パスが上手く出来ません。パスが上手く出来ません。入力中の回答があります。ページを離れますか?※ページを離れると、回答が消えてしまいますページを離れるA回答を続ける入力中のお礼があります。ページを離れますか?※ページを離れると、お礼が消えてしまいますページを離れるお礼を続ける最新閲覧日:2017/01/13Tweet細胞培養について。パスが上手く出来ません。閲覧ありがとうございます。数週間前にバイオ系の研究室に配属されました、大学3回生の者です。癌細胞(浮遊、接着)を細胞培養専用のフラスコを使って培養しています。細胞が増えたらチューブに移して遠心にかけ、上清を吸って培養液を入れ数個のフラスコに分けるのですが、その分けた後のフラスコを見ても細胞が全くない、あるいは非常に少なくそれからは育たずに消えて(死んで?)しまいます。遠心後の時点でチューブの底にペレットはあるので、おそらくその後の操作が悪いのだと思います。オートピペッターを使ったピペッティングが上手く出来ていないからと思いましたが、移した後でチューブを見てもペレットは残っていないようです。ピペッティングの際は、培養液をチューブに入れるときに少し入れた後、数回液を吸ったり出したりしてから全て出しています。それなら上清を吸うときにペレットも吸ったのかなとも思いましたが、もちろんパスツールをチューブの底まで突っ込むような事はしていません。チューブを傾けて、パスツールを壁に当てるようにして吸っています。自分なりに慎重に操作しているつもりですが、どこが悪いのかわかりません。熟練した方に見て頂けたら一番良いのですが、先輩や先生は自分の研究で忙しそうなので頼みにくいです...細胞を使わずクリーンベンチ内で練習した時は見て下さいましたが、特に悪かった訳ではなさそうでした。研究室での課題が進められず、本当に困っています。初心者なので、用語が間違っていたり言葉足らずでしたらごめんなさい。細胞を使った研究などをされている方から何かアドバイスを頂ければと思い、質問させて頂きました。通報するこの質問への回答は締め切られました。20:08No.1です。経つとペレットが緩んでしまいます。遠心後はできるだけ速やかに上清を除去すると良いですよ。・遠心管を遠心機から取り出す際や運ぶ際など、ペレットが乱れないように優しく扱ってみて下さい。・先輩に聞かずに失敗するよりは、聞いた方が絶対良いです!変に遠慮するとお互い損です。初めに的確なアドバイスをしてくださったw6o6nさんをベストアンサーに選ばせて頂きます。あれから自分のどこが悪かったかを見直し、ようやく成功しました。不慣れですが、これからも与えられた課題を頑張ってこなそうと思います。お時間を割いて回答して下さった皆様、本当にありがとうございました。今後の参考にさせて頂こうと思います。13:52トリプシンの処理が長すぎたりピペットで激しく若しくは長時間混ぜすぎて細胞が死んでしまっているのかもしれませんね。「あるいは非常に少なくそれからは育たずに消えて(死んで?)しまいます。」よく分かりませんが、接着系だったら少しでも細胞があるようでしたら諦めずにずっと飼ってみたらどうですか?多分増えてくると思うのですが。気持ちは分かりますが、一度くらいは観てもらいましょう。細胞を維持していきたいだけなのですよね?だったら、例えば接着系の細胞の場合、10cmディシュだったらトリプシン-EDTA液を1mL入れてインキュベーターに1,2分入れておいてから培養液を5-10mL加えてピペットで懸濁して、10mLの新しい培養液を加えた新しい培地にその細胞の液を1,2mL加えれば問題ないし(トリプシンは希釈されるし培地には高蛋白質のFBSが入っているはずなのでトリプシンは不活化されます)、浮遊系の細胞なら増えた細胞の培地から1mL取って10-20mLの新しい培地に加えて培養すれば問題ないです。先輩や先生はこういったやり方を嫌がるかもしれません。回答ありがとうございました。処理にトリプシンは使っていませんが、ピペッティングのし過ぎは考えられるかもしれません。14:44ペレットを吸うというのは考えにくいですね。心配なら適当なビーカーにデカンタで上清を捨ててみたらいかがでしょうか。ただの継代なら上清をギリギリまで吸う必要はないですよ。遠心分離の回転数が高すぎて細胞が死滅くらいでしょうか。なんにせよ、慣れないうちは継代後もサンプリングをしてトリパンブルー処理後、細胞数を測定した方が良いですよ。遠心分離の回転数や、接着細胞の処理(EDTAのみです)は同じ細胞なら全員共通なのでおそらく問題ないと思います。今まで上清をかなりギリギリまで吸っていましたが、少し余裕を持っても大丈夫なのですね。細胞数のカウントは、課題に含まれているのでいずれやります。回答ありがとうございました。参考にさせて頂きます。13:02細胞の濃度(密度)が低いと、生育に支障がでることがあるので、まず、あまり薄めないようにします。培地、まちがっていませんよね。遠心で死ぬ可能性があるので、遠心しないで、単に、1枚のシャーレから2枚に分けるとか。古い培養じょうせいをわざと、持ち込むようにします。私はフラスコより10cmなどのシャーレが好きですね。私は、増やすとき遠心しませんけど。通報するこの回答へのお礼まだ操作に不慣れの為、細胞濃度は少し濃くなるようにしています。(名前ははっきり覚えていません、すみません。回答ありがとうございました。00:35上清を吸うときにペレットも吸っている可能性が非常に高いです。吸引力が強いと、多少ペレットから離れていてもズルっと吸ってしまいます。ペレットの近くまで上清を吸ったら、パスツールピペットを上清に差し込んで吸わず、液表面から少しずつ吸うのがコツです。吸引時にペレットを凝視し、最後までペレットが吸い込まれていないことを確認して下さい。念のため、遠心機の設定を確認してみて下さい(低速遠心で落ちるのでまず大丈夫と思いますが)。回答ありがとうございました。ペレットも吸っていた事が一番考えられる原因の様です。今日パスする際に、接着細胞と浮遊細胞を同時に遠心しましたが、遠心後クリーンベンチに戻す際に底のペレットが浮いてしまいました。接着の方はペレットがはっきりと確認できたため、(今のところ)成功しましたが浮遊の方はおそらく吸ってしまったようで失敗しました。通報するお探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!全カテゴリから検索このカテゴリから検索Q質問する(無料)このQ&Aを見た人はこんなQ&Aも見ています細胞播種(96well)のコツを教えてください。DMEM培地について。非動化の目的を教えて下さい。4IC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。5マイクロピペットの使い方がわかりません。細胞播種(96well)のコツを教えてください。DMEM培地について。非動化の目的を教えて下さい。4IC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。5マイクロピペットの使い方がわかりません。回答数ランキングです。・本当は知りたい、発毛体験のあれこれ。全クリア参照履歴を保存しないこのQ&Aを見た人がよく見るQ&A細胞播種(96well)のコツを教え...DMEM培地について。非動化の目的を教えて下さい。細胞播種(96well)のコツを教え...DMEM培地について。非動化の目的を教えて下さい。恋愛からビジネスまで人気の記事が一目で分かる今読むべき記事はコレ!貴社サイトにQ&Aを!QAコネクトとは・・?QA機能を導入できます利用料0円。Inc.質問して、直接聞いてみよう!Q質問する(無料)Q&A検索goo検索gooIDで新規登録・ログイン新規登録する(無料)会員の方はこちら外部サービスのアカウントで新規登録・ログインYahoo!で新規登録・ログインGoogleで新規登録・ログインTwitterで新規登録・ログインFacebookで新規登録・ログイン※各種外部サービスのアカウントをお持ちの方はこちらから簡単に登録できます。お客様の許可なしに外部サービスに投稿することはございませんのでご安心ください。会員でない方、会員になるとあなたも質問や回答ができるようになります!!親切・丁寧な回答が集まる場30分以内に回答がもらえ回答数は平均3件!匿名(ニックネーム)での投稿なので。