内因性遺伝子と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素(ALS)遺伝子とを含む発現ベクターを用いて宿主トウモロコシに導入する形質転換トウモロコシの製造方法において、配列番号1の塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出する工程と、上記ポリヌクレオチドが存在する個体を形質転換トウモロコシと判定する工程とを含む形質転換トウモロコシの製造方法。本発明は、マーカーを利用した形質転換トウモロコシの製造方法、当該マーカーを含む発現ベクター、及び当該発現ベクターを含む形質転換トウモロコシに関する。植物に外部から遺伝子を導入してその形質を変える植物形質転換の手法としては、アグロバクテリウム菌を介するアグロバクテリウム法、遺伝子銃によるパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等が知られている。近年ではアグロバクテリウム法によるプラスミドバイナリーベクターを用いた形質転換が主流となってきており、タバコやシロイヌナズナ等の双子葉植物またはイネやトウモロコシの単子葉植物に対して適応できる。ここに挙げた形質転換手法では、いずれの場合も遺伝子が導入された植物、培養細胞(カルス)、種子等を選抜する必要がある。性質を持った選抜マーカー遺伝子を持たせ、特定の除草剤や抗生物質の存在下で生育する個体を選抜する。後代の種子にはメンデル則によって遺伝子が導入された種子と導入されない種子に分離される。ALS)遺伝子に特定の変異が導入された変異型ALS遺伝子が使用されている。ここで、変異型ALS遺伝子としては、形質転換を受ける植物種由来の遺伝子を用いることが好ましい。トウモロコシの形質転換には、トウモロコシ由来の変異型ALS遺伝子をマーカー遺伝子として利用する。変異型ALS遺伝子としては、スルホニルウレア系除草剤に対して特異的な抵抗性を有するもの、イミダゾリノン系除草剤に対して特異的な抵抗性を有するもの、或いはスルホニルウレア系除草剤とイミダゾリノン系除草剤の両方に対して抵抗性を有するものが挙げられる。これら以外にも、アミノ酸置換を伴う変異をALS遺伝子へ導入することで、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤から選ばれる少なくとも1種の除草剤に対する抵抗性を付与することが明らかとなっている(非特許文献1)。特許文献1及び2には、イネ由来のALS遺伝子に特定のアミノ酸置換変異を導入することで、ピリミジニルカルボキシ系除草剤に対する優れた抵抗性を付与できることが示されている。トウモロコシ由来の変異型ALSとしては、ドメインBのトリプトファンがロイシンに、ドメインEのセリンがイソロイシンに変異した変異型ALSが知られている。この変異型ALSは、ピリミジニルカルボキシ系除草剤に対する優れた抵抗性を有している。この変異型ALS遺伝子を選抜マーカー遺伝子として利用することで、ピリミジニルカルボキシ系除草剤に対する抵抗性を指標として形質転換トウモロコシの後代を選抜できるが、トウモロコシ由来の変異型ALSは、他の植物と比較して抵抗性の程度が十分に高いとは言えない。したがって、この変異型ALSを利用して形質転換トウモロコシの後代を選抜する際には、除草剤抵抗性のみならず他の手段によって判断する必要があった。導入された変異型ALS遺伝子をPCRで増幅し、シークエンシングにより配列を決定することで形質転換トウモロコシの後代を選抜できる。図8に示すように、変異型ALS遺伝子が導入されたか否かは、変異型ALS遺伝子を含むDNA断片を制限酵素で処理して得られる断片のサイズに基づいて判断することができる。Iで切断されるが、変異型ALS遺伝子を含むDNA断片は切断されない。この差異を利用することで形質転換トウモロコシの後代を選抜できる。使用できる発現ベクター、当該発現ベクターを含む形質転換トウモロコシを提供することを目的とする。Element)様因子を特定し、これを利用することで変異型ALS遺伝子を含む発現ベクターが組み込まれたことを検出できることに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。上記ポリヌクレオチドが存在する個体を形質転換トウモロコシと判定する工程とを含む形質転換トウモロコシの製造方法。(2)上記宿主トウモロコシは、Na65品種以外の品種であることを特徴とする(1)記載の形質転換トウモロコシの製造方法。(3)上記発現ベクターを宿主トウモロコシに導入する処理の後で、上記ポリヌクレオチドを検出する工程の前に、処理後のトウモロコシ個体を除草剤に接触させ除草剤耐性を有するトウモロコシ個体を選抜する工程を含む(1)記載の形質転換トウモロコシの製造方法。(4)上記除草剤は、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤から選ばれる少なくとも1種の除草剤であることを特徴とする(3)記載の形質転換トウモロコシの製造方法。(5)上記ポリヌクレオチドを検出する工程では、上記ポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅を行うことを特徴とする(1)記載の形質転換トウモロコシの製造方法。(6)導入目的の内因性遺伝子を挿入する部位と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素(ALS)遺伝子とを含む発現ベクターにおいて、当該変異型アセト乳酸合成酵素(ALS)遺伝子の3'-非翻訳領域に以下の(a)〜(c)のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。(7)上記内因性遺伝子が組み込まれたことを特徴とする(6)記載の発現ベクター。(8)上記(6)又は(7)記載の発現ベクターを含む形質転換トウモロコシ。本発明によれば、変異型ALS遺伝子に含まれる特定の領域を使用することで、変異型ALS遺伝子が導入された形質転換トウモロコシを簡易に判定することができる。本発明を適用することによって、非常に簡便かつ低コストに形質転換トウモロコシを製造することができる。【図面の簡単な説明】【0014】【図1】トウモロコシ自殖系統Na65由来ALS2遺伝子の解析スキームを示す図である。【図2】トウモロコシ自殖系統Na65由来ALS2遺伝子のクローニングを示す図である。【図3】クローニングしたALS2遺伝子を基にして、2点変異型ALS(W542L/S621I)を作製するフロー図である。【図4】2点変異型ALS遺伝子及びGFP遺伝子を挿入したバイナリベクターを作製するフロー図である。【図5】トウモロコシ自殖系統Na65及びMi29におけるALS2遺伝子とPCRに使用したプライマーとの関係を示す模式図である。【図6】実施例10で行ったPCRの結果を示す電気泳動写真である。【図7】実施例11で行ったPCRの結果を示す電気泳動写真である。【図8】変異型ALS遺伝子が導入されたか否を制限酵素断片により判別する際の判別スキームを示す図である。以下、本発明を詳細に説明する。本発明では、トウモロコシを宿主植物とした形質転換に際して、形質転換トウモロコシを判別するための新規マーカー領域を提供する。この新規マーカー領域は、以下の(a)〜(c)のいずれかに記載されたポリヌクレオチドである。element)]配列(配列番号2)を含む塩基配列である。配列番号1の塩基配列は、トウモロコシ自殖系統Na65のALS2(ZmALS2)遺伝子の終止コドンに隣接した塩基からMITE配列を含む540塩基からなる。上記(b)において、「複数の塩基」とは、1〜10個の塩基、好ましくは1〜5個の塩基を意味する。配列番号1の塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加され得る領域としては、特に限定されない。Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。詳細に、ストリンジェントな条件としては、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68°C、好ましくは42〜65°Cである。NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42°Cである。従来、ゲノムDNAに2個存在すると考えられるトウモロコシALS遺伝子のターミネーターから3'-非翻訳領域に至る配列はDDBJ/NCBI/EMBL公開のアクセッション番号BT042814、BT019211、DY398831、AW056264、EC899385、DT947958、DT943695、CF627002、DN215004、DR796514、AW165578、AW054309、DT943694、FM194841、CF044302、AC205154、GP518224、G71374及びI07769により公知である。これら登録された配列情報には、配列番号1の塩基配列は含まれていない。ALS2(ZmALS2)遺伝子の3'-非翻訳領域に含まれるMITE配列は新規な塩基配列といえる。DDBJ/NCBI/EMBL公開のアクセッション番号BU050334及びBM736838の配列は、トウモロコシALS遺伝子のターミネーターにMITE配列が隣接して結合しているが、MITE配列より更に3'-非翻訳領域に至る配列については明らかにしておらず、この配列情報を用いてPCR等の手法により遺伝子導入個体を識別することはできない。本発明の発現ベクターは、トウモロコシ自殖系統Na65以外のトウモロコシ品種・系統に所望の遺伝子を導入する際に使用される。導入されたか否かは、内因性遺伝子を含むDNA断片を増幅する方法によっては判別することができない。内因性遺伝子が導入されていなくても、本来的に内在する遺伝子を含むDNA断片が常に増幅されるからである。本発明の発現ベクターは、上述したマーカー領域を含む変異型ALS遺伝子と、導入目的の内因性遺伝子と含む。03/083118号公報に開示されるように、特定のアミノ酸変異を有することで特定の除草剤に対して耐性を有するALSをコードする遺伝子である。本発明において、変異型ALS遺伝子としては、これら従来公知の変異型ALS遺伝子のいずれも使用することができる。ここで、変異型ALS遺伝子とは、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤から選ばれる少なくとも1種の除草剤に対する抵抗性を示す変異型ALSをコードする遺伝子である。マーカー領域を含む変異型ALS遺伝子とは、言い換えると、トウモロコシ自殖系統Na65由来であって、3'-非翻訳領域のMITE配列を含む野生型ALS遺伝子に対して、特定のアミノ酸置換変異を伴う変異が導入された遺伝子と同義である。本発明の発現ベクターに含まれる導入目的の内因性遺伝子は、特に限定されず如何なるタンパク質をコードする遺伝子であっても良い。導入目的の内因性遺伝子は、公知のプロモーターと連結したかたちで発現ベクターに組み込まれても良い。かかるプロモーターは、トウモロコシ内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。プロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(CaMV35S)、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのPR1a遺伝子プロモーター、トマトのリブロース1,5−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、アクチン遺伝子プロモーター又はユビキチン遺伝子プロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、トウモロコシ内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。これらマーカー領域を含む変異型ALS遺伝子や導入目的の内因性遺伝子をベクターに挿入するには、まず、変異型ALS遺伝子や内因性遺伝子を含む精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明においては、任意遺伝子を発現させるため、上記発現ベクターに、さらに当該任意遺伝子を挿入することができる。任意の遺伝子を挿入する手法は、ベクターに本発明のDNA断片を挿入する方法と同様である。本発明の発現ベクターは、上述したマーカー領域を含む変異型ALS遺伝子と、導入目的の内因性遺伝子の他に、従来トウモロコシの形質転換に利用されている発現ベクターと同様な構成を有していても良い。従来トウモロコシの形質転換に利用されている発現ベクターとしては、いわゆるアグロバクテリウム法に使用されるバイナリーベクター、パーティクルガン法に使用されているベクターを挙げることができる。マーカー領域を含む変異型ALS遺伝子や導入目的の内因性遺伝子を挿入するベクターとしては、例えばpSTARA(クミアイ化学工業株式会社)、pBI101(Clonetech社)などのベクターを使用することができる。本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを宿主となるトウモロコシに導入することにより得ることができる。ここで、宿主となるトウモロコシとしては、トウモロコシ自殖系統Na65以外のトウモロコシ品種・系統である。トウモロコシ自殖系統Na65は、配列番号1の塩基配列に含まれるMITE配列を本来的に有する。したがって、トウモロコシ自殖系統Na65に対しては、本発明の発現ベクターが導入されたか否かを上述したマーカー領域の存在・非存在に基づいて判断できない。言い換えると、トウモロコシ自殖系統Na65以外のトウモロコシ品種・系統であれば、本発明の発現ベクターが導入されたか否かを上述したマーカー領域の存在・非存在に基づいて判断することができる。)又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。宿主となるトウモロコシ(自殖系統)としては、例えば、Mi29(九州沖縄農業研究センター育成のデント型自殖系統)、Ho102(北海道農業研究センター育成のデント型自殖系統)、Pa91(アメリカ合衆国で育成されたデント型自殖系統)、H99(アメリカ合衆国で育成されたデント型自殖系統)、A188(アメリカ合衆国で育成されたデント型自殖系統)等を挙げることができる。上述した本発明の発現ベクターは、通常の形質転換方法、例えば電気穿孔法(エレクトロポレーション法)、植物ウイルス法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等によって植物中に導入することができる。エレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧500〜1600V、25〜1000μF、20〜30msecの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入する。そのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置(例えばBio-Rad社のPDS-1000/He等)を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は1000〜1800psi程度の圧力、5〜6cm程度の距離で行う。植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体から切り出し、植物宿主に接種することによって、目的遺伝子を植物宿主に導入することができる。アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用する方法においては、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドDNAの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、目的遺伝子を植物宿主に導入する。rhizogenes)は、植物に感染して毛状根を発生させる。DNA)と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。Ti又はRiプラスミド上のT-DNA領域中に、植物ゲノム中に組み込みたいDNAを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物宿主に感染する際に目的とするDNAを植物ゲノム中に組込むことができる。器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン(オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等)の投与などにより植物体に再生させることができる。導入目的の内因性遺伝子が宿主トウモロコシに組み込まれたか否かの確認は、PCR法により行うことができる。得られた形質転換トウモロコシから定法に従ってDNAを調製し、上述したマーカー領域を特異的に増幅するように設計された一対のプライマーを用いてPCRを行う。PCRは、ディネーチャーを94〜98°Cで10秒〜1分、アニールを50〜65°Cで30秒〜2分、エロンゲーションを65〜75°Cで30秒〜2分とするサイクルを、例えば20〜40サイクル行う条件とすることができる。Green液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出する。これにより、上述したマーカー領域が形質転換トウモロコシに存在することを確認することができ、導入目的の内因性遺伝子が導入されたと判断することができる。蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。上述したようにPCR法によりマーカー領域の存在・非存在を確認するのに先立って、変異型ALS遺伝子により付与された除草剤抵抗性により形質転換トウモロコシを選抜しても良い。上述したように各種方法により形質転換を行った後、得られた個体を除草剤の存在下に培養・生育する。変異型ALS遺伝子を有しない個体や野生型の個体は、除草剤の存在下において死滅したり生育が大幅に抑制される。本発明の発現ベクターを有する個体は、変異型ALS遺伝子が発現することにより除草剤の存在下にて生育できる。この除草剤抵抗性の獲得を指標として形質転換トウモロコシを選抜し、その後、上述したマーカー領域の存在・非存在をPCRによって確認しても良い。ここで、除草剤としては、発現ベクターに使用した変異型ALS遺伝子により適宜選択して使用することができる。除草剤としては、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤を使用することができる。ピリミジニルカルボキシ系除草剤としては、ビスピリバックナトリウム塩、ピリチオバックナトリウム塩、ピリミノバックを例示することができる。スルホニルウレア系除草剤としては、クロルスルフロンを例示することができる。イミダゾリノン系除草剤としては、イマザキンを例示することができる。トリアゾロピリミジン系除草剤としては、ペノキススラム、ピロクススラムを例示することができる。トリアゾリノン系除草剤としては、フルカルバゾンナトリウム塩、プロポキシカルバゾンナトリウム塩を例示することができる。形質転換植物体に再生することができる。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、LS培地、MS培地などが例示される。本発明の「植物体を製造する方法」は、本発明の発現ベクターで形質転換した形質転換トウモロコシ細胞を得て、該形質転換トウモロコシ細胞から形質転換トウモロコシを再生し、得られた形質転換トウモロコシから種子を得て、該種子からトウモロコシを生産する工程を含む。形質転換トウモロコシから種子を得るには、例えば、形質転換トウモロコシを発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる。生育させることにより、植物体を生産する。以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。Scientific社)を用いPCRを行った。PCRは初期denature:98°C(5min)、denature:98°C(30sec)-annealing:58°C(30sec)-elongation:72°C(1min)を40サイクル、最終elongation:72°C(7min)の条件で行った。GC含量が高いので、PCRの際、DMSOを5%添加した。Technologies社)を用いてダイレクトシークエンスを行った。その結果、ALS2と相同性の高い配列であることが確認された。Scientific社)を用いPCRを行い、ALS2遺伝子の-352〜1833番目の塩基配列を増幅した。DMSOを5%添加し、初期denature:98°C(5min)、denature:98°C(30sec)-annealing:58°C(30sec)-elongation:72°C(2min)を40サイクル、最終elongation:72°C(7min)の条件で反応した。Technologies社)を用いてダイレクトシークエンスを行い、配列を決定した。Kitを用いたゲノムウォーキングによりPCRクローニングし配列を決定した。Scientific社)を用い、トウモロコシNa65系統ゲノムDNAを鋳型とし、配列特異的センスプライマー(ZmALS-5:5'-CCAGATTTTGTGGCAATTGCTAAAGGG-3':配列番号6)とキット添付のDW-ACP1、2、3及び4の組合わせで反応溶液を調製し、98°C(5分)-42°C(1分)-72°C(2分)の条件で反応した後、98°C(40秒)-55°C(40秒)-72°C(1分)のサイクルを40回繰り返し、最後に72°Cで7分間反応を行った。引き続き1回目のPCR反応液1μLを鋳型として用い2回目のPCRを行った。配列特異的プライマー(ZmALS-5:上記)とキット添付のプライマーDW-ACP-Nの組合わせで、98°C(5分)保持し、98°C(30秒)-58°C(30秒)-72°C(1分)のサイクルを40回繰り返し、最後に72°Cで7分間反応を行った。プライマーDW-ACP-1を用いた反応液を鋳型とした2回目のPCR生成物に約800bpのPCR産物が増幅されたのでこれをアガロースゲルから回収した。Technologies社)を用いたダイレクトシークエンシングによってターミネーター領域から3'-非翻訳領域に至る配列の決定を試みたが、ダイレクトシークエンシングではシグナルが急激に減衰し、解析が困難であった。そこでこれをpUC18プラスミドにサブクローニングした後、シークエンス解析を行った。I/BAP処理したpUC18ベクターに平滑末端同士で連結し、pUC18プラスミドへサブクローニングし、大腸菌(JM109株)に導入した。50ppmアンピシリン含有LB培地上でシングルコロニーを選び、4コロニーからプラスミドを抽出し、ターミネーター領域から3'-非翻訳領域に至る配列(540bp)を含むALS2のシークエンスを解析した。これら4個のコロニー由来のシークエンス配列が全て一緒の配列であったことから、PCRで用いたDNA合成酵素に由来する変異導入はないと考え、正しい配列として確定した。実施例1でトウモロコシ自殖系統Na65由来ALS2のプロモーター領域の352bpの配列が明らかになったが、更に上流のプロモーター領域の配列解析をゲノムウォーキングにより行った。Scientific社)を用いゲノムウォーキングを行った。Scientific社)0.25μLを最終量25μLとなるように混和した。98°C(5分)-42°C(1分)-72°C(2分)でインキュベート後、98°C(40秒)-55°C(40秒)-72°C(1分)の反応を40サイクル行い、最後に72°Cで7分間インキュベートした。Science社)を用いてカラム精製し、精製液1μLを鋳型として用い、プライマーDW-ACP-N(10μM)0.5μL及び配列特異的プライマーZmALS-21(3.2μM)2μLを用いた。これら以外は最初のPCRと同様の組成で反応を行った。98°C(5分)保持し、98°C(30秒)-58°C(30秒)-72°C(1分)の反応を40サイクル行い、最後に72°Cで7分間インキュベートした。Science社)を用いて精製した。ダイレクトシークエンシングによって本PCR産物の配列を解析し、プロモーター領域のシークエンスを決定した。トウモロコシ自殖系統Na65のゲノムDNAを鋳型として以下の2組のプライマーを用いて、DNA断片を増幅させた。ターミネーターカセット(P2)を増幅し取得した。実施例1〜3により取得したALS2プロモーター領域-ALS2遺伝子-ALS2ターミネーター領域の塩基配列を配列番号13に示した。ALS2遺伝子がコードするALS2タンパク質のアミノ酸配列を配列番号14に示した。トウモロコシALS2上への2点変異(W542L/S621I)の導入は、P1をpUC18プラスミドにサブクローニングした後に行った。I/BAP処理したpUC18プラスミドに平滑末端で組み込み、Plasmid-1を得た。この精製したプラスミドのALS遺伝子のアミノ酸配列上621番目のセリン(Ser)に対応するコドン(AGT)をイソロイシン(Ile)に対応するコドン(ATT)に変換後、542番目のトリプトファン(Trp)に対応するコドン(TGG)をロイシン(Leu)に対応するコドン(TTG)に変換した。Plasmid-1を鋳型として、プライマーZmALS_mut_S621I(5'-CTATTGGTGGGGCTTTCAAGG-3':配列番号15、センス)とZmALS-29(5'-GGATCATAGGCAACACATGC-3':配列番号16、アンチセンス)を用いてプラスミド全長を一周してPCRで増幅させた。Scientific社)を用い、98°Cで5分間インキュベート後、98°C(30秒)-58°C(30秒)-72°C(1分)の反応を40サイクル行い、最後に72°Cで7分間インキュベートした。kinaseを用いてリン酸化した後、セルフライゲーションさせALS2上にS621Iの変異の入ったプラスミド(Plasmid-2)を作製した。本プラスミドを鋳型として、W542Lの変異を導入した。S621I変異導入と同様のPCR条件で、プライマーZmALS_mut_W542L(5'-GTTGGAGGACAGGTTCTATAAG-3':配列番号17、センス)/ZmALS-28(5'-TGCACCACCATCCCGAGGTG-3':配列番号18、アンチセンス)のセットでプラスミド全長をPCRで増幅させた。kinaseを用いてリン酸化した後、セルフライゲーションさせW542L/S621Iの2点変異を含むプラスミド(Plasmid-3)を作製した。Kit(QIAGEN)で精製し取得した。Iで処理し、ORFの2点変異型ALS2(W542L/S621I)を含むC末端側領域(1331bp)および520bpターミネーター領域を含むDNA断片(F3)を得た。Iで処理し、1013bpプロモーター領域およびORFのN末端領域(586bp)のDNA断片を得た。次にこのDNA断片を同制限酵素で処理したpUC18に導入した。I処理後、セルフライゲーションを防ぐため脱リン酸化BAP処理を行った。ALS2ターミネーターカセットを組み込んだpUC18ベクターを作製した。このプラスミドをPlasmid-4とした。ALS2ターミネーターカセットを含むDNA断片(F4)を切り出した。IIで処理し、pSTARAベクターのバックボーンを切り出した。ALS2ターミネーターカセットを組み込んだpSTARAバイナリーベクタープラスミド(Plasmid-5)を得た。作製してあったシロイヌナズナ2点変異型ALS(W574L/S653I)遺伝子を持つA-3バイナリーベクタープラスミド(クミアイ化学)にLR反応でsGFP(S65T)を導入したプラスミド(Plasmid-6)からCaM35Sプロモーター::sGFP(S65T)::NOSターミネーターカセットを切り出し、Plasmid-5に組込んだ。terminatorを切り出した。IIでも処理しpSTARAプラスミドの基本骨格部分を消化し、CaM35Sプロモーター::sGFP(S65T)::NOSターミネーターカセット断片とアガロースゲル泳動で重ならないようにした。polymeraseで平滑化した。Iで処理し平滑断片とした後、BAP処理を行い5'末端のリン酸基を除去した。これら2つのDNA断片をライゲーションさせ、大腸菌(HST02株)に導入した。CaM35Sプロモーター::sGFP(S65T)::NOSターミネーターカセットがセンス方向に挿入したプラスミドをPlasmid-7とした。スペクチノマイシンを含む)に塗布し、27°Cで3日間静置培養を行った。得られたシングルコロニーをYM液体培地に植菌し、27°Cで3日間振とう培養を行い、その培養液をグリセロールストックとして保存した。R2040)XH84を母材とするSI系統「307042」を花粉親として交配し、「NX694」を作成した。その後「NX694」と「P3352」とを交配し、S0世代(母材)として自殖系統の育成を開始した。各種病害抵抗性についての個体選肢と自殖による固定化を進め、S5世代まで育成し、諸特性の評価で有望と認められたのでこれを自殖系統「Na65」とした。卜種自殖系統間の単交雑Fl系統NX220を種子親とし、デント種Fl品種P3358(パイオニア社)を花粉親として交配し、その後P3358が戻し交配された。R2040(クライド・ブラック&サン社)の掛け合わせで構成されている。P3358をS0世代(母材)として自殖系統の育成を開始し、耐倒伏性と各種病害抵抗性についての有望であった系統の固定化を進め、これを自殖系統「Mi29」とした。2007)により未熟胚へのアグロバクテリウム感染により行った。自家受粉後約10日のトウモロコシ自殖系統Mi29の未熟胚を摘出し、アグロバクテリウム菌(EHA105株、グリセロールストック番号KLB-348)に浸した後、46°Cの高温処置と遠心分離処理を行いLS-AS培地(アセトシリンゴンを含むMS培地)で25°C暗所で約1週間培養した。未熟胚からはカルスが形成されるが、その後ビスピリバックナトリウム塩0.2μMとカルベニシリンを含む培地に移し25°C暗所で2週間〜1ヶ月培養した。ビスピリバックナトリウム塩耐性を示し成長を続けたカルスを28°C連続照明下でゼアチンを含むLSZ培地で2週間〜1ヶ月培養し、シュート形成を促した。シュートが形成されたカルスはさらに棒びん中のLSF培地(0.2mg/lのIBAを含む)に移植し発根を促した。棒びん内で十分発根した組換え体を鉢上げした。(Qiagen社)を用い抽出し、濃度100μg/mlの水溶液を50μl得た。引き続きPCRを全量50μlで調製した。Buffer(MgCl2含)10μl、dNTPs(25mM)4μlである。プライマーは50pmol加え、ZmALS-30/ZmALS-18、ZmALS-30/ZmALS-31、ZmALS-14/ZmALS-18、ZmALS-14/ZmALS-31の4通りの組合わせで混合した(図5参照)。反応条件は95°Cからのホットスタートで開始し、95°C(30秒)-50°C(1分)-72°C(2分)の増幅サイクルを40回繰り返し、最終サイクルの後、72°Cで7分間インキュベートし反応を完結させた。PCR生成物はアガロースゲル電気泳動に供しPCR生成物のサイズを確認した(図6)。使用したプライマーとPCR生成物のサイズとの関係を表1に示す。Kit(Qiagen社)を用い抽出し、濃度100μg/mlの水溶液を50μl得た。引き続きPCRを全量50μlで調製した。(MgCl2含)10μl、dNTPs(25mM)4μlである。プライマーは50pmol加え、ZmALS-14/ZmALS-31の組合わせで混合した。反応条件は95°Cからのホットスタートで開始し、95°C(30秒)-50°C(1分)-72°C(2分)の増幅サイクルを40回繰り返し、最終サイクルの後、72°Cで7分間インキュベートし反応を完結させた。PCR生成物はアガロースゲル電気泳動に供しPCR生成物のサイズを確認した(図7)。導入目的の内因性遺伝子を挿入する部位と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素(ALS)遺伝子とを含む発現ベクターにおいて、当該変異型アセト乳酸合成酵素(ALS)遺伝子の3'-非翻訳領域に以下の(a)〜(c)のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。上記内因性遺伝子が組み込まれたことを特徴とする請求項6記載の発現ベクター。請求項6又は7記載の発現ベクターを含む形質転換トウモロコシ。ekouhou.net。