文字の大きさを変更する機能は、JavaScriptが無効なため使用できません。JavaScriptを有効にしてご利用ください。して、がんに関連した細胞外因子に対するRNAアプタマーを作製しています。よって得られる標的物質特異的に結合する核酸分子で、抗体に比べ副作用が少ないという特徴があります。近年の研究からタンパク質のアミノ酸配列情報をコードしない非コードRNA(ncRNA)がゲノムからの転写産物の90%以上に達することが示されるとともに、遺伝子の転写、翻訳の時間的、空間的な制御に必須な機能性RNAが多数存在していることが確認されている。幹細胞に必須なタンパク質複合体がncRNAの作る骨格により維持されていることが明らかになるなど、新たな知見が次々と報告されている。応用可能な分子として注目が高まっている。enrichment(SELEX)-を用いることにより、標的物質の機能を促進/阻害するRNA分子の取得が可能である。アプタマーは安価に大量合成が可能で副作用も少なく、修飾塩基の導入により安定化することから、医薬品や検査診断薬へ向けた研究開発が国内外で行われている。開発で遅れを取っている。することで効率よくアプタマーを取得する方法を開発した。SELEX法は図1のような一連の工程を1ラウンドとして、10〜15ラウンド程度を行い標的物質に特異的に結合するアプタマーを取得する方法である。通常はこの十数ラウンドの工程を1回の試行とし、取得までに条件を変えながらを4〜5回を繰り返す。一工程は1014種類以上のRNA分子プールと標的物質を会合させ、結合していない分子を洗浄して特異的に結合するRNA分子の存在比率を高め、これを回収後に増幅して再度RNAプールを作製することで終了する。この1工程の各段階におけるRNA量の変化モデル(図1棒グラフ:縦軸対数)を示す。逆転写反応、テンプレートに含まれる固定配列(P1、P2)を使用したPCR反応、PCR産物をテンプレートとしたRNA転写反応によりスタート時とほぼ同じ量のRNA(1,000,000倍程度)にまで増幅する。この一工程でRNAプール中の高親和性RNAは100倍から1000倍程度に増幅されることが期待される。我々は、SELEX法においてRNAプールに「標的物質と結合する」という正の選択圧に対して、取得の難易度を高くしている負の選択圧には大きく分けて2つあるとの仮説を立てた。1つは結合・洗浄時のセレクションにおける分子種存在比率のドリフト、もう一つはセレクション後に分子数を増幅するときに掛かるバイアスである。前者は、強いセレクションを行うと操作上避けられないロスの影響が大きくなることで、標的物質への結合の高い分子も取り零してしまう現象である(図2)。後者は、増幅操作の過程で結合能とは無関係に増幅されやすい分子種の存在比率が高くなることで高親和性分子の比率が低下する現象である(図3)。これらに基づき、1)操作上避けられないロス、2)増幅時のバイアスの2点を減らす方法を考案し、アプタマー取得を試みた。行い、従来の方法(10〜20種類/100分子)より高親和性RNAの配列が多様性を保持している(40〜50種類/100分子)プールを取得できた。silico解析)に適したデータグループであることから、我々の取得したプールから次世代シーケンサーにより得られた数万以上の配列情報をNECソフト(株)が解析することで、アプタマーの取得効率を高める研究を進めている。(HMGB1)は生存に必須であり、細胞核内ではクロマチン構造を形成するタンパク質として遺伝子転写時に機能する。細胞外に放出または分泌されたHMGB1は細胞表面の受容体に結合し、炎症反応や細胞の形態変化、移動を促進するサイトカインとして機能する。近年、後者の機能解析が進み、自己免疫疾患や敗血症、外傷性ショック、虚血や虚血再灌流障害がおこる際に炎症反応を悪化させ、細胞死を誘導することが明らかとなり、HMGB1がこれら疾患の診断マーカー、治療の標的となり得ることが示されている。がんに関しても、乳がん、大腸がん、メラノーマ、前立腺がん、膵臓がんおよび肺がん等の増殖や浸潤転移にHMGB1が関与する可能性が報告されている。このような背景から、我々は診断薬、治療薬を目標として、HMGB1に結合するアプタマーを作製し、医薬品候補物質とするための研究を行っている。行い、RNAプールの結合能が十分上昇するまでselectionを8回繰り返した。<1nM)が見られた。silico解析を行い、複数のアプタマー候補配列を得た。<1pM)を取得することができた。強く結合するアプタマーを小型化するために二次構造を予測した。解析により結合に関与しないと判断された塩基を欠損した変異体を作製し、80merのアプタマーから39merへと結合力を維持した状態での小型化に成功した。現在、これらアプタマーの生理活性の評価を行っている。factor(HGF)が結合することで細胞増殖や分化、アポトーシスの抑制などを引き起こす。肺がん、消化器系がんなど様々ながんで発現亢進が報告されている。ある肺がん細胞株ではHGF刺激による細胞増殖や移動能の上昇が確認されていることから、がん細胞の増殖や転移、浸潤への関与が指摘されていて、がん治療の標的物質として注目されている。我々は、HMGB1と同様に、c-Metに結合するアプタマーを作製し、医薬品候補物質とするための研究を行っている。プールは同じタグを持つ他のリコンビナントタンパク質には結合しないため、c-Met分子に結合していると考えられた。このプールから96分子の塩基配列を決定し比較したところ、8種類のクラスターに分類され、全ての配列で特異的な結合が確認された。このプールを次世代シーケンサーで配列解析すると、HMGB1に対するアプタマーと同様に、プラスミドクローニングでは取りこぼしていた強力に結合するアプタマーを多数確認した。修飾塩基導入によりRNase耐性としたアプタマーは、HGF刺激による細胞移動を抑制することが明らかになった。現在、さらなる生理活性の評価と、その作用機序の解析を行っている。研究活動の概要(辻)分子診断研究プロジェクトでは、がんの診断、治療に役立つ生物製剤(バイオ医薬品)の研究と開発を行っている。具体的には、(1)新しい悪性胸膜中皮腫マーカーであるインテレクチンに関する研究と、(2)抗体作製技術の改良と開発を行っている。研究の背景と研究経過ヒトインテレクチン-1は、結核菌細胞壁(BCG-CWS)による抗がん免疫賦活効果の研究の過程で、結核菌細胞壁中のガラクトフラノースに特異的に結合する新規蛋白質として発見した生体防御レクチンである。インテレクチンの相同遺伝子はホヤからヒトまでの脊索・脊椎動物間で高度に保存されており、特に抗体が未発達な水生脊椎動物では複数の相同遺伝子からなる分子ファミリーを形成している。これらのインテレクチン相同蛋白質は、全てCa2+イオン依存的にガラクトースに結合する分泌型レクチンであるが、C型レクチンやガレクチンとは一次構造上の類似性はなく、生理的役割も異なっていると考えられる。インテレクチン-1は、ヒトの正常組織では主に腸管の杯細胞から消化管内腔に分泌されており、正常血液中にも含まれているが、それ以外の健常組織では蛋白質レベルの発現はほとんど認められない。感染やアレルギーにより気道上皮細胞での発現が増加するほか、寄生虫感染により消化管での発現が強く誘導され、抗酸菌や寄生虫の感染防御に関わっていると考えられている。それぞれの面から研究を進めている。(以下、中皮腫)はアスベストの吸引により発生する極めて予後の悪いがんで、深刻な社会問題を引き起こしている疾患である。アスベストを多量に使用した工場や造船所が集中していた地域であり、全国でも最悪クラスの中皮腫の多発地帯となっている(図1)。中皮腫は放射線や抗がん剤治療に耐性を示すため、早期症例に対して手術を行う以外に根治が期待できる治療法はなく、早期診断法の開発は中皮腫の治療のために必須の要件と言える。中皮腫はアスベスト曝露後30-40年という長い時間を経て発症するため、日本での中皮腫の発症者は過去のアスベストの使用の増加と平行して2010年頃より急増し、2040年までに10万人に達すると予測されている。従って、中皮腫の早期診断法の開発は、社会的にも喫緊の課題となっている。(IBL社)より製品化され、タカラバイオ株式会社を通じて販売されている。計162症例のうち、インテレクチン-1を発現しているがんは、ほぼ粘液産生がんに限られていた。カルレチニンとの二重陽性判定により、計201症例のがんから、感度88%、特異度100%で上皮型中皮腫を判別することが可能であった。中皮腫細胞を用いて抗中皮腫モノクローナル抗体を30種類作製した。このうち、3クローンについて中皮腫および他のがんへの反応性を解析した。その結果、1クローンが中皮腫に対して感度特異性ともに極めて高く、既存の中皮腫マーカー(カルレチニン、インテレクチン、ポドプラニン、WT-1、メソテリン)と比較して優れていることが明らかとなった。他の2クローンについても、中皮腫に対して比較的特異性の高い染色性を示した。そこでこれらの抗体が認識する抗原を精製し、MALDI-TOFを用いた抗原同定を行った。同定された抗原はこれまでに中皮腫マーカーとして報告されている分子ではなく、新規の中皮腫マーカーになり得ると考えられた(投稿準備中)。中皮腫に特異的なインテレクチン-1の発現誘導機構を解析するため、インテレクチン-1のプロモーター領域の解析を行った。bp程度まで解析しても明確なエンハンサーを見いだすことは出来なかった。bpの領域に強いエンハンサー活性が認められ、中皮腫細胞でインテレクチン-1の発現を強く誘導する一因となっていると考えられた。現在、エンハンサー領域を確定するために、更なる解析を行っている。4)インテレクチンのCa2+依存性の解析インテレクチン-1は精製後不溶化しやすく、生理活性である糖結合性を保ったまま精製標品を得ることは不可能であった。そこで精製条件の検討を行い、糖結合能を回復した精製インテレクチン-1を得ることに成功した。インテレクチン-1の糖結合能の二価金属イオン依存性はCa2+>Mn2+≥Sr2+であり、他の二価イオンでは糖結合能は確認できなかった。Ca2+の有無による多量体形成は確認されなかったが、Ca2+により抗体で認識できる立体構造変化が生じており、分子内部に新規のCa2+結合ドメインが存在すると考えられた。現在、Ca2+結合ドメインの解析を行っている。2009)、様々な標的に結合するRNAアプタマーを単離している。2009、特願2009-119269、PCT/JP2010/058221)。現在、shot47を利用した新しい人工抗体の作製法(Hishot法)を考案し研究を行っている。Hishot法は、Hisタグが付加された抗体配列をコードする遺伝子を合成し、shot47の配列をmRNAの非翻訳領域に挿入した大腸菌発現プラスミドを構築することで、大腸菌を用いて人工的にモノクローナル抗体作製を行う方法である。virus法と比べ、特殊な試薬や装置、技術的な熟練を必要とせずに、簡便かつ安価に試行できる利点があり、動物を用いて抗体が作製できない抗原に対し、抗体を提供できる可能性がある。これまでに、高効率のライブラリの作製法とHishot法の標準プロトコルを確立し、特許出願を行っている(特願2010-085545、PCT/JP2011/058249)。現在、インテレクチンおよびTNF-αに対して特異的に結合する抗体フラグメントのクローンを得ており、実用的な人工抗体作製法として原著論文での発表を準備中である(投稿準備中)。同時に発展することが必要とされている。神奈川県立がんセンターでは多岐におよぶ悪性腫瘍の集学的治療をおこなっており、臨床研究所において切除標本の凍結バンクおよび組織アレイを作製し、多くの標的分子を明らかにしてきた。その標的分子を創薬に応用し癌治療におけるTRシステムの確立を目指すことが我々の次なる使命である。おこなっており20余の特許を取得している。多種で豊富な手術検体数を有し多数のゲノム情報を有する当センター研究所と膨大な構造ゲノミクス情報を有するUSC薬学部がコラボレーションすることで、固形癌に関する最新の標的分子をゲノム創薬に応用することが可能となり、TRシステムの確立につながる。systemになりうる可能性を示した。)に対するPDI阻害薬の有効性を明らかにする。1)PDIと癌細胞死との関連(ERストレスとの関連を中心に)を解明するPDIは癌細胞死に関わっている。先の申請者らの報告でもPDIをノックダウンした卵巣癌細胞は著明に増殖能が低下することが報告されている。PDIは細胞ストレスによって生じた変性タンパクを修復することで、過度のERストレス下のアポトーシスによる細胞死を回避している。この経路における調節機構に関しては未知の部分が多い。本研究ではPDIとERストレスによるアポトーシスとの関連を解明する。次にマウスを用いた動物実験をおこない、腫瘍組織におけるPDIの発現と生体内におけるPACMA31の腫瘍増殖抑制効果との関連を調べる。感受性、生命予後との関連を調べる。分子標的薬との併用療法で多くの臨床試験がおこなわれている。gemcitabine単独療法よりも明らかに優れた治療法は未だに見出されておらず、平均生存期間は最長で10カ月程度にとどまる。甲状腺未分化癌においては標準治療すら存在せず1年生存率は10%未満であるのが現状である。したがって両者を治療するにあたっては新しい標的分子の発見とそれをターゲットとした治療薬の創薬が急務である。従来PDIの機能不全はアルツハイマー病やパーキンソン病を引き起こすと考えられてきたが、近年様々な癌組織においてPDIが高発現していることと、PDIの活性阻害がアポトーシスを誘導することが報告されておりPDIは癌の新たな治療標的分子と考えられている。2012/129452)、多種の固形腫瘍への応用が期待される。我々らは予備的な検討でPDI高発現の細胞株に対しPDI阻害薬が高い殺細胞効果を示していること、切除標本の免疫組織染色では癌細胞にPDIの高発現を認めるなど興味深い結果を得ている。共同研究により、タンパク3次元構造解析に基づいたPDI阻害薬のさらなる改良をおこない、当センター臨床部門との共同研究によってPDI阻害薬臨床応用のための基盤研究をすすめていく。6以下では正しく表示されない場合があります。