천연두의 진단은 섭씨 38.3도 이상의 급성 발열 및 그 이후 발생하는, 다른 명백한 이유가 없는 수포성 또는 농포성 발진의 확인으로 이루어진다

현미경으로 보면 두바이러스는 특유의 세포질 봉입을 나타낸다. 가장 중요한 것은 소위 과리네리체로서 이곳이 바이러스 복제의 장소가 된다. 과리네리체는 헤마톡실린 및 에오신을 염색하는 생체조직검사에서 쉽게 확인될 수 있으며 분홍색 얼룩처럼 보인다. 과리네리체는 모든 두바이러스 감염증에서 발견되지만 과리네리체의 부재가 곧 천연두가 아님을 확정할 수 있는 근거는 될 수 없다. 농포 속의 유체나 딱지를 전자현미경 검사해 보면 오르토두바이러스 감염을 빠르게 진단할 수 있다. 그러나 모든 오르토바이러스들은 전자현미경으로 보았을 때 모두 똑같은 벽돌모양 비리온을 나타낸다

실험실에서는 미리 정의된 온도 환경에서 닭의 배아 장요막에 바이러스를 배양시키고 그 결과 발생한 마맛자국 발진을 검사함으로써 천연두바이러스를 확정적으로 확인할 수 있다. DNA 가닥은 폴리메라아제 연쇄반응(PCR) 및 제한효소 단편 다형성(RFLP) 분석을 통해 특징지을 수 있다. 혈청학 검사와 효소연결 면역흡착측정법(ELISA)에서는 천연두바이러스 특유의 항면역 글로블로빈과 항원을 검사함으로써 천연두 감염 여부의 진단을 도울 수 있다. 

수두가 천연두와 매우 흔히 혼동되곤 했다. 수두와 천연두는 다양한 방법으로 구분할 수 있다. 천연두와 달리 수두는 대개 손바닥과 발바닥에 발진이 나지 않는다. 또 수두는 농포마다 수포 분출 시기가 달라서 농포의 크기가 농포마다 제각각이지만 천연두는 바이러스의 효과가 보다 일정하게 진행되어 농포들의 크기가 거의 모두 똑같다. 천연두로 의심되는 감염사례가 사실 수두인지 아닌지 구분하는 다양한 실험실 방법들이 마련되어 있다
천연두와 비슷하여 흔히 헷갈리는 병명은 무엇인가요?
수두