今回の実習では免疫反応を用いて蛋白質を定量する方法を学ぼう。一般に医学検査材料となる体液や組織には非常に多くの種類の蛋白質やペプチドが含まれている。臨床検査の場では、数え切れないほど多くの蛋白質やペプチドが、しかもそれぞれ異なる濃度で含まれた試料の中の、ある特定の蛋白質のみを定量する必要がしばしば生じる。それがアルブミンのように大量に存在する蛋白質であれば、例えば電気泳動を行ってバンドの太さを比較するだけで良い場合もあるが、他の蛋白質に比べて微量しか存在しない蛋白質やペプチドを相手にする場合は、特異性の高さ(目的の物質を狭雑する他の蛋白質からどれだけ正確に区別できるか)と定量性の良さ(どれだけ微量まで正確に量れるか)が同時に求められる。このような目的に合致する検査法として抗体の特異性を用いた方法が開発された。目的の蛋白質或いはペプチドのみと反応し、狭雑する他の蛋白質とは反応しない抗体が出来れば、それによって先ず「特異性」が確保出来るし、抗原抗体反応は比較的定量的に起こる(IgGの場合1分子の抗体に最大限で2分子の抗原しか結合しない)ので、抗体の量がわかっていれば抗原の量を求めるのはそれ程困難ではない。immunoassay)等がある。固相免疫測定法で最も初期に実用化されたものの一つは放射免疫測定法(radioimmunoassay:RIA)であって、これはプラスチックのチューブ(固相)に結合した抗原にラジオアイソトープで標識した抗体を加え、結合した抗体の量をアイソトープの放射能で測定する方法である。Yalowは、RIAを駆使して多数のペプチドホルモンを同定した他の二人の研究者とともに1977年のノーベル医学生理学賞を受賞した。RIAはラジオアイソトープを利用するため、検出感度は高いが利用できる施設が限られ(勿論学生実習は困難!)、試薬と検出器を含めて費用もかなり高価になる欠点があった。assay:ELISA)である。この方法は安価で簡便であるため、現在ホルモンや微量蛋白質、或いは感染性微生物抗原の検出と定量に極めて広範に用いられている。プラスチックの表面などの固相に、目的とする蛋白質の含まれた溶液を接触させ、溶液中の蛋白質を吸着させる。その後液相を除いて固相に吸着した蛋白質だけを残し、ここに目的とする蛋白質のみに特異的に反応する抗体の液を加える。最初に加える抗原の量と後から加えた抗体の量が適切な範囲にあれば、固相に吸着している抗原の量に応じて結合する抗体の量が変化する。酵素反応によって発色する化学物質を検出に用いれば、色の濃さ(吸光度)を測定することにより結合した抗体の量がわかり、ひいては元々存在した抗原蛋白質の量もわかる。ELISAには直接吸着法とサンドイッチ法の2種類がある。well)に接触させ、固相表面に非特異的に吸着させる(実際には蛋白質の持つ電荷や疎水性相互作用で、物理化学的に吸着する)。後から加える抗体が直接固相に吸着してしまわないよう、固相表面を無関係な蛋白質で覆う(ブロッキング)。ここで目的の蛋白質に特異的な抗体を加え、抗原に結合しなかった抗体を洗い流して、残った抗体を酵素反応により定量する。この方法は簡便であるが、最初に固相に加えた溶液に目的の抗原以外の蛋白質が多量にあり、それらが強い吸着力を持っていると、溶液中の目的蛋白質は殆ど吸着出来なくなってしまう。条件によっては検出感度が著しく低くなるし、検出出来る筈の抗原が検出出来ないこともある(固相への吸着の段階が感度を左右する)。これに対しサンドイッチ法では、先ず固相に目的の蛋白質に特異的な抗体を結合させておく。固相表面をブロックした後目的物質を含む溶液を加えると、溶液中の抗原が「抗原抗体反応により」固相に結合する。余計な蛋白質や固相に結合しなかった抗原を洗い流した後標識した抗体を加え、固相に結合していた目的物質を定量する。この場合、最初に抗原を捉える(capture)抗体と、後から結合量を量る抗体とは同じ抗原分子上の異なる部位に結合しなければいけない。目的の抗原上に複数の抗体結合部位があるか、用いる2種類の抗体が同一分子上の異なる抗原決定基を認識していないといけない。用いる抗体の量が少ないと、後から検出に用いる抗体の量が幾ら多くても最初に捉えられた量以上の抗原は検出出来ない。従って、サンドイッチ法は感度は高いが、定量的に検出するためには工夫が必要な方法である。96穴マイクロプレートを用意しておく。体が結合しており、マウスIgGの検出と定量ができるようになっている。IgMの検出、定量用である。用抗体の固相への吸着)。プレートをリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄する。