【請求項1】シルクセリシンからなるセリシンナノファイバーであって、該シルクセリシンが、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなり、該シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解したセリシン溶液から得られたセリシンナノファイバーであることを特徴とするセリシンナノファイバー。【請求項2】前記シルクセリシンが、セリシン分子内にエポキシ化合物による処理でエポキシ化合物が導入されてなるセリシンか、二塩基酸無水物による処理で二塩基酸無水物がセリシンの塩基性アミノ酸側鎖と結合し、カルボキシル基が導入されてなるセリシンか、またはアルデヒド化合物による処理でセリシン分子間が架橋されてなるセリシンであることを特徴とする請求項1に記載のセリシンナノファイバー。6】シルクセリシンの分子内に二塩基酸無水物による処理でカルボキシル基が導入されてなる水不溶性のセリシンナノファイバーからなることを特徴とする金属イオン吸着材。【請求項7】前記セリシンナノファイバーを構成するシルクセリシンが、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンであることを特徴とする請求項6に記載の金属イオン吸着材。10】裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなるシルクセリシンとシルクフィブロインとの複合体からなり、該複合体をトリフルオロ酢酸で溶解した溶液から得られたセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーであることを特徴とするセリシン・フィブロイン複合ナノファイバー。アルコールと間接的に接触させるかまたはアルデヒド化合物を作用させる第1工程と、エポキシ化合物または二塩基酸無水物を作用させる第2工程とからなることを特徴とする請求項13に記載のセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法。染色性増強材に関する。本発明はまた、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーおよびその製造方法にも関する。【背景技術】【0002】生糸の本体は絹フィブロイン繊維(以下、シルクフィブロインまたは単にフィブロインともいう)であり、絹フィブロイン繊維は膠着物質のシルクセリシン(以下、シルクセリシンまたは単にセリシンという)で被覆されている。絹フィブロイン繊維である絹糸は衣料材料として古くから使用されてきたのに対し、膠着物質のセリシンは、生糸から絹糸を製造する過程、製糸工程、あるいは生糸の仕上げ過程において重要な役割を果たすものである。セリシンは、その殆どが、生糸が絹製品になるまでの最終段階では除去されてしまい、最終製品では絹フィブロイン繊維の絹糸が利用されているに過ぎない。このため、セリシンは、研究対象になり難く、副産物としてセリシンを多目的に利用する技術開発が重要であるにもかかわらず、その応用や利用の技術の開発は極めて遅れている。【0003】セリシンは、膠質絹タンパク質であり、繭糸の表面を覆い、グリシン、アラニンの他、セリン、スレオニン、アスパラギン酸等の化学反応性に富む嵩高いアミノ酸から構成されている。繭糸から生糸、生糸から絹織物を製造する諸過程で、セリシンは絹糸の溶解性を制御し、高品質な絹糸を製造する上で重要な意味を持つ。接着機能タンパク質として極めて重要な役割を果たす。絹繊維を衣料素材として利用する場合、繭糸を覆うシルクセリシンの殆どは除去・廃棄されてしまうため、セリシンは貴重な未利用資源である。我が国の繭生産量は683トン、世界の主要な養蚕国の中国繭生産量は64万トン(平成16年度統計)であり、我が国だけでも134トン、中国では何と13万トンのセリシンが全く利用されないまま廃棄されている計算となる。した未利用資源を新たな素材(例えば、エレクトロスピニング技術を利用して製造するナノファイバー形状の素材等)として広範な産業分野で利活用することが強く望まれてきた。その有効な利活用法は開発されていない。【0004】繭糸や生糸を熱水あるいはアルカリ水溶液で加熱処理すると、水溶解性のシルクセリシンは溶出し、その溶出液がシルクセリシン水溶液となる。これをポリエチレン膜の上に拡げて蒸発乾燥固化すると、乾燥固化条件によっても異なるが、粉末状態または脆い膜状のシルクセリシンが得られる。セリシンは水に対する溶解度が高いため、その使用用途が限定されるので、広い用途を目的とするためには、水不溶性のセリシンを開発することが必要である。Hexafluoro-2-propanol(HFIP)、例えば、和光純薬工業(株)製)等が使用されていた。(1)絹フィブロイン繊維を溶解する際にはHFAcを用いる技術が知られ、(2)繭糸を精練してセリシンを除去した絹フィブロイン繊維を溶解する際にはHFIPを用いる技術が知られている(例えば、特許文献1参照)。【0006】しかし、セリシン蚕の繭層の溶液を作製する場合、従来のエレクトロスピニングで使用されている上記溶媒(HFAc、HFIP)では、セリシン蚕の繭層の溶解量が十分でなく、また、溶解時にセリシン蚕の繭層の分子量を大幅に低下させるという問題があるため、これらの溶媒を使用することができない。セリシンの分子量を低下させることなくセリシン蚕の繭層を溶解させ、エレクトロスピニングに利用できるセリシン溶液とするための溶媒について、また、セリシン溶液を用い、所望の諸物性を備えたナノスケールのセリシンナノファイバーを製造することは、いまだ提案されておらず、そのようなセリシンナノファイバーを製造する技術の開発が強く望まれてきた。【0007】上記した「セリシン蚕の繭層」という用語は、セリシン繭幼虫が作った繭層を意味するが、以下では、単に「セリシン繭層」とも称す。上記した「セリシン繭層の分子量の低下」とは、正確には、セリシン繭層を構成するセリシン分子の分子量が低下することを言うが、以下、単に「セリシン繭層の分子量の低下」または「セリシンの分子量の低下」とも称す。【0008】本発明者らは、家蚕または野蚕由来の絹タンパク質水溶液を透析して絹タンパク質ドープを調製した後、この絹タンパク質ドープを用いてエレクトロスピニングにより絹タンパク質ナノファイバーを製造する方法および得られた絹タンパク質ナノファイバーを提案した(例えば、特許文献2参照)。この場合、絹タンパク質ドープ(水溶液)として絹セリシンドープ(水溶液)を用い、エレクトロスピニングして絹セリシンナノファイバーを製造し、所望によりルコールのみにて水不溶化を行ったことを提案した。【0009】セリシンを有機溶媒に溶かした溶液を用い、エレクトロスピニングして製造できるセリシンナノファイバーは、そのままでは水に極めて溶解し易いため、応用範囲は限られてしまうという問題があるので、新しい応用を拓くには、水溶解性セリシンナノファイバーを水不溶性に変える必要があるが、こうした目的に合致した効率的な水不溶化処理方法はいまだ知られていない。セリシンの分子量を低下させることなく、効率よく溶解できれば、セリシンにカイコ由来のフィブロインを複合した新素材が製造できるはずであるが、そのような溶媒および新素材についてもいまだ知られていない。【0010】また、本発明者らは、商品化したセリシンパウダーを85°Cの加熱水溶液に溶解してなるセリシン水溶液をエレクトロスピニングすることでセリシンナノファイバーを製造することを提案した(特開2010-270426号)。セリシンパウダーを使用するには、加熱した水溶液にセリシンパウダーを溶解する。セリシン濃度を40wt%~60wt%の濃度範囲に設定してエレクトロスピニングすると、平均繊維径とその標準偏差が微少なセリシンナノファイバーが製造できることが知られている。セリシン繭層を溶解させる溶媒、溶解条件、セリシン濃度、エレクトロスピニング条件によっては、製造されるセリシンナノファイバー中にビーズ状の形態が存在する場合がある。【0011】セリシン繭層として、セリシンを大量に生産する新蚕品種「セリシンホープ」が知られており(例えば、特許文献3参照)、このセリシンホープのセリシン繭層を用いてハイドロゲル、セリシン多孔質体を製造する技術が知られている(例えば、特許文献4参照)。これによるとセリシンホープのセリシン繭層を臭化リチウム水溶液で溶解させてなる溶液に1MのTris-HC緩衝液(pH9)を加えた後、弱アルカリ性に調整する。透析チューブに入れて純水で透析を繰りかえし、濾過を行い、セリシン水溶液を調製する。このセリシン水溶液にエタノールを添加して超音波処理することでセリシンハイドロゲルができる。このセリシン水溶液を-25°Cで凍結させて水分を除去することでセリシン多孔質体が製造できる。0012】【特許文献1】特表2006-504450号公報【特許文献2】特開2010-150712号公報【特許文献3】特開2001-245550号公報【特許文献4】特開2006-111667号公報【発明の概要】【発明が解決しようとする課題】【0013】本発明の課題は、上述の従来技術の問題点を解決することにあり、カイコ由来のセリシンを、十分な量で溶解する有機溶媒であって、かつその際にセリシンの分子量低下のない所望の有機溶媒に溶解して得た溶液を用いて、エレクトロスピニングにより得られる所望の特性を有するセリシンナノファイバーおよびその製造方法を提供すると共に、このセリシンナノファイバーを効率的に水不溶化し、次いで化学加工処理したセリシンナノファイバーにより染色性を増強し(染色増強材)、金属イオンを効果的に吸着し(金属イオン吸着材)、または優れた耐薬品性を付与する(耐薬品性増強材)ことができるセリシンナノファイバーおよびそれを製造するための技術を提供することにある。【0014】本発明の課題はまた、上記従来技術の問題点を解決し、カイコ由来のセリシンを素材にしたセリシン溶液を用いてエレクトロスピニングし、平均繊維径と繊維径分布の制御を可能とするセリシンナノファイバーの効率的、経済的な製造技術を提供することにある。【0015】本発明の課題はさらに、シルクセリシンとシルクフィブロインとからなるセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーおよびその製造方法を提供することにある。)を研究することで、多様な機能を持ち、産業資材として多面的に利用できる素材開発を進めてきた。【0017】シルクセリシンをどのような有機溶媒に溶かすのか、その溶解温度と溶解時間について、そしてエレクトロスピニング条件について検証した。この特定の有機溶媒に溶解して得られたセリシン溶液を用い、エレクトロスピニングして製造できるセリシンナノファイバーは、高い水溶解性を示す。この水溶解性セリシンナノファイバーを染色したり、金属吸着実験を行ったり、酸やアルカリの水溶液による溶解性実験等を行うために、これらの実験に先立って、セリシンナノファイバーをセリシンの貧溶媒で処理することで水不溶化処理を行う水不溶化したセリシンナノファイバーを製造するための方法を確立した。EDTA二塩基酸無水物を作用させて化学加工処理した水不溶化セリシンナノファイバーを製造し、このセリシンナノファイバーがアルカリ・酸の水溶液に対して溶解しないこと、金属イオン吸着性および抗菌活性を有すること、ならびに染色増強性を有すること等を見出し、本発明を完成させるに至った。第1工程でアルコールなどを作用させて水不溶化するのは、第2工程において水を用いた系で処理する場合に、セリシンがその化学加工処理中に溶解してしまわないようにするためである。本発明で「水不溶化」といった場合、文意により、第1工程(アルコール処理など)による場合および第2工程(化学加工処理)による場合の一方または両方を含む場合がある。【0018】また、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(Nd-s)または新蚕品種・セリシンホープに由来する蚕品種のセリシン繭層を有機溶媒で溶解し、この溶液を用いてエレクトロスピニングすることにより、所望の平均繊維径の小さい、しかも繊維径分布が少ないセリシンナノファイバーを効率的に製造することが可能となり、従来技術の問題を解決することに成功し、本発明を完成するに至った。【0019】本発明に使用できる蚕の絹糸腺、繭層または繭は、下記の4種類の蚕品種に由来するものであれば使用が可能である。セリシンN、セリシンNd蚕、Nd-s蚕およびセリシンホープ等の蚕品種(注:カイコの幼虫を意味する)に由来する繭層を構成するセリシン、またはこれらカイコ幼虫の体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンを例示でき、セリシンホープを特に好ましく用いることができる。pura中部及び後部糸腺の退化により吐糸が不能で裸蛹となる)。Hashimoto:Ndと性状は同じ)。cocoon後部糸腺の退化によりフィブロイン合成が負で、セリシンだけからなる繭をつくる)。Page244、日本蚕糸学会、1979に基づく。【0023】(4)セリシンホープと呼ばれるカイコ。蚕品種セリシンホープは、中国品種「CS83」系統に品種「Nd系統」を交配し、さらに戻し交配等を行い、作製した品種である(特許文献3:特開2001-245550)。蚕品種セリシンホープは、フィブロイン合成能が退化しており、セリシンを多量に生産する((4)の文言は特許文献4:特開2006-111667号公報より引用)。開発し、蚕品種として特許されており、この蚕の特徴は、セリシンを合成する絹糸腺が大部分で、フィブロインを合成する部分がほとんど発達していない。そのため、セリシンホープが作る繭は通常の品種より繭層が薄く小さい(高原社HPより)。【0024】本発明のセリシンナノファイバーは、シルクセリシンからなり、該シルクセリシンが、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンンからなり、該シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解したセリシン溶液から得られたセリシンナノファイバーであることを特徴とする。【0025】前記シルクセリシンが、セリシン分子内にエポキシ化合物による処理でエポキシ化合物が導入されてなるセリシンか、二塩基酸無水物による処理で二塩基酸無水物がセリシンの塩基性アミノ酸側鎖と結合し、その結果、カルボキシル基が導入されてなるセリシンか、またはアルデヒド化合物による処理でセリシン分子間が架橋されてなるセリシンであることを特徴とする。【0026】本発明のセリシンナノファイバーの製造方法は、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくはセリシンホープの繭層、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなるシルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解してなるセリシン溶液を用い、エレクトロスピニングしてなることを特徴とする。【0028】前記セリシンナノファイバーの製造方法において、エレクトロスピニングした後、得られたセリシンナノファイバーを水不溶化処理してなることを特徴とする。【0029】前記セリシンナノファイバーの製造方法において、水不溶化処理が、アルコールと間接的に接触させるかまたはアルデヒド化合物を作用させる第1工程と、エポキシ化合物または二塩基酸無水物を作用させる第2工程とからなることを特徴とする。【0030】本発明の金属イオン吸着材は、シルクセリシンの分子内に二塩基酸無水物による処理でカルボキシル基が導入されてなる水不溶性のセリシンナノファイバーからなることを特徴とする。【0031】前記金属イオン吸着材において、セリシンナノファイバーを構成するシルクセリシンが、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンであることを特徴とする。【0032】本発明の染色機能増強材は、シルクセリシンの分子内にエポキシ化合物による処理でエポキシ化合物が導入されてなるか、または二塩基酸無水物による処理でカルボキシル基が導入されてなる水不溶性のセリシンナノファイバーであって、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなる該シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解したセリシン溶液から得られたセリシンナノファイバーからなることを特徴とする。【0034】本発明の耐薬品性増強材は、シルクセリシンの分子内にエポキシ化合物による処理でエポキシ化合物が導入されてなる水不溶性のセリシンナノファイバーであって、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなる該シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解したセリシン溶液から得られたセリシンナノファイバーからなることを特徴とする。【0036】本発明のセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーは、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなるシルクセリシンとシルクフィブロインとの複合体からなり、該複合体をトリフルオロ酢酸で溶解した溶液から得られたセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーであることを特徴とする。【0038】本発明のセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法は、シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解してなるセリシン溶液と、シルクフィブロインをトリフルオロ酢酸で溶解してなるフィブロインスポンジとからなる複合溶液を用い、エレクトロスピニングしてなることを特徴とする。【0039】前記セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法において、複合溶液が、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくはセリシンホープの繭層、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解してなるセリシン溶液と、シルクフィブロインをトリフルオロ酢酸で溶解してなるフィブロインスポンジとからなる複合溶液であることを特徴とする。【0040】前記セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法において、エレクトロスピニングした後、得られたセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを水不溶化処理してなることを特徴とする。【0041】前記セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法において、水不溶化処理が、アルコールと間接的に接触させるかまたはアルデヒド化合物を作用させる第1工程と、エポキシ化合物または二塩基酸無水物を作用させる第2工程とからなることを特徴とする。【発明の効果】【0042】本発明によれば、カイコ由来のセリシン(例えば、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくは新蚕品種・セリシンホープからの繭層由来のセリシン)をTFA等の有機溶媒に溶解してなるセリシン溶液を用いてエレクトロスピニングし、平均繊維径と繊維径分布との制御を可能とする所望のセリシンナノナノファイバーを効率的、経済的に製造する技術を提供できるという効果を奏する。して利用できるという効果を奏する。【0044】さらに、本発明によれば、上記セリシン溶液と絹タンパク質であるフィブロインの溶液とを用いてエレクトロスピニングし、平均繊維径と繊維径分布との制御を可能とする所望のセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを効率的、経済的に製造する技術を提供できるという効果を奏する。【0045】なお、本発明によれば、上記水溶解性のセリシンナノファイバーは、極細であることに加え、生体適合性素材であり、かつ生分解性であるため、体内に移植しても体内酵素で分解するという生化学特性を有する。ヘルスケアー分野、バイオテクノロジー分野、エネルギー分野における新素材として有望である。優れ、紫外線のエネルギーを吸収する性質を持ち、かつ有効表面積が広いという諸特性を有する。【図面の簡単な説明】【0048】【図1】実施例4において製造された水溶解性のセリシンナノファイバーの形態を示すSEM画像。【図2】比較例1において製造された水溶解性のセリシンナノファイバーの形態を示すSEM画像。【発明を実施するための形態】【0049】本発明に係るセリシンナノファイバーの実施の形態によれば、セリシンナノファイバーは、裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)もしくはセリシンホープの繭層由来のシルクセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなり、エレクトロスピニングにより得られる。【0050】上記したシルクセリシンは、遺伝的にセリシンからなる繭層を作るセリシンを多量に製造する裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)あるいは新蚕品種・セリシンホープ幼虫に由来するセリシンホープの繭層由来のものである。従来技術には、例えば、セリシンホープ繭層を溶解するための最適な溶媒について、また、セリシンホープ繭層をその溶媒に溶解して得たセリシンホープ繭層溶液を用いてエレクトロスピニングする技術については、全く開示も示唆もされていない。セリシンホープ繭層を効率的に、かつセリシンの分子量を急激に低下させずに溶解できる溶媒で溶解して得たセリシンホープ繭層の溶液を用いてエレクトロスピニングすることで、各種産業資材として利用できるセリシンナノファイバーが製造できれば新たな用途に利用できる素材となり得るであろう。従来はこうした技術の提案がないために素材開発が遅れていた。【0051】本発明によれば、セリシンを溶媒に溶かした溶液を用い、エレクトロスピニングして製造できるセリシンナノファイバーは、水に極めて溶解し易く、用途に限界がある。そのため、新しい応用を拓くには、水溶解性セリシンナノファイバーを水不溶性に変える必要があったが、従来技術には、こうした目的に合致した効率的な水不溶化処理方法は開示も示唆もされていない。セリシンの分子量を低下させることなく効率よく溶解できれば、セリシンにカイコ由来のフィブロインを複合した新素材の製造もできるはずである。【0052】本発明でエレクトロスピニングする原料であるセリシンを得るためには次のような方法がある。絹糸本体の成分であるフィブロインを生合成する組織である後部絹糸腺が遺伝的に退化した突然変異系統である裸蛹(遺伝子記号Nd)、セリシン蚕(遺伝子記号Nd-s)、または先端技術で育成して得られ、最近特許になった第3374177号(発明の名称:セリシンを大量に生産する蚕品種)に記載された「セリシンホープ」のセリシンホープ繭層が好ましく利用できる。これらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンやこの液状セリシンを凝固させたセリシンも用いることができる。【0053】遺伝子記号NdおよびはNd-s、ならびにセリシンホープ幼虫におけるセリシンの吐糸量、幼虫の大きさ、強健度、営繭性などは全く異なる。【0054】これらの突然変異種の蚕品種について詳細に説明する。した突然変異種としては次の2種がある。(1)フィブロインをほとんど合成せず、セリシンのみ(含量99%以上)を合成する裸蛹系統(「Nd系統」)。(2)フィブロイン約30%、セリシン約70%の組成から成るタンパク質を生産するセリシン蚕系統「Nd-s系統」(特許文献3:特開2001-245550参照)。【0055】しかし、上記突然変異種であるカイコは、絹タンパク質の生産量が1頭当たり30mg内外と非常に少なく、セリシン1gを生産するには、Nd系統で約55頭、Nd-S系統で釣80頭を飼育する必要があり、両系統ともセリシンの生産量が著しく低い(特開2001-245550参照)。これに対して、本発明で最も効率的に利用できるセリシンホープ繭層は、1頭当たりの吐糸量が約95mg、セリシン量の割合が99%で、交雑種に比べてセリシン生産量が1.2~1.3倍であるセリシンN(セリシンホープ蚕品種)(注:セリシンの含量、1頭当たりの吐糸量、フィブロイン含量についての記述は、特開2001-245550参照)である。【0056】本発明によれば、セリシンを多量に製造するセリシン繭層を用いることが好ましく、こうしたセリシンを用い、エレクトロスピニングしてなるセリシンナノファイバー、およびその製造方法が提供される。本発明によればまた、エレクトロスピニングにより得られたセリシンナノファイバーを水不溶化処理することにより、金属イオン吸着性セリシンナノファイバー、酸やアルカリに対する耐薬品性が増強したセリシンナノファイバー、および染色性が向上したセリシンナノファイバーを提供できる。【0057】本発明では、上記したように、セリシンを多量に吐糸するセリシンホープのセリシン繭層、Ndカイコのセリシン繭層がセリシンナノファイバーを製造するのに好ましく利用できる。これらカイコの繭層には、上記のとおり重量比で数%のフィブロインが含まれるが、残りのタンパク質はセリシンであるため、これらカイコ繭層は実質的にはセリシンから構成されていると考えてよい。【0058】これらのセリシン繭層は、本発明者らが出願した先願で用いたセリシンパウダーとは異なり溶媒に対する溶解性も大きく相違する。セリシン繭層はカイコが吐糸して製造されたものであり、繊維構造を持つが、セリシンパウダーは家蚕繭糸のセリシンを粉末化したものであるため繊維構造を持たず、熱水には溶解し易い。セリシン繭層の熱水に対する溶解性は低く、本発明で用いるセリシンを多量に吐糸するセリシン繭層は、85°Cの加熱温水で処理しても溶解率は低く5%程度を示す程度に過ぎない。本発明に従ってセリシンナノファイバーを製造するために用いる素材は、セリシンホープのセリシン繭層、Ndカイコのセリシン繭層等であり、セリシンパウダーでないため、どんな溶媒で溶解するとよいか、セリシンの最適濃度はどの位か等の情報は全く不明であった。【0059】こうしたセリシンホープのセリシン繭層、セリシンカイコのセリシン繭層、Ndカイコのセリシン繭層を原料として用い、エレクトロスピニングしてセリシンナノファイバーを製造するに際して、セリシンナノファイバーの平均繊維径や繊維径分布をいかに微少にするかの技術的な開示はこれまで無い。そこで、これらの問題解決を可能とする、経済的でかつ効率的なセリシンナノファイバーの製造技術の出現が強く望まれてきた。【0060】本発明のセリシンホープのセリシン繭層、セリシンカイコのセリシン繭層、Ndカイコのセリシン繭層を溶解する際に、フィブロインを溶解するための従来公知の上記溶媒で溶解するかどうかは一切不明であった。【0061】本発明では、上記セリシン繭層の分子量を低下させずにエレクトロスピニング用の溶液を製造する最善の方法を試行錯誤的に工夫しながら検討し、最適溶媒と最適エレクトロスピニング条件を解明し本発明を完成させた。【0062】エレクトロスピニング法でセリシン溶液を用いてセリシンナノファイバーを製造する際に、セリシン溶液を用い、エレクトロスピニングして平均繊維径と繊維径分布を制御したセリシンナノファイバーを効率的にしかも経済的に製造することが製造上の重要な要件であった。【0063】本発明では、セリシン繭層を溶解する溶媒を試行錯誤的に検索した結果、トリフルオロ酢酸(TFA)が特に優れた溶解性を示し、かつセリシン繭層の分子量を急激に低下することがなく、その結果、セリシン繭層のTFA溶液を用いてエレクトロスピニングすることで、所望のセリシンナノファイバーを効率的に経済的に製造することが可能となった。した方法でセリシン繭層の溶液を用いてエレクトロスピニングすると、セリシンからなり、表面積が極めて大きいセリシンナノファイバーが製造でき、その結果、有用細胞を効率的に増殖させるための再生医療材料としての利用価値は高く、様々な生体細胞との親和性が良く、短時間に細胞増殖が可能となるため再生医用材料として広範に利用できる。【0064】セリシンナノファイバーは、例えば染色工程では高温水溶液系に接触するため、素材が水溶解性であると染色することはできない。して使用するには、予め水不溶性にしておくことが必要であり、本発明によれば、より満足すべき特性を有する水不溶化したセリシンナノファイバーの製造が可能となった。【0065】上記したように、本発明における素材は、シルクセリシンを特異的に生合成する蚕(遺伝子記号がNd-s、Ndで表されるセリシン幼虫)由来のセリシン繭層、特に好ましくはセリシンホープ幼虫のセリシン繭層である。【0066】セリシンホープ幼虫を例にとり、以下説明する。セリシンホープ幼虫体内からセリシンを取り出すには次のようにするとよい。成熟したセリシンホープ幼虫体内から絹糸腺を取り出し、水洗いして絹糸腺細胞をピンセットで除去すると、液状のセリシンが得られるので、これを、蒸留水を入れたシャーレに浸漬し、5°Cで4時間放置すると、均一なセリシン水溶液が製造できる。送風乾燥してセリシンの濃度を高めると高分子量の所定濃度のセリシン水溶液が製造できる。本発明によれば、この絹糸腺から取り出して調製したセリシン水溶液を用いてエレクトロスピニングしても良いが、このセリシン水溶液を蒸発・乾燥・固化して粉末状のセリシンを得た後、この粉末状のセリシンを所定の有機溶媒に溶解して所定濃度を有するセリシン溶液を調製し、この溶液を用いてエレクトロスピニングすることにより、所望のセリシンナノファイバーを製造することが好ましい。【0067】セリシンを構成する主要なアミノ酸はセリンである。シルクセリシンには、その他に、側鎖が長くて嵩高いアルギニン、ヒスチジン、リジン等の化学反応性に富むアミノ酸が多く含まれる。繭糸をアルカリ抽出して得られるセリシンは水溶解性であるため、高温の水に長時間晒されるとセリシンは膨潤し、ついには溶解してしまう。そのため、グラフト加工処理や化学加工処理、あるいは染色処理の工程の対象には、水に溶解しない水不溶性のセリシンを用いることが必要である。従来の方法でセリシンを染色するには、高温度で長時間、水溶液系の染色浴で処理するため、水不溶化したセリシンを用い、水溶液系によらない染色浴での染色をする必要がある。【0068】本発明において、セリシンまたはセリシン繭層を溶解し、セリシンナノファイバーを製造するために使用できる溶媒としては、例えばトリフルオロ酢酸(TFA)、蟻酸(FA)、ヘキサフルオロアセトン(HFAc)1.5水和物、ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)等を利用できる。分子量を低下させることなく、溶解性に優れた溶媒としてはTFAまたはFAが好ましく利用でき、TFAが特に好ましく利用できる。【0069】本発明によれば、セリシン溶液を製造するためのセリシン原料は、上記したように、裸蛹(遺伝子記号Nd)の繭層、セリシン蚕(Nd-s)の繭層、または新蚕品種・セリシンホープに由来するセリシンホープの繭層である。これらの試料をTFAまたはFA等の有機酸で溶解したセリシンの溶液を使用してエレクトロスピニングすることが好ましい。【0070】裸蛹、シルクセリシン繭、シルクセリシンホープのカイコ幼虫は成熟すると繊維状のセリシンを吐糸する。この未処理未加工の繊維状セリシンは熱水には一部溶解するが、試料の全量を溶解することは無い。したセリシンをTFA等の有機溶媒に溶解した溶液を用い、エレクトロスピニングして製造できるセリシンナノファイバーは、高い水溶解性を示すため、セリシンナノファイバーを用いて、染色したり、金属吸着実験を行ったり、酸やアルカリ水溶液による溶解性実験を行うには、これらの実験に先立ってセリシンナノファイバーを水に対して不溶化処理し、かつまた染色にあたっては染色効率をよくするため、水溶液系ではなく溶媒系の染色浴で、かつできる限り低温で染色することが可能な染色技術の開発が望まれてきた。(紡糸距離ともいう)、溶液送り出し速度等の紡糸条件を変えながらナノファイバーの最適製造条件を試行錯誤的に検討する必要があった。)を試行錯誤的に変えながら所望する条件に合う最適条件を探すことで、所望するセリシンナノファイバーを製造する必要がある。変える実験を主に行った。【0072】本発明におけるシルクセリシンはまた、蚕が作った繭糸から取り出すことも可能であるし、蚕の絹糸腺内のセリシンを利用することも可能である。【0073】セリシンホープ繭層をTFAに溶解して得られるセリシンTFA溶液の濃度は、1wt%~15wt%が好ましく、2wt%~15wt%が特に好ましい。セリシン溶液の濃度が1wt%未満と低すぎると、エレクトロスピニング効率が良くなく、セリシン溶液の濃度が15wt%を超えると、エレクトロスピニングの際、紡糸口でセリシンが凝固したり、安定した紡糸ができなかったり、紡糸口から良好なセリシンジェットが噴出しないので、表面が平滑な極細のセリシンナノファイバーが製造できないという問題がある。【0074】セリシン溶液を用い、エレクトロスピニングして製造されるセリシンナノファイバーの形態上の評価は次のようにして行う。セリシンナノファイバーの平均繊維径がどれほどか、そのバラツキの指標である平均繊維径の標準偏差はどれほどか、あるいは陰極板上に集積するナノファーバーに粒状の「ビーズ」の付着が見られるかを観察することにより行われる。陰極金属板までの紡糸距離である。エレクトロスピニングの紡糸条件が一定であれば、セリシン溶液濃度が希薄なほどナノファイバーの平均繊維径は細くなる傾向にある。セリシン溶液濃度が1wt%未満だと、紡糸口からシルクドープを微細に放出しても、陰極板上ではナノファイバーの形態とならず、極微細な粒子(ビーズ)状となってしまうし、セリシン溶液濃度が15wt%を超えると、電圧を印加してもセリシンジェットが紡糸口から噴出しないという問題が生ずる。【0077】本発明で用いることができるエレクトロスピニング装置は、特別の仕様の装置でなくてもよく、従来の既知の装置で良い。【0078】本発明で用いるエレクトロスピニング装置は、高圧電源、ポリマー溶液の貯蔵タンク、陽極に接続する紡糸口、およびアースされ陰極に接続する陰極板(コレクター)から構成される。【0079】セリシン溶液を試料貯蔵容器(タンク)に入れ、既知の操作に従ってエレクトロスピニングすれば良く、例えば、紡糸口と陰極板間に10~30kVの電圧を印加すると、セリシン溶液表面の過剰電荷が表面張力を越える時、セリシン溶液の表面積が最大となるようにセリシン溶液のジェットが噴射し、超微細なセリシンナノファイバーとなって陰極板(コレクター)に向かって噴射し、金属製の陰極板上にセリシンナノファイバーが積層する。【0080】上記したように、セリシンナノファイバーを効率よく製造するためには、セリシン溶液を製造するためにセリシンをどのような溶媒で溶解するか、セリシン溶液の最適濃度は何wt%とするか、印加電圧をどのように設定するかが重要な要因である。【0081】また、セリシンホープ繭層を溶解するための従来の溶媒はHFIP、HFAcであるが、分子量を低下することなく効率的に溶解するにはTFAやFAが好ましく用いられ、特にTFAが好ましく用いられる。有するセリシンナノファイバーおよびその製造方法、および染色方法等についてその好ましい実施の形態を詳細に説明する。【0083】セリシンとしては、上記したように、セリシン蚕由来の液状セリシンあるいはセリシン蚕幼虫が吐き出すセリシン繭であっても同様に利用できる。セリシン蚕であれば、遺伝子記号がNd、Nd-sで表されるカイコ由来のシルクセリシンが利用できる。【0084】以下、金属イオン吸着性、耐薬品性および染色性に関して説明する。セリシン溶液を用い、エレクトロスピニングして製造できるセリシンナノファイバーは水に溶解してしまうが、水不溶化処理した後に二塩基酸無水物等で化学加工処理してカルボキシル基を導入した水不溶化セリシンナノファイバーは金属イオンを吸着するための基材やその他の基材として利用できる。これは、セリシンを構成するグルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸側鎖が金属イオンを配位する拠点となるためである。セリシンナノファイバーの耐薬品性を向上させるためには、まずセリシンナノファイバーを水不溶化処理した後、エポキシ化合物で化学加工処理するとよい。エポキシ化合物でセリシンナノファイバーを化学加工処理する方法は次の通りである。:デナコールEX-810)等のような2官能性エポキシ化合物を用いて化学加工処理すれば良い。【0088】セリシンナノファイバーの化学加工処理において、エポキシ化合物を溶解するための有機溶媒としては、従来公知の有機溶媒を利用できる。このようなものとしては、例えば、N,N-ジメチルホルムアミド(DMFと略記することもある)、ジメチルスルホキシド(DMSOと略記することもある)、ジメチルアセトアミド(DMAと略記することもある)、テトラヒドロフラン、ピリジン等が挙げられる。本発明においては、例えば、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)等の使用が特に好ましい。【0089】上記した化学加工処理は、例えば、エポキシ化合物を、試料重量に対して20倍(浴比1:20と略記することもある)のジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、この溶液を逆流冷却器を付けた100mLのナス型フラスコに入れ、試料がDMF中に完全に浸漬するように留意しながら、ウォーターバス中で、75~80°Cの間で時間を変えて反応させることにより実施できる。取り出し、DMFで洗浄し、続いて55°Cのアセトンで洗浄することで未反応試薬を除去する。最終的に水で洗浄し、乾燥後重量を測定し、公知の方法で化学加工の有無を確認する。【0090】セリシンナノファイバーへのエポキシ化合物による化学加工処理は、化学反応時の反応温度60~90°Cで実施される。反応温度が60°Cより低すぎると反応効率が良くなく、反応温度が90°Cを超えると反応が短時間に進んでしまい、反応量を制御でき難くなる等の問題がある。有機溶媒中におけるエポキシ化合物の濃度は、5~30wt%であればよい。濃度が5wt%未満となると反応効率が低下するという問題があり、また、30wt%を超えると、有機溶媒に無駄に溶解する酸無水物量が増えるため、経済的ではないし、かつ反応温度を上げると短時間に反応効率が上がりすぎてしまい、加工効率を制御することが困難となるという問題がある。【0091】なお、開放容器中で、75°C以上の温度で化学加工処理すると、反応時間が長時間に及ぶので溶媒が蒸発し、これに伴い加工試薬濃度が変化し、セリシンナノファイバーの化学加工処理の程度を制御することが困難となる。そのため、化学加工処理は逆流冷却器を付けたナス型フラスコ、三角フラスコ等内で行うことが望ましい。セリシンナノファイバーの染色性を増強するための化学加工処理は次のようにする。セリシンナノファイバーを、アルコールで水不溶化処理した後またはアルデヒド化合物で水不溶化処理した後、この水不溶化した試料にエポキシ化合物もしくは二塩基酸無水物で化学加工処理することで染料が吸着する拠点となるカルボキシル基やエポキシ基を予め導入しておく。この場合、水不溶化した試料に対して、エポキシ化合物で処理した後にさらに二塩基酸無水物で化学加工処理しても、染色性増強効果は得られる。しては、無水コハク酸(SA)、無水グルタル酸(GA)、無水イタコン酸(IA)、無水フタル酸(PA)または無水o-スルホベンゾイル無水物(OSBA)が例示できる。した二塩基酸無水物を有機溶媒に溶解し、その中にセリシンナノファイバー等の試料を入れ、予め一定時間加熱加工しておくことで、染料を吸着するカルボキシル基が確実に導入でき、その結果、塩基性染料で良く染まるようになる。【0094】二塩基酸無水物で予め化学加工処理したセリシンナノファイバーを染色するには、エタノール溶媒染色するとよく、染料を含む所定のエタノール濃度の水溶液中での溶媒染色が最適である。塩基性染料を溶解したエタノール水溶液による溶媒染色で処理したセリシンナノファイバーは、未加工未処理に較べて多くの染料を吸着することができる。染色には加熱した染色浴を使用することはなく、室温付近の染色加工でよく、時間は30分以上、好ましくは1時間程度がよい。【0095】アルデヒド化合物としては、例えばパラホルムアルデヒドのようなホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド等を挙げることができ、エポキシ化合物は上記した通りである。100mLのDMFに5~20g含まれるようにし、試料に対して20倍(浴比1:20と略記することもある)のジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、この溶液を、逆流冷却器を付けた10mLのナス型フラスコに入れ、試料がDMF中に完全に浸漬するように留意しながら、75~80°Cのウォーターバス中で、随時、時間を変えて反応させることにより実施できる。取り出し、DMFで洗浄し、続いて55°Cのアセトンで洗浄することで未反応試薬を除去する。試料量の変化から加工率を求める。【0098】染料は水に良く溶けた状態で水不溶性のセリシンナノファイバー内に入り込み、吸着する。試料への染料の吸着度合いは、染料を含むエタノール水溶液濃度に依存し、染色浴のエタノール濃度は低くもなく、高くもない値、例えば40~70v/v%の濃度範囲が好ましい。染色浴中のエタノール濃度が70v/v%を超えると、染料はセリシンナノファイバー内に入り難くなり、染着状態が悪化する。エタノール濃度が40v/v%未満であると、染着量は減少するが、セリシンナノファイバーが膨潤し溶解する恐れがある。【0099】セリシンナノファイバーを溶媒染色で染める詳細な染色方法は次の通りである。【0100】エタノールで水不溶化したセリシンナノファイバーはエタノール溶媒染色法で染色できる。染色浴はエタノールと水との混合で組成比はエタノール濃度40~70%であればよい。浴比が1:200となるようにして、エタノール染色浴にサンプルを入れ、室温で1時間静置すると染色が可能となる。染料濃度は0.1~0.5%でよい。2などの酸性染色で染めるとよいし、グルタル酸無水物(GA)で予め試料にカルボキシル基を導入したセリシンナノファイバーは塩基性染料で染色するとよい。【0101】次に、水不溶化処理について、纏めて記載する。水溶解性のセリシンナノファイバーを水不溶性にするには次のようにするとよい。【0102】例えば、70v/v%のメタノール水溶液または70v/v%のエタノール水溶液をポリスチレン容器の底部分に入れ、これらの水溶液が直接セリシンナノファイバーに触れないように上げ底付きの台にセリシンナノファイバーを置く。ポリスチレン容器に蓋をして室温で2日間静置すると、ポリスチレン容器内部はアルコールにより蒸気圧が高まり、アルコールはセリシンナノファイバーに吸着される。ポリスチレン容器から試料を取りだし、室温で乾燥すると水不溶性のセリシンナノファイバーが製造できる。これが第1工程である。この場合、温度を高くすれば、吸着時間は短くなる。【0103】溶解性のセリシンナノファイバーを完全に水不溶化するには、上記したようにアルコールで水不溶化する第1工程か、または以下の(a)のパラホルムアルデヒドで水不溶化する第1工程を経れば良く、次いで染色性の向上などのために、水不溶性セリシンナノファイバーに対して、以下の化学加工処理(b)の第2工程を行う。リン酸緩衝液pH7.4にセリシンナノファイバーを室温で2時間浸漬処理した後、試料を取り出し十分に水洗いを行い標準状態で乾燥させる。して製造したセリシンナノファイバーは、水不溶性である。取り出し、DMFで洗浄し、続いて55°Cのアセトンで洗浄することで未反応試薬を除去する。最終的に水で洗浄して室温で乾燥させる。このように第2工程の化学加工処理を行うことにより染色性などの向上した水不溶化ナノファイバーが得られる。エレクトロスピニングで製造したセリシンナノファイバーに水・アルコールの混合溶液を作用させる際、ポリスチレン容器の底部分に水・アルコールを入れ、セリシンナノファイバーが水・アルコールに触れないようにして水・アルコール蒸気に一定時間晒すことが効率的である。しかるのち、プラスチック容器からセリシンナノファイバーを取り出した後、室温の標準状態で軽く乾燥させるとよい。不溶化には公知のアルコールを用いることができ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどが例示できる。水・アルコール混合溶液において、まず水がセリシンに浸透し、構造を弱め、しかるのち、アルコールが弱まった構造部分に入り込み、脱水効果を与えセリシンが結晶化するのであろう。そのため、アルコール溶液に水を所望により適当量入ることが必要であり、セリシン繭層を結晶化させるためのアルコール濃度は、通常、30~90v/v%、好ましくは40~80v/v%である。30v/v%未満ではアルコールによる脱水作用が少なくなり結晶化効果が薄れる傾向があり、90v/v%を超えると水による拡散が不十分となり、結晶化度を向上させることは困難となる傾向がある。【0107】メタノール、エタノールを用いるときは所望により水を加えアルコール濃度60~80v/v%のアルコール水溶液を用い、セリシン繭層を室温で5分以上浸漬した後に取り出し、室温で乾燥するとよい。浸漬用アルコールが60v/v%未満であると結晶化速度が遅くなり、十分に結晶化しない傾向があり、また80v/v%を超えるとサンプル中に水が拡散しなくなり、逆に結晶化が進まなくなる傾向がある。【0108】上記第2工程としての(b)の化学加工処理を更に詳細に説明する。【0109】セリシンナノファイバーの染色性を向上させるためには、水不溶性のセリシンナノファイバーをエポキシ化合物で化学加工処理するとよい。グリセロールポリグリシジルエーテル(ナガセ化成工業(株)製、商品名:デナコールEX-313およびEX-314)のように3官能性エポキシ化合物や、エチレングリコールジグリシジルエーテル(ナガセ化成工業(株)製、商品名:デナコールEX-810)のような2官能性エポキシ化合物を用いて化学加工処理することができる。対する有機溶媒としては、従来公知の有機溶媒を利用できる。このようなものとしては、例えば、N,N-ジメチルホルムアミド(DMFと略記することもある)、ジメチルスルホキシド(DMSOと略記することもある)、ジメチルアセトアミド(DMAと略記することもある)、テトラヒドロフラン、ピリジン等が挙げられる。本発明においては、例えば、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)等の使用が特に好ましい。【0111】本発明によれば、上記したセリシン溶液を用いてエレクトロスピニングするに際して、セリシンナノファイバーに第二物質としてカイコ由来の絹フィブロイン(単に、フィブロインということもある)を複合してセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを提供することができる。この絹フィブロインの原料としては、絹糸を溶解して製造できるフィブロインスポンジを原料として用いることができる。このフィブロインスポンジは、次のようにして製造できる。【0112】例えば、絹フィブロイン繊維を臭化リチウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硝酸アンモニウム等の加熱した中性塩水溶液(例えば、60°Cの7Mの臭化リチウム水溶液)で溶解し、セルロース製透析膜で水と置換する透析法を採用する。その結果得られる、絹フィブロイン以外の夾雑物が除去された絹フィブロイン水溶液にメタノールやエタノール等のアルコールを添加して凝固させた後、凍結乾燥することでフィブロインスポンジ(シルクスポンジともいう)が製造できる。このシルクスポンジを、時間をかけながらTFA、HFAc、HFIP、FA等(TFA、FAが好ましく、ナノファイバー製造の効率的、経済的な視点からすると、TFAが特に好ましい)に溶解してシルクのフィブロイン溶液(フィブロインドープ)を調製することができる。このフィブロイン溶液を用いてエレクトロスピニングする。【0113】例えば、セリシンホープ繭層をTFAに溶解してなるセリシンTFA溶液に、シルクスポンジをFAまたはTFAに溶解したフィブロイン溶液を複合して製造できるセリシン・フィブロイン複合溶液を用いてエレクトロスピニングすることで、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを製造できる。ならびに金属イオン吸着性、耐薬品性および染色性に関する記載は、全て適用され得るので、その詳細については説明しない。以下、本発明を実施例および比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。実施例で使用する試料特性の測定方法は次の通りである。本発明で調製したセリシンナノファイバーやセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの理化学的特性を明らかにするため次の項目の試験を行った。65°Cの4M塩酸水溶液および0.1M水酸化ナトリウム水溶液のそれぞれにサンプルを1時間浸漬処理し、処理前後の重量変化から酸溶解度とアルカリ溶解度とを評価した。上式において、Mbは、薬品処理前のサンプル重量(105°Cで1時間30分乾燥)であり、Maは、薬品処理後のサンプル重量(105°Cで1時間30分乾燥)である。アルコール処理により水不溶化したセリシンナノファイバーを、更にEDTA二塩基酸無水物を含み加熱した有機溶媒で処理することで金属イオンの配位基となるEDTAをセリシンナノファイバーに導入して金属イオン吸着用の試料を製造した。これを0.5mMの硝酸銀水溶液あるいは0.5mMの硝酸銅水溶液に浸漬することで、銀イオンあるいは銅イオンを吸着させた。Spectrometer(ICP-AES))を用いて定量した。5~10mgの試料を、ミクロウェーブ加水分解炉(MDS-81DCCEM)を用いて2mLの65%硝酸で完全に加水分解し、実験時にさらに10mLの水を加え、ICP-AES分析を行った。金属イオンの吸着量は、試料重量(g)あたりの金属イオン量をmmolで表示した。加熱溶解後55°Cに保持した半合成脇本培地またはキングB培地25mLと、トマトかいよう病細菌(濃度109/mL)2mLとを混合し、この混合物をシャーレに流し込んで平板状に固めた。約1cm四方の試料膜(水不溶化セリシンナノファイバー)を置き、試料全体を培地に密着させた。これを20~25°Cに保ち、所定の経過時間毎に検定試料付近の培地での菌増殖阻害程度を、試料の周囲に現れる阻止円の大きさをmm単位で実測し、阻止円のサイズ変化から抗菌活性の有無、優劣を評価した。水不溶化セリシンナノファイバーの染色には、エタノール・水の混合水溶液系を染色浴にした「溶媒染色法」によることが最適である。溶媒染色法によると、未加工・未処理のセリシンナノファイバーは、酸性染料で効率的に染まるが、化学加工処理によりカルボキシル基等を導入した水不溶化セリシンナノファイバーは、塩基性染料で特異的に染色できるようになる。)を含む有機溶媒系で染色するとよい。浴比を1:100に設定し、染色は、室温で1時間処理することが好都合である。溶媒染色法では次の染料を用いることができる。