ObjectiveThe aim of this study was to optimize the synthesis of the plasmin and urokinase (uPA) inhibitor benzylsulfonyl-D-Ser-homoPhe-(4-amidino-benzylamide) (BSFAB), to characterize its activity and mechanism of action and to assess its use to improve stratum corneum (SC) barrier function. MethodsPeptide coupling methods were used to synthesize BSFAB, and high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) together with H-1- and C-13-nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) were applied to clarify its structure and determine its purity. Its binding mode was determined by docking studies to the catalytic domains of plasmin and uPA. Inhibition constants (K-i) were determined by enzyme kinetic studies, and the effect of BSFAB on plasmin, uPA and transglutaminase 1 expression was evaluated in non-cytokine and cytokine-stimulated keratinocytes. A vehicle-controlled clinical study on SC barrier function was conducted on facial skin of subjects with self-perceived sensitive skin. ResultsBSFAB was synthesized with high purity (97.3%). In silico studies indicated that the amidine moiety of BSFAB was anchored in the S1 pocket of both enzymes by binding to Asp189, Ser190 and Gly219, whereas the backbone of the D-Ser residue makes an anti-parallel -sheet interaction with Gly216. BSFAB was shown to be an effective inhibitor of plasmin and uPA with K-i values of 29 and 25 nM, respectively. BSFAB also inhibited keratinocyte-secreted protease activities in basal (plasmin inhibition 37.7%, P < 0.05 and uPA inhibition 96.6%, P < 0.01) and cytokine-induced conditions (plasmin inhibition 41.1%, P < 0.05 and uPA inhibition 97.0%, P < 0.001) and stimulated the gene expression of transglutaminase 1 in cytokine-stimulated keratinocytes (approximately 4.5 times increased expression, P < 0.01). Clinically, BSFAB was shown to improve SC barrier integrity (P < 0.02 on day 29) and subjective improvements in the perception of healthy skin (P < 0.05 on day 28). ConclusionBSFAB binds as a reversible competitive inhibitor to the active sites of plasmin and uPA. Additionally, BSFAB positively improved keratinocyte differentiation gene expression (transglutaminase 1). These effects were translated into improvements in SC barrier integrity clinically in subjects with dry and sensitive skin and improved their perception of having a healthy skin condition. Resume ObjectifLe but de cette etude etait d'optimiser la synthese de l'inhibiteur de plasmine et de l'urokinase (uPA) benzylsulfonyl-D-Ser-homoPhe- (4-amidino-benzylamide) (BSFAB), pour caracteriser son activite et le mecanisme d'action et d'evaluer son utilisation pour ameliorer la fonction de barriere du stratum corneum (SC). MethodesLes methodes de couplage peptidique ont ete utilisees pour synthetiser BSFAB et la chromatographie liquide a haute performance-spectrometrie de masse (CLHP-SM) avec spectroscopie de resonance magnetique nucleaire 1H et 13C (RMN), qui servent a clarifier sa structure et determiner sa purete ont ete employees. Son mode de liaison a ete determine par l'etude d'amarrage aux domaines catalytiques de plasmine et d'uPA. Les constantes d'inhibition (Ki) ont ete determinees par des etudes de cinetique enzymatique et l'effet de BSFAB sur la plasmine, l'uPA et l'expression de la transglutaminase 1 a ete determine chez les keratinocytes stimules par les cytokines ou non. Une etude clinique controlee contre placebo sur la fonction barriere du SC a ete realisee sur la peau du visage des sujets a peau sensible auto-percue. ResultatsLe BSFAB a ete synthetise avec une purete elevee (97.3%). Les etudes in silico ont indique que le groupement amidine de BSFAB a ete ancre dans la poche S1 de deux enzymes par liaison a Asp189, Ser190 et Gly219, alors que le squelette du residu D-Ser fait un -feuillet d'interaction avec Gly216 antiparallele. BSFAB s'est montre etre un inhibiteur efficace de la plasmine et de l'uPA avec des valeurs de K-i de 29 et 25 nM respectivement. BSFAB a egalement inhibe les activites des proteases keratinocytaires secretees dans les conditions de base (plasmine, l'inhibition de 37,7%, P < 0.05 et uPA inhibition de 96.6%, P < 0.01) et des conditions induites par la cytokine (plasmine inhibition de 41,1%, P < 0.05 et uPA inhibition de 97.0%, P < 0.001) et a stimule l'expression du gene de la transglutaminase 1 dans les keratinocytes stimules par des cytokines (une expression accrue d'environ 4,5 fois, P < 0.01). Cliniquement BSFAB a ete permis d' ameliorer l'integrite de la barriere SC (P < 0.02 le jour 29) et apporter des ameliorations subjectives dans la perception de la peau saine (P < 0.05 au jour 28). ConclusionBSFAB se lie comme un inhibiteur competitif reversible aux sites actifs de la plasmine et de l'uPA. En outre, BSFAB ameliore positivement l'expression du gene de la differenciation des keratinocytes (transglutaminase 1). Ces effets ont ete traduits en ameliorations dans l'integrite de la barriere SC cliniquement chez les sujets ayant une peau seche et sensible et ont ameliore leur perception d'avoir une condition de la peau saine.