mg/L、10%KSR).【図2】図2は、ES細胞由来のPdx1/GFP-細胞またはAFP発現細胞の形成における各種因子の作用を免疫組織化学分析で比較した結果を示す。(A)は、d4~d8に加えた各種因子の作用の比較を示す。ES細胞はM15細胞上で培養し、d0~d4にアクチビンとbFGFを加えた。d4~d8にアクチビンとbFGFを取り除き、次の培養条件について検討した。4500KSR)を含む培養液で培養した。(B)は、d4~d8に加えたDex、HGF、OsMの効果を比較した。d4~d8に、3因子のうちいずれも加えなかった場合(上図)、3因子のうち任意の2つをES細胞培地に加えた場合(下図)を示す。(C)では、Albタンパク質(緑)の発現が(B)の条件下で30日目に検出された。(A、B)8日間培養し、ES細胞をAFP(赤)およびGFP(Pdx1:緑)で染色した。【図3】図3は、ES細胞由来の最終分化した内胚葉からの肝細胞分化にはBMPシグナルならびにFGFシグナル伝達が必要不可欠であることを示す。mg/Lを含む培養液に代え、指示された成長因子を補給し、あるいは成長因子無しで培養した。(A)疫組織化学分析核では、核を抗AFP抗体とDAPIで対比染色した。Nogginを加えると、AFP陽性細胞への分化が阻害されたが、bFGFを加えるとNogginの阻害作用が相殺された。バーは200μmを示す。(B)対照と比較したAFP陽性細胞では倍数増加していた。Visionプログラムで解析した。結果の数値は平均値±標準誤差(n=3)で示した。<0.01対対照(Studentのt検定)【図4】図4は、時系列分析から、AFP陽性細胞ならびにアルブミン陽性細胞の逐次誘導が明らかになったことを示す。mg/Lを含む培養液でd0~d4まで培養した。mg/Lを含む培養液に代えた。分化したES細胞をd10、d18、d22、d30にAFP(緑)およびAlb(赤)で染色した。d10に、AFP+肝芽細胞葉細胞が発生した(d10、緑)。分化から18日目にAFP+/Alb+細胞が発生した(d18、黄)。d22では、AFP+/Alb+成熟肝細胞様細胞が増加し(d22、赤)、AFP+細胞(d22、緑)は減少した。d30では、AFP+細胞はほぼ消失し、アルブミン+細胞がはっきりとしたコロニーを形成した。バーは200μmを示す。【図5】図5は、胆管細胞と肝細胞の分子マーカーの分析を示す。ES細胞は肝臓分化に最適な条件である、DexならびにHGFを含む培養液でd4以降培養された。agglutinin(DBA)レクチン(胆管細胞マーカー、緑)で染色した。レクチン+細胞が別個のコロニーを形成しているのが確認された。1-アンチトリプシン、Cyp3A、Cyp7A1(赤)で染色した。バーは200μmを示す。【図6】図6は、リアルタイムPCRにより、ES細胞由来の肝細胞の肝臓分子マーカーを分子解析し、胎仔肝臓または成体肝臓由来の肝細胞と比較した結果を示す。肝臓マーカー遺伝子の転写はリアルタイムPCR分析により定量化した。転写レベルはβ-アクチンのレベルで標準化した。それぞれの値をd30の分化ES細胞でのレベルで標準化し、d30でのレベルを100として相対的な遺伝子発現レベルをグラフに示した。ES細胞は肝臓分化に最適な条件であるDexとHGFを含む培養液で培養した。M15:M15細胞、ES:未分化ES細胞、d10とd30:M15細胞上で培養した10日目および30日目の分化したES細胞、FL:E12.5胎仔肝臓、AL:成体肝臓【図7】図7は、ES細胞由来の肝細胞の機能解析を示す。ES細胞は肝臓分化に最適な条件であるDexとHGFを含む培養液で培養した。過ヨウ素酸シッフ染色をd30の分化したES細胞に実施した結果、複数のコロニー内で多くの肝細胞が細胞質にグリコーゲンを貯蔵していた(濃赤)。この現象はd4の分化したES細胞またはM15細胞では認められなかった。8】ヒトES細胞の肝細胞様細胞への分化を示す。mg/Lブドウ糖を加えて培養したd10での分化したヒトES細胞(KhES-1)。10ng/mLに切り替えた。(A)d20とd30での分化ES細胞をAFP(未成熟肝細胞マーカー赤)ならびにOct3/4(未分化ES細胞マーカー、緑)で染色した。対照:d10~d20に無処置培養液内で培養した分化したES細胞。agglutinin(DBA)レクチン(胆管マーカー、緑)で染色した。【図9】図9は、ES細胞由来肝細胞のアルブミン分泌能をELISAで分析した結果を示す。分化培地を、分析の24時間前に新しい培地に交換した。ES細胞由来肝細胞から培地に24時間の間に放出されたアルブミンの量を、分化の8日目、40日目及び60日目の各培地中で測定した。各値は、蛋白質量で標準化し、グラフは、成人肝臓の活性を1とした場合の相対活性を示す。値は、平均±標準誤差(n=3)を示す。【図11】図11は、ヒトES細胞の肝細胞への分化を示す。グルコースを添加したM15細胞上で生育させた10日目の分化したヒトES細胞(KhES-1)。(A)は、分化したES細胞における内胚葉又は肝マーカーのRT-PCR分析を示す。