Pa producir bones alliniadures ye importante la eleición duna función de puntuación que reflexe observaciones biolóxiques o estadístiques sobre secuencies conocíes. Les secuencies de proteínes son alliniaes usando frecuentemente matrices de sustitución que reflexen les probabilidaes de particulares sustituciones calter per calter. Una serie de matrices denominaes matrices PAM (del inglés Point Accepted Mutation, mutación puntual aceptada, orixinalmente definíes por Margaret Dayhoff, polo que dacuando se denominen matrices Dayhoff) codifican explícitamente los aproximamientos evolutivos considerando les frecuencies y probabilidaes de mutaciones particulares daminoácidos. Otra serie común de matrices de puntuación, conocíes como BLOSUM (del inglés Blocks Substitution Matrix, matriz de sustitución de bloques), codifica probabilidaes de sustitución derivaes empíricamente. Utilícense variantes de dambos tipos de matrices pa detectar secuencies con distintos niveles de diverxencia, dexando asina a los usuarios de BLAST o FASTA acutar les sos busques a coincidencies más cercanamente rellacionaes, o estendeles pa detectar secuencies más diverxentes. Les penalizaciones por gaps representen la introducción de buecos (nel modelu evolutivu, una mutación por insertamientu o borráu) en secuencies tantu de nucleótidos como de proteínes, y estos valores de penalización, poro, tendríen de ser proporcionales a la frecuencia esperada de tales mutaciones. La calidá de les alliniadures producíes depende, arriendes dello, de la calidá de la función de puntuación.