ブタ精子の接触及び非接触培養(5時間)が精子の運動率へ及ぼす影響。(ASC)を接着させた後、セルインサート内でブタ精子を共培養した場合(接触:セルインサートの膜を介して精子はASCに接触可能。ウェルの底面でASCを培養した後、セルインサート(裏面へのASCの接着なし)をウェルに装着し、セルインサート内でブタ精子を共培養した場合(非接触:セルインサートで隔離されるため、精子はASCに接触できない)を比較した。培養5時間後の精子運動率を示す。ブタ精子の接触及び非接触培養(7時間)が精子の前進運動性へ及ぼす影響。(ASC)を接着させた後、セルインサート内でブタ精子を共培養した場合(接触:セルインサートの膜を介して精子はASCに接触可能。ウェルの底面でASCを培養した後、セルインサート(裏面へのASCの接着なし)をウェルに装着し、セルインサート内でブタ精子を共培養した場合(非接触:セルインサートで隔離されるため、精子はASCに接触できない)を比較した。培養7時間後の前進運動を示した精子の数(精子の運動を約20秒間撮影した映像中でカウントされた前進運動精子の実数)を示す。【図6】体外受精実験の結果。添加又は非添加で前培養したブタ精子を体外成熟ブタ卵子に体外受精した結果を示す。【図7】体外受精実験の結果。(細矢印)、精子尾部(太矢印)、雌性前核(囲い)、極体(矢じり)が認められ、受精していることがわかる(但し、異常受精(多精子侵入)卵)。精子の進入数が多いほど受精能を獲得した精子が多いことになる。【図8】体外受精実験の結果。ASCと接触可能な状態で前培養した精子(精子濃度10x106/ml)で受精した卵子。雌雄両前核(矢印)を形成して極体(卵子上方の小体が核)も放出された正常受精卵である。【図9】体外受精実験の結果。ASCと非接触状態で前培養した精子(精子濃度1x106/ml)で受精した卵子。第2成熟分裂中期の卵子の染色体(矢じり)と第1極体(矢印)が認められるが、精子は全く認められなかった。本発明の第1の局面は精子活性化方法(以下、「本発明の方法」とも呼ぶ)に関する。本発明の方法によれば活性化された精子が得られる。従って、本発明の方法は、活性化精子の生産ないし取得方法ともいえる。精子について使用する用語「活性化」とは、精子の運動性/運動率(特に前進運動性/前進運動率)が高まることを意味する。運動性/運動率の低下を抑え、高い運動性/運動率を維持することも、ここでの「運動性/運動率が高まること」に該当する。精子の活性化は、卵子突入率の向上及び/又は受精率の向上をもたらす。【0009】本発明の方法では、特定の細胞と精子とを共培養する(ステップ(1))。vitro(生体外)で実施される。線維芽細胞が用いられる。典型的にはこれらの細胞のいずれか、即ち一種類の細胞が用いられるが、二種以上の細胞を併用することを妨げるものではない。高い精子活性化効果を認めた。【0010】細胞の由来、即ち生物種は特に限定されないが、本発明の方法に使用する精子の由来、及び本発明の方法によって得られる精子(活性化された精子)の用途を考慮して細胞の由来を決定するとよい。精子の由来がヒトであり、活性化された精子の用途がヒトの疾患の治療であれば、好ましくはヒト細胞を精子との共培養に供する。このように、好ましくは、共培養細胞の生物種と精子の生物種を同一にする。特定の細胞と精子との共培養による所望の効果(即ち、精子の活性化)が種を超えて認められるという驚くべき知見(詳細は後述の実施例を参照)に鑑みれば、精子との共培養に供する細胞の由来が精子の由来と異なっていてもよい。精子との共培養に供する細胞の由来(生物種)の例として、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターを挙げることができる。精子の由来(生物種)の例は、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、鳥類(ニワトリ、ウズラ、カモなど)、魚類(サケ、マス、マグロ、カツオなど)である。一態様では、ヒト精子が用いられる。別の一態様では非ヒト哺乳動物精子(例えばブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジの精子)が用いられる。線維芽細胞の調製は常法に従えばよい。これらの細胞は各種用途に広く用いられており、当業者であれば文献や成書を参考にして容易に調製することができる。公的な細胞バンクから分譲された細胞や市販の細胞などを用いることにしてもよい。調製法と歯髄由来幹細胞の調製法を説明する。(ASC)」に該当するものとする。通常、ASCは、生体から分離された脂肪組織を出発材料とし、細胞集団(脂肪組織に由来する、ASC以外の細胞を含む)を構成する細胞として「単離された状態」に調製される。cells)等とも呼ばれる。ASC、ADRC、AT-MSC、AD-MSC、を相互に置換可能に使用する。工程を経て調製される。ASCの調製法は特に限定されない。Apr;7(2):211-28.等が参考になる)に従ってASCを調製することができる。脂肪組織からASCを調製するための装置(例えば、Celution(登録商標)装置(サイトリ・セラピューティクス社、米国、サンディエゴ))も市販されており、当該装置を利用してASCを調製することにしてもよい。以下、ASCの調製法の具体例を示す。脂肪組織は動物から切除、吸引などの手段で採取される。具体的には例えばサル、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等)を含む。本発明の方法で得られた活性化精子を治療目的で使用する場合には、免疫拒絶の問題を回避するため、活性化精子を適用する対象(レシピエント)と同一の個体から脂肪組織(自己脂肪組織)を採取することが好ましい。同種の動物の脂肪組織(他家)又は異種動物の脂肪組織の使用を妨げるものではない。この中でも皮下脂肪は局所麻酔下で非常に簡単に採取できるため、採取の際のドナーへの負担が少なく、好ましい細胞源といえる。通常は一種類の脂肪組織を用いるが、二種類以上の脂肪組織を併用することも可能である。複数回に分けて採取した脂肪組織(同種の脂肪組織でなくてもよい)を混合し、以降の操作に使用してもよい。脂肪組織の採取量は、ドナーの種類や組織の種類、或いは必要とされるASCの量を考慮して定めることができ、例えば0.5~500g程度である。ヒトをドナーとする場合にはドナーへの負担を考慮して一度に採取する量を約10~20g以下にすることが好ましい。採取した脂肪組織は、必要に応じてそれに付着した血液成分の除去及び細片化を経た後、以下の酵素処理に供される。脂肪組織を適当な緩衝液や培養液中で洗浄することによって血液成分を除去することができる。【0016】酵素処理は、脂肪組織をコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ等の酵素によって消化することにより行う。Publication参照)。/又はこれらの前駆細胞等を含む。細胞集団を構成する細胞の種類や比率などは、使用した脂肪組織の由来や種類に依存する。細胞集団は続いて遠心処理に供される。遠心処理による沈渣を沈降細胞集団(本明細書では「SVF画分」ともいう)として回収する。遠心処理の条件は、細胞の種類や量によって異なるが、例えば1~10分間、800~1500rpmである。遠心処理に先立ち、酵素処理後の細胞集団をろ過等に供し、その中に含まれる酵素未消化組織等を除去しておくことが好ましい。【0018】ここで得られた「SVF画分」はASCを含む。従って、SVF画分を、精子との共培養に使用する細胞として用いることもできる。SVF画分を構成する細胞の種類や比率などは、使用した脂肪組織の由来や種類、酵素処理の条件などに依存する。国際公開第2006/006692A1号パンフレットにはSVF画分の特徴が示されている。これらの前駆細胞等)が含まれる。そこで本発明の一態様では以下の選択培養を行い、SVF画分から不要な細胞成分を除去する。その結果得られた細胞をASCとして本発明に用いる。【0020】まず、SVF画分を適当な培地に懸濁した後、培養皿に播種し、一晩培養する。培地交換によって浮遊細胞(非接着性細胞)を除去する。その後、適宜培地交換(例えば2~4日に一度)をしながら培養を継続する。必要に応じて継代培養を行う。継代数は特に限定されないが、多能性と増殖能力の維持の観点からは過度に継代を繰り返すことは好ましくない(5継代程度までに留めておくことが好ましい)。培養用の培地には、通常の動物細胞培養用の培地を使用することができる。)、MCDB201培地(機能性ペプチド研究所)等を使用することができる。replacement(KSR)など)を添加した培地を使用することにしてもよい。血清又は血清代替物の添加量は例えば5%(v/v)~30%(v/v)の範囲内で設定可能である。【0021】以上の操作によって接着性細胞が選択的に生存・増殖する。続いて、増殖した細胞を回収する。回収操作は常法に従えばよく、例えば酵素処理(トリプシンやディスパーゼ処理)後の細胞をセルスクレイパーやピペットなどで剥離することによって容易に回収することができる。市販の温度感受性培養皿などを用いてシート培養した場合は、酵素処理をせずにそのままシート状に細胞を回収することも可能である。このようにして回収した細胞(ASC)を用いることにより、ASCを高純度で含有する細胞集団を調製することができる。本発明の一態様では、上記(3)の操作の代わりに又は上記(3)の操作の後に以下の低血清培養を行う。その結果得られた細胞をASCとして本発明に用いる。【0023】低血清培養では、SVF画分((3)の後にこの工程を実施する場合には(3)で回収した細胞を用いる)を低血清条件下で培養し、目的の多能性幹細胞(即ちASC)を選択的に増殖させる。低血清培養法では用いる血清が少量で済むことから、本発明の方法で得られた活性化精子を治療目的に使用する場合、対象(患者)自身の血清を使用することが可能となる。自己血清を用いた培養が可能となる。ここでの「低血清条件下」とは5%以下の血清を培地中に含む条件である。好ましくは2%(V/V)以下の血清を含む培養液中で細胞培養する。-2(bFGF)を含有する培養液中で細胞培養する。【0024】血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることができる。本発明の方法で得られた活性化精子をヒトの治療に使用する場合には、好ましくはヒト血清、更に好ましくは治療対象の血清(即ち自己血清)を用いる。【0025】培地は、使用の際に含有する血清量が低いことを条件として、通常の動物細胞培養用の培地を使用することができる。)、MCDB201培地(機能性ペプチド研究所)等を使用することができる。【0026】以上の方法で培養することによって、多能性幹細胞(ASC)を選択的に増殖させることができる。上記の培養条件で増殖する多能性幹細胞(ASC)は高い増殖活性を持つので、継代培養によって、本発明に必要とされる数の細胞を容易に調製することができる。国際公開第2006/006692A1号パンフレットには、SVF画分を低血清培養することによって選択的に増殖する細胞の特徴が示されている。【0027】続いて、上記の低血清培養によって選択的に増殖した細胞を回収する。回収操作は上記(3)の場合と同様に行えばよい。回収した細胞(ASC)を用いることにより、ASCを高純度で含有する細胞集団を得ることができる。【0028】以上の方法では、SVF画分を低血清培養して増殖した細胞が利用に供されることになるが、脂肪組織から得た細胞集団を直接(SVF画分を得るための遠心処理を介することなく)低血清培養することによって増殖した細胞をASCとして用いることにしてもよい。本発明の一態様では、脂肪組織から得た細胞集団を低血清培養したときに増殖した細胞をASCとして用いる。含有する)をそのまま用いることにしてもよい。ここでの「そのまま用いて」とは、選択的培養を経ることなく本発明に用いること、を意味する。5807-12.;国際公開第2006/010600号パンフレット)。【0030】歯髄幹細胞の採取・調製法の一例を以下に示す。この採取・調製法では(1)歯髄の採取、(2)酵素処理、(3)細胞培養、(4)細胞の回収を順に行う。自然に脱落した乳歯(又は抜歯した乳歯、或いは永久歯)をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液で消毒した後、歯冠部を分割し歯科用リーマーにて歯髄組織を回収する。ダルベッコ変法イーグル培地)に懸濁し、2mg/mlのコラゲナーゼ及びディスパーゼで37°C、1時間処理する。5分間の遠心操作(5000回転/分)により酵素処理後の歯髄細胞を回収する。セルストレーナーによる細胞選別はSHEDやDPSCの神経幹細胞分画の回収効率を低下させるので原則、使用しない。細胞を4cc基本培地で再懸濁し、直径6cmの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。5%CO2、37°Cに調整したインキュベータにて3日間培養した後、コロニーを形成した接着性細胞を0.05%トリプシン・EDTAにて5分間、37°Cで処理する。ディッシュから剥離した歯髄細胞を直径10cmの付着性細胞培養用ディッシュに播種し拡大培養を行う。肉眼で観察してサブコンフルエント(培養容器の表面の約70%を細胞が占める状態)又はコンフルエントに達したときに細胞を培養容器から剥離して回収し、再度、培養液を満たした培養容器に播種する。継代培養を繰り返し行ってもよい。継代培養を1~8回行い、必要な細胞数(例えば約1×107個/ml)まで増殖させる。培養容器からの細胞の剥離は、トリプシン処理など常法で実施することができる。以上の培養の後、細胞を回収して保存することにしてもよい(保存条件は例えば-198°C)。次に、細胞を回収する。トリプシン処理等で培養容器から細胞を剥離した後、遠心処理を施すことによって細胞(歯髄由来幹細胞)を回収することができる。線維芽細胞)と精子を共培養するため、本発明の一態様では、以上のようにして調製ないし用意した共培養用細胞と精子を培養容器に播種し、培養に供する。播種する順序は特に問わず、いずれを先に播種してもよい。両者を混合した後に播種することにしてもよい。培養条件は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。36°C~39°C、5%CO2の環境下で培養すればよい。精子の動物種を考慮し、動物の体温に近い温度に設定することが好ましい。ブタやウシなどの家畜の精子を用いる場合、比較的高温(38°C~39°C)に設定するとよい。ヒトの精子であれば37°C前後の温度条件が好ましい。基本培地としてダルベッコ変法イーグル培地(D-MEM)(ナカライテスク株式会社、シグマ社、Gibco社等)、ハムF12培地(HamF12)(SIGMA社、Gibco社等)、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)(GIBCO社等)、グラスゴー基本培地(Gibco社等)、RPMI1640培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。培地に添加可能な成分の例として血清、血漿、血清アルブミン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン(PVP)、抗生物質、2-メルカプトエタノール、アミノ酸、ビタミン、無機塩を挙げることができる。典型的には培養皿などの培養容器を用いて二次元的に細胞を培養する。共培養の期間は例えば1時間~1日、好ましくは2時間~5時間とする。長すぎると、精子の活性低下を引き起こし得る。【0036】本発明の別の一態様では、層状(シート状)に形成した共培養用細胞の上で精子を培養する。精子の共培養に先立って、層状の共培養細胞を用意しておく。共培養用細胞を適当な培養容器(典型的には培養皿)で培養し、増殖させることにより共培養用細胞層(共培養用細胞シート)を得た後、当該細胞層上に精子を播種して培養する。このように、共培養用細胞層の形成と精子の共培養を連続的に実施するのではなく、共培養用細胞層を事前に用意しておき(例えば、細胞層形成後に保存しておく)、精子との共培養に利用することにしてもよい。このような実施形態の場合、市販の又は公的な細胞バンクなどから分譲を受けた細胞層を利用してもよい。【0037】前述のように、本発明者らの検討によって、細胞と精子の接触によって精子が活性化することが判明した。従って、本発明における共培養では、共培養用細胞と精子が接触する状態を形成することが重要である。層状の共培養用細胞を用いる上記態様は、共培養用細胞と精子が接触する環境を作り出すことに有利である。【0038】共培養用細胞との共培養によって精子が活性化される。活性化された精子が得られる。本発明の一態様では、共培養後の精子(即ち、活性化された精子)を回収する(ステップ(2))。このとき、好ましくは、共培養用細胞から分離した状態で精子を回収する。層状の共培養用細胞を用いると、このような分離回収を比較的容易に行うことができる。回収した精子は後述の各種用途に用いられる。本発明の第2の局面は、本発明の方法で得られた活性化精子の用途に関する。(成功率や効率の向上)、家畜の繁殖(人工授精の成功率や効率の向上)、育種・種の維持(例えば絶滅危惧種の維持、ペットの系統の維持又は交雑)等に利用され得る。【0040】本発明の活性化精子を用いて人工授精を実施する場合(家畜の繁殖や育種・種の維持を目的とした人工授精も含む)、生体内又は生体外で活性化精子と卵子(卵細胞、卵)が共存する状態を形成させることになる。生体内で共存状態を形成させるためには、活性化精子を卵子が存在する生体の部位に投与する。哺乳動物であれば子宮内に活性化精子を注入する。他方、生体外で共存状態を形成させるのであれば、生体からの単離や細胞バンクなどから分譲などによって用意した卵子と活性化精子を同一の容器内に入れ、インキュベートすればよい。【0041】本発明は、人工授精方法の一態様として、本発明の方法(精子の活性化方法)を適用していない精子(典型的には、生体から分離した精子)を用いた人工授精方法も提供する。線維芽細胞(説明の便宜上、本発明の第1の局面における呼称に統一して「共培養用細胞」と呼ぶ)、精子、及び卵子の三者が共存する状態を形成し、精子の活性化と受精を進行させる。混合する方法、(5)生体外において、共培養用細胞と精子を共培養(即ち本発明の精子活性化方法を実施)した後、卵子を添加する方法、である。(2)~(5)は体外受精方法に該当する。【0042】本発明は様々な生物種を対象とする。精子又は卵子の由来となる生物種の例はヒト、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、鳥類(ニワトリ、ウズラ、カモなど)、魚類(サケ、マス、マグロ、カツオなど)である。精子と卵子の生物種は原則として同一である。受精可能な組合せであれば、精子の生物種と卵子の生物種が異なっていてもよい。【0043】上記の各用途への利用に際し、活性化精子を組成物の形態で提供することもできる。細胞の保護を目的としてジメチルスルフォキシド(DMSO)や血清アルブミン等を、細菌の混入を阻止することを目的として抗生物質等を、細胞の活性化、増殖又は分化誘導などを目的として各種の成分(ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等)を本発明の精子活性化剤に含有させてもよい。)を本発明の活性化精子組成物に含有させてもよい。線維芽細胞(即ち共培養用細胞)との接触が精子の活性化に有効であるとの知見に従えば、期待される生理作用が発揮される前に、共培養用細胞との接触状態を形成しておくことが有利且つ重要であるといえる。従って、この態様の組成物には、精子と共培養用細胞が含有されることになる。線維芽細胞との接触状態を形成することによって精子が活性化することが明らかとなった。線維芽細胞を有効成分として含有する精子活性化剤を提供する。繁殖、育種・種の維持等に利用され得る。精子障害を伴う又は精子障害が主因又は副因の各種疾患の治療・改善に対して特に有効である。当該用途に使用する場合には、治療上有効量の細胞が投与されるように、一回投与分の量として例えば1x104個~1x107個の細胞を含有させるとよい。状態、細胞の状態などを考慮して適宜調整することができる。考慮して作成すればよい。単回投与の他、連続的又は定期的に複数回投与することにしてもよい。複数回投与する際の投与間隔は特に限定されず、例えば1日~1月である。投与回数も特に限定されない。投与回数の例は2回~10回である。)を含有させてもよい。言及しない点(各細胞の動物種、精子の動物種など)については、本発明の第2の局面の場合と同様であり、対応する説明を援用する。線維芽細胞)と精子が接触する状態を生体内又は生体外で形成させるために使用される。当該接触状態を生体内で形成させるためには、本発明の精子活性化剤を生体に投与することになる。典型的には、精子の貯留器官である精嚢に注入することになるが、投与後に本発明の精子活性化剤の有効成分と精子が接触する状態が形成される限りにおいて、投与部位や投与方法は特に限定されない。本発明の精子活性化剤の有効成分と精子との接触状態を生体外で形成させるためには、例えば、予め用意しておいた精子と本発明の精子活性化剤を適当な容器(典型的には培養皿、培養フラスコなど)に入れればよい。添加順序は特に問わず、いずれを先に入れることにしてもよい。両者を混合した後に容器に移すことにしてもよい。臨床では陰嚢静脈逆流または鬱滞により精巣温度が上昇し、精子運動率が低下する精索静脈瘤の病態がある。獣医学では夏の室内温度上昇のために上記同様な病態で、いわゆる夏季不妊症と呼ばれるブタ精子の運動率低下が毎年夏季に発生し、人工授精用精液の供給に不安定性を来している。ヒト精索静脈瘤において精子運動性の低下により発生する男子不妊症を治療するための新規細胞療法を開発する目的で、本疾患と同一の病態を持つブタ夏季不妊症の精子とブタ脂肪幹細胞(ASC)を利用して共培養による治療を試みた。ブタ精子に及ぼすヒト幹細胞の治療効果を調べた。準備実験として、牛精子とブタASCとの共培養を行った。以下、実験プロトコールを示す。ブタASCをシート状あるいは浮遊した状態でブタ精子と培養した(ASCと精子の共培養)。F12培養液(図中では「培地」と表記)を使用し、コントロール群ではこれらの中にブタ精子のみを浮遊して培養した。共培養群では、シート状(図中では「ASC」と表記)又は浮遊した状態のブタ脂肪幹細胞(図中では「ASC.sus」と表記)とブタ精子を共培養した。培養開始後、0時間(コントロール群のみ)及び5時間後に精子を取り出し、血球計算盤(C-Chip)に入れ、その運動性を倒立位相差顕微鏡で観察すると共に、精子の運動を20秒間撮影した。spermatozoa)を算出した。2回繰り返した結果を平均値±標準誤差で示した。test)により検定した。準備実験として牛凍結融解精子とブタ培養ASCシート(ロンザ社)を共培養した結果、共培養1時間の時点において、運動する精子の割合(運動率)が約50%であり、共培養していない場合の運動率25%よりも上昇していた。培養を継続したところ、培養2時間目から、共培養の有無によって、精子の直進運動性が異なる傾向を認めた。培養22時間後の評価では、共培養の有無に関わらず精子の運動率は約1%であったが、ASCと共培養した精子において、共培養しなかった場合には全く認められなかった活発に前進運動する精子の存在が確認された。ブタASCが精子の前進運動性を高める又は長時間維持する効果を有することが示唆された。本実験では、ブタ精子とブタASCを共培養し、その効果を調べた。6~8時間の共培養の結果、共培養しない場合又は浮遊状態のブタASCとブタ精子を混和して培養した場合に比べ、精子の運動性は高く維持されただけでなく、精子の受精能力として重要である前進運動する精子の割合が上昇した(図1、図2)。確認の目的でブタASC培養上清中のサイトカイン濃度を測定したが、培養前後で差はなかった。ブタの精子をヒトASCシート(ロンザ社)と共培養した。ヒト精子をヒトASCシート(ロンザ社)と共培養した結果、共培養2時間で精子の運動率に差が出始め、ヒト精子採取後21.5時間(培養開始後16時間)においては、コントロール群(精子のみを培養)の精子が全く運動を示さなかった(運動率0%)のに対して、共培養群の運動率は55%(目視による)であった。以上の通り、以下の組み合わせで精子とASCを共培養し、ASCの精子活性化現象を詳細に確認した。以上一連の実験結果より、1)ASCは精子の運動率を高く維持し、且つ精子の前進運動性を活性化する又は高率に維持すること、2)ASCの精子活性化作用は、分泌されるサイトカインが介在するのではなく、精子とASCの接触によること、及び3)精子とASCの共培養による効果(精子活性化)は種を超えて認められること、が判明した。この現象、即ちASCによる精子活性化は、ヒト静脈瘤による男子不妊症の細胞治療として応用可能であり、精子運動率低下の病態(例えば、ブタの夏期不妊症)に対して、種を超えて有用な治療技術と考えられる。goで行わることによって効果が発現しているものと推測される。ASCと精子を共培養することにより精子の運動性が高く維持されることが示された(上記実験)。更なる検討として、この精子活性化効果がASCに特異的であるか否かを調べることにした。具体的には、種々の異なるタイプの細胞とブタ精子を共培養し、その効果を検討することにした。セルインサートを使用することにより、ASCと精子が接触した培養環境と非接触の培養環境を作り出すことによって、細胞と精子の接触が精子の活性化を引き起こすことの実証を試みた。Normal-Human-Dermal-Fibroblasts))をそれぞれ常法に従い24ウェル培養プレートでコンフルエント状態になるまで培養した。mm)のメンブレン底面にASCを接着させたのち、24ウェルプレートのウェルへ装着した。コントロールとしてウェル底面でASCを培養した後、セルインサート(裏面へのASCの接着なし)をウェルに装着したものを用意した。F12培養液へ交換した。105/ウェル/500μlであった。手圧法にて採取した濃厚部ブタ精液をBTS希釈液にて希釈後、17°Cにて使用直前まで保存した。106/mlとなるように調整し、上記の通り準備したウェルへ添加して各細胞との共培養を開始した。セルインサートの入ったウェルにおいてはセルインサートの中へ精子を添加して培養を開始した。全ての細胞について、培養条件は37.0°C、5%CO2/95%空気の気相条件とした。培養終了後、直接(フラスコ培養の場合)あるいは培養した一部の精子をとり(ウェル培養の場合)、血球計算盤へ入れて精子を観察し、その運動性を21~27秒間撮影した。撮影した画像を解析し、目視にて運動率(%)を判定するとともに、撮影した映像に現れた前進運動精子の実数をカウントした。培養フラスコ内でコンフルエント状態となった各細胞上で精子を7時間培養した。その結果、コントロール群(精子単独の培養)では運動率が約1%であったのに対して、各細胞(ASC、BM-MSC、DPSC又はNHDF)との共培養では運動率が5~10%であり、いずれも運動率が高い傾向を示した(図3)。ウェルの底面でASCを培養した後、セルインサート(裏面へのASCの接着なし)をウェルに装着し、セルインサート内でブタ精子を共培養した場合(セルインサートで隔離されるため、精子はASCに接触できない)に比べ、セルインサートの裏面にASCを接着させた後、セルインサート内でブタ精子を共培養した場合(セルインサートの膜を介して精子はASCに接触可能)は、培養5時間後の精子運動率が高く維持されていた(図4)。培養7時間後において、前進運動を示す精子の数(精子の運動を約20秒間撮影した映像中でカウントされた前進運動精子の実数)も同様に、細胞と精子が接触できた場合の方が格段に多い(図5)。尾部の振動はASCとの接触があった精子の方が活発であり、接触のなかった運動精子では尾部の振動は極めて微弱であった。いずれの細胞を用いても、コントロール群に比べ、共培養した場合に精子の運動性が高い傾向を示した。この結果は、ASCのみならず一般に他の体細胞との接触が精子の運動性を維持する可能性を示唆する。精子とASCが接触した状態で共培養した場合において、非接触の共培養より精子の運動率が高く、且つ前進運動性精子数が多かったことから、細胞と精子の接触が精子の運動性の維持ないし上昇(即ち、活性化)に重要であるといえる。場にて未成熟雌ブタより卵巣を採取し、ペニシリンナトリウム60μg/ml及び硫酸ストレプトマイシン100μg/mlを添加した滅菌生理食塩水(35°C)に入れ、実験室まで持ち帰った。mmの卵胞より卵子を吸引採取した。38.5°C、5%CO2/95%空気の気相下で24時間培養した。硫酸カナマイシン添加)で希釈後、17°Cにて実験室まで運搬した。17°Cにて使用まで保存後、2.5mlの希釈精液をとり、室温にて10分間放置することにより細胞塊を沈殿させた。精子/mlとなるように再浮遊し、4時間前培養した。なるように添加あるいは無添加(コントロール)した。コントロールとして前培養用培地のみ添加した。