本発明の方法によれば、ES細胞から肝細胞を効率よく分化誘導することができる。本発明の培養方法を用いることにより、未知の物質の肝臓への分化誘導効果を感度良く測定することができることから、肝細胞への分化誘導物質のスクリーニング方法として応用できる。以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。本発明は、ES細胞から肝細胞へと分化誘導する方法において、M15細胞の存在下で哺乳動物由来のES細胞を、アクチビン、及びbFGFの存在下で培養した後に、デキサメタゾン、HGF、及びオンコスタチンMの存在下で培養することを特徴とする方法である。上記の通り、本発明は、ES細胞からの肝細胞様細胞の誘導に関するものである。ES細胞由来の肝細胞を分析した結果、これらの細胞はグリコーゲンを貯蔵し、アルブミン、胆汁酸トランスポーター、チトクロームP450代謝酵素などの分子マーカーを発現しているという点で成熟した肝細胞に類似していることが判明した。本発明で用いるES細胞は、哺乳動物由来のES細胞であればよく、その種類などは特に限定されず、例えば、マウス、サル又はヒト由来のES細胞などを使用することができる。ES細胞としては、例えば、その分化の程度の確認を容易とするために、Pdx1遺伝子付近にレポーター遺伝子を導入した細胞を用いることができる。以下の実施例で使用しているような、Pdx1プロモーター制御下のGFPレポータートランスジーンをもつES細胞SK7株などを使用することができる。Hnf3β内胚葉特異的エンハンサー断片制御下のmRFP1レポータートランスジーン及びPdx1プロモーター制御下のGFPレポータートランスーンを有するES細胞PH3株を使用することもできる。medium(Invitrogen)を用いて維持することができる。本発明では、ES細胞を支持細胞であるM15細胞の存在下で培養すること、即ち、ES細胞をM15細胞と共培養する。Wiltshire))に登録されている。391-401)の記載に従って入手可能である。M15についてのバンク情報を以下に記載する。M15細胞は、血清などを補充した動物細胞用の通常の培地(例えば、RPMI培地又はDMEM培地など)を用いて常法に従って培養することができる。M15細胞の存在下で哺乳動物由来のES細胞を培養する方法は特に限定されないが、例えば、M15細胞をフィーダー細胞として使用して、ES細胞を培養することができる。未分化のES細胞をトリプシンで解離させ、未処理培養皿で分化培地中LIF非存在下に懸濁培養し、胚様体を形成させる。することにより、肝細胞へと分化誘導を行うことができる。本発明の分化誘導方法においてM15細胞の存在下でES細胞を培養する際には、アクチビン、及びbFGFの存在下で培養した後に、デキサメタゾン、HGF、及びオンコスタチンMの存在下で培養する。M15細胞の存在下で哺乳動物由来のES細胞を培養する際にさらにBMP4を添加することも好ましい。このような培養により、ES細胞から肝細胞へと分化誘導することができる。ES細胞から肝細胞への分化は、肝細胞に特異的なマーカーの発現量を測定することにより確認することができる。肝細胞に特異的なマーカーとしては、例えば、アルブミン、胆汁酸トランスポーター、チトクロームP450代謝酵素などの分子マーカーを用いることができる。本発明によれば、M15細胞の存在下で哺乳動物由来のES細胞を、アクチビン、及びbFGFの存在下で培養した後に、デキサメタゾン、HGF、及びオンコスタチンMの存在下で培養することによってES細胞から肝細胞へと分化誘導する際に、被験物質の存在下でES細胞を培養し、被験物質の非存在下でES細胞を培養した場合における肝細胞への分化誘導の程度と被験物質の存在下でES細胞を培養した場合における肝細胞へと分化誘導の程度とを比較することを含む、ES細胞から肝細胞へと分化誘導を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法が提供される。被験物質としては、成長因子又は低分子化合物などを使用することができる。この際、肝細胞で発現するマーカーの発現量を指標として、肝細胞へと分化誘導の程度を測定することが可能である。本発明によれば、本発明の方法により得られるES細胞から分化誘導された肝細胞に被験物質を投与し、該肝細胞に対する影響を分析することによって肝臓毒性を試験することができ、あるいは本発明の方法により得られるES細胞から分化誘導された肝細胞に被験物質を投与し、該被験物質の代謝を分析することによって薬物代謝を試験することもできる。以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。Pdx1プロモーター由来のGFPレポーター導入遺伝子を有するSK7(マウスのES細胞)は既報のものを使用した(国際公開WO2006/126574号公報)。medium(Invitrogen)を用いて維持した。926-32.)は中辻博士と末盛博士(京都大学)から分与されたもので、日本政府のhES細胞ガイドラインに沿って使用した。mM、非必須アミノ酸100μM、β-メルカプトエタノール100μMを含むDMEM/F12(Sigma)を用いてマイトマイシンC10μg/mLで不活性化したMEFフィーダー層上で維持した。mg/mLコラゲナーゼIVで処理することでhES細胞コロニーを支持細胞層から分離し、その後、培養液を加え、ピペットで優しく数回吸引することでES細胞塊を小片にした(5-20細胞)。継代は1:2の分割比で実施した。Antipolis]、仏、アンティポリス)から分与されたものである。M15細胞は10%FBSを含むDMEM内で培養した。μg/mLで処理した。その後、M15細胞がコンフルエントになった状態で、ES細胞を支持細胞の上に置いた。分化研究用に、MEF非含有のゼラチンコート・プレートにマウスES細胞を移し、MEFを除去するために2日間培養した。その後、事前にM15細胞でコートした24-wellまたは6-wellプレート(Nunc)にそれぞれ細胞数5,000と20,000のES細胞を播いた。mg/Lを含む分化培養液で培養し、d4以降は10%KSRとブドウ糖2000mg/Lを含む培養液に変えて最長30日間培養した。ng/mL)を加えた。ng/mL)ならびにデキサメタゾン(1μM)を加えた。培養液は2日に1度、成長因子を含む新しいものに取り替えた。成長因子の詳細は分化セクションの最後に記載する。ヒトES細胞に関しては、事前にM15細胞を培養した24-wellと6-wellのプレートにそれぞれwell当たりそれぞれ20,000個と80,000個のKhES-1細胞を播いた。units/mL、ストレプトマイシン50μg/mL、β-メルカプトエタノール100μMを含むDMEM)で培養した。ng/mL)を加えた。ng/mL)を加えた。培養液は2日に1度、成長因子を含む新しいものに取り替えた。成長因子は以下の(4)に記載する。各成長因子を加えた正確な日程は各図を参照のこと。使用した濃度は次の通りである。Buffer(Invitrogen)で解離した。Pharmingen)のいずれかを使用した。Dickinson)で分取した。Star)で解析した。mini-kit(Qiagen)を用いてES細胞からRNAを抽出した後、RNAをDNA分解酵素(Quiagen)で処理した。primers(東洋紡)を用いて3μgのRNAを逆転写した。5倍に希釈したcDNA(RTプロダクトの1%)の1μLをPCR分析に使用した。表1に各プライマーセットのプライマーシークエンスを記載した。Biosystems)のSyberGreenで定量化した。各遺伝子の発現レベルはβ-アクチンの発現レベルで標準化した。PCRの条件は次の通りであった。95°Cで15秒間の変性、及び60°Cで60秒のアニーリング及び伸長を40サイクルまで行った。増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数)から平均β-アクチンCt値を引くことでサンプル間のβ-アクチンを標準化した。それぞれの標的mRNAレベルは任意単位で示し、標準曲線法で決定した。Probes)で染色した。増幅産物の予想サイズは目視検査により計算したサイズと一致した。coverslips(Nunc)に播いた。System(Leica)を用いて共焦点像を得た。Inverted(Olympus)を用いて位相差画像を得た。検出に用いた抗体は以下の通りである。Probes)を用いた。細胞はDAPI(Roche)で対比染色した。Corporation)を用いてAfp陽性染色像の領域を分析した。機能的成熟の指標として、培養細胞のブドウ糖の産生及び貯蔵の有無を調べるために、PAS染色を行なった。培養細胞を3.3%のホルマリンで10分間処理した後、細胞内ブドウ糖をPAS染色液(武藤化学株式会社)で染色した。染色はメーカーの指示に従って行なった。【0040】(B)結果(1)中胚葉由来のM15細胞は、ES細胞を肝臓内胚葉細胞に分化させた。内胚葉系組織に領域特異的に分化させることができる。時系列分析から、ES細胞は複数の過程を経て内胚葉系譜に分化することが明らかになっている。した内胚葉、最後に領域特異的に最終分化した内胚葉由来臓器へと順次分化した。vivoでの初期胚の誘導事象を模倣するものである。膵臓と肝臓は発生過程中の胚の前腸腹側内胚葉の近接部から発生する。膵臓と肝臓に共通の前駆細胞が存在すること、ならびに心臓中胚葉からのシグナルが膵臓と肝臓への分化を特定化することがこれまでに報告されている。このモデルによれば、心臓中胚葉からFGFのようなシグナルが送られ、細胞の運命を肝臓に方向づける。165-79.)由来のES細胞SK7(国際公開WO2006/126574号公報)を用いた。本発明者らの近年の研究では、アクチビンとbFGFがES細胞からの中内胚葉ならびに最終分化した内胚葉の発生を促すことが判明しているため、本発明では培養分化の初期4日間にアクチビンとbFGFを加えた。図1Aは、アクチビンならびにbFGFを加えると内胚葉細胞ならびにPdx1発現細胞の割合が増加することを示している。アクチビンとbFGFの添加を中断した後に、デキサメタゾン(Dex)、肝細胞成長因子(HGF)、及びオンコスタチンM(OsM)を添加した場合の効果を検討した。Dex、HGF、OsMの追加によりPdx1発現細胞はさらに減少した(図1A)。最終分化した内胚葉での肝臓分化の範囲を検討するため、リアルタイムPCRを用いて、ソニックヘッジホッグ(Shh)ならびに初期肝臓マーカーである(フェトプロテイン(Afp)の転写量を測定した(図1B)。最終分化した内胚葉(E-カドヘリン+/Cxcr4+)細胞はフローサイトメトリーを用いて分離した。この最終分化した内胚葉細胞由来のcDNAをテンプレートとして、リアルタイムPCR分析を実施した。FBSを用いた場合、Afp転写はほとんど誘導されなかった。KSR条件下では、Afp転写は増加した。低ブドウ糖条件下で、d4からd8にDex、HGF、OsMを加えた場合、Afpを発現した最終分化した内胚葉細胞が最も多くなり、Pdx1/GFP陽性細胞が増加し(図1A、黒)、ShhまたはAfp転写が減少した(図1B黒)。逆に、Dex、HGF、OsMを加えた場合は、肝臓分化が優勢で、その結果Pdx1/GFP陽性細胞が減少し(図1Aグレー)、ShhまたはAfp転写が増加した(図1B、グレー)。免疫組織化学分析により、Pdx1発現細胞ならびにAFP発現細胞が相補的であり、ほとんどが異なるコロニーから発生していることを確認した(図2A)。アクチビンとFGFを継続的に追加するとPdx1発現細胞が優勢になった(アクチビン&bFGF欄)。Dex&HGF&OsM)、Pdx1発現細胞が減少する一方、相当量のAFP発現細胞の増加がみられた。mg/Lで使用して、1因子または2因子を追加した培養状態を比較した。OsMの順でAFP発現が促されたことを示す。2因子を加えた場合、DexとHGFの組み合わせが、ES細胞からのAFP発現細胞分化が最も多く、Pdx1発現細胞の分化が最も少なかった(図2B)。同様に、d30に実施したアッセイでは、アルブミン(Alb)発現細胞が最も多くみられた(図2C)。mg/L)でDexとHGFを加えた培養液で培養するという条件でさらに詳細な分析を行なった。【0046】(2)ES細胞から最終分化した内胚葉が肝臓に分化するためには、BMPとFGFシグナルは極めて重要である。用いて肝臓分化に与える効果を検討した(図3)。FGFのみを加えるとAFP陽性細胞数は増加した。FGFレセプターIの阻害因子であるSU5402を加えるとAFP陽性細胞数は減少した。Nogginを加えるとAFP発現細胞はほぼ消失したが、bFGFを加えるとAFP発現細胞が回復した。この結果から、BMPシグナル伝達は、肝臓分化に必要であり、FGFシグナル伝達がBMPのこの効果を増強していることが明らかになった。【0047】(3)時系列的分析から、分子マーカーの逐次誘導が、肝芽細胞と肝細胞の分化ならびに胆管細胞の分化を示していることが明らかになった。よりAFPまたはAlb発現細胞について検討を行なった(図4)。培養は最長30日まで延長した。図4は、AFP陽性細胞が最初に現れ、その後、Alb陽性細胞が18日目に検出されたことを示している。この時期には、AFPとアルブミンの双方を発現している細胞が存在していた。その後、AFP発現細胞は減少し、Alb発現細胞は増加した。この免疫染色の結果はAFPとAlbが個別に調整されていることを示していることから、ES細胞由来の肝細胞はまず未熟な肝細胞前駆細胞(AFP+/Alb-)を形成し、その後、肝芽細胞(AFP+/Alb+)を経て、肝細胞(AFP-/Alb+)に分化することが示唆された。agglutinin(DBA)レクチン+コロニーを形成していることが示された(図5A)。成熟分子マーカーの免疫組織化学分析では、アルブミン陽性細胞の一部が同時に(アンチトリプシンなどの成熟肝臓マーカーとチトクロームP450(Cyp)酵素のうちCyp3AとCyp7A1を発現していることが判明した(図5B)。(1-アンチトリプシンはセリン・プロテアーゼとトリプシンの阻害因子である。Cyp3AはチトクロームP450サブファミリーに属し、薬物およびステロイド代謝酵素であり、Cyp7A1はコレステロール7(ヒドロキシラーゼで、コレステロールを胆汁酸に変える経路を調整している。Cyp7A1は肝臓で発現しているが卵黄嚢組織では発現していないため、肝細胞のマーカーとして有用である。肝細胞の成熟度を測るため、培養10日目ならびに30日目にリアルタイムPCRで肝臓分子マーカーの分子解析を行い、E12.5胎仔肝臓または成体肝臓の肝細胞と比較した。30日目の分化したES細胞ではAfp転写が減少していた。これは上記の免疫組織化学データ(図5)と一致する。その他の成熟肝細胞マーカーとして、Alb1、ケラチン19(Krt19)、チトクロームP450酵素であるCyp2b10、Cyp3a11、Cyp3a13、ならびにヒドロキシステロイドスルホトランスフェラーゼ酵素(Sult2a1)、グルクロン酸転移酵素(Ugt1a1)、有機アニオン輸送ポリペプチド(Slco1a4)、胆汁塩輸出ポンプ(Abcd11)で検討した(図6)。した成熟肝細胞マーカーは分化10日目に検出され、30日目には高レベルに増加した。発現レベルを胎仔と成体の肝細胞と比較した結果、ほとんどのマーカーの発現レベルは胎仔肝臓と同程度であったが、Cyp2b10、Cyp3a13、Slco1a4は胎仔肝臓の肝細胞よりも高い発現レベルを示した。この結果から、ES細胞由来の分化した細胞は多くの成熟肝細胞マーカーを発現することが立証された。ES細胞由来の肝細胞の特性を機能的に調べた。培養を過ヨウ素酸シッフ染色したところ、分化30日目でほとんどの細胞が赤い細胞質染色を示した。これは成熟肝細胞の特徴であるグリコーゲン貯蔵を示す(図7)。より、初期未成熟肝臓マーカーであるAFPが分化20日目に誘導されたことが判明した。Dex、HGF、OsMを追加したところ、AFP発現細胞が増加するのと同時に、Oct3/4を発現した未分化ES細胞が減少した(図8A)。分化40日目にAlb陽性コロニーが確認された。このAlb陽性コロニーの中に、胆管細胞の存在を示すDBAレクチン陽性細胞が観察された。これはマウスES細胞ではほとんど検出されなかった(図8B)。アルブミン陽性コロニーとDBAレクチン陽性コロニーの存在はそれぞれ肝臓および胆管細胞への分化を立証するものであり、この結果から、KhES-1もマウスES細胞と同様に肝臓および胆管細胞の双方に分化することが示された。vitroで分化させることに成功した。成長因子を添加または中断することで、分化誘導に成功した。ならびに膵臓分化が一層促進された。それぞれの誘導過程において必要不可欠であることが示された。アクチビンまたはbFGFシグナル伝達経路を阻害すると、最終分化した内胚葉への分化が妨げられた。4日目以降、ES細胞をアクチビンとbFGFを除いた条件で培養したところ、Pdx1発現細胞への分化ではなく、肝臓分化が促された。本実施例の結果から、無血清条件下で肝細胞分化が増強されることが示唆された。本実施例では、血清の除去はPdx1発現を阻害する一方、肝細胞誘導を強力に増強することが示された。この結果は肝臓分化を阻害する未知の血清因子の存在を裏付けるものである(図1、及び図2)。本実施例では、BMP、bFGFおよびそのアンタゴニストであるNogginやSU5402についても検討した(図3)。bFGFはAFP発現細胞を増加させ、SU5402が減少させる。NogginはAFP発現細胞を完全に消失させるが、bFGFによりAFP発現細胞は回復する。この結果から、BMP4およびbFGFはいずれも肝臓分化に必要であることが明らかになった。617-27.)、これは本実施例の実験結果と一致する(図4)。動態ならびに定量的PCR分析から、Afp発現はAlb1発現に先行することが示され、ES細胞由来の肝細胞が通常の肝臓発生プログラムを模倣していることが示唆された(図6)。DBAレクチン陽性細胞がES細胞から分化することも示された。以上から、本発明の手法により、胆管細胞と肝細胞を含む肝臓系譜の細胞を誘導できることが示された(図5)。本発明では、Sult2A、Ugt1A、Cyp2b10、Cyp3a11、Cyp3a13などの解毒化経路における酵素機能がDexならびにHGFによる処理で誘導されることが示された(図6)。Cyp3A4は現在使用されている薬物の半数以上の代謝に関係している。Cyp3A4阻害に関連する臨床上重要な薬物-薬物相互作用や毒性を呈するいくつかの事例にこの酵素が関連している。ある種の薬物はCyp3A4活性レベルを積極的に調節できるため、Cyp3A4の基質である併用薬のクリアランスを変化させる。したがって、創薬過程においてCyp3A4代謝を阻害する薬物の能力を評価することが重要と考えられる。Cyp3A11、Cyp3A13、Cyp3A25はマウスで同定されている6つのCyp3Aアイソフォームに含まれる。リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析から、ES細胞由来の肝細胞が肝臓特異的マーカーや酵素遺伝子を発現していることが明らかになった(図6)。生化学分析では、ES細胞由来の肝細胞で通常の成熟肝細胞の特性であるグリコーゲン蓄積が示唆された(図7)。本実施例では、ヒトES細胞であるKhES-1を、マウスES細胞と同様の手法で、M15細胞上で培養した。本実施例では、M15細胞を支持細胞として用い、成長因子を組み合わせることにより、KhES-1がマウスES細胞と同様の順序でAFPとAlbを発現し、肝細胞に向かう過程をたどることが示された(図8)。ヒトES細胞の場合、KhES-1細胞を、M15細胞を予め撒いた24ウエル又は6ウエルプレートにウエル当たり各々20,000又は80,000細胞で撒いた。中で50日目まで培養した。(1μM)を10日目から50日目に添加した。培地は、増殖因子を添加した新しい分化培地に2日毎に交換した。(Qiagen)で処理した。(Toyobo)及びオリゴdTプライマー(Toyobo)を用いて逆転写した。用いてPCR分析を行った。各プライマーセットのプライマーは表2に示す。Biosystems)にてSyberGreenを用いて定量した。各遺伝子の発現量は、β-アクチンの発現量を用いて標準化した。条件は以下の通りである。95°Cで15秒の変性、60°Cで60秒のアニーリング及び伸長を40サイクル。Ct値(限界サイクル)を平均の各遺伝子のCtから差し引くことによって、各測定は、各試料についてβアクチン(マウス)及びGAPDH(ヒト)に対して標準化した。各標的mRNA量(任意単位で表したもの)を標準曲線により求めた。Chemicals)を取扱説明書に従って用いて染色した。(Shibayagi)を用いて、アルブミン分泌を分析した。(Promega)を用いて分析した。ミクロソームは、6週齢の雄ICRマウスの肝臓、未分化ES細胞、及び分化したES細胞から調製した。(Pierce)を用いて測定した。マウスES細胞から誘導された細胞について、免疫組織染色法によりアルブミン発現細胞の定量を行った。その結果を表3に示す。αフェトプロテイン陽性細胞が分化8日目には33.1%存在したが、分化30日目には7.4%まで減少した。分化30日目には、アルブミン陽性肝細胞が約18%、DBA陽性胆管細胞が約72%であった。したがって、分化細胞の割合が上昇したといえる。ヒトES細胞については、分化20日目においてAFP陽性細胞が80%という高い効率で分化誘導された(表3)。分化40日目にはアルブミンを発現する肝細胞が9%程度存在した。90-94)、OsMによるアルブミン分泌に対する影響をELISAにより分析した。アルブミン分泌に対するOsMの増強効果は、分化の40日目までは観察されなかった。HGFを補充した分化培地においてアルブミン分泌の2倍の増加が検出された。P450酵素Cyp3Aの酵素活性について評価を行った。