【0199】以上のように、糖分子を4単位あるいは2単位集合させたリガンドを合成した。以下これらのリガンドを用いてタンパク質との相互作用をSPR測定により解析した。【0200】〔実施例5・SPR法を用いた糖分子とタンパク質との特異的相互作用〕SPR測定ではアナライトがリガンド以外の分子と非特異的に相互作用する場合が多い。そのため実際の測定では、特異的な相互作用と非特異的なものとが合わさった共鳴角度変化を観測している。非特異的な相互作用を低減し、特異的な相互作用を観測するということが測定上の最大の問題点となる。本発明者らは、この問題点を次の方法(2チャンネル解析法と称する)により解決できるのではないかと考えた。LAB)には、(S),(R)という2つのチャンネルがあり、図3に示すように、それぞれの表面上のリガンドとアナライトとの相互作用を同時に観測できる。A)をこれら2つの表面に同時に同条件で流すとする。Aは4-Malの末端に存在するグルコピラノースと結合するが、これを持たない4-Glcとは結合しにくいと考えられる。Aとの相互作用に差があるとすれば、4-Malに存在するグルコピラノースに起因すると考えられる。Aとの特異的な相互作用に相当する。【0202】このように2種類の異なるリガンドを(S)と(R)とにそれぞれ固定化し、両者の相互作用の差を観測するという従来の手法を応用し、末端の糖の有無以外は同じ構造を持つ化合物をリガンドとして用いることによって、糖分子とタンパク質との特異的な相互作用が検出できることを本発明者らは見いだした。リガンド導入チップの作製)初めに、SPR測定により糖分子とタンパク質との相互作用解析を行うために、センサチップにリガンドを固定化した。実施例4で合成したリガンドをビオチン-アビジンの結合を利用してチップ上に固定化させ、リガンド導入チップ(リガンド担持体)を得た。アビジンをSPRセンサチップ上に固定化させてから、リガンドを固定化した。【0204】具体的にリガンド導入チップを得るために、以下のような操作を行った。初めに、13×20×0.7mmのガラス基盤に50nmの金薄膜を蒸着した日本レーザー電子株式会社製のセンサチップを、UVオゾンクリーナー(商品名:NL-UV253、日本レーザー電子株式会社)に入れて紫外線を20分間照射し、オゾンでセンサチップの表面を洗浄した。Scientific社)。チップに4-チオ酪酸を、金-硫黄結合を用いて固定させた。1,4-Dioxan溶液9mLとの混合溶液の入ったシャーレに浸し、室温で30分間緩やかに振とうさせた。シャーレに水10mLを加え室温で5分間振とうさせて、活性化反応を終了させた。チップを水で4回洗浄し風乾後、SPR670のセンサチップカートリッジに取り付けた。センサチップカートリッジに取り付けたチップにランニングバッファーを流し、レーザー光を金膜に照射させ、そのとき観測される表面プラズモン共鳴角度変化をモニターした。ランニングバッファーは、pH7.4のリン酸緩衝溶液(PBS)を用い、サンプルを流すとき以外は、常にランニングバッファーを流速5mL/minでチップ上に流した。filter)を用いてろ過してから使用した。5.5)を,流速5μL/minで60μLずつ3回流した。SPRでサンプル溶液を流した後はランニングバッファーに切り替え、余分なサンプルを洗い流して、共鳴角度変化が一定になってから次の操作を行った。8.5)を流速5μL/minで60μLずつ2回流し、アビジン付加チップ(アビジン付加体)を得た。【0206】続いて、種々の濃度の実施例4で得たリガンドのPBS溶液を、流速10μL/minで60μLずつ順に流し、上記アビジン付加チップ上にリガンドを固定化させ、リガンド導入チップ(リガンド担持体)を得た。リガンドの固定化はSPRセンサーグラムでレゾナンスユニットの上昇が認められなくなるまで繰り返えした。【0207】リガンドを固定化させるまでのSPRセンサーグラムの一例を図4に示す。ここではSチャンネル(以下(S)と略称する)には上記実施例4の(4-3)で得た4-Mal、Rチャンネル(以下(R)と略称する)には4-Glcを固定化させた時のセンサーグラムを表示した。Unit))を示している。以下PBSと略称する)が流速5μL/minで絶えず流れている。チップ上へのアナライトの添加が終了すると、自動的にPBSが流れて、結合に関与しなかった余分なアナライトを洗浄するようにした。5.5)を流速5μL/minで60μL流すと、共鳴角度の増加が観測され、ニュートロアビジンが上記チップに固定化されたことが分かった。【0209】その後チップ上に残存する活性エステルをキャッピングするため、1.0Mエタノールアミンを含むPBS溶液を、流速5μL/minで60μL流した。キャッピングの後、共鳴角度変化が一定になった時点と、ニュートロアビジン溶液を流す前と後との共鳴角度変化量を固定化量とした。このセンサーグラムでの固定化量は(S)が3690RU、(R)が3480RUとなった。4-Glc溶液を流速10μL/minで60μL流して固定化した。固定化されなかった過剰なリガンドを洗い流し、共鳴角度変化が一定になった時点と、固定化前との共鳴角度変化量をリガンドの固定化量とした。リガンドの固定化は、集合体を流しても固定化量が増えない状態に達するまで繰り返し行った。このセンサーグラムでの4-Malの固定化量は220RU、4-Glcの固定化量は220RUとなり、2種類の異なるリガンドが同程度に固定化されたリガンド導入チップが作製できた。同様の手法でリガンドの異なる種々のリガンド導入チップを作製した。リガンドの固定化についての検証)合成したリガンドが、ビオチン-ニュートロアビジンの結合によりチップ上に固定化されているかどうかを、ビオチンを持たない比較例1で得たアセチルリンカー15によりマルトースを集合化させた化合物18(Ace-8-Mal)を用いてSP測定で検証した。5.3-Malと同じ条件で、Ace-8-Malをニュートロアビジンが固定化されたチップ上に流し、これが固定化されなければ、非特異的なリガンドの固定化がないことを確認できる。【0212】まず、上記(5-1)と同様にニュートロアビジンを固定化させたアビジン付加チップを作製した。このときのニュートロアビジンの固定化量は、(S)が6620RU、(R)が6330RUであった。このチップの(S)に順に、0.61μMのAce-8-Mal溶液、5.48μMのAce-8-Mal溶液、0.61μMの5.3-Mal溶液、5.48μMの5.3-Mal溶液を、流速10μL/minで60μL流し、(R)にはPBSだけを流し続けた。このときの(S)と(R)との差に相当する(D)のセンサーグラムを重ねて描いたのが、図5である。同図では、Ace-8-MalはAce-Ma1と、5.3-MalはBio-Malと表記している。【0213】図5に示すように、SPR測定の結果からビオチンを含む5.3-Malが特異的にチップ上に固定化され、ビオチンを含まないAce-8-Malは、全く固定化されなかった。したがって、ビオチンリンカーを用いて糖分子を集合化した化合物(リガンド)は、ビオチン-アビジン(ニュートロアビジン)の結合によって特異的にチップ上に固定化することができた。リガンド導入チップを用いた糖分子とレクチンとの相互作用)上記(5-1)で得られたリガンド導入チッップに、種々の濃度のタンパク質のPBS溶液を、流速20μL/minで60μLずつ流し、SPR測定により、リガンド導入チップとタンパク質との結合及び解離の挙動を観測した。【0215】なお用いたタンパク質は以下の通りである。KOGYO)なお、上記タンパク質が導入されたリガンド導入チップは、該リガンド導入チップ表面に、10mMの水酸化ナトリウム水溶液を60μL/minで60μL流すことによって解離させ再生させて、再使用した。Unit))になるまで、1~3回繰り返して行った。Aとの相互作用を調べた。上記(5-1)と同様にチップにニュートロアビジンを固定化させ、アビジン付加チップを得た。このときのニュートロアビジンの固定化量は、(S)が5470RU、(R)が4380RUであった。その後、アビジン付加チップの(S)に5.3-Malを、(R)に8-Glcを固定化し、リガンド導入チップを得た。リガンドの固定化量は、(S)は390RU、(R)は390RUであった。A溶液を流速10μL/minで60μL流した。このとき観測された(S)、(R)および両者の差に相当する(D)の共鳴角度変化を図6に示す。Aとが結合して、(S)、(R)とも共鳴角度が上昇した。Aが完全に解離したことが分かった。同図中の(D)は、結合、解離を表す典型的なSPRセンサーグラムと同様になった。Aとグルコピラノースとの特異的な相互作用を観測できた。Aを作用させ相互作用をSPR測定した。BSA、およびPSAとの相互作用についてもSPR測定し共鳴角度変化観測した。【0219】以上の結果から、次の以下のことが明らかとなった。合成したビオチンリンカーによって糖分子を集合化させたリガンドは、アビジン(ニュートロアビジン)を固定化させたチップ上に固定化することができる。Aとグルコピラノースとの特異的な相互作用を解析することができる。【0220】また、リガンド導入チップを用いた「2チャンネル解析法」によって、タンパク質との非特異的な相互作用を打ち消すことができると結論した。ConAと同様に、グルコピラノース認識レクチンであるPSAが特異的に相互作用しなかったことから、糖認識能をもつレクチンでも、チップ上に固定化された糖分子とは結合の程度に差が出るということが分かった。PNA溶液を流し、SPR測定して共鳴角度変化観測した。【0222】糖分子の集合化の度合いによるレクチンとの相互作用の違いについて、得られた結果をまとめて表1に示した。【0223】【表1】【0224】表1より、解離定数(KD)は値が小さいほど分子間の結合が強いことを表している。表1を用いて、同じアナライトに対する解離定数を比較すると、4単位の糖分子が集合した系が、2単位の系の約2/3の値であることがわかる。Aとの結合が強くなったことが確認された。Aとリガンドとの結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)を比較すると次のことが明らかになった。両者の結合速度には差がないが、解離速度は、糖分子を4単位有するリガンドが2単位のもの約1/2の値であり、比較的大きな差が見受けられた。Aが解離しにくい状況にあるということが分かった。Aが解離した後に再結合する機会が増えて解離速度が低下し、この影響により解離定数が小さな値になったと考えられる。この結果から本発明のリンカー化合物は糖分子を集合化させ、クラスター効果によって相互作用する分子との結合を強めることが確認された。【0226】次に、糖分子を変えて、ガラクトースとガラクトース認識レクチンの相互作用を解析した。上記(5-1)で得た末端のガラクトースの有無だけが異なる4-Lacと4-Glcとをニュートロアビジンチップに固定化したリガンド導入チップを用いた。濃度の異なるRCA120、また、PNAを用いて上記と同様のSPR測定を行った。PNA溶液を流してSPR測定を行い、共鳴角度変化(D)を観測した。これらの観測結果から、ラクトースを集合化させたリガンドを用いれば、ガラクトースとガラクトース結合レクチンRCA120及びPNAとの特異的な相互作用を解析することができることが明らかになった。【0227】以上により得られたSPR測定の結果から以下のことが言える。1)本研究で合成したリンカーを用いて糖分子を集合化させたリガンドを、ビオチン-アビジン(ニュートロアビジン)の結合によってSPRセンサチップ上に固定化させることができた。2)「2チャンネル解析法」と称される、末端の糖分子以外が同じ構造である対照リガンドを用いる方法によって、SPR測定で一番問題となる非特異的な相互作用を相殺して、糖とタンパク質との特異的な相互作用を検出することを可能にした。3)集合化度の異なる糖リガンドを固定化させた糖チップを用いることによって、クラスター効果による糖分子とレクチンとの結合の増強を観察することができた。【0228】以上のように、本発明のリンカー化合物は、糖分子を集合化し、得られる集合体(リガンド導入チップ)は、SPR測定によるレクチンと糖との相互作用解析に充分適用できるものである。アフィニティカラム作製)実施例4で合成したリガンドを用いてアフィニティカラムを作製した一般に行われているアフィニティカラムの作製法に従い、実施例4で得られたリガンド4-Malを固定化したアフィニティカラムを作製した。基)、アミノ基を持つ化合物を担体上に固定化させるのに適している。アフィニティーカラムの作製手順の概略を図6に示す。mL)を用いて、カラムの下端から流出する溶液が毎秒1滴の流速となるよう手動で行った。μm)を用いてろ過したものを用いた。バッファーとして以下の1~3の溶液を調製した。)1mLに、氷冷した1mM塩酸1mLを通じ充填されていたイソプロパノールを除去した。カップリングバッファー溶液1mLを通じ、密栓し室温で30分放置した。次にブロッキングバッファー6mLを通じて密栓し、室温で30分放置したあと、洗浄バッファー6mL、ブロッキングバッファー6mL、PBS6mLを順に通じた。その後0.5mg/mLのリガンド(4-Mal)PBS溶液を1mL通じ、密栓し室温で30分放置した。その後PBS5mLを通じて過剰なリガンドを洗い流した。アフィニティクロマトグラフィ)上記(6-1)で得られたアフィニティカラムを用いて、リガンドと相互作用するタンパク質と、相互作用しないタンパク質とを分離した。用いたタンパク質は以下の3種類である。Aは4-Malと強く結合し、水酸化ナトリウム水溶液によって解離することが分かっている。PSAおよびBSAは特異的に相互作用しないことも分かっている。4-Malに結合してカラムに保持され、それ以外は素通りして溶出されると予想した。水酸化ナトリウムを含むPBS溶液をカラムに通じることで溶出されると考えられる。結合阻害剤としてグルコース溶液をカラムに通じても溶出されると考えた。このアフィニティクロマトグラフィの手順を、図7示す。なるように調整したタンパク質混合PBS溶液1mLを通じ、密栓し5分室温で放置した。