【0050】次に、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーについて説明する。本発明の口腔癌の腫瘍マーカーは、Akt1遺伝子の発現をマーカーとして利用するものである。本発明において、「口腔癌の腫瘍マーカー」とは、口腔癌細胞の目印(マーカー)になる物質であって、口腔癌の診断や治療の判断基準として役立つ物質の総称をいう。本発明の口腔癌の腫瘍マーカーにおいて、マーカーとなる物質は、Akt1、Akt2又はAkt3遺伝子の転写産物であるAkt1、Akt2又はAkt3mRNA、前記転写産物の翻訳産物であるAkt1、Akt2又はAkt3タンパク質、リン酸化Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質、Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質及び/又はリン酸化Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質に対する自己抗体の少なくとも一つである。制限されないが、例えば、リンパ節、唾液、血液等である。本発明の口腔癌の腫瘍マーカーにおいて、腫瘍マーカーが「陽性」であるとは、腫瘍マーカーの測定値が、所定のしきい値より大きい場合のことをいう。前記しきい値は、当該技術分野の当業者であれば、例えば、健常者や良性の腫瘍患者における前記腫瘍マーカーの数値を統計学的に処理した値に基づいて定めることができる。前記しきい値としては、例えば、健常者や良性の腫瘍患者等の平均の値の3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、及びそれ以上の値があげられる。【0051】前記Akt1mRNAの塩基配列は、前述のとおり、GenBankアクセッション番号(2005年10月31日付)NM_005163、NM_001014431及びNM_001014432に登録されている。前記Akt1タンパク質は、配列表の配列番号9のアミノ酸配列からなるAkt1タンパク質である。前記リン酸化Akt1タンパク質のリン酸化部位は、配列表の配列番号9の第473番目のセリン(Ser473)である。前記Akt2mRNAの塩基配列は、前述のとおり、GenBankアクセッション番号(2006年8月20日付)がNM_001626に登録されている。前記Akt2タンパク質は、配列表の配列番号18のアミノ酸配列からなるAkt2タンパク質である。前記リン酸化Akt2タンパク質のリン酸化部位は、配列表の配列番号18の第474番目のセリン(Ser474)である。前記Akt3mRNAの塩基配列は、前述のとおり、GenBankアクセッション番号(2006年8月20日付)がNM_005465に登録されている。前記Akt3タンパク質は、配列表の配列番号27のアミノ酸配列からなるAkt3タンパク質である。前記リン酸化Akt3タンパク質のリン酸化部位は、配列表の配列番号27の第472番目のセリン(Ser472)である。相違があるものであっても、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーに含まれる。前記数個とは、例えば、2、3、4個である。前記Akt1、Akt2又はAkt3mRNA及び前記Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質の一部分も本発明の口腔癌の腫瘍マーカーに含まれる。【0052】次に、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーの使用方法について説明する。本発明の口腔癌の腫瘍マーカーの使用方法としては、特に制限されず、従来公知の腫瘍マーカーと同様の使用方法にて使用できるが、例えば、被検者から被検試料を準備する準備工程と、前記被検試料中に本発明の口腔癌の腫瘍マーカーを検出する検出工程と、前記腫瘍マーカーが陽性か否かを判定する判定工程とを含む使用方法があげられる。前記準備工程において、被検者から被検試料を準備する。次に、前記検出工程において、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーのマーカー物質であるAkt1、Akt2又はAkt3mRNA、Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質、リン酸化Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質、抗Akt1、Akt2又はAkt3若しくは抗リン酸化Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質自己抗体等を、後述するように、それぞれ、例えば、従来公知の方法等を用いて検出し、最後に、前記判定工程において、前記腫瘍マーカーが陽性か否かを判定する。検出対象は1種類に限られず、例えば、Akt1、Akt2及びAkt3のマーカー物質のいずれか2種類又は3種類を組み合わせて使用することも好ましい。【0053】前記判定工程における本発明の口腔癌の腫瘍マーカーが陽性か陰性かの判定は、前述のとおり、例えば、健常者等の値を基準として設定するしきい値と比較して判定することができる。situハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットプロット、RNaseプロテクションアッセイ等のほか、マイクロアレイを用いる方法、リアルタイムPCR法等のPCRを利用する方法、前記RNAを直接測定する方法等の迅速な測定が可能な方法があげられる。前記定量は、前記判定工程において前記しきい値との比較ができる相対的な定量であってもよく、例えば、適当な内部標準や外部標準を利用することができる。【0055】前記マイクロアレイを用いる方法としては、前記Akt1、Akt2又はAkt3mRNAに対応するプローブが配置されたマイクロアレイを準備し、このマイクロアレイに、前記被検試料中の前記Akt1、Akt2又はAkt3mRNAを鋳型として調製した標識化ターゲットをハイブリダイズさせ、前記プローブに結合した前記ターゲットの標識シグナルを測定して前記RNA鎖を定量する方法があげられる。前記リアルタイムPCR法としては、例えば、被検試料のトータルRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、このcDNAを鋳型に前記マーカー転写産物領域をPCRで増幅し、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングして解析する方法があげられる。Technologies社)RNAアッセイ等があげられる。前記Akt1mRNAを検出する方法としては、これらの方法に限られず、種々の定量方法を適用できる。前記抗体は、前記Akt1タンパク質等を用いた従来公知の方法で作製してもよく、市販のものを購入してもよい。前記抗体は、ポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。【0057】本発明の口腔癌の腫瘍マーカーにおける前記Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質及び/又はリン酸化Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質に対する自己抗体を検出する方法としては、特に制限されないが、例えば、前記自己抗体の抗原であるAkt1、Akt2又はAkt3タンパク質及び/又はリン酸化Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質を固相に固定化し、前記自己抗体と抗原抗体反応により複合体を形成させ、さらに、前記自己抗体に対する標識抗体により前記複合体を検出する方法等が挙げられる。【0058】次に、本発明の検出キットについて説明する。本発明の検出キットは、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーの検出するためのキットである。本発明のキットは、第1の態様として、前記マイクロアレイを含む検出キットが挙げられる。検出前記キットには、さらに、被検試料からトータルRNAを調製するプライマーや試薬、ターゲットを調製するための標識化された本発明のプライマーや試薬等を含んでもよい。前記試薬としては、従来公知の試薬が利用でき、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、標識化合物、バッファー等があげられる。本発明の検出キットは、第2の態様として、前述のPCR等の遺伝子増幅技術を用いたAkt1、Akt2又はAkt3mRNA検出/測定方法に使用するプローブやプライマーを含むキットが挙げられる。これらのプローブやプライマーの配列は、特に制限されず、当業者であれば容易に設定可能である。前記検出キットは、例えば、マイクロアレイを製造する場合や、リアルタイムPCR法により検出する場合に使用できる。本発明の検出キットは、第3の態様として、Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質に対する抗体を含む検出キットが挙げられ、例えば、ウェスタンブロット、ELISA等の前記ポリペプチドの免疫学的測定に使用できる。第4の態様として、自己抗体の抗原であるAkt1、Akt2又はAkt3タンパク質及び/又はリン酸化Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質、並びに、前記自己抗体に対する標識化抗体を含む検出キットが挙げられ、例えば、上述したとおり、自己抗体の免疫学的測定に使用できる。前記自己抗体を検出することで、間接的にAkt1、Akt2又はAkt3遺伝子の発現を検出できる。前記Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質及び/又はリン酸化Akt1、Akt2又はAkt3タンパク質は、固相に固定化されていることが好ましい。本発明の検出キットは、上述のいずれの態様においても取扱説明書を含んでもよい。【0059】さらに、本発明は、口腔癌の診断方法であって、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーを使用することを含む口腔癌の診断方法を含む。本発明は、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーの使用であって、口腔癌の診断における本発明の口腔癌の腫瘍マーカーの使用を含む。【0060】以下に、本発明を実施例を用いて説明する。【実施例1】【0061】前記表1Aの5種類の21塩基オーバーハング二本鎖siRNA(A6、A22、A33、A56及びA58;それぞれ、配列表の配列番号1~5)と、3種類の27塩基ブラントエンド二本鎖siRNA(A1392、A2224及びA2239;それぞれ、配列表の配列番号6~8)の8種類の二本鎖siRNAを合成して調製し、それぞれの合成二本鎖siRNAについて、1nMの濃度で使用した場合のAkt1遺伝子に対するRNAi効果及び細胞増殖抑制効果を確認した。具体的には、以下のようにして行った。前記5種類の21塩基オーバーハング二本鎖siRNA(A6、A22、A33、A56及びA58)は、配列表の配列番号1~5の19塩基の配列及びその相補配列それぞれの3’末端にTT配列からなる2塩基オーバーハング部分を加えたRNA鎖を、定法により化学合成し、それらを対合させて調製した。前記3種類の27塩基ブラントエンド二本鎖siRNAは、配列表の配列番号6~8の配列及びその相補配列のRNA鎖を定法により化学合成し、それらを対合させて調製した。以下のRNAi効果及び細胞増殖抑制効果の確認に際しては、適宜、HPLC等で精製したものを使用した。SASに、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を導入して分離したGFP安定発現株GFP-SAS細胞を用いた。International社製)、100μg/mlストレプトマイシン、100U/mlペニシリン、0.25mg/mlアンホテリシンB(Invitrogen社製)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;Sigma-Aldrich社製)を増殖培養液として用い、空気中に5%の割合で炭酸ガスを含む培養器内で、37°Cで行った。Biosciences社製)に、8×105個の前記GFP-SAS細胞を植え込み、24時間培養後opti-MEM(Invitrogen社製)にて2回洗浄し、1nMの合成二本鎖siRNAを含むLipofectamine2000(Invitrogen社製)溶液を加えた。5時間後10%FBSを含むDMEMに培地交換した。Reagent(Sigma-Aldrich社製)を用いて可溶化した。difuoeide)膜(Millipore社製)に転写した。Tween20;Sigma-Aldrich社製)にて4°C、1晩ブロッキングした。同様に1時間反応させた。Biosciences社製)にて発色させた後、LAS3000(富士フィルム社製)を用いてデジタル画像化した。Coulter社製)を用いて細胞数を計測した。GFP-SASに導入し、上述のとおり、RNAi効果をAkt1タンパク質の発現レベルで評価した。その結果、前記8種類の全ての合成二本鎖siRNAが、1nMの濃度で標的遺伝子Akt1の発現を有意に抑制することが確認された。その結果の一例を図1に示す。同図において、上段が、Akt1タンパク質に対するウエスタンブロッティングの結果を示し、下段が、内部対照マーカーであるβ-チューブリンに対するウエスタンブロッティングの結果を示す。同図において、一番左のレーンは、GFP遺伝子に対する合成二本鎖siRNA(21塩基オーバーハング)を導入した場合のコントロールである。同図に示すとおり、前記8種類の中でも、A58、A1392、及びA2239の3種類の合成二本鎖siRNAは、80%以上の顕著なRNAi効果を示した。その結果、前記8種類の全ての合成二本鎖siRNAが、1nMの濃度で前記口腔癌細胞の増殖を有意に抑制することが確認された。その結果の一例を図2に示す。同図において、左3レーンは、左から、それぞれ、siRNAを導入しなかった場合、GFPを標的とした21塩基オーバーハングsiRNAを導入した場合、及び、GFPを標的とした27塩基ブラントエンドsiRNAを導入した場合のコントロールである。同図において、縦軸は、前記siRNAを導入しなかった場合の細胞数を1とした場合の相対的な細胞数を示す。同図に示すとおり、前記8種類の中でも、A56、A58、及びA1392の3種類の合成二本鎖siRNAは、70%以上の顕著な口腔癌細胞の増殖抑制効果を示した。【0069】上述のとおり、前記8種類の合成二本鎖siRNAは、1nMという超低濃度でも、有意なAkt1遺伝子を標的としたRNAi効果及び口腔癌細胞の増殖抑制効果を示した。そのなかでも、A58及びA1392は、とりわけ優れたRNAi効果及び細胞増殖抑制効果を示した。【実施例2】【0070】Akt1遺伝子が口腔癌に共通して発現しており、Akt1タンパク質が口腔癌の腫瘍マーカーとなることを確認した。10種類の口腔癌細胞株におけるAkt1タンパク質を、ウェスタンブロットにより検出した。その結果の一例を図3に示す。前記ウェスタンブロットは、定法により行った。同図に示すとおり、Akt1タンパク質は、口腔癌細胞にのみ共通して発現していた。同図において左図は、正常口腔粘膜を使用したコントロールである。前記口腔癌組織におけるAkt1陽性率の結果を下記表2に示す。よるAkt1の陽性率は90%を超えており、本発明の口腔癌の腫瘍マーカーは、極めて有用であることが確認された。5×104個のGFP-SAS細胞を0.5mlのコラーゲンゲルに封入したのち、1nMの濃度で合成siRNAを細胞内に導入した。4日間培養したのち、コラゲナーゼでコラーゲンゲルを分解し、細胞を回収し、細胞数を計測した。その結果を図6に示す。同図に示すとおり、前記8種類の合成二本鎖siRNAはすべて有意に口腔癌細胞の浸潤増殖を抑制できることが示された。【実施例4】【0075】上記表1Aに示すAkt1遺伝子を標的とした8種類の合成二本鎖siRNAのインビボにおける抗腫瘍活性の効果をヌードマウス背部皮下腫瘍モデルを用いて確認した。GFP-SAS細胞1×106個を6週齢雄のBalb/Cヌードマウス背部皮下に移植して腫瘍形成を確認した後、合成二本鎖siRNAをアテロコラーゲン(商品名:AteloGene、高研社製)と混合して投与した。前記投与は、腫瘍周囲に注入する局所投与(6日間隔、3回)と静脈内投与(4日間隔、3回)の2つの方法で行った。腫瘍体積を長径×短径×高さ×0.5236の計算式を用いて算出し、合成二本鎖siRNAの抗腫瘍活性を評価した。【0076】Akt1遺伝子を標的とした合成二本鎖siRNAとしてA22及びA58を用い、対照としてsiRNAを導入しない偽処理(-)及びGFPを標的とした21塩基オーバーハングsiRNAをコントロールとして用いた場合の結果を図7及び図8に示す。図7は局所投与の結果であり、図8は全身投与(静脈投与)の結果である。腫瘍形成を著しく抑制できることが確認された。図7(B)は、ヌードマウスの背部の脊椎を挟んで左右に腫瘍を形成させ、左側にA58、右側にコントロールを局所投与した結果の一例を示す写真である。図7(B)に示すとおり、Akt1遺伝子を標的とした本発明の合成二本鎖siRNAの抗腫瘍活性は視覚的にも明らかであった。図8(A)に示す全身投与の結果も同様にA22及びA58が腫瘍形成を著しく抑制できたことを示す。図8(B)は形成された腫瘍を取り出して大きさを計測した写真であって、上段は光学写真、下段はGFPの蛍光を撮影した写真である。このように局所投与及び全身投与のいずれの場合もAkt1遺伝子を標的とした本発明の合成二本鎖siRNAは、優れた抗腫瘍活性を示した。これらの結果は、本発明の合成二本鎖siRNAの癌治療への臨床応用が可能であることを示す。【実施例5】【0077】前記表1Bの5種類の21塩基オーバーハング二本鎖siRNA(B36、B172、B431、B477;それぞれ、配列表の配列番号10~14)と、3種類の27塩基ブラントエンド二本鎖siRNA(B33、B390、B475;それぞれ、配列表の配列番号15~17)の8種類の二本鎖siRNAを合成して調製し、それぞれの合成二本鎖siRNAについて、1nMの濃度で使用した場合のAkt2遺伝子に対するRNAi効果及び細胞増殖抑制効果を2種類のヒト口腔癌細胞株(GFP-ACC2及びGFP-ACCM)において確認した。【0078】使用したいずれの口腔癌細胞株も実施例1のGFP-SAS株と同様に緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を導入して分離したGFP安定発現株である。これらの細胞における1nMの濃度で使用した場合のAkt2遺伝子に対するRNAi効果及び細胞増殖抑制効果の結果の一例を図9(GFP-ACC2細胞株)及び図10(GFP-ACCM細胞株)に示す。これらの図には、B36、B172、B395、B431及びB477についての結果のみを示す。対する本発明のAkt2標的siRNAによる細胞増殖抑制効果を示し、下段の写真はAkt2タンパク質のウェスタンブロットの結果であってRNAi効果を示す。これらの結果が示すとおり、本発明のAkt2遺伝子を標的としたsiRNAは、口腔癌細胞においてRNAi効果及び細胞増殖抑制効果を発揮しうることが示された。【実施例6】【0079】前記表1Cの5種類の21塩基オーバーハング二本鎖siRNA(C169、C498、C941、C1229、C1321;それぞれ、配列表の配列番号19~23)と、3種類の27塩基ブラントエンド二本鎖siRNA(C166、C496、C1224;それぞれ、配列表の配列番号24~26)の8種類の二本鎖siRNAを合成して調製し、実施例5と同様にして、1nMの濃度で使用した場合のAkt3遺伝子に対するRNAi効果及び細胞増殖抑制効果を確認した。【0080】1nMの濃度で使用した場合のAkt3遺伝子に対するRNAi効果及び細胞増殖抑制効果の結果の一例を図11(GFP-ACC2細胞株)及び図12(GFP-ACCM細胞株)に示す。これらの図には、C169、C498、C941、C1299及びC1321についての結果のみを示す。対する本発明のAkt3標的siRNAによる細胞増殖抑制効果を示し、下段の写真はAkt3タンパク質のウェスタンブロットの結果であってRNAi効果を示す。これらの結果が示すとおり、本発明のAkt3遺伝子を標的としたsiRNAは、口腔癌細胞においてRNAi効果及び細胞増殖抑制効果を発揮しうることが示された。【実施例7】【0081】Akt2及びAkt3遺伝子が口腔癌に共通して発現又は過剰発現しており、Akt2及びAkt3タンパク質が口腔癌の腫瘍マーカーとなりうることを確認した。【0082】その結果を図13に示す。図13(A)は、Akt2及びAkt3タンパク質のウェスタンブロットの結果であって、唾液腺の正常組織及び正常上皮細胞ではAkt2及びAkt3タンパク質が検出されないのに対し、ヒト口腔癌細胞株(ヒト唾液腺癌細胞株)であるGFP-ACC2及びGFP-ACCM細胞ではAkt2及びAkt3タンパク質が過剰発現されていることを示す。図13(B)は、実際に6症例の口腔癌患者の正常粘膜部(N)及び患部(T)試料を用いてそれぞれAkt2及びAkt3タンパク質の過剰発現をウェスタンブロットで検出した結果の一例を示す。この6症例においては、Akt2及びAkt3タンパク質の(過剰)発現は、それぞれ、100%及び50%の陽性率を示した。【実施例8】【0083】前記表1Bの5種類の21塩基オーバーハング二本鎖siRNA(B36、B172、B431、B477;それぞれ、配列表の配列番号10~14)と、3種類の27塩基ブラントエンド二本鎖siRNA(B33、B390、B475;それぞれ、配列表の配列番号15~17)の8種類の二本鎖siRNAを合成して調製し、ヒト前立腺癌細胞株(PC-3)の細胞について、1nMの濃度で使用した場合のAkt2遺伝子に対するRNAi効果及び細胞増殖抑制効果を確認した。培地としてダルベッコ改変イーグル培地に換えてRPMI培地(Sigma-Aldrich社製)を用いた他は実施例1と同様にして行った。【0084】その結果の一例を図14に示す。図14(A)は、PC-3細胞内のAkt2タンパク質をウェスタンブロットで確認した結果の一例を示す図である。実施例1と同様に内部対照マーカーとしてβ-チューブリンを使用したが図示していない。定量化したグラフである。【実施例9】【0085】前記表1Cの5種類の21塩基オーバーハング二本鎖siRNA(C169、C498、C941、C1229、C1321;それぞれ、配列表の配列番号19~23)と、3種類の27塩基ブラントエンド二本鎖siRNA(C166、C496、C1224;それぞれ、配列表の配列番号24~26)の8種類の二本鎖siRNAを合成して調製し、ヒト前立腺癌細胞株(PC-3)の細胞について、1nMの濃度で使用した場合のAkt3遺伝子に対するRNAi効果及び細胞増殖抑制効果を確認した。培地としてダルベッコ改変イーグル培地に換えてRPMI培地(Sigma-Aldrich社製)を用いた他は実施例1と同様にして行った。【0086】その結果の一例を図15に示す。図15(A)は、PC-3細胞内のAkt3タンパク質をウェスタンブロットで確認した結果の一例を示す図である。実施例1と同様に内部対照マーカーとしてβ-チューブリンを使用したが図示していない。定量化したグラフである。本発明のAkt1、Akt2、及び、Akt3を標的としたsiRNAのうち少なくとも2種類を併用すると、それぞれ単独で使用する場合よりも効率的に前立腺癌の細胞増殖を抑制できることを確認した。Akt1を標的としたsiRNAとして上記表1AのA2239のsiRNAを使用し、Akt2を標的としたsiRNAとして上記表1BのB477のsiRNAを使用し、Akt3を標的としたsiRNAとして上記表1CのC1321のsiRNAを使用した場合の結果の一例を図16に示す。同図の結果ではAkt2を標的としたsiRNAが著しい細胞増殖抑制効果を示すが、例えば、これとともにAkt1及び/又はAkt3を標的としたsiRNAを用いれば、単独で得られる効果よりも一層優れた細胞増殖抑制効果が得られることが確認された。【産業上の利用可能性】【0088】以上説明したとおり、本発明の二本鎖siRNAは、オフターゲット効果及びインターフェロン応答を回避しつつ、Akt1、Akt2又はAkt3遺伝子特異的なRNAiを媒介できるから、例えば、臨床応用が可能であり、Akt1、Akt2又はAkt3を標的分子とした医療や医薬組成物の分野、例えば、口腔癌を含む癌治療に関する治療や医薬組成物の分野で有用である。【図面の簡単な説明】【0089】【図1】図1は、本発明の二本鎖siRNAのAkt1遺伝子を標的としたRNAi効果をウエスタンブロッティングで確認した結果の一例である。確認した結果の一例である。おけるAkt1タンパク質を検出したウェスタンブロットの結果の一例である。【図4】図4は、正常口腔粘膜(左図)及び口腔扁平上皮癌(右図)について、抗Akt1抗体を用いて免疫組織化学染色をした写真の一例である。【図5】図5は、口腔癌における治療標的分子としてAkt1遺伝子を同定した工程を説明するフロー図である。確認した結果の一例である。【図7】図7は、本発明の二本鎖siRNAの局所投与による抗腫瘍活性を確認した結果の一例である。【図8】図8は、本発明の二本鎖siRNAの全身(静脈)投与による抗腫瘍活性を確認した結果の一例である。確認した結果の一例である。確認した結果のその他の例である。確認した結果の一例である。確認した結果のその他の例である。【図13】図13は、正常細胞及び口腔癌細胞におけるAkt2及びAkt3タンパク質の発現を確認した結果の一例である。(B)を確認した結果の一例である。(B)を確認した結果の一例である。おける併用効果を確認した結果の一例である。