title: Směrnice Rady 98/81/ES ze dne 26. října 1998, kterou se mění směrnice 90/219/EHS o uzavřeném nakládání s geneticky modifikovanými mikroorganismy

text:
Důležité právní upozornění

|

31998L0081

Úřední věstník L 330 , 05/12/1998 S. 0013 - 0031

		Směrnice Rady 98/81/ESze dne 26. října 1998,kterou se mění směrnice 90/219/EHS o uzavřeném nakládání s geneticky modifikovanými mikroorganismyRADA EVROPSKÉ UNIE,s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství, a zejména na čl. 130s odst. 1 této smlouvy,s ohledem na návrh Komise [1],s ohledem na stanovisko Hospodářského a sociálního výboru [2],v souladu s postupem stanoveným článkem 189c Smlouvy [3],(1) vzhledem k tomu, že podle Smlouvy by činnost Společenství týkající se životního prostředí měla být založena na zásadě preventivních činností, jejichž cílem je zachovat, chránit a zlepšovat životní prostředí a chránit lidské zdraví;(2) vzhledem k tomu, že uzavřené nakládání s geneticky modifikovanými mikroorganismy (GMM) by mělo být klasifikováno ve vztahu k rizikům, která představují pro lidské zdraví a životní prostředí; že taková klasifikace má být v souladu s mezinárodní praxí a má být založena na posouzení rizik;(3) vzhledem k tomu, že pro zajištění vysoké úrovně ochrany musí uzavření a další ochranná opatření použitá při uzavřeném nakládání odpovídat třídě uzavřeného nakládání; že v případě nejistoty má být použito uzavření a další ochranná opatření pro vyšší třídu, dokud patřičné údaje neprokážou oprávněnost méně přísných opatření;(4) vzhledem k tomu, že by měla být přijata a používána příslušná opatření pro dohled nad zneškodňováním materiálů z uzavřeného nakládání s GMM;(5) vzhledem k tomu, že GMM, které jsou zneškodňovány, aniž byla zajištěna opatření pro specifické uzavření a opatření omezující jejich styk s obyvatelstvem a životním prostředím, nespadají do oblasti působnosti této směrnice; že se na ně mohou vztahovat jiné právní předpisy Společenství, jako např. směrnice Rady 90/220/EHS ze dne 23. dubna 1990 o záměrném uvolňování geneticky modifikovaných organismů do životního prostředí [4];(6) vzhledem k tomu, že výjimky na základě této směrnice nezakládají výjimky podle jakýchkoli jiných platných právních předpisů Společenství, jako např. směrnice 90/220/EHS;(7) vzhledem k tomu, že pro všechny činnosti týkající se GMM mají platit zásady správné mikrobiologické praxe, bezpečnosti a hygieny práce v souladu s příslušnými právními předpisy Společenství;(8) vzhledem k tomu, že uzavření a další ochranná opatření platná pro uzavřené nakládání by měla být pravidelně kontrolována;(9) vzhledem k tomu, že osoby zaměstnané v provozech uzavřeného nakládání mají být v souladu s požadavky příslušných právních předpisů Společenství konzultovány, zejména podle směrnice Rady 90/679/EHS ze dne 26. listopadu 1990 o ochraně pracovníků před riziky spojenými s expozicí biologických činitelů při práci (sedmá samostatná směrnice ve smyslu čl. 16 odst. 1 směrnice 89/391/EHS) [5];(10) vzhledem k tomu, že ve směrnici 90/219/EHS [6] byly shledány nedostatky; že správní postupy a požadavky na oznámení by měly být vázány na rizika uzavřeného nakládání;(11) vzhledem k tomu, že směrnice 90/219/EHS neumožňovala dostatečné přizpůsobení technickému pokroku; že je nutno technické části této směrnice technickému pokroku přizpůsobit;(12) vzhledem k tomu, že pro provádění směrnice 90/219/EHS by bylo výhodné připojit seznam GMM, které jsou bezpečné pro lidské zdraví a životní prostředí; že tyto GMM by měly splňovat určitá kritéria, aby bylo možné stanovit jejich bezpečnost;(13) vzhledem k rychlosti rozvoje biotechnologie, vzhledem k povaze kritérií, která je nutno stanovit, a vzhledem k omezenému rozsahu seznamu je namístě, aby Rada tato kritéria stanovila a přezkoumala;(14) vzhledem k tomu, že nyní je již k dispozici značné množství poznatků a zkušeností s riziky spojenými s uzavřeným nakládáním s GMM;(15) vzhledem k tomu, že směrnice 90/219/EHS by tudíž měla být odpovídajícím způsobem pozměněna,PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:Článek 1Směrnice 90/219/EHS se mění takto:1. Články 2 až 16 se nahrazují tímto:"Článek 2"mikroorganismem"  rozumí jakákoli mikrobiologická entita, buněčná nebo nebuněčná, schopná rozmnožování nebo přenosu genetického materiálu, včetně virů, viroidů, živočišných a rostlinných buněk v kultuře;"geneticky modifikovaným mikroorganismem (GMM)" i) ke genetické modifikaci dochází přinejmenším pomocí technik uvedených v příloze I části A;ii) techniky uvedené v příloze I části B nejsou považovány za techniky vedoucí ke genetickým modifikacím;"uzavřeným nakládáním"  rozumí každá činnost, při které jsou mikroorganismy geneticky modifikovány nebo při níž jsou GMM pěstovány, uchovávány, dopravovány, ničeny, zneškodňovány nebo jakýmkoli jiným způsobem používány a pro kterou jsou používána specifická opatření pro uzavření, aby byl omezen styk těchto GMM s obyvatelstvem a životním prostředím a zajištěna vysoká úroveň jejich ochrany;"nehodou"  rozumí jakákoli událost, při níž v průběhu uzavřeného nakládání dojde k významnému a neúmyslnému uvolnění GMM, které může představovat bezprostřední nebo pozdější ohrožení lidského zdraví nebo životního prostředí;"uživatelem"  rozumí jakákoli fyzická nebo právnická osoba, která je zodpovědná za uzavřené nakládání s GMM;"oznámením"  rozumí předložení požadovaných informací příslušným orgánům členského státu.Článek 3Aniž je dotčen čl. 5 odst. 1, tato směrnice se nevztahuje:- na genetické modifikace získané použitím technik/metod uvedených v příloze II části A nebo- na uzavřené nakládání týkající se pouze typů GMM, které splňují kritéria uvedená v příloze II části B, čímž je potvrzena jejich bezpečnost pro lidské zdraví a životní prostředí. Seznam těchto typů GMM je uveden v příloze II části C.Článek 4Ustanovení čl. 5 odst. 3, čl. 5 odst. 6 a články 6 až 12 se nevztahují na dopravu GMM po silnici, železnici, vnitrozemských vodních cestách, po moři ani letecky.Tato směrnice se nevztahuje na uchovávání, pěstování, dopravu, ničení, zneškodňování nebo používání GMM, které byly uvedeny na trh v souladu se směrnicí Rady 90/220/EHS ze dne 23. dubna 1990 o záměrném uvolňování geneticky modifikovaných organismů do životního prostředí [7] nebo podle jiných právních předpisů Společenství, které stanoví specifické postupy posouzení rizika pro životní prostředí podobné postupu posouzení, který stanovená uvedená směrnice, za předpokladu, že uzavřené nakládání je v souladu s podmínkami souhlasu s uvedením na trh, pokud takové podmínky existují.Článek 51. Členské státy zajistí, aby byla přijata veškerá vhodná opatření pro předcházení nepříznivým účinkům na lidské zdraví a životní prostředí, které by mohly vznikat v důsledku uzavřeného nakládání s GMM.2. Za tímto účelem uživatel vypracuje posouzení uzavřeného nakládání z hlediska možných rizik pro lidské zdraví a životní prostředí, která tato uzavřená nakládání mohou přivodit, a využije k tomu minimálně prvky posouzení uvedené v příloze III částech A a B.3. Výsledkem posouzení uvedeného v odstavci 2 bude konečná klasifikace uzavřených nakládání do čtyř tříd za použití postupu uvedeného v příloze III, jehož výsledkem bude přiřazení úrovní uzavření v souladu s článkem 6:Třída 1 : činnosti bez rizika nebo se zanedbatelným rizikem, tj. činnosti, při nichž k ochraně lidského zdraví a životního prostředí stačí úroveň uzavření 1.Třída 2 : činnosti s nízkým rizikem, tj. činnosti, při nichž k ochraně lidského zdraví a životního prostředí stačí úroveň uzavření 2.Třída 3 : činnosti s mírným rizikem, tj. činnosti, při nichž k ochraně lidského zdraví a životního prostředí stačí úroveň uzavření 3.Třída 4 : činnosti s vysokým rizikem, tj. činnosti, při nichž je k ochraně lidského zdraví a životního prostředí nutná úroveň uzavření 4.4. Jestliže existují pochybnosti o tom, která třída je pro navrhované uzavřené nakládání vhodná, musí být použita přísnější ochranná opatření, dokud nebudou ve shodě s příslušným orgánem k dispozici dostatečné informace, které použití méně přísných opatření dostatečně odůvodní.5. Posouzení uvedené v odstavci 2 musí brát zvláštní zřetel na zneškodňování odpadu a odpadních tekutin. Kde to je vhodné, budou uplatněna nezbytná bezpečnostní opatření k ochraně lidského zdraví a životního prostředí.6. Záznam posouzení podle odstavce 2 bude uložen u uživatele a ve vhodné formě zpřístupněn příslušnému orgánu jako součást oznámení podle článků 7, 9 a 10 nebo na vyžádání.Článek 61. S výjimkou případů, kdy odstavec 2 přílohy IV připouští použití jiných metod, uplatní uživatel obecné zásady a vhodné uzavření a další ochranná opatření stanovená v příloze IV, které odpovídají třídě uzavřeného nakládání tak, aby pracoviště a životní prostředí byla GMM vystavena na nejnižší prakticky dosažitelné úrovni a aby byl zajištěn vysoký stupeň bezpečnosti.2. Posouzení uvedené v čl. 5 odst. 2 a uzavření a ostatní ochranná opatření jsou přezkoumávána pravidelně a v následujících případech také neprodleně:a) opatření na uzavření nejsou nadále přiměřená nebo třída, do níž bylo uzavřené nakládání zařazeno, již neodpovídá skutečnosti nebob) existuje důvodné podezření, že toto posouzení již není vzhledem k novým vědeckým nebo technickým poznatkům správné.Článek 7Jestliže se má v nějakém zařízení poprvé přistoupit k uzavřenému nakládání, je uživatel před zahájením takovéhoto nakládání povinen předložit příslušným orgánům oznámení obsahující přinejmenším informace uvedené v příloze V části A.Článek 8Po předložení oznámení podle článku 7 může následovat uzavřené nakládání třídy 1 bez dalšího oznámení. Uživatelé GMM ve třídě 1 uzavřeného nakládání jsou povinni vést a uchovat záznam všech posouzení uvedených v čl. 5 odst. 6 a na požádání tento záznam zpřístupnit příslušnému orgánu.Článek 91. Pro první a další uzavřené nakládání třídy 2, které bude prováděno v zařízeních oznámených podle článku 7, musí být předloženo oznámení obsahující informace uvedené v příloze V části B.2. Jestliže zařízení byla předmětem předchozího oznámení o provádění uzavřeného nakládání třídy 2 nebo vyšší a všechny požadavky pro příslušný souhlas byly splněny, může být uzavřené nakládání třídy 2 zahájeno ihned po tomto novém oznámení.Žadatel může však požádat příslušný orgán o rozhodnutí o formálním povolení. Toto rozhodnutí musí být vydáno do 45 dnů od předložení oznámení.3. Jestliže zařízení nebyla předmětem předchozího oznámení o provádění uzavřeného nakládání třídy 2 nebo vyšší, může být uzavřené nakládání třídy 2, pokud se příslušný orgán nevyjádří v opačném smyslu, zahájeno po uplynutí 45 dnů od předložení oznámení podle odstavce 1 nebo se souhlasem příslušného orgánu i dříve.Článek 101. Pro první a další uzavřená nakládání třídy 3 nebo 4, která mají být prováděna v zařízeních oznámených v souladu s článkem 7, musí být předloženo oznámení obsahující informace uvedené v příloze V části C.2. Uzavřené nakládání třídy 3 a vyšší nelze provádět bez předchozího souhlasu příslušného orgánu, který své rozhodnutí sdělí písemně:a) nejpozději do 45 dnů po předložení nového oznámení v případě zařízení, která již byla předmětem předchozího oznámení o uzavřeném nakládání třídy 3 nebo vyšší a u nichž již byly splněny všechny požadavky pro příslušný souhlas pro stejnou nebo vyšší třídu uzavřeného nakládání, jako je ta, v níž se má dotyčné nakládání provádět;b) v ostatních případech nejpozději do 90 dnů po předložení oznámení.Článek 111. Členské státy určí příslušný orgán nebo orgány, které provedou opatření, jež přijmou v souvislosti s použitím této směrnice, a které rovněž přijmou oznámení podle článků 7, 9 a 10 a potvrdí jejich přijetí.2. Příslušné orgány ověří shodu oznámení s požadavky této směrnice, přesnost a úplnost poskytnutých údajů, správnost posouzení podle čl. 5 odst. 2 a třídu uzavřeného nakládání a popřípadě i vhodnost uzavření a dalších ochranných opatření, opatření pro nakládání s odpady a opatření pro případ nehody.3. Pokud je to nezbytné, příslušný orgán může:a) požádat uživatele o poskytnutí dalších informací nebo o úpravu podmínek navrhovaného uzavřeného nakládání nebo o úpravu třídy, do níž je toto uzavřené nakládání zařazeno. V tomto případě může příslušný orgán požadovat, aby uzavřené nakládání, je-li zatím pouze v návrhu, nebylo zahájeno nebo, jestliže již probíhá, aby bylo pozastaveno nebo ukončeno, dokud příslušný orgán neudělí souhlas na základě dalších získaných informací nebo upravených podmínek tohoto uzavřeného nakládání;b) omezit dobu, na kterou má být uzavřené nakládání povoleno, nebo je podřídit určitým specifickým podmínkám.4. Pro účely vypočtení lhůt uvedených v článcích 9 a 10 nesmějí být zahrnuta období, během nichž příslušný orgán:- čeká na další údaje, které si mohl vyžádat od oznamovatele v souladu s odstavcem 3 písm. a), nebo- provádí průzkum veřejného mínění nebo konzultace podle článku 13.Článek 12Jestliže se uživatel seznámí s novými příslušnými skutečnostmi nebo pokud upraví uzavřené nakládání způsobem, který by mohl mít významné důsledky pro rizika spojená s tímto nakládáním, uvědomí o tom co nejdříve příslušný orgán a upraví oznámení podle článků 7, 9 a 10.Jestliže příslušný orgán následně získá informace, které by mohly mít významné důsledky pro rizika spojená s uzavřeným nakládáním, může uživatele požádat o úpravu podmínek nebo může uzavřené nakládání pozastavit či ukončit.Článek 13Považuje-li to členský stát za vhodné, může v otázkách hledisek navrhovaného uzavřeného nakládání konzultovat veřejnost, aniž je dotčen článek 19.Článek 14Příslušné orgány zajistí, aby před zahájením uzavřeného nakládání:a) byl vypracován havarijní plán pro uzavřené nakládání v případech, kdy selhání uzavíracích opatření může vést k vážnému nebezpečí, ať již bezprostřednímu nebo následnému, pro osoby vně objektů nebo pro životní prostředí, s výjimkou případů, kdy byl takový havarijní plán podle jiných právních předpisů Společenství již vypracován;b) byly institucím a orgánům, které mohou být nehodou postiženy, poskytnuty informace o těchto havarijních plánech, včetně příslušných bezpečnostních opatření, která mají být použita, a to vhodným způsobem a aniž by si je musely tyto orgány vyžádat. Tyto informace jsou ve vhodných intervalech aktualizovány. Jsou rovněž veřejně přístupné.Dotyčné členské státy zpřístupní současně dalším dotyčným státům tytéž informace, které poskytují vlastním státním příslušníkům a které poslouží jako základ pro nezbytné konzultace v rámci dvoustranných vztahů.Článek 151. Členské státy přijmou nezbytná opatření k tomu, aby uživatel v případě nehody musel v souladu s článkem 11 příslušnému orgánu neprodleně poskytnout informace:- o okolnostech nehody,- údaje o druhu a množství příslušných GMM,- všechny informace nezbytné k posouzení účinků nehody na zdraví obyvatel a životní prostředí,- o přijatých havarijních opatřeních.2. V případech, kdy se předávají informace podle odstavce 1, se od členských států vyžaduje, aby:- zajistily, že budou přijata nezbytná opatření a že bude bezprostředně varován každý členský stát, který by mohl být nehodou zasažen;- shromáždily, pokud je to možné, informace nezbytné k úplné analýze nehody a podaly, a pokud je to vhodné, vypracovaly doporučení pro předcházení podobným nehodám v budoucnosti, případně pro omezení jejich účinků.Článek 161. Od členských států se vyžaduje, aby:a) s členskými státy, které by mohly být postiženy případnou nehodou, konzultovaly navrhované provádění havarijních plánů;b) co nejdříve uvědomily Komisi o jakékoli nehodě v rozsahu působnosti této směrnice a poskytly podrobnosti o okolnostech nehody, druhu a množství GMM, kterých se nehoda týkala, o přijatých následných opatřeních a jejich účinnosti, dále poskytly analýzu nehody, včetně doporučení k omezení a předcházení podobným nehodám v budoucnosti.2. Komise po konzultaci s členskými státy stanoví postup pro výměnu informací podle odstavce 1. Komise rovněž zřídí a povede soupis nehod v oblasti působnosti této směrnice, který bude k dispozici členským státům a bude obsahovat též analýzy příčin nehod, získané zkušenosti a opatření přijatá k předcházení podobným nehodám v budoucnosti."2. Články 18, 19 a 20 se nahrazují tímto:"Článek 181. Členské státy zašlou Komisi koncem každého roku souhrnnou zprávu o uzavřených nakládáních tříd 3 a 4 oznámených v průběhu roku podle článku 10, včetně popisu, účelu a rizik těchto uzavřených nakládání.2. Každé tři roky, poprvé dne 5. června 2003, zašlou členské státy Komisi souhrnnou zprávu o svých zkušenostech s touto směrnicí.3. Každé tři roky, poprvé dne 5. června 2004, zveřejní Komise souhrn založený na zprávách podle odstavce 2.4. Komise může zveřejnit obecné statistické údaje o provádění této směrnice a o souvisejících záležitostech, pokud tyto informace neobsahují žádné údaje, které by mohly poškodit postavení uživatele v hospodářské soutěži.Článek 191. V případech, kdy zveřejnění informací může mít nepříznivý vliv na jeden nebo více bodů uvedených v čl. 3 odst. 2 směrnice Rady 90/313/EHS ze dne 7. června 1990 o svobodě přístupu k informacím o životním prostředí [8], může oznamovatel v oznámeních předkládaných podle této směrnice označit informace, které mají být považovány za důvěrné. V takových případech musí podat ověřitelné zdůvodnění.2. Příslušný orgán po konzultaci s oznamovatelem rozhodne, které informace budou považovány za důvěrné, a o svém rozhodnutí oznamovatele uvědomí.3. Za důvěrné nesmějí být v žádném případě pokládány následující údaje, pokud jsou předloženy podle článků 7, 9 a 10:- obecná charakteristika GMM, jméno a adresa oznamovatele a místo nakládání,- třída uzavřeného nakládání a opatření pro uzavření,- zhodnocení předvídatelných účinků, zejména všech škodlivých účinků na lidské zdraví a životní prostředí.4. Komise a příslušné orgány nevyzradí třetím stranám žádnou informaci, o jejíž důvěrnosti bylo podle odstavce 2 rozhodnuto a která byla oznámena nebo jinak poskytnuta podle této směrnice, a budou chránit práva duševního vlastnictví týkající se obdržených údajů.5. Jestliže oznamovatel z jakýchkoli důvodů oznámení stáhne, musí příslušný orgán respektovat důvěrnost poskytnutých informací.Článek 20O změnách a doplňcích nezbytných pro přizpůsobení přílohy II části A a příloh III až V technickému pokroku a o přizpůsobení přílohy II části C se rozhodne v souladu s postupem uvedeným v článku 21."3. Vkládá se nový článek, který zní:"Článek 20aDo 5. prosince 2000 přijme Rada přílohu II část B uvádějící kritéria pro zahrnutí typů GMM do přílohy II části C. Rada návrh Komise přijme kvalifikovanou většinou. Změny a doplňky přílohy II části B přijme Rada na návrh Komise kvalifikovanou většinou."4. Přílohy se nahrazují přílohami k této směrnici.Článek 21. Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 18 měsíců od vstupu této směrnice v platnost. Neprodleně o tom uvědomí Komisi.Tato opatření přijatá členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí být takový odkaz učiněn při jejich úředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy.2. Členské státy sdělí Komisi znění hlavních vnitrostátních právních předpisů, které přijmou v oblasti působnosti této směrnice.Článek 3Tato směrnice vstupuje v platnost dnem svého zveřejnění v Úředním věstníku Evropských společenství.Článek 4Tato směrnice je určena členským státům.V Lucemburku dne 26. října 1998.Za RadupředsedaW. Schüssel[1] Úř. věst. C 356, 22.11.1977, s. 14 a Úř. věst. C 369, 6.12.1997 s. 12.[2] Úř. věst. C 295, 7.10.1996, s. 52.[3] Stanovisko Evropského parlamentu ze dne 12. března 1997 (Úř. věst. C 115, 14.4.1997, s. 59), společný postoj Rady ze dne 16. prosince 1997 (Úř. věst. C 62, 26.2.1998, s. 1), rozhodnutí Evropského parlamentu ze dne 16. června 1998 (Úř. věst. C 210, 6.7.1998).[4] Úř. věst. L 117, 8.5.1990, s. 15, směrnice naposledy pozměněná směrnicí Komise 97/35/ES (Úř. věst. L 169, 27.6.1997, s. 72).[5] Úř. věst. L 374, 31.12.1990, s. 1, směrnice naposledy pozměněná směrnicí Komise 97/59/ES (Úř. věst. L 282, 15.10.1997, s. 33).[6] Úř. věst. L 117, 8.5.1990, s. 1, směrnice naposledy pozměněná směrnicí Komise 94/51/ES (Úř. věst. L 297, 18.11.1994, s. 29).[7] Úř. věst. L 117, 8.5.1990, s. 15, směrnice naposledy pozměněná směrnicí Komise 97/35/ES (Úř. věst. L 169, 27.6.1997, s. 72).[8] Úř. věst. L 158, 23.6.1990, s. 56.--------------------------------------------------PŘÍLOHA I"PŘÍLOHA IČÁST AMezi techniky genetické modifikace, které uvádí čl. 2 odst. b) bod i) mimo jiné patří:1. Techniky rekombinantních nukleových kyselin zahrnující tvorbu nových kombinací genetického materiálu vložením molekul nukleových kyselin, připravených jakýmkoli způsobem mimo organismus, do viru, bakteriálního plasmidu nebo jiného vektorového systému a jejich začleněním do hostitelského organismu, v němž se přirozeně nevyskytují, ale ve kterém jsou schopny dalšího množení.2. Techniky, při nichž se do mikroorganismu přímo zavádí dědičný materiál připravený mimo mikroorganismus a které zahrnují mikroinjekci, makroinjekci a mikroenkapsulaci.3. Techniky buněčné fúze nebo hybridizace, při nichž se fúzí dvou či několika buněk způsobem, který se v přírodních podmínkách nevyskytuje, tvoří živé buňky s novými kombinacemi dědičného genetického materiálu.ČÁST BTechniky podle článku 2 písm. b) bod ii), u nichž se předpokládá, že vedou ke genetické modifikaci, pokud nezahrnují použití molekul rekombinantních nukleových kyselin nebo GMM připravených jinak než technikami/metodami vyloučenými přílohou II částí A:1. oplození in vitro,2. konjugace, transdukce, transformace nebo jiné přirozené procesy;3. indukce polyploidie.PŘÍLOHA IIČÁST ATechniky nebo metody genetické modifikace poskytující mikroorganismy, jež mají být vyloučeny z oblasti působnosti této směrnice, pokud tyto techniky nezahrnují použití molekul rekombinantní nukleové kyseliny, nebo GMM jiné než ty, které byly připraveny jednou nebo více z níže uvedených technik:1. Mutageneze.2. Buněčná fúze (včetně fúze protoplastů) prokaryontních druhů, jež si vyměňují genetický materiál známými fyziologickými procesy.3. Buněčná fúze (včetně fúze protoplastů) buněk jakýchkoli eukaryontních druhů, včetně tvorby hybridomů a fúze rostlinných buněk.4. Samoklonování spočívající ve vyjmutí sekvencí nukleové kyseliny z některé buňky organismu, po němž může, nebo nemusí následovat opětovné vložení části nebo celé této nukleové kyseliny (nebo jejího syntetického ekvivalentu), která byla, nebo nebyla předtím podrobena enzymatickým nebo mechanickým krokům, do buněk stejného druhu nebo buněk fylogeneticky blízce příbuzných druhů, které si mohou vyměňovat genetický materiál přirozenými fyziologickými procesy, a kde není pravděpodobné, že by výsledný mikroorganismus způsobil choroby člověka, zvířat nebo rostlin.Samoklonování může zahrnovat použití rekombinantních vektorů podložené dlouhodobým záznamem bezpečného používání v příslušném mikroorganismu.ČÁST BKritéria stanovující bezpečnost GMM pro zdraví člověka a životní prostředí:… (bude doplněno v souladu s postupem podle článku 20a)ČÁST CDruhy GMM, které splňují kritéria uvedená v části B:… (bude doplněno v souladu s postupem podle článku 21)PŘÍLOHA IIIZÁSADY, KTERÉ JE NUTNO DODRŽET PŘI POSUZOVÁNÍ PODLE ČL. 5 ODST. 2Tato příloha obecně popisuje základní prvky, které je třeba zvážit, a postup, který je třeba dodržovat při posuzování podle čl. 5 odst. 2. Příloha, především část B, bude doplněna průvodními poznámkami vypracovanými Komisí v souladu s postupem podle článku 21.Průvodní poznámky budou dokončeny nejpozději dne 5. června 2000.A. PRVKY HODNOCENÍ1. Níže uvedené jevy je třeba považovat za potenciálně škodlivé účinky:- choroby člověka, včetně alergických a toxických účinků,- choroby zvířat a rostlin,- škodlivé účinky způsobené nemožností léčit nějakou chorobu nebo zajistit účinnou profylaxi,- škodlivé účinky způsobené usídlením a rozšířením v prostředí,- škodlivé účinky způsobené přirozeným přenosem vloženého genetického materiálu na jiné organismy.2. Posouzení podle čl. 5 odst. 2 má být založeno na těchto prvcích:a) identifikace všech potenciálně škodlivých účinků, zejména účinků spojených:(i) s přijímajícím mikroorganismem;(ii) s vloženým genetickým materiálem (pocházejícím z dárcovského organismu);(iii) s vektorem;(iv) s dárcovským mikroorganismem (pokud je dárcovský mikroorganismus v průběhu operace použit);(v) s výsledným GMM;b) charakteristika činnosti;c) závažnost potenciálně škodlivých účinků;d) pravděpodobnost, že potenciálně škodlivé účinky skutečně nastanou.B. POSTUP3. První etapou procesu posouzení má být identifikace škodlivých vlastností příjemce, případně i identifikace dárcovského mikroorganismu, a všech škodlivých vlastností spojených s vektorem nebo vloženým materiálem, včetně všech změn stávajících vlastností příjemce.4. Pro zařazení do třídy 1 v souladu s článkem 5 jsou obecně považovány pouze geneticky modifikované organismy, jež vykazují tyto charakteristiky:(i) není pravděpodobné, že příjemce nebo mateřský mikroorganismus způsobí chorobu lidí, zvířat nebo rostlin [1];(ii) povaha vektoru a inzertu je taková, že nemohou podmínit fenotyp GMM, který by mohl způsobit chorobu lidí, zvířat nebo rostlin [2] nebo který by mohl mít škodlivé účinky na životní prostředí;(iii) není pravděpodobné, že geneticky modifikovaný organismus způsobí choroby lidí, zvířat nebo rostlin [3] a není pravděpodobné, že bude mít škodlivé účinky na životní prostředí.5. Pro získání informací nezbytných k provedení tohoto postupu může vzít uživatel v úvahu nejprve příslušné právní předpisy Společenství (zejména směrnici Rady 90/679/EHS [4]. Mezinárodní nebo národní klasifikační systémy (např. WHO, NIH atd.) a jejich poslední úpravy podle nových vědeckých poznatků a technického rozvoje mohou být rovněž vzaty v úvahu.Tyto systémy se zabývají přírodními mikroorganismy a jako takové jsou obvykle založeny na schopnosti mikroorganismů způsobovat choroby lidí, zvířat nebo rostlin a na závažnosti a možnostech přenosu těchto chorob. Směrnice 90/679/EHS rozděluje mikroorganismy coby biologické činitele do čtyř tříd rizika na základě případných účinků na zdravého dospělého člověka. Tyto třídy rizika mohou být použity jako vodítko pro kategorizaci činností uzavřeného nakládání do čtyř tříd rizika uvedených v čl. 5 odst. 3. Uživatel též může vzít v úvahu klasifikační systémy vztahující se na rostlinné a živočišné patogeny (které jsou obvykle sestaveny na národní úrovni). Výše uvedené klasifikační systémy poskytují pouze předběžné vyznačení třídy rizika příslušné činnosti a odpovídajícího souboru uzavíracích a kontrolních opatření.6. Identifikace nebezpečí prováděná podle odstavců 3 až 5 má vést k určení úrovně rizika spojeného s GMM.7. Výběr úrovně uzavření a dalších ochranných opatření má být proveden na základě úrovně rizika spojeného s geneticky modifikovaným organismem spolu s uvážením:(i) charakteristiky životního prostředí, které by mohlo být zasaženo (např. zda jsou v tomto prostředí známa společenstva, která by mohla být mikroorganismy z uzavřeného nakládání negativně ovlivněna),(ii) charakteristiky činnosti (např. její rozsah a povaha);(iii) jakékoli nestandardní operace (např. očkování zvířat GMM; zařízení, které by mohlo vytvářet aerosoly).Zvážení bodů (i) až (iii) pro danou činnost může zvýšit, snížit, nebo ponechat beze změny úroveň rizika spojenou s GMM, která byla určena podle odstavce 6.8. Analýza provedená výše popsaným způsobem povede nakonec k zařazení činnosti do jedné ze tříd popsaných v čl. 5 odst. 3.9. Konečná klasifikace uzavřeného nakládání má být potvrzena přezkoumáním celkového postupu posouzení podle čl. 5 odst. 2.PŘÍLOHA IVUZAVŘENÍ A DALŠÍ OCHRANNÁ OPATŘENÍObecné zásady1. Tyto tabulky představují běžné minimální požadavky a opatření nutná pro každou úroveň uzavření.Uzavření se také dosahuje zachováním zásad správné laboratorní praxe, zaškolením, vybavením pro uzavření a zvláštní úpravou příslušných technických zařízení. Při všech činnostech, při nichž se nakládá s GMM, je nutno uplatnit zásady správné mikrobiologické praxe a následující zásady pracovní hygieny a bezpečnosti práce, podle nichž je třeba:i) udržovat expozici pracoviště a životního prostředí působení GMM na nejnižší prakticky dosažitelné úrovni;ii) používat technická kontrolní opatření u zdroje a, pokud je to nutné, doplnit je vhodným osobním ochranným oděvem a dalšími ochrannými pomůckami;iii) v přiměřené míře provádět zkoušky a údržbu zařízení a vybavení; dodržovat kontrolní opatření;iv) kde je to nutné, provádět vně primárních fyzikálních zábran zkoušky na přítomnost životaschopných organismů;v) zajistit patřičné vyškolení pracovníků;vi) na žádost zřídit výbory nebo podvýbory pro biologickou bezpečnost;vii) vytvořit a zavést vnitřní pravidla bezpečnosti práce;viii) na vhodných místech umístit označení pro biologické nebezpečí;ix) zajistit zařízení pro mytí a dekontaminaci pracovníků;x) vést příslušné záznamy;xi) zakázat jídlo, pití, kouření, používání kosmetiky a ukládání potravin pro lidskou spotřebu v pracovních prostorech;xii) zakázat pipetování ústy;xiii) je-li to nutné k zajištění bezpečnosti, vybavit pracoviště písemnými normalizovanými pracovními postupy;xiv) mít přístup k účinným dezinfekčním prostředkům a stanovit určité dezinfekční postupy pro případ kontaminace GMM;xv) zajistit bezpečné uložení kontaminovaného laboratorního zařízení a materiálů.2. Nadpisy tabulek mají informativní charakter:Tabulka I A uvádí minimální požadavky pro laboratorní činnosti.Tabulka I B uvádí dodatky a úpravy tabulky I A pro činnosti ve sklenících/pěstitelských prostorách s využitím GMM.Tabulka 1 C uvádí dodatky a úpravy tabulky I A pro činnosti se zvířaty s využitím GMM.Tabulka II uvádí minimální požadavky na činnosti jiné než laboratorní.V některých zvláštních případech může být potřeba použít kombinaci opatření stejné úrovně z tabulky I A a tabulky II.Pokud mají uživatelé souhlas příslušného orgánu, nemusí v některých případech uplatnit specifikaci podle příslušné úrovně uzavření nebo mohou kombinovat specifikace ze dvou různých úrovní.Výrazem "nepovinný" se v těchto tabulkách rozumí, že uživatel může použít tato opatření případ od případu, v závislosti na posouzení podle čl. 5 odst. 2.3. Při provádění této přílohy mohou členské státy pro objasnění těchto požadavků zařadit do následujících tabulek obecné zásady z odstavců 1 a 2.Tabulka I AUzavření a ostatní ochranná opatření pro laboratorní činnostSpecifikace | Úroveň uzavření || | 1 | 2 | 3 | 4 |1 | Komplex laboratoří: izolace | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se |2 | Laboratoř: utěsnitelná pro zaplynování | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se |Vybavení3 | Povrchy odolávající vodě, kyselinám, alkáliím, rozpouštědlům, dezinfekčním činidlům a dekontaminačním činidlům, snadno čistitelné | Vyžaduje se (pracovní stůl) | Vyžaduje se (pracovní stůl) | Vyžaduje se (pracovní stůl, podlaha) | Vyžaduje se (pracovní stůl, podlaha, strop a stěny) |4 | Vstup do laboratoře hygienickou smyčkou | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Nepovinný | Vyžaduje se |5 | Snížený tlak vzhledem k tlaku v bezprostředním okolí | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Vyžaduje se, s výjimkou | Vyžaduje se |6 | Je třeba, aby nasávaný a odsávaný vzduch byl filtrován filtry HEPA | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Vyžaduje se (HEPA) –odsávaný vzduch, s výjimkou | Vyžaduje se (HEPA) – nasávaný a odsávaný vzduch |7 | Aseptický box | Nevyžaduje se | Nepovinné | Vyžaduje se | Vyžaduje se |8 | Parní tlakový sterilizátor | V aerálu | V budově | Na místě | V laboratoři – se dvěma víky |Pracovní systém9 | Omezený přístup | Nevyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se |10 | Znaky biologického ohrožení na dveřích | Nevyžadují se | Vyžadují se | Vyžadují se | Vyžadují se |11 | Specifická opatření pro regulaci šíření aerosolů | Nevyžadují se | Vyžaduje se omezit šíření na minimum | Vyžaduje se zabránit šíření | Vyžaduje se zabránit šíření |13 | Sprcha | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Nepovinná | Vyžaduje se |14 | Ochranný oděv | Vhodný ochranný oděv | Vhodný ochranný oděv | Vhodný ochranný oděv a (nepovinná) obuv | Úplná výměna oděvu a obuvi před vstupem a výstupem |15 | Ochranné rukavice | Nevyžadují se | Nepovinné | Vyžadují se | Vyžadují se |18 | Účinná kontrola a regulace vektorů (např. hlodavců a hmyzu) | Nepovinná | Vyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se |Odpady19 | Inaktivace GMM ve výtoku z umyvadel, výlevek, vodovodních odpadů a sprch a podobných odpadních tekutinách | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Nepovinná | Vyžaduje se |20 | Inaktivace GMM v kontaminovaných materiálech a odpadech | Nepovinná | Vyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se |Jiná opatření21 | Laboratoř má své vlastní vybavení | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Nepovinné | Vyžaduje se |23 | Je instalován průhled nebo jiné alternativní zařízení, jímž lze pozorovat personál v laboratoři | Nepovinné | Nepovinné | Nepovinné | Vyžaduje se |Specifikace | Úroveň uzavření || | 1 | 2 | 3 | 4 |Budova1 | Skleník: stavba trvalého charakteru | Nevyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se |Vybavení3 | Vstup přes samostatnou místnost se dvěma vzájemně blokovanými dveřmi | Nevyžaduje se | Nepovinný | Nepovinný | Vyžaduje se |4 | Kontrola a regulace odtékající vody | Nepovinná | Omezit odtok na minimum | Zabránit odtoku | Zabránit odtoku |Systém práce6 | Opatření pro regulaci nežádoucích druhů jako jsou hmyz nebo hlodavci | Vyžadují se | Vyžadují se | Vyžadují se | Vyžadují se |7 | Postupy pro přenos živých materiálů mezi skleníkem/prostorem pro pěstování, ochranná konstrukce a laboratoř musí mít šíření GMM pod kontrolou | Omezit šíření na minimum | Omezit šíření na minimum | Zabránit šíření | Zabránit šíření |Tabulka I CUzavření a ostatní ochranná opatření pro činnost v chovných jednotkáchPlatí všechna ustanovení Tabulky I A s těmito dodatky:Specifikace | Úroveň uzavření || | 1 | 2 | 3 | 4 |Vybavení1 | Izolace chovné jednotky | Nepovinná | Vyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se |2 | Chovná zařízení oddělená uzamykatelnými dveřmi | Nepovinná | Vyžadují se | Vyžadují se | Vyžadují se |3 | Chovná zařízení určená k usnadnění dekontaminace (nepromokavé a snadno omyvatelné materiály (klece, atd.)) | Nepovinná | Nepovinná | Vyžadují se | Vyžadují se |4 | Podlaha a stěny, které lze snadno mýt | Nepovinné | Vyžaduje se (podlaha) | Vyžadují se (podlaha a stěny) | Vyžadují se (podlaha a stěny) |5 | Zvířata chovaná v příslušných uzavřených zařízeních, jako jsou klece, kotce nebo nádrže | Nepovinné | Nepovinné | Nepovinné | Nepovinné |6 | Filtry na izolačních jednotkách nebo izolační místnosti | Nevyžadují se | Nepovinné | Vyžadují se | Vyžadují se |Specifikace | Úroveň uzavření || | 1 | 2 | 3 | 4 |Obecná opatření1 | Životaschopné mikroorganismy mají být uzavřeny v systému, který odděluje proces od prostředí (uzavřený systém) | Nepovinné | Vyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se |2 | Zabezpečení a regulace plynů odcházejících z uzavřeného systému | Nevyžaduje se | Vyžaduje se omezit šíření na minimum | Vyžaduje se zabránit šíření | Vyžaduje se zabránit šíření |3 | Zabezpečení a regulace aerosolů během odběru vzorků, přidávání materiálu do uzavřeného systému nebo přenosu materiálu do jiného uzavřeného systému | Nepovinné | Vyžaduje se omezit šíření na minimum | Vyžaduje se zabránit šíření | Vyžaduje se zabránit šíření |4 | Inaktivace celkové kultivační půdy před vyjmutím z uzavřeného systému | Nepovinná | Vyžaduje se, validovanými prostředky | Vyžaduje se, validovanými prostředky | Vyžaduje se, validovanými prostředky |5 | Těsnění a uzávěry mají být navrženy tak, aby zabránily úniku nebo jej omezily na minimum | Bez specifických požadavků | Omezit šíření na minimum | Zabránit šíření | Zabránit šíření |6 | Kontrolovaný prostor má být navržen tak, aby zachytil celý obsah uzavřeného systému, pokud dojde k jeho úniku | Nepovinné | Nepovinné | Vyžaduje se | Vyžaduje se |7 | Kontrolovaný prostor má být utěsnitelný, aby umožňoval zaplynování | Nevyžaduje se | Nepovinné | Nepovinné | Vyžaduje se |Zařízení8 | Vstup do laboratoře hygienickou smyčkou | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Nepovinný | Vyžaduje se |9 | Povrchy odolávající vodě, kyselinám, alkáliím, rozpouštědlům, dezinfekčním činidlům a dekontaminačním činidlům, snadno čistitelné | Vyžaduje se (pracovní stůl, pokud je) | Vyžaduje se (pracovní stůl, pokud je) | Vyžaduje se (pracovní stůl, pokud je, podlaha) | Vyžaduje se (pracovní stůl, podlaha, strop, stěny) |10 | Specifická opatření pro dostatečné větrání kontrolovaného prostoru s cílem omezit kontaminaci vzduchu na minimum | Nepovinná | Nepovinná | Nepovinná | Vyžadují se |11 | Kontrolovaný prostor má být udržován pod nižším tlakem, než je tlak v bezprostředním okolí | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Nepovinné | Vyžaduje se |12 | Je třeba, aby vzduch nasávaný a odsávaný z kontrolovaného prostoru byl filtrován filtry HEPA | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Vyžaduje se (odsávaný vzduch, nepovinné pro nasávaný vzduch) | Vyžaduje se (odsávaný i nasávaný vzduch) |Systém práce13 | Uzavřený systém má být umístěn uvnitř kontrolovaného prostoru | Nevyžaduje se | Nepovinné | Vyžaduje se | Vyžaduje se |14 | Přístup má být omezen pouze na určené pracovníky | Nevyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se |15 | Mají být rozmístěny značky biologického ohrožení | Nevyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se | Vyžaduje se |17 | Pracovníci se mají před opuštěním kontrolovaného prostoru sprchovat. | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Nepovinné | Vyžaduje se |18 | Pracovníci mají nosit ochranný oděv | Vyžaduje se (pracovní oděv) | Vyžaduje se (pracovní oděv) | Vyžaduje se | Úplné převléknutí před vstupem a před výstupem |Odpady22 | Inaktivace GMM ve výtoku z umyvadel, výlevek, vodovodních odpadů a sprch a podobných odpadních tekutinách | Nevyžaduje se | Nevyžaduje se | Nepovinná | Vyžaduje se |23 | Inaktivace GMM v kontaminovaných materiálech a odpadech, včetně GMM v tekutinách odcházejících z procesů před jejich konečným vypuštěním | Nepovinná | Vyžaduje se, validovanými prostředky | Vyžaduje se, validovanými prostředky | Vyžaduje se, validovanými prostředky |PŘÍLOHA VČÁST AInformace požadované pro oznámení podle článku 7:- jméno uživatele (uživatelů), včetně osob odpovědných za dohled a bezpečnost,- informace o školení a kvalifikaci osob odpovědných za dozor a bezpečnost,- podrobné údaje o všech biologických výborech a podvýborech,- adresa a obecný popis areálu,- popis povahy práce, která se bude provádět,- třídy uzavřených nakládání,- pouze pro uzavřená nakládání 1. třídy: souhrn hodnocení podle čl. 5 odst. 2 a informace o nakládání s odpady.ČÁST BInformace požadované pro oznámení podle článku 9:- datum předložení oznámení podle článku 7,- jména osob odpovědných za dohled a bezpečnost, informace o školení a kvalifikaci pracovníků,- použitý přijímající, dárcovský nebo mateřský mikroorganismus a, kde to je namístě, použitý systém či systémy hostitel-vektor,- zdroj (zdroje) a zamýšlené funkce genetického materiálu (materiálů) účastnících se na modifikaci (modifikacích),- identita a charakteristiky GMM,- účel uzavřeného nakládání, včetně předpokládaných výsledků,- přibližné objemy kultur, jichž má být použito,- popis uzavření a ostatních ochranných opatření, která mají být použita, včetně informací o nakládání s odpady, včetně odpadů, které vzniknou, o jejich zpracování, konečné podobě a místě určeném pro jejich uložení,- souhrn posouzení podle čl. 5 odst. 2,- informace nezbytné k tomu, aby příslušný orgán mohl vyhodnotit havarijní plány podle článku 14.ČÁST CInformace požadované pro oznámení podle článku 10:a) - datum předložení oznámení podle článku 7,- jména osob odpovědných za dohled a bezpečnost, informace o školení a kvalifikaci pracovníků;b) - přijímající nebo mateřský mikroorganismus, který má být použit,- systém (systémy) hostitel-vektor, které mají být použity (je-li tento údaj potřebný),- zdroj (zdroje) a zamýšlené funkce genetického materiálu (materiálů), který se účastní modifikace (modifikací),- identita a charakteristiky GMM,- přibližné objemy kultur, které mají být použity;c) - popis uzavření a ostatních ochranných opatření, které mají být použity, včetně informací o nakládání s odpady obsahujících i informaci o druhu a formě odpadů vznikajících během procesu, o jejich zpracování, konečné podobě a místu, které je určeno k jejich uložení,- účel uzavřeného nakládání, včetně předpokládaných výsledků,- popis součástí technické zařízení;d) informace o předcházení nehodám a o havarijních plánech, pokud existují:- upozornění na všechna nebezpečí, která mohou mít původ v umístění zařízení,- popis uplatňovaných preventivních opatření, jako jsou bezpečnostní zařízení, výstražné systémy a způsoby uzavření,- popis postupů a plánů pro ověřování trvalé účinnosti opatření pro uzavření,- popis informací, sdělovaných pracovníkům,- informace nezbytné k tomu, aby mohl příslušný orgán vyhodnotit havarijní plány, jsou-li vyžadovány podle článku 14;e) jeden výtisk posouzení podle čl. 5 odst. 2."[1] Vztahuje se pouze na živočichy a rostliny v životním prostředí, které bude pravděpodobně vystaveno účinkům.[2] Vztahuje se pouze na živočichy a rostliny v životním prostředí, které bude pravděpodobně vystaveno účinkům.[3] Vztahuje se pouze na živočichy a rostliny v životním prostředí, které bude pravděpodobně vystaveno účinkům.[4] Úř. věst. L 374, 31.12.1990, s. 1, směrnice naposledy pozměněná směrnicí Komise 97/59/ES (Úř. věst. L 282, 15.10.1997, s. 33).--------------------------------------------------


Důležité právní upozornění

|

32000L0045

Směrnice Komise 2000/45/ES ze dne 6. července 2000, kterou se stanoví analytické metody Společenství pro stanovení vitamínu A, vitamínu E a tryptofanu v krmivechText s významem pro EHP

Úřední věstník L 174 , 13/07/2000 S. 0032 - 0050 CS.ES Kapitola 3 Svazek 30 S. 12  - 30 ET.ES Kapitola 3 Svazek 30 S. 12  - 30 HU.ES Kapitola 3 Svazek 30 S. 12  - 30 LT.ES Kapitola 3 Svazek 30 S. 12  - 30 LV.ES Kapitola 3 Svazek 30 S. 12  - 30 MT.ES Kapitola 3 Svazek 30 S. 12  - 30 PL.ES Kapitola 3 Svazek 30 S. 12  - 30 SK.ES Kapitola 3 Svazek 30 S. 12  - 30 SL.ES Kapitola 3 Svazek 30 S. 12  - 30

		Směrnice Komise 2000/45/ESze dne 6. července 2000,kterou se stanoví analytické metody Společenství pro stanovení vitamínu A, vitamínu E a tryptofanu v krmivech(Text s významem pro EHP)KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství,s ohledem na směrnici Rady 70/373/EHS ze dne 20. července 1970, kterou se zavádí metody odběru vzorků a analýzy Společenství pro úřední kontrolu krmiv [1], naposledy pozměněnou aktem o přistoupení Rakouska, Finska a Švédska [2], a zejména na článek 2 uvedené směrnice,vzhledem k tomu, že:(1) Směrnice 70/373/EHS stanoví, že úřední kontroly krmiv za účelem zjištění, zda jsou splněny požadavky právních a správních předpisů na jakost a složení krmiv, musí být prováděny za použití metod Společenství pro odběr vzorků a analýzy.(2) Směrnice Rady 70/524/EHS ze dne 23. listopadu 1970 o doplňkových látkách v krmivech [3], naposledy pozměněná nařízením Komise (ES) č. 2439/1999 ze dne 17. listopadu 1999 [4], stanoví, že obsah vitamínu A a vitamínu E musí být uváděn na etiketách, pokud jsou tyto látky přidány do premixů a krmiv.(3) Směrnice Rady 79/373/EHS ze dne 2. dubna 1979 o uvádění krmných směsí na trh [5], naposledy pozměněná směrnicí Komise 2000/16/ES [6], a směrnice Rady 93/74/EHS ze dne 13. září 1993 o krmivech určených ke zvláštním účelům výživy [7], naposledy pozměněná směrnicí 96/25/ES [8], stanoví, že aminokyseliny musí být uváděny na etiketách krmiv.(4) Musí být stanoveny analytické metody pro kontrolu těchto látek.(5) Opatření této směrnice jsou v souladu se stanoviskem Stálého výboru pro krmiva,PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:Článek 1Členské státy zajistí, aby se úřední kontroly obsahu vitamínu A, vitamínu E a tryptofanu v krmivech a premixech prováděly metodami stanovenými v příloze.Článek 2Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 31. srpna 2000. Neprodleně o nich uvědomí Komisi.Budou tyto předpisy používat od 1. září 2000.Tato opatření přijatá členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí být takový odkaz učiněn při jejich úředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy.Článek 3Tato směrnice vstupuje v platnost dvacátým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.Článek 4Tato směrnice je určena členským státům.V Bruselu dne 6. července 2000.Za KomisiDavid Byrnečlen Komise[1] Úř. věst. L 170, 3.8.1970, s. 2.[2] Úř. věst. C 241, 29.8.1994, s. 1.[3] Úř. věst. L 270, 14.12.1970, s. 1.[4] Úř. věst. L 297, 18.11.1999, s. 8.[5] Úř. věst. L 86, 6.4.1979, s. 30.[6] Úř. věst. L 105, 3.5.2000, s. 36.[7] Úř. věst. L 237, 22.9.1993, s. 23.[8] Úř. věst. L 125, 23.5.1996, s. 35.--------------------------------------------------PŘÍLOHAČÁST A STANOVENÍ VITAMÍNU A1. Účel a oblast použitíTato metoda je určena pro stanovení vitamínu A (retinolu) v krmivech a premixech. Vitamín A zahrnuje all-trans-retinyl alkohol a jeho cis izomery, které se stanoví touto metodou. Obsah vitamínu A je vyjádřen v mezinárodních jednotkách (IU) na kg. Jedna IU odpovídá aktivitě 0,300 μg all-trans-vitamín A alkoholu nebo 0,344 μg all-trans-vitamín A acetátu nebo 0,550 μg all-trans-vitamín A palmitátu.Mez stanovitelnosti je 2000 IU vitamínu A/kg.2. PrincipVzorek je hydrolyzován etanolovým roztokem hydroxidu draselného a vitamín A je extrahován do petroléteru. Rozpouštědlo je odstraněno odpařením a zbytek se rozpustí v metanolu a, pokud je to nutné, zředí na požadovanou koncentraci. Obsah vitamínu A se stanoví reverzní fází vysoce účinné kapalinové chromatografie (RP-HPLC) za použití UV nebo fluorescenční detekce. Chromatografické parametry jsou vybírány tak, aby nedošlo k oddělení all-trans-vitamín A alkoholu a jeho cis izomerů.3. Činidla3.1 Etanol, σ = 96 %3.2 Petroléter, rozsah varu 40 až 60 °C3.3 Metanol3.4 Roztok hydroxidu draselného, β = 50 g/100 ml3.5 Roztok askorbanu sodného, β = 10 g/100 ml (viz 7.7 poznámky)3.6 Sulfid sodný, Na2S. x H2O (x = 7–9)3.6.1 Roztok sulfidu sodného, c = 0,5 mol/l v glycerolu, β = 120 g/l (pro x = 9) (viz 7.8 poznámky)3.7 Roztok fenolftaleinu, β = 2 g/100 ml v etanolu (3.1)3.8 2-propanol3.9 Mobilní fáze pro HPLC: směs metanolu (3.3) a vody, např. 980 + 20 (objemově + objemově). Extrakční poměr bude stanoven charakteristikami použité kolony.3.10 Dusík, prostý kyslíku3.11 All-trans-vitamín A acetát, extra čistý, ověřené aktivity, např. 2,80 x 106 IU/g3.11.1 Zásobní roztok all-trans-vitamín A acetátu: Odvažte s přesností na 0,1 mg 50 mg acetátu vitamínu A (3.11) do 100 ml odměrné baňky. Rozpusťte ve 2-propanolu (3.8) a doplňte po značku stejným rozpouštědlem. Nominální koncentrace tohoto roztoku je 1400 IU vitamínu A na ml. Přesný obsah musí být stanoven podle 5.6.3.1.3.12 All-trans-vitamín A palmitát, extra čistý, ověřené aktivity, např. 1,80 x 106 IU/g.3.12.1 Zásobní roztok all-trans-vitamín A palmitátu: Odvažte s přesností na 0,1 mg 80 mg palmitátu vitamínu A (3.12) do 100 ml odměrné baňky. Rozpusťte ve 2-propanolu (3.8) a doplňte po značku stejným rozpouštědlem. Nominální koncentrace tohoto roztoku je 1400 IU vitamínu A na ml. Přesný obsah musí být stanoven podle 5.6.3.2.3.13 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (viz 7.5 poznámky)4. Přístroje a pomůcky4.1 Rotační vakuová odparka4.2 Nádobí z opakního skla4.2.1 Baňky s plochým dnem nebo Erlenmeyerovy baňky, 500 ml, se zábrusovými hrdly4.2.2 Odměrné baňky se zábrusovými zátkami, úzkohrdlé, 10, 25, 100 a 500 ml4.2.3 Dělící nálevky, kuželovité, 1000 ml, se zábrusovými zátkami4.2.4 Hruškovité baňky, 250 ml, se zábrusovými hrdly4.3 Allihnův kondenzátor, délka izolační vrstvy 300 mm, se zábrusovým hrdlem, s adaptérem pro přívodní trubici plynu.4.4 Skládaný filtrační papír pro oddělení fáze, průměr 185 mm (např. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)4.5 HPLC výbava se vstřikovacím systémem4.5.1 Kolona pro kapalinovou chromatografii, 250 mm x 4 mm, C18, velikost částic náplně 5 nebo 10 μm nebo obdobné (výkonnostní parametry: pouze jednotlivý pík pro všechny izomery retinolu za podmínek HPLC)4.5.2 UV nebo fluorescenční detektor s proměnlivým nastavením vlnové délky4.6 Spektrofotometr s 10 mm křemennými kyvetami4.7 Vodní lázeň s magnetickým míchadlem4.8 Extrakční přístroj (viz obrázek 1) sestávající ze:4.8.1 Skleněný odměrný válec o objemu 1l vybavený zábrusovým hrdlem a zátkou4.8.2 Zábrusová vložka vybavená bočním ramenem a nastavitelnou trubicí procházející středem. Nastavitelná trubice musí mít spodní konec ve tvaru písmene U a trysku na opačném konci tak, aby mohla být horní vrstva kapaliny ve válci převedena do dělící nálevky.5. PostupPoznámka:Vitamín A je citlivý vůči (UV) světlu a oxidaci. Všechny operace musí být prováděny v nepřítomnosti světla (za použití nádobí z opakního skla, nebo nádobí chráněného hliníkovou fólií) a kyslíku (vypláchněte dusíkem). Vzduch nad kapalinou musí být během extrakce nahrazen dusíkem (vyhněte se přetlaku občasným povolením zátky).5.1 Příprava vzorkuRozmělněte vzorek tak, aby prošel sítem s otvory 1 mm, přičemž dbejte, aby nedošlo k zahřátí. Rozmělnění musí být provedeno bezprostředně před vážením a saponifikací, jinak může dojít ke ztrátám vitamínu A.5.2 SaponifikaceV závislosti na obsahu vitamínu A, odvažte s přesností na 0,01 g, 2 g až 25 g vzorku do 500 ml baňky s plochým dnem nebo Erlenmeyerovy baňky (4.2.1). Přidejte postupně za stálého kroužení 130 ml etanolu (3.1), přibližně 100 mg BHT (3.13), 2 ml roztoku askorbanu sodného (3.5) a 2 ml roztoku sulfidu sodného (3.6). Připojte kondenzátor (4.3) k baňce a ponořte baňku do vodní lázně s magnetickým míchadlem (4.7). Zahřejte k varu a nechejte odtékat pět minut. Potom přidejte 25 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4) přes kondenzátor (4.3) a nechejte odtékat dalších 25 minut za stálého míchání pod pomalým proudem dusíku. Potom vypláchněte kondenzátor přibližně 20 ml vody a obsah baňky ochlaďte na pokojovou teplotu.5.3 ExtrakcePřeveďte dekantací saponifikovaný roztok kvantitativně vypláchnutím celkovým objemem 250 ml vody do 1000 ml dělící nálevky (4.2.3) nebo do extrakčního přístroje (4.8). Vypláchněte saponifikační baňku postupně 25 ml etanolu (3.1) a 100 ml petroléteru (3.2) a převeďte výplachy do dělící nálevky nebo do extrakčního přístroje. Podíl vody a etanolu v kombinovaných roztocích musí být okolo 2:1. Třepejte silně dvě minuty a nechejte ustát dvě minuty.5.3.1 Extrakce s použitím dělící nálevky (4.2.3)Když se vrstvy oddělily (viz poznámky 7.3), převeďte vrstvu petroléteru do další dělící nálevky (4.2.3). Opakujte tuto extrakci dvakrát 100 ml petroléteru (3.2) a dvakrát 50 ml petroléteru (3.2).Promyjte kombinované extrakty v dělící nálevce dvakrát 100 ml dávkami vody za současného kroužení (aby se zabránilo tvorbě emulzí) a potom opakovaným třepáním s dalšími 100 ml dávkami vody, dokud voda nezůstává bezbarvá za přídavku roztoku fenolftaleinu (3.7) (čtyřnásobné promývání je obyčejně dostačující). Přefiltrujte extrakt přes suchý skládaný filtr pro dělení fází (4.4), aby se odstranila všechna suspendovaná voda do 500 ml odměrné baňky (4.2.2). Vypláchněte dělící nálevku a filtr 50 ml petroléteru (3.2), doplňte po značku petroléterem (3.2) a dobře promíchejte.5.3.2 Extrakce za použití extrakčního přístroje (4.8)Když se vrstvy oddělily (viz poznámky 7.3), nahraďte zátku skleněného válce (4.8.1) za zábrusovou vložku (4.8.2) a nasměrujte dolní konec ve tvaru písmene U nastavitelné trubice tak, aby byl právě nad hladinou rozhraní. Za pomoci tlaku z rozvodu dusíku do postranního ramene, převeďte vrchní vrstvu petroléteru do 1000 ml dělící nálevky (4.2.3) Přidejte 100 ml petroléteru (3.2) do skleněného válce, zazátkujte a dobře protřepejte. Nechejte vrstvy oddělit se a převeďte vrchní vrstvu do dělící nálevky jako předtím. Opakujte postup extrakce dalšími 100 ml petroléteru (3.2), potom dvakrát 50 ml dávkami petroléteru (3.2) a přidejte vrstvy petroléteru do dělící nálevky.Promyjte kombinované extrakty petroléteru tak, jak je to popsáno v 5.3.1, a pokračujte jak je tam popsáno.5.4 Příprava roztoku vzorku pro HPLCOdpipetujte alikvotní část roztoku petroléteru (z 5.3.1 nebo 5.3.2) do 250 ml baňky ve tvaru hrušky (4.2.4). Odpařte rozpouštědlo téměř do sucha na rotační vakuové odparce (4.1) za sníženého tlaku při teplotě vodní lázně nepřekračující 40 °C. Obnovte atmosférický tlak připuštěním dusíku (3.10) a odpojte baňku od rotační vakuové odparky. Odstraňte zbývající rozpouštědlo proudem dusíku (3.10) a ihned rozpusťte zbytek ve známém objemu (10–100 ml) metanolu (3.3) (koncentrace vitamínu A by měla být v rozsahu 5 IU/ml až 30 IU/ml).5.5 Stanovení pomocí HPLCVitamín A je oddělen na reverzní fázové koloně C18 (4.5.1) a koncentrace je měřena pomocí UV detektoru (325 nm) nebo fluorescenčního detektoru (excitace: 325 nm, emise: 475 nm) (4.5.2).Vstříkněte alikvotní část (např. 20 μl) metanolového roztoku získaného v 5.4 a vymývejte mobilní fází (3.9). Vypočtěte střední výšku píku (plochu) několika vstřiků roztoku stejného vzorku a střední výšky (plochy) několika vstřiků kalibračních roztoků (5.6.2).Podmínky HPLCNásledující podmínky jsou předkládány jako doporučení; ostatní podmínky smějí být použity za předpokladu, že poskytují shodné výsledky.Kolona pro kapalinovou chromatografii (4.5.1): | 250 mm x 4 mm, C18, velikost částic náplně 5 nebo 10 μm nebo ekvivalent |Mobilní fáze (3.9): | Směs metanolu (3.3) a vody, např. 980 + 20 (objemově + objemově) |Úroveň toku: | 1 – 2 ml/min. |Detektor (4.5.2): | UV detektor (325 nm) nebo fluorescenční detektor (excitace: 325 nm/emise: 475 nm) |5.6 Kalibrace5.6.1 Příprava standardních pracovních roztokůOdpipetujte 20 ml zásobního roztoku vitamín A acetátu (3.11.1) nebo 20 ml zásobního roztoku vitamín A palmitátu (3.12.1) do 500 ml baňky s plochým dnem nebo Erlenmeyerovy baňky (4.2.1) a hydrolyzujte, jak je to popsáno v 5.2, ale bez přídavku BHT. Následně extrahujte petroléterem (3.2) podle 5.3 a doplňte do 500 ml petroléterem (3.2). Odpařte 100 ml tohoto extraktu na rotační vakuové odparce (viz 5.4) téměř do sucha, odstraňte zbývající rozpouštědlo proudem dusíku (3.10) a znovu rozpusťte zbytek v 10,0 ml metanolu (3.3). Nominální koncentrace tohoto roztoku je 560 IU vitaminu A/1 ml. Přesný obsah se stanoví podle 5.6.3.3 Standardní pracovní roztok musí být čerstvě připraven před použitím.Pipetujte 2,0 ml tohoto standardního pracovního roztoku do 20 ml odměrné baňky, doplňte po značku metanolem (3.3) a promíchejte. Nominální koncentrace tohoto zředěného standardního pracovního roztoku je 56 IU vitamínu A na ml.5.6.2 Příprava kalibračních roztoků a kalibrační grafPřeveďte 1,0, 2,0, 5,0 a 10,0 ml zředěného standardního pracovního roztoku do sérií 20 ml odměrných baněk, doplňte po značku metanolem (3.3) a promíchejte. Nominální koncentrace těchto roztoků jsou 2,8, 5,6, 14,0 a 28,0 IU vitamínu A na ml.Vstříkněte několikrát 20 μl každého kalibračního roztoku a stanovte střední výšky píků (plochy). Za použití středních výšek píků (ploch) nyrýsujte kalibrační graf odpovídající výsledkům UV kontroly (5.6.3.3).5.6.3 UV standardizace standardních roztoků5.6.3.1 Zásobní roztok vitamín A acetátuPipetujte 2,0 ml zásobního roztoku vitamín A acetátu (3.11.1) do 50 ml odměrné baňky (4.2.2) a doplňte po značku 2-propanolem (3.8) Nominální koncentrace tohoto roztoku je 56 IU vitamínu A na ml. Pipetujte 3,0 ml tohoto zředěného roztoku vitamín A acetátu do 25 ml odměrné baňky a doplňte po značku 2-propanolem (3.8). Nominální koncentrace tohoto roztoku je 6,72 IU vitamínu A na ml. Změřte UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (3.8) ve spektrofotometru (4.6) mezi 300 nm a 400 nm. Extinkční maximum musí být mezi 325 nm a 327 nm.Výpočet obsahu vitamínu A:+++++ TIFF +++++5.6.3.2 Zásobní roztok vitamín A palmitátuPipetujte 2,0 ml zásobního roztoku vitamín A palmitátu (3.12.1) do 50 ml odměrné baňky (4.2.2) a doplňte po značku 2-propanolem (3.8) Nominální koncentrace tohoto roztoku je 56 IU vitamínu A na ml. Pipetujte 3,0 ml tohoto zředěného roztoku vitamín A palmitátu do 25 ml odměrné baňky a doplňte po značku 2-propanolem (3.8). Nominální koncentrace tohoto roztoku je 6,72 IU vitamínu A na ml. Změřte UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (3.8) ve spektrofotometru (4.6) mezi 300 nm a 400 nm. Extinkční maximum musí být mezi 325 nm a 327 nm.Výpočet obsahu vitamínu A:+++++ TIFF +++++5.6.3.3 Standardní pracovní roztoky vitamínu APipetujte 3,0 ml nezředěného standardního pracovního roztoku vitamínu A, připraveného podle 5.6.1 do 50 ml odměrné baňky (4.2.2) a doplňte po značku 2-propanolem (3.8). Pipetujte 5,0 ml tohoto roztoku do 25 ml odměrné baňky a doplňte po značku 2-propanolem (3.8). Nominální koncentrace tohoto roztoku je 6,72 IU vitamínu A na ml. Změřte UV spektrum tohoto roztoku proti 2-propanolu (3.8) ve spektrofotometru (4.6) mezi 300 nm a 400 nm. Extinkční maximum musí být mezi 325 nm a 327 nm.Výpočet obsahu vitamínu A:+++++ TIFF +++++6. Výpočet výsledkůZe střední výšky (plochy) píku pro roztok vzorku vitamínu A stanovte koncentraci roztoku vzorku v IU/ml ve vztahu ke kalibračnímu grafu (5.6.2).Obsah vitamínu A w v IU/kg ve vzorku je dán následující rovnicí:w =500 . β . V. 1000V. mve které:β = koncentrace vitamínu A v roztoku vzorku (5.4) v IU/mlV1 = objem roztoku vzorku (5.4) v mlV2 = objem alikvot odebraných v 5.4 v mlm = hmota zkušební dávky v g7. Poznámky7.1 U vzorků s nízkou koncentrací vitamínu A může být užitečné spojit extrakty petroléteru dvou saponifikačních vsázek (hmotnostní hodnota: 25 g) do jednoho roztoku vzorku pro stanovení pomocí HPLC.7.2 Množství tuku ve vzorku odebraném pro analýzu by nemělo překročit 2g.7.3 Pokud se neobjeví fázové dělení, přidejte přibližně 10 ml etanolu (3.1), k rozrušení emulze.7.4 U rybího tuku a ostatních čistých tuků by měla být doba saponifikace prodloužena na 45–60 minut.7.5 Namísto BHT může být použit hydrochinon.7.6 Oddělení izomerů retinolu je možné s použitím normální fázové kolony.7.7 Namísto askorbanu sodného může být použito přibližně 150 mg kyseliny askorbové.7.8 Namísto roztoku sulfidu sodného může být použito přibližně 50 mg EDTA.8. OpakovatelnostRozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit 15 % z vyššího výsledku.9. Výsledky studijní spolupráce [1]L : počet laboratořín : počet jednotlivých hodnotsr : standardní odchylka opakovatelnostisR : standardní odchylka reprodukovatelnostir : opakovatelnostR : reprodukovatelnostCVr : koeficient variace opakovatelnostiCVR : koeficient variace reprodukovatelnosti| Premix | Premixové krmivo | Minerální koncentrát | Bílkovinný koncentrát | Krmivo pro selata |L | 13 | 12 | 13 | 12 | 13 |n | 48 | 45 | 47 | 46 | 49 |střed [IU/kg] | 17,02 x 106 | 1,21 x 106 | 537100 | 151800 | 18070 |sr [IU/kg] | 0,51 x 106 | 0,039 x 106 | 22080 | 12280 | 682 |r [IU/kg] | 1,43 x 106 | 0,109 x 106 | 61824 | 34384 | 1910 |CVr [IU/kg] | 3,0 | 3,5 | 4,1 | 8,1 | 3,8 |sR [IU/kg] | 1,36 x 106 | 0,069 x 106 | 46300 | 23060 | 3614 |R [IU/kg] | 3,81 x 106 | 0,193 x 106 | 129640 | 64568 | 10119 |CVR [%] | 8,0 | 6,2 | 8,6 | 15 | 20 |+++++ TIFF +++++ČÁST B STANOVENÍ VITAMÍNU E1. Účel a oblast použitíTato metoda je určena pro stanovení vitamínu E v krmivech a premixech. Obsah vitamínu E je vyjádřen jako mg DL-α-tokoferol acetátu na kg. 1 mg DL-α-tokoferol acetátu odpovídá 0,91 mg DL-α-tokoferolu (vitamín E).Mez stanovitelnosti je 2 mg vitamínu E/kg.2. PrincipVzorek je hydrolyzován etanolovým roztokem hydroxidu draselného a vitamín E je extrahován do petroléteru. Rozpouštědlo je odstraněno odpařením a zbytek se rozpustí v metanolu a, pokud je to nutné, zředí na požadovanou koncentraci. Obsah vitamínu E se stanoví reverzní fází vysoce účinné kapalinové chromatografie (RP-HPLC) za použití UV nebo fluorescenčního detekce.3. Činidla3.1 Etanol, σ = 96 %3.2 Petroléter, rozsah varu 40 až 60 °C3.3 Metanol3.4 Roztok hydroxidu draselného, β = 50 g/100 ml3.5 Roztok askorbanu sodného, β = 10 g/100 ml (viz 7.7 poznámky)3.6 Sulfid sodný, Na2S. x H2O (x = 7–9)3.6.1 Roztok sulfidu sodného, c = 0,5 mol/l v glycerolu, β = 120 g/l (pro x = 9) (viz 7.8 poznámky)3.7 Roztok fenolftaleinu, β = 2 g/100 ml v etanolu (3.1)3.8 Mobilní fáze pro HPLC: směs metanolu (3.3) a vody, např. 980 + 20 (objemově + objemově). Extrakční poměr bude stanoven charakteristikami použité kolony.3.9 Dusík, prostý kyslíku3.10 DL-α-tokoferol acetát, extra čistý, ověřené aktivity3.10.1 Zásobní roztok DL-α-tokoferol acetátu: Odvažte s přesností na 0,1 mg, 100 mg DL-α-tokoferol acetátu (3.10) do 100 ml odměrné baňky. Rozpusťte v etanolu (3.1) a doplňte po značku stejným rozpouštědlem. 1 ml tohoto roztoku obsahuje 1 mg DL-α-tokoferol acetátu. (UV kontrola – viz 5.6.1.3; stabilizace – viz 7.4 poznámky).3.11 DL-α-tokoferol, extra čistý, ověřené aktivity3.11.1 Odvažte s přesností na 0,1 mg, 100 mg DL-α-tokoferolu (3.10) do 100 ml odměrné baňky. Rozpusťte v etanolu (3.1) a doplňte po značku stejným rozpouštědlem. 1 ml tohoto roztoku obsahuje 1 mg DL-α-tokoferolu. (UV kontrola – viz 5.6.2.3; stabilizace – viz 7.4 poznámky).3.12 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (viz 7.5 poznámky)4. Přístroje a pomůcky4.1 Rotační vakuová odparka4.2 Nádobí z opakního skla4.2.1 Baňky s plochým dnem nebo Erlenmeyerovy baňky, 500 ml, se zábrusovými hrdly4.2.2 Odměrné baňky se zábrusovými zátkami, úzkohrdlé, 10, 25, 100 a 500 ml4.2.3 Dělící nálevky, kuželovité, 1000 ml, se zábrusovými zátkami4.2.4 Hruškovité baňky, 250 ml, se zábrusovými hrdly4.3 Allihnův kondenzátor, délka izolační vrstvy 300 mm, se zábrusovým hrdlem, s adaptérem pro přívodní trubici plynu4.4 Skládaný filtrační papír pro oddělení fáze, průměr 185 mm (např. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)4.5 HPLC výbava se vstřikovacím systémem4.5.1 Kolona pro kapalinovou chromatografii, 250 mm x 4 mm, C18, velikost částic náplně 5 nebo 10 μm nebo ekvivalent4.5.2 UV nebo fluorescenční detektor s proměnlivým nastavením vlnové délky4.6 Spektrofotometr s 10 mm křemennými kyvetami4.7 Vodní lázeň s magnetickým míchadlem4.8 Extrakční přístroj (viz obrázek 1) sestávající ze:4.8.1 Skleněný odměrný válec o objemu 1l vybavený zábrusovým hrdlem a zátkou4.8.2 Zábrusová vložka vybavená bočním ramenem a nastavitelnou trubicí procházející středem. Nastavitelná trubice musí mít spodní konec ve tvaru písmene U a trysku na opačném konci tak, aby mohla být horní vrstva kapaliny ve válci převedena do dělící nálevky.5. PostupPoznámka:Vitamín E je citlivý vůči (UV) světlu a oxidaci. Všechny operace musí být prováděny v nepřítomnosti světla (za použití nádobí z opakního skla, nebo nádobí chráněného hliníkovou fólií) a kyslíku (vypláchněte dusíkem). Vzduch nad kapalinou musí být během extrakce nahrazen dusíkem (vyhněte se přetlaku občasným povolením zátky).5.1 Příprava vzorkuRozmělněte vzorek tak, aby prošel sítem s otvory 1 mm, přičemž dbejte, aby nedošlo k zahřátí. Rozmělnění musí být provedeno bezprostředně před vážením a saponifikací, jinak může dojít ke ztrátám vitamínu E.5.2 SaponifikaceV závislosti na hmotnosti obsahu vitamínu E odvažte s přesností na 0,01 g, 2 g až 25 g vzorku do 500 ml baňky s plochým dnem nebo Erlenmeyerovy baňky (4.2.1). Přidejte postupně za stálého kroužení 130 ml etanolu (3.1), přibližně 100 mg BHT (3.12), 2 ml roztoku askorbanu sodného (3.5) a 2 ml roztoku sulfidu sodného (3.6). Připojte kondenzátor (4.3) k baňce a ponořte baňku do vodní lázně s magnetickým míchadlem (4.7). Zahřejte k varu a nechejte odtékat pět minut. Potom přidejte 25 ml roztoku hydroxidu draselného (3.4) přes kondenzátor (4.3) a nechejte odtékat dalších 25 minut za stálého míchání pod pomalým proudem dusíku. Potom vypláchněte kondenzátor přibližně 20 ml vody a obsah baňky ochlaďte na pokojovou teplotu.5.3 ExtrakcePřeveďte dekantací saponifikovaný roztok kvantitativně vypláchnutím celkovým objemem 250 ml vody do 1000 ml dělící nálevky (4.2.3) nebo do extrakčního přístroje (4.8). Vypláchněte saponifikační baňku postupně 25 ml etanolu (3.1) a 100 ml petroléteru (3.2) a převeďte výplachy do dělící nálevky nebo do extrakčního přístroje. Podíl vody a etanolu v kombinovaných roztocích by měl být okolo 2:1. Třepejte silně dvě minuty a nechejte ustát dvě minuty.5.3.1 Extrakce s použitím dělící nálevky (4.2.3)Když se vrstvy oddělily (viz poznámky 7.3), převeďte vrstvu petroléteru do další dělící nálevky (4.2.3). Opakujte tuto extrakci dvakrát 100 ml petroléteru (3.2) a dvakrát 50 ml petroléteru (3.2).Promyjte kombinované extrakty v dělící nálevce dvakrát 100 ml dávkami vody za současného kroužení (aby se zabránilo tvorbě emulzí) a potom opakovaným třepáním s dalšími 100 ml dávkami vody, dokud voda nezůstává bezbarvá za přídavku roztoku fenolftaleinu (3.7) (čtyřnásobné promývání je obyčejně dostačující). Přefiltrujte extrakt přes suchý skládaný filtr pro dělení fází (4.4), aby se odstranila všechna suspendovaná voda do 500 ml odměrné baňky (4.2.2). Vypláchněte dělící nálevku a filtr 50 ml petroléteru (3.2), doplňte po značku petroléterem (3.2) a dobře promíchejte.5.3.2 Extrakce za použití extrakčního přístroje (4.8)Když se vrstvy oddělily (viz poznámky 7.3), nahraďte zátku skleněného válce (4.8.1) za zábrusovou vložku (4.8.2) a nasměrujte dolní konec ve tvaru písmene U nastavitelné trubice tak, aby byl právě nad hladinou rozhraní. Za pomoci tlaku z rozvodu dusíku do postranního ramene, převeďte vrchní vrstvu petroléteru do 1000 ml dělící nálevky (4.2.3) Přidejte 100 ml petroléteru (3.2) do skleněného válce, zazátkujte a dobře protřepejte. Nechejte vrstvy oddělit se a převeďte vrchní vrstvu do dělící nálevky jako předtím. Opakujte postup extrakce dalšími 100 ml petroléteru (3.2), potom dvakrát 50 ml dávkami petroléteru (3.2) a přidejte vrstvy petroléteru do dělící nálevky.Promyjte kombinované extrakty petroléteru tak, jak je to popsáno v 5.3.1, a pokračujte jak je tam popsáno.5.4 Příprava roztoku vzorku pro HPLCOdpipetujte alikvotní část roztoku petroléteru (z 5.3.1 nebo 5.3.2) do 250 ml baňky ve tvaru hrušky (4.2.4). Odpařte rozpouštědlo téměř do sucha na rotační vakuové odparce (4.1) za sníženého tlaku při teplotě vodní lázně nepřekračující 40 °C. Obnovte atmosférický tlak připuštěním dusíku (3.9) a odpojte baňku od rotační vakuové odparky. Odstraňte zbývající rozpouštědlo proudem dusíku (3.9) a ihned rozpusťte zbytek ve známém objemu (10–100 ml) metanolu (3.3) (koncentrace DL-α-tokoferolu by měla být v rozsahu 5 μg/ml až 30 μg/ml).5.5 Stanovení pomocí HPLCVitamín E je oddělen na reverzní fázové koloně C18 (4.5.1) a koncentrace je měřena pomocí fluorescenčního detektoru (excitace: 295 nm, emise: 330 nm) nebo UV detektoru (292 nm) (4.5.2).Vstříkněte alikvotní část (např. 20 μl) metanolového roztoku získaného v 5.4 a vymývejte mobilní fází (3.8). Vypočtěte střední výšky píku (plochy) několika vstřiků roztoku stejného vzorku a střední výšky (plochy) několika vstřiků kalibračních roztoků (5.6.2).Podmínky HPLCNásledující podmínky jsou předkládány jako doporučení; ostatní podmínky smějí být použity za předpokladu, že poskytují shodné výsledky.Kolona pro kapalinovou chromatografii (4.5.1): | 250 mm x 4 mm, C18, velikost částic náplně 5 nebo 10 μm nebo obdobné |Mobilní fáze (3.8): | Směs metanolu (3.3) a vody, např. 980 + 20 (objemově + objemově) |Úroveň toku: | 1–2 ml/min. |Detektor (4.5.2): | Fluorescenční detektor (excitace: 295 nm/emise: 330 nm) nebo UV detektor (292 nm) |5.6 Kalibrace (DL-α-tokoferol acetátu nebo DL-α-tokoferolu)5.6.1 Standard DL-α-tokoferol acetátu5.6.1.1 Příprava standardních pracovních roztokůPřeveďte pipetou 25 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1) do 500 ml baňky s plochým dnem nebo Erlenmeyerovy baňky (4.2.1) a hydrolyzujte, jak je to popsáno v 5.2. Následně extrahujte petroléterem (3.2) podle 5.3 a doplňte do 500 ml petroleterem. Odpařte 25 ml tohoto extraktu na rotační vakuové odparce (viz 5.4) téměř do sucha, odstraňte zbývající rozpouštědlo proudem dusíku (3.9) a znovu rozpusťte zbytek v 25,0 ml netanolu (3.3). Nominální koncentrace tohoto roztoku je 45,5 μg DL-α-tokoferolu na ml, ekvivalent 50 μg DL-α-tokoferol acetátu na ml. Standardní pracovní roztok musí být čerstvě připraven před použitím.5.6.1.2 Příprava kalibračního roztoku a kalibrační grafPřeveďte 1,0, 2,0, 4,0 a 10,0 ml standardního pracovního roztoku do sérií 20 ml odměrných baněk, doplňte po značku metanolem (3.3) a promíchejte. Nominální koncentrace těchto roztoků jsou 2,5, 5,0, 10,0 a 25,0 μg/ml DL-α-tokoferol acetátu, tj. 2,28, 4,55, 9,10 a 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolu.Vstříkněte několikrát 20 μl každého kalibračního roztoku a stanovte střední výšky píků (plochy). Za použití středních výšek píků (ploch) narýsujte kalibrační graf.5.6.1.3 UV standardizace zásobního roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1)Rozřeďte 5,0 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferol acetátu (3.10.1) na 25,0 ml etanolem a změřte UV spektrum tohoto roztoku proti etanolu (3.1) ve spektrofotometru (4.6) mezi 250 nm a 320 nm.Absorpční maximum by mělo být při 284 nm:+++++ TIFF +++++Při tomto ředění by měla být získána extinkce 0,84 až 0,88.5.6.2 Standard DL-α-tokoferolu5.6.2.1 Příprava standardního pracovního roztokuPřeveďte pipetou 2,0 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1) do 50 ml odměrné baňky, rozpusťte v metanolu (3.3) a doplňte po značku metanolem. Nominální koncentrace tohoto roztoku je 40 μg DL-α-tokoferolu na ml, ekvivalent 44,0 μg DL-α-tokoferol acetátu na ml. Standardní pracovní roztok musí být čerstvě připraven před použitím.5.6.2.2 Příprava kalibračního roztoku a kalibrační grafPřeveďte 1,0, 2,0, 4,0 a 10,0 ml standardního pracovního roztoku do sérií 20 ml odměrných baněk, doplňte po značku metanolem (3.3) a promíchejte. Nominální koncentrace těchto roztoků jsou 2,0, 4,0, 8,0 a 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolu, tj. 2,20, 4,40, 8,79 a 22,0 μg/ml DL-α-tokoferol acetátu.Vstříkněte několikrát 20 μl každého kalibračního roztoku a stanovte střední výšky píků (plochy). Za použití středních výšek píků (ploch) narýsujte kalibrační graf.5.6.2.3 UV standardizace zásobního roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1)Rozřeďte 2,0 ml zásobního roztoku DL-α-tokoferolu (3.11.1) na 25,0 ml etanolem a změřte UV spektrum tohoto roztoku proti etanolu (3.1) ve spektrofotometru (4.6) mezi 250 nm a 320 nm. Absorpční maximum by mělo být při 292 nm:+++++ TIFF +++++Při tomto ředění by měla být získána extinkce 0,6.6. Výpočet výsledkůZe střední výšky (plochy) píku pro roztok vzorku vitamínu E stanovte koncentraci roztoku vzorku v μg/ml (počítáno jako α-tokoferol acetát) ve vztahu ke kalibračnímu grafu (5.6.1.2 nebo 5.6.2.2).Obsah vitamínu E w v mg/kg ve vzorku je dán následující rovnicí:+++++ TIFF +++++ve které:β = koncentrace vitamínu E v roztoku vzorku (5.4) v μg/mlV1 = objem roztoku vzorku (5.4) v mlV2 = objem alikvot odebraných v 5.4 v mlm = hmota zkušební dávky v g7. Poznámky7.1 U vzorků s nízkou koncentrací vitamínu E může být užitečné spojit extrakty petroléteru dvou saponifikačních vsázek (hmotnostní hodnota: 25 g) do jednoho roztoku vzorku pro stanovení pomocí HPLC.7.2 Množství tuku ve vzorku odebraném pro analýzu nesmí překročit 2g.7.3 Pokud se neobjeví fázové dělení, přidejte přibližně 10 ml etanolu (3.1), k rozrušení emulze.7.4 Po spektrofotometrickém měření roztoku DL-α-tokoferol acetátu nebo DL-α-tokoferolu podle 5.6.1.3 nebo 5.6.2.3 přidejte do roztoku (3.10.1 nebo 3.10.2) přibližně 10 mg BHT (3.12) a skladujte roztok v chladničce (maximální doba skladovatelnosti je čtyři týdny).7.5 Namísto BHT může být použit hydrochinon.7.6 Oddělení α-, β-, χ- a δ tokoferolů je možné s použitím normální fázové kolony.7.7 Namísto askorbanu sodného může být použito přibližně 150 mg kyseliny askorbové.7.8 Namísto roztoku sulfidu sodného může být použito přibližně 50 mg EDTA.8. OpakovatelnostRozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit 15 % z vyššího výsledku.9. Výsledky studijní spolupráce [2]L : počet laboratořín : počet jednotlivých hodnotsr : standardní odchylka opakovatelnostisR : standardní odchylka reprodukovatelnostir : opakovatelnostR : reprodukovatelnostCVr : koeficient variace opakovatelnostiCVR : koeficient variace reprodukovatelnosti| Premix | Premixové krmivo | Minerální koncentrát | Bílkovinný koncentrát | Krmivo pro selata |L | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |n | 48 | 48 | 48 | 48 | 48 |střed [mg/kg] | 17 380 | 1 187 | 926 | 315 | 61,3 |sr [mg/kg] | 384 | 45,3 | 25,2 | 13,0 | 2,3 |r [mg/kg] | 1 075 | 126,8 | 70,6 | 36,4 | 6,4 |CVr [%] | 2,2 | 3,8 | 2,7 | 4,1 | 3,8 |sR [mg/kg] | 830 | 65,0 | 55,5 | 18,9 | 7,8 |R [mg/kg] | 2 324 | 182,0 | 155,4 | 52,9 | 21,8 |CVR [%] | 4,8 | 5,5 | 6,0 | 6,0 | 12,7 |+++++ TIFF +++++ČÁST C STANOVENÍ TRYPTOFANU1. Účel a oblast použitíTato metoda je určena pro stanovení celkového a volného tryptofanu v krmivech. Nerozlišuje mezi D- a L- formami.2. PrincipPro stanovení celkového tryptofanu je vzorek hydrolyzován za alkalických podmínek nasyceným roztokem hydroxidu barnatého a zahříván při 110 °C po 20 hodin. Po hydrolýze je přidán vnitřní standard.Pro stanovení volného tryptofanu je vzorek extrahován za mírně kyselých podmínek v přítomnosti vnitřního standardu.Tryptofan a vnitřní standard jsou stanoveny v hydrolyzátu nebo extraktu pomocí HPLC s fluorescenční detekcí.3. Činidla3.1 Dvojnásobně destilovaná voda, nebo voda obdobné kvality musí být používána (vodivost < 10 μS/cm)3.2 Standardní látka: tryptofan (čistota/obsah > 99 %), sušený pod vakuem přes pentoxid fosforu3.3 Vnitřní standardní látka: α-methyl-tryptofan (čistota/obsah > 99 %), sušený pod vakuem přes pentoxid fosforu3.4 Octa-hydrát hydroxidu barnatého (musí být dbáno, aby nebyl Ba(OH)2. 8 H2O nadměrně vystavován na vzduchu, aby se zabránilo tvorbě BaCO3, jež může rušit stanovení) (viz poznámky 9.3)3.5 Hydroxid sodný3.6 Kyselina orto-fosforečná, w = 85 %3.7 Kyselina chlorovodíková, p20 = 1,19 g/ml3.8 Metanol, HPLC stupeň3.9 Petroléter, rozsah varu 40–60 °C3.10 Roztok hydroxidu sodného, c = 1 mol/l:Rozpusťte 40,0 g NaOH (3.5) ve vodě a doplňte do 1 l vodou (3.1).3.11 Kyselina chlorovodíková, c = 6 mol/l:Vezměte 492 ml HCL (3.7) a doplňte do 1 l vodou.3.12 Kyselina chlorovodíková, c = 1 mol/l:Vezměte 82 ml HCL (3.7) a doplňte do 1 l vodou.3.13 Kyselina chlorovodíková, c = 0,1 mol/l:Vezměte 8,2 ml HCL (3.7) a doplňte do 1 l vodou.3.14 Kyselina orto-fosforečná, c = 0,5 mol/l:Vezměte 34 ml kyseliny orto-fosforečné (3.6) a doplňte do 1 l vodou (3.1)3.15 Koncentrovaný roztok tryptofanu (3.2), c = 2,50 μmol/ml:Rozpusťte 0,2553 g tryptofanu (3.2) v 500 ml odměrné baňce v kyselině chlorovodíkové (3.13) a doplňte po značku kyselinou chlorovodíkovou (3.13). Skladujte při –18 oC po dobu maximálně čtyř týdnů.3.16 Koncentrovaný vnitřní standardní roztok, c = 2,50 μmol/ml:Rozpusťte 0,2728 g α-methyl-tryptofanu (3.3) v 500 ml odměrné baňce v kyselině chlorovodíkové (3.13) a doplňte po značku kyselinou chlorovodíkovou (3.13). Skladujte při –18 oC po dobu maximálně čtyř týdnů.3.17 Kalibrační standardní roztok tryptofanu a vnitřní standard:Vezměte 2,00 ml koncentrovaného roztoku tryptofanu (3.15), a 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (α-methyl-tryptofan) (3.16). Zřeďte vodou (3.1) a metanolem (3.8) na přibližně stejný objem a na přibližně stejnou koncentraci metanolu (10–30 %) jako konečný hydrolyzát.Tento roztok musí být připravován čerstvý před použitím.Během přípravy chraňte před přímým slunečním svitem.3.18 Kyselina octová3.19 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol3.20 Ethanolamin > 98 %3.21 Roztok 1 g 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanolu (3.19) ve 100 ml metanolu (3.8).3.22 Mobilní fáze pro HPLC: 3,00 g kyseliny octové (3.18) + 900 ml vody (3.1) + 50,0 ml roztoku (3.21) 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanolu (3.19) v metanolu (3.8) (1g/100 ml). Upravte pH na 5 s použitím ethanolaminu (3.20). Doplňte do 1000 ml vodou (3.1).4. Přístroje a pomůcky4.1 Vybavení pro HPLC se spektrofluorimetrickým detektorem4.2 Kolona pro kapalinovou chromatografii, 125 mm x 4 mm, C18, velikost částic náplně 3 μm nebo ekvivalent4.3 pH metr4.4 Polypropylenová láhev, objem 125 ml, se širokým hrdlem a šroubovacím uzávěrem4.5 Membránový filtr, 0,45 μm4.6 Autokláv, 110 (+ 2) °C, 1,4 (+ 0,1) baru4.7 Mechanická třepačka nebo magnetické míchadlo4.8 Vířivý mixer5. Postup5.1 Příprava vzorkuVzorek je rozmělněn tak, aby prošel sítem s otvory 0,5 mm. Vzorky, které mají vysokou vlhkost, musí být před rozmělněním usušeny buď vzduchem při teplotě nepřesahující 50 °C, nebo zmrazením. Vzorky s vysokým obsahem tuku musí být před mletím extrahovány petroléterem (3.9).5.2 Stanovení volného tryptofanu (extrakt)Odvažte s přesností na 1 mg příslušné množství (1–5 g) připraveného vzorku (5.1) do Erlenmeyerovy baňky. Přidejte 100 ml kyseliny chlorovodíkové, c = 0,1 mol/l (3.13) a 5,00 ml koncentrovaného vnitřního standardního roztoku (3.16). Třepejte nebo mixujte 60 minut s použitím mechanické třepačky, nebo magnetického míchadla (4.7). Nechejte usadit sediment a pipetujte 10,0 ml roztoku supernatantu do kádinky. Přidejte 5 ml kyseliny orto-fosforečné, c = 0,5 mol/l (3.14). Upravte pH na 3,0 za použití hydroxidu sodného, c = 1,0 mol/l (3.10). Přidejte přiměřeně metanolu (3.8), abyste obdrželi koncentraci mezi 10 a 30 % metanolu v konečném objemu. Převeďte do odměrné baňky o vhodném objemu a zřeďte vodou na objem nezbytný pro chromatografii (přibližně stejný objem jako kalibrační standardní roztok (3.17)).Před vstříknutím do kolony HPLC přefiltrujte několik ml roztoku přes membránový filtr 0,45 μm (4.5). Provádějte chromatografii podle 5.4.Chraňte standardní roztok a extrakty před přímým slunečním světlem. Pokud není možné analyzovat extrakty stejný den, mohou být skladovány při 5 °C po maximální dobu tří dnů.5.3 Stanovení celkového tryptofanu (hydrolyzát)Odvažte s přesností na 0,2 mg od 0,1 do 1 g připraveného vzorku (5.1) do polypropylénové láhve (4.4). Odvážená dávka vzorku by měla mít obsah dusíku okolo 10 mg. Přidejte 8,4 g octa-hydrátu hydroxidu barnatého (3.4) a 10 ml vody. Promíchejte na vířivém mixeru (4.8) nebo magnetickém míchadle (4.7). Ponechejte teflonem potažený magnet ve směsi. Opláchněte stěny nádoby 4 ml vody. Našroubujte uzávěr a láhev volně uzavřete. Přeneste do autoklávu (4.6) s vroucí vodou a párou na 30–60 minut. Uzavřete autokláv a autoklávujte při 110 (+ 2) °C po dobu 20 hodin.Před otevřením autoklávu snižte teplotu právě pod 100 °C. Aby nedošlo ke krystalizaci Ba(OH)2. 8 H2O, přidejte do horké směsi 30 ml vody o pokojové teplotě. Mírně protřepávejte, nebo míchejte. Přidejte 2,00 ml koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (α-methyl-tryptofan) (3.16). Zchlaďte nádobu ve vodní/ledové lázni po dobu 15 minut.Potom přidejte 5 ml orto-fosforečné kyseliny, c = 0,5 mol/l (3.14). Udržujte nádobu ve chladící lázni a neutralizujte kyselinou chlorovodíkovou, c = 6 mol/l (3.11) zatímco mícháte a upravte pH na 3,0 s použitím HCL, c = 1 mol/l (3.12). Přidejte přiměřeně metanolu, abyste obdrželi koncentraci mezi 10 a 30 % metanolu v konečném objemu. Převeďte do odměrné baňky o vhodném objemu a zřeďte vodou na definovaný objem nezbytný pro chromatografii (například 100 ml). Přídavek metanolu by neměl způsobit sraženinu.Před vstříknutím do kolony HPLC přefiltrujte několik ml roztoku přes membránový filtr 0,45 μm (4.5). Pokračujte v chromatografii podle odstavce 5.4.Chraňte standardní roztok a hydrolyzáty před přímým slunečním světlem. Pokud není možné analyzovat hydrolyzáty stejný den, mohou být skladovány při 5 °C po maximální dobu tří dnů.5.4 Stanovení pomocí HPLCNásledující podmínky pro izokratické vymývání jsou předkládány jako doporučení; ostatní podmínky smějí být použity za předpokladu, že poskytují shodné výsledky (viz také poznámky 9.1 a 9.2):Kolona pro kapalinovou chromatografii (4.2): | 125 mm x 4 mm, C18, velikost částic náplně 3 μm nebo ekvivalent |Teplota kolony | Pokojová teplota |Mobilní fáze (3.22): | 3,00 g kyseliny octové (3.18) + 900 ml vody (3.1) + 50,0 ml roztoku (3.21) 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanolu (3.19) v metanolu (3.8) (1 g/100 ml). Upravte pH na 5,00 s použitím ethanolaminu (3.20). Doplňte do 1000 ml vodou (3.1) |Úroveň toku: | 1 ml/min. |Celková doba běhu: | přibližně 34 minut |Detekční vlnová délka: | excitace: 280 nm, emise: 356 nm |Vstřikový objem: | 20 μl |6. Výpočet výsledků+++++ TIFF +++++A = plocha píku vnitřního standardu, roztoku kalibračního standardu (3.17)B = plocha píku tryptofanu, extraktu (5.2) nebo hydrolyzátu (5.3)C = objem roztoku koncentrovaného tryptofanu (3.15) (2 ml) přidaný do kalibračního roztoku (3.17)D = koncentrace koncentrovaného roztoku tryptofanu (3.15) v μmolech/ml (= 2,50) přidaného do kalibračního roztoku (3.17)E = objem koncentrovaného vnitřního standardního roztoku (3.16) v ml přidaného při extrakci (5.2) (= 5,00 ml) nebo do hydrolyzátu (5.3) (= 2,00 ml)F = plocha píku vnitřního standardu, extraktu (5.2) nebo hydrolyzátu (5.3)G = plocha píku tryptofanu, kalibračního standardního roztoku (3.17)H = objem koncentrovaného vnitřního standardního roztoku (3.16) v ml (= 2,00) přidaného do kalibračního standardního roztoku (3.17)W = hmotnost vzorku v g (opravená na původní hmotnost, jestliže byl vzorek sušen a/nebo odtučněn)MW = molekulová hmotnost tryptofanu (= 204,23)7. OpakovatelnostRozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených u stejného vzorku nesmí překročit 10 % z vyššího výsledku.8. Výsledky studijní spolupráceStudijní spolupráce Společenství (čtvrté vzájemné porovnání) byla uspořádána tak, že byly tři vzorky analyzovány ve 12 laboratořích k ověření metody pro hydrolýzy. Replikované (5) analýzy byly prováděny u každého vzorku. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:L : počet laboratoří předkládajících výsledkyn : počet jednotlivých hodnot zadržených eliminačních odlehlých výsledků (identifikované Cochran-Dixonovým testem)sr : standardní odchylka opakovatelnostisR : standardní odchylka reprodukovatelnostir : opakovatelnostR : reprodukovatelnostCVr : koeficient variace opakovatelnosti, %CVR : koeficient variace reprodukovatelnosti, %| Vzorek 1 Krmivo pro prasata | Vzorek 2 Krmivo pro prasata doplněné L-tryptofanem | Vzorek 3 Krmný koncentrát pro prasata |L | 12 | 12 | 12 |n | 50 | 55 | 50 |střed [g/kg] | 2,42 | 3,40 | 4,22 |sr [g/kg] | 0,05 | 0,05 | 0,08 |r [g/kg] | 0,14 | 0,14 | 0,22 |CVr [%] | 1,9 | 1,6 | 1,9 |sR [g/kg] | 0,15 | 0,20 | 0,09 |R [g/kg] | 0,42 | 0,56 | 0,25 |CVR [%] | 6,3 | 6,0 | 2,2 |Další studijní spolupráce Společenství (třetí vzájemné porovnání) byla uspořádána tak, že dva vzorky byly analyzovány až ve 13 laboratořích k ověření metody pro extrakci volného tryptofanu. Replikované (5) analýzy byly prováděny u každého vzorku. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:L : počet laboratoří předkládajících výsledkyn : počet jednotlivých hodnot zadržených eliminačních odlehlých výsledků (identifikované Cochran-Dixonovým testem)sr : standardní odchylka opakovatelnostisR : standardní odchylka reprodukovatelnostir : opakovatelnostR : reprodukovatelnostCVr : koeficient variace opakovatelnosti, %CVR : koeficient variace reprodukovatelnosti, %| Vzorek 4 Směs pšenice se sójou | Vzorek 5 Směs pšenice se sójou (= vzorek 4) s přidaným tryptofanem (0,457 g/kg) |L | 12 | 12 |n | 55 | 60 |střed [g/kg] | 0,391 | 0,931 |sr [g/kg] | 0,005 | 0,012 |r [g/kg] | 0,014 | 0,034 |CVr [%] | 1,34 | 1,34 |sR [g/kg] | 0,018 | 0,048 |R [g/kg] | 0,050 | 0,134 |CVR [%] | 4,71 | 5,11 |Další studijní spolupráce Společenství byla uspořádána tak, že čtyři vzorky byly analyzovány až v sedmi laboratořích s cílem potvrzení tryptofanu pro hydrolýzy. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:L : počet laboratoří předkládajících výsledkyn : počet jednotlivých hodnot zadržených eliminačních odlehlých výsledků (identifikované Cochran-Dixonovým testem)sr : standardní odchylka opakovatelnostisR : standardní odchylka reprodukovatelnostir : opakovatelnostR : reprodukovatelnostCVr : koeficient variace opakovatelnosti, %CVR : koeficient variace reprodukovatelnosti, %| Vzorek 1 Směsné krmivo pro prasata (CRM 117) | Vzorek 2 Nízko-tučná rybí moučka (CRM 118) | Vzorek 3 Sójová moučka (CRM 119) | Vzorek 4 Sušené odstředěné mléko (CRM 120) |L | 7 | 7 | 7 | 7 |n | 25 | 30 | 30 | 30 |střed [g/kg] | 2,064 | 8,801 | 6,882 | 5,236 |sr [g/kg] | 0,021 | 0,101 | 0,089 | 0,040 |r [g/kg] | 0,059 | 0,283 | 0,249 | 0,112 |CVr [%] | 1,04 | 1,15 | 1,30 | 0,76 |sR [g/kg] | 0,031 | 0,413 | 0,283 | 0,221 |R [g/kg] | 0,087 | 1,156 | 0,792 | 0,619 |CVR [%] | 1,48 | 4,69 | 4,11 | 4,22 |9. Poznámky9.1 Následující specielní chromatografické podmínky mohou poskytnout lepší rozdělení mezi tryptofanem a α-methyl-tryptofanem.Izokratické vymývání následované gradientovým čistěním kolony:Kolona pro kapalinovou chromatografii: | 125 mm x 4 mm, C18, velikost částic náplně 5 μm nebo obdobné |Teplota kolony: | 32 oC |Mobilní fáze: | A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (objemově + objemově) B: Metanol |Gradientový program: | 0 min. | 100 % A | 0 % B |15 min. | 100 % A | 0 % B |17 min. | 60 % A | 40 % B |19 min. | 60 % A | 40 % B |21 min. | 100 % A | 0 % B |33 min. | 100 % A | 0 % B |Úroveň toku: | 1,2 ml/min. |Celková doba běhu: | přibližně 33 minut |9.2 Chromatografie se bude různit podle typu HPLC kolony a použitého plnícího materiálu. Vybraný systém musí být schopen poskytnout separační startovní čáru mezi tryptofanem a vnitřním standardem. Navíc je důležité, aby byly degradační produkty dobře odděleny od tryptofanu a vnitřního standardu. Hydrolyzáty bez vnitřního standardu by měly být chromatografovány, aby se překontrolovala startovní čára za vnitřního standardu pro nečistoty. Je důležité, aby doba běhu byla dostatečně dlouhá pro vymytí všech degradačních produktů, jinak mohou píky pozdního vymývání ovlivňovat následný průběh chromatografie.V rozsahu činnosti, by měl chromatografický systém dát lineární odezvu. Lineární odezva by měla být měřena s konstantní (normální) koncentrací vnitřního standardu a měnícími se koncentracemi tryptofanu. Je důležité, aby velikosti píků tryptofanu a vnitřního standardu byly v lineárním rozsahu HPLC/flourescenčního systému. Pokud pík (píky) buď tryptofanu, a/nebo vnitřního standardu je (jsou) příliš malý (malé) nebo příliš vysoký (vysoké), měly by být analýzy opakovány se vzorkem jiné velikosti a/nebo změněným konečným objemem.9.3 Hydroxid barnatýStářím se stává hydroxid barnatý hůře rozpustný. To se projevuje v nečirém roztoku pro stanovení pomocí HPLC, což může u tryptofanu způsobovat nižší výsledky.[1] Řízené pracovní skupinou pro krmiva Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).[2] Řízené pracovní skupinou pro krmiva Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).--------------------------------------------------


title: Směrnice Rady ze dne 14. prosince 1981, kterou se doplňují směrnice 75/362/EHS, 77/452/EHS, 78/686/EHS a 78/1026/EHS o vzájemném uznávání diplomů, osvědčení a jiných dokladů o dosažené kvalifikaci lékařů, zdravotních sester a ošetřovatelů odpovědných za všeobecnou péči, zubních lékařů a veterinárních lékařů, pokud jde o nabytá práva

text:
Důležité právní upozornění

|

31981L1057

Úřední věstník L 385 , 31/12/1981 S. 0025 - 0026 Finské zvláštní vydání: Kapitola 16 Svazek 1 S. 0050  Španělské zvláštní vydání: Kapitola 06 Svazek 2 S. 0126  Švédské zvláštní vydání: Kapitola 16 Svazek 1 S. 0050  Portugalské zvláštní vydání Kapitola 06 Svazek 2 S. 0126

		Směrnice Radyze dne 14. prosince 1981,kterou se doplňují směrnice 75/362/EHS, 77/452/EHS, 78/686/EHS a 78/1026/EHS o vzájemném uznávání diplomů, osvědčení a jiných dokladů o dosažené kvalifikaci lékařů, zdravotních sester a ošetřovatelů odpovědných za všeobecnou péči, zubních lékařů a veterinárních lékařů, pokud jde o nabytá práva(81/1057/EHS)RADA EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,s ohledem na Smlouvu o založení Evropského hospodářského společenství, zejména na články 49, 57 a 66 této Smlouvy,s ohledem na návrh Komise [1],s ohledem na stanovisko Evropského parlamentu [2],s ohledem na stanovisko Hospodářského a sociálního výboru [3],vzhledem k tomu, že ve směrnicích 75/362/EHS [4], 77/452/EHS [5], 78/686/EHS [6] a 78/1026/EHS [7] o vzájemném uznávání diplomů, osvědčení a ostatních dokladů o dosažené kvalifikaci lékařů, zdravotních sester a ošetřovatelů odpovědných za všeobecnou péči, zubních lékařů a veterinárních lékařů, obsahujících opatření k usnadnění účinného výkonu práva usazování a volného pohybu služeb, se ustanovení týkající se nabývání práv zmiňují o diplomech, osvědčeních a obdobných dokladech o dosažené kvalifikaci lékařů, zdravotních sester a ošetřovatelů odpovědných za všeobecnou péči, zubních lékařů a veterinárních lékařů udělených členskými státy před provedením uvedených směrnic;vzhledem k tomu, že se tato ustanovení tudíž výslovně netýkají diplomů, osvědčení a obdobných dokladů o dosažené kvalifikaci dokládajících vzdělání, jež nesplňuje minimální požadavky na vzdělání stanovené ve směrnicích 75/363/EHS [8], 77/453/EHS [9], 78/687/EHS [10] a 78/1027/EHS [11], které bylo dokončeno po provedení uvedených směrnic, ale započalo před jejich provedením;vzhledem k tomu, že je žádoucí napravit toto opomenutí,PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:Článek 1Ustanovení čl. 9 odst. 1 a 2 směrnice 75/362/EHS, článku 4 směrnice 77/452/EHS, čl. 7 odst. 1 a 2 směrnice 78/686/EHS a článku 4 směrnice 78/1026/EHS se použijí také na diplomy, osvědčení a obdobné doklady o dosažené kvalifikaci dokládající vzdělání, které nesplňuje minimální požadavky na vzdělání stanovené v článcích 1, 2, 3, 4 a 5 směrnice 75/363/EHS, v článku 1 směrnice 77/453/EHS, v článcích 1, 2 a 3 směrnice 78/687/EHS a v článku 1 směrnice 78/1027/EHS a které bylo dokončeno po provedení uvedených směrnic, ale bylo zahájeno před jejich provedením.Článek 2Členské státy přijmou opatření nezbytná k dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 30. června 1982. Neprodleně o nich uvědomí Komisi.Článek 3Tato směrnice je určena členským státům.V Bruselu dne 14. prosince 1981.Za RadupředsedaG. Howe[1] Úř. věst. C 121, 23.5.1981, s. 3.[2] Úř. věst. C 172, 13.7.1981, s. 114.[3] Úř. věst. C 185, 27.7.1981, s. 7.[4] Úř. věst. L 167, 30.6.1975, s. 1.[5] Úř. věst. L 176, 15.7.1977, s. 1.[6] Úř. věst. L 233, 24.8.1978, s. 1.[7] Úř. věst. L 362, 23.12.1978, s. 1.[8] Úř. věst. L 167, 30.6.1975, s. 14.[9] Úř. věst. č. L 176, 15. 7. 1977, s. 8.[10] Úř. věst. č. L 233, 24. 8. 1978, s. 10.[11] Úř. věst. č. L 362, 23. 12. 1978, s. 7.--------------------------------------------------