Kit(キアゲン社製、以下同じ)で精製した。じ)にそのcDNAを組み込み、その組換えベクターを大腸菌に形質転換させ、各cDNAのクローンを得た。各cDNAクローンについてシークエンス測定を行った。【0102】得られた各塩基配列情報に基づきコンティグシークエンスを作成した結果、菌体中に存在した四種類の二本鎖RNAについて、いずれについても、ほぼ全長の塩基配列を取得できた。Transferase(タカラバイオ株式会社製)を用いてその一本鎖cDNAにデオキシシトシンホモポリマーをアンカー配列として付加した。次に、デオキシグアニンホモポリマーの付いたアダプタープライマーを合成し、遺伝子特異的なアンチセンスプライマーを合成し、両プライマーに挟まれた部分をPCR法により増幅してcDNAを合成した。Kitで精製し、その末端をリン酸化修飾した後、pUC19プラスミドベクターにそのcDNAを組み込み、その組換えベクターを大腸菌に形質転換させ、各cDNAのクローンを得た。各cDNAクローンについてシークエンス測定を行った。【0106】以上の手順により、新規マイコウイルスの遺伝子情報の全長配列を得た。このマイコウイルスは、四種類の二本鎖RNAから構成されている。各二本鎖RNAの配列を配列番号1~4に示す。二本鎖RNAをcDNAに置換してシークエンス測定を行っているため、配列表では「ウラシル」が「チミン」に置換されている。【0107】なお、得られた塩基配列について解析を行った結果、配列番号1に示すRNA配列には、トチウイルス及びその近縁ウイルスなどに存在するRdRp(RNA依存性RNA合成酵素)の保存モチーフが含まれていた。配列番号3に示すRNA配列には、ラ・フランス病ウイルスのL3二本鎖RNA断片と相同性を有する領域が含まれていた。【0108】この結果は、本発明に係る四種類の二本鎖RNAが、新規マイコウイルスの遺伝子情報であることを示す。【実施例8】【0109】実施例8では、本発明に係るマイコウイルスのウイルス粒子について、生化学的特性の解析を行った。1a株を液体窒素で凍結させ、乳鉢で摩砕した。そのサンプルに4~6倍容量の0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)を加え、ミキサーで攪拌した。次に、リン酸緩衝液に対して40%容積のブタノール・クロロホルム(容積比1:1)を加え、30分間攪拌し、遠心(8,000×g、10分間)してその上清を回収し、この操作を数回繰り返した。【0111】次に、その上清にポリエチレングリコール(平均分子量6,000)を終濃度8%、塩化ナトリウムを終濃度1%になるように加えて溶解させ、4°Cで3時間放置してウイルス同士を凝集させ、遠心(12,000×g、20分間)し、ポリエチレングリコールにより凝集されたウイルス沈殿物を得た。【0112】このウイルス沈殿物を適量の0.05Mリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、溶け残った不純物を遠心(6,000×g、5分間)して除去し、その上清を回収した。【0113】次に、クッションとして遠心チューブの底から約1cm程度の高さになるように20%ショ糖を分注し、回収した上清を重層させ、超遠心(100,000×g、2時間)し、その沈殿物を少量の0.05Mリン酸緩衝液(pH7.0)に溶かし、これを部分純化ウイルス標品とした。【0114】このウイルス標品の一部をSDS-PAGE(7.5%ゲル、トリスーグリシンバッファー(pH8.8)、20mA、90分間)し、CBB(クーマシーブリリアントブルー)で染色し、ウイルスタンパク質の主な成分(外皮タンパク質)の分子量解析を行った。【0115】その結果、約70kDaのサイズにウイルス粒子由来のタンパク質のバンドを検出した。【0116】そこで、SDS-フェノール法で、この70kDaのタンパク質が検出される成分から核酸抽出を行った。その結果、2.8~3.6kbpの4成分の2本鎖RNAが検出された。【0117】以上、本実施例により、本発明に係るマイコウイルスのウイルス粒子の存在を確認できた。【実施例9】【0118】実施例9では、本発明が植物病害真菌の防除に有効であるかどうかを、噴霧接種法で検討した。1a株をオートミール培地プレートに接種し、25°Cの室内で培養した。接種後15日目に分生子が充分できていない場合は、プレートに滅菌蒸留水を2mL程度注ぎ、筆で培地表面をこすって気菌糸を取り除き、このプレートを3日間ブラックライト下に置いて分生子形成を誘導し、滅菌蒸留水を1mL程度注ぎ、再び筆で培地表面をこすって気菌糸ごと分生子を回収し、分生子含有液を得た。接種後15日目に分生子が充分できている場合は、プレートに滅菌蒸留水を2mL程度注ぎ、筆で培地表面をこすって気菌糸ごと分生子を回収し、分生子含有液を得た。対照として、イネいもち病菌のマイコウイルス完全治癒株を実施例3と同様の手順で作製し、その菌から同様の手順で分生子含有液を得た。【0120】次に、それらの分生子含有液をキムワイプ又はガーゼでろ過し、分生子濃度を2×106個/mLに調整し、0.02%(v/v)のTween20を加え、分生子懸濁液とした。菌のレースを考慮して適宜選択した品種、播種後2~3週間目のもの)に、ノズルを用いて分生子懸濁液をまんべんなく噴霧し、植物体を26°C、相対湿度100%の接種箱で24時間静置した後、ポットを温室に移して室温を23~30°Cに維持し、噴霧接種後7日間培養した。噴霧接種後7日目に一定葉面積あたりの3~4mmとなった罹病性病斑の数を計測した。【0122】結果を図2に示す。図2は、イネいもち病菌を接種した葉における病斑数を示すグラフである。本発明に係るマイコウイルスに感染したイネいもち病菌から調製した分生子懸濁液を噴霧した場合の病斑数を、「完全治癒株」はイネいもち病菌のマイコウイルス完全治癒株から調製した分生子懸濁液を噴霧した場合の病斑数(対照)を、それぞれ表す。【0123】図2に示す通り、本発明に係るマイコウイルスに感染したイネいもち病菌から調製した分生子懸濁液を噴霧した場合、対照と比較し、病斑数が顕著に減少した。この結果は、本発明が植物病害真菌の防除に有効であることを示す。【実施例10】【0124】実施例10では、本発明が植物病害真菌の防除に有効であるかどうかを、パンチ付傷接種法で検討した。【0125】実施例9と同様の手順で分生子懸濁液を調製し、3%素寒天膜に同液を付着させ,寒天膜を約2mm角に切り取り、寒天片を作製した。23~30°Cの温室で栽培したイネの第4葉を接種用パンチではさみ、浸潤状の傷をつけ、その付傷部分に寒天片を乗せ、植物体を26°C、相対湿度100%の接種箱で24時間静置した後、ポットを温室に移して室温を23~30°Cに維持し、接種後14日間培養した。接種後14日目に病斑の大きさを計測した。【0126】その結果、本発明に係るマイコウイルスに感染したイネいもち病菌から調製した分生子懸濁液を接種した場合、対照と比較し、病斑の大きさが顕著に小さかった。この結果は、実施例9と同様、本発明が植物病害真菌の防除に有効であることを示す。【実施例11】【0127】実施例11では、菌体外に存在したウイルス粒子を電子顕微鏡により同定した。Extract0.5%、グルコース2%)中で培養し、その培養上清からウイルス粒子を単離した。その培養上清を遠心(10,000×g、5分間)し、その上清を超遠心(100,000×g、30分間)し、ウイルス粒子を含む沈殿物を得た。その沈殿物を0.05Mリン酸バッファー(pH7.0)に溶解し、リンタングステン酸又は酢酸ウランを用いてネガティブ染色し、電子顕微鏡(倍率:×20,000~40,000)で観察した。【0129】結果を図3に示す。1a株の培養上清から得られたウイルス粒子の電子顕微鏡写真である。図3に示す通り、電子顕微鏡により、本発明に係るマイコウイルスのウイルス粒子を同定できた。このウイルス粒子は、約30~40nmの正6角形様であり、エンベロープ様の構造に包まれていた。2】実施例9において、イネいもち病菌を接種した葉における病斑数を示すグラフ。