b'\n_START_ARTICLE_\nSistema de Mutaci\xc3\xb3n Refractario a la Amplificaci\xc3\xb3n por PCR\n_START_PARAGRAPH_\nEl Sistema de Mutaci\xc3\xb3n Refractario a la Amplificaci\xc3\xb3n por PCR o ARMS-PCR por sus siglas en ingl\xc3\xa9s (Amplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction) es una t\xc3\xa9cnica para detectar mutaciones puntuales conocidas, que se cree que fue descrita por primera vez por el equipo de Newton en 1989.\xe2\x80\x8b Se ha desarrollado para el diagn\xc3\xb3stico de todas las mutaciones \xce\xb2-talasemia comunes que se encuentran en diferentes grupos \xc3\xa9tnicos alrededor del mundo y sobre todo en los pa\xc3\xadses asi\xc3\xa1ticos.\xe2\x80\x8b La t\xc3\xa9cnica se basa en que un cebador espec\xc3\xadfico s\xc3\xb3lo permita que la amplificaci\xc3\xb3n tenga lugar cuando su extremo 3\' coincida con su secuencia diana. Por ejemplo, para detectar la mutaci\xc3\xb3n \xce\xb2-talasemia (G / C), el nucle\xc3\xb3tido en el extremo 3\' del cebador es una guanina con el fin de que si se encuentra con una citocina, el nucle\xc3\xb3tido sustituido en el ADN mutante, si no se lleva a cabo la amplificaci\xc3\xb3n ser\xc3\xada debido a que el cebador formar\xc3\xada un desajuste o "mismatch" G-G con el ADN normal. Esta falta de correspondencia es d\xc3\xa9bil, entonces para que se pueda reducir la eficiencia de hibridaci\xc3\xb3n de los cebadores con la cadena molde de ADN entre un 0 y 5% para as\xc3\xad evitar la amplificaci\xc3\xb3n, una mayor falta de correspondencia con la secuencia diana u objetivo tendr\xc3\xada que ser introducida en el segundo, tercero o cuarto de los nucle\xc3\xb3tidos antes del extremo 3\' del cebador utilizado.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nAntecedentes hist\xc3\xb3ricos\n_START_PARAGRAPH_\nEn 1989, algunos grupos independientes describieron un tipo de PCR que podr\xc3\xada ser utilizada para el an\xc3\xa1lisis de mutaciones puntuales conocidas en el ADN y que as\xc3\xad se pudiera distinguir entre el alelo normal, el genotipo heterocigoto y los genotipos mutantes o normales homocigotos; estos grupos independientes fueron los de Newton, Nichols,  Okayama,  Sommer y Wu. El m\xc3\xa9todo se conoce como PCR-ARMS o \xc3\xbanicamente ARMS (Sistema de Mutaci\xc3\xb3n Refractario a la Amplificaci\xc3\xb3n por PCR) nombrado as\xc3\xad en el texto publicado por Newton en 1989, como PASA (PCR para la amplificaci\xc3\xb3n de alelos espec\xc3\xadficos) por Sommer y como ASPCR (PCR alelo-espec\xc3\xadfico) por Wu. La aplicabilidad es la de analizar mutaciones asociadas a enfermedades conocidas como la fenilcetonuria y anemia de c\xc3\xa9lulas falciformes; posteriormente, en 1992, el equipo de investigaci\xc3\xb3n liderado por Sommer realiz\xc3\xb3 estudios de validaci\xc3\xb3n que establecieron que esta nueva estrategia de Reacci\xc3\xb3n en Cadena de la Polimerasa es aplicable al an\xc3\xa1lisis de cualquier mutaci\xc3\xb3n puntual conocida o Polimorfismo de un solo nucle\xc3\xb3tido.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_En su art\xc3\xadculo Analysis of any point mutation in DNA. ARMS., Newton y su equipo dijeron: "Hemos mejorado la "Reacci\xc3\xb3n en Cadena de la Polimerasa" (PCR) para permitir el an\xc3\xa1lisis r\xc3\xa1pido de cualquier mutaci\xc3\xb3n conocida en el ADN gen\xc3\xb3mico. Demostramos un sistema, ARMS (Sistema de Mutaci\xc3\xb3n Refractario a la Amplificaci\xc3\xb3n por PCR) que permite el genotipado \xc3\xbanicamente por la inspecci\xc3\xb3n de las mezclas de reacci\xc3\xb3n despu\xc3\xa9s de la electroforesis en gel de agarosa. El sistema es simple y fiable, permite distinguir claramente alelos heterocigotos u homocigotos en un locus para cualquiera de los dos alelos. El sistema no requiere ni la digesti\xc3\xb3n con enzimas de restricci\xc3\xb3n o de oligonucle\xc3\xb3tidos espec\xc3\xadficos de alelos como son aplicados convencionalmente, ni el an\xc3\xa1lisis de la secuencia de los productos de PCR. La base de la invenci\xc3\xb3n son los oligonucle\xc3\xb3tidos que no se unan a la cadena molde en el extremo 3\' , as\xc3\xad no funcionar\xc3\xadan como cebadores en la PCR en condiciones apropiadas. Hemos analizado el ADN de pacientes con calantitripsina (AAT), de portadores de la enfermedad y de  individuos normales. Nuestros resultados est\xc3\xa1n en completo acuerdo con las asignaciones de los alelos derivados de la secuenciaci\xc3\xb3n directa de los productos de la PCR ... La viabilidad de la PCR-ARMS descrita por Newton se demostr\xc3\xb3 por la amplificaci\xc3\xb3n del ex\xc3\xb3n III y parte del intr\xc3\xb3n III en el gen de AAT humano. La aplicaci\xc3\xb3n directa de la PCR-ARMS a los alelos cl\xc3\xadnicamente significativos se realiz\xc3\xb3 y los diagn\xc3\xb3sticos estaban de acuerdo con los resultados del an\xc3\xa1lisis de la secuencia de los productos de PCR".\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Los grupos independientes antes mencionados demostraron una t\xc3\xa9cnica general que permite la verificaci\xc3\xb3n de cualquier polimorfismo o mutaci\xc3\xb3n puntual conocidos. La t\xc3\xa9cnica requiere que el extremo terminal 3\' de los cebadores de PCR sea espec\xc3\xadfico para los alelos conocidos, tanto mutante como normal. As\xc3\xad, el cebador inicia la s\xc3\xadntesis en dos formas. Si el alelo es de la forma "normal", entonces es refractario a la amplificaci\xc3\xb3n por PCR sobre la cadena de ADN "mutante", mientras que si la forma es "mutante" es refractario a la PCR sobre el ADN "normal". En algunos casos una sola base que no concuerde s\xc3\xad permite la amplificaci\xc3\xb3n, de manera que demostraron que la introducci\xc3\xb3n de algunos otros desajustes adicionales cerca del extremo 3 \' de los cebadores apropiados aminora este problema.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_ARMS es un m\xc3\xa9todo simple, r\xc3\xa1pido y confiable que proporciona precisi\xc3\xb3n a la hora de hacer un diagn\xc3\xb3stico pre- y post-natal y un medio para la detecci\xc3\xb3n de heterocigotos. ARMS sigue siendo de beneficio a\xc3\xban si las mutaciones asociadas a la enfermedad, hasta ahora no caracterizada, est\xc3\xa1n vinculados a los polimorfismos caracterizados. En tales casos, la t\xc3\xa9cnica permitir\xc3\xa1 analizar el haplotipo de manera detallada con una cantidad m\xc3\xadnima de ADN.  Los diagn\xc3\xb3sticos prenatales precisos son alcanzables en unas pocas horas si se evita la contaminaci\xc3\xb3n materna a partir de material fetal, aunque hoy en d\xc3\xada las tecnolog\xc3\xadas y m\xc3\xa9todos de diagn\xc3\xb3stico con ADN fetal circulante parecen prometedoras. Una consideraci\xc3\xb3n pr\xc3\xa1ctica importante con este enfoque (como con otras estrategias basadas en la Reacci\xc3\xb3n en Cadena de la Polimerasa) es que es innecesario preparar ADN de alta calidad, adecuado para la digesti\xc3\xb3n con enzimas de restricci\xc3\xb3n.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Un requisito previo de la PCR-ARMS es la ausencia de una actividad correctora 3\'-exonucleol\xc3\xadtica asociada con la ADN polimerasa, igual que el extremo 3\'-OH de los cebadores coincidentes sean refractarios a la extensi\xc3\xb3n por la polimerasa de ADN elegida. En los casos en que la falta de coincidencia no es refractaria a la extensi\xc3\xb3n (como se demostr\xc3\xb3 en los resultados de la experimentaci\xc3\xb3n de Newton en 1989), son requeridos algunos desajustes m\xc3\xa1s desestabilizadores.  Emp\xc3\xadricamente, el grado de especificidad observada con los cebadores no coincidentes (y por tanto el requisito de que la desestabilizaci\xc3\xb3n adicional se lleve a cabo), se correlaciona con el tipo de desajuste. C / T, A / A y desajustes de T / T (que son todos o bien purina / purina o desajustes pirimidina / pirimidina) son considerablemente m\xc3\xa1s refractarios a la extensi\xc3\xb3n por la Taq Polimerasa que los desajustes G / T, T / G, A / C o C / A  (donde todos son desajustes purina / pirimidina).\xe2\x80\x8b _NEWLINE_Es probable que cualquiera de estos enfoques para desestabilizar deliberadamente los cebadores de la PCR-ARMS y, por lo tanto, mejorar la especificidad puede ser mediante la reducci\xc3\xb3n de dNTPs, magnesio y concentraciones de cebador o el simple aumento de las temperaturas de amplificaci\xc3\xb3n / extensi\xc3\xb3n y de hibridaci\xc3\xb3n. Por el contrario, un aumento en la concentraci\xc3\xb3n de estos reactivos o una disminuci\xc3\xb3n de la temperatura de amplificaci\xc3\xb3n podr\xc3\xada suponer que tenga un efecto adverso sobre las especificidades de los cebadores de manera que no generen previamente ning\xc3\xban producto deseado.\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b_NEWLINE_La optimizaci\xc3\xb3n de las concentraciones de magnesio, Taq polimerasa, dNTP y / o de la temperatura exacta a trav\xc3\xa9s de los ciclos de la PCR-ARMS, el control cuidadoso de la variable debe ser alcanzable con la instrumentaci\xc3\xb3n totalmente automatizada de la PCR-ARMS. De hecho, la adici\xc3\xb3n de Taq polimerasa para mezclas de reacci\xc3\xb3n a 60 \xc2\xb0 C y asegurar que la temperatura de reacci\xc3\xb3n nunca cae por debajo de \xc3\xa9sta, puede aumentar significativamente la especificidad de reacci\xc3\xb3n y evitar la generaci\xc3\xb3n de productos en plantillas no coincidentes.\xe2\x80\x8b_NEWLINE__NEWLINE_Hemos elegido utilizar grandes cebadores (30-meros) en este ensayo ya que esto permite el uso de altas temperaturas de amplificaci\xc3\xb3n para mejorar la especificidad y reduce la posibilidad de un mal acoplamiento de los cebadores en otros lugares del ADN gen\xc3\xb3mico. Un enfoque alternativo podr\xc3\xada ser el uso de cebadores m\xc3\xa1s cortos que abarquen una mutaci\xc3\xb3n puntual tal que la discriminaci\xc3\xb3n entre loci "normal" y "mutante" se logre mediante la hibridaci\xc3\xb3n de los cebadores de una manera espec\xc3\xadfica con ciertos alelos en condiciones apropiadas, naturalmente.  Es importante tener en cuenta, sin embargo, que en este an\xc3\xa1lisis de la especificidad de los cebadores no se habla de algo absoluto, la ausencia de controles internos podr\xc3\xada concebiblemente dar lugar a diagn\xc3\xb3sticos err\xc3\xb3neos y la hibridaci\xc3\xb3n de los mismos cebadores. Otras desventajas ser\xc3\xadan que las diferentes condiciones tendr\xc3\xadan que ser determinadas para cada locus de inter\xc3\xa9s lo que complicar\xc3\xada el an\xc3\xa1lisis simult\xc3\xa1neo de m\xc3\xbaltiples loci.\xe2\x80\x8b _NEWLINE_"No se nos escapa que la PCR-ARMS puede tener muchas otras aplicaciones en la medicina y la biolog\xc3\xada molecular. La t\xc3\xa9cnica ser\xc3\xa1 \xc3\xbatil para la tipificaci\xc3\xb3n precisa de los pat\xc3\xb3genos infecciosos con base en los cambios espec\xc3\xadficos de la cepa, caracter\xc3\xadsticos para cada una, de manera que pueden ser identificados. El an\xc3\xa1lisis de activaci\xc3\xb3n de oncogenes es as\xc3\xad sencillo al igual que la detecci\xc3\xb3n de deleciones en el ADN. Muchas aplicaciones adicionales tambi\xc3\xa9n se pueden considerar en el contexto de la investigaci\xc3\xb3n."\xe2\x80\x8b_NEWLINE_-Newton et al., 1989\n_START_SECTION_\nPrincipio\n_START_PARAGRAPH_\nLa PCR-ARMS se basa en la observaci\xc3\xb3n de que la amplificaci\xc3\xb3n por PCR es ineficiente o completamente refractaria si hay un desajuste entre el nucle\xc3\xb3tido terminal de un cebador en su extremo 3\' y la plantilla correspondiente.\xe2\x80\x8b La Taq ADN polimerasa carece de una actividad de exonucleasa y por lo tanto no se pueden corregir desajustes en los extremos 3\' del cebador. Como tal, se requiere la hibridaci\xc3\xb3n de bases complementarias en el extremo 3\' del cebador para la amplificaci\xc3\xb3n eficiente de Taq DNA polimerasa; la amplificaci\xc3\xb3n del alelo normal, y no el de la mutante, se lleva a cabo utilizando un cebador que es complementaria al alelo normal y tiene un desajuste entre el residuo 3\' y el alelo mutante. Por el contrario, s\xc3\xb3lo el mutante se amplificar\xc3\xa1 si el residuo 3\' del cebador es complementario al alelo mutante y no el alelo normal. La especificidad o poder de discriminaci\xc3\xb3n del nucle\xc3\xb3tido terminal en el extremo 3\' se puede mejorar a\xc3\xban m\xc3\xa1s si se incorpora una asimetr\xc3\xada adicional posicionado cerca del nucle\xc3\xb3tido 3\'.\xe2\x80\x8b \xe2\x80\x8b_NEWLINE_Varios estudios han intentado cuantificar el efecto inhibidor de diferentes desajustes en la amplificaci\xc3\xb3n por PCR, como aquellos de los \xc3\xbaltimos a\xc3\xb1os de la d\xc3\xa9cada de 1990. Aunque han surgido algunas tendencias, los resultados han sido notablemente discordantes. Sarkar y sus colegas, en 1990, concluyeron que la PCR es inhibida por desajustes entre la plantilla y el nucle\xc3\xb3tido en el extremo 3\' del cebador. Por otra parte, Kwok y su equipo en 1990 demostraron una reducci\xc3\xb3n de 20 veces en la eficiencia de la amplificaci\xc3\xb3n con desajustes A\xc2\xa0: A (cebador\xc2\xa0: molde), la reducci\xc3\xb3n de 100 veces con desajustes A\xc2\xa0: G, G\xc2\xa0: A, y C\xc2\xa0: C, y poca o ninguna reducci\xc3\xb3n con otros desajustes. En 1992, Huang y sus colaboradores demostraron alg\xc3\xban grado de inhibici\xc3\xb3n con cada combinaci\xc3\xb3n de desajustes. La inhibici\xc3\xb3n m\xc3\xa1s d\xc3\xa9bil, la reducci\xc3\xb3n de aproximadamente 100 veces, se asoci\xc3\xb3 con desajustes C\xc2\xa0: T . Hab\xc3\xada aproximadamente 10 veces una reducci\xc3\xb3n con desajustes A  : C, C\xc2\xa0: A, G\xc2\xa0: T, y desajustes; G: 34T 10 a 10 veces de reducci\xc3\xb3n con desajustes T\xc2\xa0: C y T 6: T\xc2\xa0; y al menos 10 veces la tasa de reducci\xc3\xb3n con desajustes A\xc2\xa0: A, G\xc2\xa0: A, A\xc2\xa0: G, G\xc2\xa0: G, y C\xc2\xa0: C. Ayyadevara y colegas, que realizaron ciertos experimentos en el a\xc3\xb1o 2000 variaron sistem\xc3\xa1ticamente tanto el extremo terminal 3\' y los nucle\xc3\xb3tidos de los pen\xc3\xbaltimos cebadores, todo ello bajo condiciones de relativamente alta rigurosidad. Su estudio indica que los cebadores que terminan Adenina son moderadamente inferiores a los que terminan en otros nucle\xc3\xb3tidos.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_La PCR-ARMS est\xc3\xa1 basada en el mismo principio que ASO (Allele Specific Oligonucleotide): la utilizaci\xc3\xb3n de oligonucle\xc3\xb3tidos espec\xc3\xadficos para la secuencia normal y para la secuencia mutada; en la PCR-ARMS estos oligonucle\xc3\xb3tidos son cebadores de PCR. Se dise\xc3\xb1an, por tanto, dos reacciones de PCR que comparten un mismo cebador com\xc3\xban pero se diferencian en que un cebador amplificar\xc3\xa1 s\xc3\xb3lo el alelo normal, mientras que el otro cebador amplificar\xc3\xa1 s\xc3\xb3lo el mutado. Dada la rapidez y sencillez de la PCR, esta t\xc3\xa9cnica est\xc3\xa1 desplazando cada vez m\xc3\xa1s a la t\xc3\xa9cnica de ASO.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Dicho de otra forma, una PCR ARMS est\xc3\xa1ndar consiste en dos reacciones complementarias (dos tubos) y utiliza 3 cebadores. Un cebador es constante y complementarios a la plantilla en ambas reacciones, los otros cebadores difieren en sus extremos 3\' y son espec\xc3\xadficos para la secuencia de ADN de tipo normal o la secuencia mutada en una base dada. Los productos de PCR se separan por electroforesis a trav\xc3\xa9s de un gel de agarosa que contiene bromuro de etidio. Si la muestra es homocig\xc3\xb3tica para el alelo normal u homocig\xc3\xb3tico para el alelo mutante, s\xc3\xb3lo se producir\xc3\xa1 s\xc3\xb3lo en uno de los tubos, si la muestra es heterocig\xc3\xb3tica se ver\xc3\xa1 en ambos tubos.\xe2\x80\x8b    _NEWLINE_ARMS es un m\xc3\xa9todo basado en la Reacci\xc3\xb3n en Cadena de la Polimerasa, que utiliza cebadores espec\xc3\xadficos para el alelo normal o el alelo mutante. En este m\xc3\xa9todo, un cebador de oligonucle\xc3\xb3tido con un extremo de triple complementaria a la secuencia de una mutaci\xc3\xb3n espec\xc3\xadfica, junto con un cebador com\xc3\xban se utiliza en una reacci\xc3\xb3n de PCR. En paralelo, un cebador normal correspondiente, junto con un cebador com\xc3\xban se utiliza en otra reacci\xc3\xb3n PCR. La presencia de un producto amplificado en la primera reacci\xc3\xb3n indica la presencia de la mutaci\xc3\xb3n mientras que su ausencia indica la presencia de la secuencia de ADN normal en ese sitio espec\xc3\xadfico. En la segunda reacci\xc3\xb3n, la presencia de un producto amplificado indica la presencia de una secuencia de ADN normal en ese sitio espec\xc3\xadfico, mientras que su ausencia indica presencia de la mutaci\xc3\xb3n. Se pueden separar los resultados de una PCR-ARMS en un gel de agarosa al 2 o 3%.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nDise\xc3\xb1o de cebadores\n_START_PARAGRAPH_\nComo regla general para el dise\xc3\xb1o de cebadores de una PCR-ARMS, se debe tratar de implementar el desajuste en el segundo nucle\xc3\xb3tido en la primera instancia y probar la cartilla de la especificidad y la generaci\xc3\xb3n de producto. La posici\xc3\xb3n de la desigualdad puede ser alterado si el primario no funciona, o la fuerza de la falta de coincidencia aumenta si se observan bandas inespec\xc3\xadficas. Seg\xc3\xban Little, S. en Current Protocols in Human Genetics,\xe2\x80\x8b y como se ha mencionado anteriormente, los desajustes pueden ser: m\xc3\xa1ximos, GA, CT, TT; fuerte, CC; medio, AA, GG; D\xc3\xa9bil, CA, GT; ninguno, AT, GC.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Una prueba de ARMS t\xc3\xadpica para una sola mutaci\xc3\xb3n se compone de dos amplificaciones de la misma mezcla de reacci\xc3\xb3n utilizando el mismo ADN gen\xc3\xb3mico como sustrato. Los resultados de los productos de amplificaci\xc3\xb3n a partir del cebador espec\xc3\xadfico y su par de cebadores (cuando la mutaci\xc3\xb3n est\xc3\xa1 presente en el ADN gen\xc3\xb3mico) y los otros resultados de la amplificaci\xc3\xb3n de dos cebadores que generan un fragmento de control en todos los casos. La generaci\xc3\xb3n de un producto de control indica la mezcla de reacci\xc3\xb3n y que el termociclador est\xc3\xa1 funcionando de manera \xc3\xb3ptima. La estrategia consiste en la detecci\xc3\xb3n de las mutaciones comunes en el pa\xc3\xads de origen \xc3\xa9tnico del paciente en primer lugar y luego para la detecci\xc3\xb3n de las mutaciones m\xc3\xa1s raras. Despu\xc3\xa9s de lo cual, las mutaciones no caracterizadas son identificadas por secuenciaci\xc3\xb3n gen\xc3\xb3mica.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Los cebadores para el diagn\xc3\xb3stico de los alelos normales para muchas mutaciones se enumeran en diversos art\xc3\xadculos publicados en revistas cient\xc3\xadficas. En los \xc3\xbaltimos a\xc3\xb1os se ha visto un aumento exponencial en la generaci\xc3\xb3n de bibliograf\xc3\xada de este tipo.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nCondiciones\n_START_PARAGRAPH_\nGeneralmente se utilizan 20 \xc2\xb5l de volumen final de reacci\xc3\xb3n de PCR. El volumen de reacci\xc3\xb3n se compone de 0,5 microgramos de la plantilla de ADN, 0,01 g de cada uno de los cuatro cebadores (2 cebadores de control, 1 cebador com\xc3\xban, y 1 mutante / cebadores para la reacci\xc3\xb3n normal / mutante), 0,5 unidad de Taq ADN polimerasa y 0,2 mM de cada dNTP en una soluci\xc3\xb3n de tris-C1 10 mM, MgCl2 50 mM y espermidina 1 mM. El r\xc3\xa9gimen de ciclo t\xc3\xa9rmico consisti\xc3\xb3 en 30 ciclos de: precalentamiento a 94 \xc2\xbaC durante 2 minutos, desnaturalizaci\xc3\xb3n a 94 \xc2\xbaC durante 1 minuto, se permite la hibridaci\xc3\xb3n variable y la extensi\xc3\xb3n a 72 \xc2\xbaC durante 1 minuto.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nMateriales\n_START_PARAGRAPH_\ndNTP_NEWLINE_"Sume 50 \xc2\xb5l de una soluci\xc3\xb3n 100 mM de cada dNTP y 3,8 ml de agua destilada. El dNTP de la soluci\xc3\xb3n madre a 1,25 mM se debe almacenar en al\xc3\xadcuotas congeladas".\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Cebadores_NEWLINE_"50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 a temperatura ambiente), MgCl2 1,5 mM, 100 mg / ml. Un amortiguador a 10x puede ser preparado mediante la suma de 0,5 ml de 1 M Tris-HCl (pH 8,3 a temperatura ambiente), 1,25 ml de 2 M KCl, 75 l de 1 M de MgCl2, 5 mg y 3.275 ml de agua destilada . La reserva de estabilizaci\xc3\xb3n se calienta a 37 \xc2\xbaC hasta que se disuelve y luego se congela en al\xc3\xadcuotas".\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Taq polimerasas_NEWLINE_"Las sugeridos son las siguientes, AmpliTaq Gold (PE Biosystems) que funciona mejor para pruebas de digesti\xc3\xb3n ARMS-PCR / RE y Platinum Taq (Gibco Life Technologies) para Gap-PCR. (EDTA Tris-borato (TBE) tamp\xc3\xb3n: 89 mM Tris-borato, 89 mM \xc3\xa1cido b\xc3\xb3rico, 10 mM EDTA pH 8,0)".\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nOptimizaciones\n_START_PARAGRAPH_\nEl dise\xc3\xb1o y la optimizaci\xc3\xb3n de los protocolos de ARMS-PCR es hecha en funci\xc3\xb3n de la secuencia diana y las diferencias de nucle\xc3\xb3tidos que definen los alelos. Adem\xc3\xa1s de los desajustes entre el nucle\xc3\xb3tido del extremo 3\xe2\x80\x99 del cebador y la diana, solo los desajustes deber\xc3\xadan incorporarse en varias posiciones del extremo 3\xe2\x80\x99. Aparte de las consideraciones te\xc3\xb3ricas relativas a la posici\xc3\xb3n terminal 3\xe2\x80\x99 de los cebadores espec\xc3\xadficos para alelos, el dise\xc3\xb1o y optimizaci\xc3\xb3n de los cebadores para ARMS-PCR sigue las mismas consideraciones utilizadas para cualquier otro tipo de PCR. Los cebadores se eligen para tener temperaturas de fusi\xc3\xb3n te\xc3\xb3ricas (Tm) comparables; las longitudes de los cebadores son generalmente de 20 nucle\xc3\xb3tidos o m\xc3\xa1s, aunque la longitud es menos importante que la Tm; los cebadores no deben tener secuencias auto-complementarias de 4 nucle\xc3\xb3tidos o m\xc3\xa1s, ni deben tener m\xc3\xa1s de 4 nucle\xc3\xb3tidos de complementariedad entre sus extremos 3\xe2\x80\x99._NEWLINE_Como con cualquier estrategia basada en PCR, los resultados falsos negativos pueden ser el resultado de la presencia de polimorfismos que han tenido un impacto negativo en la hibridaci\xc3\xb3n del cebador y / o en la amplificaci\xc3\xb3n. Este problema potencial puede ser superado por la orientaci\xc3\xb3n de la cadena opuesta para la amplificaci\xc3\xb3n, o mediante la incorporaci\xc3\xb3n de un nucle\xc3\xb3tido degenerado en el cebador._NEWLINE_Para identificar mutaciones individuales con ARMS-PCR, las condiciones de la PCR se pueden establecer mediante la titulaci\xc3\xb3n de la concentraci\xc3\xb3n de MgCl2 y / o cambiar las concentraciones del cebador a la temperatura de amplificaci\xc3\xb3n constante. Para ARMS multiplex, el primer paso es optimizar las condiciones de PCR para la detecci\xc3\xb3n sensible y espec\xc3\xadfica de cada alelo. El objetivo es definir los par\xc3\xa1metros de los ciclos de PCR y la concentraci\xc3\xb3n de MgCl2 en las que todos los alelos se amplifican de una manera eficiente y espec\xc3\xadfica. Puede ser necesario volver a dise\xc3\xb1ar uno o m\xc3\xa1s pares de cebadores para lograr la amplificaci\xc3\xb3n espec\xc3\xadfica de alelo bajo un conjunto de condiciones de PCR. Una vez se han establecido los par\xc3\xa1metros de la PCR, los pares de cebadores se pueden combinar para evaluar el rendimiento del ensayo ARMS-PCR m\xc3\xbaltiple. Las concentraciones del cebador deben ajustarse de tal manera que cada uno de los alelos se amplifique en un grado comparable. La especificidad del ensayo de ARMS-PCR debe ser evaluada utilizando muestras de los controles normales y de los portadores conocidos de las mutaciones. La especificidad tambi\xc3\xa9n se puede probar utilizando diluciones seriadas de ADN mutante mezclado con ADN normal (por ejemplo, mutante: normal = 1: 1, 1: 2, 1: 4, 1: 8, etc.); la amplificaci\xc3\xb3n uniforme y espec\xc3\xadfica de cada alelo puede requerir manipulaci\xc3\xb3n adicional de los par\xc3\xa1metros de ciclaci\xc3\xb3n o la concentraci\xc3\xb3n de uno o m\xc3\xa1s reactivos (cebadores, Taq polimerasa, MgCl2).\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nARMS-PCR m\xc3\xbaltiple\n_START_PARAGRAPH_\nMuchos trastornos gen\xc3\xa9ticos se caracterizan por un peque\xc3\xb1o n\xc3\xbamero de mutaciones comunes que representan una proporci\xc3\xb3n significativa y, en algunos casos, la mayor\xc3\xada de los alelos mutantes representadas en una poblaci\xc3\xb3n dada. Una vez que se ha establecido el espectro de mutaciones y las frecuencias de los alelos individuales, la PCR-ARMS se puede utilizar para la detecci\xc3\xb3n de manera simult\xc3\xa1nea de las mutaciones m\xc3\xa1s comunes. En la pr\xc3\xa1ctica, los ensayos multiplex pueden ser desarrollados para la detecci\xc3\xb3n de cuatro a seis mutaciones diferentes un solo tubo de PCR.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nT-ARMS-PCR\n_START_PARAGRAPH_\nEl sistema de mutaci\xc3\xb3n refractario a la amplificaci\xc3\xb3n por PCR con tetra-cebadores (T-ARMS-PCR) es un m\xc3\xa9todo r\xc3\xa1pido y econ\xc3\xb3mico para el an\xc3\xa1lisis de polimorfismos de un solo nucle\xc3\xb3tido (SNP), requiriendo s\xc3\xb3lo la amplificaci\xc3\xb3n por PCR y la posterior electroforesis para la determinaci\xc3\xb3n de genotipos. Para mejorar el rendimiento y la eficiencia de la T-ARMS-PCR, se puede combinar la T-ARMS-PCR con una estrategia quim\xc3\xa9rica de interrupci\xc3\xb3n de temperatura basada en los iniciadores o cebadores de PCR (TSP) y asimismo se puede utilizar la electroforesis capilar (CE por sus siglas en ingl\xc3\xa9s) para la separaci\xc3\xb3n e identificaci\xc3\xb3n de los resultados de la amplificaci\xc3\xb3n o \xe2\x80\x9camplicones\xe2\x80\x9d como com\xc3\xbanmente se denominan. En el 2013, algunos investigadores evaluaron este proceso en el genotipado simult\xc3\xa1neo de cuatro tipos de c\xc3\xa1ncer de mama y dos relacionados con el riesgo de c\xc3\xa1ncer de cuello uterino, todos relacionados con algunos SNPs.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Un total de 24 cebadores T-ARMS-PCR, cada uno etiquetado con una secuencia universal en el extremo 5\xe2\x80\x99 y un par de cebadores universales, fueron agrupados para amplificar los 12 alelos de 6 SNPs en 186 muestras de sangre de mujeres que fungir\xc3\xadan como controles. Tambi\xc3\xa9n se realiz\xc3\xb3 una secuenciaci\xc3\xb3n directa de todas las muestras para evaluar la exactitud de este m\xc3\xa9todo.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_De las 186 muestras se pudieron producir hasta 11 amplicones en una sola PCR y ser separados por Electroforesis Capilar. Los resultados de genotipado con la T-ARMS-PCR m\xc3\xbaltiple estaban en completa concordancia con la secuenciaci\xc3\xb3n directa de todas las muestras. Este nuevo m\xc3\xa9todo de T-ARMS-PCR m\xc3\xbaltiple es el primer m\xc3\xa9todo reportado que permite determinar el genotipo de seis SNPs en una sola reacci\xc3\xb3n sin ning\xc3\xban tratamiento post-PCR distinta de la electroforesis; este m\xc3\xa9todo es fiable, r\xc3\xa1pido y f\xc3\xa1cil de realizar.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_El papel de los polimorfismos de un solo nucle\xc3\xb3tido (SNP) es el de contribuir a la variabilidad entre individuos, a veces haci\xc3\xa9ndolos susceptibles al c\xc3\xa1ncer,\xe2\x80\x8b el crecimiento del tumor y la tasa de met\xc3\xa1stasis,\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b as\xc3\xad como en la eficacia del tratamiento y las respuestas secundarias a los medicamentos.\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b Entre los muchos m\xc3\xa9todos que se han desarrollado para determinar el genotipo de los SNPs; el sistema de mutaci\xc3\xb3n refractario a la amplificaci\xc3\xb3n por PCR con tetra-cebadores (T-ARMS-PCR) ha demostrado ser r\xc3\xa1pido, simple y econ\xc3\xb3mico.\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b  A trav\xc3\xa9s de la combinaci\xc3\xb3n de dos cebadores externos y los dos cebadores internos espec\xc3\xadficos para alg\xc3\xban alelo, la genotipificaci\xc3\xb3n requiere s\xc3\xb3lo una PCR seguida de una separaci\xc3\xb3n por electroforesis.\xe2\x80\x8b La incorporaci\xc3\xb3n de una T-Arms- PCR m\xc3\xbaltiple, con ocho cebadores en una PCR hace capaz la detecci\xc3\xb3n de manera simult\xc3\xa1nea de dos mutaciones.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_Por otro lado, la hibridaci\xc3\xb3n quim\xc3\xa9rica m\xc3\xbaltiple por PCR a\xc3\xb1ade una etiqueta universal de 59 nucle\xc3\xb3tidos a la secuencia de cebadores espec\xc3\xadficos para varios objetivos, se ha utilizado para mejorar el rendimiento y la eficiencia de la reacci\xc3\xb3n en cadena de la polimerasa.\xe2\x80\x8b dando buenos resultados. Con su alta eficiencia en la detecci\xc3\xb3n de decenas de diferentes productos de PCR en una reacci\xc3\xb3n, el uso de un cebador quim\xc3\xa9rico para PCR con frecuencia se ha utilizado en la cuantificaci\xc3\xb3n de ARNm\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b y la detecci\xc3\xb3n de pat\xc3\xb3genos.\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b_NEWLINE_El c\xc3\xa1ncer de mama y el c\xc3\xa1ncer c\xc3\xa9rvico-uterino se han convertido en los c\xc3\xa1nceres m\xc3\xa1s frecuentemente diagnosticados y las principales causas de muerte por c\xc3\xa1ncer entre las mujeres.\xe2\x80\x8b Estudios recientes demuestran que las variantes som\xc3\xa1ticas en regiones de susceptibilidad est\xc3\xa1n asociados con la probabilidad de ocurrencia de c\xc3\xa1ncer de mama y c\xc3\xa1nceres ginecol\xc3\xb3gicos.\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b _NEWLINE_Algunos SNPs fueron escogidos para un estudio que se hizo sobre las asociaciones gen\xc3\xa9ticas reportadas con estos tipos de c\xc3\xa1ncer y que tiene una alta prevalencia en las poblaciones asi\xc3\xa1ticas. Se seleccionaron cuatro variantes de baja penetrancia para la predicci\xc3\xb3n del riesgo de c\xc3\xa1ncer de mama: rs4784227 SNP\xe2\x80\x8b y rs3803662\xe2\x80\x8b se encuentran en el TOX3 un factor de transcripci\xc3\xb3n; rs1219648 se encuentra dentro de FGFR2, que contribuye al crecimiento celular, la invasi\xc3\xb3n, la motilidad y la angiog\xc3\xa9nesis;\xe2\x80\x8b rs889312\xe2\x80\x8b est\xc3\xa1 dentro de MAP3K1, que est\xc3\xa1 vinculada a la respuesta celular a los mit\xc3\xb3genos. Se seleccionaron dos variantes asociadas con el riesgo de c\xc3\xa1ncer c\xc3\xa9rvicouterino o de ovario. rs750749 SNP\xe2\x80\x8b es un polimorfismos en CD83, que est\xc3\xa1 implicado en el reconocimiento inmune y la presentaci\xc3\xb3n de ant\xc3\xadgenos; rs749292 en CYP19A1, que desempe\xc3\xb1a un papel clave en la bios\xc3\xadntesis de estr\xc3\xb3genos.\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b_NEWLINE_En este trabajo, se describe un nuevo m\xc3\xbaltiplex T-ARMS-PCR que permite el genotipado simult\xc3\xa1neo de 6 SNPs (rs4784227, rs3803662, rs1219648, rs889312, rs750749 y rs749292) asociado con c\xc3\xa1nceres de mama y ginecol\xc3\xb3gicos en un solo tubo utilizando 24 quim\xc3\xa9rico cebadores y un par de cebadores universales el uso de cebadores quim\xc3\xa9ricos y una estrategia de interruptor de temperatura PCR (TSP) se combinaron con T-ARMS-PCR para optimizar los par\xc3\xa1metros de amplificaci\xc3\xb3n y mejorar el rendimiento de SNP genotipado. La combinaci\xc3\xb3n de estas diferentes t\xc3\xa9cnicas de genotipificaci\xc3\xb3n de- muestra por primera vez la capacidad de tetra-primer ARMS-PCR para detectar de forma fiable y eficiente seis SNPs en una sola reacci\xc3\xb3n. Desde hace m\xc3\xa1s de 10 productos de PCR con longitudes diferentes deben ser identificados, electroforesis capilar (CE) se utiliza en lugar de la electroforesis en gel de agarosa.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_El estudio hecho sobre la prevalencia de ciertos tipos de c\xc3\xa1nceren la poblaci\xc3\xb3n asi\xc3\xa1tica, habla de que de acuerdo con los monitoreos recogidos en los centros de salud comunitarios en Wuhan, China en 2011 un gran porcentaje de la poblaci\xc3\xb3n presenta polimorfismos de un solo nucle\xc3\xb3tido asociados a estos.\xe2\x80\x8b_NEWLINE_M\xc3\xa9todos que permitan el bajo costo de la determinaci\xc3\xb3n r\xc3\xa1pida y fiable de los SNPs est\xc3\xa1n generando un creciente inter\xc3\xa9s ahora que vamos encaminados a la era de la medicina personalizada. Es ampliamente reconocido que el uso de la informaci\xc3\xb3n de m\xc3\xbaltiples genotipos de SNPs proporciona una evaluaci\xc3\xb3n del riesgo m\xc3\xa1s precisa que la predicha por el riesgo de un alelo \xc3\xbanico,\xe2\x80\x8b por lo tanto, algunos m\xc3\xa9todos capaces de identificar m\xc3\xbaltiples genotipos, tales como MALDI-TOF (espectrometr\xc3\xada de masas)\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b y basado en la hibridaci\xc3\xb3n\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b o a base de enzimas se han utilizado\xe2\x80\x8b m\xc3\xa9todos. Sin embargo, estos m\xc3\xa9todos requieren equipo especial costoso, como los espectr\xc3\xb3metros de masas o tardan mucho tiempo despu\xc3\xa9s de la operaci\xc3\xb3n._NEWLINE_El m\xc3\xa9todo de ARMS-PCR con tetra-cebadores se ha convertido en uno de los m\xc3\xa9todos m\xc3\xa1s com\xc3\xbanmente utilizados para el genotipado de SNP. S\xc3\xb3lo se requiere equipo de biolog\xc3\xada molecular regular y elimina la necesidad de hibridaci\xc3\xb3n o reacciones enzim\xc3\xa1ticas adicionales. Aunque se han reportado m\xc3\xa9todos tr\xc3\xadplex y cu\xc3\xa1druplex de PCR, se hace un uso limitado de m\xc3\xbaltiplex T-ARMS-PCR en la determinaci\xc3\xb3n del genotipo debido a dos limitaciones clave. En primer lugar, la probabilidad de encontrar cebadores con temperaturas de fusi\xc3\xb3n emparejados cae dr\xc3\xa1sticamente cuando se trata de combinar la detecci\xc3\xb3n de varios SNPs en una sola reacci\xc3\xb3n. En segundo lugar, la piscina que resulta de los amplificados requiere suficientes intervalos de longitud entre bandas vecinas en la electroforesis para facilitar la separaci\xc3\xb3n. Mediante la combinaci\xc3\xb3n de T-ARMS-PCR con una estrategia quim\xc3\xa9rica basada en los iniciadores de temperatura de activaci\xc3\xb3n PCR eludimos en gran medida estas limitaciones. Nuestro m\xc3\xa9todo demuestra por primera vez la capacidad de tetra-primer ARMS-PCR para detectar f\xc3\xa1cilmente seis SNPs en una sola reacci\xc3\xb3n.\xe2\x80\x8b_NEWLINE__NEWLINE_Es notable que la intensidad de la banda pueden ser objeto de varios factores, incluyendo la calidad del ADN gen\xc3\xb3mico y PCR calidad de los reactivos; se ha encontrado que 50 a 100 ng / ml de ADN es \xc3\xb3ptima para proporcionar bandas suficientemente clara y brillante con el fondo m\xc3\xadnima (datos no mostrados). Adem\xc3\xa1s, a diferencia de la mayor\xc3\xada de otros m\xc3\xa9todos inform\xc3\xb3 T-ARMS-PCR, una falta de coincidencia deliberado en la posici\xc3\xb3n -1 de la 39 terminal se incorpor\xc3\xb3 en ambos cebadores internos y era suficientemente espec\xc3\xadfico para la detecci\xc3\xb3n diferencial de dos alelos para cada SNP. Debido a la limitaci\xc3\xb3n de tama\xc3\xb1o de la discriminaci\xc3\xb3n entre los productos de PCR, dise\xc3\xb1o de cebadores de PCR puede ser restringido en cierta medida, hacer m\xc3\xbaltiples T-ARMS-PCR dif\xc3\xadcil de escribir los SNPs que se encuentran m\xc3\xa1s cerca que 20 pb de la otra. Dos claras ventajas del m\xc3\xa9todo ARMS-PCR m\xc3\xbaltiple son el corto tiempo de ensayo y los bajos costos, incluso para ensayar un gran n\xc3\xbamero de muestras. El m\xc3\xa9todo propuesto, solo que incluya la PCR convencional con un CE, puede llevarse a cabo antes de 3,5 horas con un m\xc3\xadnimo esfuerzo pr\xc3\xa1ctico. Despu\xc3\xa9s de la extracci\xc3\xb3n de ADN gen\xc3\xb3mico, los pasos posteriores se pueden completar en un solo tubo de reacci\xc3\xb3n, lo que permite el an\xc3\xa1lisis de m\xc3\xbaltiples muestras listo en una \xc3\xbanica prueba para cribado de alto rendimiento. Este ensayo consume solamente reactivos de PCR est\xc3\xa1ndar y cartuchos de electroforesis; los costos en este estudio fueron s\xc3\xb3lo 2 US $ para la detecci\xc3\xb3n simult\xc3\xa1nea de seis SNPs por muestra. Para nuestro conocimiento, el m\xc3\xa9todo propuesto es el primero en detectar seis SNPs en una \xc3\xbanica reacci\xc3\xb3n usando tetra-primer ARMS-PCR. El nuevo m\xc3\xa9todo multiplex tetra-primer ARMS-PCR desarrollada en este estudio tiene un potencial significativo para ser ampliamente aplicable tanto en entornos comerciales y cl\xc3\xadnicas para la detecci\xc3\xb3n de m\xc3\xbaltiples SNPs.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nq-ARMS-PCR\n_START_PARAGRAPH_\nLa leu A3243G ARNmt mitocondrial (UUR) es un punto de mutaci\xc3\xb3n que puede causar miopat\xc3\xada mitocondrial, encefalopat\xc3\xada, s\xc3\xadndrome de acidosis l\xc3\xa1ctica y episodios de ictus (MELAS), el trastorno de ADN mitocondrial m\xc3\xa1s com\xc3\xban, y tambi\xc3\xa9n se encuentra en los pacientes con diabetes de herencia materna y s\xc3\xadndrome de sordera (EDIM). Para correlacionar la manifestaci\xc3\xb3n de la enfermedad con las cargas de mutaci\xc3\xb3n, es necesario medir el porcentaje de la mutaci\xc3\xb3n A3243G en el ADNmt._NEWLINE_Para cuantificar de manera fiable las bajas proporciones del ADNmt mutante, hemos desarrollado un sistema de mutaci\xc3\xb3n refractario a amplificaci\xc3\xb3n por PCR cuantitativo en tiempo real (ARMS-qPCR). Hemos validado el m\xc3\xa9todo con muestras experimentales que contienen proporciones conocidas de A3243G mutante ADNmt generados mediante la mezcla de cantidades conocidas de ADN de pl\xc3\xa1smido clonado que contiene ya sea el de tipo salvaje o las secuencias mutantes._NEWLINE_Se encontr\xc3\xb3 un coeficiente de correlaci\xc3\xb3n de 0,9995 entre los valores esperados y observados para las proporciones de A3243G mutante en las muestras experimentales. Evaluaci\xc3\xb3n de un total de 36 muestras de ADN de pacientes demostr\xc3\xb3 resultados consistentes entre la PCR de restricci\xc3\xb3n polimorfismo de longitud de fragmento de an\xc3\xa1lisis (RFLP) y en ARMS-qPCR. Sin embargo, el \xc3\xbaltimo m\xc3\xa9todo fue mucho m\xc3\xa1s sensible para la detecci\xc3\xb3n de bajos porcentajes de heteroplasmia mutante. Tres muestras conten\xc3\xadan mutaciones de oligonucle\xc3\xb3tidos-detectable pero RFLP-indetectable espec\xc3\xadficos de alelo._NEWLINE_El m\xc3\xa9todo en tiempo real ARMS-PCR cuantitativa proporciona un r\xc3\xa1pido, de un solo paso de detecci\xc3\xb3n cuantitativa y fiable de mutante heteroplasmic ADNmt._NEWLINE_En los ARMS-PCR de PCR, el cebador inverso (5\'-TGGCCATGGGTATGTTGTTA-3 \') era en las posiciones de nucle\xc3\xb3tidos 3319-3300 para la amplificaci\xc3\xb3n de ambos de tipo salvaje ADNmt y la mutaci\xc3\xb3n A3243G. Los cebadores directos para el an\xc3\xa1lisis de RT ARMS-PCR de la mutaci\xc3\xb3n A3243G se enumeran. Los n\xc3\xbameros corresponden a las posiciones de nucle\xc3\xb3tidos en GenBank adhesi\xc3\xb3n no. NC001807 y la base de datos MITOMAP (2). Originalmente, una falta de coincidencia en la posici\xc3\xb3n de nucle\xc3\xb3tido pen\xc3\xbaltima del sitio de mutaci\xc3\xb3n se introdujo en los cebadores directos para aumentar la especificidad de la reacci\xc3\xb3n ARMS basado en los principios descritos por Newton. Sin embargo, la especificidad no era suficiente, y no hab\xc3\xada se\xc3\xb1ales de fondo en 0% mutante. Dos desajustes en los dos nucle\xc3\xb3tidos inmediatamente 5 \'al sitio de la mutaci\xc3\xb3n A continuaci\xc3\xb3n, se introducen, que mejora en gran medida la especificidad. Por lo tanto, se utilizaron cebadores modificados hacia adelante desde el conjunto B de este estudio. En el sitio de la mutaci\xc3\xb3n, la imprimaci\xc3\xb3n de tipo salvaje que contiene una "A" ser\xc3\xada conjuntar con la secuencia diana de tipo salvaje, pero ser\xc3\xada una falta de coincidencia d\xc3\xa9bil "AC" con la secuencia diana mutante. Del mismo modo, el cebador mutante que contiene una "G" ser\xc3\xada una combinaci\xc3\xb3n perfecta con la secuencia diana mutante, pero ser\xc3\xada una falta de coincidencia d\xc3\xa9bil "GT" con la secuencia diana de tipo salvaje. Por lo tanto, se espera que la introducci\xc3\xb3n de un fuerte desajuste CC en la pen\xc3\xbaltima de nucle\xc3\xb3tidos para aumentar la especificidad de imprimaci\xc3\xb3n.\n_START_SECTION_\nRT-ARMS-q-PCR\n_START_PARAGRAPH_\nEl ensayo RT-qPCR ARMS se realiz\xc3\xb3 por triplicado para cada tipo salvaje y la secuencia diana mutante. La mezcla de 20-l de reacci\xc3\xb3n de PCR conten\xc3\xada 1 \xc3\x97 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen), 500 nM de cada cebador, tinte Rox, y ~ 4 ng de extracto de ADN gen\xc3\xb3mico total, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En tiempo real las condiciones de PCR fueron 2 min a 50 \xc2\xb0 C y 10 min a 95 \xc2\xb0 C, seguido por 45 ciclos de desnaturalizaci\xc3\xb3n durante 15 s a 95 \xc2\xb0 C y el recocido / extensi\xc3\xb3n durante 60 s a 63 \xc2\xb0 C. colorante SYBR Green se une al surco menor del ADN de doble cadena y aumenta la intensidad de las emisiones fluorescentes, mientras que los amplicones se producen en cada ciclo de amplificaci\xc3\xb3n. Las intensidades de la se\xc3\xb1al fluorescente se registraron y analizaron durante la PCR en un sistema 7700 detector de secuencias ABI Prism (Applied Biosystems) utilizando el software SDS (Ver. 1.91). curvas de disociaci\xc3\xb3n para los amplicones se generaron despu\xc3\xa9s de cada carrera para confirmar que el aumento de la intensidad de fluorescencia no eran atribuibles a las se\xc3\xb1ales no espec\xc3\xadficas (d\xc3\xadmeros de cebadores). El aumento de la se\xc3\xb1al fluorescente est\xc3\xa1 asociado con un crecimiento exponencial de producto de PCR durante la fase lineal-log. El ciclo umbral (C ^ sub T ^) es el ciclo en el cual se detecta primero un aumento significativo en el producto de reacci\xc3\xb3n. Cuanto mayor sea la cantidad inicial de ADN, se detecta el producto en menos tiempo acumulado en el proceso de la PCR y la parte baja de la C ^ sub t ^ valor. Por lo tanto, el C ^ sub T ^ valores dentro de la fase de aumento exponencial lineal se utilizan para medir los n\xc3\xbameros originales de copia de la plantilla de ADN y para construir la curva de calibraci\xc3\xb3n. Si una muestra conten\xc3\xada> 100 000 o <100 copias sobre la base de la C ^ sub T ^, el ensayo se repiti\xc3\xb3 a una diluci\xc3\xb3n mayor o menor del extracto de ADN de manera que la medici\xc3\xb3n caer\xc3\xada dentro de un rango de n\xc3\xbameros de copias de ADN lineal.\n_START_SECTION_\nARMS-Scorpion\n_START_PARAGRAPH_\nEl objetivo de un estudio fue el de comparar el test de KRAS sensibles y con control de calidad con la secuenciaci\xc3\xb3n directa y para evaluar el impacto en la toma de decisiones de tratamiento._NEWLINE_Se analiz\xc3\xb3 el ADN gen\xc3\xb3mico aislado de las muestras incluidas en parafina fijado en formol por secuenciaci\xc3\xb3n directa y un sistema de ensayo de ARMS-Scorpion (ARMS / S). El cetuximab se administr\xc3\xb3 a los pacientes identificados como de tipo salvaje (WT) KRAS mediante secuenciaci\xc3\xb3n directa. Los efectos terap\xc3\xa9uticos se evaluaron en funci\xc3\xb3n de su estado de KRAS como se determina por ARMS / S._NEWLINE_Entre los 159 pacientes, la tasa de mutaci\xc3\xb3n general se determin\xc3\xb3 que era 37,0% por secuenciaci\xc3\xb3n directa y 44,0% en los ARMS-PCR / S. Para los pacientes diagnosticados como WT por secuenciaci\xc3\xb3n directa y tratados con cetuximab (n = 47), se observ\xc3\xb3 una tasa de respuesta del 16,0% para 38 pacientes ARMS-PCR / S WT, mientras que 9 ARMS-PCR / S mutante (MUT) pacientes no respondieron. Los ARMS-PCR / pacientes S WT mostraron una mejor\xc3\xada significativa en la supervivencia libre de progresi\xc3\xb3n (SLP) y la supervivencia global (SG) en comparaci\xc3\xb3n con los ARMS-PCR / pacientes S MUT (PFS mediana de 5,0 vs 1,7 meses, promedio de riesgo (HR) = 0,29, p = 0,001; La mediana de SG 12,1 vs 3,8 meses, HR = 0,26, p = 0,001). El test de KRAS sensibles y con control de calidad puede proporcionar una mejor capacidad de predicci\xc3\xb3n para determinar la eficacia de los anticuerpos del factor de crecimiento anti-epid\xc3\xa9rmicos .\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nARMS-PCR con hexa-cebadores\n_START_PARAGRAPH_\nEl sistema de mutaci\xc3\xb3n refractario a la amplificaci\xc3\xb3n por PCR con tetra-cebadores (TARMS-PCR) es un m\xc3\xa9todo de genotipificaci\xc3\xb3n sencillo y barato para la diferenciaci\xc3\xb3n de los dos alelos de un polimorfismo / mutaci\xc3\xb3n (polimorfismos y peque\xc3\xb1as inserciones / deleciones) con un \xc3\xbanico tubo de PCR. En T-ARMS-PCR, un par de cebadores comunes (exteriores) produce un amplic\xc3\xb3n de control inespec\xc3\xadfico de alelo y en combinaci\xc3\xb3n con los cebadores 2 alelo-espec\xc3\xadficos (interior) (dise\xc3\xb1ado para hibridarse en la orientaci\xc3\xb3n opuesta) produce 2 amplicones espec\xc3\xadficos de alelo. Por lo tanto, los amplicones se pueden separar por electroforesis en gel est\xc3\xa1ndar. T-ARMS-PCR tambi\xc3\xa9n ha sido dise\xc3\xb1ado de un modo multiplex para el genotipo m\xc3\xa1s de un polimorfismo / mutaci\xc3\xb3n por un \xc3\xbanico tubo de PCR. Se describe una T-ARMS-PCR m\xc3\xbaltiplex modificada, el hexaprimer ARMS-PCR (H-ARMS-PCR), que es para cuando est\xc3\xa1n cerca de 2 polimorfismos en la secuencia. H-ARMSPCR utiliza s\xc3\xb3lo 6 cebadores y proporciona informaci\xc3\xb3n directa sobre la estructura de haplotipos._NEWLINE_El gen CTLA4 (citot\xc3\xb3xico prote\xc3\xadna asociada a Linfocitos T 4, tambi\xc3\xa9n conocida como CD152) es un regulador negativo de la funci\xc3\xb3n de las c\xc3\xa9lulas T. Los polimorfismos CTLA4 -318 C> T (rs5742909) y 49 A> G (rs231775) est\xc3\xa1n asociados con la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes y c\xc3\xa1ncer._NEWLINE_Para determinar el genotipo de estos 2 polimorfismos, que s\xc3\xb3lo son 365 pb de separaci\xc3\xb3n, en la regi\xc3\xb3n 5 \'del gen de CTLA4, se dise\xc3\xb1\xc3\xb3 un H-ARMS-PCR que combina un \xc3\xbanico par de cebadores comunes y 2 pares de cebadores alelo-especificos en el mismo tubo._NEWLINE_La reacci\xc3\xb3n de PCR (25 \xc2\xb5l) conten\xc3\xada 200 desoxinucle\xc3\xb3sidos trifosfato mol / l, 100 ng de ADN gen\xc3\xb3mico, 1,25 U de HotStarTaq ADN polimerasa con su buffer y los siguientes cebadores a las concentraciones indicadas: - 318fo, 5\'CAATGAAATGAATTGGACTGGA TG-3 \'(0,5 mol / L); + 49ro, 5\'-TA CAGAGCCAGCCAAGCCAGATT3 \'(0,8 mol / L); -318fi (C), 5\'-CTC CACTTAGTTATCCAGATCGTC-3 \'(2,5 mol / L); -318ri (T), 5\'-AC TGAAGCTTCATGTTCACTCrA-3 \'(0,5 mol / L); + 49fi (a), 5\'-GCACA AGGCTCAGCTGAACCTGGATA3 \'(0,1 mol / L); y + 49ri (g), 5\'-ACAGGAGAGTGCAGGGCCAG GTCCTAGC-3 \'(0,5 mmol / L)._NEWLINE_Las condiciones de ciclaci\xc3\xb3n fueron 12 min a 95 \xc2\xb0 C, seguido de 5 ciclos de 94 \xc2\xb0 C durante 30 s, 62 \xc2\xb0 C durante 30 s, y 72 \xc2\xb0 C durante 45 s; 30 ciclos de 94 \xc2\xb0 C durante 30 s, 57 \xc2\xb0 C durante 30 s, y 72 \xc2\xb0 C durante 45 s; y un ciclo final a 72 \xc2\xb0 C durante 10 min._NEWLINE_Estamos genotipo tanto el -318 C> T y 49 A> G polimorfismos CTLA4 con este nuevo dise\xc3\xb1o de H-ARMS-PCR para muestras de 80 individuos que hab\xc3\xadan sido previamente caracterizado con 3 m\xc3\xa9todos establecidos: RFLP, PCR, secuenciaci\xc3\xb3n directa del ADN, y T-ARMS-PCR  y se observaron discrepancias. Por otra parte, H-ARMS-PCR proporciona un control interno adicional y la informaci\xc3\xb3n directa sobre la estructura de haplotipos mediante la generaci\xc3\xb3n de un amplic\xc3\xb3n que es espec\xc3\xadfico para 1 de los 4 haplotipos que 2 polimorfismos pueden tener te\xc3\xb3ricamente. En este caso, el amplic\xc3\xb3n-haplotipo espec\xc3\xadfico se observa cuando los alelos - 318C y + 49G est\xc3\xa1n en el mismo cromosoma._NEWLINE_Adem\xc3\xa1s, la prueba de este enfoque mediante la aplicaci\xc3\xb3n de H-ARMS-PCR en la determinaci\xc3\xb3n del genotipo de 2 polimorfismos que son 142 pb de separaci\xc3\xb3n, en la regi\xc3\xb3n no traducida 3 \'(UTR) del gen CYP19A1 (citocromo P450, familia 19, subfamilia A, polip\xc3\xa9ptido 1): rs10046 (C> T) y rs4646 (G> T). CYP19A1 codifica la aromatasa, la enzima responsable de la etapa final de la bios\xc3\xadntesis de estr\xc3\xb3genos. polimorfismos CYP19A1 se han asociado con las concentraciones de estr\xc3\xb3genos en la mujer y con la susceptibilidad al c\xc3\xa1ncer de mama y de pr\xc3\xb3stata._NEWLINE_Se utiliz\xc3\xb3 la PCR para analizar estos 2 polimorfismos CYP19A1 en el 3 \'UTR en 100 individuos ya que se caracterizan por RFLP PCR y / o secuenciaci\xc3\xb3n de ADN directa y observamos no hay discrepancias. Un amplic\xc3\xb3n-haplotipo espec\xc3\xadfico est\xc3\xa1 presente cuando alelos rs10046C y rs4646T est\xc3\xa1n en el mismo cromosoma. Este H-ARMSPCR se est\xc3\xa1 utilizando actualmente en un ensayo cl\xc3\xadnico multic\xc3\xa9ntrico italiano (GIM5) para poner a prueba la posible asociaci\xc3\xb3n de polimorfismos CYP19A1 con la eficacia de la terapia adyuvante con un inhibidor de la aromatasa (letrozol) despu\xc3\xa9s del tratamiento con tamoxifeno en pacientes posmenop\xc3\xa1usicas con c\xc3\xa1ncer de mama temprano._NEWLINE_Adem\xc3\xa1s, genotipo una serie de 40 individuos de ambos polimorfismos CTLA4 y CYP19A1 por an\xc3\xa1lisis de H-ARMS-PCR con diferentes termocicladores (iCyder\xc2\xae por Bio-Rad, Px2\xc2\xae por Hybaid, y PTC0 -100\xc2\xae por MJ Research) y en diferentes laboratorios, y se obtuvieron resultados completamente concordantes, lo que demuestra la robustez y reproducibilidad de este enfoque. Todas las muestras humanas fueron recolectados despu\xc3\xa9s se obtuvo el consentimiento informado de acuerdo con el procedimiento institucional._NEWLINE_Hemos demostrado que H-ARMSPCR es una t\xc3\xa9cnica eficaz y robusto para el genotipado de 2 polimorfismos (en un intervalo de aproximadamente 100 a 400 pb) con s\xc3\xb3lo 6 cebadores. Las H-ARMS-PCR pueden trabajar para el genotipado de polimorfismos incluso m\xc3\xa1s alejados o separadas, probablemente dentro de una distancia de aproximadamente 5 kb. Adem\xc3\xa1s, al proporcionar informaci\xc3\xb3n directa sobre un haplotipo definido, H-ARMS-PCR, pueden ser \xc3\xbatiles para la identificaci\xc3\xb3n de haplotipos potencialmente ambiguos en individuos que son heterocigotos dobles .\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nInmunizaci\xc3\xb3n\n_START_PARAGRAPH_\nDe acuerdo a las noticias procedentes de Kaohsiung, Taiw\xc3\xa1n, los corresponsales VerticalNews, la investigaci\xc3\xb3n indic\xc3\xb3, "Un sistema de mutaci\xc3\xb3n refractaria a la amplificaci\xc3\xb3n m\xc3\xbaltiple inversa de la reacci\xc3\xb3n en cadena de la polimerasa (RT- ARMS-PCR) fue desarrollado para el diagn\xc3\xb3stico diferencial del virus de la leucemia felina vacuna y salvaje (FeLV) de tipo cepas sobre la base de una mutaci\xc3\xb3n puntual entre la cepa de la vacuna (S) y la cepa de tipo salvaje (T) situado en el gen p27. Este sistema fue actualizado adicionalmente para obtener un tiempo real de RT-PCR ARMS-PCR (ARMS QRT-PCR ) con un an\xc3\xa1lisis de alta resoluci\xc3\xb3n de fusi\xc3\xb3n (HRMA) plataforma "._NEWLINE_Sun Yat: "El genotipado de varias cepas de FeLV se determin\xc3\xb3 mediante la comparaci\xc3\xb3n de las curvas HRMA con la de tipo salvaje definido FeLV (cepa TW1), y los resultados se expresaron como una la confianza porcentual. Los l\xc3\xadmites de detecci\xc3\xb3n de ARMS-PCR de RT-PCR y los ARMS-PCR QRT-PCR combinados con HRMA eran 100 y 1 copias de RNA de FeLV transcrito por 0,5 ml de muestra, respectivamente. No hay resultados falsos positivos se obtuvieron con 6 pat\xc3\xb3genos no relacionados y 1 felina l\xc3\xadnea celular. cepas Doce FeLV Taiw\xc3\xa1n fueron identificados correctamente utilizando ARMS-PCR QRT-PCR combinada con HRMA. los genotipos de las cepas se correspond\xc3\xada con el FeLV genotipo de tipo salvaje cepa definida con la confianza de al menos el 91,17%. Un mayor grado de polimorfismo de secuencia se encuentra en todo el gen p27 en comparaci\xc3\xb3n con la larga repetici\xc3\xb3n terminal regi\xc3\xb3n "._NEWLINE_"El estudio actual describe la relaci\xc3\xb3n filogen\xc3\xa9tica de las cepas FeLV Taiw\xc3\xa1n y demuestra que el ensayo de ARMS RT-PCR desarrollado es capaz de ser utilizado para detectar la replicaci\xc3\xb3n de una cepa de vacuna que no ha sido adecuadamente inactivado, actuando as\xc3\xad como un control de seguridad para la calidad de las vacunas de FeLV " .\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nGenotipificaci\xc3\xb3n\n_START_PARAGRAPH_\nLas PCR-ARMS se pueden utilizar para determinar el genotipo de las muestras para la mutaci\xc3\xb3n m\xc3\xa1s com\xc3\xban asociada con la hemocromatosis hereditaria (HFE C282Y). Las PCR-ARMS se pueden utilizar para determinar los genotipos para las mutaciones individuales o SNP; es decir, distinguir heterocigotos de los homocigotos. Esto se puede lograr mediante dos ARMS-PCR ensayos separados: uno espec\xc3\xadfico para el alelo mutante y el otro espec\xc3\xadficas para el alelo normal. Alternativamente, los sistemas de ARMS-PCR de PCR se han desarrollado para el genotipado de un solo tubo de mutaciones o SNPs. El sistema m\xc3\xa1s simple implica la amplificaci\xc3\xb3n bidireccional, con el alelo normal amplifica usando una hebra como molde y el alelo mutante amplificado de la cadena complementaria. Los cebadores est\xc3\xa1n dise\xc3\xb1ados de tal manera que las longitudes de los amplicones pueden ser f\xc3\xa1cilmente resueltos por electroforesis en gel convencional. Esta estrategia tiene un control positivo incorporado que resulta de la amplificaci\xc3\xb3n entre los cebadores m\xc3\xa1s exteriores de los amplicones normales y mutantes. \xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nHaplotipado\n_START_PARAGRAPH_\nPCR-ARMS-PCR pueden ser utilizados para establecer los haplotipos de los individuos en la ausencia de muestras de los familiares. Esto es particularmente \xc3\xbatil para determinar el haplotipo de SNP que se encuentran dentro de las distancias que son susceptibles de amplificaci\xc3\xb3n por PCR. Considere el caso de SNPs bi-al\xc3\xa9lica adyacentes, donde los alelos se designan Aa y Bb. PCR-ARMS-PCR con las cuatro combinaciones posibles de ARMS-PCR de cebadores espec\xc3\xadficos para los alelos SNP A y B SNP (AB, Ab, aB, ab) pueden ser utilizados. \xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nPCR-ARMS e hibridaci\xc3\xb3n reversa en la detecci\xc3\xb3n de mutaciones en beta-thalassemia\n_START_PARAGRAPH_\nLa beta-talasemia es la enfermedad hereditaria m\xc3\xa1s com\xc3\xban en Ir\xc3\xa1n y durante los \xc3\xbaltimos 10 a\xc3\xb1os, el sistema de amplificaci\xc3\xb3n refractario a las mutaciones (ARMS) y el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricci\xc3\xb3n (RFLP) fueron la \xc3\xbanica t\xc3\xa9cnica molecular utilizada para el diagn\xc3\xb3stico de la enfermedad. Aunque existen muchas mutaciones del gen beta-globina en la poblaci\xc3\xb3n multi\xc3\xa9tnica de Ir\xc3\xa1n, estas t\xc3\xa9cnicas parecen mucho trabajo, mucho tiempo y es caro. Esto nos ha instado a utilizar nuevas t\xc3\xa9cnicas como la hibridaci\xc3\xb3n inversa y secuenciaci\xc3\xb3n directa de este problema.7_NEWLINE_En este estudio, hibridaci\xc3\xb3n inversa en paralelo con los ARMS-PCR para la detecci\xc3\xb3n de las 10 mutaciones beta-talasemia m\xc3\xa1s comunes y la hemoglobina S en 82 pacientes con diagn\xc3\xb3stico cl\xc3\xadnico de menor importancia beta-talasemia y la mayor.7_NEWLINE_A partir de los resultados, de los 82 casos detectables por ambos m\xc3\xa9todos, 80 tuvieron resultados similares. En comparaci\xc3\xb3n a las ARMS-PCR, la hibridaci\xc3\xb3n inversa parece ser m\xc3\xa1s fiable, rentable, r\xc3\xa1pido y aplicable.7_NEWLINE_Teniendo en cuenta el amplio espectro de mutaciones beta-talasemia en Ir\xc3\xa1n, una t\xc3\xa9cnica r\xc3\xa1pida y fiable, como hibridaci\xc3\xb3n inversa representa ventajas vitales en comparaci\xc3\xb3n con los m\xc3\xa9todos de diagn\xc3\xb3stico tradicionales. De hecho, se recomienda como la t\xc3\xa9cnica de elecci\xc3\xb3n que puede ser empleada por el Proyecto Nacional de Talasemia para la detecci\xc3\xb3n y el diagn\xc3\xb3stico prenatal de la talasemia en Ir\xc3\xa1n.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nIdentificaci\xc3\xb3n de SNPs comparando PCR-ARMS con PCR-RFLP\n_START_PARAGRAPH_\nLa identificaci\xc3\xb3n de polimorfismos de nucle\xc3\xb3tido \xc3\xbanico (SNP) es ahora posible mediante muchas t\xc3\xa9cnicas, pero la elecci\xc3\xb3n de uno de estos m\xc3\xa9todos para un caso particular representa todo un reto, debido a que el investigador debe tener en cuenta muchos factores._NEWLINE_En este art\xc3\xadculo los autores est\xc3\xa1n tratando de presentar un estudio comparativo de dos m\xc3\xa9todos, que se utiliza actualmente en nuestro laboratorio, para la identificaci\xc3\xb3n de polimorfismos SNP: ARMS - PCR (sistema de mutaci\xc3\xb3n refractaria a la amplificaci\xc3\xb3n) y. Los dos SNPs en el que nos centramos pertenecen al gen VDR humano (gen del receptor de la vitamina D) y son ApaI (un cambio de base G por T en el intr\xc3\xb3n 8) y Taq I (T por el cambio de base C silenciosa en el cod\xc3\xb3n 352), el nombre de la enzimas de restricci\xc3\xb3n que reconocen estas variaciones. 49_NEWLINE_Dado que los resultados obtenidos por los dos m\xc3\xa9todos se confirmaron por secuenciaci\xc3\xb3n directa, concluimos que el m\xc3\xa9todo ARMS-PCR es el m\xc3\xa1s adecuado para la detecci\xc3\xb3n de los genotipos alternativos determinados por mutaciones de una sola base. La simplicidad de este m\xc3\xa9todo lo hace adecuado para el an\xc3\xa1lisis de gran n\xc3\xbamero de muestras, situaci\xc3\xb3n que por lo general se cumple en casos y controles y estudios gen\xc3\xa9ticos de poblaci\xc3\xb3n, porque esta prueba es f\xc3\xa1cil de usar, costo - efectiva y tener una precisi\xc3\xb3n de 99,9%. \xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nBiopsias cl\xc3\xadnicas\n_START_PARAGRAPH_\nSe han comparado el an\xc3\xa1lisis de mutaci\xc3\xb3n mediante secuenciaci\xc3\xb3n de ADN y amplificaci\xc3\xb3n refractaria mutaci\xc3\xb3n System \xe2\x84\xa2 (ARMS \xe2\x84\xa2) por su capacidad para detectar mutaciones en muestras de biopsia cl\xc3\xadnicos. Se han evaluado cinco en tiempo real ARMAS ensayos: BRAF 1799T> A, [esto incluye V600E y V600K] y las ANR 182A> G [Q61R] y 181c> A [Q61K] en el melanoma, el EGFR 2573T> G [L858R], 2235- 2249del15 [E746-A750del] en el c\xc3\xa1ncer de pulm\xc3\xb3n no de c\xc3\xa9lulas peque\xc3\xb1as, y compararon los resultados con la secuenciaci\xc3\xb3n del ADN de la mutaci\xc3\xb3n \'puntos calientes\' de estos genes en el tumor incluido en parafina y fijado en formalina ADN (FF-PET). Los ensayos ARMS maximizan el n\xc3\xbamero de muestras que podr\xc3\xadan analizarse cuando tanto la calidad y cantidad de ADN fue baja, y mejoraron tanto la sensibilidad y la velocidad de an\xc3\xa1lisis en comparaci\xc3\xb3n con la secuenciaci\xc3\xb3n. Armas fue m\xc3\xa1s robusta con menos fallos de reacci\xc3\xb3n en comparaci\xc3\xb3n con la secuencia y fue m\xc3\xa1s sensible, ya que fue capaz de detectar mutaciones funcionales que no fueron detectados por secuenciaci\xc3\xb3n del ADN. La secuenciaci\xc3\xb3n del ADN fue capaz de detectar un peque\xc3\xb1o n\xc3\xbamero de baja frecuencia mutaciones recurrentes a trav\xc3\xa9s de los exones seleccionados que no fueron interrogados usando los ensayos ARMS espec\xc3\xadficos en estos estudios. La PCR-ARMS fue m\xc3\xa1s sensible y robusto en la detecci\xc3\xb3n de mutaciones som\xc3\xa1ticas definidos que la secuenciaci\xc3\xb3n de ADN en muestras cl\xc3\xadnicas en las que el tipo de muestra predominante fue FF-PET.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nAn\xc3\xa1lisis de mutaciones puntuales\n_START_PARAGRAPH_\nUna aplicaci\xc3\xb3n com\xc3\xban de PCR-ARMS es la detecci\xc3\xb3n de mutaciones puntuales individuales en el ADN. Se dise\xc3\xb1an cebadores que preferentemente amplificar\xc3\xa1 el alelo mutante, mientras que ser refractario a la amplificaci\xc3\xb3n del alelo normal. Incluido en la mezcla de reacci\xc3\xb3n es un segundo conjunto de cebadores que son espec\xc3\xadficos para un locus heter\xc3\xb3logo que sirve como control positivo para la amplificaci\xc3\xb3n PCR. sistemas de agarosa o en gel de poliacrilamida de electroforesis convencionales se utilizan para resolver el amplic\xc3\xb3n de control desde el amplic\xc3\xb3n mutante. Dado que la eficiencia de la amplificaci\xc3\xb3n es inversamente proporcional a la longitud del amplic\xc3\xb3n, el amplic\xc3\xb3n de control debe ser mayor o cerca en tama\xc3\xb1o con el amplic\xc3\xb3n mutante.4_NEWLINE_Este ensayo distingue entre las muestras que son positivas para la mutaci\xc3\xb3n IVS 8-1 GAEC (homocigotos o heterocigotos) y los que son negativos para la mutaci\xc3\xb3n. Esto es suficiente para aplicaciones donde no es necesario distinguir entre los heterocigotos y homocigotos. Para otras aplicaciones, tales como el an\xc3\xa1lisis de mutaci\xc3\xb3n para los individuos afectados con un trastorno recesivo, puede ser deseable determinar el genotipo de los individuos que son positivos para la mutaci\xc3\xb3n. Esto se puede lograr mediante el cribado de todas las muestras positivas con un segundo ensayo de ARMS-PCR que es espec\xc3\xadfico para el alelo normal y refractario para el alelo mutante. heterocigotos ser\xc3\xa1n positivos para ambos ensayos ARMS-PCR, mientras que los homocigotos ser\xc3\xa1n positivos para el ensayo s\xc3\xb3lo se ARMS-PCR mutante.4_NEWLINE_La especificidad de la PCR-ARMS es tal que las piscinas de las muestras pueden ser examinados para identificar a los portadores de mutaciones raras espec\xc3\xadficas. Este enfoque es capaz de detectar una muestra positiva solo en piscinas de 30 o m\xc3\xa1s muestras.; as\xc3\xad como la necesidad de probar un gran n\xc3\xbamero de muestras individualmente para establecer las frecuencias de poblaci\xc3\xb3n para los alelos mutantes individuales. El sistema de amplificaci\xc3\xb3n de mutaci\xc3\xb3n refractaria (ARMS) es un m\xc3\xa9todo sencillo para detectar cualquier mutaci\xc3\xb3n que implica cambios de bases individuales o peque\xc3\xb1as deleciones. ARMS se basa en el uso de cebadores de PCR espec\xc3\xadficos de secuencia que permiten la amplificaci\xc3\xb3n de ADN de prueba s\xc3\xb3lo cuando el alelo diana est\xc3\xa1 contenida dentro de la muestra. Despu\xc3\xa9s de una reacci\xc3\xb3n ARMS la presencia o ausencia de un producto PCR es diagn\xc3\xb3stico para la presencia o ausencia del alelo diana. Los protocolos detallados aqu\xc3\xad describen m\xc3\xa9todos que se pueden utilizar para analizar el ADN gen\xc3\xb3mico humano para una o m\xc3\xa1s mutaciones. El protocolo b\xc3\xa1sico se describe el desarrollo y la aplicaci\xc3\xb3n de una prueba de ARMS-PCR por una sola mutaci\xc3\xb3n; Protocolo alternativo extiende esta multiplexar ARMS para el an\xc3\xa1lisis de dos o m\xc3\xa1s mutaciones. El Protocolo de Soporte describe un m\xc3\xa9todo de extracci\xc3\xb3n r\xc3\xa1pida de ADN de muestras de sangre o de enjuague bucal que produce ADN compatible con el tipo de pruebas que se describen. ARMS es un m\xc3\xa9todo simple para detectar cualquier mutaci\xc3\xb3n que implica el cambio de una sola base.51_NEWLINE_El polimorfismo de nucle\xc3\xb3tido \xc3\xbanico (SNP) puede secuanciarse o genotipificarse, se consideran actualmente como unas herramientas particularmente valiosas para el diagn\xc3\xb3stico de diferentes patolog\xc3\xadas. Por esta raz\xc3\xb3n, en los \xc3\xbaltimos a\xc3\xb1os una gran cantidad de esfuerzo se ha dedicado al desarrollo de tecnolog\xc3\xadas precisas, r\xc3\xa1pidas y rentables para el an\xc3\xa1lisis de SNP. A pesar de que un gran n\xc3\xbamero de enfoques distintos se ha informado cada laboratorio utilice uno de los m\xc3\xa9todos publicados en funci\xc3\xb3n de su capacidad t\xc3\xa9cnica y econ\xc3\xb3mica. En este art\xc3\xadculo se presenta una aplicaci\xc3\xb3n de un ensayo en el local, ARMS-PCR tetra-cabadores, y su aplicaci\xc3\xb3n en la genotipificaci\xc3\xb3n de SNP. Hemos demostrado que este ensayo podr\xc3\xada ser m\xc3\xa1s ventajoso en comparaci\xc3\xb3n con la PCR-RFLP, PCR en tiempo real, y la secuenciaci\xc3\xb3n del ADN. Hemos demostrado que el ensayo tiene \xc3\xa9xito en el genotipado usando tejidos embebidos en parafina archivados, muestras heparinated y l\xc3\xadquido amni\xc3\xb3tico con meconio. Estos ensayos de baja presupuestado (3 $ / reacci\xc3\xb3n) podr\xc3\xadan completarse tras 3-4 horas despu\xc3\xa9s de la recepci\xc3\xb3n de muestras que permite un tiempo razonable vuelco en el laboratorio. Desde ARMS-PCR tetra-primer ensayo de PCR no requiere ning\xc3\xban equipo especial, el ensayo se podr\xc3\xada establecer en la mayor\xc3\xada de los laboratorios de diagn\xc3\xb3stico cl\xc3\xadnico.,\xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nDetecci\xc3\xb3n de mutaciones comunes en el gen G6PD\n_START_PARAGRAPH_\nLa deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato (G6PD) es la enzimopat\xc3\xada humano m\xc3\xa1s com\xc3\xban. Hasta la fecha, m\xc3\xa1s de 122 mutaciones en el gen de la G6PD se han descubierto, entre los cuales 12 mutaciones puntuales se encuentran en los chinos. Las 2 mutaciones m\xc3\xa1s comunes, G1388A y G1376T, representan m\xc3\xa1s del 50% de las mutaciones que representan diversas regiones y grupos \xc3\xa9tnicos en China. Configuraci\xc3\xb3n de un m\xc3\xa9todo simple y preciso para detectar estas mutaciones no s\xc3\xb3lo es \xc3\xbatil para el estudio de la frecuencia de los genotipos de G6PD, sino tambi\xc3\xa9n para la b\xc3\xbasqueda de nuevas mutaciones. El prop\xc3\xb3sito de este estudio fue encontrar un m\xc3\xa9todo simple, barato y exacto para detectar estas mutaciones comunes. El m\xc3\xa9todo de amplificaci\xc3\xb3n de sistema de mutaci\xc3\xb3n refractaria (ARMS) se utiliz\xc3\xb3 en este estudio. Se investigaron muestras de machos 28 con deficiencia de G6PD. El m\xc3\xa9todo de amplificaci\xc3\xb3n y la digesti\xc3\xb3n con enzimas de restricci\xc3\xb3n natural y no coincidente se utiliza como un m\xc3\xa9todo est\xc3\xa1ndar para evaluar la naturaleza de las mutaciones puntuales. Se encontraron diecis\xc3\xa9is casos que llevan la mutaci\xc3\xb3n G1388A y 12 de la mutaci\xc3\xb3n G1376T. Catorce casos de G1388A y 10 casos de G1376T fueron confirmados por las armas. Cuatro casos no estaban en concordancia con los resultados obtenidos por la digesti\xc3\xb3n con enzimas de amplificaci\xc3\xb3n restricci\xc3\xb3n no coinciden. Estos 4 casos fueron luego juzgados por secuenciaci\xc3\xb3n directa por PCR en el ex\xc3\xb3n 12. Los datos de secuenciaci\xc3\xb3n de ADN apoyaron los resultados obtenidos por las armas. De esta manera llegamos a la conclusi\xc3\xb3n de que las armas es un m\xc3\xa9todo r\xc3\xa1pido, sencillo, econ\xc3\xb3mico y preciso para la detecci\xc3\xb3n de las mutaciones del gen G6PD m\xc3\xa1s comunes entre los chinos.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nDetecci\xc3\xb3n de mutaciones en MUTYH\n_START_PARAGRAPH_\nSe describe un T-ARMS-PCR para la detecci\xc3\xb3n de mutaciones MUTYH, que se asocian con adenomas colorrectales y c\xc3\xa1ncer colorrectal. Mediante el dise\xc3\xb1o de cebadores para la T-ARMS-PCR espec\xc3\xadficos para los ensayos de mutaciones (6 Y165C, G382D, 1395_7delGGA, Y90X, 1103delC, y R231H) seleccionados sobre la base de la frecuencia de su aparici\xc3\xb3n. Tambi\xc3\xa9n hemos dise\xc3\xb1ado un conjunto de 3 ensayos multiplex de T-ARMS-PCR, cada uno para la detecci\xc3\xb3n de 2 mutaciones . Se han probado muestras de ADN de pacientes con poliposis adenomatosa coli atenuado o cl\xc3\xa1sico y no hay mutaciones en la l\xc3\xadnea germinal APC detectables._NEWLINE_Todas las mutaciones se han detectado f\xc3\xa1cilmente tanto con los ensayos de T-ARMS-PCR m\xc3\xbaltiples y espec\xc3\xadficos. Los resultados se confirmaron por an\xc3\xa1lisis de ADN HPLC en los 54 pacientes, y cada mutaci\xc3\xb3n se confirm\xc3\xb3 mediante secuenciaci\xc3\xb3n directa del ADN._NEWLINE_La T-ARMS-PCR no requiere ning\xc3\xban equipo especial, y proporciona una detecci\xc3\xb3n r\xc3\xa1pida, reproducible y rentable de mutaciones MUTYH comunes. Multiplex T-ARMS-PCR permite la detecci\xc3\xb3n de mutaciones 6 MUTYH com\xc3\xban con el uso de tan s\xc3\xb3lo 3 tubos reacciones de PCR. Podr\xc3\xada ser \xc3\xbatil para llevar a cabo grandes estudios epidemiol\xc3\xb3gicos poblacionales._NEWLINE_En contraste, T-ARMS-PCR amplifica tanto de tipo salvaje y los alelos mutantes, junto con un fragmento de control, en una reacci\xc3\xb3n de PCR en un solo tubo. La regi\xc3\xb3n flanqueante de la mutaci\xc3\xb3n es amplificado por 2 cebadores comunes (exteriores), produciendo un amplic\xc3\xb3n de control no alelo-espec\xc3\xadfica. Dos alelo-espec\xc3\xadfica (interior) se dise\xc3\xb1an cebadores en orientaci\xc3\xb3n opuesta y, en combinaci\xc3\xb3n con los cebadores comunes, puede amplificar simult\xc3\xa1neamente tanto la de tipo salvaje y los amplicones mutantes. Los 2 amplicones espec\xc3\xadficos de alelo tienen longitudes diferentes y se pueden separar f\xc3\xa1cilmente por electroforesis en gel est\xc3\xa1ndar, ya que la mutaci\xc3\xb3n se encuentra de forma asim\xc3\xa9trica con respecto a los cebadores comunes (exteriores). Debido a que el amplic\xc3\xb3n de control y al menos 1 de los 2 amplicones espec\xc3\xadficos de alelo son siempre presente, T-ARMS-PCR proporciona un control interno con respecto a falsos negativos, as\xc3\xad como la falta de amplificaci\xc3\xb3n. Adem\xc3\xa1s, la presencia de tipo salvaje y mutantes amplicones al\xc3\xa9licas permite la f\xc3\xa1cil interpretaci\xc3\xb3n de los resultados de PCR._NEWLINE_Se dise\xc3\xb1\xc3\xb3 un T-ARMS-PCR para cada uno de los 6 mutaciones siguientes seleccionados sobre la base de su frecuencia en la literatura y en una serie de pacientes: Y165C, G382D , 1395_7delGGA, Y90X, 1103delC, y R231H. Seg\xc3\xban los informes sobre el an\xc3\xa1lisis de mutaci\xc3\xb3n sistem\xc3\xa1tica de todo el gen, la detecci\xc3\xb3n de estos 6 mutaciones identificar\xc3\xada al menos 85% de los pacientes con mutaciones MUTYH bial\xc3\xa9licos._NEWLINE_Para llevar a cabo incluso genotipificaci\xc3\xb3n r\xc3\xa1pida, se hab\xc3\xada dise\xc3\xb1ado un conjunto de 3 T-ARMS-PCR m\xc3\xbaltiples para la detecci\xc3\xb3n de estas mutaciones 6 MUTYH frecuentes: mutaciones Y165C relativamente frecuente y G382D; las mutaciones 1103delC y 1395_7delGGA; y las mutaciones R231H y Y90X.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nDiagn\xc3\xb3stico molecular\n_START_PARAGRAPH_\nUna funci\xc3\xb3n principal de los diagn\xc3\xb3sticos moleculares es la detecci\xc3\xb3n de mutaciones y polimorfismos de nucle\xc3\xb3tido \xc3\xbanico (SNPs) que se asocian con fenotipos particulares. Una variedad de estrategias se han desarrollado utilizando cebadores que son complementarios y permitir la amplificaci\xc3\xb3n espec\xc3\xadfica de alelos individuales. PCR-ARMS y PCR-ASO han sido ampliamente utilizados en la investigaci\xc3\xb3n y el diagn\xc3\xb3stico molecular desde su desarrollo inicial a finales de 1980. La atracci\xc3\xb3n de estos m\xc3\xa9todos radica en su simplicidad y la aplicabilidad al an\xc3\xa1lisis de pr\xc3\xa1cticamente cualquier punto de mutaci\xc3\xb3n conocido o SNP. Adem\xc3\xa1s, estos m\xc3\xa9todos no requieren costos muy altos e instrumentaci\xc3\xb3n sofisticada.\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nSarampi\xc3\xb3n\n_START_PARAGRAPH_\nWakukouomou y sus colegas publicaron su estudio en la revista Journal of Clinical Microbiology (virus del sarampi\xc3\xb3n Genotipado por el sistema de amplificaci\xc3\xb3n refractario a las mutaciones-PCR en tiempo real representa una aproximaci\xc3\xb3n r\xc3\xa1pida para las investigaciones de brotes de sarampi\xc3\xb3n J Clin Microbiol 2006; 44 (2):. 487-494)._NEWLINE_"La PCR en tiempo real se ha desarrollado para determinar el genotipo del virus del sarampi\xc3\xb3n (MV) de cultivos. Cepas circulantes en epidemias en Gab\xc3\xb3n en 1984, en Camer\xc3\xban en 2001, en Marruecos en 2003 y en Francia en 2004 fueron investigados"_NEWLINE_D. Wakukouomou y sus colegas en el INSERM, U404 en Lyon, _NEWLINE_"Desarrollamos un sistema de amplificaci\xc3\xb3n refractario a las mutaciones-PCR en tiempo real (RT-PCR AMRS) utilizando SYBR GREEN una fluor\xc3\xb3foro verde._NEWLINE_"Seis pares de cebadores para la RT-PCR ARMS fueron dise\xc3\xb1ados para amplificar espec\xc3\xadficamente los genotipos A, B2, B3.1, B3.2, C2, y D7. Genotipos podr\xc3\xada diferenciarse por fusi\xc3\xb3n de an\xc3\xa1lisis de la curva. Todas las cepas tambi\xc3\xa9n se confirmaron por secuenciaci\xc3\xb3n directa "._NEWLINE_"La utilizaci\xc3\xb3n del resultado obtenido por secuenciaci\xc3\xb3n directa y el an\xc3\xa1lisis filogen\xc3\xa9tico como la referencia, la exactitud de MV por RT-ARMS PCR y an\xc3\xa1lisis de la curva de fusi\xc3\xb3n fue de 97%. Sin embargo, el \xc3\xbaltimo m\xc3\xa9todo es m\xc3\xa1s r\xc3\xa1pido y sensible que el primero."_NEWLINE_"Este m\xc3\xa9todo podr\xc3\xada ser una herramienta \xc3\xbatil para estudios epidemiol\xc3\xb3gicos moleculares de MV, proporcionando una alternativa eficiente para estudios a gran escala." \xe2\x80\x8b\xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nVentajas\n_START_PARAGRAPH_\nLa PCR-ARMS es ideal para muchas aplicaciones de diagn\xc3\xb3stico molecular, particularmente aquellos que requieren la detecci\xc3\xb3n de un n\xc3\xbamero relativamente peque\xc3\xb1o de mutaciones puntuales y tener rendimientos bajos a moderados. La principal ventaja de la PCR-ARMS es la facilidad con que se pueden desarrollar ensayos m\xc3\xbaltiples, validados e implementados. Por otra parte, las pruebas son no radiactivas y no requieren sistemas de detecci\xc3\xb3n caras y sofisticadas. Es r\xc3\xa1pido, fiable y no isot\xc3\xb3pico. La multiplexaci\xc3\xb3n en un solo tubo es posible con los fluor\xc3\xb3foros m\xc3\xa1s recientes.,\xe2\x80\x8b \xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nDesventajas\n_START_PARAGRAPH_\nLa limitaci\xc3\xb3n m\xc3\xa1s importante de PCR-ARMS es que puede ser utilizada para detectar solamente mutaciones conocidas y polimorfismos. Como tal es necesario combinar ARMS PCR con otras estrategias de diagn\xc3\xb3stico molecular (por ejemplo, de secuenciaci\xc3\xb3n) para proporcionar una detecci\xc3\xb3n completa de la mutaci\xc3\xb3n. En sus formatos m\xc3\xa1s simples, tales como los descritos en este cap\xc3\xadtulo, PCR-ARMS puede ser poco pr\xc3\xa1ctica para aplicaciones que implican un gran n\xc3\xbamero de mutaciones o de alto rendimiento. Para tales aplicaciones, considere el uso de ensayos de ARMS-PCR con las estrategias de detecci\xc3\xb3n de alelos que son m\xc3\xa1s susceptibles a la automatizaci\xc3\xb3n. El formato original no distingu\xc3\xada entre homocigotos y heterocigotos, sin embargo, ahora con la tecnolog\xc3\xada de indicadores fluorescentes s\xc3\xad se puede distinguir entre los homocigotos y heterocigotos.,\xe2\x80\x8b  \xe2\x80\x8b\n_START_SECTION_\nKits comerciales\n_START_PARAGRAPH_\nCF29v2, CF30, CF-polyT = ARMS m\xc3\xbaltiple (cuatro tubos, el n\xc3\xbamero de cebadores en una \xc3\xbanica reacci\xc3\xb3n); CF4v2 y CF-EU2 = ARMS fluorescentes m\xc3\xbaltiple (1 metro). Los dos ejemplos son kits que comercializa Gen-Probe Life Sciences.\xe2\x80\x8b'