(月曜日に配布)Aさん夫妻に4人目の赤ちゃんが生まれ、三郎君と名付けられました。生下時体重2,980gの男の子です。夫妻に最初に生まれた男の子は、生後5ヶ月頃から激しい下痢を繰り返すようになり、生後10ヶ月で亡くなってしまいました。その後女の子が一人と、別の男の子を授かりましたが、二人とも元気に育って、それぞれ小学校と幼稚園に通っています。Aさんの奥さんは4人姉弟ですが、2番目の弟さんは生後半年くらいで亡くなったと聞いています。g/dlしかなく、極度の貧血であると言われました。第1週と第2週にかけて、免疫応答の調節異常がある事例を用いて自己学習を進めます。事例は生後間もない男児です。生下時体重は正常範囲にあります。注目すべきは家族歴で、三郎君の兄が生後5ヶ月から激しい下痢を起こして10ヶ月で死亡しており、母親の弟も生後半年で死亡しています。三郎君のもう一人の兄は今のところ健康であり、姉にも母親にも異常を示す記述はないことから、学生さんたちは比較的簡単に伴性劣性遺伝の疾患を考えられるだろうと思います。家系図を描いてみて下さい。事例の記述だけからでも、かなり多くの情報が得られます。三郎君には二人の兄と一人の姉があり、そのうち長男と三郎君が発症者です。母親についても、事例の記載から弟が二人あり、そのうち一人の弟が発症者であることが判ります。ある可能性が考えられます。)を採り上げて来ました。三郎君の家族歴では、長男も母方の叔父も、生後半年くらいで発症していることに注目して下さい。あっても、胎盤を通して母胎から移行したIgGの存在により、生後数ヶ月は細菌感染症に対する抵抗性を保ち得ます。これについては、過去の事例の解説で何度も詳しく触れてきました。この点も、自己学習して下さい。三郎君には生後2ヶ月から貧血が発症しています。造血系腫瘍を合併する場合にも貧血を伴うことがあります。合併症により貧血を示すことは稀でしょう。新生児・乳児の貧血にはどのような原因によるものが考えられるか、自己学習の課題として下さい。(水曜日に提示)主治医は三郎君の血液を用いて、Coombs試験を行いました。その結果は、直接Coombs試験も間接Coombs試験も、ともに陽性でした。母親の血清を用いた間接Coombs試験は陰性の結果でした。洗滌赤血球の輸注と糖質コルチコイド(プレドニソロン)の投与が行われました。その後糖質コルチコイドをベタメタゾンに切り換えたところ、間接Coombs試験が陰性となり、貧血は改善しました。mlに及ぶ激しい水様下痢が始まり、通常の下痢止め薬は無効でした。IgM濃度は正常範囲内でしたが、抗平滑筋抗体が陽性でした。月曜日に提示した事例1について、十分な討論を行って下さい。いくつかを調べて来たでしょうか?無ガンマグロブリン血症や低ガンマグロブリン血症では細菌(特にグラム陽性菌)に対して易感染性となりますが、母体からの移行抗体の存在により、生後半年近くまでは症状が現れない場合が多いことを理解した学生さんが多いものと期待します。原発性の無ガンマグロブリン血症であっても、抗生物質と免疫グロブリン製剤が普及した現在、生後半年で死亡に至る例はそれ程多くないはずです。果たせるかな、事例2で三郎君の血清免疫グロブリン濃度は正常範囲内である(=無ガンマグロブリン血症ではない)ことが明らかとなります。よる発育遅延などを示す場合が多く、事例の家族歴とは少し異なるように思われます。発症者が男児に限られているのもおかしいと言うことになります。グルコース6リン酸脱水素酵素(G6PD)欠損症はX染色体連鎖ですが、この原因で発症する溶血性貧血は何らかの感染症や薬物投与が引き金となることが多く、乳児での発症は珍しいと言えます。この疾患はマラリア感染に対する抵抗性形質として選択されたと考えられ、マラリア流行地を中心に、世界中で4億人がG6PD異常遺伝子を持っているとみなされています。三郎君の家族歴や症状とは一致しません。事例1の最後に出て来た貧血について、学生さんたちは何を調べて来たでしょうか?恐らく、話題に上るのは血液型不適合による新生児溶血性疾患だと思います。母児間に血液型不適合がある条件(実は、Rh型不適合よりもABO型不適合の方が多い!)で、何らかの原因により母体が子の血液型物資により感作され、胎盤通過能のあるIgG抗体を産生した場合に生じる、子の貧血と黄疸を主徴とする病態です。赤芽球出現により気付かれるはずです。胎盤による繋がりの切れた出生後に、母体のIgG抗体が子に移行し続けるはずはありません。出生直後の異常について何らの記載もなく、生後2ヶ月から貧血が生じたという三郎君に関する記述は、新生児赤芽球症とは相容れないのです。学生さんたちは、このことに気付いたでしょうか?そこで事例2です。検査として、Coombs試験はあまりにも有名です。ここではまず、直接Coombs法と間接Coombs法の違いをしっかり纏めて下さい。Coombs試験は、患児の赤血球表面に既に結合している抗血液型抗体を、(蛍光標識した)抗ヒト免疫グロブリン抗体と「直接」反応させることにより検出するものです。間接Coombs試験では、問題の血液型抗原を持つ赤血球(例えば、Rh型D抗原の不適合例であれば、D抗原陽性のO型赤血球)を用意し、これに患児の血清、または母親の血清を反応させて洗った後、(標識)抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させます。患者赤血球に結合している抗体を「直接」検出するか、血清中の抗赤血球抗体を一旦標的赤血球と反応させ、その後二次抗体により「間接に」検出するかの違いがあります。学生さんたちは、この方法論に関する図を描けなくてはいけません。因みに、抗赤血球抗体により「溶血性」貧血になるのであれば、抗体が結合した赤血球は「溶けて」しまい、直接Coombs試験で陽性となる細胞が検出出来るはずは無いと思いませんか?もしこのような疑問を持つ学生がいたら、その人には高い点数を上げたくなります。実際には、「溶血」と言っても血管内で赤血球の細胞膜が破壊され、赤血球が「溶ける」訳ではありません。MAC)は、同種細胞の膜には潜り込むことが出来ません。これは、同種制限因子であるCD59の働きによります。「溶血」は実際には、脾臓や肝臓のマクロファージ系細胞が、Fc受容体やC3b受容体を介して抗体で被覆された赤血球を貪食することにより進行するのです(左図)。IgAは5〜6日とされます。従って、もしも三郎君が新生児溶血性疾患の患児であるとしても、生後2ヶ月になれば母体から移行した抗血液型抗体の濃度は既に1/10以下に低下しているはずです。母親を間接Coombs法で調べた結果は陰性でした。ないCoombs試験陽性の貧血とは何かと、学生たちに考えてもらいたい訳です。患者で頻繁に出現します。ここでは、多彩な自己抗体の一環として抗平滑筋抗体の存在が気付かれています。月曜日に配布)治療に反応しない下痢の原因を明らかにするため、主治医は三郎君の血清を用いて蛍光抗体法による自己抗体の検出を試みました。血液型がO型の患者さんから手術時に摘出された小腸より、病変がない周辺部分を選び、本人の同意を得て凍結切片とし、これに三郎君の血清を段階希釈して反応させ、さらに蛍光標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させました。その結果、三郎君の血清からは、300倍以上に薄めても小腸絨毛部の正常上皮細胞と反応するIgGが検出されました。対照として用いた三郎君の健常な兄の血清は、ヒト小腸の凍結切片とは反応しませんでした。mg/dlと上昇していました。学生さんたちに討論して貰いたかったポイントどうして手術で取り出された小腸を勝手に使ってはいけないの?インフォームド・コンセントって何?血清を段階希釈したのは何故?自分自身の小腸絨毛上皮と反応する抗体があるとは、どういうこと?貧血や「抗平滑筋抗体」との関係は?どうして血液型O型の切片を使うの?三郎君の血糖値は正常?糖尿病について勉強したことを憶えている?下痢との関係はどうなのだろうか?事例のねらいと解説いよいよ、事例の本質に迫り始めます。先週の事例1,事例2を纏めるところから始めて下さい。三郎君はX連鎖劣性遺伝の何らかの疾患を持っている可能性が考えられます。三郎君の兄も叔父も、生後半年程度で下痢を起こすようになって亡くなりました。考えることが必要です。出現も多彩な自己抗体産生の一環として理解出来ます。治療法として、糖質コルチコイドの投与は標準的です。糖質コルチコイドの免疫抑制作用については、第3週のコースでも学びますが、基本的なことは事例2から自己学習が出来ているはずです。そこで事例3に入って下さい。ここでは、さらに多彩な自己免疫現象に関する記載が始まります。検出は、些か特殊な例を挙げているように思われるかも知れません。ここでの狙いは、組織切片と蛍光(或いは酵素)抗体法を用いて自己抗体を検出するという、技術上の概念を理解することです。学生さんたちは、既に先週の実習で血球凝集反応を経験し、今週は蛍光色素で標識した抗体を用いて、FACS解析の実体験もします。Coombs試験について自己学習した過程で、蛍光抗体法の概念を掴んでいるはずです。そこで、事例における具体的な記述を手掛かりに、組織切片を用いた蛍光抗体染色、即ち免疫組織化学法の考え方と具体的な手法を理解してほしいのです。各種の自己免疫疾患で、血清中の自己抗体が検査されます。事例2の抗平滑筋抗体について学生さんたちが自己学習してきたであろう通り、大多数の自己抗体は、現在では精製した、場合によっては遺伝子操作の手法で作られた抗原を用いて、ELISA法などで定量されます。これは一見極めて科学的な検査のように思えますが、重大な問題が潜んでいます。それは、「測定キットが手に入る抗原」に対してしか、検査データが得られないということです。いろいろな疾患で「入手可能な測定キット」による自己抗体価の検査が実施出来ますが、検出された自己抗体が、本当に病態の形成にとって重要な役割を果たしているかどうかは判りません。疾患病態の形成に重要な自己抗体ではなく、組織傷害が起こってしまった結果、二次的に産生された自己抗体を検出しているに過ぎない可能性もある訳です。全身性エリテマトーデスで検出される抗DNA抗体が、本当にDNAを抗原としているのか、糸球体腎炎の病変形成に、抗DNA抗体が必要十分な組織傷害因子であるのかなどは、代表的な疑問です。病態理解により重要と言える訳です。学生さんたちには、事例3を足掛かりに、凍結切片を用いた蛍光抗体法の方法論を考えて下さい。その場合に「正常組織」をどのようにして入手するのか、手術時に患者さんから採取した組織の一部を黙って使ってはいけないのかなど、医療倫理やインフォームド・コンセントについても考えて下さい。O型の患者組織を選んだのは、勿論ABO式血液型抗原に対する自然抗体の影響を除くためです。血液型抗原と、これに反応する「自然抗体」の由来を考えるのにも良い機会です。このような実験を行う場合に必要な陰性対照についても、十分に理解して貰いたいと思います。ところで、三郎君は尿糖が陽性で、血糖値も上昇しています。乳児の血糖値は、正常で91±9mg/dlです。いうことは、三郎君には糖尿病があることが考えられます。6の第3週で事例を扱っているはずです。�T型糖尿病と�U型糖尿病の違いも自己学習したはずです。この時の知識を思い起こさせて下さい。16,400/μlと増加しており、その分画は顆粒球が62%、リンパ球が25%、単球が11%でした。2,300/μlと増加していました。CD4とCD25が共に陽性の細胞が、ほとんど全く検出されませんでした。8年前に亡くなったAさん夫妻の長男に関する剖検記録を取り寄せたところ、膵臓に多数のリンパ球が浸潤していたとの記載がありました。事例3までを纏めましょう。発症し、生後5ヶ月から激しい下痢を起こすようになりました。三郎君の血清中には小腸絨毛の上皮細胞と反応する「自己抗体」が検出されます。抗平滑筋抗体も陽性ですから、多彩な自己抗体を伴う乳児の自己免疫疾患であると言うことになります。尿糖が陽性で、血糖値も上昇していました。事例4で、三郎君は末梢血のCD4陽性T細胞数が多いこと、しかしCD4陽性CD25陽性のT細胞は欠損していることが気付かれます。小児の白血球数は年齢により大きく変動しますが、大まかに言うと若年程多く、1歳児では10,400±2,600/μl前後、2歳児で9,300±2,600/μl前後、その後ゆっくりと低下していき、10歳児で7,500±1,600/μl前後とされます。16,400/μlというのは、成人であれば白血球増多症で、何らかの感染症を疑うことになりますが、生後半年なら極端な増多症とは言えません。白血球の分画は異常です。生後2年目くらいまでの乳児では、末梢血白血球に占める各分画の割合はリンパ球優位であるのが普通で、生後5ヶ月から8ヶ月ではリンパ球が70%、2年で50%、13歳くらいで40%になります。従って、三郎君の末梢血では顆粒球増多症が起こっています。破壊により上皮バリアが破れ、腸内細菌が粘膜下に入り込んでいますので、当然の結果です。リンパ球の実数はどうでしょうか?成人では末梢血白血球のおよそ35%がリンパ球、うちCD4陽性T細胞が5割程度を占めますから、計算するとCD4陽性T細胞数は1,000/μl程度になるのが判ります(学生たちは、今週の実習でFACSを用いて、自分たちの末梢血中のCD4陽性T細胞の割合を実際に調べます)。これが500/μl未満となると日和見感染症の症状が現れ始めることは、昨年の事例でも解説しました。占めるリンパ球の割合が高いので、CD4陽性T細胞数はより多くなります。104:3513-3519)によれば、健常な小児(平均年齢5.5歳)の末梢血CD4陽性T細胞数は、およそ1,500/μlとあります。この数値から考えると、三郎君の末梢血CD4陽性T細胞数は多いのがわかります。CD4陽性CD25陽性T細胞が、この事例の焦点です。この細胞の意義については、事例5の後で詳しく解説します。CD25はIL-2受容体のα鎖です。通常のTリンパ球では、抗原受容体からのシグナルによってCD25(=IL-2Rα)の発現が誘導され、細胞の活性化と分裂増殖が始まります(これは講義でも触れました)。ところが、ヒトやマウスの末梢血や各種組織中には、抗原受容体からの刺激の有無に関わらず、構成的にCD25を発現しているCD4陽性T細胞が少数存在します。三郎君はこの細胞が欠損している訳です。事例に関する臨床所見や検査データの記載だけでは、この事例の病因にはなかなか到達出来ないと思いますので、この段階で鍵となる病態を明記することとしました。三郎君の末梢血中にはCD4陽性・CD25陽性の「制御性T細胞」が欠損しているのです。事例3で出て来た糖尿病については、その原因に繋がる記載が現れました。同じように乳児期に死亡した兄の剖検所見です。膵臓に多数のリンパ球浸潤を認めたと言うことです。下痢との関係はどうなっているのでしょうか?特徴的な病態が出揃いましたので、そろそろこの事例の本質に気付くところまで進めて欲しいと考えます。(第2週の金曜日に提示)主治医は三郎君にシクロスポリンAを投与することに決めました。一日4mg/kgの静注により下痢は改善し、尿糖は陰性となりました。現在も、腎機能をモニターしつつ慎重にシクロスポリンの投与を続けています。IPEX)」の一家系です。152:313-315)の記述を基に、一部改変を加えています。オリジナルの文献に報告された症例では、初発症状として自己免疫性の甲状腺機能低下症が記載されていますが、学生さんたちの議論を行動目標に集中させるため、省略しました。Treg)」の分化異常が、実際にヒト疾患に結び付くことを示しているからです。あるように、一般の臨床医は一生に一度も出会うことがないであろう稀な疾患ですが、その病因・病態を理解することが免疫系の正常機能を理解することに繋がるという好例です。私たちが行う免疫学の講義では、これまで制御性T細胞に触れることはありませんでした。今年のUnitにおける講義・実習でも、制御性T細胞について直接解説を行う機会はありません。自己寛容のしくみについては、あくまでも胸腺と骨髄における自己反応性レセプターの排除を中心に解説し、「末梢寛容」については殆ど触れません。その部分を自己学習して貰うのが、この事例の狙いです。T細胞受容体レベルでの自己反応性除去については、第2週の講義で詳しく解説します。selection)ですが、この機構だけでは自己抗原と反応するTリンパ球を完全に除去することが出来ないのは明らかです。実際、胸腺におけるT細胞受容体の選択は、「自己+自己正常タンパク質由来ペプチド」を基準として正の選択と負の選択が同時に起こる訳ですから、ランダムに形成されたT細胞受容体レパトアの中で、連続的に変化する自己MHC+自己正常ペプチドとの結合力に、ここからが自己反応性という画然とした境界線が引けるはずもありません。TCRはそもそも、自己MHC分子の上に何らかのペプチドが提示された構造と多少とも反応性を持たなければ役に立つ受容体でない(正の選択)以上、末梢に出た成熟Tリンパ球の受容体は、本質的に自己MHC+自己正常ペプチドとごく弱い反応性を残しているのが当然と言うことになります。二次リンパ組織に出た成熟Tリンパ球が、正常自己タンパク質由来ペプチドを認識して活性化することにより生じた「自己反応性エフェクター細胞」を、その作用の現場で抑え込んでいるのが、制御性T細胞であると考えられています。制御性T細胞は、CD4陽性T細胞に属し、非自己抗原由来ペプチドを強く認識して活性化する(通常の)CD4陽性T細胞と同じく、胸腺で分化します。両者の違いは、制御性T細胞が最初からCD25即ちIL-2受容体のα鎖を発現していること、これに対して、外来抗原由来のペプチドを認識する(CD25陰性性の)CD4陽性T細胞は、樹状細胞からの抗原提示を受けて初めてIL2受容体α鎖を発現するようになることです。従って、以前Tregは、末梢に存在する「CD4陽性・CD25陽性細胞」として分画されていました。元・神戸大学長の実兄)らは、胸腺の生理的機能を明らかにするため(正確には、マウス乳癌ウイルスによる発がんにリンパ球が果たす役割を解明するため)、新生仔の胸腺を摘出する実験を行いました。出生直後に胸腺摘出を行うと、免疫不全状態となり、通常の飼育条件では感染症を起こして死亡します。これは、胸腺がT細胞分化の場であるから当然です。ところが、生後3日で胸腺摘出を受けたマウスは、免疫系がほぼ正常に発達し、通常の飼育条件でも対照マウスとほぼ同じ寿命を全うします。このことは、マウスの場合、その一生(約2年間)に出会う可能性がある環境中の微生物抗原ほぼ全てに対応可能なT細胞受容体レパトアが、生後3日までに胸腺で形成され尽くして末梢リンパ組織に用意されることを意味します。166:753-755)。thymectomy)でリンパ球浸潤を伴う自己免疫性の甲状腺炎や胃炎が発生することなどが、次々と明らかにされていきました。上記の胸腺移植実験は、現在の知識で解釈すれば生後7日以降の胸腺から、末梢免疫寛容に関わるTreg細胞が生み出されると言うことになる訳です。後に西塚のグループに加わった坂口志文は、この実験系を細胞免疫学的観点から詳しく解析し、やがて独立して、ついに胸腺に由来して末梢免疫寛容を担っている細胞はCD4陽性CD25陽性Tリンパ球であることを突き止め、Tregの概念を提唱しました。マウスでもヒトでも、末梢リンパ組織中のCD4陽性T細胞のうち、5〜10%がCD4陽性CD25陽性T細胞です。現在では、これら制御性T細胞は、CD25陰性の(通常の)CD4陽性T細胞に較べて自己抗原由来ペプチドにより高い親和性を示す受容体を持つこと、T細胞受容体を介する刺激に対して殆ど増殖反応を起こさないが、周囲のエフェクターT細胞機能を細胞接着依存性に抑制することが明らかとなっています。問題は、TregのマーカーであるCD25が、IL2受容体α鎖であり、これは通常の(ヘルパー機能を発揮するようになる)CD4陽性T細胞が抗原刺激によって活性化した場合にも発現する分子であるため、活性化したCD4陽性T細胞とTregとを画然と区別することが困難な点でした。X染色体連鎖の奇妙な表現型を示すScurfyと呼ばれるマウスの系統が知られていました。(sf)変異の表現型は、魚鱗癬様の皮膚肥厚と消耗症候群で、肝脾腫があり、肝臓や皮膚に激しいリンパ球浸潤が見られます。