title: Директива 2000/33/ЕО на Комисията от 25 април 2000 година относно двадесет и седмо адаптиране към техническия прогрес на Директива 67/548/EИО на Съвета за сближаването на законовите, подзаконовите и административни разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни веществатекст от значение за ЕИП.

text:
Важна правна забележка

|

32000L0033

Официален вестник n° L 136 , 08/06/2000 стр. 0090 - 0107 специално чешко издание глава 13 том 25 стр. 242  - 259 специално испанско издание глава 13 том 25 стр. 242  - 259 специално унгарско издание глава 13 том 25 стр. 242  - 259 специално литвийско издание глава 13 том 25 стр. 242  - 259 LV.ES глава 13 том 25 стр. 242  - 259 MT.ES глава 13 том 25 стр. 242  - 259 PL.ES глава 13 том 25 стр. 242  - 259 SK.ES глава 13 том 25 стр. 242  - 259 специално словенско издание глава 13 том 25 стр. 242  - 259

		20000425Директива 2000/33/ЕО на Комисиятаот 25 април 2000 годинаотносно двадесет и седмо адаптиране към техническия прогрес на Директива 67/548/EИО на Съвета за сближаването на законовите, подзаконовите и административни разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества [*](текст от значение за ЕИП)КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност,като взе предвид Директива 67/548/EИО на Съвета от 27 юни 1967 г. за сближаване на законовите, подзаконовите и административни разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества [2], последно изменена от Директива 1999/33/ЕО на Европейския парламент и на Съвета [3], и по-специално член 28 от нея,като има предвид, че:(1) Приложение V към Директива 67/548/ЕИО урежда методите за определяне на физикохимическите свойства, токсичността и екотоксичността на веществата и препаратите. Необходимо е това приложение да се приведе в съответствие с постиженията на техническия прогрес.(2) Съгласно член 7, параграф 2 от Директива 86/609/ЕИО на Съвета от 24 ноември 1986 г. за сближаване на законовите, подзаконовите и административните разпоредби на държавите-членки относно защита на животните, използвани за опитни и други научни цели [4], експеримент, при който се налага използването на животни не следва да бъде провеждан, ако съществува и е практически достъпен друг научен метод, с помощта на който да се постигнат търсените резултати.(3) Комисията възнамерява да въведе в приложение V към Директива 67/548/ЕИО алтернативни тест-методи, при които не се използват животни, с цел запазването им за тестване на химични вещества в съответствие с член 3, параграф 1 от Директива 67/548/ЕИО.(4) Предвидените в настоящата директива мерки са в съответствие със Становището на Комитета по адаптиране към техническия прогрес на директивите за премахване на техническите пречки пред търговията с опасни вещества и препарати,ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:Член 1Текстовете в приложение I и приложение II към настоящата директива се добавят към част Б на приложение V към Директива 67/548/ЕИО.Член 21. Държавите-членки въвеждат в сила не по-късно от 1 октомври 2001 г. законовите, подзаконовите и административните разпоредби, необходими, за да се съобразят с настоящата директива. Те незабавно информират Комисията за това.Когато държавите-членки приемат тези разпоредби, в тях се съдържа позоваване на настоящата директива или то се извършва при официалното им публикуване. Условията и редът на позоваване се определят от държавите-членки2. Държавите-членки съобщават на Комисията текста на основните разпоредби от националното законодателство в областта, уредена с настоящата директива, както и таблица на съответствието между разпоредбите на настоящата директива и приетите национални разпоредби.Член 3Настоящата директива влиза в сила на третия ден от датата на публикуването ѝ в Официален вестник на Европейските общности.Член 4Адресати на настоящата директива са държавите-членки.Съставено в Брюксел на 25 април 2000 година.За КомисиятаMargot WallströmЧлен на Комисията[*] Приета преди 26-та адаптация.[2] ОВ L 196, 16.8.1967 г., стр. 1.[3] ОВ L 199, 30.7.1999 г., стр. 57.[4] ОВ L 358, 18.12.1986 г., стр. 1.--------------------------------------------------20000425ПРИЛОЖЕНИЕ 1"Б.40. КОРОЗИЯ НА КОЖАТА1. METОД1.1 ВъведениеДвата теста ин витро за корозивност на кожата, едно изследване на транскутантната електрическа резистентност (TEР) при плъховете и един тест с използване на модела на човешката кожа са одобрени като научно обосновани от Европейския център за утвърждаване на алтернативни методи (ЕCVAM) (1) (2) (3). Проучването за утвърждаване, направено от ЕCVAM показва, че и двата теста дават възможност да се диференцират познатите кожни корозивни вещества от не-корозивните. Освен това, протоколът от теста, основаващ се на модела на човешката кожа, позволява точно разграничение между степените на корозивните ефекти (познати като тежки кожни корозиви, R35, и други кожни корозиви, R34) (2). Oписанията и процедурите по двата теста са дадени по-долу; изборът на определен тест зависи от специфичните изисквания и предпочитания на потребителя.Виж също "Общо въведение", част Б.1.2. ДефиницииКорозия на кожата: необратимо увреждане на кожата, вследствие на прилагането на проучвания материал.1.3. Референтни веществаНе са уточнени, но виж т.1.5.3.4 и 1.7.2.3.1.4. Принцип на тест-метода — кожен тест TEР при плъховеМатериалът за тестване се поставя за 24 часа върху епидермалната повърхност на кожни проби, взети от необработени кожи на хуманно убити млади плъхове. Корозивните материали се идентифицират според способността им да предизвикват загуба на целостта при нормална слоеста структура на роговия слой, както и нарушаване на предпазната му функция, което се измерва като намаление на вродената TEР под определено прагово ниво(5 кΩ) (4) (5). Дразнещи и недразнещи материали не намаляват TEР под праговото ниво. В тестовата процедура може да се включи стъпка за свързване на повърхностно-активни и неутрални органични вещества (за дефиниция виж (6) с багрилно вещество, с цел намаляване на неверните положителните резултати, получавани специфично с тези химични видове (2) (7).1.5. Описание на тест — метода — кожен тест TEР при плъхове1.5.1. ЖивотниЗа подготовката на кожни проби се изискват млади (20—23 дневни) плъхове (от порода Wistar или подобна). Козината по гърба и хълбоците се отстранява внимателно с малки животински ножици. След това животните се измиват внимателно, като областта се обработва с антибиотичен разтвор (съдържащ, например стрептомицин, пеницилин, хлорамфеникол или амфотерицин в концентрация, инхибираща ефективно бактериалния растеж). Животните се измиват отново с антибиотичен разтвор на третия или четвъртия ден след първото измиване, и се използват в рамките на 3 дни (за да се използват за кожни проби, животните не трябва да са по-стари от 31 дни).1.5.2. Подготовка на кожни пробиЖивотните се убиват по хуманен начин. Отстранява се кожата от гърба на всяко животно, като излишната мазнина внимателно се отделя чрез обелване от кожния слой. Необработената кожа се поставя върху една политетрафлуоретиленов (РTFE) тръба така че повърхността на епидермиса да е в контакт с тръбата. Гумен пръстен с формата на буквата "О" е вкаран плътно върху единия край на тръбата така че да държи кожата, а излишната тъкан се отстранява. Размерите на тръбата и на О-образния гумен пръстен са показани на фигура 1. Посредством гумения пръстен се запечатва единия край на тръбата с керосинов клей. Тръбата се поддържа от пружинен клипс(скоба) във вътрешността на рецепторна камера, съдържаща разтвор на магнезиев сулфат(154 mM) (фигура 2).1.5.3. Процедура за тестване1.5.3.1. Прилагане на материала за тестванеПроучваните течни вещества (150 µl) се прилагат върху епидермалната повърхност, намираща се в тръбата (фигура 2). Ако се тестват твърди материали, необходимо е да се приложи достатъчно количество от твърдия материал върху пробата, така че цялата повърхност на епидермиса да бъде покрита. Добавя се дейонизирана вода (150 µl) до върха на материала и тръбите внимателно се разклащат.Тестваните вещества следва да имат плътен контакт с кожата. За някои вещества това може да бъде постигнато посредством нагряването им до 30 °С с цел разтопяване на веществото или чрез стриване до получаване на гранули или прах.За всяко проучвано вещество се използват по три кожни проби. Проучваните вещества се прилагат в продължение на 24 часа (виж също 1.5.3.4). Тестваното вещество се отстранява на струя течаща вода при температура до 30 °С до пълното отстраняване на материала. Отстраняването на втвърдилите се в тръбата проучвани вещества може да се улесни чрез измиването им със струя вода с температура приблизително 30 °С.1.5.3.2. Измервания на ТЕРТЕР се измерва като се използва мост с нисковолтов, променлив ток (AIM 401 или 6401, или еквивалентен на тях). Преди измерване на електрическото съпротивление повърхностното напрежение на кожата се намалява, като епидермисът се покрива достатъчно добре със 70 % разтвор от етанол (етилов алкохол). След няколко секунди етанолът се отстранява, като тръбата се обръща и тъканта се хидратира с добавяне на 3 ml. разтвор на магнезиев сулфат (154 mM). Електродите на измервателния мост се поставят от двете страни на кожната проба, за да се получи измерване на съпротивлението в кΩ/кожна проба (диск) (фигура 2). Размерите на електродите, а също и размерите на непокритата им част под "крокодилските" клипси, са показани на фигура 1. По време на измерване на съпротивлението придържащият вътрешния (дебел) електрод "крокодилски" клипс, остава на върха на тефлоновата тръба, така че да осигури потопяването на достатъчна дължина от електрода в разтвора от магнезиев сулфат. Външният (тънък) електрод се поставя във вътрешността на рецепторната камера, така че да опира на нейното дъно. Разстоянието от долната повърхност на пружинения клипс до дъното на тефлоновата тръба се поддържа постоянно (фиг.1), тъй като то влияе на измереното съпротивление.Да се има предвид, че ако измереното съпротивление надвишава 20 кΩ, това може да се дължи на слоя проучвано вещество, покриващо епидермалната повърхност на кожния диск. Отстраняването на този слой може да се извърши, като например тефлоновата тръба се запуши с пръст от ръкавица, след това се разклати за около 10 секунди; разтворът от магнезиев сулфат се отстранява и измерването на резистентността (съпротивлението) се повтаря с нов магнезиев сулфат.Получените средни резултати за ТЕР се приемат при условие че едновременно проведените положителни и отрицателни контроли попадат в рамките на допустимите за метода. Предложените контролни вещества и съответните им допустими области за транскутанна електрическа резистентност според възприетата методология и апаратура, са дадени по-долу:Контрола | Вещество | Област на резистентност (кΩ) |Положителна | 10 М солна киселина(36 %) | 0,5—1,0 |Отрицателна | Дестилирана вода | 10—25 |1.5.3.3. Променена процедура за повърхностно-активни и неутрални органични веществаАко стойностите на ТЕР за проучваните вещества, които са или повърхностно-активни или неутрални органични вещества, са по-малки или равни на 5 кΩ, следва да се направи оценка на степента на проникване на багрилното вещество в тъканта. Тази процедура определя дали резултатите са невярно положителни (2).1.5.3.3.1. Приложение и отстраняване на багрилото сулфородамин БСлед начална обработка с проучваното вещество, 150 µl от 10 %(w/v) разтвор на сулфородамин Б в дестилирана вода, се прилага върху епидермалната повърхност на всеки кожен диск в продължение на 2 часа. След това кожните дискове се измиват на струя течаща вода при стайна температура за около 10 секунди, за да се отстрани излишното(несвързано) багрило. Всеки кожен диск се изважда от тефлоновата тръба и се поставя в стъкленица (20 ml стъклен чист съд), съдържаща дейонизирана вода (8ml). Стъклениците се разклащат внимателно за около 5 минути с цел отстраняване на останалото излишното(несвързано) багрило. Тази процедура на изплакване се повтаря, след което кожните дискове се изваждат и поставят в стъкленици, съдържащи 5 ml от 30 %(W/v) разтвор на натриев додецилсулфат (НДС) в дестилирана вода, и се инкубират в продължение на една нощ при температура 60 °С. След инкубирането всеки кожен диск се отделя и отстранява, като останалият разтвор се центрофугира в продължение на 8 мин. при температура 21 °С (относителна центрофугираща сила ~ 175). Проба от 1 ml суперанатант се разрежда в отношение 1 в 5(v/v) (т.е. 1 ml + 4 ml) със 30 % (w/v) НДС в дестилирана вода. Оптичната плътност на разтвора се измерва при дължина на вълната около 565 nm.1.5.3.3.2. Изчисляване съдържанието на багрилотоСъдържанието на багрилото сулфородамин Б във всяка проба се изчислява според стойностите на оптичната плътност (коефицентът на моларна екстинкция на сулфородамин Б при дължина на вълната 565 nm = 8,7 × 104; молекулярно тегло = 580). Съдържанието на сулфородамин Б се определя за всеки кожен диск по отделно, след което за повторните тестове се изчислява средна величина. Средните резултати за свързването на багрилото се приемат при условие че стойностите на едновременно извършените контролни тестове, попадат в обсега на допустимите за метода. Предлаганите приемливи области за съдържание на багрилото в контролните вещества по отношение на методологията и апаратурата, са дадени по-долу:Контрола | Вещество | Област на съдържанието на багрилото (µg/проба) |Положителна | 10 М солна киселина(36 %) | 40-100 |Отрицателна | Дестилирана вода | 15-35 |1.5.3.4. Допълнителна информацияПроучваните вещества могат да бъдат приложени върху кожните дискове за по-кратки периоди (например 2 часа) с цел идентифициране на онези материали, които са силно корозивни. Проучване за установяване на валидност открива, че определянето на ТЕР надценява корозивния потенциал на няколко проучвани химически вещества след прилагането им върху кожните дискове за период от 2 часа (2), въпреки, че точно са идентифицирани корозивните и не-корозивните вещества след 24 - часово прилагане.Свойствата и размерите на опитната апаратура и използваната експериментална процедура могат да окажат влияние върху получените стойности за ТЕР. Прагът за корозивност от 5 кΩ е уточнен според данните, получени със специалната апаратура и процедура, описани в този метод. В случай, че опитните условия са променени значително, то тогава се използват друг праг и контролни стойности. Ето защо се препоръчва методологията и стойността на прага на резистентност да бъдат калибрирани посредством тестуване на серия от референтни стандарти, избрани от химическите вещества, използвани в проучването за валидност (3).1.6. Принцип на тест — метода — анализ на човешкия модел на кожатаПроучваните материали се прилагат в продължение на 4 часа локално, към три измерен модел на човешката кожа, представляващ реконструиран епидермис с функционален рогов слой. Корозивните материали се идентифицират според тяхната способност да предизвикват намаляване на жизнеността на клетките (определя се например, чрез използването на теста за намаляване на МТТ) под определени прагови нива при определени експозиционни периоди. Принципът на опита е в съответствие с хипотезата, че корозивните химически вещества са тези, които са способни да проникнат в роговия слой (чрез дифузия или ерозия) и са достатъчно цитотоксични, за да причинят смърт на клетките в подлежащите клетъчни слоеве.1.7. Описание на метода за тестване — анализ на човешкия модел на кожата1.7.1. Модели на човешката кожаМоделите на човешката кожа произхождат от различни източници и трябва да отговарят на определени критерии. Моделът следва да притежава функционален рогов слой с подлежащ слой от живи клетки. Пазещата (бариерната) функция на роговия слой следва да бъде адекватна. Това може да се докаже чрез определяне на резистентността на модела към цитотоксичността, последвала прилагането на вещества, познати като цитотоксични към клетките, но които нормално не преминават през роговия слой. Моделът следва да дава резултати при определени експериментални условия.Жизнеспособността на живите клетки на модела следва да е достатъчно висока, за да разграничи добре положителните от отрицателните контролни вещества. Клетъчната жизнеспособност (например, измерена със степента на понижаването на МТТ, т.е. стойността на оптическата плътност ОП) след излагане на действието на отрицателно контролно вещество следва да попадне в приемливи за съответния модел граници. По подобен начин стойностите за клетъчна жизнеспособност под действие на положителното контролна вещество (отнесени към тези за отрицателната контрола) следва също да попаднат в определени граници. Най-важното е да се покаже, че използваният предсказващ модел отговаря на утвърдените международни стандарти (2).1.7.2. Процедура за тестване1.7.2.1. Прилагане на проучвания материалПо отношение на течните материали, следва да се приложи достатъчно количество от проучваното вещество, така че да се покрие повърхността на кожата (минимално 25μl/cm2). По отношение на твърдите материали, следва да се приложи достатъчно количество от проучваното вещество, така че да се покрие повърхността на кожата, последната да бъде навлажнена с цел осигуряване на добър контакт с нея; при необходимост твърдите вещества, преди използването им, могат да бъдат стрити на прах. Трябва да се докаже, че прилаганият метод е подходящ за широк набор от химически вещества (2). В края на експозиционния период, проучваният материал трябва да бъде измит внимателно от кожната повърхност с физиологичен разтвор.1.7.2.2. Определяне на жизнеността на клеткитеВсеки един утвърден количествен метод би могъл да бъде използван за определяне жизнеспособността на клетките. Най-често използваният количествен метод е изследване на МТТ редуцирането, доказал, че представя точни и резултати в различни лаборатории(2). Кожният диск се поставя в МТТ разтвор с концентрация 0,3 mg/ml при температура 20—28 °С в продължение на 3 часа. Утаилият се син формазанов продукт се екстрахира (екстракция на разтворителя) и концентрацията на формазана се измерва посредством определяне на оптичната плътност при дължина на вълната между 545 и 595 nm.1.7.2.3. Допълнителна информацияИзползваният модел на кожата и точният протокол за времето на експозиция, както и процедурите по измиване, и.т.н. оказват най-голямо влияние върху резултатите за оценка на клетъчната жизнеспособност. Препоръчва се методологията и модел на прогнозиране да се калибрират посредством тестването на серия от референтни стандарти, избрани от химическите вещества, използвани в проучването за валидност на ECVAM (3). Изключително важно е да се покаже, че използваният метод е в рамките на всяка една и между отделните лаборатории, по отношение на широк кръг от химически вещества, в съответствие с международните стандарти. Като минимално условие се изисква методът да отговаря на критериите за научна достоверност, дефинирана предварително (2), като резултатите от такова утвърдително проучване трябва да бъдат публикувани в обзорно научно списание.2. ДАННИ2.1. Обработване на резултатите2.1.1. Изследване на кожна ТЕР при плъховетеСтойностите за резистентност (кΩ) на проучвания материал, положителните и отрицателните контроли, както и всяко стандартно референтно химическо вещество, следва да бъдат представени в таблична форма, включвайки данните за повторените експерименти, средните стойности и създадената класификация.2.1.2. Изследване на модел на човешка кожаСтойностите на оптичната плътност, процентните данни за клетъчната жизнеспособност на проучвания материал, положителните и отрицателните контроли, както и всяко стандартно референтно химическо вещество, следва да бъдат представени в таблична форма, включвайки данните за повторените експерименти, средните стойности и създадената класификация.2.2. Оценка и интерпретация на резултатите2.2.1. Изследване на кожна ТЕР при плъховетеАко получената средна стойност на ТЕР за проучваното вещество е по-голяма от 5 кΩ, то не е корозивно. Ако тя е по-малка или равна на 5 кΩ и тестваното вещество не е повърхностно-активно или неутрално органично, то е корозивно.За повърхностно-активните или неутралните органични вещества, чиято стойност за ТЕР е по-малка или равна на 5 кΩ, би могло да бъде направен тест за проникване на багрилото. В случай, че средното количество на багрилото в кожния диск е по-голямо или равно на средното съдържание на багрило в диск, съдържащ 36 % солна киселина като положителна контрола, изследвана едновременно, то тогава проучваното вещество е истински положително и затова корозивно. В случай, че средното количество на багрилото в кожния диск е по-малко от средното съдържание на багрило в диск, съдържащ 36 % солна киселина като положителна контрола, получена едновременно, то тогава проучваното вещество е невярно положително и затова не-корозивно.2.2.2. Изследване на модел на човешка кожаСтойността на отрицателната контрола на оптичната плътност представлява 100 % жизнеспособност на клетката; оттук следва, че стойностите на оптичната плътност, получени за всяка проба, могат да бъдат използвани за изчисляване на процентната жизнеспособност, отнесена към отрицателната контрола. Процентната граничната прагова стойност за клетъчна жизнеспособност, разграничаваща корозивните от не-корозивните проучвани материали (или отличава различните корозивни класове), трябва да бъде ясно определен в модел на прогнозиране преди узаконяването на метода, като следващото проучване за валидност трябва да потвърди, че този праг е достоверен (2).3. ДОКЛАДВАНЕДоклад за тестаДокладът за теста трябва да включва най-малко следната информация:Проучвано вещество:- Идентифициращи данни, физична същност и при необходимост - данни за физико-химичните свойства. Подобна информация следва да се представи и за референтните вещества, в случай че се използват.Условия на теста:- подробности за използваната тестова процедура,- описание и обосновка на всякакъв вид промени.Резултати:- представяне в табличен вид на стойностите за резистентност (изследване на ТЕР) или процентната стойност за клетъчна жизнеспособност (изследване на модел на човешка кожа) на проучвания материал, положителните и отрицателните контроли, както и всяко стандартно референтно химическо вещество, включвайки данните за повторените експерименти и средните стойности.- описание на всички други наблюдавани ефекти.Обсъждане на резултатите.Заключения.4. ПОЗОВАВАНИЯ(1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, pp. 275-280.(2) Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.(3) Barratt, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, I., Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, pp. 471-482.(4) Oliver, G. J. A., Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test — modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, pp. 507-512.(5) Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., Basketter, D. A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, pp. 191-194.(6) Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, pp. 709-720.(7) Botham, P. A., Chamberlain, M., Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, pp. 219-255.+++++ TIFF +++++Фигура 1Размери на PTFE цилиндър (тръба)16mm10mm95mm3mm0,5mm1mm1mm13mm0,5mmРазмери на електрода"крокодилски" клипс81mm75mm78mm1mm3mm+++++ TIFF +++++Фигура 2"Апаратура за определяне на кожния ТЕР при плъховевътрешен (плътен) електрод"крокодилски" клипсPTFE цилиндър (тръба)външен (тънък) електрод"крокодилски" клипспружинен клипсрецепторна камера (сменяем цилиндър)магнезиев сулфат (154 mM)епидермис на кожния дискгумен пръстенмагнезиев сулфат (154 mM)дерма на кожния диск“--------------------------------------------------20000425ПРИЛОЖЕНИЕ II"В.41. ФОТОТОКСИЧНОСТ — ИН ВИТРО 3T3 NRU ФОТОТОКСИЧЕН ТЕСТ1. METОД1.1. ВъведениеФототоксичността се определя като токсична реакция, предизвикана след първото излагане на кожата на действието на определени химични вещества и последващо излагане на светлина, или реакция индуцирана по подобен начин чрез облъчване на кожата след системно прилагане на химично вещество.Информацията, получена от фототоксичния тест ин витро 3T3 NRU (поглъщане на неутрално червено), служи за определяне на фототоксичния потенциал на проучваното вещество, т.е. наличие или липса на възникване на възможни рискове от страна на тестваното вещество при експозиция на ултравиолетова и видима светлина.Тъй като токсикологичната крайна цел на теста ин витро, е определяне на фотоцитотоксичността, индуцирана от комбинираното въздействие на химическото вещество и светлината, съединенията, които са фототоксични ин виво след системно прилагане и разпределение в кожата, както и съединения, които действат като фотодразнители след локално прилагане върху кожата, могат да бъдат определени чрез теста.Фототоксичният тест ин витро 3T3 NRU е разработен и утвърден в съвместен проект на Европейския съюз/Европейската асоциация по парфюмерия и козметика (EU/COLIPA) от 1992—1997 (1) (2) (3) с цел утвърждаване на тест ин витро, алтернативен на използваните дотогава тестове ин виво. През 1996 г. работна среща на Организацията за икономическо сътрудничество и развитие препоръчва провеждането на поредица от опити ин витро, като подход за оценка на фототоксичност (4).Резултати от фототоксичния тест ин витро 3T3 NRU са сравнени с силните ефекти на фототоксичност/фотодразнимост ин виво при животни и хора, като тестът показва, че дава отлична предсказуемост на тези ефекти.Тестът не е предназначен за прогнозиране на други неблагоприятни ефекти, които могат да възникнат при комбинираното действие на химическото вещество и светлината, т.е. фотогенотоксичност, фотоалергия и фотоканцерогенност, макар че много химически вещества, които притежават тези специфични свойства, реагират положително в фототоксичния тест ин витро 3T3 NRU. Освен това, фототоксичният тест не е предназначен за оценяване на фототоксичния потенциал.В допълнението е представен последователен подход за тестване на химически вещества за фототоксичност.1.2. ДефиницииИрадиация: Интензитетът на ултравиолетовата(UV) или видима светлина, падаща върху повърхност, измерен в W/m2 или mW/cm2.Доза светлина: Количеството (= интензитет x време) на ултравиолетовата (UV) или видима светлина, падаща на повърхност, изразена в джаули (W x s) на единица площ, т.е. J/m2 или J/cm2.Ултравиолетова дължина на вълната: означенията, препоръчани от Международната комисия, разработила цветови стандарти CIE (Commission Internationale de L'Eclairage) са: UVA (315—400 nm), UVB (280—315 nm) и UVC (100—280 nm). Използват се и други указания: разделът между UVB и UVA се поставя на 320 nm, като UVA може да бъде разделена на UV-A1 и UV-A2, разделна линия на около 340 nm.Клетъчна жизнеспособност: параметър, измерващ общата активност на клетъчната популация (т.е. поглъщане на неутралното червено багрило в клетъчните лизозоми), който в зависимост от измерената крайна стойност и използвания проект на теста, корелира с общия брой и/или жизненост на клетките.Относителна клетъчна жизнеспособност: клетъчната жизнеспособност, изразена по отношение на отрицателните (с разтворител) контроли, които са определяни по време на цялата тест - процедура (+ UV или - UV), но без да са обработвани с тестваното химическо вещество.Модел на прогнозиране: алгоритъм за трансформиране на резултатите от тест за токсичност в прогнозиране на токсичния потенциал. В настоящото ръководство за теста, ФФД и СФЕ могат да бъдат използвани за трансформиране на резултатите от фототоксичния тест ин витро 3Т3 NRU за прогнозиране на фототоксичния потенциал.ФФД (фактор на фотодразнимост): фактор, получен при сравнението на две еднакво ефективни цитотоксични концентрации (EC50) на проучваното химическо вещество, получени в отсъствието(- UV) и присъствието (+ UV) на не-цитотоксична ирадиация с UVA/видима светлина.СФЕ(среден фото ефект): ново измерване, получено от математически анализ на завършените форми на двете ответни криви на концентрацията, получени в отсъствието(- UV) и присъствието (+ UV) на не-цитотоксична ирадиация с UVA/видима светлина.Фототоксичност: остра токсична реакция, предизвикана след първото излагане на кожата на действието на определени химически вещества и последващо излагане на светлина, или която е индуцирана по подобен начин от кожна ирадиация след системно прилагане на химическо вещество.Фотодразнимост: подвид на термина "фототоксичност", предназначен да опише само тези фототоксични реакции, които се наблюдават в кожата след излагането ѝ на химически вещества (локално или през устата). Тези фототоксични реакции винаги водят до неспецифично увреждане на клетката (подобно на реакция при слънчево изгаряне).Фотоалергия: придобита имунологична реактивност, която не се наблюдава при първото третиране с химическо вещество и светлина, и която се нуждае от индукционен период от една или две седмици преди изявата на кожната реактивност.Фотогенотоксичност: генотоксична реакция, наблюдавана при генетично промяна, предизвикана след излагане на клетки на действието на не-генотоксична доза ултравиолетова/видима светлина и не-генотоксично химическо вещество.Фотоканцерогенност: канцерогенност, стимулирана от повтарящо се прилагане на светлина и химическо вещество. Терминът "фото ко-канцерогенност", се използва в случай, че предизвиканата с UV туморогенеза (развитие на тумор), се засилва под действието на химично вещество.1.3. Референтни веществаОсвен положителната контрола хлорпромазин, която следва да бъде тествана при всяко изследване, се препоръчва - при въвеждане на нов фототоксичен тест 3Т3 NRU да се прилагат като референтни химически вещества набор от тези, които се използват в междулабораторни изпитания с наличния тест (1) (3) (13).1.4. Начални съображенияСъобщава се за голям брой химически вещества, които предизвикват фототоксични ефекти (5) (6) (7) (8). Единствената им обща характеристика е способността им да абсорбират светлинна енергия в слънчевия спектър. Съгласно първия закон на фотохимията (законът на Grotthaus-Draper), фотореакцията изисква достатъчно абсорбиране на светлинна квантова енергия. Така че, преди да се обсъди извършването на биологично проучване, съгласно съществуващото ръководство за теста, следва да се определи абсорбционния спектър в ултравиолетовата/видима зона светлина на проучваното химическо вещество(в съответствие с Ръководството за извършване на тестове 101 на Организацията за икономическо сътрудничество и развитие). Химическото вещество няма фотореактивен потенциал, ако моларният коефицент на екстинкция/абсорбция е по-малък от 10 литра × mol-1 × сm-1, и не е нужно да бъде тествано чрез фототоксичен тест ин витро 3T3 NRU, или какъвто да е друг биологичен тест за установяване на неблагоприятни фотохимични ефекти (Допълнение).1.5. Принцип на тест методаИзвестни са четири механизми, чрез които абсорбирането на светлина от (химически) хромофор може да предизвика фототоксична реакция(7). Всички те увреждат клетката. Ето защо фототоксичният тест ин витро 3T3 NRU се основава на сравнението на цитотоксичността на определено химическо вещество, тествано както при наличие, така и при липса на излагане на не-цитотоксична доза от UVA/видима светлина. Цитотоксичността в този тест се представя като зависимо от концентрацията намаляване на поглъщането на неутрално червено багрило(NR) (9) 24 часа след обработване с проучваните химически вещества и облъчване (ирадиация).Клетки Balb/C 3T3 се култивират в среда в продължение на 24 часа с цел образуване на монослоеве. След това две плаки с по 96 гнезда за всяко едно от проучваните химически вещества предварително се инкубират с осем различни негови концентрации за 1 час. След това една от двете плаки се излага на действието на доза от 5J/cm2 нецитотоксична UVA/видима светлина (+ UV експеримент), докато другата плака се съхранява на тъмно(-UV експеримент). Опитната среда и в двете плаки се заменя с култивирана среда и след нова 24-часова инкубация, клетъчната жизнеспособност се определя с oпит за поглъщане на неутрално червено(NRU) за 3 часа. Относителната клетъчна жизнеспособност се изчислява за всяка от осемте пробни концентрации и се изразява като процент от необработените отрицателни контроли. За да се предскаже фототоксичния потенциал, концентрациите, получени в присъствието(+ UV) и отсъствието(-UV) на облъчване (ирадиация) се сравняват, обикновено на ниво EC50, т.е. при концентрацията, инхибираща клетъчната жизнеспособност с 50 % в сравнение с необработените контроли.1.6. Качествени критерииЧувствителност на клетките към UVA, данни от предишни изследвания: клетките следва да бъдат периодично проверявани за чувствителност към UVA. Клетките се посяват при плътност, каквато се използва в фототоксичния тест ин витро 3T3 NRU, облъчват се на следващия ден с дози от 1 до 9 J/cm2 UVA, след което един ден по-късно се определя жизнеспособността на клетката посредством NRU тест. В случай, че жизнеспособността на клетките след ирадиация с 5 J/cm2 UVA не спада под 80 % от жизнеспособността на тъмни контроли, то те отговарят на качествените критерии. Жизнеспособността на клетките не следва да бъде по-малка от 50 % от тази на тъмните контроли при най-високата UVA доза от 9 J/cm2. Такава проверка следва да се извършва на всеки 10-ти пасаж на клетките.UVA чувствителност на отрицателните контролни клетки, настоящ тест: тестът отговаря на критериите за качество, ако отрицателните контроли (клетки в балансиран солен разтвор на Earl (EBSS)) със или без 1 % диметилсулфоксид (DMSO) или 1 % етанол (ЕtOH)) по време на + UVA експеримент показват жизненоспособност, не по-малка от 80 % от тази на необлъчените клетки в същия разтворител, при едновременно протичащ експеримент на тъмно (- UVA).Жизнеспособност на отрицателните контроли: абсолютната оптична плътност(OD540 NRU), измерена в NR екстракт от отрицателни контроли, показва дали 1 x 104 на гнездо култивирани клетки са се размножили двойно по време на двудневния опит. Тестът отговаря на общоприетите критерии, ако средната OD540 NRU на необработените контроли е по-голяма или равна на 0,2.Положителна контрола: познато фототоксично химическо вещество се проверява във всеки фототоксичен тест ин витро 3Т3. Препоръчва се хлорпромазин (ХПЗ), който е използван като положителна контрола при стандартизационния тест на Европейския съюз/Европейската федерация на проЗаключениятелите на козметика - EU/COLIPA. За хлорпромазин, тестван според стандартния протокол по време на фототоксичния тест ин витро 3Т3, са одобрени следните критерии за приемливост на теста: облъчен (ирадииран) хлорпромазин (+ UVA): EC50 = 0,1-2,0 µg/ml, необлъчен хлорпромазин (- UVA): EC50 = 7,0-90,0 µg/ml. Факторът за фотодразнимост (ФФД), т.е. промяната в EC50, следва да бъде най-малко 6.Други познати фототоксични химически вещества, отговарящи на химическия клас или на характеристиките за разтворимост на проучваното химическо вещество, след оценка могат да се използват като равностойни положителни контроли, заместители на хлорпромазин. В този случай, основавайки се на данни от предишни изследвания, следва да бъдат прецизно определени областта от значения за ЕС50 и ФФД или СФЕ (среден фотоефект), като критерии за приемливост на теста.1.7. Описание на тест метода1.7.1. Препарати1.7.1.1. КлеткиПостоянна клетъчна линия от фибробласти на мишки — Balb/c 3T3, клонинг 31, получени или от АТСС или от ЕСАСС, е използвана в проучването за стандартизация (узаконяване), заради което се и препоръчва. Ако условията за отглеждане се адаптират към специфичните нужди на клетките, то и други клетки или клетъчни линии може да се използват успешно със същия протокол за тестване, но трябва тяхната еднозначност да е доказана.Клетките следва да бъдат редовно проверявани за микоплазмено замърсяване и следва да бъдат използвани само в случай, че резултатите са задоволителни.Тъй като UVA чувствителността на клетките може да се увеличава с броя пасажите, следва да бъдат използвани клетки Ваlb/c 3Т3 от най-ниския получен пасажен номер, за предпочитане по-малък от 100. Необходимо е чувствителността към UVA на клетки Ваlb/c 3Т3 да бъде редовно проверявана, в съответствие с процедурата за контрол на качеството, описана в настоящето ръководство.1.7.1.2. Среда и условия за отглежданеЗа обичайния пасаж на клетки, както и по време на процедурата за тестване, следва да се използват подходяща среда за култивиране и условия за инкубация. По отношение на клетки Ваlb/c 3Т3, това са DMEM, допълнен с 10 % серум от новородено теле, 4 mM глутамин, пеницилин и стрептомицин; както и влажна инкубация при 37 °С/7,5 % СО2. Особено важно е условията за отглеждане на клетки да осигурят времеви клетъчен цикъл в рамките на нормалния за използваните клетките или клетъчни линии.1.7.1.3. Подготовка на културиКлетки от замразени култури се посяват в средата за култивиране при подходяща плътност, и се прекултивират поне веднъж преди да се използват в фототоксичния тест ин витро 3T3 NRU.За да изпълнят условията на теста за фототоксичност, клетките се посяват в средата за отглеждане при плътност, която да не позволи сливане на материала към края на теста, т.е. при определяне на клетъчната жизнеспособност 48 часа след посяването им. За клетки Ваlb/c 3Т3 се препоръчва култивиране в плаки от по 96 гнезда, при плътност 1 × 104 клетки на гнездо.За всяко едно проучвано химическо вещество клетките се посяват по един и същ начин в две отделни плаки с по 96 гнезда всяка, обработвани едновременно по време на цялата тест процедура, при едни и същи условия за отглеждане, с изключение на периода от време, за който една от плаките е облъчена (+ UVA/vis), а другата е държана на тъмно (- UVA/vis).1.7.1.4. Метаболитно активиранеДокато употребата на метаболизиращи системи е основно изискване за всички тестове ин витро за предсказване наличието на генотоксичен или канцерогенен потенциал, от гледна точка на фототоксикологията досега няма познато химическо вещество, за което да е необходима метаболитна трансформация, която да му позволи да действа като фототоксин ин виво или ин витро. Поради това не е нито необходимо, нито научно обосновано, настоящият тест да бъде провеждан с участието на метаболитна активираща система.1.7.1.5. Проучвано химическо вещество/подготовкаПроучваните химически вещества трябва да бъдат приготвени непосредствено преди употреба, освен ако данните за стабилност не показват, че съхранението им е надеждно и приемливо. Изисква се подготовка на веществата под червена светлина тогава, когато е възможна бърза фотодеградация.Проучваните химически вещества следва да бъдат разтворени в буферирани солени разтвори, напр. балансирания солен разтвор на Earl (EBSS) или фосфатен буфер (PBS), които с цел да се избегне интерференция по време на облъчване, трябва да не съдържат белтъчни компоненти, както и абсорбиращи светлина pH индикаторни оцветители.Проучваните химически вещества с ограничена разтворимост във вода следва да бъдат разтваряни в подходящи разтворители в желаната 100-кратно по-ниска крайна концентрация, а след това разредени 1:100 с буфериран солен разтвор. Ако се използва разтворител, той трябва да присъства в постоянна концентрация от 1 %(v/v) във всички култури, т.е. както в отрицателните контроли, така и във всички концентрации на тестваното химическо вещество.Препоръчваните разтворители са диметилсулфоксид (DMSO) и етанол (EtOH). Други разтворители с ниска цитотоксичност(напр. ацетон) са също подходящи, но следва да се преценят специфичните им особености, напр. реакция с проучваното химическо вещество, подтискане на фототоксичния ефект, или свързване на радикали.С цел увеличаване на разтворимостта може, при необходимост, да се използва центрофугиране и/или излагане на слънце и/или затопляне до температура 37 °С.1.7.1.6. UV облъчване (ирадиация)/подготовкаСветлинен източник: изборът на подходящ светлинен източник и подходящо филтриране са най-критичните фактори във фототоксичния тест. UVA и областите на видима светлина се асоциират обикновено с фоточувствителността (7) (10), докато UVB е с по-малка относителна стойност и директно цитотоксичен, увеличавайки своята цитотоксичност 1000 пъти от 313 до 280 nm (11). Критерите за избор на подходящ светлинен източник следва да включват като основно изискване следното: светлинният източник да излъчва дължина на вълната, абсорбирана от химическото вещество; дозата светлина (която може бъде постигната в разумно време) да е достатъчна, за да бъде регистрирана от добре познатите фотосинтезатори. Освен това, използваните дължини на вълната и дози не следва да оказват значителна вреда на експерименталната система, което се изразява в излъчването на топлина (вълни в инфрачервената област).Симулацията на слънчева светлина със слънчеви симулатори се счита за оптимален светлинен източник. В тях се използват ксенонови и живачно-метални (поглъщащи) халогенни волтови дъги. Последните имат предимството да излъчват по-малко топлина и да са по-евтини, но генерираната от тях светлина не отговаря точно на слънчевата. Тъй като всички слънчеви симулатори излъчват значително количество UVB, те следва да имат подходящи филтри, които да подтиснат силно цитотоксичните UVB вълни.При прилагането на теста за фототоксичност ин витро 3T3 NRU следва да се използва излъчващ спектър, несъдържащ USB вълни (в съотношение UVA: UVB = 1:20). Публикуван е пример на разпределението на спектралното излъчване на филтрирания слънчев симулатор, използван в изследването за стандартизация (узаконяване) на фототоксичния ин витро 3T3 NRU тест (3).Дозиметрия: интензитетът на светлина (излъчването) следва да бъде редовно проверяван преди всеки тест за фототоксичност, като се използва подходящ широколентов UV измерител. UV-измерителят следва да бъде калибриран по отношение на източника на светлина. Действието на UV-измерителя следва да се провери, като за целта се препоръчва използването на втори, референтен UV-измерител от същия тип, калибриран по същия начин. Идеален за целта е спектрорадиометър, измерващ през по-големи интервали спектралното излъчване на филтриран светлинен източник и проверяващ калибрацията на широколентовия UV-измерител, но такива инструменти предполагат значителна квалификация на обслужващия ги персонал.В изследването за стандартизация (узаконяване) е определена доза от 5 J/cm2 (UVA), не-цитотоксична за Balb/c 3T3 клетки, и достатъчно способна да възбуди дори слаби фототоксични химически вещества. За да се постигне 5 J/cm2 в период от 50 мин., излъчването следва да бъде настроено на 1,666 mW/cm2. В случай, че се използва друга клетъчна линия или светлинен източник, UVA дозата би могла да се промени, като се използват съществуващите критерии за безвредност за клетките и достатъчност за откриване на стандартни фототоксини. Времето на светлинното облъчване се изчислява по следния начин:+++++ TIFF +++++1.7.2. Условия за тестванеМаксималната концентрация на проучвано химическо вещество не следва да надвишава 100 µg/ml, тъй като всички фототоксични химични вещества се откриват при по-ниски концентрации, докато при по-високи концентрации появата на невярно положителни (свръхпрогнозни) резултати нараства (13). Величината pH на най-високата концентрация на проучваното химическо вещество следва да бъде достатъчно задоволителна (област на рH: 6,5—7,8).Обхвата на концентрации на проучваното химично вещество при наличието (+ UVA) и липсата (- UVA) на светлина следва да бъде точно определена в предшестващи експерименти за неговото установяване. Обхвата и отрязъка на концентрацията в нейната последователност следва да бъдат така добре определени, че кривите на реакция спрямо концентрацията да се подкрепят в достатъчна степен от експерименталните данни. Препоръчва се използването на геометричните серийни концентрации (с постоянно съотношение на разреждане).1.7.3. Процедура на тестване [1]1.7.3.1. Първи денПриготвя се клетъчна суспенсия от 1 × 1055 клетки/ml в клетъчна култура и се разпределя в количества по 100 µl само в периферните гнезда на 96-гнездовата микротитър на плака за тъканни култури (= празни проби). В оставащите гнезда се поставят по 100 µl от клетъчната култура от 1 × 105 клетки/ml (= 1 × 104 клетки/гнездо). За всяко от тестваните химически вещества се подготвят две плаки: една за определяне на цитотоксичност (- UVA), а другата за определяне на фотоцитотоксичността (+ UVA).Клетките се инкубират в продължение на 24 часа (7,5 % CO2, 37 °C), докато се образува полусливащ се монослой. Този инкубационен период позволява на клетките възстановяване и придържане една към друга, както и експоненциален растеж.1.7.3.2. Втори денСлед инкубация клетъчната култура се прехвърля и се промива два пъти с 150 µl EBSS/PBS на гнездо. Добавя се 100 µl от EBSS/PBS в подходяща концентрация на тестваното химическо вещество или разтворителя (отрицателна контрола). Прибавят се 8 различни концентрации на проучваното химическо вещество. Клетките с проучваното химическо вещество се инкубират на тъмно в продължение на 60 минути (7,5 % CO2, 37 °C).За да се изпълни (+ UVA) частта на изследването, клетките се ирадиират на стайна температура в продължение на 50 минути чрез през отвор на похлупак на 96-гнездната плака с 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2). Извършва се вентилация с вентилатор с цел предотвратяване на кондензирането на вода под похлупака. Съхраняват се дублиращите гнезда(- UVA) на стайна температура в тъмна кутия в продължение на 50 минути(= UVA времето за експониране).Проучваният разтвор се прелива и се промива два пъти с 150 µl EBSS/PBS. EBSS/PBS се замества с клетъчна среда и се инкубира (7,5 % CO2, 37 °C) в продължение на една нощ (18—22) часа.1.7.3.3. Трети денМикроскопска оценкаКлетките се изследват под фазово-контрастен микроскоп. Записват се промените в морфологията на клетките, дължащи се на цитотоксични ефекти, предизвикани от проучваното химическо вещество. Тази проверка се препоръчва, за да се избегнат грешките от експеримента, но тези записи не се използват за оценка на цитотоксичността или фототоксичността.Oпит за поглъщане на неутрално червено (NR)Клетките се измиват със 150 µl предварително затоплен EBSS/PBS. Миещият разтвор се отстранява с внимателно почукване. Добавят се 100 µl среда от неутрално червено и се инкубира при 37 °С, във влажна атмосфера от 7,5 % CO2 в продължение на 3 часа.След инкубацията неутрално червеното се отстранява от средата и клетките се измиват със 150 µl EBSS/PBS. Долива се EBSS/PBS и разпръсква изцяло.(Друга възможност: да се центрофугира на обратната плака.)Добавят се точно 150 µl неутрално червено дезорбиран разтвор(прясно приготвени етанол/оцетна киселина).Микротитърната плака се разклаща енергично, поставена върху вибрационен съд за микротитърни плаки в продължение на 10 минути, докато се отдели неутрално червеното от клетките и се образува хомогенен разтвор.Измерва се оптичната плътност на екстракта на неутрално червеното при 540 nm в спектрометър, като се използват празни контроли за референтни стойности. Данните се запазват в подходящ файлов формат (напр. ASCII) за последващи анализи.2. ДАННИ2.1. Качество и количество на даннитеДанните следва да позволят да се направят еднозначен анализ на реакцията към концентрацията, получена при наличието и при липсата на UVA/vis ирадиация. В случай, че се открие цитотоксичност, както областта на концентрацията, така и отрязъците на индивидуалните концентрации следва да бъдат подредени по такъв начин, че да доведат до съвпадение на кривата с експерименталните данни. Имайки пред вид, че проучваното химическо вещество може да не бъде цитотоксично при експеримент на тъмно(- UVA) до определена граница на концентрация от 100 µg/ml, но високо цитотоксично при ирадиация (+ UVA), тестваните области на концентрация и в двете части на експеримента (изпълнявайки изискването за достатъчно качество на данните) могат да се различават значително. Ако не бъде открита цитотоксичност и в двете части на експеримента(- UVA и + UVA), е достатъчно тестване с голяма разлика между единичните дози до най-високата концентрация.За потвърждаването на ясен положителен резултат не се изисква повтаряне на експеримента. Освен това, не е необходимо потвърждаването на точни отрицателни резултати, в случай че проучваното химическо вещество е било тествано при достатъчно високи концентрации. В такива случаи е достатъчен един главен експеримент, подкрепен от един или повече предварителни експерименти за установяване на обхвата.Тестове с гранични резултати, близки до праговата линията на модела на прогнозиране, следва да бъдат повтаряни с цел потвърждаване.В случай че е необходимо повтарящото се тестване, то промяната в условията на експеримента може да се окаже важна за постигане на ясен резултат. Главна променлива в този тест е подготовката на разтвори от проучваните химически вещества. От това следва, че промяната на тези условия (съпътстващ разтворител, пулверизация, акустичност) могат да се окажат най-уместни при повторението на един тест. Като алтернатива може да се вземе предвид промяната във времето на предварителната ирадиационна инкубация. За водно-нестабилни химически вещества може да се окаже подходящо едно по-кратко време.2.2. Третиране на резултатиПри възможност се определя концентрация на проучваното химическо вещество, отразяваща 50 % инхибиране на клетъчния NRU(EC50). Това може да се направи, като се приложи коя да е подходяща нелинейна регресионна процедура (за предпочитане функция на Hill или логистична регресия) към данните за реакция спрямо концентрацията, или като се използват други възможни процедури(14). Тяхното качество следва да бъде внимателно проверено, преди използването на EC50 за по-нататъшни изчисления. Като алтернатива, могат да бъдат използвани графични методи за изчисляване на EC50. В този случай се препоръчва използването на теорията на вероятностите(x-скала: log, y-скала: вярност), като в много случаи функцията-отговор на концентрацията остава почти линейна след тази трансформация.2.3. Оценка на резултатите (модели на прогнозиране)2.3.1. Модел на прогнозиране 1: фактор на фотодразнимост (ФФД)В случай, че едновременно при наличието (+ UVA) и при липсата (- UVA) на светлина се получават завършени криви на реакция спрямо концентрацията, факторът на фотодразнимост (ФФД) се изчислява чрез следната формула:+++++ TIFF +++++При ФФД < 5 липсва фототоксичен потенциал, докато при ФФД ≥ 5 е възможен фототоксичен потенциал.В случай, че химическо вещество е цитотоксично само при + UVA, но не е цитотоксично при –UVA, ФФД не може да бъде изчислен, въпреки че това е резултат, който показва наличие на фототоксичен потенциал. В такива случаи "> ФФД" може да се изчисли, ако (-UV) цитотоксичният тест се извърши до най-високата пробна концентрация (Cmax) и тази стойност се използва за изчисление на "> ФФД";+++++ TIFF +++++В случай, че само "> ФФД" може да бъде получено, то тогава която и да е стойност > 1 предвижда фототоксичен потенциал.В случай, че стойностите на ЕС50(- UV) и EC50(+ UV) не могат да бъдат изчислени поради факта, че химичното вещество не показва признаци на цитотоксичност до най-високата пробна концентрация, това потвърждава липса на фототоксичен потенциал. В такива случаи, формално "ФФД = *1" се използва за характеризиране на резултата;+++++ TIFF +++++Ако може да бъде получено само "ФФД = *1", това предсказва отсъствие на фототоксичен потенциал.В случаите (б) и (в) концентрациите, постигнати в теста за фототоксичност ин витро 3T3 NRU, следва да бъдат внимателно преценени, когато се използват за предсказване на фототоксичния потенциал.2.3.2. Модел на прогнозиране 2: среден фото ефект (СФЕ)Като друга възможност, може да бъде приложена нова версия на модела за прогнозиране на фототоксичния потенциал, която е разработена като са използвани данните на изследването за валидиране на Европейската Асоциация по парфюмерия и козметика (EU/COLIPA) (15) и са тествани в опити на сляпо в следващо проучване върху ин витро фототоксичността на UV филтрирани химически вещества (13). Този модел преодолява ограниченията на ФФД модела в случаи, където ЕС50 не може да бъде получено. Моделът използва "среден фото ефект" (СФЕ), измерване, което се основава на сравнение на цялостните криви на реакция спрямо концентрацията. За прилагане на модела на "среден фото ефект" е разработен специален компютърен софтуер в Хумболтовия университет (Берлин), който може да се получи безплатно.2.4. Интерпретация на резултатиПоложителен резултат в теста за фототоксичност ин витро 3T3 NRU (ФФД ≥ 5 или СФЕ ≥ 0,1) показва, че пробното вещество има фототоксичен потенциал. Ако този резултат е получен при концентрация под 10 µg/ml, проучваното химическо вещество се проявява и като фототоксин при различни експозиционни условия ин виво. В случай, че се получи положителен резултат само при най-високите пробни концентрации от 100 µg/ml, може да се окаже необходимо тези данни да бъдат преценени от гледна точка на случайност или на фототоксичен потенциал. Те могат да включват данни, свързани с проникването, абсорбцията и възможното акумулиране на проучваното химическо вещество в кожата, или тестването му в алтернативен тест за потвърждение, напр. използване на човешки ин витро модел на кожата.Отрицателен резултат от проведен тест за фототоксичност ин витро 3Т3 NRU (ФФД < 5 или СФЕ < 0,1), показва че пробното вещество не е фототоксично за културите от клетки на бозайници при условията на провеждане на теста. В случаите, където проучваните химически вещества са били тествани при най-високата концентрация от 100 µg/ml, отрицателният резултат показва, че те нямат фототоксичен потенциал и фототоксичността ин виво може да се счита малко вероятна. В случаи, където са били получени идентични реакции на токсична концентрация (EC50 + UV и EC50-UV) при по-ниски концентрации, интерпретирането на данните следва да се извърши по същия начин. Обратно, ако не се докаже токсичност(+ UV и - UV), и водноразтворимите концентрации са ограничени до стойности под 100 µg/ml, тогава съвместимостта на пробното вещество със изследването може да се постави под съмнение и следва да се предвиди едно изследване за потвърждение (напр. модел на кожата ин витро, или модел екс виво или тест ин виво).3. ДОКЛАДВАНЕДоклад от тестаДокладът от теста трябва да включва следната информация:Проучвано химическо вещество:- идентифициращи данни и CAS №, ако е известен,- физически свойства и липса на примеси,- физико-химически свойства, свързани с провеждането на изследването,- стабилност и фотостабилност, ако са известни.Разтворител:- обосновка за избора на разтворител,- разтворимост на проучваното химическо вещество в разтворителя,- процентно съдържание на разтворителя в използваните среди (EBSS или PBS).Клетки:- вид и източник на клетките,- отсъствие на микоплазма,- брой на клетъчните пасажи, ако е известен,- UVA чувствителност на клетки, определена с апаратура за облъчване (ирадиационна апаратура), използвана в тест за фототоксичност ин витро 3T3 NRU.Условия за тестване(а) — инкубация преди или след обработването:- вид и състав на клетъчната култура,- условия за инкубация (концентрация на CO2, температура, влажност)- продължителност на инкубацията (предварително обработване, последващо обработване).Условия за тестване(б) — обработване с химически вещества:- обосновка за избора на концентрации на тестваните химически вещества, използвани при наличието и липсата на UV/vis ирадиация,- в случай на ограничена разтворимост на проучваното химическо вещество и липса на цитотоксичност, обосновка за тестване на най-високата концентрация,- вид и състав на използваната среда (буфериран разтвор на соли),- продължителност на химическата обработка.Условия за тестване(в) — облъчване (ирадиация):- обосновка за избор на използвания светлинен източник,- спектрални характеристики на излъчване на светлинния източник,- излъчващи/абсорбционни характеристики на използвания(те) филтър(и),- характеристики на радиометъра и подробно определяне на неговата калибрация,- разстояние на светлинния източник до системата за тестване,- UVA ирадиация при това разстояние, изразена в mW/cm2,- продължителност на UV/vis светлинно облъчване,- UVA доза(ирадиация x време), изразена в J/cm2,- едновременно отчитане на използваната температура при работа с клетъчните култури по време на облъчването(ирадиацията), както и на температурата на средата за клетъчните култури, едновременно с това съхранявани на тъмно.Условия за тестване(г) — NRU тест:- състав на среда на неутрално червено,- продължителност на инкубация на неутрално червено,- условия за инкубация (концентрация на CO2, температура, влажност),- условия за екстракция на неутрално червено (екстрахиращо вещество, продължителност),- дължина на вълната, използвана при спектрометричното отчитане на оптичната плътност на неутрално червено,- втора дължина на вълната (референтна), в случай, че се използва,- съдържание на формуляра за спектрофотометрия, ако се използва.Рeзултати:- клетъчна жизнеспособност, получена при всяка концентрация на проучваното химическо вещество, изразена като процент от средна жизнеспособност на контролите,- криви на реагиране на концентрацията,(тестване на концентрацията на химическото вещество спрямо относителната клетъчна жизнеспособност), получени в резултат на едновременно проведени + UVA и – UVA експерименти,- анализ на данните от кривите на реагиране на концентрацията: ако е възможно: компютърна обработка/изчисление на EC50 (+ UVA) и EC50 (- UVA),- сравнение на две криви на реагиране на концентрацията, получени при наличието и липсата на UVA/vis ирадиация, чрез изчисляване на фактора за фотодразнимост (ФФД), или чрез изчисление на средния фотоефект (СФЕ),- класификация на фототоксичния потенциал,- възприети критерии на тестване (а) — едновременно с отрицателна контрола:- абсолютна жизнеспособност(оптична плътност на екстракта на неутрално червено) на ирадиирани и неирадиирани клетки,- данни за отрицателната контрола от предишни изследвания, средна стойност и стандартно отклонение.- възприети критерии на тестване (б) — едновременен с положителна контрола:- EC50 (+ UVA) и EC50 (- UVA) и ФФД на пoложителната контрола,- данни от предишни изследвания за положителната контрола: EC50 (+ UVA) и EC50 (- UVA), средна стойност и стандартно отклонение.Обсъждане на резултатите.Заключения.4. ПОЗОВАВАНИЯ(1) Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H. G., Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Moldenhauer, F., Moore, L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W. and Willshaw, A. (1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, pp. 793-796.(2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, pp. 7-8.(3) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., Pechovitch, G., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Clothier, R., Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA "In vitro phototoxicity" validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, pp. 305-327.(4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996.(5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology in Vitro 7, pp. 95-102.(6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, pp. XI-XXXV.(7) Spielmann, H., Lovell, W. W., Hölzle, E., Johnson, B. E., Maurer, T., Miranda, M. A., Pape, W. J. W., Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, pp. 314-348.(8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, pp. 79-110.(9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, pp. 119-124.(10) Lambert L. A, Warner W. G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, pp. 515-530.(11) Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, pp. 1825-1829.(12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project "In Vitro Photoirritation".(13) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W. J. W., De Silva, O., Holzhütter, H. G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, pp. 679-708.(14) Holzhütter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, pp. 127-138.(15) Holzhütter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, pp. 445-462."20000425Допълнение+++++ TIFF +++++"[1] Допълнителни данни могат да се намерят в позоваване 12."--------------------------------------------------


title: Директива 2004/42/ЕО на Европейския Парламент и на Съвета от 21 април 2004 година относно намаляването на емисиите от летливи органични съединения, които се дължат на използването на органични разтворители в някои лакове и бои и в продукти за пребоядисване на превозните средства и за изменение на Директива 1999/13/ЕО

text:
               15/ 11

               BG

               Официален вестник на Европейския съюз

               187
            32004L0042
               L 143/87

               ОФИЦИАЛЕН ВЕСТНИК НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ

      ДИРЕКТИВА 2004/42/ЕО НА ЕВРОПЕЙСКИЯ ПАРЛАМЕНТ И НА СЪВЕТА
   от 21 април 2004 годинаотносно намаляването на емисиите от летливи органични съединения, които се дължат на използването на органични разтворители в някои лакове и бои и в продукти за пребоядисване на превозните средства и за изменение на Директива 1999/13/ЕОЕВРОПЕЙСКИЯТ ПАРЛАМЕНТ И СЪВЕТЪТ НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ,като взеха предвид Договора за създаване на Европейската общност, и по-специално член 95 от него,като взеха предвид предложение на Комисията,като взеха предвид становището на Европейския икономически и социален комитет (1),в съответствие с процедурата, предвидена в член 251 от Договора (2),като имат предвид, че:
               (1)

               Директива 2001/81/ЕО на Европейския парламент и на Съвета от 23 октомври 2001 г. относно националните пределно допустими стойности за емисии на някои атмосферни замърсители (3) установява също така национални тавани за емисии на някои замърсители, включително летливите органични съединения (посочени по-нататък като „ЛОС“), които да бъдат достигнати до 2010 г., като част от интегрираната стратегия на Общността за борба срещу подкиселяване на почвите и образуването на озон на нивото на почвата, но тази директива не включва пределни стойности за емисиите на тези замърсители от специфични източници.

               (2)

               С цел да се съобрази с националния таван на ЛОС, държавите-членки трябва да имат за цел определен брой различни категории източници на тези емисии.

               (3)

               Настоящата директива допълва мерките, взети на национално ниво, с цел да гарантира съответствието с тавана за емисиите на ЛОС.

               (4)

               Поради липсата на разпоредби на Общността, законодателствата на държавите-членки, в които се определят пределни стойности на летливите органични съединения в някои категории продукти, могат да се различават. Тези различия, както и липсата на законодателство в тази област в някои държави-членки биха били вероятна причина за създаване на ненужни пречки пред търговския обмен и за нарушаване на конкуренцията в рамките на вътрешния пазар.

               (5)

               Следователно е необходимо да бъдат хармонизирани националните законодателства и разпоредбите за борба с образуването на озон на нивото на почвата, които определят пределните стойности на ЛОС, присъстващи в продуктите, обхванати от настоящата директива, така че да се гарантира, че тези стойности не ограничават свободното движение на тези продукти.

               (6)

               Като се има предвид, че целта на предвидените действия, а по-специално намаляването на емисиите на ЛОС, не може да бъде реализирана по задоволителен начин от държавите-членки, тъй като емисиите на ЛОС в определена държава-членка вредят на качеството на въздуха в друга държава-членка и че тя може, като се имат предвид обемът и последиците от предвидените действия, да бъде осъществена по по-добър начин на общностно ниво, то Общността може да предприеме мерки в съответствие с принципа на субсидиарност, както е установено в член 5 от Договора. В съответствие с принципа на пропорционалност, така както е установен в посочения член, настоящата директива се ограничава само с необходимото за постигането на тази цел.

               (7)

               Съдържанието на ЛОС в боите, лаковете и продуктите за пребоядисване на превозните средства увеличава значителните емисии на ЛОС във въздуха, което допринася за образуването на място и отвъд границите на страната на фотохимически оксиданти в граничния слой на тропосферата.

               (8)

               Следователно съдържанието на ЛОС в някои лакове и бои, както и в някои от продуктите за пребоядисване на превозните средства следва да бъде намалено, още повече предвид факта, че това е възможно да се осъществи от техническа и икономическа гледна точка, отчитайки климатичните условия.

               (9)

               Високото ниво на опазване на околната среда изисква фиксирането и спазването на граничните стойности на съдържанието за ЛОС, използвани в продуктите, предмет на настоящата директива.

               (10)

               Следва да бъдат изготвени разпоредби за преходни мерки за продуктите, произведени преди влизането в сила на изискванията на настоящата директива.

               (11)

               Държавите-членки следва да бъдат в състояние да издават индивидуални лицензии за продажбата и покупката за специални цели на продукти в строго ограничени количества, които не отговарят на установените от настоящата директива пределно допустими стойности на разтворителите.

               (12)

               Настоящата директива допълва разпоредбите на Общността относно етикетирането на химическите вещества и препарати.

               (13)

               Опазването на здравето на потребителите и/или на работниците и опазването на работната среда следва да не попадат в приложното поле на настоящата директива и следователно мерките, взети от държавите-членки с тази цел, следва да не бъдат засегнати от настоящата директива.

               (14)

               Необходим е мониторинг на пределните стойности на съдържанието с цел да се определи дали тегловните концентрации на ЛОС, открити във всяка от категориите бои, лакове и продукти за пребоядисване на превозните средства, които са засегнати в настоящата директива, са в рамките на допустимите пределни стойности.

               (15)

               Тъй като съдържанието на ЛОС в продуктите, използвани за някои дейности по пребоядисване на превозните средства, се определя оттук нататък от настоящата директива, Директива 1999/13/ЕО на Съвета от 11 март 1999 г. за ограничаване на емисиите на летливи органични съединения, дължащи се на употребата на органични разтворители в определени дейности и инсталации (4) следва да бъде изменена.

               (16)

               Въпреки това държавите-членки следва да имат възможност да поддържат или въвеждат национални мерки за контрола на емисиите, предизвикани от някои дейности по пребоядисване на превозните средства, които се състоят в операции по нанасяне на първоначално покритие на пътно превозно средство, както е определено в Директива 70/156/ЕИО на Съвета от 6 февруари 1970 г. относно сближаването на законодателствата на държавите-членки по отношение на типовото одобрение на моторни превозни средства и техните ремаркета (5), или част от тях, проведени като част от извършения ремонт, консервация или декорация на превозното средство извън производствените инсталации.

               (17)

               Настоящата директива следва да не се прилага за продуктите, продавани, за да бъдат използвани предимно в инсталациите, които имат разрешение за експлоатация съгласно Директива 1999/13/ЕО, в които мерките за ограничаване на емисиите позволяват посредством други средства да се постигне най-малко еквивалентно намаляване на емисиите на ЛОС.

               (18)

               Държите-членки следва да установят правилата за санкциите, които се прилагат в случай на нарушаване на разпоредбите на настоящата директива, и да гарантират, че те са прилагани. Тези санкции следва да бъдат ефективни, адекватни и възпиращи.

               (19)

               Държавите-членки следва да предоставят доклад на Комисията относно опита, придобит в рамките на прилагането на настоящата директива.

               (20)

               Следва да бъдат преразгледани както обхватът на намаляване на съдържанието на ЛОС на продуктите извън обхвата на настоящата директива, така и възможността за по-нататъшното намаляване на вече предвидените пределни стойности на емисиите на ЛОС.

               (21)

               Мерките, необходими за изпълнението на настоящата директива, следва да бъдат приети в съответствие с Решение 1999/468/ЕО на Съвета от 28 юни 1999 г. относно установяването на процедурите за упражняване на изпълнителните правомощия, предоставени на Комисията (6),
            ПРИЕХА НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:Член 1Цел и обхват1.   Целта на настоящата директива е да ограничи общото съдържание на летливи органични съединения (ЛОС) в някои лакове, бои и продукти за пребоядисване на превозните средства с цел да предотврати или намали замърсяването на въздуха, което се дължи на влиянието на ЛОС върху образуването на тропосферния озон.2.   За да постигне целта, установена в параграф 1, настоящата директива сближава техническите спецификации, които се прилагат за някои лакове, бои и продукти за пребоядисване на превозните средства.3.   Настоящата директива се прилага за продуктите, установени в приложение I.4.   Настоящата директива не накърнява, нито засяга мерките, включително на изискванията относно етикетирането, които са взети на общностно ниво или на национално ниво за опазване на здравето на потребителите и работниците и тяхната работна среда.Член 2ОпределенияПо смисъла на настоящата директива се прилагат следните определения:

         1.
         „Компетентен орган“ означава органа(ите) или властта или властите или органите, отговорни по силата на законодателството на държавите-членки за изпълнението на задълженията, произтичащи от настоящата директива.

         2.
         „Вещество“ означава всеки химичен елемент и неговите съединения, така както те съществуват в естествено състояние или така както са произведени от промишлеността, независимо дали са в твърдо, течно или газообразно състояние.

         3.
         „Препарат“ означава смес или разтвор, който се състои от две или повече вещества.

         4.
         „Органично съединение“ означава всяко съединение, което се състои най-малко от елемента въглерод и един или няколко от следните елементи: водород, кислород, сяра, фосфор, силиций, азот, или даден халоген, с изключение на въглеродните оксиди и неорганичните карбонати и бикарбонати.

         5.
         „Летливо органично съединение (ЛОС)“ означава всяко органично съединение, чиято начална точка на кипене, измерена при стандартно налягане от 101,3 kPa, е по-ниска или равна на 250 °C.

         6.
         „Съдържание на ЛОС“ означава масата на летливите органични съединения, изразена в грамове на литър (g/l) в описанието на състава на продукта, в състояние, готово за употреба. Масата на летливите органични съединения в даден продукт, които са подложени на химична реакция при изсушаването, за да образуват повърхностното покритие, не се счита като част от съдържанието на ЛОС.

         7.
         „Органичен разтворител“ означава всяко летливо органично съединение, което се използва самостоятелно или заедно с други реактиви за разтваряне или разреждане на суровини, продукти или отпадъчни материали, или използвано като почистващо вещество за разтваряне на замърсители или като дисперсионна среда, или като коректор на вискозитет или коректор на повърхностно напрежение, пластификатор или консервант.

         8.
         „Покритие“ означава всеки препарат, включително всички органични разтворители или препарати, съдържащи органични разтворители, необходими за правилното им приложение, който се използва за получаване на филм с декоративно, предпазващо или всеки друг вид функционално въздействие върху дадена повърхност.

         9.
         „Филм“ означава непрекъснат слой, който е резултат от едно или няколко прилагания на продукт върху дадена основа.

         10.
         „Водноразтворими покрития (ВРП)“ означава покритията, чийто вискозитет се коригира чрез използването на вода.

         11.
         „Разтваряни с разтворител покрития (РРП)“ означава покрития, чийто вискозитет се коригира чрез използване на органичен разтворител.

         12.
         „Пускане на пазара“ означава определен продукт да стане достъпен за трети страни чрез размяна или срещу заплащане, или без. Всеки внос на митническата територия на Общността се счита за пускане на пазара по смисъла на настоящата директива.Член 3Изисквания1.   Държава-членка гарантира, че продуктите, определени в приложение I, са пускани на пазара в рамките на нейната територия, считано от датите, установени в приложение II, единствено ако тяхното съдържание на ЛОС не надвишава пределните стойности, установени в приложение II, и ако те съответстват на член 4.За определяне на съответствието с пределните стойности на съдържанието на ЛОС, установени в приложение II, се използват аналитичните методи, посочени в приложение III.За продуктите, установени в приложение I, към които трябва да бъдат добавени разтворители или други компоненти, които съдържат разтворители, за да може продуктът да бъде готов за употреба, се прилагат пределните стойности относно съдържанието на ЛОС в готовия за употреба продукт, установени в приложение II.2.   Чрез дерогация от параграф 1 държавите-членки освобождават от спазването на горепосочените изисквания продуктите, които се продават, за да бъдат използвани изключително в рамките на дейността, посочена в Директива 1999/13/ЕО, и извършвани в инсталация, която е била регистрирана или е получила разрешение съгласно членове 3 и 4 от посочената директива.3.   За целите на възстановяването и поддръжката на стари сгради и коли стар модел, за които компетентните органи смятат, че имат особена историческа и културна стойност, държавите-членки могат да предоставят индивидуални лицензии за продажбата и покупката на строго ограничени количества на продукти, които не отговарят на установените в приложение II пределни стойности относно съдържанието на ЛОС.4.   Продуктите, които попадат в обхвата на настоящата директива, за които е доказано, че са произведени преди датите, установени в приложение II, и които не отговарят на изискванията на параграф 1, могат да бъдат пускани на пазара за период от 12 месеца след датата на влизане в сила на изискването, което се отнася до съответния продукт.Член 4ЕтикетиранеДържавите-членки гарантират, че продуктите, посочени в приложение I, имат етикет по време на пускането им на пазара. Етикетът указва:
               а)

               подкатегорията на продукта и съответните пределни стойности на съдържанието на ЛОС, изразени в g/l, както е посочено в приложение II;

               б)

               максималното съдържание на ЛОС в готовия за употреба продукт, изразено в g/l.
            Член 5Компетентен органДържавите-членки определят компетентен орган, отговорен за изпълняването на задълженията, установени в настоящата директива, и информират Комисията за това най-късно до 30 април 2005 г.Член 6МониторингДържавите-членки разработват програма за мониторинг за целите на проверяване спазването на настоящата директива.Член 7ДокладванеДържавите-членки докладват резултатите от програмата за мониторинг, за да демонстрират спазването на директивата, както и на категориите и на количествата от продуктите, за които е издадена лицензия съгласно член 3, параграф 3. Първите два доклада се предоставят на Комисията 18 месеца след датите, определени за изпълнение на изискванията относно максималното съдържание на ЛОС, установени в приложение II; след това доклад се предоставя на всеки пет години. Комисията изготвя предварително общ формат за предоставяне на данните от мониторинга в съответствие с процедурата, предвидена в член 12, параграф 2. Годишните данни се предоставят на разположение на Комисията при поискване.Член 8Свободно движениеДържавите-членки нямат право по предвидените в настоящата директива причини да забраняват, ограничават или пречат на пускането на пазара на продукти, които попадат в обхвата на настоящата директива и които, когато са готови за употреба, отговарят на изискванията на настоящата директива.Член 9ПреразглежданеКомисията е поканена да представи на Европейския парламент и на Съвета:
               1.

               най-късно до 2008 г. доклад относно резултатите от преразглеждането, посочено в член 10 от Директива 2001/81/ЕО. Този доклад разглежда:

                           а)

                           широкия обхват и потенциал от възможности за намаляването на съдържанието на ЛОС в продуктите, които попадат извън обхвата на настоящата директива, включително аерозолите за лакове и бои;

                           б)

                           възможното включване на нов етап на намаляване съдържанието на ЛОС (етап II) относно продуктите за пребоядисване на превозните средства;

                           в)

                           всеки нов елемент, който има връзка със социално-икономическите последици от прилагането на етап II, както е предвидено за лакове и бои.

               2.

               Най-късно 30 месеца след датата за изпълнение на пределни стойности на съдържанието на ЛОС от етап II от приложение II се представя доклад, в който се вземат предвид по-специално докладите, посочени в член 7, и всеки технологичен напредък в областта на производството на бои, лакове и продукти за пребоядисване на превозните средства. Този доклад разглежда широкия обхват от възможности за допълнително намаляване на съдържанието на ЛОС в продуктите, които попадат в обхвата на настоящата директива, включително възможното разграничаване между боите, използвани за вътрешно покритие и за външно покритие от подкатегории г) и д), посочени в точка 1.1 от приложение I и в раздел A от приложение II.
            Ако е уместно, тези доклади се придружават от предложения за изменения на настоящата директива.Член 10СанкцииДържите-членки определят правилата за налагане на санкции, които да се прилагат в случай на нарушаване на националните разпоредби, приети съгласно настоящата директива, и вземат необходимите мерки за гарантиране на тяхното прилагане. Предвидените санкции трябва да бъдат ефективни, адекватни и възпиращи. Държавите-членки нотифицират Комисията относно тези правила и мерки най-късно до 30 октомври 2005 г. и я нотифицират незабавно за всяко последващо изменение, което ги засяга.Член 11Адаптиране към техническия напредъкВсички изменения, необходими за адаптирането на приложение III към техническия напредък, се приемат от Комисията в съответствие с процедурата, предвидена в член 12, параграф 2.Член 12Комитет1.   Комисията се подпомага от комитета, учреден по силата на член 13 от Директива 1999/13/ЕО на Съвета (по-нататък наречен „Комитета“).2.   Когато се прави позоваване на настоящия параграф, се прилагат членове 5 и 7 от Решение 1999/468/ЕО, като се имат предвид разпоредбите на член 8 от него.Периодът, установен в член 5, параграф 6 от Решение 1999/468/ЕО, е определен на три месеца.3.   Комитетът приема свой процедурен правилник.Член 13Изменение на Директива 1999/13/ЕО1.   С настоящото Директива 1999/13/ЕО се изменя, както следва:В приложение I, в раздела „Пребоядисване на превозните средства“ се заличава следното тире:
               „—

               пребоядисване на пътни превозни средства, както е определено в Директива 70/156/ЕИО, или на част от такова превозно средство, което се извършва извън производствените инсталации в случай на ремонт, консервация или декорация на превозното средство; или“.
            2.   Независимо от разпоредбите на параграф 1, държавите-членки могат да поддържат или въвеждат национални мерки за контрола на емисиите, предизвикани от някои дейности по пребоядисване на превозните средства, които са изключени от обхвата на Директива 1999/13/ЕО.Член 14Транспониране1.   Държавите-членки въвеждат в сила законови, подзаконови и административни разпоредби, необходими, за да се съобразят с настоящата директива, преди 30 октомври 2005 г. Те незабавно информират Комисията за това.Когато държавите-членки приемат тези разпоредби, в тях се съдържа позоваване на настоящата директива или то се извършва при официалното им публикуване. Условията и редът на позоваване се определят от държавите-членки.2.   Държавите-членки съобщават на Комисията текста на разпоредбите от националното си законодателство в областта, уредена от настоящата директива, както и таблица на съответствието между разпоредбите на настоящата директива и приетите национални разпоредби.Член 15Влизане в сила на директиватаНастоящата директива влиза в сила в деня на публикуването ѝ в Официален вестник на Европейския съюз.
   Член 16АдресатиАдресати на настоящата директива са държавите-членки.
      Съставено в Страсбург на 21 април 2004 година.

            За Европейския парламент

            Председател

         P. COX

            За Съвета

            Председател

         D. ROCHE

      (1)  ОВ C 220, 16.9.2003 г., стр. 43.
      (2)  Становище на Европейския парламент от 25 септември 2003 г. (все още непубликувано в Официален вестник), Обща позиция на Съвета от 7 януари 2004 г. (ОВ С 79 Е, 30.3.2004 г., стр. 1) и Становище на Европейския парламент от 30 март 2004 г. (все още непубликувано в Официален вестник).
      (3)  ОВ L 309, 27.11.2001 г., стр. 22.
      (4)  ОВ L 85, 29.3.1999 г., стр. 1. Директива, изменена с Регламент (ЕО) № 1882/2003 на Европейския парламент и на Съвета (ОВ L 284, 31.10.2003 г., стр. 1).
      (5)  ОВ L 42, 23.2.1970 г., стр. 1. Директива, последно изменена с Директива 2004/3/EО на Европейския парламент и на Съвета (ОВ L 49, 19.2.2004 г., стр. 36).
      (6)  ОВ L 184, 17.7.1999 г., стр. 23.ПРИЛОЖЕНИЕ IОБХВАТПо смисъла на настоящата директива бои и лакове с изключение на аерозолите означават продукти, които са изброени в подкатегориите, изброени по-долу. Става дума за покрития, нанасяни върху сградите, дървената им дограма и части и елементи и подобните им структури, за декоративна, функционална и защитна цел.1.1.   Подкатегории

         а)
         „матови покрития за вътрешни стени и тавани“ означава покрития, предназначени да бъдат полагани на вътрешни стени и тавани, които имат коефициент на отражение ≤ 25@60°;

         б)
         „гланцови покрития за вътрешни стени и тавани“ означава покрития, предназначени да бъдат полагани на вътрешни стени и тавани, които имат коефициент на отражение > 25@60°;

         в)
         „покрития за външни стени на минерални основи“ означава покрития, предназначени да бъдат полагани на външни стени от зидария, от тухли или стуко;

         г)
         „вътрешни/външни бояджийски покрития за довършителни работи и облицовъчни плоскости от дърво, метал или пластмаса“ означава покрития, предназначени да бъдат полагани на детайли от дограма и на облицовки с цел получаването на матов филм. Тези покрития са предназначени да бъдат полагани върху дърво, метал или пластмаса. Тази подкатегория включва подслоевете и междинните покрития;

         д)
         „лакове и лазурни покрития с вътрешна/външна употреба за довършителни работи“ означава покрития, предназначени да бъдат полагани на детайли от дограма за получаването на прозрачен или полупрозрачен филм с декоративна цел или за консервация на дърво, метал или пластмаса. Тази подкатегория включва матовите лазурни лакове. Матовите лазурни лакове означават покрития, които образуват матов филм с декоративна цел или за целите на предпазване на дървото от атмосферните влияния, както е определено в стандарт EN 927-1, в рамките на категорията на полустабилни;

         е)
         „минимално образуване на филм лазурни лакове“ означава лазурни лакове, които в съответствие със стандарт EN 927-1:1996 образуват филм със средна дебелина под 5 µm, когато е тестван според метод 5 A съгласно ISO стандарт 2808:1997;

         ж)
         „грундиращи покрития“ означава покрития с втвърдяваща и/или изолираща функция, предназначени да бъдат използвани върху дърво или върху стени и тавани;

         з)
         „фиксиращи грундиращи покрития“ означава покрития, предназначени да стабилизират свободните частици от основата или да придават водоизолиращи свойства и/или да предпазват дървото от потъмняване;

         и)
         „еднокомпонентни покрития със специална функция“ означава специални покрития на основата на филмообразуващ материал. Те са предназначени за изпълняване на приложения, които изискват специално изпълнение, например като първичен слой или като завършващ слой при пластмасите, първичен слой при металните основи или реактивните метали, като цинка или алуминия, при довършителни антикорозионни операции, подови покрития, включително такива от дърво или цимент, покрития против графити, незапалителни покрития или покрития, отговарящи на хигиенните стандарти в хранително-вкусовата промишленост или в здравните услуги;

         й)
         „двукомпонентни покрития със специално предназначение“ означава покрития със същата употреба като еднокомпонентните покрития със специална функция, но с втори компонент (например третични амини), който се добавя преди употребата им;

         к)
         „многоцветни покрития“ означава покрития, които са предназначени за получаването директно, още от първото полагане, на двуцветен или многоцветен ефект;

         л)
         „покрития с декоративен ефект“ означава покрития, които са предназначени за получаване на специални естетически ефекти върху предварително боядисани специално подготвени основи или върху основен слой и обработвани след това с различни инструменти по време на етапа на изсъхване.По смисъла на настоящата директива „продукти за пребоядисване на превозните средства“ означава продуктите, които са изброени в определените по-долу подкатегории. Те са използвани за операции по пребоядисване на превозно средство, както е определено в Директива 70/156/ЕИО, или на част от такова превозно средство, което се извършва извън производствените инсталации като част от поправка на превозното средство, при ремонт, консервация или декорация на превозното средство.2.1.   Подкатегории

         а)
         „подготвителни и почистващи продукти“ означава продуктите, предназначени за отстраняване чрез механично или химическо действие на старите покрития и ръждата или позволяващи нанасянето на новите покрития:i)подготвителните продукти включват почистващите вещества за бояджийски пистолети (продукт, който е предназначен да почиства пулверизаторните пистолети и останалото оборудване); препаратите за сваляне на бояджийски покрития, обезмаслителите (включително от антистатичен вид за пластмаси) и продуктите за отстраняване на силикон;ii)предпочистващ продукт означава продукт, предназначен за отстраняване на замърсителите от повърхността, която ще се боядисва, по време на подготовката и преди прилагането на китовете;

         б)
         „кит за запушване на пори и за обработка на каросерии/продукти за запълване на отвори в каросерии“ означава гъсти съставки, предназначени да бъдат пулверизирани или прилагани за запушване на дълбоки неравности на обработваната повърхност преди прилагането на слоевете от бои;

         в)
         „първоначално покритие“ означава всяко покритие, предназначено да бъде прилагано върху метал или върху съществуващи стари окончателни слоеве за осигуряване на предпазване от корозия преди прилагането на първи слой кит:i)покритие за оформяне на повърхностния слой означава всяко покритие, предназначено да бъде полагано непосредствено преди окончателния слой, за да гарантира защита от корозията и прилепването на окончателния слой на повърхностното покритие; той позволява също така получаването на гладка повърхност, като запълва малките неравности по нея;ii)общи първоначални покрития за метал означава покритията, предназначени да бъдат полагани като първоначален слой, като например вещества за улесняване на прилепването, продукти за осигуряване на водонепромокаемост, китове за оформяне на повърхностния слой, подслоеве, първични покрития за пластмаси, китове и маджуни, полагани върху влажни основи, които не могат да се обработват с абразиви, и китове и маджуни, които се нанасят чрез пулверизация;iii)първоначални реактивни бояджийски покрития означава покритията, съдържащи най-малко 0,5 тегловни % фосфорна киселина, предназначени да бъдат полагани директно върху метални основи за осигуряване на предпазване от корозия и добро прилепване; покритията, използвани като първични слоеве, върху които могат да се правят заварки; и разтворите на безири и байцове за повърхности от галванизиран метал и цинк;

         г)
         „окончателен слой“ означава всяко пигментирано покритие, предназначено да бъде полагано или като един-единствен слой, или като няколко слоя, за придаване на желаната степен на блясък и трайност. Включва всички продукти от този вид, като например основните слоеве и лаковете:i)основен слой означава пигментирано покритие, предназначено да придава желания цвят и всякакъв желан оптичен ефект, но не и блясъка, нито повърхностната устойчивост на системата за покритие;ii)безцветно покритие означава прозрачно покритие, предназначено да придава окончателен блясък и устойчивост на системата за покритие;

         д)
         „специални окончателни покрития“ означава покрития, предназначени да бъдат полагани като окончателен слой, който придава специални свойства, като например металически или перлен ефект с един-единствен слой, като висококачествено едноцветно или прозрачно гланцово покритие (например лак против надраскване или с флуоресцентен ефект), основен отразяващ светлината слой, окончателен слой с текстурни ефекти (например като от удари с чукче), покритие против приплъзване, водонепроницаемо покритие за долните части на каросериите, покритие, издържащо на удари, вътрешни окончателни покрития; и аерозоли.ПРИЛОЖЕНИЕ IIА.   МАКСИМАЛНО СЪДЪРЖАНИЕ НА ЛЕТЛИВИ ОРГАНИЧНИ СЪЕДИНЕНИЯ (ЛОС) В НЯКОИ ЛАКОВЕ И БОИ

               Подкатегория продукти

               Тип

               Етап I (g/l) (1)

               (от 1.1.2007 г.)

               Етап II (g/l) (1)

               (от 1.1.2010 г.)

               a

               Матови покрития за вътрешни стени и тавани (коефициент на отражение < 25@60°)

               ВР (водноразтворими)

               75

               30

               РР (разтваряни с разтворител)

               400

               30

               б

               Гланцови покрития за вътрешни стени и тавани (коефициент на отражение > 25@60°)

               ВР

               150

               100

               РР

               400

               100

               в

               Покрития за външни стени на минерална основа

               ВР

               75

               40

               РР

               450

               430

               г

               Вътрешни/външни бояджийски покрития за довършителни работи и облицовъчни плоскости от дърво, метал или пластмаса

               ВР

               150

               130

               РР

               400

               300

               д

               Лакове и лазурни покрития с вътрешна/външна употреба за довършителни работи, включително непрозрачни лазурни лакове

               ВР

               150

               130

               РР

               500

               400

               е

               Необразуващи филм лазурни лакове за вътрешна и външна употреба

               ВР

               150

               130

               РР

               700

               700

               ж

               Грундиращи покрития

               ВР

               50

               30

               РР

               450

               350

               з

               Фиксиращи грундиращи покрития

               ВР

               50

               30

               РР

               750

               750

               и

               Еднокомпонентни покрития със специално предназначение

               ВР

               140

               140

               РР

               600

               500

               й

               Двукомпонентни покрития със специално предназначение за специфична крайна употреба, например върху подови настилки

               ВР

               140

               140

               РР

               550

               500

               к

               Многоцветни покрития

               ВР

               150

               100

               РР

               400

               100

               л

               Покрития с декоративен ефект

               ВР

               300

               200

               РР

               500

               200

      Б.   МАКСИМАЛНО СЪДЪРЖАНИЕ НА ЛЕТЛИВИ ОРГАНИЧНИ СЪЕДИНЕНИЯ (ЛОС) В ПРОДУКТИТЕ ЗА ПРЕБОЯДИСВАНЕ НА ПРЕВОЗНИТЕ СРЕДСТВА

               Подкатегория продукти

               Покрития

               ЛОС g/l (2)

               (1.1.2007 г.)

               a

               Подготвителни и почистващи продукти

               Подготвителен продукт

               850

               Предпочистващ продукт

               200

               б

               Кит за запушване на пори и за обработка на каросерии/продукти за запълване на отвори в каросерии

               Всички видове

               250

               в

               Първоначално покритие

               Различни видове продукти за оформяне на повърхностния слой/китове за запушване на пори и първични покрития (за метали)

               540

               Първични реактивни бояджийски покрития

               780

               г

               Окончателен слой

               Всички видове

               420

               д

               Специални окончателни покрития

               Всички видове

               840

      (1)  g/l от готовия за употреба продукт.
      (2)  g/l от готовия за употреба продукт. С изключение на подкатегория a), следва да се приспадне процентът вода, съдържаща се в готовия за употреба продукт.ПРИЛОЖЕНИЕ IIIМЕТОДИ, ПРЕДВИДЕНИ В ЧЛЕН 3, ПАРАГРАФ 1
               Параметър

               Мерна единица

               Тест

               метод

               дата на публикуване

               Съдържание на ЛОС

               g/l

               ISO 11890-2

               2002 г.

               Съдържание на ЛОС при наличие на реактивни разредители

               g/l

               ASTMD 2369

               2003 г.