低下し培地がわずかに変色する。試料と細胞を直接接触させた場合(直接接触法)及び抽出液を用いた場合(抽出法)について規定するが,金属系インプラント材料が使用される環境を考慮し,いずれかを選定し同一の条件で細胞適合性を比較する。000番以上の耐水研磨紙で仕上げる。エタノール中で十分に超音波洗浄する。2)11.に規定する陽性及び陰性対照材料を試験試料と同様に切断する。分間の高圧蒸気滅菌を行う。4)試料,陽性及び陰性対照材料は,シャーレ(又はウエルプレート)内によく密着させる。性などを考慮して選ぶ。規定する方法に従い作製した金属摩耗粉などを用いる。粒子径分布を測定することが望ましい。値が,0.5cm2/mL以上(9)となるようにする。超えない範囲で培地が劣化しない条件とする。値が,0.01g/mL以下で培地が劣化しない条件で行う。子において,どん(貪)食作用を示し結果に影響を与えることがあるので注意する。methodsに準じている。抽出液及び抽出条件は,次による。試料及び血清を含んだ培地をメジューム瓶などに入れ,無菌状態を維持し,37°Cで培養液の活性度が低下しない時間内の条件で二酸化炭素インキュベータ中にふたを緩めた状態で静置し抽出する。時間以下とし,特に,金属粉末の種類によって抽出時間が長くなると培養液と反応し,沈殿物の生成などによる変性が生じる場合があるので注意する。時間)まで高圧蒸気滅菌器中で抽出した後,血清などを加え培地とする。2.2)と同じ条件で抽出し,この超純水を用いて培地を調製する。溶液などで摩擦させた摩擦摩耗溶液を用いて培地を調製するか又はこの摩擦摩耗溶液を滅菌後,培地に加えて試験してもよい。これら以外の抽出条件で行う場合には,適切な抽出条件で実施する。似する方法でできるだけ早い時期に行う。合には,そのことを結果に付記する。培養前と培養後で濃度差がある場合には,結果にそのことを付記する。以下の状態で保存するとよい。接触法及び抽出法による細胞適合性の評価は,次に示す方法に準じて行う。培養シャーレを用いる場合を一例として次に示す。し,ウエルプレートを用いる場合には,ウエルプレートに適した培養液の量及び初期細胞数とし,その他はこれに準じて行う。1)10.の規定に従い,継代した細胞をトリプシン処理し,細胞浮遊液を調製し培養液に懸濁する。5×103∼105個)の細胞をは(播)種する。3)11.に規定する陰性対照材料及び陽性対照材料に対しても同様に細胞をは(播)種する。時間後又は必要に応じて培地を交換するとよい。8mL)を用いて行う。細胞の細胞数の計数は,次の方法に準じて行う。1)培養後,シャーレ内の培養液をパスツールピペットなどで吸引除去する。溶液をパスツールピペットなどで吸引する。分間二酸化炭素インキュベータ中に静置する。ピペッティングし,培養液(例えば,3mL)を入れた細胞数計数用カップに移す。同様にピペッティングして細胞数計数用カップに移す。5)細胞数計数用カップ内の溶液をかくはんし細胞を均一に分散させた後,細胞数計数装置で細胞数を計測する。回以上繰り返し測定した平均値を細胞数とする。血球計算盤を用いて同様に細胞数を計測してもよい。溶液を加え,ウエルプレートリーダーを用い吸光度を測定してもよい。ウエルプレートリーダー及び血球計算盤を使用した場合には,感度及び精度の検証が必要となる。試薬,アイソトン⃝RIIなどがある。1)10.に規定する細胞の継代培養に準拠して細胞を継代する。2)12.に規定する試料の調製方法に準拠して試料を準備する。3)a)に規定する細胞は(播)種方法に準拠して,試料,コントロール,11.に規定する対照材料に細胞をは(播)種する。コントロールには,培養シャーレ又は参照材料を用いる。日間以内に細胞数を計測する。5)次の式から細胞初期付着率を算出する。日間以内の時間とする。ウエルプレートリーダーを用いた場合には,細胞数の代わりに吸光度を用いる。6)陰性対照材料及び陽性対照材料の細胞初期付着率を求める。d)細胞増殖試験1)10.に規定する細胞の継代培養に準拠して細胞を継代する。2)12.に規定する試料の調製に準拠して試料を準備する。3)a)に規定する細胞は(播)種に準拠して,試料,コントロール,11.に規定する対照材料に細胞をは(播)種する。コントロールには,培養シャーレ又は参照材料を用いる。日間)培養後の細胞数を計数する。5)次の式によって相対細胞増殖率を算出する。小さくなるにつれてコントロールに比べ細胞増殖阻害作用が強くなる。ウエルプレートリーダーを用いた場合には,細胞数の代わりに吸光度を用いる。6)陰性対照材料及び陽性対照材料の相対細胞増殖率を求める。細胞を用いたコロニー形成試験は,次の方法に準拠して行う。細胞濃度まで希釈する。2)12.に規定する試料の調製に準拠して試料を調製する。細胞をは(播)種する。(播)種後,細胞が均一に拡散するように静かに振とうする。日間二酸化炭素インキュベータ中で培養してもよい。細胞をは(播)種する。分間コロニーを固定する。時間保持し,コロニーを染色する。200050個以上存在するコロニー数を数える。コロニーの大きさを比較することによって細胞への影響を検討することもできる。9)試料を含まない培養シャーレ又は参照材料を含むシャーレ(又はウエルプレート)のコロニー数をコントロールとしその平均値を算出する。10)試料のコロニー数を数え,次の式に示したようにコントロールのコロニー数の平均値に対する割合(コロニー形成率)を求める。日間培養後のコロニー数の平均値11)陰性対照材料及び陽性対照材料のコロニー形成率を求める。12)コロニーカウンターなどを用いてコロニー形成率を求める場合には,測定精度の検討が必要となる。個以上の平均値と標準偏差などの統計処理によって,培養シャーレをコントロールとした場合の相対細胞増殖率及びコロニー形成率が,次の値を満たす場合には細胞の感度及び精度が保証される。11.に規定する陰性対照材料が次の値を満たすこととする。次に示す濃度付近にある場合には細胞の感度及び精度が検証できる。細胞増殖阻害作用の強いバナジウム製円板を陽性対照材料とし培養シャーレをコントロールとした場合の相対細胞増殖率及びコロニー形成率が,次に示す値である場合には細胞の感度及び精度が検証できる。殖率及びコロニー形成率の平均値を参照材料又はコントロールのそれらと統計解析に基づき比較することによって,金属系インプラント材料間の細胞増殖阻害作用の強さを比較する。2000c)細胞増殖阻害作用に対する金属の濃度の影響を比較する場合には,縦軸に相対細胞増殖率又はコロニー形成率,横軸に培地中の金属濃度(対数)を示す。値を用いて金属の濃度の影響を比較してもよい。d)試験報告書には,次の項目について報告する。1)試験を実施した機関の名称,住所,試験責任者の氏名,試験開始日及び試験終了日2)試験材料,陰性対照材料及び陽性対照材料について次の項目を明記する。金属粉末を用いる場合には,粒子の形状,粒子径と粒子径分布。1(参考)は,本体に関する事柄を補足するもので,規定の一部ではない。ホームページアドレスの一覧は,次のとおりである。2(参考)は,本体に関する事柄を補足するもので,規定の一部ではない。細胞などの継代培養方法の一例を,次に示す。個を用いた場合を一例として示す。1)培養用フラスコ内で,細胞が単層で増殖し,飽和密度に近い状態のときにフラスコ内の培養液をパスツールピペットを用いて吸引除去する。炭素インキュベータ中に静置する。分間遠心分離し,上澄み液をパスツールピペットで吸引除去する。