
Американские ученые разработали простой, быстрый и надежный
метод получения человеческих индуцированных нервных стволовых клеток (hiNSC). Отчет
о работе опубликован в журнале Stem Cell Reports.
 
Человеческие нейроны необходимы для проведения множества
нейробиологических и доклинических исследований. По понятным причинам добыть
нервные клетки непосредственно из мозга невозможно (за исключением абортивного
или трупного материала, однако это вызывает много этических вопросов, и такие клетки
плохо культивируются на питательной среде). Поэтому в большинстве случаев
ученые либо пользуются иммортализированными (бессмертными) клеточными линиями,
подходящими далеко не для всех целей, либо получают нейроны из индуцированных
плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Последний метод также имеет ряд недостатков: он занимает
много времени, требует множества сложных в выполнении промежуточных стадий и
приводит к неоднородной дифференцировке итоговых нейронов.
 
Чтобы преодолеть эти сложности, сотрудники Университета
Тафтса использовали прямое перепрограммирование фибробластов кожи и стволовых
клеток жировой ткани в hiNSC. Для этого они с помощью обезвреженного вируса ввели
в клетки гены нескольких факторов транскрипции, управляющих дифференцировкой клеток (OCT4,
KLF4, SOX2 и c-MYC). Причем работа этих генов происходила без встраивания в геном, что дало возможность впоследствии удалить посторонний генетический материал. После
этого клетки поместили на среду с питающим слоем мышиных эмбриональных
фибробластов и получили растущие колонии hiNSC.
 
После этого колонии превратили в суспензию из отдельных
клеток и поместили их на питательную среду. Уже
на четвертый день клетки начали спонтанно дифференцироваться в зрелые нейроны (на поверхности которых появились характерные биомаркеры и белки, необходимые для формирования синапсов) и
глиальные клетки (вспомогательные клетки нервной ткани). Причем соотношением
типов клеток можно было управлять, меняя состав питательной среды. Кроме того,
полученные клеточные линии hiNSC хорошо выдерживали множественные пересевы на
питательных средах и хранились в замороженном виде.
 
После восьминедельной инкубации на специальных средах
полученные из hiNSC нейроны демонстрировали все признаки зрелости: поддерживали
мембранный потенциал от −50 до −70 милливольт, генерировали спонтанные и
вызванные потенциалы действия и реагировали на добавление фармпрепаратов, в
частности ингибиторов и стимуляторов тормозных ГАМК-рецепторов.
 
В следующем эксперименте ученые ввели hiNSC в нервную трубку
куриных эмбрионов. В зависимости от непосредственного окружения клетки
дифференцировались в разные типы нейронов и встроились как в центральную
нервную систему, так и в периферическую нервную ткань формирующейся конечности,
не теряя своей формы и функции в присутствие клеток других тканей.
 
В заключение исследователи поместили hiNSC в разработанную
ими модель мозга, которая была сделана из покрытого ламинином шелкового каркаса и коллагенового геля.
Через три недели у дифференцированных нейронов появились длинные отростки и
наблюдалась активная электрическая деятельность, что свидетельствует об их
функциональности.
 
Исследователи отмечают, что их методика позволяет стабильно
и быстро получать hiNSC для широкого круга лабораторных экспериментов, однако в
текущем виде не готова к клиническому применению, поскольку требует
использования животных материалов. Ученые продолжают совершенствовать
разработанную технологию и планируют модифицировать ее для моделирования
различных заболеваний мозга.
 
«Быстрая дифференцировка клеток ускоряет проведение
исследований. Другие модели мозга, находящиеся в стадии разработки, часто
требуют месяцев для формирования аналога нервной ткани. При использовании
нашего матрикса клетки уже через несколько недель формируют нейронные сети», —
отметила первый автор работы Дана Кэирнс (Dana Cairns).
 
В последнее время нейробиологи достигли немалых успехов в
манипуляциях с нервными клетками. Так, например, они научились управлять
нервными клетками с помощью радиоволн, «сваривать» их лазером, создавать
искусственные нейронные ансамбли памяти и печатать аналог мозговой ткани на
3D-принтере.
Олег Лищук
