blindproeve(r ) bestemmes den totale CO2-maengde , som teststoffet har produceret gennem testen , og beregnes som en procentdel af den totale CO2-maengde , som teststoffet paa basis af sit kulstofindhold teoretisk kunne have produceret .  Proceduren kontrolleres ved hjaelp af et kontrolstof  ( se 1.6.1.3 ) .  1.5 . Kvalitetskriterier  Metodens reproducerbarhed er efterproevet i OECD - og EOEF-ring tests og fundet passende for en screening-test .  Den endogene CO2-produktion i inoculum , som maales i blindproeven , er hovedaarsagen til , at der i testen ikke kan anvendes koncentrationer lavere end 5 mg/l teststof . Saafremt testen tilpasses til anvendelse af 14C-maerkede teststoffer , kan testsfkoncentrationen vaere meget lavere .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Reagenser  1.6.1.1 . Vand af hoej kvalitet .  Dobbeltdestilleret vand , frit for toksiske stoffer  ( specielt kobber ) , med et lavt kulstofindhold  ( < 2,0 mg/l TOC ) og med en modstand paa * 18 megohm * cm . Destilleret vand maa ikke indeholde mere end 10 % af det organiske kulstof , som tilfoeres med teststoffet .  1.6.1.2 . Naeringsoploesning  a ) Stamoploesning  FeCl3 * 6H2O jern(III)chlorid hexahydrat * 0,25 g , *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml ; * *  MgSO4 * 7H2O magnesiumsulfat heptahydrat * 22,50 g , *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml ; * *  CaCl2 calciumchlorid * 27,50 g , *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml ; * *  KH2PO4 kaliumdihydrogenphosphat * 8,50 g , *  K2HPO4 kaliumhydrogenphosphat * 21,75 g , *  Na2HPO4 * 2H2O natriumhydrogenphosphat dihydrat * 33,40 g , *  NH4Cl ammoniumchlorid * 1,70 g , *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml ; * *  ( NH4)2SO4 ammoniumsulfat * 40,00 g . *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml . * *   ( b ) Testmedium  Testmediet indeholder foelgende reagenser pr . liter vand ( 1.6.1.1 ) :   - 4 ml af ovennaevnte jern(III)chloridoploesning ,   - 1 ml af ovennaevnte magnesiumsulfatoploesning , - 1 ml af ovennaevnte calciumchloridoploesning ,   - 2 ml af ovennaevnte phosphatoploesning ,   - 1 ml af ovennaevnte ammoniumsulfatoploesning ;  pH skal vaere 7,2 mere aller mindre 0,2 .  1.6.1.3 . Kontrolstoffer  Anilin ( frisk destilleret ) , natriumacetat , natriumbenzoat .  1.6.1.4 . Bariumhydroxid , 0,025 N ( 0,0125 M )  Oploes 4,0 g Ba(OH)2 * 8H2O pr . liter vand af hoej kvalitet . Filtrer gennem filtrerpapir og opbevar den klare oploesning taet tillukket for at undgaa adsorption af CO2 fra luften . Det anbefales af fremstille mere end fem liter samtidig , naar der laves en forsoegsserie .  1.6.2 . Apparatur  1.6.2.1 . Gasvaskeapparat for CO2 .  Til en serie paa 12 testflasker ( svarende til tre teststoffer ) anvendes ( flaske betyder her en fire - til femliter brun glasflaske . Hvis klare glasflasker bruges , skal testen udfoeres i moerke ) :   - fire en-liter plastflasker indeholdende 700 ml 10N ( 10M ) NaOH ,   - en en-liter Erlenmeyerkolbe indeholdende 700 ml 0,025 N ( 0,0125 M ) Ba(OH)2-oploesning ,   - en tom en-liter Erlenmeyerkolbe til hindring af vaeskemedrivning .  Disse flasker forbindes i serie med inert slange til en trykluftkilde og luft bobles gennem vaskeoploesningerne med konstant hastighed .  For hvert yderligere saet paa fire testflasker vedfoejes yderligere en en-liter plastflaske paafyldt 700 ml 10 N  ( 10 M ) NaOH .  1.6.2.2 . CO2-produktionsapparat  Fire fire - til fem-liters brune engangsflasker til hvert testmateriale .  Propper , boejelig slange , plastslange .  1.6.2.3 . CO2-absorptionsflasker  100 ml bariumhydroxydabsorptionsflasker .  1.6.3 . Forberedelse af inoculum  Kilden for testorganismer er aktiveret slam , der nylig er indsamlet fra et godt fungerende kommunalt rensningsanlaeg . Dette anlaeg maa kun modtage lidt eller intet industrispildevand .  Ved ankomsten til laboratoriet udluftes de aktiverede slam i fire timer . 500 ml af den blandede vaeske udtages og homogeniseres i to minutter med en blender . Der bundfaeldes i en halv time . Hvis supernatanten stadig indeholder en stor maengde slamartikler efter 30 minutter , skal der bundfaeldes i yderligere 30 til 60 minutter , eller adapteres til laboratoriebetingelser for at opnaa bedre bundfaeldning .  Supernatanten dekanteres for at give tilstraekkeligt volumen til et 1 % inoculum for hver CO2 testflaske . Undgaa at overfoere slamartikler , der vil forstyrre maalingen af det dannede CO2 .  Skoent det ikke kraeves , er det nyttigt at taelle kolonidannende enheder pr . ml . supernatant . Dette inoculum boer normalt indeholde 10 6 til 20 gange 10 6 kolonidannende enheder pr . ml .  Det skal bruges samme dag , det er forberedt .  1.6.4 . Testprocedure  1.6.4.1 . Stamoploesning  En startstamoploesning forberedes af teststoffet ved oploesning i vand af hoej kvalitet i en koncentration paa 1 000 mg/l .  Stamoploesninger laves paa grundlag af indholdet af organisk bundet kulstof i teststoffet . Hvis dette ikke er kendt , laves stamoploesningerne paa vaegtbasis til en koncentration af 1 000 mg/l . For at faa en homogen proeve er det noedvendigt at blande godt , idet man samtidig boer undgaa skumdannelse , som kan medfoere koncentrering af teststoffet . For faste stoffer kan det vaere noedvendigt at smelte og blande hele indholdet af proeven , foer der udtages delproeve af den . Dette er yderst vigtigt , da beregningerne af % bionedbrydning afhaenger af , om den korrekte maengde kulstof er tilsat testsystemet .  pH af stamoploesningen behoever ikke at justeres , medmindre det falder uden for intervallet 3 til 10 , da phosphatpufferen i testmediet vil regulere det . Hvis pH ligger uden for dette interval , justeres en proeve af stamoploesningen til pH 7,0 mere aller mindre 1,0 med l N ( l M ) HCl eller NaOH , idet man paaser , at oploesningen blandes kraftigt under tilsaetningen af syre eller base .  Som kontrol af den indstillede koncentration af organisk kulstof i teststoffet kan stamoploesningen  ( eller den neutraliserede proeve ) analyseres for totalt organisk kulstof . En TOC analyse er ogsaa paakraevet for stamoploesningen af kontrolstoffet .  Hvis et teststof er uoploeseligt i vand tilsaettes den passende maengde teststof direkte til testflasken paa basis af vaegt eller volumen .  Hvis teststoffet ikke er oploeseligt ved testkoncentrationen , kan der anvendes specielle teknikker , saasom dispersion ved hjaelp af ultralyd , for at opnaa en god dispersion af teststoffet .  1.6.4.2 . Betingelser  Da et 1 % inoculum bruges i CO2-testen , er det noedvendigt at foretage fortyndinger i CO2-testmediet .  Dette foregaar lettest paa foelgende maade :  a ) Til hver af de fire til fem liters testflasker saettes 2 470 ml vand af hoej kvalitet . ( 1.6.1.1 ) .  b ) Til hver af de fire til fem liters testflasker saettes tre ml af hver af ammoniumsulfat - , magnesiumsulfat - og calcium-chlorid-stamoploesningerne , seks ml af phosphatbufferstamoploesningen og 12 ml af ferrichloridoploesningen .  c ) Til hver af de fire til fem liters testflasker saettes 30 ml inoculum af aktiveret slam .  Denne blanding udluftes med CO2-fri luft i 24 timer for at rense systemet for kuldioxyd .  Efter udluftningen paafyldes tre CO2-absorptionsflasker hver 100 ml 0,025 N ( 0,0125 M ) Ba ( OH)2 og forbindes i serie til luftafledningen fra hver sin testflaske .  1.6.4.3 . Udfoerelse af testen  Teststof tilsaettes to af de fire testflasker ved start af testningen . Hvert stof testes ved to koncentrationer : 10 og 20 mg/l .  Maengden af teststofstamoploesning , der kraeves i flasken , udregnes paa foelgende maade :  ml stamoploesning pr . flaske = B gange C/A  hvor :  B er teststof-koncentrationen i testflasken ( mg/l ) ,  A er teststof-koncentrationen i stamoploesningen  ( mg/l ) , og  C er det endelige volumen af testmediet i testflasken  ( ml ) .  Tilstraekkelig stamoploesning til at opnaa den oenskede testkoncentration , som beregnet ovenfor , plus tilstraekkeligt destilleret vand til at give 473 ml  ( stamoploesning plus vand af hoej kvalitet ) tilsaettes de givne flasker . Til den tredje flaske , der bruges som blindforsoeg , og som ikke indeholder noget teststof , saettes 473 ml vand af hoej kvalitet . Det endelige volumen af hver flaske er nu 3 000 ml .  Et kontrolstof saettes til den sidste af de fire flasker , til en koncentration paa 20 mg/l .  Testen startes ved at boble CO2-fri luft gennem oploesningen med en hastighed paa 50 til 100 ml/min . pr . flaske ( ca . 1 til 2 bobler/sek . ) .  For vandoploeselige teststoffer , der tilsaettes som toert stof til CO2-testflasken , kan omroering ske med en magntomroerer . For skummende kemikalier kan CO2-fri luftgennembobling erstattes med indblaesning over overfladen og magnetisk omroering .  Det kuldioxid , der produceres i hver flaske , reagerer med bariumhydroxidet og udfaeldes som bariumcarbonat , maengden af produceret CO2 bestemmes ved titrering af det resterende Ba(OH)2 med 0,05 N ( 0,05 M ) standard HCl . Regelmaessigt ( hver anden eller hver tredie dag ) fjernes CO2-absorptionsflasken naermest testflasken og titreres . De resterende to absorptionsflasker rykkes en plads naermere testflasken , og en ny absorptionsflaske fyldt med 100 ml frisk 0,025 N ( 0,0125 M ) Ba ( OH)2 placeres bagest i serien .  Titreringer udfoeres efter behov ( foer bundfald af bariumcarbonat er synligt i den anden flaske ) omtrent hver anden dag de foerste ti dage , derefter hver femte dag indtil den 28 . dag .  Paa den 27 . dag skal pH af testflaskens indhold maales igen , hvorefter en ml koncentreret HCl saettes til hver flaske for at udrive uorganisk carbonat . Flaskerne udluftes natten over , og der udtages proever fra hver flaske til DOC analyse . Den sidste titrering foretages paa dag 28 .  Titreringer af de 100 ml Ba(OH)2-oploesning foretages efter , at flasken naermest testflasken er fjernet . Bariumhydroxidet titreres med 0,05 N ( 0,05 M ) HCl med phenolphthalein som indikator .  Testen udfoeres ved stuetemperatur ( 20 til 25 * C ) og temperaturen registreres under testperioden .  Hvis et plateau observeres foer den 28 . dag , kan testen sluttes .  Hvis nedbrydningen tydeligt er startet , men ikke har naaet et plateau ved den 28 . dag , anses det for fornuftigt at forlaenge testperioden en til to uger .  1.6.5 . CO2-bestemmelse  Andre maader til maaling af CO2-udviklingen end tilbagetitrering af bariumhydroxidfaelder kan komme i betragtning . Dette aendrer ikke testens princip , og kan muligvis foere til kontinuerlig maaling af bionedbrydningen .  Det foerste trin i beregningen af den producerede CO2-maengde er at korrigere flaskerne med teststof for endogen CO2-produktion . Kontrolflasken tjener som blindvaerdi for korrektion for den maengde CO2 , som kan produceres ved bakteriers endogene respiration . Maengden af CO2 , som et teststof har produceret , bestemmes ved forskellen ( i ml af titrant ) mellem den eksperimentelle og den blinde bariumhydroxidfaelde .  Naar man anvender 0,05 N ( 0,05 M ) HCl ved titreringen , svarer hver ml HCl til 1,1 mg CO2 .  2 . DATA OG BEDOEMMELSE  De analytiske resultater angives i det vedlagte skema  ( tillaeg I ) , og vaerdien for den biologiske nedbrydning beregnes , som angivet i 1.2 .  Kuldioxidkoncentrationerne beregnes til naermest 0,1 mg/l . Vaerdien for den biologiske nedbrydning rundes op til naermeste hele procent . Forloebet af nedbrydningstesten foelges grafisk i et diagram som vist paa vedfoejede eksempel ( tillaeg 2 ) .  Resultaterne af nedbrydningstesten er gyldige , hvis foelgende betingelser er opfyldt :   - I den samme testserie skal kontrolstoffet inden for 28 dage give en bionedbrydning , der er stoerre end eller lig 60 % . ( Hvis dette ikke er tilfaeldet , skal hele serien forkastes og gentages med et inoculum fra en anden kilde ) .   - Der maa ikke ske en signifikant CO2-udvikling fra blindflasken gennem testen ( forurening af mediet , glasapparaturet og luftforsyningen ) . Total kuldioxidudvikling ved afslutningen af testen maa ikke overstige 50 mg CO2/3 l medium .  3 . RAPPORT  3.1 . Testrapport  Testrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende :   - Data skal rapporteres paa skema ( tillaeg 1 ) .   - Forloebet af nedbrydningen afbildes grafisk i et diagram , der viser lag-fase , nedbrydningsfase , haeldning og " tidsvindue " , - dvs . en ti-dages periode begyndende fra den dag bionedbrydningen foerst overskrider 10 % .   - Dispersionsmetode , der er anvendt for stoffer , som ikke er oploeselige ved testbetingelserne .   - Angiv dato og lokalitet for indsamling af testorganismerne , samt hvordan de blev haandteret foer inokulation .   - Temperaturintervallet gennem forsoegsperioden skal angives .   - Hvis maalt , som foreslaaet under punkt 1.6.3  ( inoculum ) , angives antallet af mikroorganismer pr . ml ( kolonidannende enheder ( colony forming units ) - CFU/ml ) .   - Bevis for testens gyldighed ( * 60 % nedbrydning af kontrolstoffet paa 28 dage ) .  3.2 . Fortolkning af resultater  Paa grund af denne tests stramme forsoegsbetingelser betyder et lavt resultat ikke noedvendigvis , at teststoffet ikke er bionedbrydeligt under miljoebetingelser , men indicerer , at mere arbejde vil vaere paakraevet for at afgoere dette .  Testkemikalier , der giver et hoejt resultat af bionedbrydning i denne test , anses for let bionedbrydelige , forudsat at dette niveau er naaet inden for ti dage , regnet fra den dag , hvor det observerede niveau af bionedbrydning foerst overskrider 10 % .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test guideline 301B . Decision of the Council C(81)30 Final .   ( 2 ) Gerike , P . , Fisher , W . K . , A correlation study of Biodegradability determinations with various chemicals in various tests , Ecotoxicology and Environmental Safety , Vol . 3 , No 2 , 1979 , p . 159 to 173 .   ( 3 ) Gerike , P . , Fisher , W . K . , A correlation study of Biodegradability determinations with various chemicals in various tests II . Additional results and conclusions , Ecotoxicology and Environmental Safety , Vol . 5 , No 1 , 1981 , p . 45 to 55 .   ( 4 ) Larson , R . J . , Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals , Applied and Environmental Microbiology , Vol . 38 , 1979 , p . 1153 to 1161 .  Tillaeg 1  Modificeret STURM Test  Skema : JFR . EFT  Tillaeg 2  TABELLER : JFR . EFT  C . 6 . NEDBRYDNING  BIOLOGISK NEDBRYDNING : CLOSED BOTTLE TEST  1 . METODE  1.1 . Indledning  Formaalet med metoden er at maale bionedbrydeligheden af organiske stoffer i et aerobt vandigt miljoe ved en testkoncentration fra to ( standardkoncentrationen ) til 10 mg af stof pr . liter .  Paa sit nuvaerende udviklingstrin er testen specielt egnet til bedoemmelse af bionedbrydeligheden af vandoploeselige stoffer . Dog kan , i det mindste i princippet , ogsaa flygtige saavel som tungtoploeselige stoffer testes .  Den empiriske formel for teststoffet er noedvendig for at kunne beregne det teoretiske oxygenforbrug  ( ThOD , theoretical oxygen demand ) ; hvis den ikke kendes , kan det kemiske oxygenforbrug ( COD , chemical oxygen demand ) tjene som referencevaerdi ( tillaeg 1 ) .  Metoden er kun anvendelig for organiske teststoffer , som ikke er haemmende for bakterier ved den anvendte testkoncentration . Hvis teststoffet ikke er oploeseligt ved de angivne koncentrationer , kan der anvendes specielle teknikker , saasom dispersion ved hjaelp af ultralyd , for at opnaa en god dispersion af teststoffet .  Oplysninger om de relative maengder af teststoffets hovedkomponenter vil vaere nyttig for fortolkningen af de opnaaede resultater , specielt i de tilfaelde , hvor resultaterne er lave .  Oplysninger om stoffets toksicitet over for mikroorganismer kan vaere nyttig for fortolkningen af lave resultater og ved valget af passende testkoncentrationer .  Denne metode kan benyttes til bestemmelse af BOD-vaerdien .  1.2 . Definitioner og enheder  Det biokemiske oxygenforbrug ( BOD , biochemical oxygen demand ) beregnes som forskellen mellem oxygenforbruget for en blindproeve og for en oploesning af teststoffet ved proevningsbetingelserne . Efter division med koncentrationen ( vaegt/volumen ) af stoffet faas oxygenforbruget i mg BOD pr . mg stof .  Nedbrydningen er defineret som forholdet mellem det biokemiske oxygenforbrug og enten det teoretiske oxygenforbrug ( ThOD ) eller det kemiske oxygenforbrug  ( COD ) , og den udtrykkes i procent .  Bemaerk :  Undertiden vil de to beregningsmaader ( % af ThOD og % af COD ) ikke give det samme resultat : JFR . EFT  1.3 . Referencestoffer  Det er oenskeligt at bruge passende kontrolkemikalier til at kontrollere aktiviteten af inoculum . Anilin , natriumacetat eller natriumbenzoat ( f.eks . ) kan bruges hertil og de skal udvise en nedbrydning paa * 60 % inden for 28 dage . Hvis dette ikke er tilfaeldet , anses testen for ugyldig og gentages med et inoculum fra en anden kilde .  1.4 . Metodens princip  En forud bestemt maengde af stoffet oploeses i et uorganisk medium ( mineralsk naeringsoploesning ) til en koncentration , der normalt er 2 mg teststof/l . Oploesningen inokuleres med et lille antal mikroorganismer fra en blandingspopulation og holdes i lukkede flasker i moerke i et bad eller et rum ved konstant temperatur ( 20 til 21 * C ) .  Nedbrydningen foelges med oxygenanalyser over en 28 dages periode . Proceduren kontrolleres ved hjaelp af parallel inokulation af kontrolstof .  En oxygen-blindvaerdi bestemmes i en parallel test , der hverken indeholder teststof eller kontrolstof .  Samtidig kontrolleres teststoffet for mulig haemmende effekt paa inoculum .  1.5 . Kvalitetskriterier  Metodens reproducerbarhed er efterproevet i OECD - og EOEF-ring-tests .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Reagenser  1.6.1.1 . Destilleret eller ionbyttet vand  Destilleret eller ionbyttet vand der ikke indeholder mere ende 0,01 mg Cu/l , luftmaettet . En maengde svarende til det daglige behov ( f.eks . 50 liter ) holdes ved stuetemperatur , saa naer ved 20 * C som mulig , og udluftes kraftigt i 20 minutter med ren trykluft . Normalt er vandet klar til brug efter at have staaet i 20 timer ved 20 * C . Oxygen bestemmes som kontrol . Koncentrationen ved 20 * C skal vaere 9,09 mg O2/l . Al vaeskeoverfoersel og paafyldning med det luftmaettede vand maa foregaa uden bobler med en haevert .  1.6.1.2 . Naeringsoploesning  a ) Stamoploesninger :  KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat * 8,50 g , *  K2HPO4 Kaliumhydrogenphosphat * 21,75 g , *  Na2HPO4 * 2H2O Natriumhydrogenphosphat dihydrat * 33,30 g , *  NH4Cl Ammoniumchlorid * 1,70 g , *  oploeses i destilleret vand til 1 000 ml . * *  pH skal vaerre 7,2 . * *  MgSO4 * 7H2O Magnesiumsulfat heptahydrat * 22,50 g , *  oploeses i destilleret vand til 1 000 ml . * *  CaCl2 Calciumchlorid * 27,50 g , *  oploeses i destilleret vand til 1 000 ml . * *  FeCl3 * 6H2O jern(III)chlorid hexahydrat * 0,25 g , *  oploeses i destilleret vand til 1 000 ml . * *  b ) Testmedium  Testmediet indeholder en ml af hver af de ovennaevnte stamoploesninger pr . liter vand ( 1.6.1.1 ) .  pH skal vaere 7.2 mere aller mindre 0,2 .  1.6.1.3 . Kontrolstoffer  Anilin ( frisk destilleret ) , natriumacetat , natriumbenzoat .  1.6.2 . Apparatur  1.6.2.1 . Der kan bruges kalibrerede 250 til 300 ml BOD kolber med glasslib eller ikke-kalibrerede tyndhalsede 250 ml kolber med glasslib , hvis volumen skal bestemmes .  1.6.2.2 . Adskillige to , tre og fem liters kolber proevningen og for paafyldning af BOD kolberne .  1.6.2.3 . Pipetter fra en til ti ml . Tragte og groft filtrerpapir . Flasker til forberedelse af inoculum .  1.6.2.4 . Vandbad til at holde kolberne ved konstant temperatur under udelukkelse af lys .  1.6.3 . Forberedelse af inoculum  Inoculum kan faas fra en af foelgende fire kilder , idet dets aktivitet kontrolleres ved hjaelp af et kontrolstof  ( 1.6.1.3 ) .  1.6.3.1 . Inoculum fra jord  En vandig opslemning af ugoedet havejord . 100 g havejord , der ikke nyligt er goedet , ( jord fra et drivhus , som er under konstant temperatur aaret rundt er navnlig at foretraekke ) opslemmes i en liter chlor-frit ledningsvand . Efter 30 minutter filtreres opslemningen gennem groft filtrerpapir , og de foerste 200 ml af filtratet bortkastes . Den foelgende del af filtratet tjener til inokulation med en draabe fra spids pipette for hver liter slutrumfang . Inoculum forberedes umiddelbart foer forsoeget . Saafremt det staar i flere timer foer brug , skal det udluftes . Antallet af kim kan bestemmes ved udsaaningsplader eller paa naeringsplader . Der boer ikke vaere mere end 10 3 til 10 5 kim pr . milliliter slutrumfang .  1.6.3.2 . Inoculum fra sekundaert afloeb  Inoculum boer fortrinsvis forberedes ved proevetagning fra et sekundaert afloeb fra et aktiveret rensningsanlaeg eller et sivefilter , der hovedsagelig behandler husholdningsspildevand . Proeven skal holdes under aerobe betingelser i tiden mellem indsamling og anvendelse . Som forberedelse af inoculum filtreres proeven gennem et groft filter , idet de foerste 200 ml bortkastes . Resten af filtratet holdes aerobt indtil brugen . Inokulering skal foretages samme dag , som proeven er taget .  1.6.3.3 . Inoculum fra aktiveret rensningsanlaeg i laboratorieskala  Der bruges et afloeb fra et staerkt udluftet aktiveret rensningsanlaeg i laboratorieskala . Inoculum forberedes som beskrevet under 1.6.3.2 .  1.6.3.4 . Blandingsinoculum  Lige dele af de tre inoculumproever ( 1.6.3.1 til 1.6.3.3 ) blandes godt , og det endelige inoculum tages fra denne blanding .  1.6.4 . Testprocedure  Alle noedvendige manipulationer foer inkubationen skal udfoeres ved ca . 20 * C .  Grupper af kolber skal forberedes til bestemmelse af BOD-vaerdien af test - og kontrolstoffer i parallelle proevningsserier ( tillaeg 2 ) . Hvis kemiske analyser udfoeres samtidigt , skal et tilstraekkeligt stort antal kolber forberedes , inklusive kontrollerne af inoculum og af blindproeve . For eksempel forberedes 7 eller 15 kolber pr . teststof til 0 - , 5 - , 15 - og 28 dages proever , efter at en tilstraekkelig maengde vand er forberedt i store kolber ( 1.6.2.2 ) .  Disse store kolber fyldes foerst til omtrent en trediedel af deres volumen med destilleret vand ( 1.6.1.1 ) ved hjaelp af en haevert . Derefter afpipetteres de individuelle stamoploesninger af salte ( 1.6.1.2 ) i disse kolber alt efter slutrumfang , og henholdsvis teststof og kontrolstof tilsaettes i saadanne maengder , at der opnaas en endelig koncentration paa to eller undertiden fem eller ti mg/l .  Koncentrationen paa ca . ni mg oploest oxygen pr . liter vand ved 20 * C begraenser den mulige startkoncentration af teststoffet til ca . to mg/l , for at en signifikant residual oxygenkoncentration skal kunne garanteres efter oxidationen af teststoffet . Daarligt nedbrydelige stoffer eller stoffer med lavt ThOD kan med fordel testes parallelt ved hoejere koncentrationer .  Dernaest inokuleres forsoegskolber saavel som blindproeve med en draabe fra pipette for hver liter slutrumfang  Slutrumfang opnaas ved paafyldning med en haevert , der naar bunden af kolben . Dette sikrer tilstraekkelig blanding . Umiddelbart derefter fyldes hver forberedt oploesning over paa den tilsvarende gruppe af kolber ved hjaelp af en haevert fra den nederste fjerdedel af kolben ( ikke fra bunden ) .  Yderligere analyseres nul-kontrollerne , eller de konserveres til senere analyse ( til oxygenbestemmelsen ved faeldning med MnCl2 og NaOH ) .  De oevrige kolber placeres i vandbadet ved 20 * C og holdes i moerke . Der udtages kolber til analyse efter henholdsvis 5 , 15 og 28 dage .  Hver serie ledsages af en komplet parallel serie til bestemmelse af blindvaerdien , af oxygenforbruget uden inokulation og af kontrolstof .  Inhiberingstest  Stoffer kan let og simpelt testes for haemmende virkninger i den lukkede flaske-test .  serie 1 : 2 mg/l af et let nedbrydeligt stof , f.eks . fedt alkohol kondenseret med ethylenoxid ( i mol-forholdet 1:10 ) eller et af kontrolstofferne ;  serie 2 : x mg/l af teststof ( x er saerdvanligvis 2 ) ;  serie 3 : 2 mg/l af de let nedbrydelige stoffer samt x mg/l af teststoffet .  Hvis BOD-vaerdierne i serie tre findes at vaere mindre end summen af vaerdierne af serie en og to , anses teststoffet for at have haemmende virkning over for bakterier ved denne koncentration . Dette kontrolforsoeg er altid noedvendigt , hvis et negativt eller et daarligt nedbrydningsresultat synes ulogisk ved vurdering af teststoffets struktur dvs . , hvis der er antydninger af , at det kan skyldes inhibering .  1.6.5 . Bestemmelse af oploest oxygen  Den oploeste oxygenmaengde bestemmes ved hjaelp af en international eller nationalt anerkendt kemisk eller elektrokemisk metode .  2 . DATA OG BEDOEMMELSE  De analytiske resultater anfoeres paa det vedfoejede skema ( tillaeg 3 ) .  Forloebet af nedbrydningsproevningen foelges grafisk i et diagram som vist i ( tillaeg 4 ) .  Resultaterne af nedbrydningstesten er gyldige , hvis foelgende betingelser er opfyldt :   - I den samme testserie skal kontrolstoffet inden for 28 dage give en bionedbrydning , der er stoerre end eller lig med 60 % . Hvis dette ikke er tilfaeldet , skal hele serien forkastes .   - Oxygenforbruget i kolben uden inokulation maa ikke overstige 0,3 mg O2/l efter fem dage og 0,4 mg O2/l efter 28 dage . Blindvaerdien med inokulation maa ikke overstige 0,5 mg O2/l efter fem dage og 0,6 mg O2/l efter 15 og 28 dage .  3 . RAPPORT  3.1 . Testrapporter  Testrapporten skal i videst mulige omfang indeholde foelgende :   - data skal rapporteres paa skema ( tillaeg 2 ) ,   - forloebet af nedbrydningen afbildes grafisk i et diagram , der viser lag-fase , nedbrydningsfase , haeldning og " tidsvindue " , - dvs . en ti-dages periode begyndende fra den dag bionedbrydningen foerst overskrider 10 % ,   - metoden , der er anvendt til COD bestemmelse ,   - metoden , der er anvendt til oxygenmaalinger ,   - dispersionsmetode for stoffer , der er tungtoploeselige ved testbetingelserne ,   - bevis for testens gyldighed .  3.2 . Fortolkning af resultater  Man maa tage den mulighed i betragtning , at nitrogenholdige stoffer kan paavirke resultatet .  Paa grund af denne tests stramme forsoegsbetingelser betyder et lavt resultat ikke noedvendigvis , at teststoffet ikke er bionedbrydeligt under miljoebetingelser , men det indicerer , at mere arbejde vil vaere paakraevet for at afgoere dette .  Testkemikalier , der udviser et hoejt oxygenforbrug i denne test , anses for let bionedbrydelige , forudsat at dette niveau er opnaaet inden for ti dage , regnet fra den dag , hvor det observerede niveau af bionedbrydning foerst overskrider 10 % .  4 . Referencer   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 301 D . Decision of the Council C(81 ) 30 . Final .   ( 2 ) Gerike , P . , Fischer , W . K . , A correlation study of Biodegradability determinations with various chemicals in various tests , Ecotoxicology and Environmental Safety , vol . 3 , No 2 , 1979 , p . 159 to 1973 .   ( 3 ) Gerike , P . , Fischer , W . K . , A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests II . Additional results and conclusions , Ecotoxicology and Environmental Safety , Vol . 5 , No 1 , 1981 , p . 45 to 55 .  Tillaeg 1  Beregning af det teoretiske biokemiske oxygenforbrug  Det teoretiske biokemiske oxygenforbrug ( ThOD ) af stoffet C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s med molekylvaegten MW beregnes efter foelgende formel : JFR . EFT  Denne beregning forudsaetter , at C oxideres til CO2 , H til H2O , P til P2O5 og Na til Na2O . Halogen elimineres som hydrogenhalogenid og nitrogen som ammoniak .  Eksempel : Glukose C6H12O6 , MW = 180 : JFR . EFT  Molekylvaegten af salte ( bortset fra salte af alkalimetaller ) beregnes under den forudsaetning , at saltene er hydrolyseret .  Svovl antages at blive oxideret til oxidationstrin + 6 .  Eksempel : Natrium-n-alkylbenzolsulfonat C18H29SO3Na , MW = 348 : JFR . EFT  I tilfaelde af nitrogenholdige stoffer , kan nitrogen elimineres som ammoniak , nitrit eller nitrat , hvortil svarer forskellige teoretiske biokemiske oxygenforbrug : JFR . EFT  Eksempel :  Antag fuld omdannelse til nitrat ved analyse af en sekundaer amin : ( C12H25)2 NH , MW : 353 : JFR . EFT  Tillaeg 2  Skema over flaskearrangementet i langtids BOD-proeve  ( Closed bottle-test ) : JFR . EFT  Tillaeg 3  Bionedbrydning : closed bottle-test ( Langtids BOD-bestemmelse ) : JFR . EFT  FORTSAETTELSE : JFR . EFT  Tillaeg 4  TABELLER : JFR . EFT  C . 7 . NEDBRYDNING  BIOLOGISK NEDBRYDNING : MODIFICEREDE MITI-TEST  1 . METODE  1.1 . Indledning  Formaalet med denne test er at maale bionedbrydeligheden af organiske stoffer i et vandigt miljoe med respirometer , der udtrykker det biokemiske oxygenforbrug .  Den empiriske formel for teststoffet er noedvendig for at kunne beregne det teoretiske oxygenforbrug  ( ThOD , theoretical oxygen demand ) , idet det kemiske oxygenforbrug ( COD , chemical oxygen demand ) ellers maa benyttes .  Metoden er kun anvendelig for de organiske teststoffer , der ved den anvendte testkoncentration   - har et forsvindende damptryk ,   - ikke er haemmende over for bakterier , og   - ikke kommer i kontakt med eller reagerer med CO2-absorptionsmidlet .  Hvis teststoffet ikke er oploeseligt ved testkoncentrationen , kan der anvendes specielle teknikker , saasom dispersion ved hjaelp af ultralyd , for at opnaa en god dispersion af teststoffet . Oplysninger om teststoffets toksicitet over for mikroorganismer kan vaere nyttige for fortolkningen af lave resultater og ved valget af passende testkoncentrationer . Oplysninger om de relative maengder af teststoffets hovedkomponenter vil vaere nyttige for fortolkningen af de opnaaede resultater .  1.2 . Definitioner og enheder : JFR . EFT  1.3 . Referencestoffer  Det er oenskeligt at anvende kontrolstoffer for at bedoemme aktiviteten af inoculum . Anilin , natriumacetat eller natriumbenzoat kan bruges hertil . Hvis den procentvise nedbrydning af anilin , beregnet ud fra oxygenforbruget , ikke overstiger 40 % efter syv dage eller 65 % efter 14 dage skal testen betragtes som ugyldig . Hvis der faas en lav genfindelse i blindproeven , Sb , betragtes testen ogsaa som ugyldig .  1.4 . Metodens princip  Testkemikalierne er de eneste kilder til organisk kulstof , og der er ingen forudgaaende adaptation af microorganismerne til testkemikalierne .  Der anvendes et automatiseret , lukket system til maaling af oxygenforbruget ( BOD-meter ) . Stofferne , der skal afproeves , inokuleres med mikroorganismer i testkolber . I testperiodens forloeb maales det biokemiske oxygenforbrug kontinuerligt med BOD-meteret . Bionedbrydeligheden beregnes paa grundlag af BOD , og der foretages supplerende kemiske analyser saasom koncentrationen af oploest organisk kulstof , koncentrationen af restkemikalie , osv .  1.5 . Kvalitetskrav  1.5.1 . Reproducerbarhed :  I almindelighed god , isaer for kemikalier , der er mere oploeselige i vand end svarende til 0,1 g/l .  1.5.2 . Sensitivitet :   ( A ) Oxygenforbruget : Detektionsgraense = 1 mg  ( oxygenforbruget af mikroorganismer ) ( B ) Kemiske analyser : Afhaenger af sensitiviteten af de analytiske metoder .  1.5.3 . Specificitet :  Kan anvendes til alle typer kemikalier , for hvilke det gaelder , at forholdet ( C v ) i vand til ( C l ) i luft er stoerre end eller lig med 1 ; Ved proevning af flygtige kemikalier , skal der bruges et " modificeret BOD-meter " , som bestaar af et normalt BOD-meter med kapillarroer . ( Se tillaeg 1 ) .  1.6 . Beskrivelse af testmetoden  1.6.1 . Reagenser  1.6.1.1 . Det destillerede vand maa ikke indeholde mere kulstof end svarende til 10 % af det kulstof , som tilfoeres med teststoffet .  1.6.1.2 . Naeringsoploesning  Til hver 3 ml af oploesning A , oploesning B , oploesning C og oploesning D tilsaettes vand til 1 000 ml .  ( Deioniseret vand bruges overalt . )  A : K2HPO4 kaliumhydrogenphosphat * 21,75 g *  KH2PO4 kaliumdihydrogenphosphat * 8,50 g *  Na2HPO4 * 12H2O natriumhydrogenphosphat dodecahydrat * 44,60 g *  NH4Cl ammoniumchlorid * 1,70 g *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml . * *  pH skal vaere 7,2 . * B : MgSO4 * 7H2O magnesiumsulfat heptahydrat * 22,50 g *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml . * *  C : CaCl2 calciumchlorid * 27,50 g *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml . * *  D : FeCl3 * 6H2O jern(III)chlorid hexahydrat * 0,25 g *  oploeses i vand ( 1.6.1.1 ) til 1 000 ml . * *  1.6.2 . Apparatur  BOD-meter udstyret med 6 flasker ( hver paa 300 ml )  Flaske 1 og 2 :  deioniseret vand , 300 ml + teststof , 30 mg .  Flaske 3 og 4 :  naeringsoploesning ( 1.6.1.2 ) , 300 ml + aktiveret slam , 9 mg ( toerstof ) + teststof , 30 mg .  Flaske 5 :  naeringsoploesning ( 1.6.1.2 ) , 300 ml + aktiveret slam , 9 mg ( toerstof ) + anilin eller et andet referencestof , 30 mg  Flaske 6 :  naeringsoploesning ( 1.6.1.2 ) , 300 ml + aktiveret slam , 9 mg ( toerstof ) .  1.6.3 . Forberedelse af inoculum  1.6.3.1 . Aktiveret slam  Indsamlingssteder : Slamindsamling foretages i princippet paa mindst ti lokaliteter over hele landet , hovedsagelig i omraader , hvor mange kemiske stoffer kan antages at blive brugt og bortkastet .  I Japan er f . eks . Det japanske Biotest-Center's aktiverede standardslam fremstillet ved blanding af slam udtaget paa foelgende lokaliteter .   - By-rensningsanlaeg : tre anlaeg beliggende i hhv . den nordlige , den centrale og den sydlige del af Japan .   - Industri-rensningsanlaeg : et anlaeg , som renser spildevand fra kemisk industri .   - Flod : tre floder i hhv . den nordlige , den centrale og den sydlige del af Japan .   - Soe : en soe i midt-Japan .   - Hav : to japanske indhave .  Hyppighed af proeveindsamling : Slamindsamling skal i princippet foretages fire gange om aaret , i marts , juni , september og december .  Slamindsamlingsmetoder   - Byspildevand : 1 liter af sekundaert slam i et rensningsanlaeg .   - Floder , soeer , marskomraader eller have : 1 liter overfladevand og 1 liter overfladejord paa kysten med kontakt til atmosfaeren .  Forberedelse : Slamproeverne , der er indsamlet fra proevestederne , blandes ved omroering i en beholder og man lader blandingen staa . Flotterende fremmedlegemer fjernes , og supernatanten filtreres gennem filtrerpapier nr . 2 . Filtratet justeres til pH 7,0 mere aller mindre 1,0 med natriumhydroxid eller phosphorsyre , overfoeres til en kulturtank og udluftes .  Kultur : Naar oploesningen er udluftet i 30 min . fjernes ca . 1/3 af hele supernatantens rumfang . Et tilsvarende volumen af 0,1 % syntetisk spildevand 0,1 % syntetisk spildevand : 1 g glucose , 1 g pepton og 1 g monokaliumphosphat oploeses i 1 liter vand og justeres til pH 7,0 mere aller mindre 1,0 med NaOH . Saettes til den tilbageblevne portion supernatant , og blandingen udluftes igen . Denne procedure gentages een gang hver dag . Kulturen holdes ved 25 mere aller mindre 2 * C .  Kontrol :  Som kontrol af opdyrkningstrinet udfoeres foelgende kontroller , og de noedvendige justeringer foretages :   - Supernatantens udseende : Supernatanten af det aktiverede slam skal vaere klar .   - Bundfaeldning af aktiveret slam : Det aktiverede slam i store flager maa let kunne bundfaeldes .   - udviklingstilstanden af aktivt slam : Saafremt vaekst af flager ikke observeres , kan det syntetiske spildevand tilsaettes , enten i stoerre maengde eller med stoere hyppighed .   - supernatantens pH er 7,0 mere aller mindre 1,0   - temperatur : Temperaturen skal vaere 25 mere aller mindre 2 * C ved kultiveringen af det aktiverede slam .   - Udluftning : Ved erstatning af supernatanten med det syntetiske spildevand maa opslemningen i kulturtanken udluftes tilstraekkeligt til at holde koncentrationen af oploest oxygen i vaesken over 5 mg/l .   - Det aktiverede slams mikroflora : Naar det aktiverede slam iagttages under mikroskop ( ved 100 til 400 ganges forstoerrelse ) , skal et antal protozoer af forskellige arter kunne ses sammen med fnuggede flager .   - Blanding af frisk og gammelt aktiveret slam : For at holde samme aktivitet i frisk og gammelt aktiveret slam blandes den filtrerede supernatant af et aktiveret slam , som er i brug i testen , med et tilsvarende volumen filtreret supernatant af et nylig indsamlet aktiveret slam , og blandingen dyrkes .   - Kontrol af aktiviteten af det aktiverede slam : Det aktiverede slams aktivitet kontrolleres jaevnligt , mindst een gang hver tredje maaned , med standardstoffer efter forskriften givet nedenfor . Specielt i tilfaelde , hvor frisk og gammelt slam blandes , skal omhyggelig kontrol udfoeres i sammenligning med det gamle aktiverede slam .  Eksempel paa tilberedelse af aktiveret slam med efterfoelgende brugsperiode :  december : opdyrkning  januar : brugsperiode  februar : brugsperiode  marts : blanding , opdyrkning  april : brugsperiode  maj : brugsperiode  juni : blanding opdyrkning  juli : brugsperiode  august : brugsperiode  september : blanding , opdyrkning  oktober : brugsperiode  november : brugsperiode   ( Dette forloeb for tilberedelse og brug fortsaettes ) .  1.6.4 . Forbehandling af teststoffet  Hvis teststoffet ikke er oploeseligt i vand op til testkoncentrationen , skal det pulveriseres saa fint som muligt .  1.6.5 . Tilsaetning af teststoffet og forberedelse til testen  Foelgende testkolber ( jfr . 1.6.2 ) skal bruges og justeres til testtemperaturen .  1 . To testkolber indeholdende vand , hvortil der er sat 100 mg teststof pr . liter ( flaske en og to ) .  2 . To testkolber indeholdende naeringsoploesning , hvortil der er tilsat 100 mg teststof pr . liter . Om noedvendigt justeres pH af denne oploesning til syv foer inokulation med aktiveret slam ( flaske tre og fire ) .  3 . En testkolbe indeholdende naeringsoploesning , hvortil der er sat 100 mg anilin eller andet referencestof pr . liter ( flaske fem ) .  4 . En testkolbe til blindproeven kun indeholdende naeringsoploesning ( flaske seks ) .  1.6.5.1 . Inokulation med aktiveret slam  Inoculum saettes til test-kolberne tre , fire , fem og seks , saaledes at det suspenderede toerstof , ( som defineret f . eks . i Japanese Industrial Standards , jfr . ( 3 ) ) , findes i en koncentration paa 30 mg/l .  1.6.5.2 . Testbetingelser   - Koncentration af teststoffer : 100 mg/l .   - Koncentration af aktiveret slam : 30 mg/l .   - Testtemperatur : 20 til 25 * C .   - Forsoegets loebetid : 28 dage .   - Udfoeres i moerke . Hver dag kontrolleres temperaturen og aendringer i kulturens farve .   - Kraftig omroering med mekanisk omroerer .  1.6.6 . Udfoerelse af testen  BOD-kurven optegnes loebende og automatisk gennem 28 dage ( jf . figur ) .  Efter de 28 dages testperiode bestemmes pH samt rest - og omdannelsesprodukterne i testkolberne .  Figur  Tabel : JFR . EFT  1.6.7 . Analyseapparatur  Hvis teststoffet er vandoploeseligt , bestemmes ogsaa den totale resterende maengde organisk kulstof ved proevens slutning .  a ) Saafremt der bruges et analyseapparat for totalt organisk kulstof :  10 ml af testoploesningen udtages fra testkolben og centrifugeres ved 3 000 g og i fem minutter . Den resterende maengde af totalt organisk kulstof i supernatanten bestemmes paa et analyseapparat for totalt organisk kulstof .  b ) Saafremt andre analyser  Hele testkolbens indhold ekstraheres med et oploesningsmiddel passende for teststoffet , og efter passende forbehandling , som f.eks . koncentrering , bestemmes den resterende maengde teststof paa analyseapparat ( gaskromatografi , massespektrometer , spektrofometer osv . ) .  For flygtige kemikalier skal BOD-meterets termostatbad afkoeles til 10 * C og holdes ved denne temperatur i mindst 30 minutter for at forhindre fordampning . Derefter kan de analytiske procedurer , som naevnt under a ) og b ) indledes .  2 . DATA OG BEDOEMMELSE  2.1 . Behandling af resultater  Metoden for beregning af den procentvise nedbrydning ud fra oxygenforbruget og ud fra resultatet af den direkte analyse er defineret i 1.2 .  2.2 . Bedoemmelse af resultater  Beregning af teoretisk oxygenforbrug udfoeres enten som vist i tillaeg 2 eller ved anvendelse af den originale MITI-forskrift :  Grundstof * Oxideret form *  C * CO2 *  H * H2O *  N * NO2 *  S * SO2 *  X ( halogen ) * X , *  3 . RAPPORT  3.1 . Testrapport  Testrapporten skal i videst muligt omfang indeholde foelgende punkter :   - Oplysninger om teststofferne : navn , strukturformel , molekylvaegt , renhed , art af forureninger , fysisk-kemiske egenskaber , identifikationsdata .   - Testbetingelser .   - Aktiveret slam : indsamlingslokalitet og koncentration .   - Teststof : koncentration .   - Testperiode .   - Testtemperatur   - Analytisk procedure :   - Forbehandling ,   - instrumentelle analysebetingelser .   - Genfindelse ved analyseprocedure ,   - Identifikation af omdannelsesprodukter .   - Resultater :   - Bionedbrydningskurver ( kontrol af inoculum aktivitet saavel som kurve for teststof ) .   - BOD ( mg )   - B ( mg )   - Sa ( mg )   - Sb ( mg )   - ThOd ( mg )   - Procentvis nedbrydning fundet ved BOD .   - Procentvis nedbrydning fundet ved kemisk analyse .   - Kromatogrammer eller spektre af teststoffer , som er anskaffet og brugt med henblik paa analyse .   - Bevis for gyldighed ( se 1.3 )  3.2 . Fortolkning af resultater  Man maa tage den mulighed i betragtning , at nitrogenholdige stoffer kan paavirke resultatet .  Hvis genfindingsforholdet , Sb , findes at vaere af stoerrelsesordenen 10 % eller mindre , kan dette betyde analytiske problemer eller f . eks . hydrolyse . I dette tilfaelde skal man vaere meget varsom med fortolkningen .  Paa grund af denne tests stramme forsoegsbetingelser , betyder et lavt resultat ikke noedvendigvis , at teststoffet ikke er bionedbrydeligt under miljoebetingelser , men indicerer , at mere arbejde vil vaere paakraevet for at afgoere dette .  Testkemikalier , der udviser et hoejt oxygenforbrug i denne test , anses for let bionedbrydelige , forudsat at dette niveau et naaet inden for ti dage , regnet fra den dag , hvor det observerede niveau af bionedbrydningen foerst overskrider 10 % .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test Guideline 301C . Decision of the Council C(81 ) 30 . Final .   ( 2 ) Biodegradability and bioaccumulation test of chemical substances ( C-5/98/JAP ) , 1978 .   ( 3 ) The chemical substances control law in Japan  ( Chemical Products Safety Division , Basic Industries Bureau , MITI ) ( C-2/78/JAP ) , 1978 .   ( 4 ) The biodegradability and bioaccumulation of new and existing chemical substances , 5,8  ( C-3/78/JAP ) , 1978 .  Tillaeg 1  Principskitse af apparaturet til maaling af oxygenforbrug i lukket maalesystem : JFR . EFT  Tillaeg 2  Beregning af det teoretiske biokemiske oxygenforbrug  Det teoretiske biokemiske oxygenforbrug ( ThOD ) af stoffet C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s med molekylvaegten MW beregnes efter foelgende formel : JFR . EFT  Denne beregning forudsaetter , at C oxideres til CO2 , H til H2O , P til P2O5 og Na til Na2O . Halogen elimineres som hydrogenhalogenid og nitrogen som ammoniak .  Eksempel : Glucose C6H12O6 , MW = 180 : JFR . EFT  Molekylvaegten af salte ( bortset fra salte af alkalimetaller ) beregnes under den forudsaetning , at saltene er hydrolyseret .  Svovl antages at blive oxideret til oxidationstrin + 6 .  Eksempel : Natrium-n-alkylbenzolsulfonat , C18H29SO3 Na , MW = 348 : JFR . EFT  I tilfaede af nitrogenholdige stoffer , kan nitrogen elimineres som ammoniak , nitrit eller nitrat , hvortil svarer forskellige teoretiske biokemiske oxygenforburg : JFR . EFT  Eksempel : Antag fuld omdannelse til nitrat ved analyse af en sekundaer amin : ( C12H25)2NH , MW = 353 : JFR . EFT  Tillaeg 3  Biotic degradation : Modifed MITI test : JFR . EFT  Tillaeg 4  Tabeller : JFR . EFT  C . 8 . NEDBRYDNING  BIOKEMISK OXYGEN-BEHOV  1 . METODE  1.1 . Indledning  Formaalet med metoden er maaling af det biologiske oxygenbehov ( BOD ) for faste eller flydende organiske stoffer . Data , som opnaas med denne proeve vedroerer vandoploeselige forbindelser ; dog kan flygtige forbindelser , samt forbindelser med lav vandoploeselighed ogsaa afproeves , i det mindste i princippet .  Denne metode kan kun anvendes paa organiske proevematerialer , der ikke virker haemmende for bakterier ved den koncentration , som anvendes ved proevningen . Hvis proevematerialet ikke lader sig oploese ved proevekoncentrationen , kan det vaere noedvendigt at anvende saerlige foranstaltninger , saasom ultralyddispersion for at opnaa god fordeling af proevematerialet .  Oplysninger om kemikaliets toksicitet kan vaere nyttige for fortolkningen af lave resultater og i valget af passende proevekoncentrationer .  1.2 . Definitioner og enheder  BOD defineres som den maengde oploest oxygen , der kraeves til den biokemiske oxydationsproces for en naermere angivet maengde oploesning af stoffet og under foreskrevne betingelser .  Resultatet udtrykkes som : g BOD pr . g undersoegt stof .  1.3 . Referencestoffer  Referencestoffer til kalibrering kan endnu ikke anbefales . Brugen af et egnet kontrolkemikalium til kontrol af inoculums aktivitet er oenskelig .  1.4 . Proevemetodens princip  En forud bestemt maengde stof , oploest eller dispergeret i et egnet og godt gennemluftet medium podes med mikroorganismer og inkuberes ved en konstant , defineret omgivelsestemperatur i moerke .  BOD bestemmes ved forskellen mellem indholdet af oploest oxygen ved forsoegets begyndelse og ved forsoegets afslutning . Forsoegets varighed skal vaere mindst fem dage og ikke over 28 dage .  Et blindforsoeg maa udfoeres ved parallel proevning , men uden indehold af proevestof .  1.5 . Kvalitetskriterier  Denne BOD-bestemmelse kan ikke betragtes som en gyldig bestemmelse af et stofs bionedbrydelighed , men kun som en screeningtest .  1.6 . Beskrivelse af proevemetoden  Der tilberedes en oploesning eller dispersions af stoffet for at opnaa en BOD-koncentration , som er forenelig med den anvendte metode . BOD bestemmes derpaa efter en hvilken som helst egnet national standardmetode . En international metode , vil dog blive foretrukket , naar en saadan har opnaaet enighed .  2 . Dataevaluering  BOD-indholdet i oploesningen beregnes efter den valgte normalmetode og udtrykkes som g BOD pr . g proevestof .  3 . RAPPORTERING  Den anvendte metode skal anfoeres . Det biokemiske oxygen-behov , BOD boer vaere middeltallet af mindst tre gyldige maalinger .  Alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for fortolkningen skal rapporteres , navnlig med hensyn til stoffets egen sammensaetning , urenheder , fysisk tilstand og toksiske virkninger som vil kunne paavirke resultaterne .  Eventuel brug af tilsaetningsstof til at hindre biologisk nitrifikation skal rapporteres .  4 . REFERENCER  List of standardized methods , for example :  NF T 90 - 103 : Determination of the Biochemical Oxygen Demand .  NBN 407 : Biochemical Oxygen Demand .  NEN 3235 5.4 : Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik ( BZV )  The Determination of Biochemical Oxygen Demand ,  ( Methods for the examination of Water and Associated Materials , HMSO , London ) .  C . 9 . NEDBRYDNING  KEMISK OXYGEN-FORBRUG  1 . METODE  1.1 . Indledning  Formaalet med denne metode er at maale det kemiske oxygenforbrug ( COD ) for et organisk stof i fast eller flydende form paa en naermere fastsat , standardiseret maade under givne laboratoriebetingelser .  Oplysninger om stoffets formel vil vaere nyttig for udfoerelsen af undersoegelsen og for fortolkningen af de opnaaede resultater ( f . eks . halogensalte , jern  ( ferro - ) salte af organiske forbindelser , organiske chlorforbindelser ) .  1.2 . Definitioner og enheder  Det kemiske oxygenforbrug er et maal for et stofs evne til at kunne oxideres og det udtrykkes som den aekvivalente maengde oxygen i det oxiderende reagens , der forbruges af stoffet under givne laboratoriebetingelser .  Resultatet udtrykkes som : g COD/g undersoegt stof .  1.3 . Referencestoffer  Referencestoffer behoever ikke anvendes i alle tilfaelde , naar et nyt stof undersoeges . De skal fortrinsvis tjene til kalibrering af metoden fra tid til anden og derved give mulighed for at sammenligne med resultater opnaaet ved andre metoder .  1.4 . Metodeprincip  En afmaalt maengde af stoffet , oploest eller dispergeret i vand , oxideres af kaliumdichromat i staerkt svovlsur oploesning med soelvnitrat som katalysator under tilbagesvaling i to timer . Den uforbrugte maengde dichromat bestemmes ved titrering med en standardoploesning af ferroammoniumsulfat . I tilfaelde af chlorholdige stoffer tilsaettes mercurisulfat for at nedsaette chloridinterferens .  1.5 . Kvalitetskriterier  Metoden har karakter af vilkaarligt fastlagt standardmetode , og COD maa mere betragtes som en  " oxyderbarhed indikator " end som maal for maengden af organisk stof .  Chlorid kan forstyrre maalingen ; uorganiske reducerende eller oxiderende stoffer kan ogsaa forstyrre COD-bestemmelse .  Visse cykliske forbindelser oxideres ikke fuldstaendigt ved denne metode .  1.6 . Metodebeskrivelse  En foreloebig oploesning eller opslemning af stoffet fremstilles , saaledes at der opnaas en COD-vaerdi mellem 250 og 600 mg pr . liter .  Bemaerkning :  I tilfaelde af vanskeligt oploeselige og ikke opslemmelige stoffer kan der afvejes fint pulveriseret eller vaeskeformigt stof svarende til ca . fem mg COD og dette overfoeres da til forsoegsopstillingen med vand .  COD bestemmes derefter ved hjaelp af en egnet national standardmetode indtil offenliggoerelsen af en international standardmetode , der da vil blive foretrukket .  2 . DATA  COD-indholdet i forsoegskolben beregnes i henhold til den valgte standardmetode og omregnes til g COD pr . g undersoegt stof .  3 . RAPPORTERING  Den anvendte referencemtode skal anfoeres .  Det kemiske oxygenforbrug boer vaere et gennemsnit af mindst tre maalinger . Alle oplysninger og bemaerkninger , der er af betydning for fortolkningen af resultaterne , skal rapporteres , isaer hvad angaar urenheder , fysisk tilstand og naturlige egenskaber ved stoffet ( hvis saadanne kendes ) , der maatte kunne paavirke resultaterne .  Anvendelsen af mercurisulfat for at mindske chloridforstyrrelsen maa rapporteres .  4 . REFERENCER  Liste over standaridserede metoder , for eksempel :  NBN T 91 - 201 : Determination of the Chemical Oxygen Demand .  ISBN 0 11 7512494 : Chemical Oxygen Demand  ( dichromate value ) of polluted and waste waters .  NF T 90 - 101 : Determination of the Chemical Oxygen Demand .  DS 217 = Water Analysis : Determination of the Chemical Oxygen Demand .  DIN 38409 - H - 41 : Determination of the Chemical Oxygen Demand ( COD ) within the range above 15 mg/l .  NEN 3235 5.3 : Bepalinge van het chemisch zuurstofverbruik .  ISO DP 6060 : Water Quality : Chemical Oxygen Demand Dichromate Methods .  C . 10 . NEDBRYDNING  ABIOTISK NEDBRYDNING : HYDROLYSE SOM FUNKTION AF pH  1 . METODE  Denne metode er baseret paa " OECD Test Guideline "  ( 1 ) .  1.1 . Indledning  Hydrolyse er en vigtig reaktion , der styrer den abiotiske nedbrydning . Denne reaktion er saerlig relevant for stoffer med lav bionedbrydelighed , og den kan have indflydelse paa et stofs persistens i miljoeet .  De fleste hydrolysereaktioner er af pseudo-foerste orden , og derfor er halveringstiden uafhaengig af koncentrationen . Dette betyder , at resultater , der er bestemt ved laboratoriekoncentrationer , normalt kan ekstrapoleres til forholdene i miljoeet .  Endvidere foreligger der adskillige eksempler ( 2 ) paa tilfredsstillende overensstemmelse mellem resultater bestemt i rent og i naturligt forekommende vand , og dette er tilfaeldet for flere typer kemiske stoffer . Det er nyttigt paa forhaand at have oplysninger om stoffets damptryk ved udfoerelse af metoden .  Denne metode kan kun anvendes paa vandoploeselige stoffer . Urenheder vil almindeligvis paavirke resultaterne .  Kemiske stoffers hydrolyseegenskaber skal undersoeges ved pH-vaerdier , som normalt findes i miljoeet ( pH 4 - 9 ) .  1.2 . Definitioner og enheder  Hydrolyse er reaktionen af et stof RX med vand og kan udtrykkes ved nettoudskiftningen af gruppen X med OH  RX + HOH * ROH + HX ( 1 )  Den hastighed , hvormed koncentrationen af RX aftager , er givet ved  hastighed = k * ( H2O ) * ( RX ) ( 2 )  Da vand er til stede i stort overskud i forhold til stoffet , beskrives denne type reaktion almindeligvis som en pseudo-foerste ordens reaktion , hvor den iagttagne hastighedskonstant er givet ved ligningen  k obs = k * ( H2O ) ( 3 )  Denne konstant kan ved et givet pH og en given temperatur T bestemmes ud fra udtrykket : JFR . EFT  Koncentrationerne er udtrykt i g/l eller mol/l .  Konstanten k obs har dimensionen ( tid)-1 .  Halveringstiden t 1/2 er defineret som den tid , det tager koncentrationen af stoffet at falde 50 % , dvs .  c t = 1/2 * C0 ( 5 )  Ved hjaelp af ligning ( 4 ) og ( 5 ) kan det vises , at  t1/2 = 0,693/k obs ( 6 )  1.3 . Referencestoffer  Referencestoffer behoever ikke at anvendes i alle tilfaelde ved undersoegelse af et nyt stof . De boer primaert tjene til at kontrollere metoden med jaevne mellemrum samt give mulighed for sammenligning med resultater , der opnaas ved anvendelse af en anden metode . Acetylsalicylsyre ( aspirin ) og  0,0-diethyl-0-(6-methyl-2-(1-methylethyl)-4 -pyrimidinylphosphorthioat ( dimpylate , diazinon )  har vaeret anvendt som referencestoffer ( 1 ) .  1.4 . Proevemetodens princip  Stoffet oploeses i vand i lav koncentration ved kendt pH og temperatur .  Faldet i stoffets koncentration som funktion af tiden foelges ved hjaelp af en egnet analysemetode .  Koncentrationernes logaritmer afbildes mod tiden , og hvis der fremkommer en ret linje , faas den foerste ordens hastighedskonstant af dens haeldning ( jf . punkt ( 2 ) ) .  Naar det ikke er praktisk muligt direkte at bestemme en hastighedskonstant for en bestemt temperatur , kan man saedvanligvis skoenne en vaerdi for konstanten ved brug af Arrhenius-ligningen , som udtrykker hastighedskonstantens afhaengighed af temperaturen . Ud fra en lineaer afbildning af logaritmen til hastighedskonstanten , bestemt ved passende temperaturer , mod den reciprokke absolutte temperatur ( K ) kan der ekstrapoleres til den hastighedskonstant , der ikke kunne bestemmes direkte .  1.5 . Kvalitetskriterier  I reference ( 2 ) er det anfoert , at hastighedskonstanter for hydrolyse af 13 grupper organiske stoffer kan bestemmes med stor noejagtighed .  Gentageligheden afhaenger isaer af pH og af koncentrationen af oploest oxygen og kan paavirkes af , at der er mikroorganismer til stede .1.6 . Beskrivelse af proevemetoden  1.6.1 . Reagenser  1.6.1.1 . Bufferoploesninger  Proeven udfoeres ved tre pH-vaerdier , nemlig 4,0 , 7,0 og 9,0 . Til dette formaal boer bufferoploesninger fremstilles under brug af analyserene kemikalier og sterilt destilleret eller deioniseret vand . I bilag I er vist nogle eksempler paa buffersystemer .  Hydrolysehastigheden kan afhaenge af det anvendte buffersystem . Hvis der er tegn herpaa , boer der anvendes et andet buffersystem . I reference ( 2 ) anbefales borat - eller acetatbuffere frem for phosphatbuffere .  Hvis bufferoploesningens pH ikke er kendt ved den temperatur , der benyttes ved proevningen , skal pH bestemmes med et kalibreret pH-meter ved den valgte temperatur med en noejagtighed paa 0,1 pH-enheder .  1.6.1.2 . Proeveoploesninger  Stoffet boer oploeses i den valgte buffer i en koncentration , der ikke overstiger 0,01 M eller den halve maetningskoncentration , idet den laveste vaerdi laegges til grund .  Brug af organiske oploesningsmidler , der er blandbare med vand , anbefales kun til stoffer med lav vandoploeselighed . Oploesningsmidlets maengde boer hoejst vaere 1 % , og det maa ikke indvirke paa hydrolyseprocessen .  1.6.2 . Apparatur  Der bruges glaskolber med prop , men der maa ikke anvendes fedt paa slibene .  Hvis stoffet eller buffersystemet er flygtigt , eller hvis proeven udfoeres ved forhoejet temperatur , foretraekkes forseglede eller membranlukkede glas , og luftmellemrum mellem vaeskeoverflade og lukke boer undgaas .  1.6.3 . Analysemetode  Analysemetoden afhaenger af stoffets art og skal vaere tilstraekkelig noejagtig og foelsom til , at et fald paa 10 % i forhold til startkoncentrationen kan paavises .  Metoden skal vaere specifik , saaledes at stoffet kan bestemmes ved proevekoncentrationerne , og der kan udmaerket benyttes en kombination af egnede analyseteknikker .  1.6.4 . Proevningsbetingelser  Proevningen udfoeres i et termostatstyret aflukke eller i et bad , hvis temperatur ligger inden for mere aller mindre 0,5 * C af den valgte temperatur . Temperaturen kontrolleres inden for mere aller mindre 0,1 * C . Der traeffes foranstaltninger til at undgaa paavirkning ved fotolyse .  Der traeffes egnede foranstaltninger til at undgaa oploest oxygen ( f . eks . ved gennembobling med nitrogen eller argon i fem minutter foer fremstilling af oploesningen ) .  1.6.5 . Fremgangsmaade  1.6.5.1 . Forhaandsproevning  Der udfoeres for alle stoffer en forhaandsproevning ved 50 * C mere aller mindre 0,5 * C ved tre pH-vaerdier , 4,0 , 7,0 og 9,0 . Der foretages tilstraekkelig mange maalinger til ved hver pH-vaerdi og ved 50 * C at bestemme , om halveringstiden ( t1/2 ) er mindre end 2,4 timer , eller om mindre end 10 % er hydrolyseret efter fem dage . ( Det skoennes , at disse vaerdier svarer omtrent til halveringstider paa henholdsvis mindre end én dag og mere end ét aar under forhold , der er mere repraesentative for miljoeet ( 25 * C ) . )  Hvis forhaandsproevningen viser , at 50 % eller mere af stoffet er hydrolyseret paa 2,4 timer ved 50 * C , eller at mindre end 10 % er hydrolyseret efter fem dage , ved hver af de tre pH-vaerdier ( 4 , 7 og 9 ) , er yderligere afproevning ikke noedvendig .  I andre tilfaelde , og ved enkelte pH-vaerdier , hvor betingelserne ikke har vaeret opfyldt , udfoeres proeve nr . 1 .  1.6.5.2 . Proeve nr . 1  Proeve nr . 1 udfoeres ved én temperatur , fortrinsvis 50 mere aller mindre 0,5 * C og om muligt under sterile forhold , ved de pH-vaerdier , hvor forhaandsproevningen har vist , at yderligere proevning er paakraevet Der vaelges et tilstraekkeligt antal proever ( ikke mindre end fire ) til at daekke intervallet 20 til 70 % hydrolyse , saaledes at det ved de specificerede pH-vaerdier kan kontrolleres , at reaktionen er af pseudo-foerste orden .  Reaktionens orden bestemmes ved hver af de pH-vaerdier , ved hvilke proeve nr . 1 udfoeres .  Skoen over hastighedskonstanten ved 25 * C  Hvorledes der skal gaas frem eksperimentelt , afhaenger af , om man ud fra proeve nr . 1 kan slutte , at reaktionen er af pseudo-foerste orden eller ikke .  Hvis det ud fra proeve nr . 1 ikke med sikkerhed kan konkluderes , at reaktionen er af foerste orden , maa der udfoeres yderligere forsoeg som beskrevet i proeve nr . 2 .  Hvis det ud fra proeve nr . 1 kan konkluderes med bestemthed , at reaktionen er af pseudo-foerste orden , udfoeres de foelgende forsoeg som beskrevet i proeve nr . 3 . ( Alternativt kan man under saerlige omstaendigheder muligvis beregne hastighedskonstanterne ved 25 * C ud fra konstanter ved 50 * C , som er fremkommet paa grundlag af resultater fra proeve nr . 1 , jf . punkt 3.2 ) .  1.6.5.3 . Proeve nr . 2  Denne proeve udfoeres ved alle de pH-vaerdier , hvor det ifoelge resultaterne af proeve nr . 1 er paakraevet ,   - enten ved én temperatur under 40 * C   - eller ved to forskellige temperaturer over 50 * C med mindst 10 * C imellem .  For hver pH-vaerdi og temperatur , hvor proeve nr . 2 udfoeres , bestemmes mindst seks passende fordelte datapunkter , saaledes at hydrolysegraden ligger i intervallet 20 til 70 % .  For én pH-vaerdi og én temperatur udfoeres en dobbeltbestemmelse . Hvis proeve nr . 2 udfoeres ved to temperaturer over 50 * C , er det at foretraekke at udfoere dobbeltbestemmelsen ved den laveste af de to temperaturer .  For hver pH-vaerdi og temperatur , hvor proeve nr . 2 udfoeres , angives om muligt et grafisk skoen over halveringstiden ( t1/2 ) .  1.6.5.4 . Proeve nr . 3  Denne proeve udfoeres ved alle de pH-vaerdier , hvor det ifoelge resultaterne af proeve nr . 1 er paakraevet ,   - enten ved én temperatur under 40 * C   - eller ved to forskellige temperaturer over 50 * C med mindst 10 * C imellem .  For hver pH-vaerdi og temperatur , hvor proeve nr . 3 udfoeres , bestemmes tre datapunkter , det foerste ved tiden 0 og det andet og det tredje , naar hydrolysegraden er stoerre end 30 % ; konstanten k obs og t1/2 beregnes .  2 . DATA  For reaktionen af pseudo-foerste orden fremkommer vaerdierne af k obs for hver pH-vaerdi og temperatur , proeven er udfoert ved , ud fra afbildninger af logaritmen til koncentrationen mod tiden ved hjaelp af udtrykket  k obs = - haeldning gange 2,303 .  Derefter kan t1/2 beregnes ifoelge ligning ( 6 ) .  Hvor det er muligt , skoennes en vaerdi for k25 * ved hjaelp af Arrhenius-ligningen .  Jf . punkt 3.1 for reaktioner , der ikke er af pseudo-foerste orden .  3 . RAPPORT  3.1 . Rapportering  Proevnings-rapporten skal om muligt omfatte foelgende oplysninger :   - specifikation af stoffet ,   - alle resultater , der fremkommet med referencestoffer ,   - princippet og enkelthederne i den anvendte analysemetode ,   - for hvor proevning : temperatur , pH-vaerdi , buffersammensaetning og en tabel over alle koncentration/tid-datapunkter ,   - for pseudo-foerste ordens reaktioner vaerdierne af k obs og t1/2 samt hvorledes de er beregnet ,   - for reaktioner , der ikke x er af pseudo-foerste orden , afbildninger af logaritmen til koncentrationen mod tiden ,   - alle oplysninger og bemaerkninger af betydning for fortolkning af resultaterne .  3.2 . Fortolkning af resultater  Det kan vaere muligt at beregne acceptable vaerdier for proevestoffers hastighedskonstant ( ved 25 * C ) , forudsat at der for stoffets homologe findes eksperimentelt bestemte aktiveringsenergier , og at det med rimelighed kan antages , at proevestoffets aktiveringsenergi er af samme stoerrelsesorden .  4 . REFERENCER   ( 1 ) OECD , Paris , 1981 , Test guideline III - Decision of the Council C(81 ) 30 F .   ( 2 ) OECD , Paris , 1981 , Test guideline III - Decision of the Council C(81 ) 30 F . - reference 2 .  Tillaeg 1  BUFFERBLANDINGER  A . CLARK OG LUBS  De pH-vaerdier , som er angivet i disse tabeller , er beregnet ud fra de potentielle maalinger under brug af Soerensens standardligninger ( 1909 ) . De egentlige pH-vaerdier ligger 0,04 enheder hoejere end de anfoerte vaerdier .  Sammensaetning   * pH *  0,1 M kaliumhydrogenphthalat + 0,1 N HCl ved 20 * C  2,63 ml . 0,1 N HCl + ml . phtalate to 100 ml * 3,8 *  0,1 M kaliumhydrogenphthalat + 0,1 N NaOH ved 20 * C  0,40 ml . 0,1 N NaOH + 50 ml . phtalate to 100 ml * 4,0 *  3,70 ml . 0,1 N NaOH + 50 ml . phtalate to 100 ml * 4,2 *  0,1 M kaliumhydrogenphosphat + 0,1 N NaOH ved 20 * C  23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml * 6,8 *  29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml phosphat til 100 ml * 7,0 *  35,00 ml 0,1 N NaCH + 50 ml phosphat til 100 ml * 7,2 *  0,1 M H3BO3 i 0,1 M KCl + 0,1 N NaOH ved 20 * C  16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml * 8,8 *  21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml * 9,0 *  26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyre til 100 ml * 9,2 *  B . KOLTHOFF OG VLEESCHHOUWER  Sammensaetning   * pH *  0,1 M monokaliumcitrat og 0,1 N NaOH ved 18 * C  ( Tilsaet smaa thymolkrystaller eller nogle faa milligram kviksoelv for at forebygge svampevaekst . )  2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml * 3,8 *  9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml * 4,0 *  16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat til 100 ml * 4,2 *  C . SOERENSEN  0,05 M borax + 0,1 N HCl  Sammensaetning * pH *  ml Borax * ml HCl * Soerensen 18 * C * Walbum *   * * * 10 * C * 40 * C * 70 * C *  8,0 * 2,0 * 8,91 * 8,96 * 8,77 * 8,59 *  8,5 * 1,5 * 9,01 * 9,06 * 8,86 * 8,67 *  9,0 * 1,0 * 9,09 * 9,14 * 8,94 * 8,74 *  9,5 * 0,5 * 9,17 * 9,22 * 9,01 * 8,80 *  10,0 * 0,0 * 9,24 * 9,30 * 9,08 * 8,86 *  0,05 M borax + 0,1 N NaOH  Sammensaetning * pH *  ml Borax * ml HCl * Soerensen 18 * C * Walbum *   * * * 10 * C * 40 * C * 70 * C *  10,0 * 0,0 * 9,24 * 9,30 * 9,08 * 8,86 *  9,0 * 1,0 * 9,36 * 9,42 * 9,18 * 8,94 *  8,0 * 2,0 * 9,50 * 9,57 * 9,30 * 9,02 *  7,0 * 3,0 * 9,68 * 9,76 * 9,44 * 9,12