title: Směrnice Komise 2011/9/EU ze dne 1. února 2011 , kterou se mění směrnice Rady 91/414/EHS za účelem zařazení účinné látky dodin a kterou se mění rozhodnutí 2008/934/ES  Text s významem pro EHP

text:
               2.2.2011

               CS

               Úřední věstník Evropské unie

               L 28/36

         SMĚRNICE KOMISE 2011/9/EU
   ze dne 1. února 2011,
   kterou se mění směrnice Rady 91/414/EHS za účelem zařazení účinné látky dodin a kterou se mění rozhodnutí 2008/934/ES
   (Text s významem pro EHP)
   EVROPSKÁ KOMISE,
   s ohledem na Smlouvu o fungování Evropské unie,
   s ohledem na směrnici Rady 91/414/EHS ze dne 15. července 1991 o uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh (1), a zejména na čl. 6 odst. 1 uvedené směrnice,
   vzhledem k těmto důvodům:

               (1)

               Nařízení Komise (ES) č. 451/2000 (2) a (ES) č. 1490/2002 (3) stanoví prováděcí pravidla pro třetí etapu pracovního programu podle čl. 8 odst. 2 směrnice 91/414/EHS a zavádí seznam účinných látek, které mají být zhodnoceny z hlediska jejich možného zařazení do přílohy I směrnice 91/414/EHS. Uvedený seznam zahrnoval dodin.

               (2)

               V souladu s článkem 11e nařízení (ES) č. 1490/2002 žadatel stáhl svou podporu zařazení uvedené účinné látky do přílohy I směrnice 91/414/EHS do dvou měsíců od obdržení návrhu zprávy o hodnocení. Rozhodnutí Komise 2008/934/ES ze dne 5. prosince 2008 o nezařazení některých účinných látek do přílohy I směrnice Rady 91/414/EHS a o odnětí povolení pro přípravky na ochranu rostlin obsahující tyto látky se tudíž týkalo i nezařazení dodinu (4).

               (3)

               V souladu s čl. 6 odst. 2 směrnice 91/414/EHS původní oznamovatel (dále jen „žadatel“) předložil novou žádost o uplatnění zkráceného postupu stanoveného články 14 až 19 nařízení Komise (ES) č. 33/2008 ze dne 17. ledna 2008, kterým se stanoví prováděcí pravidla ke směrnici Rady 91/414/EHS, pokud jde o běžný a zkrácený postup pro posuzování účinných látek, které byly součástí pracovního programu podle čl. 8 odst. 2 uvedené směrnice, nebyly však zařazeny do její přílohy I (5).

               (4)

               Žádost byla předložena Portugalsku, které bylo nařízením (ES) č. 451/2000 jmenováno členským státem zpravodajem. Lhůta pro zkrácený postup byla dodržena. Specifikace účinné látky a doporučená použití jsou stejná jako v případě rozhodnutí 2008/934/ES. Uvedená žádost je také v souladu s ostatními hmotněprávními a procesními požadavky článku 15 nařízení (ES) č. 33/2008.

               (5)

               Portugalsko posoudilo dodatečné údaje poskytnuté žadatelem a připravilo dodatečnou zprávu. Postoupilo tuto zprávu Evropskému úřadu pro bezpečnost potravin (dále jen „úřad“) a Komisi dne 14. srpna 2009. Úřad zaslal dodatečnou zprávu ostatním členským státům a žadateli k vyjádření a obdržené připomínky postoupil Komisi. V souladu s čl. 20 odst. 1 nařízení (ES) č. 33/2008 a na žádost Komise úřad svůj závěr týkající se dodinu dne 28. května 2010 předložil Komisi (6). Návrh zprávy o hodnocení, dodatečná zpráva a závěry úřadu byly přezkoumány členskými státy a Komisí v rámci Stálého výboru pro potravinový řetězec a zdraví zvířat a dokončeny dne 23. listopadu 2010 v podobě zprávy Komise o přezkoumání dodinu.

               (6)

               Z různých provedených zkoumání vyplynulo, že přípravky na ochranu rostlin obsahující dodin mohou obecně splňovat požadavky stanovené v čl. 5 odst. 1 písm. a) a b) směrnice 91/414/EHS, zejména pokud jde o použití, která byla zkoumána a podrobně popsána ve zprávě Komise o přezkoumání. Je tedy vhodné zařadit dodin do přílohy I a zajistit tak, aby ve všech členských státech mohla být v souladu s ustanoveními uvedené směrnice udělována povolení pro přípravky na ochranu rostlin obsahující tuto účinnou látku.

               (7)

               Aniž je dotčen tento závěr, je třeba získat další informace týkající se některých zvláštních aspektů. Podle čl. 6 odst. 1 směrnice 91/414/EHS může zařazení látky do přílohy I podléhat určitým podmínkám. Je proto vhodné požadovat, aby žadatel předložil další informace, které potvrdí posouzení dlouhodobého rizika pro ptactvo a savce a posouzení rizika v systémech přírodních povrchových vod, kde se mohly vytvořit hlavní metabolity.

               (8)

               Před zařazením účinné látky do přílohy I je třeba poskytnout členským státům a zúčastněným stranám přiměřené období, které jim umožní připravit se na plnění nových požadavků, které ze zařazení vyplynou.

               (9)

               Aniž jsou dotčeny závazky stanovené směrnicí 91/414/EHS jako důsledek zařazení účinné látky do přílohy I, mělo by být členským státům po zařazení poskytnuto šestiměsíční období, ve kterém přezkoumají stávající povolení přípravků na ochranu rostlin obsahujících dodin, aby bylo zajištěno splnění požadavků stanovených směrnicí 91/414/EHS, zejména ustanovení článku 13 uvedené směrnice a příslušných podmínek stanovených v příloze I. Členské státy by měly v případě potřeby změnit, nahradit nebo odejmout stávající povolení v souladu s ustanoveními směrnice 91/414/EHS. Odchylně od výše stanovené lhůty by pro předložení a zhodnocení úplné dokumentace podle přílohy III pro každý přípravek na ochranu rostlin a pro každé určené použití mělo být v souladu s jednotnými zásadami stanovenými ve směrnici 91/414/EHS poskytnuto delší období.

               (10)

               Zkušenosti z předchozích zařazení účinných látek, zhodnocených v rámci nařízení Komise (EHS) č. 3600/92 ze dne 11. prosince 1992, kterým se stanoví prováděcí pravidla pro první etapu pracovního programu podle čl. 8 odst. 2 směrnice Rady 91/414/EHS o uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh (7), do přílohy I směrnice 91/414/EHS ukázaly, že při výkladu povinností držitelů stávajících povolení mohou vzniknout problémy, pokud jde o přístup k údajům. Aby se předešlo dalším obtížím, zdá se proto být nezbytné ujasnit povinnosti členských států, zejména povinnost ověřit, že držitel povolení má přístup k dokumentaci splňující požadavky přílohy II uvedené směrnice. Ve srovnání s dosud přijatými směrnicemi, kterými se mění příloha I, však toto ujasnění neukládá členským státům ani držitelům povolení žádné nové povinnosti.

               (11)

               Směrnice 91/414/EHS by proto měla být odpovídajícím způsobem změněna.

               (12)

               Rozhodnutí 2008/934/ES stanoví nezařazení dodinu a odejmutí povolení pro přípravky na ochranu rostlin obsahující tuto látku do 31. prosince 2011. V příloze uvedeného rozhodnutí je třeba vypustit řádek týkající se dodinu.

               (13)

               Rozhodnutí 2008/934/ES by proto mělo být odpovídajícím způsobem změněno.

               (14)

               Opatření stanovená touto směrnicí jsou v souladu se stanoviskem Stálého výboru pro potravinový řetězec a zdraví zvířat,

         PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:
   Článek 1
   Příloha I směrnice 91/414/EHS se mění v souladu s přílohou této směrnice.
   Článek 2
   V příloze rozhodnutí 2008/934/ES se vypouští řádek týkající se dodinu.
   Článek 3
   Členské státy přijmou a zveřejní právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí do 30. listopadu 2011. Neprodleně sdělí Komisi jejich znění a srovnávací tabulku mezi těmito předpisy a touto směrnicí.
   Budou tyto předpisy používat od 1. prosince 2011.
   Tyto předpisy přijaté členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí být takový odkaz učiněn při jejich úředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy.
   Článek 4
   1.   V souladu se směrnicí 91/414/EHS členské státy do 30. listopadu 2011 v případě potřeby změní nebo odejmou stávající povolení pro přípravky na ochranu rostlin obsahující účinnou látku dodin.
   Do tohoto dne zejména ověří, zda jsou splněny podmínky přílohy I uvedené směrnice týkající se dodinu, s výjimkou podmínek stanovených v části B údajů o uvedené účinné látce, a zda držitel povolení má dokumentaci či přístup k dokumentaci splňující požadavky přílohy II uvedené směrnice v souladu s podmínkami článku 13 uvedené směrnice.
   2.   Odchylně od odstavce 1 členské státy v souladu s jednotnými zásadami stanovenými v příloze VI směrnice 91/414/EHS nově zhodnotí každý povolený přípravek na ochranu rostlin obsahující dodin jako jedinou účinnou látku, nebo jako jednu z několika účinných látek, které byly všechny do 31. května 2011 uvedeny v příloze I směrnice 91/414/EHS, a to na základě dokumentace splňující požadavky přílohy III uvedené směrnice a při zohlednění části B údajů v příloze I uvedené směrnice, které se týkají dodinu. Na základě tohoto hodnocení určí, zda přípravek splňuje podmínky stanovené v čl. 4 odst. 1 písm. b), c), d) a e) směrnice 91/414/EHS.
   Po tomto určení postupují členské státy takto:

               a)

               v případě, že přípravek obsahuje dodin jako jedinou účinnou látku, povolení v případě potřeby změní nebo odejmou do 31. května; nebo

               b)

               pokud přípravek obsahuje dodin jako jednu z několika účinných látek, povolení v případě potřeby změní nebo odejmou do 31. května 2015 nebo do data stanoveného pro tuto změnu či odnětí v příslušné směrnici nebo směrnicích, jimiž se příslušná látka nebo látky zařazují do přílohy I směrnice 91/414/EHS, přičemž rozhoduje pozdější datum.

         Článek 5
   Tato směrnice vstupuje v platnost dnem 1. června 2011.
   Článek 6
   Tato směrnice je určena členským státům.

      V Bruselu dne 1. února 2011.

            Za Komisi

         José Manuel BARROSO

            předseda

      (1)  Úř. věst. L 230, 19.8.1991, s. 1.

      (2)  Úř. věst. L 55, 29.2.2000, s. 25.

      (3)  Úř. věst. L 224, 21.8.2002, s. 23.

      (4)  Úř. věst. L 333, 11.12.2008, s. 11.

      (5)  Úř. věst. L 15, 18.1.2008, s. 5.

      (6)  European Food Safety Authority; Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance dodine. EFSA Journal 2010; 8(6):1631. [54 s.]. doi:10.2903/j.efsa.2010.1631. K dispozici na internetové stránce: www.efsa.europa.eu

      (7)  Úř. věst. L 366, 15.12.1992, s. 10.

      PŘÍLOHA
      V příloze I směrnice 91/414/EHS se na konec tabulky doplňují nové údaje, které znějí:

                     Číslo

                     Obecný název, identifikační čísla

                     Název podle IUPAC

                     Čistota (1)

                     Vstup v platnost

                     Konec platnosti zařazení

                     Zvláštní ustanovení

                     „326

                     Dodin
                     č. CAS 2439-10-3

                     č. CIPAC 101

                     dodecylguanidinium-acetát

                     ≥ 950 g/kg

                     1. června 2011

                     31. května 2021

                     ČÁST A
                     Povolena mohou být pouze použití jako fungicid.
                     ČÁST B
                     Při uplatňování jednotných zásad uvedených v příloze VI musí být zohledněny závěry zprávy o přezkoumání dodinu, a zejména dodatky I a II uvedené zprávy, dokončené Stálým výborem pro potravinový řetězec a zdraví zvířat dne 23. listopadu 2010.
                     Při tomto celkovém hodnocení musí členské státy věnovat zvláštní pozornost:

                                 a)

                                 možnému dlouhodobému riziku pro ptactvo a savce,

                                 b)

                                 riziku pro vodní organismy a zajistit, že podmínky použití ukládají opatření ke zmírnění rizika,

                                 c)

                                 riziku pro necílové rostliny vyskytující se mimo ošetřovanou plochu a zajistit, že podmínky použití ukládají opatření ke zmírnění rizika,

                                 d)

                                 monitoringu limitu reziduí u jádrového ovoce.

                           Dotčené členské státy si vyžádají předložení potvrzujících informací ohledně:

                                 a)

                                 posouzení dlouhodobého rizika pro ptactvo a savce,

                                 b)

                                 posouzení rizika v systémech přírodních povrchových vod, kde se mohly vytvořit hlavní metabolity.

                           Dotčené členské státy zajistí, aby žadatel předložil Komisi tyto potvrzující informace do 31. května 2013.“

         (1)  Další podrobnosti o identitě a specifikaci účinné látky jsou uvedeny ve zprávě o přezkoumání.


title: Směrnice Komise 2002/18/ES ze dne 22. února 2002, kterou se mění příloha I směrnice Rady 91/414/EHS o uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh za účelem zařazení účinné látky isoproturon

text:
Avis juridique important

|

32002L0018

Official Journal L 055 , 26/02/2002 P. 0029 - 0032

SMĚRNICE KOMISE 2002/18/ESze dne 22. února 2002,kterou se mění příloha I směrnice Rady 91/414/EHS o uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh za účelem zařazení účinné látky isoproturonKOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství,s ohledem na směrnici Rady 91/414/EHS ze dne 15. července 1991 o uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh1, naposledy pozměněnou směrnicí Komise 2001/103/ES2, a zejména na čl. 6 odst. 1 uvedené směrnice,vzhledem k těmto důvodům:(1) Nařízení Komise (EHS) č. 3600/92 ze dne 11. prosince 1992 o prováděcích ustanoveních pro první etapu pracovního programu uvedeného v čl. 8 odst. 2 směrnice Rady 91/414/EHS o uvádění přípravků na ochranu rostlin na trh3, naposledy pozměněné nařízením (ES) č. 2266/20004, předpokládá stanovení seznamu účinných látek obsažených v přípravcích na ochranu rostlin, které mají být posouzeny s ohledem na jejich možné zařazení do přílohy I směrnice 91/414/EHS. Tento seznam je uveden v nařízení Komise (ES) č. 933/94 ze dne 27. dubna 1994, kterým se stanoví účinné látky přípravků na ochranu rostlin a jmenují členské státy zpravodajové pro provádění nařízení Komise (EHS) č. 3600/925, naposledy pozměněném nařízením (ES) č. 2230/956, a zahrnuje isoproturon.(2) Účinky isoproturonu na lidské zdraví a životní prostředí byly posuzovány v souladu s ustanoveními nařízení (EHS) č. 3600/92 pro rozsah použití navrhovaný oznamovateli. Podle nařízení (ES) č. 933/94 bylo Německo jmenováno členským státem zpravodajem. V souladu s čl. 7 odst. 1 písm. c) nařízení (EHS) č. 3600/92 předložil členský stát zpravodaj dne 30. července 1999 Komisi hodnotící zprávu a doporučení.(3) Tuto hodnotící zprávu přezkoumaly členské státy a Komise v rámci Stálého rostlinolékařského výboru. Přezkoumání bylo dokončeno dne 7. prosince 2001 formou zprávy Komise o přezkoumání isoproturonu.(4) Z přezkoumání nevyplynuly žádné nedořešené otázky nebo obavy, které by vyžadovaly konzultaci s Vědeckým výborem pro rostliny.(5) z různých provedených zkoumání vyplynulo, že přípravky na ochranu rostlin obsahující dotyčnou účinnou látku mohou obecně splňovat požadavky stanovené v čl. 5 odst. 1 písm. a) a b) směrnice 91/414/EHS, zejména pokud jde o použití, která byla zkoumána a podrobně popsána ve zprávě Komise o přezkoumání. Je tedy vhodné zařadit dotyčnou účinnou látku do přílohy I směrnice 91/414/EHS, aby bylo zajištěno, že ve všech členských státech budou povolení přípravků na ochranu rostlin obsahujících dotyčnou účinnou látku udělována podle ustanovení uvedené směrnice.(6) Po zařazení isoproturonu do přílohy I směrnice 91/414/EHS by mělo být stanoveno období, během něhož mohou členské státy udělit, změnit nebo odejmout povolení přípravků na ochranu rostlin obsahujících tuto účinnou látku. Přípravky na ochranu rostlin by zejména neměly být povoleny do doby, než budou na základě dokumentace splňující požadavky na údaje zohledněny podmínky spojené se zařazením dotyčné účinné látky do přílohy I a jednotné zásady stanovené ve směrnici.(7) Zpráva Komise o přezkoumání je nezbytná k tomu, aby členské státy správně uplatnily příslušné části jednotných zásad stanovených ve směrnici 91/414/EHS. Je tedy vhodné stanovit, aby konečné znění zprávy o přezkoumání, s výjimkou důvěrných informací, bylo trvale k dispozici u členských států nebo aby jimi bylo zpřístupněno k nahlédnutí všem zúčastněným stranám. Pokud musí být zpráva o přezkoumání aktualizována, aby byl zohledněn technický a vědecký vývoj, měly by být zároveň v souladu se směrnicí 91/414/EHS změněny podmínky pro zařazení dané účinné látky do její přílohy I.(8) Před zařazením účinné látky do přílohy I musí být stanoveno přiměřené období umožňující členským státům a zúčastněným stranám připravit se na plnění nových požadavků, které z toho vyplynou. Po zařazení účinné látky je kromě toho nezbytné stanovit přiměřené období, aby mohly členské státy provést ustanovení směrnice 91/414/EHS u přípravků na ochranu rostlin obsahujících isoproturon. Členské státy musí během tohoto období zejména přezkoumat stávající povolení a popřípadě udělit nová povolení v souladu s ustanoveními směrnice 91/414/EHS. Delší období by mělo být stanoveno pro předložení a posouzení úplné dokumentace každého přípravku na ochranu rostlin v souladu s jednotnými zásadami uvedenými ve směrnici 91/414/EHS. U přípravků na ochranu rostlin obsahujících několik účinných látek může být úplného vyhodnocení na základě jednotných zásad provedeno až tehdy, budou-li všechny dotyčné účinné látky zařazeny do přílohy I směrnice 91/414/EHS.(9) Opatření této směrnice jsou v souladu se stanoviskem Stálého rostlinolékařského výboru,PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:Článek 1Příloha I směrnice 91/414/EHS se mění v souladu s přílohou této směrnice.Článek 2Členské státy trvale zpřístupní zprávu o přezkoumání isoproturonu, s výjimkou důvěrných informací ve smyslu článku 14 směrnice 91/414/EHS, všem zúčastněným stranám nebo jim ji poskytnou k nahlédnutí na zvláštní žádost.Článek 31. Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 30. června 2003. Neprodleně o nich uvědomí Komisi.Zejména pak v souladu se směrnicí 91/414/EHS podle potřeby změní nebo odejmou do tohoto data existující povolení přípravků na ochranu rostlin obsahujících účinnou látku isoproturon.Tato opatření přijatá členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí být takový odkaz učiněn při jejich úředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy.2. Pokud jde o hodnocení a rozhodování podle jednotných zásad stanovených v příloze VI směrnice 91/414/EHS na základě dokumentace splňující požadavky přílohy III uvedené směrnice, je lhůta pro změnu nebo odnětí povolení přípravků na ochranu rostlin obsahujících isoproturon jako jedinou účinnou látku stanovena do 1. ledna 2007.3. U přípravků na ochranu rostlin obsahujících isoproturon spolu s jinou účinnou látkou uvedenou v příloze I směrnice 91/414/EHS uplyne doba pro změnu nebo odnětí povolení po čtyřech letech od vstupu v platnost směrnice, kterou se mění příloha I směrnice 91/414/EHS za účelem zařazení poslední z těchto účinných látek.Článek 4Tato směrnice vstupuje v platnost dnem 1. ledna 2003.Článek 5Tato směrnice je určena členským státům.V Bruselu dne 22. února 2002.Za KomisiDAVID BYRNEčlen KomisePŘÍLOHANa konec tabulky v příloze I směrnice 91/414/EHS se doplňuje tato účinná látka:Číslo Obecný název, identifikační čísla Název podle IUPAC Čistota1 Vstup v platnost Konec platnosti zařazení Zvláštní ustanovení"28 Isoproturon CAS 34123-59-6 CIPAC 336 3-(4-isopropylfenyl)-1,1-dimethylmočovina 970 g/kg 1. ledna 2003 31. prosince 2012 Povolena mohou být pouze použití jako herbicid. Při uplatňování jednotných zásad uvedených v příloze VI musí být zohledněny závěry zprávy o přezkoumání isoproturonu, a zejména její příloha I a II, v konečném znění vypracovaném Stálým rostlinolékařským výborem dne 7. prosince 2001. Při tomto celkovém hodnocení musí členské státy:  věnovat zvláštní pozornost ochraně podzemních vod, je-li účinná látka použita v ohrožených oblastech, pokud jde o půdní a/nebo klimatické podmínky, nebo je-li použita ve vyšších dávkách, než jsou dávky předepsané ve zprávě o přezkoumání, a je nutné uplatnit opatření ke zmírnění rizika,  věnovat zvláštní pozornost ochraně vodních organismů a musí zajistit, aby podmínky povolení v případě potřeby obsahovaly opatření ke zmírnění rizika.1 Další podrobnosti o identitě a specifikaci účinné látky jsou uvedeny ve zprávě o přezkoumání."1 Úř. věst. L 230, 19.8.1991, s. 1.2 Úř. věst. L 313, 30.11.2001, s. 37.3 Úř. věst. L 366, 15.12.1992, s. 10.4 Úř. věst. L 259, 13.10.2000, s. 27.5 Úř. věst. L 107, 28.4.1994, s. 8.6 Úř. věst. L 225, 22.9.1995, s. 1.


Důležité právní upozornění

|

32000L0033

Směrnice Komise 2000/33/ES ze dne 25. dubna 2000, kterou se po dvacáté sedmé přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látekText s významem pro EHP.

Úřední věstník L 136 , 08/06/2000 S. 0090 - 0107 CS.ES Kapitola 13 Svazek 25 S. 242  - 259 ET.ES Kapitola 13 Svazek 25 S. 242  - 259 HU.ES Kapitola 13 Svazek 25 S. 242  - 259 LT.ES Kapitola 13 Svazek 25 S. 242  - 259 LV.ES Kapitola 13 Svazek 25 S. 242  - 259 MT.ES Kapitola 13 Svazek 25 S. 242  - 259 PL.ES Kapitola 13 Svazek 25 S. 242  - 259 SK.ES Kapitola 13 Svazek 25 S. 242  - 259 SL.ES Kapitola 13 Svazek 25 S. 242  - 259

		Směrnice Komise 2000/33/ESze dne 25. dubna 2000,kterou se po dvacáté sedmé přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek [1](Text s významem pro EHP)KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství,s ohledem na směrnici Rady 67/548/EHS ze dne 27. června 1967 o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek [2], naposledy pozměněnou směrnicí Evropského parlamentu a Rady 1999/33/ES [3], a zejména na článek 28 uvedené směrnice,vzhledem k těmto důvodům:(1) V příloze V směrnice 67/548/EHS se stanoví metody pro stanovení fyzikálně-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látek a přípravků. Je nezbytné přizpůsobit tuto přílohu technickému pokroku.(2) Podle čl. 7 odst. 2 směrnice Rady 86/609/EHS ze dne 24. listopadu 1986 o sbližování právních a správních předpisů členských států týkajících se ochrany zvířat používaných pro pokusné a jiné vědecké účely [4] nesmí být pokus, při němž má být použito zvíře, proveden, je-li rozumně a prakticky dostupná jiná vědecky uspokojivá metoda.(3) Komise zamýšlí zařadit do přílohy V směrnice 67/548/EHS určité alternativní zkušební metody, při nichž nejsou používána zvířata, s cílem zpřístupnit je pro zkoušení chemických látek podle čl. 3 odst. 1 směrnice 67/548/EHS.(4) Opatření této směrnice jsou v souladu se stanoviskem Výboru pro přizpůsobení technickému pokroku směrnic o odstranění technických překážek obchodu na úseku nebezpečných látek a přípravků,PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:Článek 1Text příloh I a II této směrnice se vkládá do části B přílohy V směrnice 67/548/EHS.Článek 21. Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 1. října 2001. Neprodleně o nich uvědomí Komisi.Tyto předpisy přijaté členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí být takový odkaz učiněn při jejich úředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy.2. Členské státy sdělí Komisi znění hlavních ustanovení vnitrostátních právních předpisů, které přijmou v oblasti působnosti této směrnice, a srovnávací tabulku mezi směrnicí a přijatými vnitrostátními ustanoveními.Článek 3Tato směrnice vstupuje v platnost třetím dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.Článek 4Tato směrnice je určena členským státům.V Bruselu dne 25. dubna 2000.Za KomisiMargot Wallströmčlenka Komise[1] Přijato před přizpůsobením po dvacáté šesté.[2] Úř. věst. 196, 16.8.1967, s. 1.[3] Úř. věst. L 199, 30.7.1999, s. 57.[4] Úř. věst. L 358, 18.12.1986, s. 1.--------------------------------------------------PŘÍLOHA I"B.40 LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI1. METODA1.1 ÚvodDvě zkoušky in vitro na leptavé účinky na kůži na principu stanovení transkutánního elektrického odporu kůže potkana (TER) a zkouška s využitím modelu lidské kůže byly Evropským střediskem pro validaci alternativních metod (ECVAM, Společné výzkumné středisko Evropské Komise) (1, 2, 3) schváleny jako vědecky platné. Validační studie ECVAM prokázala, že oběma zkouškami lze spolehlivě rozlišit známé látky leptající a neleptající kůži. Protokol o zkoušce založené na modelu lidské kůže dále umožnil správně rozlišit stupně žíravých účinků (známé látky způsobující těžké poleptání, R 35 a ostatní látky způsobující poleptání kůže, R 34) (2). Popis a postup obou zkoušek je uveden; volba zkoušky, která má být použita, závisí na specifických požadavcích a prioritách uživatele.Viz také Obecný úvod, část B.1.2 DefinicePoleptání kůže: nevratné poškození kůže po aplikaci zkoušeného materiálu.1.3 Referenční látkyNespecifikovány, avšak viz body 1.5.3.4 a 1.7.2.3.1.4 Podstata zkušební metody — zkouška TER na kůži potkanaZkoušený materiál je až po 24 h aplikován na epidermální stranu terčíků kůže humánně usmrcených mladých potkanů. Materiály s leptavými účinky jsou identifikovány schopností způsobit ztrátu normální integrity a bariérové funkce rohovité vrstvy (stratum corneum), která je měřena jako snížení vlastního TER pod prahovou úroveň (5 kΩ) (4, 5). Dráždivé a nedráždivé látky nesnižují TER pod prahovou hodnotu. Do zkušebního postupu pro povrchově aktivní látky a neutrální organické látky (definice viz literatura (6)) lze zařadit stupeň pro stanovení vázání barviva, aby se omezilo množství falešně pozitivních výsledků získaných právě pro tyto druhy chemických látek (2, 7).1.5 Popis zkušební metody — zkouška TER na kůži potkana1.5.1 ZvířataTerčíky kůže musí být připraveny z mladých (20 — 23 denních) potkanů (Wistar nebo srovnatelný kmen). Hřbetní a boční srst se opatrně odstraní holicím strojkem. Zvířata se poté omyjí opatrným otíráním, přičemž se testovací plocha ponoří do roztoku antibiotik (obsahujícího např. streptomycin, penicilin, chloramfenikol a amfotericin o koncentracích zastavujících růst bakterií). Zvířata se třetí a čtvrtý den po prvním omytí znovu omyjí roztokem antibiotik a použijí se do 3 dnů (k přípravě kůže nesmí být použita zvířata starší než 31 dnů).1.5.2 Příprava terčíků kůžeZvířata se humánně usmrtí. Z každého zvířete se poté opatrně odstraní hřbetní kůže a nadbytečný tuk se z kůže opatrně seškrábne. Kůže se poté přeloží přes konec teflonové (PTFE) trubičky tak, aby epidermis byla v kontaktu s trubičkou. Přes konec trubičky se těsně přetáhne pryžový O-kroužek, aby byla kůže upevněna, a přebytek tkáně se ořízne. Rozměry trubičky a O-kroužku jsou uvedeny na obrázku 1. Pryžový O-kroužek na teflonové trubičce se poté opatrně pokryje vrstvou vazelíny. Trubička držená pomocí pružinové svorky se umístí do receptorové komory obsahující roztok síranu hořečnatého (154 mM) (obrázek 2).1.5.3 Zkušební postup1.5.3.1 Aplikace zkoušeného materiáluKapalná zkoušená látka (150 μl) se aplikuje na epidermis uvnitř trubičky (obr. 2). Při zkoušení pevných materiálů se použije dostatečné množství tak, aby byla pokryta celá epidermis. Poté se na povrch pevné látky přidá deionizovaná voda (150 μl) a trubička se lehce protřepe. Mezi látkami a kůží by mělo dojít k maximálnímu styku. U některých látek toho může být dosaženo zahřátím až na 30 °C, aby se zkoušená látka roztavila, nebo rozemletím na zrnitý materiál nebo na prášek.Ke zkoušce každé látky se použijí tři terčíky kůže. Zkoušená látka se aplikuje po dobu 24 h (viz také bod 1.5.3.4). Zkoušená látka se zcela odstraní proudem tekoucí vody o teplotě nejvýše 30 °C. Odstranění zkoušených látek, které v trubičce ztuhly, lze usnadnit omytím proudem vody teplé až 30 °C.1.5.3.2 Měření TERTER se měří nízkonapěťovým impedančním můstkem pro střídavý proud (např. AIM 401 nebo 6401 nebo ekvivalentní). Před měřením se povrchové napětí kůže sníží přidáním dostatečného objemu 70 % ethanolu tak, aby byla epidermis zakryta. Po několika sekundách se ethanol odstraní převrácením trubice a tkáň se zvlhčí přidáním 3 ml roztoku síranu hořečnatého (154 mM). Elektrody můstku se umístí na obě strany terčíku kůže za účelem odečtu odporu v kΩ/terčík kůže (obrázek 2). Rozměry elektrod a délky exponovaných částí elektrod pod krokosvorkou jsou uvedeny na obrázku 1. Svorka vnitřní (silné) elektrody je během měření odporu opřena o horní konec teflonové trubičky, aby bylo zajištěno, že se délka části elektrody ponořené v roztoku síranu hořečnatého nemění. Vnější (tenká) elektroda je umístěna uvnitř receptorové komory tak, aby spočívala na dně komory. Vzdálenost mezi spodkem pružinové svorky a dnem teflonové trubičky se udržuje konstantní (obrázek 1), neboť tato vzdálenost má vliv na naměřené hodnoty odporu.Je třeba si všimnout, že je-li naměřená hodnota vyšší než 20 kΩ, může to být způsobeno vrstvou zkoušené látky na epidermální straně terčíku kůže. O odstranění této vrstvy se lze pokusit např. tím, že se teflonová trubička zakryje palcem v rukavici a 10 s se protřepává. Roztok síranu hořečnatého se odstraní a měření se opakuje s čerstvým síranem hořečnatým.Výsledky TER (střední hodnoty) jsou přijatelné, pokud hodnoty pozitivní a negativní kontroly spadají do přijatelného rozpětí metody. Pro popsanou metodiku a přístroje jsou doporučeny tyto kontrolní látky a jejich přijatelná rozpětí odporu:Kontrola | Látka | Rozpětí odporu (kΩ) |Pozitivní | 10M kyselina chlorovodíková (36 %) | 0,5–1,0 |Negativní | Destilovaná voda | 10–25 |1.5.3.3 Upravený postup pro povrchově aktivní látky a neutrální organické látkyJsou-li hodnoty TER pro povrchově aktivní látky nebo organické látky jakožto zkoušené látky menší nebo rovny 5 kΩ, lze provést na tkáni stanovení průniku barviva. Tímto postupem se zjistí, zda výsledky nejsou falešně pozitivní (2).1.5.3.3.1 Aplikace a odstranění barviva sulforhodaminu BPo předchozí aplikaci zkoušené látky se na epidermální stranu každého terčíku kůže aplikuje na 2 h 150 μl 10 % roztoku barviva sulforhodaminu B v destilované vodě. Terčíky kůže se poté přibližně 10 s omývají proudem vody o nejvýše pokojové teplotě, aby se odstranilo veškeré volné barvivo. Všechny terčíky kůže se opatrně sejmou z teflonové trubičky a umístí se do lahvičky (např. 20 ml skleněné lahvičky pro scintilační spektrometrii) obsahující deionizovanou vodu (8 ml). Lahvičky se lehce 5 min. protřepávají, aby se odstranilo další volné barvivo. Tato metoda oplachování se poté zopakuje, a poté se terčíky kůže vyjmou a vloží do lahviček obsahujících 5 ml 30 % roztoku (m/V) natrium-dodecyl-sulfátu (SDS) v destilované vodě a inkubují se přes noc při 60 °C. Po inkubaci se všechny terčíky kůže vyjmou a zlikvidují a zbylý roztok se odstředí 8 min. při 21 °C (relativní odstředivá síla ˜ 175). 1 ml vzorku supernatantu se poté zředí 4 ml 30 % (m/V) roztoku SDS v destilované vodě. Absorbance (A) se měří při přibližně 565 nm.1.5.3.3.2 Výpočet obsahu barvivaObsah barviva sulforhodaminu B na terčík kůže se vypočte z hodnot A (molární absorpční koeficient sulforhodaminu B při 565 nm = 8,7 × 104; molekulová hmotnost = 580). Obsah barviva sulforhodaminu B se vypočte pro každý terčík kůže a poté se vypočte jeho střední hodnota. Střední hodnoty výsledků vázání barviva jsou přijatelné, pokud hodnoty pro paralelní kontroly spadají do přijatelného rozmezí metody. Pro popsanou metodiku a přístroje jsou pro uvedení kontrolní látky doporučeny tyto přijatelné hodnoty rozmezí obsahu barviva:Kontrola | Látka | Rozmezí obsahu barviva (μg/terčík kůže) |Pozitivní | 10M kyselina chlorovodíková (36 %) | 40-100 |Negativní | Destilovaná voda | 15-35 |1.5.3.4 Doplňkové informaceLátky lze rovněž aplikovat na terčíky kůže na kratší dobu (např. 2 hodiny), aby se identifikovaly ty materiály, které jsou silně leptavé. Validační studie však ukázala, že stanovení TER nadhodnocuje leptavé účinky u několika zkoušených chemických látek při jejich aplikaci na terčík kůže po dobu 2 hodin (2), třebaže toto stanovení umožnilo správnou identifikaci látek s leptavými účinky a látek bez leptavých účinků při 24hodinové aplikaci.Vlastnosti a rozměry zkušebního zařízení a použitý experimentální postup mohou mít vliv na získané hodnoty TER. Práh 5 Ω pro předpověď leptavých účinků byl odvozen z údajů získaných se zařízením a postupem, jež jsou popsány v této metodě. Doporučuje se tedy kalibrovat metodou a určit prahovou hodnotu odporu zkoušením řady referenčních standardů vybraných z chemických látek použitých ve validační studii (3).1.6 Podstata zkušební metody — stanovení pomocí modelu lidské kůžeZkoušený materiál je aplikován až po dobu 4 hodin na trojrozměrný model lidské kůže sestávající z rekonstruované epidermis a funkční rohovité vrstvy. Materiály s leptavými účinky jsou identifikovány schopností způsobit při specifikované expoziční době pokles životaschopnosti buněk (stanovený např. použitím zkoušky redukce MTT) pod definovanou prahovou úroveň. Podstata zkoušky je založena na hypotéze, že chemické látky s leptavými účinky jsou ty, jež jsou schopny proniknout rohovitou vrstvou (difuzí nebo erozí) a jsou dostatečně cytotoxické, aby způsobily smrt buněk v hlubších buněčných vrstvách.1.7 Popis zkušební metody — stanovení pomocí modelu lidské kůže1.7.1 Modely lidské kůžeModely lidské kůže mohou pocházet z různých zdrojů, musí však splňovat určitá kritéria. Model musí mít funkční rohovitou vrstvu a vrstvu živých buněk pod ní. Bariérová funkce rohovité vrstvy musí být dostatečná. To lze prokázat demonstrací rezistence modelu k cytotoxickým látkám, které normálně neproniknou rohovitou vrstvou. Musí se prokázat, že model poskytuje za definovaných experimentálních podmínek reprodukovatelné výsledky.Životaschopnost živých buněk v modelu musí být dostatečně vysoká, aby bylo možné dobře rozlišit pozitivní a negativní kontrolní látky. ivotaschopnost buněk (stanovená např. redukcí MTT, tj. měřením hodnoty absorbance A) po expozici negativní kontrolní látce musí být v mezích přijatelných pro daný model. Podobně hodnoty životaschopnosti buněk po expozici pozitivní kontrolní látce (ve srovnání s životaschopností pro negativní kontrolní látku) musí být ve specifikovaných mezích. Nejdůležitější přitom je, aby model odpovídal mezinárodním standardům pro validaci (2).1.7.2 Zkušební postup1.7.2.1 Aplikace zkoušeného materiáluU kapalných materiálů musí být aplikováno dostatečné množství zkoušené látky, aby pokrylo povrch kůže (minimálně 25 μl/cm2). U pevných materiálů musí být aplikováno dostatečné množství zkoušené látky, aby pokrylo kůži, a zkoušená látka by měla být ovlhčena, aby byl zajištěn dobrý styk s kůží; pevné látky by měly být podle potřeby před aplikací rozemlety na prášek. Musí být prokázáno, že aplikační metoda je použitelná pro široké spektrum chemických látek (2). Po uplynutí expoziční doby musí být zkoušený materiál z povrchu kůže opatrně spláchnut fyziologickým roztokem.1.7.2.2 Měření životaschopnosti buněkK měření životaschopnosti buněk může být použita jakákoli validovaná kvantitativní metoda. Nejčastěji se používá stanovení redukce MTT, pro níž se v různých laboratořích prokázalo, že poskytuje správné a reprodukovatelné výsledky (2). Terčík kůže se umístí do roztoku MTT o koncentraci 0,3 mg/ml při teplotě 20-28oC na dobu 3 hodin. Sraženina modrého formazanu se poté extrahuje (rozpouštědlem) a koncentrace formazanu se stanoví měřením absorbance A při vlnové délce 545 až 595 nm.1.7.2.3 Doplňkové informacePoužitý model kůže a přesné zaznamenání expoziční doby, postupu oplachování atd. budou mít velký vliv na výsledky životaschopnosti buněk. Doporučuje se, aby metodika a předpovědní model byly kalibrovány zkoušením řady referenčních standardů vybraných z chemických látek použitých ve validační studii ECVAM (3). Je rozhodující, aby použitá metoda v souladu s mezinárodními standardy vykazovala v rámci laboratoře a mezi laboratořemi reprodukovatelnost pro široké spektrum chemických látek. Metoda musí splňovat alespoň již definovaná kritéria pro vědeckou validitu (2) a výsledky takové validační studie musí být publikovány ve vědeckém časopise s předcházející odbornou recenzí.2. ÚDAJE2.1 Zpracování výsledků2.1.1 Zkouška TER na kůži potkanaHodnoty odporu (kΩ) pro zkoušený materiál, pozitivní a negativní kontrolu a pro všechny standardní referenční chemické látky včetně údajů o duplicitních nebo opakovaných experimentech, o středních hodnotách a o odvozené klasifikaci by měly být uvedeny ve formě tabulky.2.1.2 Zkouška s modelem lidské kůžeHodnoty absorbance A a vypočtené hodnoty životaschopnosti buněk v procentech pro zkoušený materiál, pozitivní a negativní kontroly a pro všechny standardní referenční chemické látky včetně údajů o duplicitních nebo opakovaných experimentech, o středních hodnotách a o odvozené klasifikaci by měly být uvedeny ve formě tabulky.2.2 Hodnocení a interpretace výsledků2.2.1 Zkouška TER na kůži potkanaJe-li hodnota TER dosažená pro zkoušenou látku větší než 5 kΩ, není látka žíravá. Je-li hodnota TER menší nebo rovna 5 kΩ a nejde o povrchově aktivní látku nebo neutrální organickou látku, je látka žíravá.U povrchově aktivních látek nebo neutrálních organických látek, které dávají hodnoty TER menší nebo rovné 5 kΩ, lze provést stanovení průniku barviva. Je-li střední obsah barviva v terčíku kůže větší nebo roven střednímu obsahu barviva v terčíku kůže získanému souběžně při použití 36 % HCl jakožto pozitivní kontroly, je zkouška zkoušené látky skutečně pozitivní, a látka je tedy žíravá. Je-li střední obsah barviva v terčíku kůže menší než střední obsah barviva v terčíku kůže získaný souběžně při použití 36 % HCl, je zkouška falešně pozitivní, a látka tedy není žíravá.2.2.2 Zkouška s modelem lidské kůžeHodnoty obsorbance A pro negativní kontrolu představují 100 % životaschopnost buněk; hodnoty absorbance A dosažené pro každý zkoušený vzorek lze použít k výpočtu relativní životaschopnosti v procentech vzhledem k negativní kontrole. Hraniční procentuální podíl životaschopnosti buněk, kterým se rozlišují žíravé materiály od zkoušených materiálů, které nejsou žíravé (nebo kterým se rozlišují různé třídy leptavých účinků), musí být pro předpovědní model jasně definován před validací metody a následná validační studie musí potvrdit, že je vhodný (2).3. ZPRÁVYProtokol o zkoušceProtokol o zkoušce musí obsahovat alespoň tyto informace:Zkoušená látka:- identifikační údaje, fyzikální vlastnosti a případně fyzikálně-chemické vlastnosti. Podobné informace by měly být uvedeny pro referenční látky, pokud byly použity.Zkušební podmínky:- podrobnosti použitého postupu,- popis a zdůvodnění jakýchkoli změn.Výsledky:- hodnoty odporu (zkouška TER) nebo hodnoty životaschopnosti buněk v procentech (zkouška s modelem lidské kůže) pro zkoušený materiál, pozitivní a negativní kontroly a všechny standardní referenční chemické látky včetně údajů o duplicitních nebo opakovaných experimentech a středních hodnotách, zpracované ve formě tabulky,- popis jakýchkoli jiných pozorovaných účinků.Rozbor výsledků.Závěry.4. LITERATURA(1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, 275-280.(2) Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H-G., Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, 483-524.(3) Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, I., Walker, A. P., Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in vitro 12, 471-482.(4) Oliver, G. J. A., Pemberton, M. A., Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test — modifications and validation, Food Chem. Toxicol. 24, 507-512.(5) Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., Basketter, D. A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D. J., Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in vitro 6, 191-194.(6) Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, 709-720.(7) Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P., Balls, M. 1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, 219-255.+++++ TIFF +++++Obrázek 1+++++ TIFF +++++Obrázek 2"--------------------------------------------------PŘÍLOHA II"B.41 FOTOTOXICITA — ZKOUŠKA FOTOTOXICITY 3T3 NRU IN VITRO1. METODA1.1 ÚvodFototoxicita je definována jako toxická odezva vyvolaná po první expozici kůže určitým chemickým látkám a následné expozici světlu nebo podobně vyvolaná ozářením kůže po systémovém podání chemické látky.Informace získané ze zkoušky fototoxicity 3T3 NRU in vitro slouží k identifikaci fototoxického potenciálu zkoušené látky, tj. existence nebo neexistence možného nebezpečí, které může plynout ze zkoušené látky ve spojení s expozicí UV záření nebo viditelnému světlu.Protože cílem zkoušky in vitro z hlediska toxikologie je stanovení fototoxicity vyvolané kombinovaným působením chemické látky a světla, lze zkouškou identifikovat sloučeniny, které jsou fototoxické in vivo po systémovém podání a po nanesení na kůži, a rovněž sloučeniny, které působí po nanesení na pokožku jako fotoiritanty.Zkouška fototoxicity 3T3 NRU in vitro byla vyvinuta a validována v rámci spojeného projektu EU/COLIPA v letech 1992 — 1997 (1, 2, 3) s cílem vytvořit platnou alternativu in vitro k různým používaným zkouškám in vivo. V roce 1996 doporučila pracovní skupina OECD koncepci postupných zkoušek in vitro pro posuzování fototoxicity (4).Výsledky ze zkoušek fototoxicity 3T3 NRU in vitro byly porovnány s akutními fototoxickými nebo fotoiritačmi účinky in vivo u zvířat a u člověka a zkouška se ukázala pro předpověď těchto účinků jako vynikající. Zkouška není určena pro předpověď jiných nepříznivých účinků, které mohou plynout z kombinovaného působení chemické látky a světla, např. fotogenotoxicity, fotoalergie a fotokarcinogenity, třebaže mnoho chemických látek, které vykazují tyto specifické vlastnosti, bude ve zkoušce fototoxicity 3T3 NRU in vitro pozitivně reagovat. Zkouška dále není vyvinuta k tomu, aby umožnila hodnocení stupně fototoxicity.Koncepce postupného zkoušení fototoxicity chemických látek je uvedena v dodatku.1.2 DefiniceIntenzita ozáření: intenzita ultrafialového nebo viditelného světla dopadajícího na povrch, měřená ve W/m2 nebo mW/cm2.Dávka světelného záření: množství (intenzita × čas) ultrafialového (UV) nebo viditelného záření dopadajícího na povrch, vyjádřená v joulech (W × s) na plochu povrchu, např. J/m2 nebo J/cm2.Vlnová pásma UV světla: označení doporučená komisí CIE (Commission Internationale de l'Eclairage): UVA (315400 nm), UVB (280315 nm) a UVC (100280 nm). Používají se rovněž jiná označení: jako hranice mezi UVB a UVA je často používána hodnota 320 nm a pásmo UVA může být rozděleno na UV-A1 a UV-A2 s hranicí kolem 340 nm.Životaschopnost buněk: parametr, kterým se měří celková aktivita buněčné populace (např. příjem vitálního barviva neutrální červeně do buněčných lysosomů) a který v závislosti na měřeném jevu a na použitém uspořádání zkoušky koreluje s celkovým počtem a/nebo životaschopností buněk.Relativní životaschopnost buněk: životaschopnost v poměru k negativním kontrolám (rozpouštědlo), které prošly celým postupem zkoušky (s UV, nebo bez UV), ale nebyly exponovány zkoušeným chemickým látkám.Předpovědní model: algoritmus používaný pro převod výsledků zkoušek toxicity na předpověď toxického potenciálu. V předložené metodice lze pro převod výsledků zkoušek fototoxicity 3T3 NRU in vitro na předpověď fototoxického potenciálu použít faktor PIF a veličinu MPE.PIF (photo-irritation factor — fotoiritační faktor): faktor získaný srovnáním dvou stejně účinných cytotoxických koncentrací (EC50) zkoušené látky, a to při necytotoxickém ozáření UVA/VIS světlem (+ UV) a bez něho (-UV).MPE (mean photo effect — střední světelný účinek): nová veličina odvozená z matematické analýzy celého průběhu křivek závislosti účinku na koncentraci získaných při necytotoxickém ozáření UVA/vis světlem (+ UV) a bez něho (-UV).Fototoxicita: akutní toxická reakce, vyvolaná po první expozici kůže určitým chemickým látkám a následné expozici světlu nebo podobně vyvolaná ozářením kůže po systémovém podání chemické látky.Fotoiritace: nižší úroveň pojmu "fototoxicita", který se používá k popisu pouze těch fototoxických reakcí, které se vyskytnou na kůži po expozici chemickým látkám (topické nebo orální). Tyto fototoxické reakce vedou vždy k nespecifickému buněčnému poškození (podobné reakci při opalování).Fotoalergie: získaná imunologická reaktivita, ke které nedochází při první aplikaci chemické látky a světla a která vyžaduje indukční dobu jeden nebo dva týdny před tím, než lze reakci kůže prokázat.Fotogenotoxicita: genotoxická odezva pozorovaná z genového hlediska, která je vyvolána po expozici buněk negenotoxické dávce UV/VIS světla a negenotoxické chemické látce.Fotokarcinogenita: karcinogenita vyvolaná opakovanou aplikací světla a chemické látky. Termín foto-kokarcinogenita se používá v případě, kdy je tvorba tumoru indukovaná UV zářením zesílena chemickou látkou.1.3 Referenční látkyVedle pozitivní kontrolní chemické látky chlorpromazinu, který by měl být souběžně zkoušen při každé zkoušce, je pro nově vyvinutou zkoušku fototoxicity 3T3 NRU doporučeno použít jako referenční chemické látky výběr z chemických látek použitých při mezilaboratorních srovnáních předložené metody (1, 3, 13).1.4 Úvodní poznámkyFototoxické účinky byly zaznamenány u mnoha typů chemických látek (5, 6, 7, 8). Jejich jediným společným rysem je schopnost absorbovat světelnou energii v oblasti slunečního světla. Podle prvního zákona fotochemie (Grotthaus-Draperův zákon) vyžaduje fotoreakce dostatečnou absorpci světelných kvant. Před zvážením biologického zkoušení podle předložené metodiky by tedy mělo být stanoveno UV/VIS absorpční spektrum zkoušené chemické látky (např. podle Metodiky OECD 101). Je-li molární absorpční koeficient menší než 10 l.mol-1.cm-1, chemická látka nemá fotoreaktivní potenciál a nemusí být zkoušena zkouškou fototoxicity 3T3 NRU in vitro nebo jakoukoli jinou biologickou zkouškou na nepříznivé fotochemické účinky (dodatek).1.5 Podstata zkušební metodyByly identifikovány čtyři mechanismy, kterými může absorpce světla (chemickým) chromoforem vést k fototoxické odezvě (7). Všechny vedou k poškození buňky. Zkouška fototoxicity 3T3 NRU in vitro je proto založena na srovnání cytotoxicity chemické látky při zkoušení s expozicí necytotoxické dávce UVA/VIS světla a bez této expozice. Cytotoxicita je v této zkoušce vyjádřena jako koncentračně závislé snížení příjmu vitálního barviva neutrální červeně (NR) (9) 24 hodin po působení zkoušené chemické látky a ozáření.Buňky Balb/c 3T3 se 24 h kultivují, aby vytvořily monovrstvu. Dvě 96jamkové destičky na jednu zkoušenou chemickou látku se poté 1 h preinkubují osmi různými koncentracemi chemických látek. Poté je jedna ze dvou destiček exponována necytotoxickou dávkou UVA/VIS světla 5 J/cm2 UVA (+ UV experiment), zatímco druhá destička se udržuje v temnu (-UV experiment). U obou destiček se poté aplikační médium nahradí kultivačním médiem a po dalších 24 h inkubace je buněčná životaschopnost stanovena 3hodinovým příjmem neutrální červeně (NRU). Relativní buněčná životaschopnost vyjádřená v procentech vzhledem k neexponované negativní kontrole se vypočte pro každou z osmi zkušebních koncentrací. Pro předpověď fototoxického potenciálu se porovnají koncentračně závislé odezvy získané při ozáření (+ UV) a bez ozáření (-UV), obvykle při hodnotě EC50, tj. při koncentraci způsobující 50 % úbytek buněčné životaschopnosti ve srovnání s neexponovanými kontrolami.1.6 Kritéria jakostiCitlivost buněk na UVA, dosavadní údaje: citlivost buněk na UVA by měla být pravidelně kontrolována. Buňky se nasadí při intenzitě použité ke zkoušce fototoxicity 3T3 NRU in vitro, příští den se ozáří dávkou UVA záření 1 až 9 J/cm2 a buněčná životaschopnost se stanoví o den později zkouškou NRU. Buňky splňují kritérium jakosti, není-li jejich životaschopnost po ozáření 5 J/cm2 menší než 80 % životaschopnosti kontroly udržované v temnu. Tato kontrola by měla být opakována vždy po deseti pasážích buněk.Citlivost buněk negativní kontroly na UVA při samostatné zkoušce: zkouška splňuje kritéria jakosti, jestliže negativní kontroly (buňky v EBSS (Earlův fyziologický roztok) s 1 % dimethylsulfoxidem (DMSO) nebo 1 % ethanolem (EtOH)) nebo bez nich vykazují při + UVA experimentu životaschopnost alespoň 80 % vzhledem k životaschopnosti neozářených buněk v tomtéž rozpouštědle při souběžném experimentu v temnu (-UVA).Životaschopnost negativní kontroly: absolutní absorbance (A540 NRU) měřená v extraktu NR negativních kontrol naznačí, zda 1 × 104 buněk nasazených na jednu jamku zachovalo při růstu během dvou dnů zkoušky obvyklou dobu zdvojnásobení (doubling time). Zkouška splňuje kritérium přijatelnosti, jestliže střední hodnota A540 NRU neexponovaných kontrol je ≥ 0,2.Pozitivní kontrola: při každé zkoušce fototoxicity 3T3 NRU in vitro musí být souběžně zkoušena známá fototoxická chemická látka. Při validační studii EU/COLIPA byl použit jako pozitivní kontrola chlorpromazin (CPZ), a je tedy doporučen. Pro CPZ zkoušený podle standardního postupu při zkoušce fototoxicity 3T3 NRU in vitro byla definována tato kritéria přijatelnosti zkoušky: pro CPZ ozářený (+ UVA): EC50 = 0,1 až 0,2 μg/ml, pro CPZ neozářený (-UVA): EC50 = 7,0 až 90,0 μg/ml. Fotoiritační faktor (PIF), tj. posun hodnoty EC50, by měl být alespoň 6.Namísto CPZ mohou být použity jako souběžné pozitivní kontroly jiné známé fototoxické chemické látky vhodné z hlediska typu nebo rozpustnosti hodnocené zkoušené chemické látky. V takovém případě by měly být na základě dosavadních údajů jako kritéria přijatelnosti zkoušky přiměřeným způsobem definovány rozsahy hodnot EC50 a PIF nebo MPE (střední světelný účinek).1.7 Popis zkušební metody1.7.1 Příprava1.7.1.1 BuňkyPři validační studii byla použita permanentní myší linie fibroplastů — Balb/c 3T3, klon 31 — buď z banky ATCC, nebo z banky ECACC a je tedy doporučena. Jiné buňky nebo buněčné linie mohou být při stejném zkušebním postupu použity za předpokladu, že jsou kultivační podmínky přizpůsobeny specifickým potřebám buněk, ale musí být prokázána jejich rovnocennost.Buňky by měly být pravidelně kontrolovány, zda nejsou kontaminovány mykoplasmaty, a měly by být použity pouze tehdy, jsou-li výsledky takové kontroly uspokojivé.Vzhledem k tomu, že citlivost buněk na UV vzrůstá s počtem pasáží, měly by být použity buňky Balb/c 3T3 z pasáže s nejnižším dosažitelným počtem pasáží, nejlépe z nižší než sté pasáže. Je důležité, aby byla citlivost buněk Balb/c 3T3 na UVA pravidelně kontrolována postupem kontroly jakosti popsaným v této metodice.1.7.1.2 Média a kultivační podmínkyPro rutinní buněčné pasážování a během zkušebního postupu by měla být použita vhodná kultivační média a inkubační podmínky. U buněk Balb/c 3T3 se jedná o DMEM (Dulbeccova modifikace Eagleova media) obohacené 10 % novorozeneckým telecím sérem, 4mM glutaminem, penicilinem a streptomycinem a inkubaci ve vlhčené atmosféře při 37 °C/7, 5 % CO2. Zvláště důležité je, aby kultivační podmínky zajistily, aby byl buněčný cyklus uvnitř dosavadního rozpětí pro použité buňky nebo buněčné linie.1.7.1.3 Příprava kulturBuňky ze zmrazených kmenových kultur se nasadí do kultivačního média ve vhodné hustotě a alespoň jednou se pasážují před použitím ve zkoušce fototoxicity 3T3 NRU in vitro.Při zkoušce fototoxicity se buňky nasazují do kultivačního média v takové hustotě, aby nedosáhly konfluence do konce zkoušky, tj. do okamžiku, kdy je po 48 h od nasazení stanovována životaschopnost. Pro buňky Balb/c 3T3 kultivované v 96jamkových destičkách je doporučeno inokulum 1 × 104 buněk na jamku.Pro každou chemickou látku se buňky nasadí stejným způsobem do dvou oddělených 96jamkových destiček, které jsou poté souběžně podrobeny celému postupu zkoušky za stejných podmínek kromě doby, kdy je jedna z destiček ozářena (+UVA/VIS) a druhá je udržována v temnu (-UVA/VIS).1.7.1.4 Metabolická aktivaceZatímco použití metabolizujícího systému je obecným požadavkem při všech zkouškách in vitro určených pro posouzení genotoxického a karcinogenního potenciálu, není v fototoxikologii dosud známa žádná chemická látka, pro jejíž působení jako toxinu in vivo nebo in vitro je nezbytná metabolická transformace. Nepovažuje se tedy ani za nezbytné ani za vědecky zdůvodněné, aby byla předložená zkouška provedena se systémem aktivace metabolismu.1.7.1.5 Zkoušená chemická látka/přípravaZkoušené chemické látky musí být čerstvě připraveny bezprostředně před použitím, pokud údaje o stálosti neprokazují přijatelnost skladování. Může-li dojít k rychlé fotodegradaci, musí se příprava látky provádět pod červeným světlem.Zkoušené chemické látky by měly být rozpuštěny ve fyziologickém roztoku, např. v Earlově fyziologickém roztoku (EBSS) nebo ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem (PBS), který nesmí obsahovat proteinové složky a pH indikátory absorbující světlo, aby nerušily při ozařování.Zkoušené chemické látky s omezenou rozpustností ve vodě by měly být rozpuštěny ve vhodném rozpouštědle na 100násobek požadované konečné koncentrace a poté by měly být zředěny v poměru 1:100 fyziologickým roztokem. Použije-li se rozpouštědlo, musí být přítomné v konstantní koncentraci 1 % obj. ve všech kulturách, tj. v negativní kontrole a rovněž ve všech koncentracích zkoušené chemické látky.Doporučenými rozpouštědly jsou dimethylsulfoxid (DMSO) a ethanol (EtOH). Mohou být použita jiná vhodná méně cytotoxická rozpouštědla (např. aceton), ale měly by být pečlivě posouzeny jejich specifické vlastnosti, např. reakce se zkoušenou chemickou látku, potlačení fototoxických účinků, záchyt radikálů.Je-li třeba, může být pro usnadnění rozpouštění použito míchání a/nebo ultrazvuk a/nebo zahřátí na 37 °C.1.7.1.6 Ozáření UV světlem/přípravaZdroj světla: volba vhodného zdroje světla a vhodné filtrace je kritickým faktorem zkoušení fototoxicity. Záření v pásmu UVA a ve viditelném pásmu je obvykle spojováno s fotosenzibilizací (7, 10), zatímco záření v pásmu UVB je méně relevantní a je přímo vysoce cytotoxické, přičemž jeho cytotoxicita vzrůstá mezi 313 nm a 280 nm 1000krát (11). Kritéria pro volbu vhodného světelného zdroje by měla zahrnovat důležitý požadavek, aby zdroj světla vyzařoval světlo o vlnových délkách, které zkoušená chemická látka absorbuje, a aby dávka světelného záření (dosažitelná po přijatelnou dobu) byla dostatečná pro detekci známých fotosenzibilizujících látek. Použité vlnové délky a dávky, včetně emise tepla (infračervená oblast), by dále neměly nadměrně poškozovat testovací systém.Simulace slunečního světla solárními simulátory se považuje za optimální zdroj světla. V solárních simulátorech se používá jak xenonová výbojka, tak vysokotlaká rtuťová halogenová výbojka. Druhá z nich má tu výhodu, že emituje méně tepla a je levnější, avšak její shoda se slunečním světlem není dokonalá. Poněvadž všechny solární simulátory vyzařují významné množství UVB záření, měly by být vhodně filtrovány, aby byly vysoce cytotoxické vlnové délky UVB zeslabeny.Pro zkoušku fototoxicity 3T3 NRU in vitro by mělo být použito spektrum prakticky zbavené UVB světla (UVA:UVB ˜ 20:1). Příklad spektrální distribuce záření filtrovaného solárního simulátoru použitého ve validační studii zkoušky fototoxicity 3T3 NRU in vitro byl publikován v literatuře (3).Dozimetrie: intenzita světla (intenzita ozáření) se musí pravidelně před každou zkouškou fototoxicity kontrolovat za použití vhodného širokopásmového UV-metru. UV-metr musí být pro daný zdroj kalibrován. Funkčnost UV-metru by měla být kontrolována a za tímto účelem se doporučuje použít druhý referenční stejným způsobem kalibrovaný UV-metr stejného typu. V ideálním případě by měl být v delších časových odstupech použit k měření spektrální intenzity záření filtrovaného zdroje světla a ke kontrole kalibrace širokopásmového UV-metru spektroradiometr, avšak takové přístroje vyžadují odbornou obsluhu školenými osobami.Dávka 5 J/cm2 byla při validační studii shledána jako necytotoxická pro buňky Balb/c 3T3 a dostatečně silná k excitaci i slabě fototoxických chemických látek. Pro dosažení 5 J/cm2 po dobu 50 min. musí být intenzita ozáření nastavena na 1,666 MW/cm2. Jestliže je použita jiná buněčná linie nebo jiný světelný zdroj, může být dávka UVA záření mírně upravena, aby nepoškozovala buňky a byla dostatečná pro detekci standardních fototoxinů. Doba světelné expozice se vypočte tímto způsobem:+++++ TIFF +++++1.7.2 Zkušební podmínkyMaximální koncentrace zkoušené chemické látky by neměla překročit 100 μg/ml, neboť všechny fototoxické chemické látky byly detekovány při nižších koncentracích; při vyšších koncentracích roste výskyt falešně pozitivních výsledků (nadhodnocení). Hodnota pH nejvyšší koncentrace by měla být vyhovující (pH 6,5 — 7,8).Rozmezí koncentrací chemických látek zkoušených se světlem (+ UVA) a bez světla (-UVA) by měly být náležitě stanoveny v předchozích experimentech pro zjištění rozmezí. Rozsah koncentrační řady a intervaly mezi koncentracemi musí být zvoleny tak, aby byly křivky závislosti odezvy na koncentraci dostatečně podloženy experimentálními údaji. Měla by být použita geometrická řada koncentrací (s konstantním faktorem ředění).1.7.3 Zkušební postup [1]1.7.3.1 První denPřipraví se buněčná suspenze 1 × 105 buněk/ml v kultivačním médiu a 100 μl kultivačního média se rozdělí pouze do obvodových jamek 96jamkové destičky (slepý pokus). Do zbývajících buněk se dávkuje po 100 μl buněčné suspenze o hustotě 1 × 105 buněk/ml (1 × 104 buněk na jamku). Pro každou zkoušenou chemickou látku se připraví dvě destičky: jedna pro stanovení cytotoxicity (-UVA) a druhá pro stanovení fotocytotoxicity (+UVA).Buňky se inkubují 24 h (7,5 % CO2, 37 °C), dokud nedosáhnou semikonfluentní monovrstvy. Tato inkubační doba umožní regeneraci buněk, jejich přichycení a exponenciální růst.1.7.3.2 Druhý denPo inkubaci se kultivační médium z buněk dekantuje a každá jamka se promyje dvakrát 150 μl EBSS/PBS. Přidá se 100 μl EBSS/PBS obsahujících vhodnou koncentraci zkoušené chemické látky nebo pouze rozpouštědlo (negativní kontrola). Aplikuje se 8 různých koncentrací zkoušené chemické látky. Buňky se zkoušenou chemickou látkou se inkubují v temnu po dobu 60 min. (7,5 % CO2, 37 °C).K provedení části zkoušky s ozářením UVA se buňky při pokojové teplotě po dobu 50 min. ozařují přes víčko 96jamkové destičky UVA světlem o intenzitě 1,7 MW/cm2 (5 J/cm2. Aby nedošlo ke kondenzaci vody pod víčkem, větrá se pomocí ventilátoru. Destičky pro zkoušku bez ozáření UVA se ponechají 50 min. (doba expozice UVA) v temnu při pokojové teplotě.Zkušební roztok se odstraní a každá jamka se promyje dvakrát 150 μl EBSS/PBS. EBSS/PBS se nahradí kultivačním médiem a inkubuje se přes noc (18-22 h) (7,5 % CO2, 37 °C).1.7.3.3 Třetí denMikroskopické hodnoceníBuňky se prohlédnou pod mikroskopem s fázovým kontrastem. Zaznamenají se změny morfologie buněk způsobené cytotoxickým účinkem zkoušené chemické látky. Doporučuje se provádět tuto kontrolu, aby se vyloučily experimentální chyby, avšak záznamy se pro hodnocení cytotoxicity nebo fototoxicity nepoužijí.Zkouška příjmu neutrální červeně.Buňky se promyjí 150 μl předehřátého EBSS/PBS a promývací roztok se opatrně odstraní poklepem. Přidá se 100 μl média NR a inkubuje se 3 h při 37 °C ve zvlhčené atmosféře o 7,5 % CO2.Po inkubaci se médium NR odstraní a buňky se promyjí 150 μl EBSS/PBS. EBSS/PBS se dekantuje a zcela odsaje (případně lze destičku odstředit v obrácené poloze).Přidá se přesně 150 μl čerstvě připraveného roztoku ethanolu a kyseliny octové, aby se odstranila NR.Destička se prudce 10 min. třepe na třepačce, dokud se NR z buněk nevylouží a nevytvoří homogenní roztok.Spektrometrem se změří absorbance extraktu NR při 540 nm, přičemž se pro srovnání použije slepý pokus. Údaje se uloží ve vhodném formátu (např. ASCII) v počítači pro následnou analýzu.2. ÚDAJE2.1 Kvalita a množství údajůÚdaje by měly umožnit smysluplnou analýzu závislosti odpovědi na koncentraci získané při ozáření UVA/VIS nebo bez něho. Je-li zjištěna cytotoxicita, měl by být rozsah koncentrací a interval mezi nimi nastaven tak, aby bylo možné proložit experimentálními údaji křivku. Vzhledem k tomu, že by zkoušená chemická látka nemusela být až do mezní koncentrace 100 μg/ml určené pro experiment v temnu (-UVA) cytotoxická, ale mohla by být vysoce cytotoxická po ozáření (+UVA), může být nezbytné, aby se rozmezí koncentrací, které mají být v obou částech experimentu zkoušeny, řádově lišily, má-li být splněn požadavek uspokojivé kvality údajů. Není-li v obou částech experimentu (-UVA a +UVA) cytotoxicita zjištěna, stačí provést zkoušku s většími intervaly mezi jednotlivými dávkami až do nejvyšší koncentrace.Ověření jasně pozitivního výsledku opakovaným experimentem se nepožaduje. Negativní výsledky nemusí být dále ověřovány, jestliže byla zkoušená chemická látka zkoušena za dostatečně vysokých koncentrací. V takových případech stačí jeden hlavní experiment podpořený jednou nebo více předběžnými experimenty pro zjištění rozmezí koncentrací.Zkoušky s výsledky blízko hraničních hodnot předpovědního modelu by měly být pro kontrolu opakovány.Je-li opakované zkoušení považováno za nezbytné, může být důležité pro dosažení jasného výsledku změnit experimentální podmínky. Klíčovou proměnnou této zkoušky je příprava roztoků zkoušené chemické látky. Z tohoto důvodu může být změna podmínek (jiné rozpouštědlo, rozmělňování, použití ultrazvuku) nejzávažnějším faktorem zkoušky. Eventuálně může být vzato v úvahu kolísání inkubační doby před ozářením. Zkrácení doby může mít význam u chemických látek nestálých ve vodě.2.2 Zpracování výsledkůJe-li to možné, stanoví se koncentrace zkoušené chemické látky odpovídající 50 % inhibici buněčného příjmu neutrální červeně (NR) (EC50). Lze tak učinit požitím jakékoli vhodné metody nelineární regrese (nejlépe Hillovou funkcí nebo logistickou regresí) údajů závislosti odezvy na koncentraci nebo použitím jiných metod metody proložení (14). Před použitím hodnoty EC50 pro další výpočty by měla být vhodným způsobem zkontrolována kvalita proložení. Pro výpočet EC50 lze popřípadě použít metodu grafického proložení. V takovém případě se doporučuje použít semilogaritmický papír (měřítko osy x: logaritmické, měřítko osy y: pravděpodobnostní), neboť v mnoha případech bude po této transformaci funkce závislosti odezvy na koncentraci téměř lineární.2.3 Hodnocení výsledků (předpovědní modely)2.3.1 Předpovědní model — verze 1: fotoiritační faktor (PIF)Jestliže jsou v obou případech jak při ozáření (+UVA), tak bez ozáření (-UVA) získány úplné křivky závislosti odezvy na koncentraci, lze fotoiritační faktor (PIF) vypočítat podle tohoto vzorce:+++++ TIFF +++++Hodnota PIF < 5 předpovídá neexistenci fototoxického potenciálu, zatímco hodnota PIF ≥ 5 předpovídá existenci fototoxického potenciálu.Jestliže je chemická látka cytotoxická pouze při +UVA a není cytotoxická při zkoušce -UVA, nelze hodnotu PIF vypočítat, třebaže jde o výsledek, který svědčí o fototoxickém potenciálu. V takových případech lze vypočítat hodnotu "> PIF", jestliže se provede -UV zkouška až po nejvyšší zkušební koncentrace (Cmax), a tato hodnota se použije pro výpočet "> PIF";+++++ TIFF +++++Lze li získat pouze hodnotu "> PIF", předpovídá existenci fototoxického potenciálu jeho hodnota > 1.Jestliže nelze v důsledku toho, že chemická látka nevykazuje až do nejvyšší zkušební koncentrace žádnou fototoxicitu, vypočítat ani hodnotu EC50 (-UV) ani hodnotu EC50 (+ UV), svědčí to o neexistenci fototoxického potenciálu. V takových případech se pro charakterizaci výsledku používá formální hodnota "PIF = *1";+++++ TIFF +++++Lze li získat pouze hodnotu "PIF = *1", je tato hodnota předpovědí neexistence fototoxického potenciálu.V případech b) a c) by měly být pro předpověď fototoxického potenciálu opatrně vzaty v úvahu koncentrace dosažené ve zkoušce fototoxicity 3T3 NRU in vitro.2.3.2 Předpovědní model verze 2: střední světelný účinek (MPE)Alternativně lze použít novou verzi modelu pro předpovídání fototoxického potenciálu, který byl vyvinut s použitím údajů z validační studie EU/COLIPA (15) a byl testován naslepo v následné studii fototoxicity in vitro u chemických látek, které se chovají jako UV filtry (13). Tento model nemá omezení jako model PIF v případech, kdy nelze získat hodnotu EC50. Tento model využívá střední světelný účinek (mean photo effect) (MPE), veličinu, která je založena na srovnání celých křivek závislosti odezvy na koncentraci. Pro použití modelu byl na Humboldtově univerzitě (Berlín) vyvinut speciální počítačový software, který je volně k dispozici.2.4 Interpretace výsledkůPozitivní výsledek zkoušky fototoxicity 3T3 NRU in vitro (PIF ≥ 5 nebo MPE ≥ 0,1) znamená, že látka má fototoxický potenciál. Jestliže bylo výsledku dosaženo při koncentracích pod 10 μg/ml, je také pravděpodobné, že látka bude působit za různých expozičních podmínek jako fototoxin in vivo. Je-li pozitivního výsledku dosaženo pouze při nejvyšší zkušební koncentraci 100 μg/ml, mohou být pro posouzení nebezpečnosti nebo intenzity fototoxicity nezbytné další úvahy. Ty se mohou týkat údajů o penetraci, absorpci a možné akumulaci chemické látky v kůži nebo zkoušení chemické látky alternativní potvrzující zkouškou, např. za použití modelu lidské kůže in vitro.Negativní výsledek zkoušky fototoxicity 3T3 NRU in vitro (PIF < 5 nebo MPE < 0,1) znamená, že látka nebyla pro savčí buňky za použitých podmínek fototoxická. V případech, kdy bylo možné zkoušet chemickou látku až po nejvyšší koncentraci 100 μg/ml, znamenají negativní výsledky, že chemická látka nemá fototoxický potenciál a fototoxicitu in vivo lze pokládat za nepravděpodobnou. V případech, kdy byly při nižších koncentracích obdrženy totožné závislosti toxické odezvy na koncentraci (EC50 +UV a EC50 -UV), je interpretace údajů stejná. Není-li naproti tomu toxicita prokázána (+UV a -UV) a jsou-li koncentrace omezeny rozpustností ve vodě na hodnoty menší než 100 μg/ml, není patrně zkouška pro zkoušenou látku vhodná a mělo by být zvážena potvrzující zkouška (např. za použití modelu lidské kůže in vitro nebo zkouškou in vivo).3. ZPRÁVYProtokol o zkoušceProtokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:Zkoušená chemická látka:- identifikační údaje a číslo CAS, je-li známo,- fyzikální vlastnosti a čistota,- fyzikálně-chemické vlastnosti důležité pro provedení studie,- stálost a fotostabilita, jsou-li známy.Rozpouštědlo:- zdůvodnění volby rozpouštědla,- rozpustnost zkoušené látky v tomto rozpouštědle,- procentuální koncentrace rozpouštědla v aplikačním médiu (EBSS nebo PBS).Buňky:- typ a zdroj buněk,- nepřítomnost mykoplasmy,- číslo buněčné pasáže, je-li známo,- citlivost buněk na UVA stanovená radiometrem použitým ve zkoušce fototoxicity 3T3 NRU in vitroZkušební podmínky a) — inkubace před aplikací a po ní:- typ a složení kultivačního média,- inkubační podmínky (koncentrace CO2, teplota, vlhkost),- délka inkubace (zpracování před inkubací a po ní).Zkušební podmínky b) — aplikace chemické látky:- zdůvodnění výběru koncentrací zkoušené chemické látky použitých jak při ozáření UV/VIS, tak bez něj,- v případě, že zkoušená chemická látka vykazuje omezenou rozpustnost a není cytotoxická, zdůvodnění nejvyšší zkušební koncentrace,- typ a složení působícího média (pufrovaný fyziologický roztok),- délka aplikace chemické látky.Zkušební podmínky c) — ozáření:- zdůvodnění výběru použitého zdroje světla,- spektrální charakteristiky ozáření ze zdroje světla,- charakteristiky propustnosti/absorpce použitého filtru (použitých filtrů),- charakteristiky radiometru a podrobnosti o jeho kalibraci,- vzdálenost zdroje světla od zkoušeného systému,- intenzita ozáření UVA v této vzdálenosti, vyjádřená v mW/cm2,- délka expozice UV/VIS světlu,- dávka UVA záření (intenzita × čas), vyjádřena v J/cm2,- teplota buněčných kultur během ozařování a teplota buněčných kultur udržovaných v temnu.Zkušební podmínky d) — zkouška NRU:- složení média NR,- doba inkubace NR,- inkubační podmínky (koncentrace CO2, teplota, vlhkost),- podmínky extrakce NR (extrakční činidlo, délka extrakce),- vlnová délka použitá pro spektrofotometrický odečet absorbance NR,- druhá (referenční) vlnová délka, je-li použita,- složení slepého roztoku pro spektrometrii, je-li použit.Výsledky:- životaschopnost buněk při každé koncentraci zkoušené chemické látky vyjádřená v procentech střední životaschopnosti kontrol,- křivky závislosti odezvy na koncentraci (koncentrace zkoušené chemické látky versus relativní životaschopnost buněk) získané při paralelních experimentech +UVA a -UVA,- analýza křivek závislosti odezvy na koncentraci: je-li to možné, výpočet hodnoty EC50 (+UVA) a EC50 (-UVA),- srovnání obou křivek závislosti odezvy na koncentraci získaných s ozářením UVA/VIS a bez něho, a to buď výpočtem fotoiritačního faktoru (photo-irradiation factor ) (PIF), nebo výpočtem středního světelného účinku (mean photo effect) (MPE),- klasifikace fototoxického potenciálu,- kritéria přijatelnosti zkoušky a) — souběžná negativní kontrola:- absolutní životaschopnost (absorbance extraktu NR) ozářených a neozářených buněk,- dosavadní údaje pro negativní kontrolu, střední hodnota a směrodatná odchylka,- kritéria přijatelnosti zkoušky b) — souběžná pozitivní kontrola:- hodnoty EC50 (+UVA), EC50 (-UVA) a PIF-pozitivní kontrolní chemické látky,- dosavadní údaje pozitivní kontrolní chemické látky: hodnoty EC50 (+UVA), EC50 (-UVA) a PIF, střední hodnota a směrodatná odchylka.Rozbor výsledků.Závěry.4. LITERATURA(1) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H. G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Moldenhauer, F., Moore, L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., Willshaw, A. (1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in vitro 8, 793-796.(2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, 7-8.(3) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pechovitch, G., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., Brantom, P. (1998), EU/COLIPA "In vitro phototoxicity", validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, 305-327.(4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996.(5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology in Vitro 7, 95-102.(6) Santamaria, L., Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, XI–XXXV.(7) Spielmann, H., Lovell, W. W., Hölzle, E., Johnson, B. E., Maurer, T., Miranda, M. A., Pape, W. J. W., Sapora, O., Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, 314-348.(8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization. V: The science of photobiology, (K. C. Smith, ed.), Plenum Press, New York, 2. vyd., 79-110.(9) Borenfreund, E., Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicol. Lett. 24, 119-124.(10) Lambert, L. A., Warner, W. G., Kornhauser A. (1996). V: Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, (F. N. Marzulli, H. I. Maibach eds.), Taylor & Francis, Washington DC, 5. vyd., 515-530.(11) Tyrrell, R. M., Pidoux M. (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Res. 47, 1825-1829.(12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, navrženo 23. prosince 1997 M. Liebschem, schváleno 6. března 1998 týmem Management Team of the EU/COLIPA project "In Vitro Photoirritation".(13) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, 679-708.(14) Holzhütter, H. G., Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems, 3, 127-138.(15) Holzhütter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, 445-462.""Dodatek+++++ TIFF +++++"[1] Další podrobnosti lze nalézt v literatuře (12).--------------------------------------------------


Důležité právní upozornění

|

32004L0042

Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2004/42/ES ze dne 21. dubna 2004 o omezování emisí těkavých organických sloučenin vznikajících při používání organických rozpouštědel v některých barvách a lacích a výrobcích pro opravy nátěru vozidel a o změně směrnice 1999/13/ES

Úřední věstník L 143 , 30/04/2004 S. 0087 - 0096 CS.ES Kapitola 15 Svazek 08 S. 376  - 385 ET.ES Kapitola 15 Svazek 08 S. 376  - 385 HU.ES Kapitola 15 Svazek 08 S. 376  - 385 LT.ES Kapitola 15 Svazek 08 S. 376  - 385 LV.ES Kapitola 15 Svazek 08 S. 376  - 385 MT.ES Kapitola 15 Svazek 08 S. 376  - 385 PL.ES Kapitola 15 Svazek 08 S. 376  - 385 SK.ES Kapitola 15 Svazek 08 S. 376  - 385 SL.ES Kapitola 15 Svazek 08 S. 376  - 385

		Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2004/42/ESze dne 21. dubna 2004o omezování emisí těkavých organických sloučenin vznikajících při používání organických rozpouštědel v některých barvách a lacích a výrobcích pro opravy nátěru vozidel a o změně směrnice 1999/13/ESEVROPSKÝ PARLAMENT A RADA EVROPSKÉ UNIE,s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství, a zejména na článek 95 této smlouvy,s ohledem na návrh Komise,s ohledem na stanovisko Evropského hospodářského a sociálního výboru [1],v souladu s postupem stanoveným v článku 251 Smlouvy [2],vzhledem k těmto důvodům:(1) Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2001/81/ES ze dne 23. října 2001 o národních emisních stropech pro některé látky znečišťující ovzduší [3] stanoví národní stropy pro emise některých znečišťujících látek, včetně těkavých organických sloučenin (dále jen "VOC"), kterých má být dosaženo do roku 2010 v rámci integrované strategie Společenství v boji proti acidifikaci a přízemnímu ozonu, neobsahuje však mezní hodnoty emisí těchto znečišťujících látek ze specifických zdrojů.(2) Aby členské státy mohly tyto národní emisní stropy pro VOC dodržovat, musí se zaměřit na řadu různých kategorií těchto zdrojů produkujících emise.(3) Tato směrnice doplňuje opatření, která na vnitrostátní úrovni zajišťují dodržování emisních stropů pro VOC.(4) Pokud by neexistovala úprava na úrovni Společenství, právní předpisy členských států stanovující mezní hodnoty emisí VOC by se u některých kategorií výrobků mohly lišit. Tyto rozdíly, jakož i chybějící příslušné právní předpisy v některých členských státech, by mohly vytvářet zbytečné překážky obchodu a porušovat soutěž na vnitřním trhu.(5) Vnitrostátní právní a správní předpisy, které za účelem boje proti přízemnímu ozonu stanoví mezní hodnoty obsahu VOC ve výrobcích, na něž se vztahuje tato směrnice, je proto třeba harmonizovat, aby bylo zajištěno, že nebudou bránit volnému pohybu těchto výrobků.(6) Jelikož cíle navrhovaného opatření, totiž snížení emisí VOC, nemůže být dosaženo na úrovni členských států, neboť emise VOC v jednom členském státě ovlivňují kvalitu ovzduší v jiných členských státech, a proto s ohledem na rozsah a účinky opatření může být snížení emisí VOC lépe dosaženo na úrovni Společenství, může Společenství přijmout opatření v souladu se zásadou subsidiarity stanovenou v článku 5 Smlouvy. V souladu se zásadou proporcionality, stanovenou v uvedeném článku, nepřekračuje tato směrnice rámec toho, co je nezbytné pro dosažení uvedeného cíle.(7) Obsah VOC v barvách, lacích a výrobcích pro opravy nátěru vozidel vede ke značným emisím VOC do ovzduší, které přispívají v místním i přeshraničním rozsahu k tvorbě fotochemických oxidantů v mezní vrstvě troposféry.(8) Obsah VOC v některých barvách, lacích a výrobcích pro opravy nátěru vozidel by proto měl být snížen v technicky a ekonomicky možné míře a se zřetelem ke klimatickým podmínkám.(9) Stanovení a dodržování mezních hodnot obsahu VOC ve výrobcích, na které se vztahuje tato směrnice, je žádoucí v zájmu vysoké úrovně ochrany životního prostředí.(10) Pro výrobky vyrobené před vstupem požadavků této směrnice v platnost by měla být stanovena přechodná opatření.(11) Členské státy by měly mít možnost udělovat individuální povolení, na jejichž základě by bylo možno pro zvláštní účely v přísně omezeném množství prodávat a nakupovat výrobky, u nichž nejsou dodrženy mezní hodnoty rozpouštědel stanovené touto směrnicí.(12) Tato směrnice doplňuje ustanovení Společenství týkající se označování chemických látek a přípravků.(13) Do oblasti působnosti této směrnice by neměla patřit ochrana zdraví spotřebitelů nebo pracovníků a ochrana pracovního prostředí, a proto by opatření přijímaná v tomto směru členskými státy neměla být touto směrnicí dotčena.(14) Je nutno sledovat mezní hodnoty obsahu, aby bylo možné stanovit, zda hmotnostní koncentrace VOC zjištěné v jednotlivých kategoriích barev, laků a výrobků pro opravy nátěru vozidel, na které se vztahuje tato směrnice, jsou v povolených limitech.(15) Protože obsah VOC ve výrobcích používaných při některých činnostech při opravě nátěru vozidel je nyní upraven touto směrnicí, směrnice Rady 1999/13/ES ze dne 11. března 1999 o omezování emisí těkavých organických sloučenin vznikajících při používání organických rozpouštědel při některých činnostech a v některých zařízeních [4] by měla být odpovídajícím způsobem změněna.(16) Členské státy by přesto měly mít možnost zachovat si a zavádět vnitrostátní opatření ke kontrole emisí, které vznikají při činnostech při opravě nátěru silničních vozidel podle směrnice Rady 70/156/EHS ze dne 6. února 1970 o sbližování právních předpisů členských států týkajících se schvalování typu motorových vozidel a jejich přípojných vozidel [5], nebo jejich částí, prováděné jako součást oprav, konzervace nebo dekorace vozidla mimo výrobní zařízení.(17) Tato směrnice by se neměla vztahovat na výrobky prodávané k výlučnému použití v zařízeních, kterým bylo uděleno povolení podle směrnice 1999/13/ES, kde je možno dosáhnout přinejmenším srovnatelného snížení emisí VOC jinými opatřeními k omezení emisí.(18) Členské státy by měly stanovit pravidla pro sankce za porušení ustanovení této směrnice a zajistit jejich uplatňování. Tyto sankce by měly být účinné, přiměřené a odrazující.(19) Členské státy by měly sdělit Komisi zkušenosti, které získaly při provádění této směrnice.(20) Je třeba přezkoumat možnosti snížení obsahu VOC ve výrobcích, na které se tato směrnice nevztahuje, jakož i možnosti dalšího snížení mezních hodnot pro VOC, které již byly stanoveny.(21) Opatření nezbytná k provedení této směrnice by měla být přijata podle rozhodnutí Rady 1999/468/ES ze dne 28. června 1999 o postupech pro výkon prováděcích pravomocí svěřených Komisi [6],PŘIJALY TUTO SMĚRNICI:Článek 1Účel a oblast působnosti1. Účelem této směrnice je omezit celkový obsah VOC v některých barvách a lacích a výrobcích pro opravy nátěru vozidel za účelem prevence nebo snížení znečištění ovzduší troposférickým ozonem, na jehož tvorbě se VOC podílejí.2. K dosažení cíle uvedeného v odstavci 1 harmonizuje tato směrnice technické specifikace pro některé barvy a laky a výrobky pro opravy nátěru vozidel.3. Tato směrnice se vztahuje na výrobky uvedené v příloze I.4. Touto směrnicí nejsou dotčena nebo ovlivněna opatření, včetně požadavků na označování, přijímaná na úrovni Společenství nebo na vnitrostátní úrovni k ochraně zdraví spotřebitelů a pracovníků a jejich pracovního prostředí.Článek 2DefinicePro účely této směrnice se:"příslušným orgánem"  rozumí orgán či orgány nebo subjekty, které jsou podle právních předpisů členského státu odpovědné za plnění povinností vyplývajících z této směrnice;"látkami"  rozumějí chemické prvky a jejich sloučeniny ve stavu, v jakém se vyskytují v přírodě nebo jsou vyrobeny v průmyslu, a to v pevném, kapalném nebo plynném skupenství;"přípravkem"  rozumí směsi nebo roztoky, které se skládají ze dvou nebo více látek;"organickou sloučeninou"  rozumí sloučenina, která obsahuje přinejmenším uhlík a jeden nebo více z těchto prvků: vodík, kyslík, síra, fosfor, křemík, dusík nebo halogen, s výjimkou oxidů uhlíku a anorganických uhličitanů a hydrogenuhličitanů;"těkavou organickou sloučeninou (VOC)"  rozumí organická sloučenina, jejíž počáteční bod varu při atmosférickém tlaku 101,3 kPa je nižší nebo se rovná 250 °C;"obsahem VOC"  rozumí množství těkavých organických sloučenin, vyjádřené v gramech na litr (g/l), ve složení výrobku ve stavu, jak je připraven k použití. Za část obsahu VOC se nepovažuje množství těkavých organických sloučenin v určitém výrobku, které během zasychání chemicky reagují za vzniku složky nátěrové hmoty;"organickým rozpouštědlem"  rozumí VOC, která se používá samotně nebo ve spojení s jinými prostředky k rozpouštění nebo ředění surovin, výrobků nebo odpadů nebo která se používá jako čisticí prostředek k rozpouštění znečišťujících látek, jako dispergační činidlo, jako prostředek k úpravě viskozity či povrchového napětí, jako plastifikátor nebo jako konzervant;"nátěrovou hmotou"  rozumí přípravek, včetně všech organických rozpouštědel nebo přípravků obsahujících organická rozpouštědla nutná k jeho správnému použití, který se používá k vytváření filmu s dekorativním, ochranným nebo jiným funkčním účinkem na určitém povrchu;"filmem"  rozumí souvislá vrstva vzniklá nanesením jednoho nebo několika nátěrů na určitý podklad;"vodou ředitelnými nátěrovými hmotami (VŘNH)"  rozumějí nátěrové hmoty, jejichž viskozita se upravuje vodou;"rozpouštědlovými nátěrovými hmotami (RNH)"  rozumějí nátěrové hmoty, jejichž viskozita se upravuje organickými rozpouštědly;"uváděním na trh"  rozumí zpřístupnění třetím stranám, buď za úplatu, nebo bezplatně. Dovoz na celní území Společenství se pro účely této směrnice považuje za uvádění na trh.Článek 3Požadavky1. Členské státy zajistí, aby výrobky uvedené v příloze I byly ode dne stanoveného v příloze II uváděny na trh na jejich území pouze tehdy, jestliže obsah VOC v těchto výrobcích nepřekračuje mezní hodnoty stanovené v příloze II a jestliže jsou splněna ustanovení článku 4.Ke stanovení, zda byly dodrženy mezní hodnoty obsahu VOC podle přílohy II, se použijí analytické metody podle přílohy III.U výrobků uvedených v příloze I, k nimž je nutno přidat rozpouštědla nebo jiné složky obsahující rozpouštědla, aby byly připraveny k použití, se mezní hodnoty podle přílohy II vztahují na obsah VOC ve výrobku ve stavu, jak je připraven k použití.2. Odchylně od odstavce 1 členské státy osvobodí od plnění výše uvedených požadavků výrobky, které se prodávají výlučně k použití při činnosti, na kterou se vztahuje směrnice 1999/13/ES a která se vykonává v registrovaných nebo povolených zařízeních podle článků 3 a 4 uvedené směrnice.3. Pro účely restaurace a údržby budov a historických vozidel, kterým byla příslušnými orgány přiznána zvláštní historická a kulturní hodnota, mohou členské státy udělovat individuální povolení k prodeji a nákupu přísně omezeného množství výrobků, u nichž nejsou dodrženy mezní hodnoty obsahu VOC stanovené v příloze II.4. Výrobky spadající do oblasti působnosti této směrnice, které prokazatelně byly vyrobeny před datem uvedeným v příloze II a nesplňují požadavky odstavce 1, mohou být uvedeny na trh v období 12 měsíců ode dne, kdy požadavek vztahující se na dotyčný výrobek vstoupil v platnost.Článek 4OznačováníČlenské státy zajistí, aby výrobky stanovené v příloze I byly při uvádění na trh opatřeny štítkem. Na štítku se uvede:a) podkategorie výrobků a příslušné mezní hodnoty VOC v g/l podle přílohy II;b) nejvyšší obsah VOC v g/l v výrobku ve stavu, jak je připraven k použití.Článek 5Příslušný orgánČlenské státy určí příslušný orgán odpovědný za plnění povinností stanovených v této směrnici a nejpozději do 30. dubna 2005 o něm uvědomí Komisi.Článek 6DozorČlenské státy zavedou kontrolní program za účelem dodržování ustanovení této směrnice.Článek 7Předkládání zprávČlenské státy oznámí výsledky kontrolního programu prokazující dosažení souladu s ustanoveními této směrnice, jakož i kategorie a množství výrobků, kterým bylo uděleno povolení podle čl. 3 odst. 3. První dvě zprávy předloží Komisi ve lhůtě 18 měsíců od termínů, které jsou stanoveny v příloze II pro dodržování mezních hodnot obsahu VOC; další zprávy předloží vždy po pěti letech. V souladu s postupem podle čl. 12 odst. 2 Komise v předstihu stanoví společný formulář pro předkládání údajů z dozoru. Roční údaje se sdělují Komisi na její žádost.Článek 8Volný oběhČlenské státy nesmějí z důvodů spojených s touto směrnicí zakazovat, omezovat nebo bránit uvádění na trh výrobků, na které se vztahuje tato směrnice a které ve stavu, jak jsou připraveny k použití, splňují požadavky této směrnice.Článek 9PřezkoumáníKomise se vyzývá, aby Evropskému parlamentu a Radě předložila1. nejpozději do roku 2008 zprávu o výsledcích přezkoumání podle článku 10 směrnice 2001/81/ES. Ve zprávě budou posouzeny:a) rámcové podmínky a možnosti pro snížení obsahu VOC ve výrobcích, na které se nevztahuje tato směrnice, včetně aerosolů pro barvy a laky;b) možnosti dalšího snížení (etapy II) obsahu VOC ve výrobcích pro opravy nátěru vozidel;c) všechny nové aspekty týkající se socioekonomických účinků zavedení etapy II pro barvy a laky;2. nejpozději do 30 měsíců ode dne zavedení mezních hodnot obsahu VOC etapy II podle přílohy II zprávu, v níž bude zejména přihlédnuto ke zprávám podle článku 7 a k výsledkům technologického vývoje při výrobě barev, laků a výrobků pro opravy nátěru vozidel. V této zprávě budou posouzeny rámcové podmínky a možnosti pro další snížení obsahu VOC ve výrobcích, na které se vztahuje tato směrnice, včetně případného rozlišení mezi barvami používanými na interiéry a exteriéry podkategorií d) a e) podle přílohy I bodu 1.1 a přílohy II části A.K těmto zprávám budou v případě potřeby připojeny návrhy na změny této směrnice.Článek 10SankceČlenské státy stanoví pravidla pro sankce za porušení vnitrostátních ustanovení přijatých podle této směrnice a přijmou nezbytná opatření k zajištění jejich provádění. Sankce musí být účinné, přiměřené a odrazující. Členské státy oznámí tato pravidla a opatření Komisi nejpozději do 30. října 2005 a neprodleně ji uvědomí o všech jejich dalších změnách.Článek 11Přizpůsobení technickému pokrokuVšechny změny nezbytné k přizpůsobení přílohy III technickému pokroku přijme Komise v souladu s postupem podle čl. 12 odst. 2.Článek 12Výbor1. Komisi je nápomocen výbor zřízený článkem 13 směrnice Rady 1999/13/ES (dále jen "výbor").2. Odkazuje-li se na tento odstavec, použijí se články 5 a 7 rozhodnutí 1999/468/ES s ohledem na článek 8 zmíněného rozhodnutí.Doba uvedená v čl. 5 odst. 6 rozhodnutí 1999/468/ES je tři měsíce.3. Výbor přijme svůj jednací řád.Článek 13Změna směrnice 1999/13/ES1. Směrnice 1999/13/ES se mění takto:V příloze I v oddílu "Přestříkávání vozidel" se zrušuje tato odrážka:"— nanášení nátěrů na silniční vozidla ve smyslu směrnice 70/156/EHS nebo na jejich části prováděné jako součást oprav, konzervace nebo dekorace vozidla mimo výrobní zařízení nebo".2. Bez ohledu na odstavec 1 mohou členské státy zachovat a zavádět vnitrostátní opatření ke kontrole emisí vznikajících při činnostech při opravě nátěru vozidel, které byly vyřazeny z oblasti působnosti směrnice 1999/13/ES.Článek 14Provedení1. Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 30. října 2005 a neprodleně o nich uvědomí Komisi.Tyto předpisy přijaté členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí být takový odkaz učiněn při jejich úředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy.2. Členské státy sdělí Komisi znění hlavních ustanovení vnitrostátních právních předpisů, které přijmou v oblasti působnosti této směrnice, a předloží jí tabulku ukazující, jak přijatá vnitrostátní ustanovení odpovídají ustanovením této směrnice.Článek 15Vstup v platnostTato směrnice vstupuje v platnost dnem vyhlášení v Úředním věstníku Evropské unie.Článek 16UrčeníTato směrnice je určena členským státům.Ve Štrasburku dne 21. dubna 2004.Za Evropský parlamentpředsedaR. CoxZa RadupředsedaD. Roche[1] Úř. věst. C 220, 16.9.2003, s. 43.[2] Stanovisko Evropského parlamentu ze dne 25. září 2003 (dosud nezveřejněné v Úředním věstníku), společný postoj Rady ze dne 7. ledna 2004 (Úř. věst. C 79 E, 30. 3. 2004, s. 1) a postoj Evropského parlamentu ze dne 30. března 2004 (dosud nezveřejněný v Úředním věstníku).[3] Úř. věst. L 309, 27.11.2001, s. 22.[4] Úř. věst. 85, 29.3.1999, s. 1. Směrnice ve znění nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1882/2003 (Úř. věst. L 284, 31.10.2003, s. 1).[5] Úř. věst. L 42, 23.2.1970, s. 1. Směrnice naposledy pozměněná směrnicí Evropského parlamentu a Rady 2004/3/ES (Úř. věst. L 49, 19.2.2004, s. 36).[6] Úř. věst. L 184, 17.7.1999, s. 23.--------------------------------------------------PŘÍLOHA IOBLAST PŮSOBNOSTI1. Pro účely této směrnice se barvami a laky rozumějí výrobky uvedené níže v podkategoriích, s výjimkou aerosolů. Jsou to nátěrové hmoty používané pro budovy, jejich vybavení a příslušenství a s nimi spojené konstrukce, sloužící k dekorativním, funkčním a ochranným účelům.1.1 Podkategorie:"matné nátěrové hmoty pro stěny a stropy v interiéru"  jsou nátěrové hmoty určené k nanášení na vnitřní stěny a stropy, se stupněm lesku ≤ 25@60o;"lesklé nátěrové hmoty pro stěny a stropy v interiéru"  jsou nátěrové hmoty určené k nanášení na vnitřní stěny a stropy, se stupněm lesku > 25@60o;"nátěrové hmoty pro venkovní stěny z minerálního podkladu"  jsou nátěrové hmoty určené k nanášení na vnější zdivo, cihlové stěny nebo sádrové stěny;"vnitřní/venkovní barvy na dřevo, kov nebo plasty pro vybavení a obklady budov"  jsou nátěrové hmoty určené k nanášení na dveřní a okenní konstrukce a obklady, které vytvářejí krycí film. Určeny jsou pro dřevěné, kovové nebo plastové podklady. Tato podkategorie zahrnuje též podkladové nátěrové hmoty a nátěrové hmoty pro mezivrstvy;"vnitřní/venkovní laky a mořidla na vybavení budov"  jsou nátěrové hmoty určené k nanášení na vybavení budov a vytvářející průhledný nebo poloprůhledný film pro účely dekorace nebo ochrany dřeva, kovu a plastů. Tato podkategorie zahrnuje též krycí lazurovací hmoty na dřevo, kterými se rozumějí nátěrové hmoty vytvářející krycí film a sloužící k dekoraci nebo k ochraně dřeva před povětrnostními vlivy podle normy EN 927-1 (kategorie polostabilní);"nefilmotvorná mořidla"  jsou mořidla, která v souladu s normou EN 927-1:1996 tvoří vrstvu průměrné tloušťky menší než 5 μm, měřeno metodou 5A podle normy ISO 2808:1997;"základní nátěrové hmoty"  jsou nátěrové hmoty s těsnicím nebo izolačním účinkem určené k použití na dřevo nebo na stěny a stropy;"penetrační nátěrové hmoty"  jsou nátěrové hmoty určené ke stabilizaci volných částic podkladu nebo k dosažení hydrofobních vlastností nebo k ochraně dřeva proti zmodrání;"jednosložkové speciální nátěrové hmoty"  jsou speciální nátěrové hmoty na bázi filmotvorných látek. Jsou určeny pro aplikace se zvláštními požadavky, jako jsou základní a vrchní nátěry na plasty, základní nátěry na železné podklady, základní nátěry na reaktivní kovy, jako je zinek a hliník, antikorozní nátěry, nátěrové hmoty na podlahy, včetně dřevěných a betonových podlah, ochrana proti graffiti, protipožární nátěry a nátěry odpovídající hygienickým normám v potravinářském průmyslu a ve zdravotnických zařízeních;"vícesložkové speciální nátěrové hmoty"  jsou nátěrové hmoty ke stejnému použití jako jednosložkové speciální nátěrové hmoty, avšak s druhou složkou (např. terciárními aminy) přidávanou před použitím;"vícebarevné nátěrové hmoty"  jsou nátěrové hmoty, které přímo při prvním nanesení vytvářejí dvoubarevné nebo vícebarevné efekty;"nátěrové hmoty s dekorativními efekty"  jsou nátěrové hmoty určené k vytváření zvláštních estetických efektů na speciálně upravených, předem natřených podkladech nebo podkladových nátěrech, s následným opracováním různými nástroji během fáze zasychání.2. Pro účely této směrnice se "výrobky pro opravy nátěru vozidel" rozumějí výrobky uvedené níže v podkategoriích. Používají se k nátěru silničních vozidel nebo jejich částí podle směrnice 70/156/EHS, prováděnému jako součást oprav, konzervace nebo dekorace vozidla mimo výrobní zařízení.2.1 Podkategorie:"výrobky pro přípravné a čisticí operace" i) "přípravné prostředky" zahrnují čisticí prostředky na nástroje (výrobky určené k čištění stříkacích pistolí a dalších zařízení), odstraňovače nátěrů, odmašťovadla (včetně antistatických činidel pro plasty) a odstraňovače silikonu;ii) "čisticí prostředek" je výrobek určený k odstranění povrchových nečistot během příprav na nanášení nátěrových hmot a před jejich nanesením;"karosářské plniče a tmely"  jsou viskózní látky určené k vyplnění hlubokých nerovností povrchu před nanesením vyrovnávacího nátěru;"základní nátěrové hmoty" i) "vyrovnávací nátěrové hmoty" jsou nátěrové hmoty určené k nanášení bezprostředně před nanesením vrchního nátěru ke zvýšení odolnosti proti korozi a přilnavosti vrchního nátěru a k dosažení rovnoměrné jakosti povrchu vyplněním drobných povrchových nerovností;ii) "základní nátěrové hmoty na kov" jsou nátěrové hmoty určené k nanášení jako základní nátěr, jako jsou promotory přilnavosti, plniče, vyrovnávací nátěrové hmoty, podkladové nátěrové hmoty, základní nátěrové hmoty na plasty, nátěrové hmoty pro nanášení způsobem mokrý do mokrého, plniče neurčené k broušení a stříkací plniče;iii) "reaktivní základní nátěrové hmoty" jsou nátěrové hmoty obsahující nejméně 0,5 hmotnostních % kyseliny fosforečné, určené k přímému nanášení na holý povrch kovu k zajištění odolnosti proti korozi a přilnavosti, nátěrové hmoty používané jako svařitelné základní nátěrové hmoty a mořicí roztoky pro galvanizované a pozinkované povrchy;"vrchní nátěrové hmoty" i) "podkladové nátěrové hmoty" jsou pigmentované nátěrové hmoty určené k dosažení požadovaných barevných odstínů a optických efektů, avšak nikoli lesku nebo odolnosti povrchu nátěrového systému;ii) "laky" jsou průhledné nátěrové hmoty určené k vytváření konečného lesku a odolnosti nátěrového systému;"speciální vrchní nátěrové hmoty"  jsou nátěrové hmoty určené k nanášení jako vrchní nátěry se zvláštními vlastnostmi v jediné vrstvě, jako je metalíza a perleťové efekty, dále jsou to vysoce odolné barevné nebo čiré nátěry (např. nátěry odolné proti poškrábání a fluorované čiré nátěry), reflexní podkladové nátěry, vrchní nátěry se strukturními efekty (např. tepané efekty), protiskluzové nátěry, plniče na spodky karoserie, ochranné nátěry proti nárazům, nátěry interiérů a aerosoly.--------------------------------------------------PŘÍLOHA IIA. NEJVYŠŠÍ MEZNÍ HODNOTY OBSAHU VOC PRO BARVY A LAKY| Podkategorie výrobků | Druh | Etapa I (g/l) [1] (od 1. 1. 2007) | Etapa II (g/l) [1] (od 1. 1. 2010) |a | matné nátěrové hmoty pro stěny a stropy v interiéru (stupeň lesku ≤ 25@60o) | VŘNH | 75 | 30 |RNH | 400 | 30 |b | lesklé nátěrové hmoty pro stěny a stropy v interiéru (stupeň lesku > 25@60o) | VŘNH | 150 | 100 |RNH | 400 | 100 |c | nátěrové hmoty pro venkovní stěny z minerálního podkladu | VŘNH | 75 | 40 |RNH | 450 | 430 |d | vnitřní/venkovní barvy na dřevo a kov pro vybavení a obklady budov | VŘNH | 150 | 130 |RNH | 400 | 300 |e | vnitřní/venkovní laky a mořidla na vybavení budov, včetně krycích lazurovacích hmot na dřevo | VŘNH | 150 | 130 |RNH | 500 | 400 |f | vnitřní/venkovní nefilmotvorná mořidla | VŘNH | 150 | 130 |RNH | 700 | 700 |g | základní nátěrové hmoty | VŘNH | 50 | 30 |RNH | 450 | 350 |h | penetrační nátěrové hmoty | VŘNH | 50 | 30 |RNH | 750 | 750 |i | jednosložkové speciální nátěrové hmoty | VŘNH | 140 | 140 |RNH | 600 | 500 |j | vícesložkové reaktivní nátěrové hmoty pro specifické účely, např. na podlahy | VŘNH | 140 | 140 |RNH | 550 | 500 |k | vícebarevné nátěrové hmoty | VŘNH | 150 | 100 |RNH | 400 | 100 |l | nátěrové hmoty s dekorativními efekty | VŘNH | 300 | 200 |RNH | 500 | 200 |B. NEJVYŠŠÍ MEZNÍ HODNOTY OBSAHU VOC PRO VÝROBKY PRO OPRAVY NÁTĚRU VOZIDEL| Podkategorie výrobků | Výrobky | VOC g/l [2] (od 1. 1. 2007) |a | výrobky pro přípravné a čisticí operace | přípravné prostředky | 850 |čisticí prostředky | 200 |b | karosářské plniče a tmely | všechny druhy | 250 |c | základní nátěrové hmoty | vyrovnávací nátěrové hmoty a základní nátěrové hmoty (na kov) | 540 |reaktivní základní nátěrové hmoty | 780 |d | vrchní nátěrové hmoty | všechny druhy | 420 |e | speciální vrchní nátěrové hmoty | všechny druhy | 840 |[1] g/l připravený k použití.[2] g/l připravený k použití. Případný obsah vody ve výrobku připraveném k použití se odečte, s výjimkou výrobků v podkategorii a.--------------------------------------------------PŘÍLOHA IIIMETODY PODLE ČL. 3 ODST. 1Parametr | Jednotky | Zkouška |Metoda | Datum zveřejnění |Obsah VOC | g/l | ISO 11890-2 | 2002 |Obsah VOC za přítomnosti reaktivních ředidel | g/l | ASTMD 2369 | 2003 |--------------------------------------------------