Avis juridique important

|

31985L0347

Rådets direktiv 85/347/EØF af 8. juli 1985 om ændring af direktiv 68/297/EØF om gennemførelse af ensartede bestemmelser for afgiftsfri indførsel af brændstof, som indeholdes i erhvervsmotorkøretøjers brændstofbeholdere

EF-Tidende nr. L 183 af 16/07/1985 s. 0022 - 0023 den finske specialudgave: kapitel 9 bind 1 s. 0124  den spanske specialudgave: Kapitel 07 bind 4 s. 0003  den svenske specialudgave: kapitel 9 bind 1 s. 0124  den portugisiske specialudgave: Kapitel 07 bind 4 s. 0003

*****  RAADETS  DIREKTIV  af 8. juli 1985  om aendring af direktiv 68/297/EOEF om gennemfoerelse af ensartede bestemmelser for afgiftsfri indfoersel af braendstof, som indeholdes i erhvervsmotorkoeretoejers braendstofbeholdere  (85/347/EOEF)  RAADET FOR DE EUROPAEISKE  FAELLESSKABER HAR -  under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab, saerlig artikel 75 og 99,  under henvisning til forslag fra Kommissionen (1),  under henvisning til udtalelse fra Europa-Parlamentet (2),  under henvisning til udtalelse fra Det oekonomiske og sociale Udvalg (3), og  ud fra foelgende betragtninger:  I direktiv 68/297/EOEF (4), aendret ved direktiv 83/127/EOEF (5), fastsaettes mindstegraensen for den maengde braendstof i erhvervsmotorkoeretoejers braendstofbeholdere, som kan indfoeres afgiftsfrit ved Faellesskabets indre graenser;  med henblik paa at lette passagen af disse graenser boer naevnte maengde i foerste omgang forhoejes for koeretoejer, som er egnet og beregnet til at befordre personer. Raadet boer paa et senere tidspunkt, efter forslag fra Kommissionen, traeffe afgoerelse om forhoejelse af naevnte maengde for koeretoejer, som er egnet og beregnet til at transportere varer;  udtrykket »normal tank« boer naermere defineres -  UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV:  Artikel 1  Direktiv 68/297/EOEF aendres saaledes:  1. Artikel 1 affattes saaledes:  »Artikel 1  Medlemsstaterne foranstalter i overensstemmelse med dette direktiv gennemfoerelse af ensartede bestemmelser for den afgiftsfri indfoersel af braendstof, som indeholdes i de normale tanke i de i en medlemsstat indregistrerede erhvervskoeretoejer, der passerer medlemsstaternes faelles graenser.«  2. Artikel 2 affattes saaledes:  »Artikel 2  I dette direktiv forstaas ved:  - »erhvervskoeretoej«: ethvert motorkoeretoej til landevejstrafik, som med hensyn til konstruktionstype og udstyr er egnet og beregnet til mod eller uden vederlag,  a) at befordre mere end ni personer, foereren iberegnet,  b) at transportere varer,  - »normale tanke«: tanke, der af konstruktoeren er indbygget i alle motorkoeretoejer af samme type som det paagaeldende koeretoej, og hvis permanente anbringelse muliggoer direkte brug af braendstoffet som drivmiddel baade for koeretoejet og eventuelt for koelesystemet.  Gastanke, der er paamonteret motorkoeretoejer, konstrueret med henblik paa direkte brug af gas som braendstof, betragtes ligeledes som normale tanke«.  3. Artikel 3, stk. 1, affattes saaledes:  »1. Medlemsstaterne tillader afgiftsfri indfoersel af foelgende maengder braendstof i erhvervskoeretoejers normale tanke:  a) 200 liter pr. koeretoej pr. rejse, naar det drejer sig om koeretoejer, der er egnede og beregnede til transport af varer mod eller uden vederlag;  b) 600 liter pr. koeretoej pr. rejse, naar det drejer sig om koeretoejer, der er egnede og beregnede til at befordre mere end ni personer, foereren iberegnet, mod eller uden vederlag.  Raadet traeffer inden den 1. juli 1986, efter fremgangsmaaden i traktaten, inden for dette omraade paa forslag fra Kommissionen, afgoerelse om forhoejelse af den maengde braendstof, som de i foerste afsnit, litra a), omhandlede koeretoejer kan indfoere afgiftsfrit i deres normale tanke.«;  4. Artikel 5 udgaar.  Artikel 2  Medlemsstaterne traeffer de noedvendige foranstaltninger for at efterkomme dette direktiv senest den 1. oktober 1985. De underretter straks Kommissionen herom.  Artikel 3  Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.  Udfaerdiget i Bruxelles, den 8. juli 1985.  Paa Raadets vegne  J. SANTER  Formand  (1) EFT nr. C 95 af 6. 4. 1984, s. 4.  (2) EFT nr. C 172 af 2. 7. 1984, s. 15.  (3) EFT nr. C 248 af 17. 9. 1984, s. 13.  (4) EFT nr. L 175 af 23. 7. 1968, s. 15.  (5) EFT nr. L 91 af 9. 4. 1983, s. 28.


Avis juridique important

|

31972L0199

Kommissionens tredje direktiv 72/199/EØF af 27. april 1972 om fastsættelse af fællesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer

EF-Tidende nr. L 123 af 29/05/1972 s. 0006 - 0034 den finske specialudgave: kapitel 3 bind 4 s. 0184  den danske specialudgave: serie III kapitel 1966-1972 s. 0071  den svenske specialudgave: kapitel 3 bind 4 s. 0184  den engelske specialudgave: serie III kapitel 1966-1972 s. 0074  den græske specialudgave: Kapitel 03 bind 8 s. 0007  den spanske specialudgave: Kapitel 03 bind 6 s. 0008  den portugisiske specialudgave: Kapitel 03 bind 6 s. 0008

++++  KOMMISSIONENS TREDJE DIREKTIV  af 27 . april 1972  om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer   ( 72/199/EOEF )  KOMMISSIONEN FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -  under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab ,  under henvisning til Raadets direktiv af 20 . juli 1970 om indfoerelse af faellesskabsregler for proeveudtagning og faelleskabsanalysemetoder til den officielle kontrol af foderstoffer ( 1 ) , saerlig artikel 2 , og  ud fra foelgende betragtninger :  Ovennaevnte direktiv bestemmer , at officielle kontrolforanstaltninger vedroerende foderstoffer med henblik paa at konstatere , om de i henhold til administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser foreskrevne betingelser med hensyn til foderstoffers beskaffenhed og sammensaetning er opfyldt , foretages under anvendelse af faellesskabsregler for proeveudtagning og faellesskabsanalysemetoder ;  ved Kommissionens direktiver nr . 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 ( 2 ) og nr . 71/393/EOEF af 18 . november 1971 ( 3 ) er allerede en raekke analysemetoder fastlagt ; det arbejde , der i mellemtiden er udfoert , er nu saa vidt fremskredet , at en 3 . serie analysemetoder boer fastlaegges ;  de i dette direktiv fastsatte foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den staaende Komité for foderstoffer -  Artikel 1  Medlemsstaterne foreskriver , at analyser i forbindelse med officiel kontrol af foderstoffer med hensyn til disses indhold af stivelse , raaprotein , pepsin - og saltsyreoploeseligt raaprotein og fri og total gossypol samt med hensyn til pepsinaktiviteten udfoeres efter de i bilag I til dette direktiv beskrevne metoder . De almindelige bestemmelser i foerste del ( indledning ) af bilaget til Kommissionens foerste direktiv nr . 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 om fastsaettelse af faellesskabsanalysemetoder til officiel kontrol af foderstoffer finder anvendelse paa de i bilag I til dette direktiv beskrevne metoder .  Artikel 2  Medlemsstaterne foreskriver , at analyser i forbindelse med officiel kontrol af foderstoffer med henblik paa paavisning og identifikation af antibiotika inden for tetracyklingruppen samt med hensyn til foderstoffernes indhold af klortetracyklin , oxytetracyklin , tetracyklin , oleandomycin , tytosin og virginiamycin udfoeres efter de i bilag II til dette direktiv beskrevne metoder .  De almindelige bestemmelser i foerste del ( indledning ) af bilaget til Kommissionens foerste direktiv nr . 71/250/EOEF af 15 . juni 1971 med undtagelse af den del , der vedroerer forberedelse af analyseproeven , finder anvendelse paa de i bilag II til dette direktiv beskrevne metoder .  Artikel 3  Senest 1 . juli 1973 bringer medlemsstaterne de noedvendige administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser i anvendelse for at efterkomme dette direktivs bestemmelser . De underretter straks Kommissionen herom .  Artikel 4  Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne .  Udfaerdiget i Bruxelles , den 27 . april 1972 .  Paa Kommissionens vegne  S . L . MANSHOLT  Formand  ( 1 ) EFT nr . L 170 af 3 . 8 . 1970 , s . 2 .  ( 2 ) EFT nr . L 155 af 12 . 7 . 1971 , s . 13 .  ( 3 ) EFT nr . L 279 af 20 . 12 . 1971 , s . 7 .  BILAG I  1 . BESTEMMELSE AF STIVELSE   - polarimetrisk metode -  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af indholdet af stivelse og nedbrydningsprodukter heraf med hoej molekylvaegt i foderstoffer med undtagelse af saadanne , som indeholder snitter og diffusionssnitter af roer , toerrede roeblade og -toppe , kartoffelpulp , toergaer , inulinholdige produkter ( f . eks . jordskoksnitter og -mel ) eller fedtegrever .  2 . Princip  Metoden er baseret paa en dobbelt bestemmelse . Ved den foerste bestemmelse behandles proeven i varm tilstand med fortyndet saltsyre . Efter klaring og filtrering maales oploesningens optiske drejning polarimetrisk .  Ved den anden bestemmelse ekstraheres proeven med ethanol 40 % . Efter behandling af filtratet med saltsyre klares og filtreres og den optiske drejning maales under samme betingelser som ved den foerste bestemmelse .  Forskellen mellem de to maalinger , multipliceret med en kendt faktor , giver proevens stivelsesindhold .  3 . Reagenser  3.1 Saltsyre 25 % , mf . 1,126 ( w/w ) .  3.2 Saltsyre 1,128 % ( w/v ) .  Koncentrationen skal kontrolles ved titrering med 0,1 N natriumhydroxydoploesning under tilstedevaerelse af metylroedt 0,1 % ( w/v ) i ethanol 94 % ( v/v ) . 10 ml = 30,94 ml 0,1 N NaOH .  3.3 Carrez-oploesning I : 21,9 g zinkacetat Zn ( CH3COO)2 * 2 H2O og 3 g iseddike oploeses i vand , og der fyldes op med vand til 100 ml .  3.4 Carrez-oploesning II : 10,6 g kaliumhexacyanoferrat , K4 ( Pe(ON)6 ) * 3 H2O oploeses i vand , og der fyldes op med vand til 100 ml .  3.5 Ethanol 40 % ( v/v ) , mf . 0,948 ved 20 * C .  4 . Apparatur  4.1 250 ml Erlenmeyerkolbe med tilsleben prop og tilbageloebskoeler .  4.2 Polarimeter eller saccharimeter .  5 . Udfoerelse  5.1 Tilberedning af proeven  Proeven skal formales saa fint , at den passerer en sigte med runde huller fuldstaendigt  ( huldiameter 0,5 mm ) .  5.2 Bestemmelse af den totale optiske drejning  ( P eller S ) ( se bemaerkning 7.1 )  2,5 g af proeven afvejes med 1 mg noejagtighed i en 100 ml maalekolbe , og der tilsaettes 25 ml saltsyre ( 3.2 ) . Kolben rystes , indtil substansen er godt fordelt ; derefter tilsaettes yderligere 25 ml saltsyre ( 3.2 ) . Til slut anbringes kolben i et kogende vandbad . I de foerste 3 minutter rystes kolben kraftigt og med regelmaessige mellemrum for at forhindre klumpdannelse . Vandmaengden i vandbadet skal vaere tilstraekkelig til fortsat at holde vandet i kog , naar kolben saenkes ned . Under omrystningen maa kolben ikke tages op af vandet . Efter noejagtig 15 minutter tages kolben op af vandbadet , hvorefter der tilsaettes 30 ml koldt vand og straks afkoeles til 20 * C .  Der tilsaettes 5 ml Carrez-oploesning I  ( 3.3 ) og rystes 1 minut ; umiddelbart derefter tilsaettes 5 ml Carrez-oploesning II ( 3.4 ) , og der rystes atter 1 minut . Derpaa fyldes op med vand til maerket , omrystes og filtreres . Saafremt filtratet ikke er fuldstaendig klart , hvilket sjaeldent forekommer , skal bestemmelsen gentages med stoerre maengder af Carrez-oploesningerne I og II , f . eks . 10 ml .  Umiddelbart derefter maales oploesningens optiske drejning i et 200 mm roer med et polarimeter eller et saccharimeter .  5.3 Bestemmelse af den optiske drejning  ( P' eller S' ) for de i ethanol 40 % oploeselige substanser .  5 g af proeven afvejes med 1 mg noejagtighed i en 100 ml maalekolbe og der tilsaettes ca . 80 ml ethanol ( 3.5 ) ( se bemaerkning 7.2 ) . Derpaa henstilles kolben 1 time ved rumtemperatur . Under henstanden rystes kolben kraftigt seks gange , saaledes at substansen blandes godt med ethanolen . Der fyldes op med ethanol ( 3.5 ) til maerket , omrystes og filtreres .  50 ml af filtratet ( = 2,5 g af proeven ) afpipetteres i en 250 ml Erlenmeyerkolbe og der tilsaettes 2,1 ml saltsyre ( 3.1 ) ; kolben rystes kraftigt , sluttes til en tilbagekoebskoeler og saettes i et bad med kogende vand . Efter noejagtig 15 minutter tages Erlenmeyerkolben op af vandbadet og indholdet skylles over i en 100 ml maalekolbe med en lille maengde koldt vand ; umiddelbart herefter afkoeles til en temperatur paa 20 * C .  Derpaa klares med Carrez-oploesningerne I ( 3.3 ) og II ( 3.4 ) , fyldes op med vand til maerket , omrystes og filtreres , og den optiske drejning maales som beskrevet under 5.2 andet og tredje afsnit .  6 . Beregning af resultaterne  Indholdet af stivelse i procent af proeven beregnes som foelger :  6.1 Polarimetriske maalinger  Stivelses-procent = ( 2000 * ( P - P' ) ) / ( a ) ( 20 * , D )  P = total optisk drejning i cirkelgrader .  P' = optisk drejning i cirkelgrader af de i ethanol 40 % oploeselige substanser .   ( a ) ( 20 * /D ) = den rene stivelses specifikke drejningsevne .  Til denne faktor anvendes ifoelge aftale nedenstaaende vaerdier :   + 185,9 * : risstivelse ,   + 195,4 * : kartoffelstivelse ,   + 184,6 * : majsstivelse ,   + 182,7 * : hvedestivelse ,   + 181,5 * : bygstivelse ,   + 181,3 * : havrestivelse ,   + 184,0 * : andre stivelsesarter samt stivelsesblandinger i foderblandinger .  6.2 Saccharimetriske maalinger  Stivelses-procent = ( 2000 / ( a ) ( 20 * D ) ) *  ( ( 2 N * 0,665 ) ( S - S' ) ) /100 =  ( 26,6 N ( S - S' ) ) / ( a ) ( 20 * D )  S = total optisk drejning i saccharimeter-grader .  S' = optisk drejning i saccharimeter-grader af de i ethanol 40 % oploeselige substanser .  N = vaegt af saccharose i g , som i 100 ml vand ved en lagtykkelse paa 200 mm giver en optisk drejning paa 100 saccharimeter-grader . Denne vaegt varierer alt efter saccharimetertype :  16,29 g ved franske saccharimetre ,  26,00 g ved tyske saccharimetre ,  20,00 g ved blandede saccharimetre .   ( a ) ( 20 * , D ) = den rene stivelses specifikke drejningsevne ( se 6.1 ) .  6.3 Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ved indhold paa mindre end 40 % stivelse ikke vaere mere end 0,4 % absolut , ved indhold paa 40 % og mere ikke over 1 % relativt .  7 . Bemaerkninger  7.1 Indeholder proeven mere end 6 % karbonater , beregnet som kalciumkarbonat , skal disse foer bestemmelsen af den totale optiske drejning destrueres med den hertil noedvendige maengde af fortyndet svovlsyre .  7.2 Ved produkter med hoejt laktoseindhold , f . eks . vallepulver eller skummetmaelkspulver , anvendes efter tilsaetning af 80 ml ethanol ( 3.5 ) foelgende fremgangsmaade :  Maalekolben forsynes med en tilbageloebskoeler og nedsaenkes i 30 minutter i et vandbad paa 50 * C . Efter afkoeling fortsaettes som beskrevet under 5.3 .  2 . BESTEMMELSE AF RAAPROTEIN  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader konventionel udregning af indholdet af raaprotein i foderstoffer paa basis af kvaelstofindholdet ( Kjeldahl ) .  2 . Princip  Proeven destrueres i vaad tilstand . Den sure nedbrydningsrest goeres alkalisk med en natriumhydroxydoploesning . Den frigjorte ammoniak fraskilles ved destillation og opsamles i en bestemt maengde svovlsyre , hvis overskud titreres med en natriumhydroxydoploesning .  3 . Reagenser  3.1 Kaliumsulfat p . a .  3.2 Katalysator : Kobber(II)-oxyd CuO p.a . eller krystalliseret kobbersulfat CuSO4 * 5 H2O p.a . eller kviksoelv eller kviksoelvoxyd HgO p.a .  3.3 Zink p.a . , granuleret  3.4 Svovlsyre p.a . , mf . 1,84  3.5 0,1 N svovlsyre  3.6 0,5 N svovlsyre  3.7 Metylroedt-indikator : 300 mg metylroedt oploeses i 100 ml ethanol 95-96 % ( v/v )  3.8 Natriumhydroxydoploesning 40 % ( w/v )  3.9 0,1 N natriumhydroxydoploesning  3.10 0,25 N natriumhydroxydoploesning  3.11 Maettet natriumsulfidoploesning p.a .  3.12 Natriumtiosulfatoploesning 8 % ( w/v ) ; Na2S2O3 * 5 H2O p.a .  3.13 Granuleret pimpsten , vasket med saltsyre og gloedet .  4 . Apparatur  Destruktionsapparat og destillationsapparat ifoelge Kjeldahl ( se bemaerkning 7.1 ) .  5 . Udfoerelse  5.1 Destruktion  1 g af proeven afvejes med 1 mg noejagtighed og kommes i destruktionskolben . Hertil saettes 10 g kaliumsulfat ( 3.1 ) , en passende maengde af katalysatoren ( 3.2 ) ( 0,3 til 0,4 g kobberoxyd eller 0,9 til 1,2 g kobbersulfat eller en draabe kivksoelv eller 0,6 til 0,7 g kviksoelvoxyd ) , 25 ml svovlsyre ( 3.4 ) og et par stykker granuleret pimpsten ( 3.13 ) og kolbeindholdet blandes Kolben opvarmes i begyndelsen moderat , derefter - under jaevnlig omrystning - til substansen forkuller og skumdannelsen ophoerer og mod slutningen intensivt til vaesken koger jaevnt . Overophedning af kolben og vedhaeng af organiske dele paa kolbevaeggen skal undgaas . Saasnart oploesningen er klar og farveloes ( resp . lysegroen , saafremt der er anvendt en kobberholdig katalysator ) fortsaettes kogningen i endnu 1 time , hvorefter der afkoeles .  5.2 Destillation  Under kontinuerlig svingning tilsaettes der forsigtigt 250 til 350 ml vand , hvorved sulfaterne skal oploeses fuldstaendigt . Der afkoeles ; derpaa tilsaettes nogle stykker granuleret zink ( 3.3 ) .  I destillationsapparatets forlagskolbe kommes der alt efter det forventede kvaelstofindhold noejagtig 25 ml 0,1 N ( 3.5 ) eller 0,5 N ( 3.6 ) svovlsyre  ( se bemaerkning 7.2 ) , hvortil der saettes nogle draaber metylroedt-I ( 3.7 ) .  Kolben forbindes med destillationsapparatets koeler og dennes yderste ende saenkes mindst 1 cm ned i vaesken i forlagskolben ( se bemaerkning 7.3 ) . Gennem en tragt med hane fyldes 100 ml natriumhydroxydoploesning 40 % ( 3.8 ) langsomt ned i destillationskolben . Ved anvendelse af en kviksoelvkatalysator tilsaettes der i destillationskolben yderligere 10 ml natriumsulfidoploesning ( 3.11 ) eller 25 ml natriumtiosulfatoploesning ( 3.12 ) .  Kolben opvarmes saaledes , at der i loebet af 30 minutter afdestilleres ca . 150 ml af vaesken . Efter disse 30 minutters forloeb kontrolleres den neutrale reaktion i destillatet med lakmuspapir . Er reaktionen alkalisk , fortsaettes destilleringen . Den bringes til ophoer , naar destillatet paa lakmuspapiret viser sig at vaere neutralt . Under destilleringsprocessen svinges forlagskolbens indhold med jaevne mellemrum , og dets farvning iagttages . Saafremt farvningen gaar over i det gullige , tilsaettes omgaaende en noeje afmaalt maengde 0,1 N  ( 3.5 ) eller 0,5 N ( 3.6 ) svovlsyre .  5.3 Titrering  I forlagskolben titreres overskuddet af svovlsyre med 0,1 N ( 3.9 ) eller 0,25 N ( 3.10 ) natriumhydroxydoploesning , alt efter den anvendte svovlsyres normalitet , til omslag til klar gul farve .  5.4 Kontrol af metoden  For at kontrollere , om reagenserne er kvaelstoffri , udfoeres et blindforsoeg ( destillation og titrering ) uden analyseproeven . Til kontrol af metodens noejagtighed skal analysen ( destruktion , destillation og titrering ) udfoeres med 1,5 til 2,0 g acetanilid p.a . ( smp . 114 * C ; % N : 10,36 ) ved tilstedevaerelse af 1 g kvaelstoffri saccharose . 1 g acetanilid forbruger 14,80 ml 0,5 N svovlsyre .  6 . Beregning af resultaterne  Maengden af den forbrugte svovlsyre beregnes . 1 ml 0,1 N svovlsyre svarer til 1,4 mg kvaelstof . Kvaelstofmaengden multipliceres med faktoren 6,25 . Resultatet udtrykkes i procent af proeven .  Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved en og samme proeve ved indhold paa mindre end 20 % raaprotein ikke vaere over 0,2 % absolut , ved indhold paa fra 20 % til 40 % raaprotein ikke over 1,0 % relativt , ved indhold paa over 40 % raaprotein ikke over 0,4 % absolut .  7 . Bemaerkninger  7.1 Apparatur , ved hvilket omhaeldning mellem destruktion og destillation er noedvendig , kan anvendes . Der maa ikke spildes under omhaeldningen .  7.2 Ved kvaelstoffattige foderstoffer kan maengden af 0,1 N svvovlsyre , som skal fyldes i opsamlingskolben , eventuelt reduceres til 10 eller 15 ml , hvorefter der fyldes op med vand til 25 ml .  7.3 Findes der ikke nogen tragt med hane paa destillationsapparatet , sker tilsaetningen af natriumhydroxydoploesningen umiddelbart foer kolben forbindes med koeleren ; vaesken skal i saa fald loebe langsomt ned langs kolbevaeggen for at undgaa , at den opblandes med den sure oploesning .  3 . BESTEMMELSE AF DET MED PEPSIN OG SALTSYRE OPLOESELIGE RAAPROTEIN  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af det med pepsin og saltsyre oploeselige raaprotein under definerede betingelser . Metoden gaelder for alle foderstoffer .  2 . Princip  Proeven behandles 48 timer ved 40 * C med en pepsin-saltsyre-oploesning . Suspensionen filtreres , og kvaelstofindholdet i filtratet bestemmes efter den til bestemmelse af raaprotein beskrevne metode .  3 . Reagenser  3.1 Saltsyre , mf . 1,125 .  3.2 0,075 N saltsyre .  3.3 Pepsin 2.0 E/mg . Aktiviteten er defineret i 4 . del af forskrifterne i dette bilag og kontrolleres i overensstemmelse dermed .  3.4 Pepsinoploesning ca . 0,02 % ( w/v ) i saltsyre  ( 3.2 ) , frisk tilberedt . Aktivitet 400 E/l .  3.5 Antiskumemulsion ( f . eks . silikone ) .  3.6 Samtlige under punkt 3 i metoden til bestemmelse af raaproteiner anfoerte reagenser .  4 . Apparatur  4.1 I termostatstyret vandbad eller varmeskab , indstillet paa 40 * C mere eller mindre 1 * C .  4.2 Apparatur til destruktion og destillation ifoelge Kjeldahl .  5 . Udfoerelse  5.1 Oploesning af raaproteinet ( se bemaerkning 7.2 )  2 g af proeven afvejes med 1 mg noejagtighed og kommes i en 500 ml maalekolbe . Hertil saettes 450 ml pepsinoploesning ( 3.4 ) , som foerst er opvarmet til 40 * C , hvorefter der rystes for at forhindre klumpdannelse . Suspensionens pH-vaerdi skal ligge under 1,7 . Kolben henstilles i vandbad eller varmeskab ( 4.1 ) i 48 timer . Der rystes efter 8 , 24 og 32 timer . Efter 48 timer tilsaettes 15 ml saltsyre ( 3.1 ) , afkoeles til 20 * C , fyldes op med vand til maerket og filtreres .  5.2 Destruktion  250 ml af filtratet kommes i destruktionsapparaturets kolbe ( 4.2 ) . Derpaa tilsaettes de til destruktionen noedvendige reagenser , som anfoert i beskrivelsen af metoden til bestemmelse af raaprotein under punkt 5.1 , 2 . punktum . Der blandes og opvarmes til kogetemperatur . Saafremt der dannes kraftigt skum , tilsaettes nogle draaber antiskumemulsion ( 3.5 ) . Vaesken holdes i kraftigt kog , til vandet er naesten fuldstaendig fordampet . De sidste spor af vand elimineres forsigtigt ved lavere varmetilfoersel . Naar oploesningen er klar og farveloes ( resp . lysegroen ved anvendelse af en kobberholdig katalysator ) , fortsaettes kogningen i endnu 1 time ; derpaa afkoeles der .  5.3 Destillation og titrering  Fremgangsmaade som beskrevet i metoden til bestemmelse af raaproteiner under 5.2 og 5.3 .  5.4 Blindforsog  Et blindforsoeg udfoeres under anvendelse af samme fremgangsmaade uden analyseproeve .  6 . Beregning af resultaterne  Rumfanget af den i blindforsoeget forbrugte svovlsyre traekkes fra analyseproevens forbrug . 1 ml 0,1 N svovlsyre svarer til 1,4 mg kvaelstof .  Den fundne kvaelstofmaengde multipliceres med faktoren 6.25 . Resultatet udtrykkes i procent af proeven .  Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve   - ved indhold paa mindre end 20 % oploeseligt raaprotein , ikke vaere over 0,4 % absolut ,   - ved indhold paa 20 til 40 % oploeseligt raaprotein , ikke over 2 % relativt ,   - ved indhold paa mere end 40 % oploeseligt raaprotein , ikke over 0,8 % absolut .  7 . Bemaerkninger  7.1 De beregnede vaerdier staar ikke i direkte forhold til fordoejeligheden in vivo .  7.2 Foderstoffer , hvis raafedtindhold er mere end 10 % , skal affedtes ved ekstraktion med petroleumsaeter ( kp . 40-60 * C ) .  4 . BESTEMMELSE AF PEPSINAKTIVITET  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tjener til kontrol af aktiviteten i den pepsin , der anvendes til bestemmelse af det med pepsin og saltsyre oploeselige raaprotein .  2 . Princip  Haemoglobin behandles under definerede betingelser med pepsin og fortyndet saltsyre . Den ikke hydrolyserede andel af proteinerne udfaeldes med trikloreddikesyre . Til filtratet saettes natriumhydroxydoploesning og reagens ifoelge Folin-Ciocalteu . Ekstinktionen af denne oploesning maales ved 750 m og den til denne ekstinktion svarende maengde tyrosin aflaeses af en standardkurve .  Definition : Pepsin-enheden ( E ) defineres som den enzymmaengde , der under metodens betingelser pr . minut frigiver saa mange hydroxyaryl-grupper , at disses farvning med Folin-Ciocalteureagens giver en ekstinktion , som svarer til ekstinktionen af 1 m mol tyrosin under de samme betingelser .  3 . Reagenser  3.1 0,2 N saltsyre  3.2 0,06 N saltsyre  3.3 0,025 N saltsyre  3.4 trikloreddikesyreoploesning 5 % ( w/v )  3.5 0,5 N natriumhydroxydoploesning  3.6 Reagens ifoelge Folin-Ciocalteu : 100 g natriumwolframat ( Na2WO4 * 2 H2O ) , 25 g natriummolybdat ( Na2MoO4 * 2 H2O ) og 700 ml vand kommes i en 2 liters rundbundet kolbe med tilsleben prop . - Der tilsaettes 50 ml fosforsyre  ( mf . 1,71 ) og 100 ml koncentreret saltsyre  ( mf . 1,19 ) , hvorpaa kolben forbindes med en tilbageloebskoeler . Der opvarmes til kogetemperatur og oploesningen holdes svagt i kog 10 timer . Efter afkoeling fjerner man tilbageloebskoeleren , tilsaetter 175 g litiumsulfat ( Li2SO4 * 2 H2O ) , 50 ml , vand og 1 ml brom . Umiddelbart herefter koger man 15 minutter for at fjerne den overskydende brom .  Efter afkoeling fyldes oploesningen over i en 1 liter maalekolbe , der fyldes op med vand , rystes og filtreres . Det faerdige reagens maa ikke antage groenlig farve . Foer brugen fortyndes 1 volumendel reagens med 2 volumendele vand .  3.7 Haemoglobinoploesning : En til 354 mg kvaelstof ( 1 ) svarende haemoglobinmaengde ( ca . 2 g ) , proteasesubstrat ifoelge Anson , afvejes og kommes i en 200 ml kolbe med tilsleben prop . Man tilsaetter nogle ml 0,06 N saltsyre ( 3.2 ) , forbinder kolben med vakuumpumpen og ryster , indtil haemoglobinet er fuldstaendig oploest . Derefter fjerner man vakuum og tilsaetter under omrystning den endnu indtil 100 ml manglende maengde saltsyre ( 3.2 ) . Friskfremstilles foer brugen .  3.8 Tyrosin-standardoploesning : 181,2 mg tyrosin oploeses i saltsyre ( 3.1 ) og der fyldes op med samme syre til 1 liter ( stamoploesning ) . Der udtages 20,0 ml af denne oploesning , som fortyndes med saltsyre ( 3.1 ) til 100 ml . 1 ml af denne oploesning indeholder 0,2 m mol tyrosin .  4 . Apparatur  4.1 Ultratermostat , indstillet paa 25 * C mere eller mindre 0,1 * C .  4.2 Spektrofotometer .  4.3 Kronometer , noejagtighed : 1 sek .  4.4 pH-meter .  5 . Udfoerelse  5.1 Fremstilling af oploesningen ( se bemaerkning 7.1 )  150 mg pepsin oploeses i 100 ml saltsyre ( 3.2 ) . Af denne oploesning afpipetteres 2 ml i en 50 ml maalekolbe , og der fyldes op med saltsyre  ( 3.3 ) til maerket . Den med pH-meteret kontrollerede pH-vaerdi boer ligge paa 1,6 mere eller mindre 0,1 . Kolben saettes ind i ultratermostaten ( 4.1 ) .  5.2 Hydrolyse  5,0 ml haemoglobinoploesning ( 3.7 ) pipetteres over i et reagensglas og der opvarmes i ultratermostaten  ( 4.1 ) til 25 * C . Derpaa tilsaetter man 1,0 ml af den ifoelge 5,1 fremstillede pepsinoploesning , blander ved hjaelp af en i spidsen fortykket glasstang , som bevaeges ca . 10 gange op og ned , og lader reagensglasset henstaa i noejagtig 10 minutter  ( regnet fra pepsinoploesningens tilsaetning ) i vandbad ved 25 * C ( tid og temperatur skal overholdes noeje ) . Efter forloebet af de 10 minutter tilsaettes 10,0 ml af den i forvejen til 25 * C opvarmede trikloreddikeoploesning ( 3.4 ) , der rystes og filtreres gennem et toert filter .  5.3 Udvikling af farvningen og maaling af ekstinktionen  5,0 ml af filtratet afpipetteres i en 50 ml Erlenmeyerkolbe , hvortil der saettes 10,0 ml natriumhydroxydoploesning ( 3.5 ) . Derpaa tilsaettes der under konstant omrystning 3,0 ml af det fortyndede reagens ifoelge Folin-Ciocalteu  ( 3.6 ) . Efter 5 til 10 minutter bestemmes ekstinktionen af oploesningen fotometrisk i 1 cm kuvetter ved 750 m over for vand .  5.4 Til hver bestemmelse udfoeres et blindforsog som foelger :  5,0 ml haemoglobinoploesning ( 3.7 ) afpipetteres i et reagensglas og opvarmes i ultratermostaten  ( 4.1 ) til 25 * C . Derpaa tilsaetter man 10,0 ml af den i forvejen til 25 * C opvarmede trikloreddikesyreoploesning ( 3.4 ) , blander og tilsaetter umiddelbart derefter 1,0 ml af den ifoelge 5.1 fremstillede pepsinoploesning . Man blander ved hjaelp af en glasstang og lader reagensglasset henstaa i noejagtig 10 minutter ved 25 * C i et vandbad ( 4.1 ) . Der omrystes og filtreres . Herefter fortsaetter man som beskrevet under 5.3 .  5.5 Standardkurve  I 50 ml Erlenmeyerkolben kommes 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 og 5,0 ml tyrosinstandardoploesning ( 3.8 )  ( svarende til tyrosinmaengderne paa 0,2 , 0,4 , 0,6 , 0,8 og 1,0 m mol ) . Raekken kompletteres med en tyrosinfri sammenligningsproeve . De enkelte afmaalinger suppleres med saltsyre ( 3.1 ) til 5,0 ml . Endvidere tilsaettes der 10,0 ml . natriumhydroxydoploesning ( 3.5 ) og under konstant omrystning 3,0 ml af det fortyndede reagens ifoelge Folin-Ciocalteu ( 3.6 ) . Ekstinktionen maales som under 5.3 , sidste punktum . Standardkurven tegnes ved at saette de tilsatte maengder tyrosin mod ekstinktionen .  6 . Beregning af resultaterne  Af standardkurven aflaeses den maengde tyrosin i m mol , som svarer til den med blindvaerdien korrigerede ekstinktion af de farvede oploesninger .  Pepsinens aktivitet i m mol tyrosin pr . mg og pr . minut ved 25 * C beregnes efter foelgende formel :  Enheder pr . mg ( E/mg ) = 0,32 a/p  idet  a = den af standardkurven aflaeste tyrosinmaengde i m mol ,  p = vaegten i mg af den ifoelge 5.2 tilsatte pepsinmaengde .  7 . Bemaerkninger  7.1 Den maengde pepsin , som skal oploeses , vaelges saaledes , at der ved den fotometriske slutmaaling opnaas en ekstinktion paa 0,35 mere eller mindre 0,035 .  7.2 2 E/mg , bestemt efter denne metode , svarer til  3.64 m-Anson E/mg ( m mol tyrosin/mg * min . ved 35,5 * C ) eller  36 400 gaengse E/g ( m mol tyrosin/g * 10 min . ved 35,5 * C ) .  5 . BESTEMMELSE AF FRI OG TOTALGOSSYPOL  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af fri gossypol , totalgossypol og kemisk naert beslaegtede substanser i froe , mel og kager af bomuldsfroe , samt i foderblandinger , som indeholder produkter af bomuldsfroe . Den laveste graense for bestemmeligheden er 20 ppm .  2 . Princip  Gossypol ekstraheres under tilstedevaerelse af 3-amino-1-propanol enten med en isopropanol-hexan-blanding til bestemmelse af fri gossypol eller med dimetylformamid til bestemmelse af totalgossypol og omsaettes med anilin til gossypol-dianiline , hvis ekstinktion maales ved 440 mm .  3 . Reagenser  3.1 Isopropanol-hexan-blanding : 60 volumendele isopropanol p.a . blandes med 40 volumendele n-hexan .  3.2 Oploesningsmiddel A : I en 1 liter maalekolbe fyldes der ca . 500 ml isopropanol-hexan-blanding  ( 3.1 ) , 2 ml 3-amino-1-propanol , 8 ml iseddike og 50 ml vand , og der fyldes op med isopropanol-hexan-blanding ( 3.1 ) til maerket . Dette reagens er holdbart 1 uge .  3.3 Oploesningsmiddel B : I en 100 ml maalekolbe afpipetteres 2ml 3-amino-1-propanol og 10 ml iseddike , hvorefter der afkoeles til rumtemperatur og fyldes op med N,N-dimetylformamid til maerket . Dette reagens er holdbart 1 uge .  3.4 Anilin p . a . : Saafremt ekstinktionen i blindforsoeget er stoerre end 0,022 , destilleres anilinen over zinkstoev , idet man bortkaster de foerste og sidste 10 % af destillatet . I koeleskab er dette reagens ved opbevaring i vel tillukket , brunt glas holdbart i et par maaneder .  3.5 Gossypol-standardoploesning A : I en 250 ml maalekolbe oploeses 27,9 mg gossypol-acetat med oploesningsmiddel A ( 3.2 ) og der fyldes op til maerket med dette . 50 ml af denne oploesning afpipetteres i en 250 ml maalekolbe og der fyldes op med oploesningsmiddel A ( 3.2 ) til maerket . Denne oploesnings gossypolkoncentration er 0,02 mg/ml . Foer brugen henstaar denne oploesning 1 time ved rumtemperatur .  3.6 Gossypol-standardoploesning B : I en 50 ml maalekolbe oploeses 27,9 mg gossypol-acetat i oploesningsmiddel B ( 3.3 ) og der fyldes op til maerket . Gossypolkoncentrationen i denne oploesning er 0,5 mg/ml .  Standard-gossypol-oploesningerne er holdbare i 24 timer , saafremt de er beskyttet mod lyset .  4 . Apparatur  4.1 Mekanisk rysteapparat : ca . 35 omdr./min .  4.2 Spektrofotometer .  5 . Udfoerelse  5.1 Afvejning  Stoerrelsen af den afvejede stofmaengde retter sig efter det formodede indhold af gossypol i proeven . Det er fordelagtigt at arbejde med en lille afvejning og med en relativt stor aliquot del af filtratet for at faa en tilstraekkelig maengde gossypol til en noejagtig fotometrisk maaling . Til bestemmelsen af fri gossypol i froe , mel og kager af bomuldsfroe boer afvejningen ikke vaere paa mere end 1 g , medens den ved foderblandinger kan vaere paa 5 g . En aliquot del af filtratet paa 10 ml er i de fleste tilfaelde anvendelig ; den skal indeholde 50 til 100 mg gossypol . Til bestemmelsen af totalgossypol boer afvejningen ligge paa fra 0,5 til 5 g , saaledes at der i den aliquot del af filtratet paa 2 ml er et indhold paa 40 til 200 mg gossypol .  Analyser udfoeres ved en rumtemperatur paa ca . 20 * C .  5.2 Bestemmelse af fri gossypol  Den afvejede stofmaengde bringes i en 250 ml kolbe med tilsleben prop , hvis bund er daekket med glassplinter , 50 ml af oploesningsmidlet A ( 3.2 ) tilsaettes med pipette , kolben lukkes og rystes én time i rysteapparat . Derpaa filtreres gennem et toert filter og giltratet opsamles i en lille kolbe med tilsleben prop . Under filtreringen tildaekkes tragten med et urglas . Lige store aliquote dele af filtratet , indeholdende 50 til 100 mg gossypol afpipetteres i to 25 ml maalekolber ( A og B ) , eventuelt fortyndes med oploesningsmiddel A ( 3.2 ) til 10 ml . Derpaa suppleres kolbens indhold ( A ) med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket . Denne oploesning anvendes som sammenligningsoploesning ved maalingen af proeveoploesningen . Derefter afpipetteres 10 ml oploesningsmiddel A ( 3.2 ) i to andre 25 ml maalekolber . Indholdet i kolben ( C ) suppleres med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket . Denne oploesning anvendes som sammenligningsoploesning ved maalingen af blindproeveoploesningen .  Til hver af maalekolberne ( D ) og ( B ) saettes 2 ml anilin ( 3.4 ) . Der opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand til udvikling af farvningen , afkoeles til stuetemperatur , fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket , omrystes , hvorefter det hele henstaar 1 time .  Herefter maales i spektrofotometeret ved 440 mm og i glaskuvetter paa 1 cm tykkelse blindproevens ( B ) ekstinktion i forhold til sammenligningsoploesningen  ( C ) og proeveoploesningens ( B ) ekstinktion i forhold til sammenligningsoploesningen ( A ) . Ekstinktionen af blindproeveoploesningen traekkes fra ekstinktionen af proeveoploesningen ( = korrigeret ekstinktion ) . Paa basis af den fundne vaerdi beregnes indholdet af fri gossypol som beskrevet under 6 .  5.3 Bestemmelse af totalgossypol  En afvejet stofmaengde indeholdende 1 til 5 mg gossypol kommes i en 50 ml maalekolbe ; derpaa tilsaettes 10 ml af oploesningsmidlet B ( 3.3 ) . Samtidig tilberedes et blindforsoeg med 10 ml af oploesningsmidlet B ( 3.3 ) i en anden 50 ml maalekolbe . Begge maalekolber opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand , afkoeles til stuetemperatur og fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket . Der omrystes , henstills 10 til 15 minutter , derpaa filtreres , og filtratet opsamles i kolber med tilsleben prop .  2 ml af proevefiltratet afpipetteres i hver af to 25 ml maalekolber og 2 ml af filtratet fra blindforsoeget i hver af to andre 25 ml maalekolber . En kolbe i hver serie fyldes op med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til 25 ml . Disse oploesninger anvendes som sammenligningsoploesninger .  Til hver af de to andre maalekolber saettes 2 ml anilin ( 3.4 ) . Derpaa opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand til udvikling af farvningen , afkoeles til stuetemperatur , fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til 25 ml , omrystes , hvorefter det hele henstaar 1 time .  Ekstinktionen maales som beskrevet under 5.2 for fri gossypol . Paa basis af den fundne vaerdi beregnes indholdet af totalgossypol som beskrevet under 6 .  6 . Beregning af resultaterne  Beregningen af resultaterne kan foretages paa basis af den specifikke ekstinktion ( 6.1 ) eller ved benyttelse af en standardkurve ( 6.2 ) .  6.1 Paa basis af den specifikke ekstinktion  Den specifikke ekstinktion andrager under de angivne betingelser for fri gossypol  E 1 % /1 cm = 625  totalgossypol E 1 % /1 cm = 600  Indholdet af fri eller totalgossypol i proeven andrager :  ( E * 1250 ) /E ( 1 % /1 cm ) * p * a = % gossypol  idet :  E = korrigeret ekstinktion , som bestemt under 5.2 ,  p = afvejet stofmaengde i g  a = aliquot del af filtratet i ml .  6.2 Ved hjaelp af en standardkurve  6.2.1 Fri gossypol  Der forberedes 2 raekker med hver fem 25 ml maalekolber . I begge raekker afpipetteres 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 og 10,0 af gossypol-standardoploesningen A ( 3.5 ) og rumfanget suppleres til 10 ml med oploesningsmidlet A ( 3.2 ) . I hver raekke stilles en 25 ml maalekolbe , som kun indeholder 10 ml af oploesningsmidlet A ( 3.2 )  ( blindforsoeg ) .  Kolberne i den foerste raekke inclusive blindforsoeget fyldes op med isopropanol-hexan-blandingen  ( 3.1 ) til 25 ml ( sammenligningsraekke ) .Til hver af kolberne i den anden raekke , inclusive blindforsoeget , saettes 2 ml anilin  ( 3.4 ) . Derpaa opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand til udvikling af farvningen , afkoeles til rumtemperatur , fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket , rystes , hvorefter det hele henstaar 1 time  ( standardraekke ) .  Under de i 5.2 beskrevne betingelser maales ekstinktionen af standardraekkeoploesningerne ved sammenligning med de tilsvarende oploesninger i sammenligningsraekken . Standardkurven fremstilles grafisk , idet ekstinktionsvaerdierne og gossypolmaengderne ( i mg ) indtegnes over for hinanden .  6.2.2 Totalgossypol  Der tilberedes seks 50 ml maalekolber . I den foerste afpipetteres 10 ml af oploesningsmidlet B ( 3.3 ) og i hver af de oevrige 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 og 10,0 ml af gossypolstandardoploesningen B ( 3.6 ) . Indholdet i hver af kolberne suppleres med oploesningsmidlet B ( 3.3 ) til 10 ml , opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand , afkoeles til rumtemperatur , fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket og rystes .  I to raekker med seks 25 ml maalekolber afpipetteres i hver 2,0 ml af denne oploesning . Kolberne i den foerste raekke fyldes op med isopropanol-hexan-blandingen  ( 3.1 ) til 25 ml ( sammenligningsraekke ) .  I kolberne i den anden raekke kommes i hver 2 ml anilin ( 3.4 ) . Derpaa opvarmes i 30 minutter i et bad med kogende vand , afkoeles til rumtemperatur , fortyndes med isopropanol-hexan-blandingen ( 3.1 ) til maerket , rystes , hvorefter det hele henstaar 1 time ( standardraekke ) .  Under de i 5.2 beskrevne betingelser maales ekstinktionen af standardraekkeoploesningerne ved sammenligning med de tilsvarende oploesninger i sammenligningsraekken . Standardkurven fremstilles grafisk , idet ekstinktionsvaerdierne og gossypolmaengderne ( i mg ) indtegnes over for hinanden .  6.3 Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ved indhold paa   - mindre end 500 ppm gossypol ikke vaere over 15 % relativt ,   - 500 til 750 ppm gossypol ikke over 75 ppm absolut ,   - 750 ppm og mere gossypol ikke over 10 % relativt .  ( 1 ) Kvaelstofindholdet bestemmes efter Kjeldahls semimikrometode ( teoretisk indhold : 17,7 % nitrogren ) .  BILAG II  1 . PAAVISNING OG IDENTIFIKATION AF ANTIBIOTIKA INDEN FOR TETRACYKLINGRUPPEN  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tjener til paavisning og identifikation af antibiotika inden for tetracyklingruppen i foderstoffer , som indeholder mindst 0,1 ppm antibiotikum , i koncentrater og i forblandinger .  2 . Princip  Proeven ekstraheres med en blanding af metanol og saltsyre . Ekstrakten papirkromatograferes til sammenligning med standardoploesninger efter opstigende metodik . Antibiotikaerne paavises og identificeres ved sammenligning af deres Rf-vaerdier med standardstoffernes enten ved fluorescens i UV-lys ( hoejt indhold af antibiotika ) eller ved bioautografi paa et med B . cereus podet agarnaeringssubstrat .  3 . Reagenser og naeringssubstrat  3.1 Stoedpudeoploesning , pH 3,5  Citronsyre-monohydrat p.a . * 10,256 g *  Dinatriumfosfat Na2HPO4 * 2 H2O p.a . * 7,45 g *  Acetone p.a . * 300 ml *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  3.2 Fosfatstoedpudeoploesning , pH 5,5  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 130,86 g *  Dinatriumfosfat Na2HPO4 * 2 H2O p.a . * 6,947 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  3.3 Udviklingsvaeske I : Blanding af nitrometan , ren/kloroform , ren/a-diklorhydrin : 20/10/1,5 i vol . Tilberedes umiddelbart foer brugen .  3.4 Udviklingsvaeske II : Blanding af nitrometan , ren/kloroform , ren/a-pikolin : 20/10/3 i vol . Tilberedes umiddelbart foer brugen .  3.5 Blanding af metanol , ren/saltsyre ( mf . 1,19 ) : 98/2 i vol  3.6 0,1 N slatsyre  3.7 Ammoniakoploesning , mf . 0,91  3.8 Standardpraeparater : Klortetracyklin , oxytetracyklin , tetracyklin , hvis aktivitet angives som hydroklorid .  3.9 Testorganisme : B . cereus ATCC 11.778  Opbevaring af stamkulturen , fremstilling af sporesuspensionen og udpodning paa naeringssubstratet : Fremgangsmaade som i den under punkterne 3.1 og 3.2 i 2 . del af dette bilag beskrevne bestemmelsesmetode for klortetracyklin , oxytetracyklin og tetracyklin ved diffusion i agarnaeringssubstrat .  3.10 Naeringssubstrat ( 1 )  Glukose * 1 g *  Pepton , tryptisk fordoejet * 10 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Gaerekstrakt * 3 g *  Agar * 20 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Foer brugen indstilles til pH 5,8 .  3.11 Oploesning af 0,1 % ( w/v ) 2,3,5-trifonyltetrazoliumklorid og 5 % ( w/v ) glukose .  4 . Apparatur  4.1 Papirkromatografisk apparatur indrettet til opstigende metodik ( 25 cm papirhoejde ) . Schleicher - og Schuell-papir 2040 b eller 2043 b , eller tilsvarende .  4.2 Centrifuge .  4.3 Inkubator , indstillet paa 30 * C .  4.4 UV-lampe til fluorescenspaavisning .  4.5 Glasplader ca . 20 gange 30 cm , til fremstilling af en flad skaal til bioautografien .  5 . Standardoploesninger  5.1 Stamoploesninger  Med saltsyre ( 3.6 ) fremstilles oploesninger af standardpraeparaterne ( 3.8 ) , hvis koncentration svarer til 500 mg klortetracyklin-HCl , oxytetracyklin-HCl og tetracyklin-HCl pr . ml .  5.2 Sammenligningsoploesninger til paavisning i UV-lys  Oploesningerne ( 5.1 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 3.2 ) , for at opnaa oploesninger , hvis koncentration svarer til 100 mg klortetracyklin-HCl , oxytetracyklin-HCl og tetracyklin-HCl pr . ml .  5.3 Sammenligningsoploesninger til paavisning ved bioautografi  Oploesningerne ( 5.1 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 3.2 ) for at opnaa oploesninger , hvis koncentration svarer til 5 mg klortetracyklin : HCl , oxytetracyklin-HCl og tetracyklin-HCl pr . ml .  6 . Ekstraktion  Ved et forventet indhold af antibiotikum paa under 10 ppm kan man enten anvende den homogeniserede proeve eller den udsigtede finfraktion , da antibiotikaerne fortrinsvis befinder sig i de fineste fraktioner .  Proeven opslaemmes med blandingen ( 3.5 ) og centrifugeres . Det ovenstaaende vaeskelag paasaettes direkte eller , om noedvendigt , fortyndes der med blandingen ( 3.5 ) , for at opnaa koncentrationer af antibiotikum paa ca . 100 mg pr . ml ( 6.1 ) og ca . 5 mg pr . ml ( 6.2 ) .  7 . Paavisning og identifikation  7.1 Kromatografering  Papiret dyppes i stoedpudeoploesningen pH 3,5  ( 3.1 ) og udpresses mellem toert filtrerpapir for at fjerne den overskydende vaeske . Derpaa afsaettes der pletter à 0,01 ml af sammenligningsoploesningerne ( 5.2 og 5.3 ) og ekstraktoploesningerne ( 6.1 og 6.2 ) paa papiret . Afgoerende for en god adskillelse er den rigtige fugtighed i papiret ; det er eventuelt noedvendigt at toerre papiret lidt mere .  Der udvikles ved opstigende kromatografering med udviklingsvaeske I ( 3.3 ) til paavisning ved bioautografi , med udviklingsvaeske II ( 3.4 ) til paavisning i UV-lys . Naar vaeskefronten har bevaeget sig ca . 15 til 20 cm opad ( ca . 1 1/2 time ) , afbrydes kromatograferingen og papiret toerres .  7.2 Paavisning i UV-lys  Ved et antibiotikumindhold paa over 1 mg/cm2 kan pletterne efter behandling med ammoniakdampe ( 3.7 ) som foelge af deres guldgule fluorescens goeres synlige i UV-lys ( 4.4 ) .  7.3 Paavisning ved bioautografi  Det med B . cereus ( 3.9 ) podede naeringssubstrat  ( 3.10 ) haeldes paa glasplader ( 4.5 ) og papiret laegges paa substratet . Efter 5 minutters kontakt traekkes det af og laegges et andet sted paa substratet , hvor det bliver under inkubationstiden . Inkubationen sker natten over ved 30 * C i inkubatoren . Ved tilstedevaerelsen af et antibiotikum inden for tetracyklingruppen forekommer der i det ellers uklare naeringssubstrat klare haemningszoner .  Kromatogrammet fikseres efter inkubationen ved besproejtning af papiret med oploesningen ( 3.11 ) .  7.4 Identifikation  Nedenfor angives de relative Rf-vaerdier for de til tetracyklingruppen hoerende antibiotika . Disse vaerdier kan variere en ubetydelighed alt efter papirets kvalitet og fugtighedsindhold .  Klortetracyklin ( CTC ) * 0,60 *  Tetracyklin ( TC ) * 0,40 *  Oxytetracyklin ( OTC ) * 0,20 *  4-Epi-CTC * 0,15 *  4-Epi-TC * 0,13 *  4-Epi-OTC * 0,10 *  Epi-forbindelser har en mindre antibiotisk aktivitet end de normale forbindelser .  2 . BESTEMMELSE AF KLORTETRACYKLIN , OXYTETRACYKLIN OG TETRACYKLIN  A . VED DIFFUSION I AGARNAERINGSSUBSTRAT  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af klortetracyklin  ( CTC ) , oxytetracyklin ( OTC ) og tetracyklin  ( TC ) i foderstoffer , koncentrater og forblandinger . Den laveste graense for bestemmeligheden andrager 5 ppm . Indhold under 5 ppm kan bedoemmes ved grafisk interpolation .  2 . Princip  Ved indhold lige med eller under 50 ppm ekstraheres proeven med formamid . Ved indhold over 50 ppm ekstraheres proeven til bestemmelse af CTC med en blanding af acetone , vand og saltsyre , og til bestemmelse af CTC og TC med en blanding af metanol og saltsyre .  Derpaa fortyndes ekstrakterne , og deres antibiotiske aktivitet bestemmes ved maaling af diffusionen af CTC , OTC eller TC i et med B . cereus-podet agarnaeringssubstrat . Diffusionen paavises ved hjaelp af de opstaaende haemningszoner mod testorganismen . Diameteren af disse haemningszoner er direkte proportional med logaritmen til koncentrationen af det paagaeldende antibiotikum .  3 . Testorganisme : B . cereus ATCC 11.778  3.1 Opbevaring af stamkulturen  Et agarskraaglas af naeringssubstratet ( 4.1 ) , uden borsyre og metylenblaat , podes med B . cereus og inkuberes ved ca . 30 * C patten over . Derefter opbevares kulturen i koeleskab og podes hver 14 . dag over i agarskraaglas .  3.2 Fremstilling af sporesuspensionen  Et agarskraaglas ( 3.1 ) opslaemmes med 2 til 3 ml fysiologisk kogsaltoploesning ( 4.5 ) . Med denne suspension podes en Rouxkolbe , som indeholder 300 ml af naeringssubstratet ( 4.1 ) , uden borsyre og metylenblaat , med en agarkoncentration paa 3 til 4 % . Efter en inkubationstid paa 3 til 5 dage ved 28 til 30 * C opslaemmes kimene efter endt sporolering , som kontrolleres mikroskopisk , med 15 ml ethanol ( 4.6 ) og homogeniseres . Denne suspension kan opbevares i mindst 5 maaneder i koeleskab .  Ved hjaelp af forsoegsplader med testsubstratet  ( 4.1 ) findes den podningsmaengde , som giver de stoerst mulige , men endnu skarpe haemningszoner med de forskellige anvendte koncentrationer af antibiotika . Den ligger normalt paa 0,2 til 0,3 ml/1000 ml . Podningen af substratet skal ske ved 50 til 60 * C .  4 . Naeringssubstrat og reagenser  4.1 Testsubstrat ( 1 )  Glukose * 1 g *  Pepton , tryptisk fordoejet * 10 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Gaerekstrakt * 3 g *  Agar , alt efter kvalitet * 10-20 g *  Tween 80 * 1 ml *  Fosfatstoedpudeoploesning , pH 5,5 ( 4.2 ) * 10 ml *  Borsyreoploesning 5 % ( w/v ) * 15 ml *  Ethanolisk metylenblaatoploesning 0,5 % * 4 ml *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Indstilles foer brugen paa pH 5,8 .  4.2 Fosfatstoedpudeoploesning pH 5,5  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 130,86 g *  Dinatriumfosfat Na2HPO4 * 2H2O p.a . * 6,947 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.3 Fosfatstoedpudeoploesning ph 5,5 fortyndet til 1/10 .  4.4 Fosfatstoedpudeoploesning pH 8  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 1,407 g *  Dinatriumfosfat Na2HPO4 * 2 H2O p.a . * 57,539 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.5 Fysiologisk kogsaltoploesning , steril  4.6 Ethanol 20 % ( v/v )  4.7 0,1 N saltsyre  4.8 Formamid 70 % ( v/v ) : Friskfremstillet foer brug og indstillet til pH 4,5 med ca . 2 N svovlsyre .  4.9 Blanding acetone , ren/vand/saltsyre ( mf . 1,19 ) : 65/33/2 i vol .  4.10 Blanding af metanol , ren/saltsyre ( mf . 1,19 ) : 98/2 i vol .  4.11 Standardpraeparater : CTC , OTC , TC , hvis aktivitet angives som hydroklorid .  5 . Standardoploesninger  5.1 Klortetracyklin  Med 0,1 N saltsyre ( 4.7 ) fremstilles der af standardpraeparatet ( 4.11 ) en stamoploesning , hvis koncentration svarer til 500 mg klortetracyklin-HCl pr . ml . Denne oploesning er holdbar 1 uge ved opbevaring i koeleskab .  Af denne stamoploesning fremstilles en arbejdsstandardoploesning S8 , hvis koncentration svarer til 0,2 mg klortetracyklin-HCl pr . ml . Fortyndingen sker med fosfatstoedpudeoploesning pH 5,5 , som er fortyndet til 1/10 ( 4.3 ) og indeholder en tilsaetning paa 0,01 % amidosort ( 2 ) .  Derpaa fremstilles nedennaevnte koncentrationer med fosfatstoedpudcoploesningen ( 4.3 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) :  S4 * 0,1 mg/ml *  S2 * 0,05 mg/ml *  S1 * 0,025 mg/ml *  5.2 Oxytetracyklin  Paa samme maade som anfoert under 5.1 fremstilles der af en stamoploesning , hvis koncentration svarer til 400 mg oxytetracyklin-HCl pr . ml , en arbejdsstandardoploesning S8 med 1,6 mg tetracyklin-HCl pr . ml , og derefter foelgende koncentrationer :  S4 * 0,8 mg/ml *  S2 * 0,4 mg/ml *  S1 * 0,2 mg/ml *  5.3 Tetracyklin  Paa samme maade som anfoert under 5.1 fremstilles der af en stamoploesning , hvis koncentration svarer til 500 mg tetracyklin-HCl pr . ml , en arbejdsstandardoploesning S8 med 1,0 mg tetracyklin-HCl pr . ml , og derefter foelgende koncentrationer :  S4 * 0,5 mg/ml *  S2 * 0,25 mg/ml *  S1 * 0,125 mg/ml *  6 . Ekstraktion  6.1 Indhold , lig med eller under 50 ppm  Efter de nedenfor beskrevne angivelser tilsaettes der formamid ( 4.8 ) til en afvejet maengde stof , og der rystes i 30 minutter paa et rystebord . Derpaa fortyndes straks med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.3 ) som beskrevet nedenfor for at opnaa U8-koncentrationen . Formamidkoncentrationen i denne oploesning maa ikke andrage mere end 40 % . Herefter centrifugeres eller dekanteres ekstrakten for at faa en klar oploesning . Umiddelbart derefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.3 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) .  Antibiotika * CTC * OTC * TC *  Formodet indhold i ppm * 10 * 50 * 10 * 50 * 10 * 50 *  Afvejning i g * 10 * 10 * 24 * 9,6 * 20 * 10 *  ml formamid ( 4.8 ) * 100 * 100 * 80 * 100 * 80 * 100 *  ml fosfatstoedpudeoploesning ( 4.3 ) * fort . 1 : 5 ( a ) * fort . 1 : 25 ( b ) * 70 * 200 * 120 * fort . 1 : 5 ( a ) *  U8 koncentration i mg/ml * 0,2 * 0,2 * 1,6 * 1,6 * 1,0 * 1,0 *  ( a ) 20 ml ekstrakt udtages og fortyndes til 100 ml med fostfatstoedpudeoploesning i en maalekolbe .  ( b ) 4 ml ekstrakt udtrages og fortyndes til 100 ml med fostfatstoedpudeoploesning i en maalekolbe .  6.2 Indhold over 50 ppm  6.2.1 Klortetracyklin  Baseret paa det formodede indhold af antibiotika i proeven eller paa fremstillingsgarantien blandes en afvejet stofmaengde paa mellem 2 og 10 g med den 20-dobbelte volumen af blandingen ( 4.9 ) og der rystes 30 minutter paa et rystebord . Under ekstraktionen skal pH-vaerdien ligge under 3 ; om noedvendigt justeres ned til 3 ( ved mineralblandinger indstilles pH-vaerdien med 10 % eddikesyre ) .  Derefter bringes en aliquot del af ekstrakten til at ligge paa pH 5,5 ved hjaelp af fosfatstoedpudeoploesningen pH 8 ( 4.4 ) under tilsaetning af bromkresol-groent  ( omslag fra gult til blaat ) . Derefter fortyndes der med den til 1/10 fortyndede fosfatstoedpudeoploesning pH 5,5 ( 4.3 ) for at faa U8-koncentrationen ( se 6.1 ) .  Umiddelbart herefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.3 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) .  6.2.2 Oxytetracyklin og tetracyklin  Der fortsaettes paa samme maade som beskrevet under 6.2.1 , idet man erstatter blandingen ( 4.9 ) med blandingen ( 4.10 ) .  7 . Testmetode  7.1 Podning af naeringssubstratet  Sporesuspensionen ( 3.2 ) podes ud paa testsubstratet  ( 4.1 ) ved 50 til 60 * C .  7.2 Fremstilling af pladerne  Testen saettes an som diffusionstest paa plader med hver 4 koncentrationstrin paa standardoploesningen  ( S8 , S4 , S2 , S1 ) og ekstraktet ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Hver plade skal ubetinget indeholde alle 4 koncentrationer af standard og proeve .  Derfor skal pladerne have en saadan stoerrelse , at der kan udstanses mindst 8 huller i substratlaget ; huldiameteren skal vaere 10 til 13 mm . Den podede substratmaengde ( 7.1 ) skal vaere beregnet saaledes , at man faar et ensartet lag paa ca . 2 mm tykkelse . Testen boer fortrinsvis udfoeres paa plader , som er fremstillet af en glasplade , hvorpaa der laegges en plandrejet aluminiums - eller kunststofring med 20 mm hoejde og 200 mm diameter .  I hullerne afpipetteres noeje afmaalte maengder af antibiotika-oploesningen paa mellem 0,10 og 0,15 ml , alt efter hullernes diameter .  For hver proeve gentages paafyldningen af hver koncentration mindst 4 gange , saaledes at der pr . paasaetning for hver proeve kan bedoemmes 32 haemningszoner .  7.3 Inkubation  Der inkuberes i 18 timer ved ca . 28 til 30 * C .  8 . Bedoemmelse  Haemningszonernes diameter maales fortrinsvis ved projektion . Maalingerne indtegnes paa semilogaritmepapir , idet logaritmen til koncentrationerne indfoeres over for haemningszonernes diameter . Baade for standarden og for ekstrakten traekkes lige linjer . Ved en test med ukompliceret forloeb skal de to lige linjer vaere parallelle .  Logaritmen til den relative aktivitet udregnes efter foelgende formel :   ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) * 0,602 / U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2  Faktisk aktivitet = formodet aktivitet gange relativ aktivitet .  9 . Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ikke vaere mere end 10 % relativt .  B . VED TURBIDIMETRI  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af klortetracyklin  ( CTC ) , oxytetracyklin ( OTC ) og tetracyklin ( TC ) ved indhold paa over 1 g/kg , saafremt ingen forstyrrende ledsagesubstanser foerer til uklare ekstrakter . Denne metode er hurtigere end metoden ved diffusion i agarnaeringssubstrat .  2 . Princip  Proeven ekstraheres til bestemmelse af CTC med en blanding af acetone , vand og saltsyre og til bestemmelse af OTC og TC med en blanding af metanol og saltsyre .  Ekstrakterne fortyndes og deres antibiotiske virkning bestemmes ved maaling af transmissionen i et med Staphylococcus aureus podet naeringssubstrat , til hvilket der er sat antibiotikum . Transmissionen er en funktion af antibiotikumets koncentration .  3 . Testorganisme : Staphylococcus aureus K 141 ( 3 )  3.1 Opbevaring af stamkulturen  Et agarskraaglas af naeringssubstratet ( 4.1 ) med tilsaetning af 1,5 til 3 % agar ( alt efter kvalitet ) podes med S . aureus og inkuberes ved ca . 37 * C natten over . Derefter opbevares kulturen i koeleskab og podes hver 4 . uge over i agarskraaglas . Samtidig anlaegges subkulturer til brug i laboratoriet .  3.2 Fremstilling af podningskulturen  24 timer foer testen podes et agarskraaglas med en subkultur og inkuberes natten over ved 37 * C . Hele kulturen i et skraaglas suspenderes i ca . 2 ml af testsubstratet ( 4.1 ) og skylles derefter over i ca . 100 ml af testsubstratet ( 4.1 ) under sterile betingelser . Denne suspension inkuberes i vandbad ved 37 * C indtil stammevaeksten indtraeder i sin logaritmiske fase ( 1 1/2 til 2 timer ) .  4 . Naeringssubstrat og reagenser  4.1 Testsubstrat ( 1 )  Pepton * 5 g *  Gaerekstrakt * 1,5 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Natriumklorid * 3,5 g *  Glukose * 1,0 g *  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 1,32 g *  Dikaliumfosfat K2HPO4 p.a . * 3,68 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Efter sterilisation pH 6,8 til 7,0  4.2 Fosfatstoedpudeoploesning , pH 4,5  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 13,6 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.3 0,1 N saltsyre  4.4 Blanding af acetone , ren/vand/saltsyre  ( mf . 1,19 ) : 65/33/2 i vol .  4.5 Blanding af metanol , ren/saltsyre ( mf . 1,19 ) : 98/2 i vol .  4.6 Formaldehydoploesning ca . 10 % ( w/v )  4.7 Standardpraeparater : CTC , OTC , TC , hvis aktivitet angives som hydroklorid .  5 . Standardoploesning  Med saltsyre ( 4.3 ) fremstilles der af standardpraeparatet  ( 4.7 ) en stamoploesning , hvis koncentration svarer til 400 til 500 mg CTC-HCl , OTC-HCl eller TC-HCl pr . ml . Denne oploesning er holdbar 1 uge i koeleskab .  6 . Ekstraktion  6.1 Klortetracyklin  En proeve paa 1 til 2 g bringes sammen med ca . 100 ml af blandingen ( 4.4 ) i en 200 eller 250 ml maalekolbe og rystes 30 minutter paa et rystebord . Derpaa fortyndes der til maerket med fosfatstoedpudeoploesning pH 4,5 ( 4.2 ) , blandes og hensaettes til bundfaeldning .  6.2 Oxytetracyklin og tetracyklin  En proeve paa 1 til 2 g bringes sammen med ca . 100 ml af blandingen ( 4.5 ) i en 200 eller 250 ml maalekolbe og rystes 30 minutter paa et rystebord . Derpaa fortyndes der til maerket med fosfatstoedpudeoploesning pH 4,5 ( 4.2 ) , blandes og hensaettes til bundfaeldning .  7 . Testmetode  7.1 Fremstilling af standard - og ekstraktserier  Standardoploesningen ( 5 ) og ekstraktoploesningen ( 6 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesning pH 4,5  ( 4.2 ) saaledes , at man faar en serie af fortyndinger . For hver bestemmelse opstilles der paa basis af den paagaeldende fortynding en standardkurve , som mindst tillader interpolationen af 2 maalevaerdier for ekstraktoploesningen . Fortyndingerne vaelges efter stammens vaekstbetingelser . Disse betingelser kan vaere forskellige i de enkelte laboratorier . Normalt anvendes foelgende fremgangsmaade :  7.1.1 Klortetracyklin  Standardoploesningen ( 5 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) for at faa en arbejdsstandardoploesning , hvis koncentration svarer til 0,2 mg CTC-HCl pr . ml . Derpaa tilberedes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) 6 fortyndinger i testglas med en gentagelse for hver fortynding som foelger :  ml arbejds-standardoploesning * ml fosfatstoedpudeoploesning ( 4.2 ) * CTC-HCl koncentration  ( mg/ml ) *  0,7 * 0,3 * 0,14 *  0,6 * 0,4 * 0,12 *  0,55 * 0,45 * 0,11 *  0,45 * 0,55 * 0,09 *  0,4 * 0,6 * 0,08 *  0,3 * 0,7 * 0,06 *  Ekstrakten ( 6.1 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) til en formodet koncentration af CTC-HCl paa 0,12 mg/ml . Dermed paafyldes 2 glas med hver 1 ml og 2 andre glas med hver 0,75 ml ( = 0,09 mg ) , og volumenet i de 2 sidste glas suppleres til 1 ml med fosfatstoedpudeoploesningen  ( 4.2 ) .  7.1.2 Oxytetracyklin og tetracyklin  Standardoploesningen ( 5 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) for at faa en arbejdsstandardoploesning , hvis koncentration svarer til 0,6 mg OTC-HCl eller TC-HCl pr . ml . Derpaa tilberedes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) 7 fortyndinger i testglas med en gentagelse for hver fortynding som foelger :  ml arbejdsstandardoploesning * ml fosfatstoedpudeoploesning ( 4.2 ) * OTC-HCl eller TC-HCl ( mg/ml ) *  0,9 * 0,1 * 0,54 *  0,8 * 0,2 * 0,48 *  0,7 * 0,3 * 0,42 *  0,6 * 0,4 * 0,36 *  0,4 * 0,6 * 0,24 *  0,3 * 0,7 * 0,18 *  0,2 * 0,8 * 0,12 *  Ekstrakten ( 6.2 ) fortyndes med fosfatstoedpudeoploesningen ( 4.2 ) til en formodet koncentration af OTC-HCl eller TC-HCl paa 0,48 mg/ml . Dermed paafyldes 2 glas med hver 1 ml og 2 andre glas med hver 0,5 ml ( = 0,24 mg ) og rumfanget i de 2 sidste glas suppleres til 1 ml med fosfatstoedpudeoploesningen  ( 4.2 ) .  7.2 Podning af naeringssubstratet  Testsubstratet ( 4.1 ) podes med kulturen ( 3.2 ) saaledes , at der ved 590 mm og med en 5-cm-kuvette opnaas en transmission paa 85 % og med en 2-cm-kuvette en transmission paa 92 % , idet fotometeret indstilles til 100 % transmission med det upodede testsubstrat ( 4.1 ) .  7.3 Podning  I hvert testglas ( 7.1.1 eller 7.1.2 ) fyldes der 9 ml podet substrat ( 7.2 ) . Paafyldningen skal ske saa vidt muligt uden forureninger , men ikke noedvendigvis under sterile forhold .  7.4 Inkubation  Inkubationen sker obligatorisk i et vandbad , som ved konstant bevaegelse holdes paa en temperatur paa 37 * C mere eller mindre 0,1 * C . Inkubationstiden vaelges saaledes , at den tillader fremstilling af transmissionskurver med en for noejagtige maalinger egnet stigning ( normalt 2 1/2 til 3 timer ) . Derefter sproejtes hvert af glassene med 1 ml formaldehydoploesning  ( 4.6 ) for at stoppe vaeksten .  7.5 Maaling af vaeksten  Transmissionen maales ved 590 mm , idet fotometeret indstilles paa 100 % transmission med den klareste standardoploesning ( svarende til den hoejeste koncentration af antibiotika ) . Paa grund af de ringe turbiditetsdifferencer for de enkelte glas anbefales det at benytte mindst 2-cm-kuvetter , eller bedre endnu - 5-cm-kuvetter .  8 . Beregning af resultaterne  Standardkurven fremstilles grafisk paa millimeterpapir , idet fotometriske transmissioner og koncentrationer af antibiotikum indfoeres over for hinanden . Ekstraktens transmissionsvaerdier interpoleres paa standardkurver og proevens indhold af antibiotikum beregnes .  9 . Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved en og samme proeve ikke vaere mere end 10 % ,  3 . BESTEMMELSE AF OLEANDOMYCIN   - VED DIFFUSION I AGARNAERINGSSUBSTRAT -  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af oleandomycin i foderstoffer , koncentrater og forblandinger , ogsaa ved tilstedevaerelse af tetracykliner . Den laveste graense for bestemmeligheden andrager 0,5 ppm .2 . Princip  Proeven ekstraheres med en fortyndet metanolisk tris-(hydroxymetyl ) aminometan-oploesning . Efter centrifugering fortyndes ekstraten og dens antibiotiske aktivitet bestemmes ved maaling af oleandomycinets diffusin i et med B . cereus podet agarnaeringssubstrat . Diffusionen paavises ved hjaelp af de opstaaende haemningszoner med testorganismen . Diameteren af disse haemningszoner er direkte proportional med logaritmen til koncentrationen af antibiotikumet .  3 . Testorganisme : B . cereus K 250 TR ( 4 )  ( tetracyklinresistent )  3.1 Opbevaring af stamkulturen  Et agarskraaglas af naeringssubstratet ( 4.1 ) , som indeholder 100 mg oxytetracyklin , podes med B . cereus og inkuberes ved ca . 30 * C natten over .  Derefter opbevares kulturen i koeleskab og podes hver 4 . uge over i agarskraaglas .  3.2 Fremstilling af sporesuspensionen  Et agarskraaglas ( 3.1 ) opslaemmes med ca . 3 ml fysiologisk kogsaltoploesning ( 4.3 ) . Med denne suspension podes en Roux-kolbe , som indeholder 300 ml af naeringssubstratet ( 4.1 ) , men med en agarkoncentration paa 3-4 % . Efter en inkubationstid paa 3 til 5 dage ved 28 til 30 * C opslaemmes kimene efter endt sporolering , som kontrolleres mikroskopisk , med 15 ml ethanol og homogeniseres . Denne suspension er holdbar mindst 5 maaneder ved opbevaring i koeleskab .  Ved hjaelp af forsoegsplader med testsubstratet  ( 4.2 ) findes den podningsmaengde , som giver de stoerst mulige , men stadig skarpe haemningszoner med de forskellige anvendte koncentrationer af oleandomycin . Den andrager normalt 0,1 til 0,2 ml/1000 ml . Podningen af naeringssubstratet skal ske ved 60 * C .  4 . Naeringssubstrater og reagenser  4.1 Kultursubstrat ( 1 )  Glukose * 1 g *  Pepton , tryptisk fordoejet * 10 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Gaerekstrakt * 3 g *  Agar , alt efter kvalitet * 10-20 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Indstilles foer brugen til pH 6,5 .  4.2 Testsubstrat ( 1 )  Substrat ( 4.1 ) indstillet til pH 8,8 .  4.3 Fysiologisk kogsaltoploesning , steril .  4.4 Ethanol 20 % ( v/v ) .  4.5 Metanol , ren .  4.6 Tris ( hydroxymetyl)-aminometan-oploesning p.a . 0,5 % ( w/v ) .  4.7 Ekstraktionsoploesning  Metanol , ren * 50 ml *  Destilleret vand * 50 ml *  Tris ( hydroxymetyl)-aminometan p.a . * 0,5 g *  4.8 Standardpraeparat : Oleandomycin med kendt aktivitet .  5 . Standardoploesninger  En maengde af standardpraeparatet ( 4.8 ) oploeses i 5 ml metanol ( 4.5 ) og fortyndes med oploesningen  ( 4.6 ) for at faa en koncentration af oleandomycin paa 100 mg/ml .  Af denne stamoploesning fremstilles der ved fortynding med oploesningen ( 4.6 ) en arbejdsstandardoploesning S8 , som indeholder 0,1 mg/ml oleandomycin . Derefter fremstilles nedenstaaende koncentrationer med oploesningen ( 4.6 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) :  S4 * 0,05 mg/ml *  S2 * 0,025 mg/ml *  S1 * 0,0125 mg/ml *  6 . Ekstraktion  Baseret paa det formodede indhold af oleandomycin i proeven blandes en afvejet stofmaengde paa 2 til 10 g med 100 ml af oploesningen ( 4.7 ) , og der rystes 30 minutter paa et rystebord .  Efter centrifugering udtages en aliquot del af ekstrakten og fortyndes med oploesningen ( 4.6 ) for at opnaa en formodet koncentration af oleandomycin paa 0,1 mg/lm  ( = U8 ) . Umiddelbart herefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 med oploesningen  ( 4.6 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger  ( 1 + 1 ) .  7 . Testmetode  7.1 Podning af naeringssubstratet  Sporesuspensionen ( 3.2 ) podes ud paa testsubstratet  ( 4.2 ) ved 60 * C .  7.2 Fremstilling af pladerne  Testen saettes an som diffusionstest paa plader med hver 4 koncentrationstrin af standardoploesningen  ( S8 , S4 , S2 , S1 ) og ekstraktet ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Hver plade skal ubetinget indeholde alle koncentrationer af standard og proeve .  Derfor skal pladerne have en saadan stoerrelse , at der kan udstanses mindst 8 huller i substratlaget . Huldiameteren skal vaere 10 til 13 mm . Den podede substratmaengde ( 7.1 ) skal vaere beregnet saaledes , at man faar et ensartet lag paa ca . 2 mm tykkelse . Testen boer fortrinsvis udfoeres paa plader , som er fremstillet ved hjaelp af en glasplade , hvorpaa der laegges en plandrejet aluminiums - eller kunststofring med 20 mm hoejde og 20 mm diameter .  I hullerne afpipetteres noeje afmaalte maengder af antibiotikaoploesningen , mellem 0,10 og 0,15 ml alt efter hullernes diameter .  For hver proeve gentages paafyldningen af hver koncentration mindst 4 gange , saaledes at der pr . paasaetning for hver proeve kan bedoemmes 32 haemningszoner .  7.3 Inkubation  Der inkuberes i ca . 18 timer ved 28 til 30 * C .  8 . Bedoemmelse  Haemningszonernes diameter maales fortrinsvis ved projektion . Maalingerne indtegnes paa semilogaritmepapir , idet logaritmen til koncentrationerne indfoeres over for haemningszonernes diameter . Baade for standarden og for ekstrakten traekkes lige linjer . Ved en test med ukompliceret forloeb skal de to lige linjer vaere parallelle .  Logaritmen til den relative aktivitet udregnes efter foelgende formel :   ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) * 0,602 / U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2  Faktisk aktivitet = formodet aktivitet gange relativ aktivitet .  9 . Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ikke vaere mere end 10 % .  4 . BESTEMMELSE AF TYLOSIN   - VED DIFFUSION I AGARNAERINGSSUBSTRAT -  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af tylosin i foderstoffer , koncentrater og forblandinger . Den laveste graense for bestemmeligheden andrager 2 ppm .  2 . Princip  Proeven behandles med en til 80 * C opvarmet fosfatstoedpudeoploesning pH 8 og ekstraheres derefter med metanol . Efter centrifugering fortyndes ekstrakten , og dens antibiotiske aktivitet bestemmes ved maaling af tylosinets diffusion i et med Sarcina lutea podet agarnaeringssubstrat . Diffusionen paavises ved hjaelp af de opstaaende haemningszoner med testorganismen . Diameteren af disse haemningszoner er direkte proportional med logaritmen til koncentrationen .  3 . Testorganisme : Sarcina lutea ATCC 9341  3.1 Opbevaring af stamkulturen  Et agarskraaglas af naeringssubstratet ( 4.1 ) indstilles til pH 7,0 , podes med Sarcina lutea og inkuberes ved ca . 35 * C natten over . Derefter opbevares kulturen i koeleskab og podes 1 gang om maaneden over i agarskraaglas .  3.2 Fremstilling af kimsuspensionen  Et agarskraaglas ( 3.1 ) opslaemmes med 2 til 3 ml steril , friskfremstillet kogsaltoploesning ( 4.4 ) . Med denne suspension podes en Roux-kolbe , som indeholder 250 ml af substratet ( 4.1 ) pH 7,0 . Efter en inkubationstid paa 24 timer ved 35 * C opslaemmes kimene med 25 ml fysiologisk kogsaltoploesning  ( 4.4 ) og homogeniseres . Denne suspension fortyndes for at opnaa en transmission ved 650 mm paa ca . 75 % . Denne suspension er holdbar 1 uge ved opbevaring i koeleskab .  Ved hjaelp af forsoegsplader med testsubstratet ( 4.1 ) findes den podningsmaengde , som giver de stoerst mulige men endnu skarpe haemningszoner med de forskellige anvendte koncentrationer af tylosin . Udpodningen paa substratet skal ske ved en temperatur paa mellem 48 og 50 * C .  4 . Naeringssubstrat og reagenser  4.1 Testsubstrat ( 1 )  Glukose * 1 g *  Pepton , tryptisk fordoejet * 10 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Gaerekstrakt * 3 g *  Agar , alt efter kvalitet * 10-20 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Til opbevaring af stamkulturen og fremstilling af kimsuspensionen indstillede til pH 7,0 til bestemmelsen justeres til pH 8,0 .  4.2 Fosfatstoedpudeoploesning , pH 8  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 0,523 g *  Dikaliumfosfat K2HPO4 p.a . * 16,730 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.3 Fosfatstoedpudeoploesning , pH 7  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 5,5 g *  Dikaliumfosfat K2HPO4 p.a . * 13,6 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.4 Fysiologisk kogsaltoploesning , steril  4.5 Metanol , ren  4.6 Metanol 40 % ( v/v )  4.7 Blanding af fosfatstoedpudeoploesning ( 4.2 ) og metanol , ren : 60/40 i vol .  4.8 Standardpraeparat : Tylosin med kendt aktivitet .  5 . Standardoploesninger  Standardpraeparatet ( 4.8 ) toerres 3 timer ved 60 * C i vakuumtoerreskabet ved 5 mm Hg . En afvejet stofmaengde paa 10 til 50 mg oploeses med 5 ml metanol  ( 4.5 ) i en maalekolbe og fortyndes derpaa med fostfatstoedpudeoploesningen pH 7 ( 4.3 ) for at opnaa en koncentration af tylosin base paa 1000 mg/ml .  Af denne stamoploesning fremstilles der ved fortynding med blandingen ( 4.7 ) en arbejdsstandardoploesning S8 , som indeholder 2 mg tylosin base/ml . Herefter fremstilles nedenstaaende koncentrationer med blandingen ( 4.7 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) :  S4 * 1 mg/ml *  S2 * 0,5 mg/ml *  S1 * 0,25 mg/ml *  6 . Ekstraktion  Der afvejes ved koencentrater 10 g ved forblandinger og foderblandinger 20 g . Den afvejede stofmaengde opslaemmes med 60 ml fosfatstoedpudeoploesning pH 8 ( 4.2 ) opvarmet til 80 * C og homogeniseres 2 minutter ( koekkenmaskine , Ultra-Turrax etc . ) .  Efter henstand i 10 minutter tilsaettes 40 ml metanol ( 4.5 ) og der homogeniseres paa ny i 5 minutter . Ekstrakten centrifugeres og en aliquot del fortyndes med blandingen ( 4.7 ) for at opnaa en formodet koncentration af tylosin paa 2 mg/ml ( = U8 ) . Umiddelbart herefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 med blandingen ( 4.7 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) .  Ved indhold paa under 10 ppm inddampes ekstrakten ved 35 * C til toerhed i en rotationsfordamper og opslaemmes med metanol 40 % ( 4.6 ) .  7 . Testmetode  7.1 Podning af naeringssubstratet  Kim-suspensionen ( 3.2 ) udpodes paa det til pH 8,0 justerede testsubstrat ( 4.1 ) ved 48 til 50 * C .  7.2 Fremstilling af pladerne  Testen saettes an som diffusionstest paa plader med hver 4 koncentrationstrin af standardoploesningen  ( S8 , S4 , S2 , S1 ) og ekstraktet ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Hver plade skal ubetinget indeholde alle 4 koncentrationer af standard og proeve .  Derfor skal pladerne have en saadan stoerrelse , at der kan udstanses mindst 8 huller i substratlaget . Huldiameteren skal vaere 10 til 13 mm . Den podede substratmaengde ( 7.1 ) skal vaere beregnet saaledes , at man faar et ensartet lag paa ca . 2 mm tykkelse . Testen boer fortrinsvis udfoeres paa plader , som er fremstillet ved hjaelp af en glasplade , hvorpaa der laegges en plandrejet aluminiums - eller kunststofring med 20 mm hoejde og 200 mm diameter .  I hullerne afpipetteres noeje afmaalte maengder af antibiotikaoploesningen , mellem 0,10 og 0,15 ml alt efter hullernes diameter .  For hver proeve gentages paafyldningen af hver koncentration mindst 4 gange , saaledes at der pr . paasaetning for hver proeve kan bedoemmes 32 haemningszoner .  7.3 Inkubation  Der inkuberes natten over ved 35 til 37 * C .  8 . Bedoemmelse  Haemningszonernes diameter maales fortrinsvis ved projektion . Maalingerne indtegnes paa semilogaritmepapir , idet logaritmen til koncentrationen indfoeres over for diameteren af haemningszonerne . Baade for standarden og for ekstrakten traekkes lige linjer . Ved en test med ukompliceret forloeb skal de to lige linjer vaere parallelle . - Logaritmen til den relative aktivitet udregnes efter foelgende formel :   ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) * 0,602 / U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2  Faktisk aktivitet = formodet aktivitet gange relativ aktivitet .  9 . Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ikke vaere mere end 10 % .  5 . BESTEMMELSE AF VIRGINIAMYCIN   - VED DIFFUSION I AGARNAERINGSSUBSTRAT -  1 . Formaal og anvendelsesomraade  Metoden tillader bestemmelse af virginiamycin i foderstoffer , koncentrater og forblandinger . Den laveste graense for bestemmeligheden andrager 2 ppm .  2 . Princip  Proeven ekstraheres med en metanolisk Tween-80 oploesning . Efter centrifugering eller filtrering fortyndes ekstrakten og dens antibiotiske aktivitet bestemmes ved maaling af virginiamycinets diffusion i et med Sarcina * tea podet agarnaeringssubstrat . Diffusionen paavises ved hjaelp af de opstaaende haemningszoner med testorganismen . Diameteren af disse haemningszoner er direkte proportional med logaritmen til koncentrationen .  3 . Testorganisme : Sarcina lutea ATCC 9341  3.1 Opbevaring af stamkulturen  Et agarskraaglas af testsubstratet ( 4.1 ) podes med S . lutea og inkuberes ved ca . 35 * C natten over . Derefter opbevares kulturen i koeleskab og podes hver 14 . dag over i agarskraaglas .  3.2 Fremstilling af kim-suspensionen  Et agarskraaglas ( 3.1 ) opslaemmes med 2 til 3 ml steril , friskfremstillet kogsaltoploesning ( 4.3 ) . Med denne suspension podes en Roux-kolbe , som indeholder 250 ml af substratet ( 4.1 ) . Efter en inkubationstid paa 24 timer ved 35 * C opslaemmes kimene med 25 ml fysiologisk kogsaltoploesning ( 4.3 ) og homogeniseres . Denne suspension fortyndes for at opnaa en transmission ved 650 mm paa ca . 75 % . Denne suspension er holdbar 1 uge ved opbevaring i koeleskab .  Ved hjaelp af forsoegsplader med testsubstratet ( 4.1 ) findes den podningsmaengde , som giver de stoerst mulige , men stadig skarpe haemningszoner med de forskellige anvendte koncentrationer af virginiamycin . Podningen af naeringssubstratet skal ske ved en temperatur paa mellem 48 og 50 * C .  4 . Naeringssubstrat og reagenser  4.1 Testsubstrat ( 1 )  Glukose * 1 g *  Pepton , tryptisk fordoejet * 10 g *  Koedekstrakt * 1,5 g *  Gaerekstrakt * 3 g *  Agar , alt efter kvalitet * 10-20 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  Foer brugen justeres til pH 6,5 .  4.2 Fosfatstoedpudeoploesning , pH 6  Monokaliumfosfat KH2PO4 p.a . * 8,0 g *  Dikaliumfosfat K2HPO4 p.a . * 2,0 g *  Destilleret vand ad * 1000 ml *  4.3 Fysiologisk kogsaltoploesning , steril .  4.4 Metanol , ren .  4.5 Blanding af fosfatstoedpudeoploesning ( 4.2 ) og metanol , ren : 80/20 i vol .  4.6 Metanolisk Tween-80-oploesning 0,5 % ( w/v ) .  4.7 Standardpraeparat : Virginiamycin med kendt aktivitet .  5 . Standardoploesninger  Der fremstilles en metanolisk oploesning af standardpraeparatet ( 4.7 ) , som indeholder 800 mg virginiamycin/ml . Af denne stamoploesning fremstilles der ved fortynding med blandingen ( 4.5 ) en arbejdsstandardoploesning S8 , som indeholder 1 mg virginiamycin/ml . Derefter fremstilles nedenstaaende koncentrationer med blandingen ( 4.5 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) :  S4 * 0,5 mg/ml *  S2 * 0,25 mg/ml *  S1 * 0,125 mg/ml *  6 . Ekstraktion  6.1 Ved indhold af virginiamycin , lige med eller under 50 ppm  Der afvejes 10 til 20 g af proeven , tilsaettes 100 ml af oploesningen ( 4.6 ) og rysses 30 minutter paa et rystebord . Derefter centrifugeres eller filtreres 20 ml af den klare oploesning udtages og inddampes i en rotationsfordamper til toerhed . Inddampningsresten opslaemmes i 20 ml eller mere af blandingen ( 4.5 ) for at opnaa en formodet koncentration af virginiamycin paa 1 mg/ml ( = U8 ) . Umiddelbart herefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 med blandingen ( 4.5 ) ved efter hinanden paafoelgende fortyndinger ( 1 + 1 ) .  6.2 Ved indhold af virginiamycin over 50 ppm  Der afvejes 1 til 10 g af proeven , tilsaettes 100 ml af oploesningen ( 4.6 ) og rystes 30 minutter paa et rystebord . Derefter centrifugeres eller filtreres og fortyndes med blandingen ( 4.5 ) for at opnaa en formodet koncentration af virginiamycin paa 1 mg/ml ( = U8 ) . Umiddelbart herefter fremstilles koncentrationerne U4 , U2 og U1 som beskrevet under 6.1 .  7 . Testmetode  7.1 Podning af naeringssubstratet  Kim-suspensionen ( 3.2 ) podes ud paa testsubstratet  ( 4.1 ) ved 48 til 50 * C .  7.2 Fremstilling af pladerne  Testen saettes an som diffusionstest paa plader med hver 4 koncentrationstrin af standardoploesningen  ( S8 , S4 , S2 , S1 ) og ekstraktet ( U8 , U4 , U2 , U1 ) . Hver plade skal ubetinget indeholde alle 4 koncentrationer af standard og proeve .  Derfor skal pladerne have en saadan stoerrelse , at der kan udstanses mindst 8 huller i substratlaget ; huldiameteren skal vaere 10 til 13 mm . Den podede substratmaengde ( 7.1 ) skal vaere beregnet saaledes , at man faar et ensartet lag paa ca . 2 mm tykkelse . Testen boer fortrinsvis udfoeres paa plader , som er fremstillet ved hjaelp af en glasplade , hvorpaa der laegges en plandrejet aluminiums - eller kunststofring med 20 mm hoejde og 200 mm diameter . I hullerne afpipetteres noeje afmaalte maengder af antibiotikaoploesningen paa mellem 0,10 og 0,15 ml , alt efter hullernes diameter .  For hver proeve gentages paafyldningen af hver koncentration mindst 4 gange , saaledes at der pr . paasaetning for hver proeve kan bedoemmes 32 haemningszoner .  7.3 Inkubation  Der inkuberes i 18 time ved 28 til 30 * C .  8 . Bedoemmelse  Haemningszonernes diameter maales fortrinsvis ved projektion . Maalingerne indtegnes paa semilogaritmepapir , idet logaritmen til koncentrationerne indfoeres over for haemningszonernes diameter . Baade for standarden og for ekstrakten traekkes lige linjer . Ved en test med ukompliceret forloeb skal de to lige linjer vaere parallelle .  Logaritmen til den relative aktivitet udregnes ved hjaelp af foelgende formel :   ( U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8 ) * 0,602 / U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2  Faktisk aktivitet = formodet aktivitet gange relativ aktivitet .  9 . Reproducerbarhed  Differencen mellem to parallelbestemmelser maa ved én og samme proeve ikke vaere mere end 10 % relativt .  ( 1 ) Ethvert naeringssubstrat , som er normal handelsvare og har tilsvarende sammensaetning , og som giver samme resultater , kan anvendes .  ( 2 ) Amldesort tjener til fremhaevelse af standardoploesningernes haemningszoner ( blaa ringe ) .  ( 3 ) Denne af LUPA , Klel , isolerede stamme har en intensivere vaekst end S . aureus ATCC 6538 P .  ( 4 ) Stamme isoleret af LUFA , Kiel .


Avis juridique important

|

31980L0780

Rådets direktiv 80/780/EØF af 22. juli 1980 om indbyrdes tilnærmelse af medlemsstaternes lovgivning om førerspejle til tohjulede motorkøretøjer, med eller uden sidevogn, og om deres montering på disse køretøjer

EF-Tidende nr. L 229 af 30/08/1980 s. 0049 - 0056 den finske specialudgave: kapitel 13 bind 10 s. 0236  den græske specialudgave: Kapitel 13 bind 9 s. 0142  den svenske specialudgave: kapitel 13 bind 10 s. 0236  den spanske specialudgave: Kapitel 13 bind 11 s. 0057  den portugisiske specialudgave: Kapitel 13 bind 11 s. 0057

++++  RAADETS DIREKTIV  af 22 . juli 1980  om indbyrdes tilnaermelse af medlemsstaternes lovgivning om foererspejle til tohjulede motorkoeretoejer , med eller uden sidevogn , og om deres montering paa disse koeretoejer   ( 80/780/EOEF )  RAADET FOR DE EUROPAEISKE FAELLESSKABER HAR -  under henvisning til traktaten om oprettelse af Det europaeiske oekonomiske Faellesskab , saerlig artikel 100 ,  under henvisning til forslag fra Kommissionen ,  under henvisning til udtalelse fra Europa-Parlamentet ( 1 ) ,  under henvisning til udtalelse fra Det oekonomiske og sociale Udvalg ( 2 ) , og  ud fra foelgende betragtninger :  De tekniske forskrifter , som tohjulede koeretoejer skal opfylde i henhold til den nationale lovgivning , omfatter bl.a . foererspejle ;  disse forskrifter , hvad enten de er i kraft eller under overvejelse , varierer fra medlemsstat til medlemsstat ; der opstaar derfor hindringer for samhandelen , som boer fjernes ved , at alle medlemsstater indfoerer samme forskrifter , enten ved at supplere eller ved at aendre deres nuvaerende bestemmelser ;  baade antallet og brugen af tohjulede koeretoejer oeges ; det er derfor noedvendigt , at disse koeretoejer er forsynet med et eller to foererspejle , som muliggoer udsyn bagud og til siderne ;  ved en indbyrdes tilpasset fremgangsmaade for komponenttypegodkendelse af disse foererspejle kan den enkelte medlemsstat konstatere , om de faelles bestemmelser for fabrikation og afproevning er overholdt , og underrette de oevrige medlemsstater herom ved fremsendelse af en genpart af det EOEF-typegodkendelsesskema , der udstedes for hver type foererspejl ; ved anbringelse af et EOEF-komponenttypegodkendelsesmaerke paa alle spejle , der fremstilles i overensstemmelse med den godkendte type , overfloediggoeres en teknisk kontrol af disse spejle i de oevrige medlemsstater -  UDSTEDT FOELGENDE DIREKTIV :  Artikel 1  1 . Den enkelte medlemsstat meddeler komponenttypegodkendelse for enhver type foererspejle , der er bestemt til de i artikel 7 omhandlede koeretoejer , saafremt de er i overensstemmelse med forskrifterne for fabrikation og afproevning i bilag I .  2 . Den medlemsstat , der har meddelt EOEF-komponenttypegodkendelse , traeffer - om noedvendigt i samarbejde med de kompetente myndigheder i de oevrige medlemsstater - de noedvendige foranstaltninger med henblik paa om fornoedent at kontrollere , om produktionen er i overensstemmelse med den godkendte type . Kontrollen udoeves ved stikproever .  Artikel 2  Medlemsstaterne tildeler fabrikanten eller dennes befuldmaegtigede et EOEF-typegodkendelsesmaerke som vist i tillaegget til bilag I for enhver type foererspejle , som de i medfoer af artikel 1 meddeler typegodkendelse for .  Medlemsstaterne traeffer alle fornoedne foranstaltninger for at hindre , at der anvendes godkendelsesmaerker , der kan medfoere , at forerspejle , for hvis type der er meddelt typegodkendelse i medfoer af artikel 1 , forveksles med andre foererspejle .  Artikel 3  1 . Medlemsstaterne kan ikke forbyde salg af foererspejle under henvisning til deres fabrikation eller funktion , naar de er forsynet med EOEF-typegodkendelsesmaerke .  2 . Denne bestemmelse er dog ikke til hinder for , at en medlemsstat traeffer saadanne foranstaltninger vedroerende foererspejle med EOEF-typegodkendelsesmaerke , der systematisk afviger fra den godkendte type .  Den paagaeldende medlemsstat underretter omgaaende de oevrige medlemsstater og Kommissionen om de trufne foranstaltninger og begrunder samtidig sin beslutning . Artikel 5 finder ligeledes anvendelse .  Der foreligger uoverensstemmelse med den typegodkendte type i henhold til foerste afsnit , naar forskrifterne i bilag I ikke er overholdt .  Artikel 4  De kompetente myndigheder i den enkelte medlemsstat fremsender inden en maaned til de kompetente myndigheder i de oevrige medlemsstater genparter af EOEF-typegodkendelsesskemaerne for de foererspejlstyper , som de meddeler eller afslaar typegodkendelse for .  Artikel 5  1 . Konstaterer en medlemsstat , der har meddelt en EOEF-typegodkendelse , at flere foererspejle med det samme EOEF-typegodkendelsesmaerke ikke er i overensstemmelse med den type , den har meddelt typegodkendelse for , traeffer den de noedvendige foranstaltninger for at sikre , at produktionen bringes i overenstemmelse med den godkendte type . De kompetente myndigheder i den paagaeldende medlemsstat underretter de kompetente myndigheder i de oevrige medlemsstater om de trufne foranstaltninger , der eventuelt vil kunne omfatte inddragelse af EOEF-typegodkendelsen . Disse myndigheder traeffer de samme foranstaltninger , naar de af de kompetente myndigheder i en anden medlemsstat underrettes om en saadan manglende overensstemmelse .  2 . De kompetente myndigheder i medlemsstaterne skal inden en maaned underrette hinanden om inddragelse af en meddelt EOEF-typegodkendelse og om grundene hertil .  3 . Bestrider den medlemsstat , der har meddelt EOEF-typegodkendelsen , rigtigheden af den til den indberettede manglende overensstemmelse , skal de paagaeldende medlemsstater bestraebe sig paa at bilaegge uoverensstemmelsen . Kommissionen holdes loebende underrettet herom og foranstalter om fornoedent konsultationer med henblik paa at naa frem til en loesning .  Artikel 6  Enhver afgoerelse truffet paa grundlag af de til gennemfoerelse af dette direktiv udstedte bestemmelser , hvorved en typegodkendelse afslaas eller inddrages , eller hvorved der udstedes forbud mod salg eller brug , skal noeje begrundes . Saadanne afgoerelser skal meddeles de interesserede parter med oplysning om de i medlemsstaterne gaeldende retsmidler og fristerne for disses anvendelse .  Artikel 7  Ved koeretoej forstaas i dette direktiv ethvert motordrevet tohjulet koeretoej , med eller uden sidevogn , der er bestemt til koersel paa vej , og hvis stoerste konstruktivt bestemte hastighed overstiger 25 km/t .  Artikel 8  I dette direktiv forstaas ved " national standardtypegodkendelse " den administrative handling , der benaevnes :   - agréation par type/aanneming i den belgiske lovgivning ,   - standardtypegodkendelse i den danske lovgivning ,   - allgemeine Betriebserlaubnis i den tyske lovgivning ,   - réception par type i den franske lovgivning ,   - type approval i den irske lovgivning ,   - omologazione eller approvazione del tipo i den italienske lovgivning ,   - agréation i den luxembourgske lovgivning ,   - typegoedkeuring i den nederlandske lovgivning ,   - type approval i Det forenede Kongeriges lovgivning .  Artikel 9  1 . Paa begaering af en fabrikant eller dennes befuldmaegtigede kontrollerer den enkelte medlemsstat , at en koeretoejstype opfylder forskrifterne i bilag II . For den samme koeretoejstype kan der kun indgives begaering til en enkelt medlemsstat .  2 . Efter kontrollen udsteder medlemsstaten efter modellen i tillaegget til bilag II en attest paa , at koeretoejet er forsynet med foererspejle , i det foelgende benaevnt " attest " , hvori det saerlig anfoeres , om den paagaeldende koeretoejstype opfylder forskrifterne i dette direktiv .  3 . Den medlemsstat , der har udstedt attesten paa , at en koeretoejstype er i overensstemmelse med dette direktiv , traeffer - for saa vidt det er noedvendigt og om fornoedent i samarbejde med de oevrige medlemsstaters kompetente myndigheder - de noedvendige foranstaltninger til kontrol af , om produktionen er i overensstemmelse med den type , der er beskrevet i attesten . Denne kontrol foretages ved stikproever .  Artikel 10  De kompetente myndigheder i den enkelte medlemsstat sender inden en maaned de kompetente myndigheder i de oevrige medlemsstater en genpart af attesterne for hver koeretoejstype , som de har kontrolleret . En genpart af attesten gives desuden til den , som har fremsat begaeringen . De oevrige medlemsstater godkender dette dokument som bevis for , at forskrifterne i dette direktiv er overholdt .  Artikel 11  1 . I medlemsstater , hvor der foretages national standardtypegodkendelse af koeretoejer eller af bestemte kategorier af koeretoejer , skal forskrifterne i dette direktiv paa begaering af fabrikanten eller dennes befuldmaegtigede anvendes som grundlag for en national standardtypegodkendelse i stedet for de tilsvarende nationale forskrifter .  2 . I medlemsstater , hvor der ikke foretages national standardtypegodkendelse af koeretoejer eller af bestemte kategorier af koeretoejer , kan registrering ikke afslaas og salg , ibrugtagning eller brug af disse koeretoejer ikke forbydes under henvisning til , at forskrifterne i dette direktiv er blevet overholdt i stedet for de tilsvarende nationale forskrifter .  Artikel 12  1 . Den medlemsstat , der har udstedt attesten paa , at en koeretoejstype er i overensstemmelse med forskrifterne i dette direktiv , traeffer de noedvendige foranstaltninger for at holde sig underrettet om enhver aendring af denne koeretoejstype eller om standsning af produktionen .  2 . Skoenner den paagaeldende stat , at en saadan aendring ikke medfoerer nogen aendring af grundlaget for udstedelsen af attesten , giver denne stats kompetente myndigheder fabrikanten eller dennes befuldmaegtigede meddelelse herom .  3 . Fastslaar den paagaeldende stat derimod , at en aendring kraever ny kontrol og dermed en aendring af den gaeldende attest eller udstedelse af en ny attest , giver denne stats kompetente myndigheder fabrikanten eller dennes befuldmaegtigede meddelelse herom og sender inden en maaned efter udfaerdigelsen af de nye dokumenter disse til de kompetente myndigheder i de oevrige medlemsstater tillige med stelnummeret paa det sidste koeretoej , der er produceret i overenstemmelse med den gamle attest , samt eventuelt stelnummeret paa det foerste koeretoej , der er produceret i overensstemmelse med den aendrede eller den nye attest .  Artikel 13  De aendringer , som er noedvendige for at tilpasse forskrifterne i bilagene til den tekniske udvikling , vedtages efter fremgangsmaaden i artikel 13 i Raadets direktiv 70/156/EOEF af 6 . februar 1970 om tilnaermelse af medlemsstaternes lovgivning om godkendelse af motordrevne koeretoejer og paahaengskoeretoejer dertil ( 3 ) , senest aendret ved direktiv 78/547/EOEF ( 4 ) .  Artikel 14  1 . Medlemsstaterne saetter de noedvendige bestemmelser i kraft for at efterkomme dette direktiv inden for en frist paa atten maaneder fra dets meddelelse . De underretter straks Kommissionen herom .  2 . Medlemsstaterne meddeler Kommissionen teksten til de vigtigste nationale retsforskrifter , som de udsteder paa det omraade , der er omfattet af dette direktiv .  Artikel 15  Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne .  Udfaerdiget i Bruxelles , den 22 . juli 1980 .  Paa Raadets vegne  G . THORN  Formand  ( 1 ) EFT nr . C 197 af 4 . 8 . 1980 , s . 66 .  ( 2 ) EFT nr . C 182 af 21 . 7 . 1980 , s . 2 .  ( 3 ) EFT nr . L 42 af 23 . 2 . 1970 , side 1 .  ( 4 ) EFT nr . L 168 af 26 . 6 . 1978 , side 39 .  BILAG I  FORSKRIFTER VEDROERENDE EOEF-KOMPONENTTYPEGODKENDELSE AF FOERERSPEJLE  1 . Foererspejle paa de i dette direktiv omhandlede koeretoejer skal svare til forskrifterne vedroerende EOEF-komponenttypegodkendelse i Raadets direktiv 71/127/EOEF af 1 . marts 1971 om tilnaermelse af medlemsstaternes lovgivning om foererspejle til motordrevne koeretoejer ( 1 ) , som aendret ved direktiv 79/795/EOEF ( 2 ) ,  1.1 . Foererspejlklasse omhandlet i dette direktiv  Foererspejlene henfoeres i klasse L , som EOEF-typegodkendes i henhold til punkt 1.2 .  1.2 . EOEF-typegodkendelse af foererspejle i klasse L  Foererspejle i klasse L typegodkendes efter forskrifterne for foererspejle i klasse III , dog med forbehold af foelgende forskrifter :  1.2.1 . Gennemsnittet " r " af de krummingsradier , der maales paa den reflekterende flade , maa ikke vaere mindre end 1 000 mm eller stoerre end 1 200 mm .  1.2.2 . Den reflekterende flades dimensioner skal vaere som foelger :   - paa cirkelformede foererspejle skal den reflekterende flade have en diameter paa mellem 100 og 150 mm ;   - paa andre foererspejle skal en cirkel med en diameter paa mindst 100 mm kunne indskrives i den reflekterende flades yderkanter . Den reflekterende flade skal kunne indskrives i et kvadrat med en side paa 150 mm .  ( 1 ) EFT nr . L 68 af 22 . 3 . 1971 , s . 1 .  ( 2 ) EFT nr . L 239 af 22 . 9 . 1979 , s . 1 .  1.3 . Eksempel paa EOEF-typegodkendelsesmaerke for et foererspejl af klasse L : JFR . EFT  Tillaeg  MODEL FOR EOEF-KOMPONENTTYPEGODKENDELSESSKEMA  Myndighedens navn  OPLYSNINGER OM MEDDELELSE AF , AFSLAG PAA ELLER INDDRAGELSE AF EOEF-KOMPONENTTYPEGODKENDELSE AF EN FOERERSPEJLTYPE  EOEF-typegodkendelsesnummer ...  1 . Fabriks - eller varemaerke ...  2 . Foererspejlklasse ...  3 . Fabrikantens navn og adresse ...  4 . Navn og adresse paa fabrikantens eventuelle befuldmaegtigede ...  5 . Fremstillet til EOEF-komponenttypegodkendelse den ...  6 . Teknisk tjeneste ...  7 . Proeverapportens dato og nummer ...  8 . Dato for meddelelse af/afslag paa/inddragelse af ( 1 ) EOEF-komponenttypegodkendelse ...  9 . Sted ...  10 . Dato ...  11 . Foelgende dokumenter , der er forsynet med foranstaaende EOEF-typegodkendelsesnummer , er vedlagt dette skema : ...   ( tegninger , skitser og beskrivelser af foererspejlet ) . Disse dokumenter gives til de kompetente myndigheder i de oevrige medlemsstater paa disses udtrykkelige anmodning .  12 . Eventuelle bemaerkninger ...  ... ( underskrift )  ( 1 ) Det ikke gaeldende overstreges .  BILAG II  FORSKRIFTER VEDROERENDE FOERERSPEJLES MONTERING PAA KOERETOEJER  Antal og forskrifter for montering  1 . Koeretoejer , hvis stoerste konstruktivt bestemte hastighed er hoejst 100 km/t , skal udstyres med et foererspejl med EOEF-typegodkendelsesmaerke . Dette foererspejl skal vaere anbragt paa venstre side af koeretoejet i de medlemsstater , som har hoejrekoersel , og paa koeretoejets hoejre side i de medlemsstater , som har venstrekoersel .  2 . Koeretoejer , hvis stoerste konstruktivt bestemte hastighed er stoerre end 100 km/t , skal udstyres med to foererspejle med EOEF-typegodkendelsesmaerke , et paa koeretoejets venstre side og et paa hoejre side .  3 . Foererspejle skal monteres paa en saadan maade , at deres indstilling ikke aendres under normale koerselsforhold .  4 . Foererspejlene skal vaere placeret saaledes , at foereren fra sit saede ved normal koerestilling har oversigt over koerebanen bag koeretoejet og til siderne .  5 . Foererspejlene skal kunne indstilles af foereren , naar denne sidder i koerestilling .  6 . Forskrifterne i direktiv 71/127/EOEF vedroerende synsfelt finder ikke anvendelse paa foererspejle af klasse L .  Tillaeg  MODEL  Myndighedens navn  ATTEST VEDROERENDE FOERERSPEJLE TIL TOHJULEDE MOTORKOERETOEJER   ( i henhold til Raadets direktiv 80/780/EOEF af 22 . juli 1980 om indbyrdes tilnaermelse af medlemsstaternes lovgivning om foererspejle til tohjulede koeretoejer , med eller uden sidevogn , og om deres montering paa disse koeretoejer )  Udfaerdiget paa grundlag af :  Rapport nr . ... fra teknisk tjeneste ... dato ...  1 . Koeretoej med to hjul  1.1 . Fabrikant : ...  1.1.1 . Fabrikantens eventuelle befuldmaegtigede : ...  1.2 . Type : ...  1.3 . Model : ...  1.3.1 . Version : ...  1.4 . Stelnummer : ...  2 . Motor  2.1 . Fabrikant : ...  2.2 . Type : ...  2.3 . Model : ...  2.4 . Konstruktivt bestemt maksimalhastighed hoejst/over ( 1 ) 100 km/t  3 . Foererspejl(e )  Koeretoejet er forsynet med foererspejl(e ) , der opfylder forskrifterne i direktiv 80/780/EOEF  4 . Sted : ...  5 . Dato : ...  6 . Underskrift : ...  ( 1 ) Det ikke gaeldende overstreges .