b'\n_START_ARTICLE_\nWestern blot\n_START_PARAGRAPH_\nEl Western blot, inmunoblot o  electrotransferencia, es una t\xc3\xa9cnica anal\xc3\xadtica usada en biolog\xc3\xada celular y molecular para identificar prote\xc3\xadnas espec\xc3\xadficas en una mezcla compleja de prote\xc3\xadnas, tal como la que se presenta en extractos celulares o de tejidos. La t\xc3\xa9cnica utiliza tres etapas para lograr esto: separaci\xc3\xb3n por tama\xc3\xb1o, transferencia a un soporte s\xc3\xb3lido y, finalmente, visualizaci\xc3\xb3n mediante la marcaci\xc3\xb3n de prote\xc3\xadnas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Esta t\xc3\xa9cnica es hoy en d\xc3\xada imprescindible en varios campos de la biolog\xc3\xada, como la biolog\xc3\xada molecular, la bioqu\xc3\xadmica, la biotecnolog\xc3\xada o la inmunolog\xc3\xada._NEWLINE_Mediante una electroforesis en gel se separan las prote\xc3\xadnas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (t\xc3\xadpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la prote\xc3\xadna de inter\xc3\xa9s con anticuerpos espec\xc3\xadficos contra ella. Finalmente, se detecta la uni\xc3\xb3n ant\xc3\xadgeno-anticuerpo por actividad enzim\xc3\xa1tica o fluorescencia, entre otros m\xc3\xa9todos. De esta misma forma se puede estudiar la presencia de la prote\xc3\xadna en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a las otras prote\xc3\xadnas.\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b_NEWLINE_La t\xc3\xa9cnica \xc2\xabWestern blot\xc2\xbb fue desarrollada en la Universidad de Stanford. El nombre (Western, occidental en ingl\xc3\xa9s) le fue dado por W. Neal Burnette, y consiste en un juego de palabras con una t\xc3\xa9cnica an\xc3\xa1loga pero que usa DNA, el Southern (sure\xc3\xb1o en ingl\xc3\xa9s) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras t\xc3\xa9cnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern (norte\xc3\xb1o en ingl\xc3\xa9s) (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern (oriental en ingl\xc3\xa9s) blot y el Southwestern (del suroeste en ingl\xc3\xa9s) blot.\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nElectroforesis en gel\n_START_PARAGRAPH_\nLas prote\xc3\xadnas de la muestra ser\xc3\xa1n separadas mediante una electroforesis en gel en funci\xc3\xb3n de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto isoel\xc3\xa9ctrico, peso molecular y carga el\xc3\xa9ctrica. La naturaleza de la separaci\xc3\xb3n depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel._NEWLINE_La electroforesis en gel m\xc3\xa1s frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tamp\xc3\xb3n con dodecilsulfato (SDS). En esta t\xc3\xa9cnica las prote\xc3\xadnas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la p\xc3\xa9rdida de las estructuras secundaria y terciaria y mantiene los polip\xc3\xa9ptidos en este estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las prote\xc3\xadnas no influye en la electroforesis, y pueden separarse \xc3\xbanicamente en funci\xc3\xb3n del tama\xc3\xb1o.\n_START_SECTION_\nDifusi\xc3\xb3n simple\n_START_PARAGRAPH_\nEn la transferencia por difusi\xc3\xb3n simple se ponen en contacto las superficies del gel electrofor\xc3\xa9tico y de la membrana y, sobre \xc3\xa9sta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto pesado. Este montaje se coloca sobre un tamp\xc3\xb3n, que ascender\xc3\xa1 por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las prote\xc3\xadnas. Al llegar a la membrana, quedar\xc3\xa1n retenidas en ella._NEWLINE_Este protocolo no est\xc3\xa1 muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de prote\xc3\xadna transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia. Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificaci\xc3\xb3n que permite obtener m\xc3\xbaltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias pruebas sobre geles virtualmente id\xc3\xa9nticos. Esta modificaci\xc3\xb3n es viable cuando no es necesaria una transferencia cuantitativa de prote\xc3\xadna.\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nTransferencia al vac\xc3\xado\n_START_PARAGRAPH_\nEn esta t\xc3\xa9cnica, se a\xc3\xb1ade el poder de succi\xc3\xb3n de una bomba conectada a un sistema de secado de planchas de gel, el cual lleva las prote\xc3\xadnas desde el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa. Este m\xc3\xa9todo es v\xc3\xa1lido tanto para prote\xc3\xadnas de alto como de bajo peso molecular.\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nElectrotransferencia\n_START_PARAGRAPH_\nEste m\xc3\xa9todo se basa en una corriente el\xc3\xa9ctrica y un tamp\xc3\xb3n de transferencia para llevar las prote\xc3\xadnas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o c\xc3\xa1todo al positivo o \xc3\xa1nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, m\xc3\xa1s papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente el\xc3\xa9ctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las prote\xc3\xadnas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Tras la transferencia, se suele proceder a la tinci\xc3\xb3n del gel con Azul de Coomassie (un colorante de prote\xc3\xadnas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana._NEWLINE_La electrotransferencia es hoy en d\xc3\xada la t\xc3\xa9cnica de transferencia m\xc3\xa1s usada gracias a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de prote\xc3\xadna que se transfiere (especialmente en comparaci\xc3\xb3n con las otras t\xc3\xa9cnicas).\n_START_SECTION_\nBloqueo\n_START_PARAGRAPH_\nPuesto que la membrana escogida necesita poder unirse a las prote\xc3\xadnas de forma inespec\xc3\xadfica, es preciso bloquear los lugares de uni\xc3\xb3n que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la detecci\xc3\xb3n puede unirse a ellos, dificultando la distinci\xc3\xb3n del complejo ant\xc3\xadgeno-anticuerpo que se forma con la prote\xc3\xadna que se busca. _NEWLINE_En el bloqueo se incuba la membrana con una soluci\xc3\xb3n de prote\xc3\xadnas, t\xc3\xadpicamente de alb\xc3\xbamina de suero bovino o ASB (m\xc3\xa1s conocida por sus siglas en ingl\xc3\xa9s, BSA), leche en polvo o case\xc3\xadna, con una diminuta fracci\xc3\xb3n de detergente, como Tween 20 o Trit\xc3\xb3n X-100. Las prote\xc3\xadnas en soluci\xc3\xb3n se unir\xc3\xa1n a todos aquellos lugares de uni\xc3\xb3n de la membrana que no est\xc3\xa9n ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo s\xc3\xb3lo podr\xc3\xa1 unirse a su ant\xc3\xadgeno espec\xc3\xadfico, reduciendo as\xc3\xad el ruido de fondo y los falsos positivos.\n_START_SECTION_\nDetecci\xc3\xb3n\n_START_PARAGRAPH_\nEn la detecci\xc3\xb3n se comprueba la presencia en la membrana de una determinada prote\xc3\xadna. Para ello se emplea un anticuerpo espec\xc3\xadfico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reacci\xc3\xb3n colorim\xc3\xa9trica (produce color). De esta forma, se hace patente la uni\xc3\xb3n con el ant\xc3\xadgeno, la prote\xc3\xadna, as\xc3\xad como su localizaci\xc3\xb3n._NEWLINE_El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la detecci\xc3\xb3n en un \xc3\xbanico paso, lo cual es \xc3\xbatil en ciertos campos.\n_START_SECTION_\nM\xc3\xa9todo en dos pasos\n_START_PARAGRAPH_\nLos dos pasos de los que consta este m\xc3\xa9todo de detecci\xc3\xb3n son la uni\xc3\xb3n del anticuerpo primario y la del anticuerpo secundario.\n_START_SECTION_\nAnticuerpo primario\n_START_PARAGRAPH_\nEl primer paso es permitir la uni\xc3\xb3n de un anticuerpo primario contra la prote\xc3\xadna buscada. \xc3\x89ste se consigue inoculando dicha prote\xc3\xadna o uno de sus ep\xc3\xadtopos (regiones capaces de desencadenar la respuesta inmune)  a un animal (como un conejo o una cabra) o a un cultivo celular. Adem\xc3\xa1s, como la prote\xc3\xadna se ha desnaturalizado durante la electroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca espec\xc3\xadficamente la prote\xc3\xadna desnaturalizada. La presencia del elemento extra\xc3\xb1o deber\xc3\xada desencadenar una respuesta inmune cuyo resultado incluya la producci\xc3\xb3n del anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la prote\xc3\xadna._NEWLINE_As\xc3\xad pues, tras el bloqueo se incuba en agitaci\xc3\xb3n moderada la membrana con una disoluci\xc3\xb3n de anticuerpo primario (0,5 - 5 \xce\xbcg/ml). La disoluci\xc3\xb3n consiste en un tamp\xc3\xb3n salino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, una peque\xc3\xb1a fracci\xc3\xb3n de detergente y, en ocasiones, prote\xc3\xadnas disueltas, como ASB o leche en polvo. La membrana junto con la disoluci\xc3\xb3n pueden ser introducidas en una peque\xc3\xb1a bolsa de pl\xc3\xa1stico. Esta incubaci\xc3\xb3n puede durar desde 30 minutos a una noche entera. La temperatura a la que puede tener lugar es igualmente variada; en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones m\xc3\xa1s espec\xc3\xadficas.\n_START_SECTION_\nAnticuerpo secundario\n_START_PARAGRAPH_\nTras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario. \xc3\x89ste reconoce de forma espec\xc3\xadfica una regi\xc3\xb3n concreta del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (uni\xc3\xb3n a biotina, a una enzima reporter como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa del r\xc3\xa1bano (HRP), etc.). Varios de estos anticuerpos se unir\xc3\xa1n a cada anticuerpo primario, amplificando la se\xc3\xb1al._NEWLINE_Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de origen animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-rat\xc3\xb3n" es aquel capaz de reconoces casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: econ\xc3\xb3micas, por permitir a un laboratorio compartir una \xc3\xbanica fuente de anticuerpos secundarios; y dan resultados mucho m\xc3\xa1s consistentes._NEWLINE_Tambi\xc3\xa9n pueden emplearse prote\xc3\xadnas no anticuerpos, como las prote\xc3\xadnas A y G.\n_START_SECTION_\nRadiactividad\n_START_PARAGRAPH_\nEs una alternativa al uso de anticuerpos secundarios que consiste en prote\xc3\xadnas de uni\xc3\xb3n a anticuerpos marcadas radiactivamente. Esta prote\xc3\xadna puede ser, por ejemplo, la prote\xc3\xadna A de Staphylococcus aureus\xe2\x80\x8b o la prote\xc3\xadna G\xe2\x80\x8b marcadas con \xc2\xb9\xc2\xb2\xe2\x81\xb5I (un is\xc3\xb3topo radiactivo de yodo). Las prote\xc3\xadnas mencionadas tienen la capacidad de unirse a anticuerpos de forma inespec\xc3\xadfica, por lo que se unir\xc3\xa1n al primario._NEWLINE_Este m\xc3\xa9todo apenas se usa actualmente, por ser significativamente m\xc3\xa1s caro, peligroso y lento que los otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible, da bandas que permiten una precisa cuantificaci\xc3\xb3n; y la imagen autoradiogr\xc3\xa1fica puede ser reproducida f\xc3\xa1cilmente y con gran precisi\xc3\xb3n para su publicaci\xc3\xb3n.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nAnticuerpo unido a una enzima\n_START_PARAGRAPH_\nUn mecanismo de detecci\xc3\xb3n simple y r\xc3\xa1pido consiste en unir al anticuerpo secundario enzimas que catalicen la transformaci\xc3\xb3n de un sustrato soluble en un producto insoluble. De esta forma, en el posterior an\xc3\xa1lisis quedar\xc3\xa1 una mancha all\xc3\xad donde est\xc3\xa9 la prote\xc3\xadna de inter\xc3\xa9s. Enzimas como la peroxidasa de r\xc3\xa1bano (HRP) o una fosfatasa alcalina son v\xc3\xa1lidas para este mecanismo.\xe2\x80\x8b Por ejemplo, la peroxidasa puede catalizar la oxidaci\xc3\xb3n del 4-cloronaftol en presencia de un 1% de per\xc3\xb3xido de hidr\xc3\xb3geno. El resultado es que el primero forma una mancha de precipitado oscura.\xe2\x80\x8b Otras t\xc3\xa9cnicas, como ELISA o ELISPOT, tambi\xc3\xa9n emplean este m\xc3\xa9todo de detecci\xc3\xb3n._NEWLINE_Otro m\xc3\xa9todo m\xc3\xa1s sofisticado consiste en la uni\xc3\xb3n de una enzima que catalice una reacci\xc3\xb3n quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas tambi\xc3\xa9n son v\xc3\xa1lidas en este caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscente diferente. En el caso de la peroxidasa, cataliza la oxidaci\xc3\xb3n del luminol en presencia de per\xc3\xb3xido de hidr\xc3\xb3geno. La fosfatasa alcalina cataliza la defosforilaci\xc3\xb3n del adamantil-1-2-dioxetano fosfato, reacci\xc3\xb3n que genera luz. Si se coloca una pel\xc3\xadcula fotogr\xc3\xa1fica sobre la membrana, la exposici\xc3\xb3n a la luz que se desprende en la reacci\xc3\xb3n permite detectar la actividad enzim\xc3\xa1tica.\n_START_SECTION_\nMarcaje fluorescente\n_START_PARAGRAPH_\nOtro m\xc3\xa9todo basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos a fluorocromos del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz constante (estado est\xc3\xa1tico) cuando se excitan de manera constante, permitiendo una detecci\xc3\xb3n muy precisa y una cuantificaci\xc3\xb3n del ant\xc3\xadgeno m\xc3\xa1s exacta que la de la quimioluminiscencia, que se realiza durante un estado din\xc3\xa1mico._NEWLINE_El rojo Nilo no puede usarse para te\xc3\xb1ir bandas en membranas de PVDF; sin embargo es posible realizar la tinci\xc3\xb3n en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la membrana de PVDF. Esto \xc3\xbaltimo presenta una ventaja, y es que no es necesario realizar una tinci\xc3\xb3n del gel para comprobar la transferencia proteica.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nSistema avidina/estreptavidina\n_START_PARAGRAPH_\nOtra opci\xc3\xb3n es emplear un anticuerpo primario unido covalentemente a mol\xc3\xa9culas de biotina. Despu\xc3\xa9s la detecci\xc3\xb3n se llevar\xc3\xa1 a cabo con una prote\xc3\xadna de uni\xc3\xb3n a la misma, como la estreptavidina o la avidina.\n_START_SECTION_\nDetecci\xc3\xb3n con oro\n_START_PARAGRAPH_\nOtra t\xc3\xa9cnica, conocida como Golden blot, consiste en la detecci\xc3\xb3n de los anticuerpos primarios con prote\xc3\xadna A unida a part\xc3\xadculas de oro. El resultado es una membrana con manchas rojas, causadas por el oro, all\xc3\xad donde est\xc3\xa1 la prote\xc3\xadna.\xe2\x80\x8b La sensibilidad del m\xc3\xa9todo puede incrementarse con una tinci\xc3\xb3n fotoqu\xc3\xadmica de plata: el oro cataliza la reducci\xc3\xb3n de los iones plata a plata met\xc3\xa1lica en presencia de otro agente reductor, como la hidroquinona; la plata forma de este modo unas manchas visibles bajo microscopio \xc3\xb3ptico. Se consigue as\xc3\xad una sensibilidad comparable a la de las t\xc3\xa9cnicas radiactivas.\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nM\xc3\xa9todo en un paso\n_START_PARAGRAPH_\nHist\xc3\xb3ricamente la detecci\xc3\xb3n se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que supone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrece a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se refiere, y a\xc3\xb1ade un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de los an\xc3\xa1lisis de prote\xc3\xadnas de alto rendimiento y los menores l\xc3\xadmites de detecci\xc3\xb3n ha crecido el inter\xc3\xa9s por desarrollar sistemas de detecci\xc3\xb3n en un solo paso que aumentar\xc3\xadan la rapidez del proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la prote\xc3\xadna de inter\xc3\xa9s y una "etiqueta" detectable. Se incuba de manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar directamente.\n_START_SECTION_\nAn\xc3\xa1lisis\n_START_PARAGRAPH_\nTras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detecci\xc3\xb3n de aquellas que s\xc3\xad se han unido a la prote\xc3\xadna de inter\xc3\xa9s.\n_START_SECTION_\nDetecci\xc3\xb3n colorim\xc3\xa9trica\n_START_PARAGRAPH_\nLa detecci\xc3\xb3n colorim\xc3\xa9trica depende de la incubaci\xc3\xb3n del Western blot con un sustrato que reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al anticuerpo secundario. Pasa as\xc3\xad de ser un compuesto soluble a una forma insoluble de otro color que precipita cerca de la enzima ti\xc3\xb1endo as\xc3\xad la membrana. Se procede despu\xc3\xa9s a un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La cuantificaci\xc3\xb3n proteica se eval\xc3\xbaa por densitometr\xc3\xada (cuan intensa es la mancha) o por espectrometr\xc3\xada.\n_START_SECTION_\nDetecci\xc3\xb3n quimioluminiscente\n_START_PARAGRAPH_\nLa detecci\xc3\xb3n quimioluminiscente requieren la incubaci\xc3\xb3n de la membrana con un sustrato, que emitir\xc3\xa1 luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el anticuerpo secundario. La luz emitida es captada por una pel\xc3\xadcula fotogr\xc3\xa1fica o, m\xc3\xa1s recientemente, por c\xc3\xa1maras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se analiza la imagen por densitometr\xc3\xada para evaluar la cantidad relativa de mancha y cuantifica el resultado en t\xc3\xa9rminos de densidad \xc3\xb3ptica. Actualmente hay programas que permiten realizar an\xc3\xa1lisis m\xc3\xa1s profundos si se aplican ciertos est\xc3\xa1ndares, como la obtenci\xc3\xb3n del peso molecular.\n_START_SECTION_\nDetecci\xc3\xb3n radioactiva\n_START_PARAGRAPH_\nLos marcadores radiactivos no requieren sustratos enzim\xc3\xa1ticos; en su lugar se coloca una pel\xc3\xadcula fotogr\xc3\xa1fica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador provoca la aparici\xc3\xb3n en ella de regiones oscuras. Estas se corresponder\xc3\xa1n con las bandas de las prote\xc3\xadnas de inter\xc3\xa9s. Su alto precio y su riesgo para la salud y la seguridad han provocado su desuso en los \xc3\xbaltimos tiempos.\n_START_SECTION_\nDetecci\xc3\xb3n fluorescente\n_START_PARAGRAPH_\nEn la detecci\xc3\xb3n con marcadores fluorescentes se procede a la excitaci\xc3\xb3n lum\xc3\xadnica de \xc3\xa9stos que les provoca una excitaci\xc3\xb3n. \xc3\x89sta es detectable por un fotosensor, como una c\xc3\xa1mara CCD equipado con los filtros de emisi\xc3\xb3n apropiados. Se consigue as\xc3\xad una imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso molecular o la cuantificaci\xc3\xb3n proteica. La fluorescencia es considerada uno de los m\xc3\xa9todos de an\xc3\xa1lisis m\xc3\xa1s sensibles.\n_START_SECTION_\nExploraciones secundarias\n_START_PARAGRAPH_\nUna caracter\xc3\xadstica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa, es su capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la membrana con otros anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo en membranas de nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminaci\xc3\xb3n de los anticuerpos, permitiendo una mayor reutilizaci\xc3\xb3n antes de que el ruido de fondo sea tan grande que impida continuar con los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa, el PVDF debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de ser usado. Adem\xc3\xa1s, las membranas de PVDF tienden a ser m\xc3\xa1s delgadas y m\xc3\xa1s resistentes a los da\xc3\xb1os durante su uso.\n_START_SECTION_\nInvestigaci\xc3\xb3n\n_START_PARAGRAPH_\nActualmente, el Western blot es una de las t\xc3\xa9cnicas m\xc3\xa1s usadas en el estudio de la biolog\xc3\xada molecular.'