用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導することができる。後述する実施例で細胞を多能性幹細胞へ誘導することが実証されているポリヌクレオチドを含有する。用いれば、細胞を多能性幹細胞へ誘導することができる。【0017】また本発明によれば、配列番号41の塩基配列を含む、1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有し、未分化細胞マーカーの発現を調節する、未分化細胞マーカー発現調節剤が提供される。【0018】この未分化細胞マーカー発現調節剤は、後述する実施例で細胞内の未分化細胞マーカーを促進または抑制することが実証されている1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有する。そのため、この未分化細胞マーカー発現調節剤を用いれば、細胞内の未分化細胞マーカーの発現量を調節することができる。【0019】また本発明によれば、配列番号41の塩基配列を含む、1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有し、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進する、多能性幹細胞のp53発現促進剤が提供される。【0020】このp53発現促進剤は、後述する実施例で多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進することが実証されている1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有する。そのため、このp53発現促進剤を用いれば、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進することができる。【0021】また本発明によれば、配列番号41の塩基配列を含む、1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法が提供される。【0022】この生産方法は、後述する実施例で多能性幹細胞を作成するために利用できることが実証されている。そのため、この生産方法を用いれば、多能性幹細胞を生産することができる。【0023】また本発明によれば、配列番41の塩基配列を含む、1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有する、悪性腫瘍の治療薬が提供される。【0024】この悪性腫瘍の治療薬は、後述する実施例で悪性腫瘍を抑制することが実証されている1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有する。そのため、この悪性腫瘍の治療薬を用いれば、悪性腫瘍の治療をすることができる。【0025】また本発明によれば、配列番号41の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。【0026】このベクターを利用すれば、配列番号41を含む、1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを発現させることができる。p53の発現量を促進、または癌悪性腫瘍の治療をするための物質を生産することができる。p53発現促進用、または悪性腫瘍の治療用のキットが提供される。【0028】このキットを利用すれば、後述する実施例において、細胞を多能性幹細胞へ誘導すること、未分化細胞マーカーの発現量を調節すること、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進すること、または悪性腫瘍を抑制することが実証されている1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを簡易に使用することができる。p53の発現量を促進、または悪性腫瘍の治療をすることができる。治療薬、ベクター、およびキットにおいて、配列番号41の塩基配列の1~3個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていたとしてもよい。配列番号42の塩基配列の1~5個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていたとしてもよい。配列番号43の塩基配列の1~4個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていたとしてもよい。【発明の効果】【0030】本発明によれば、多能性幹細胞を誘導する新規の化合物が得られる。未分化細胞マーカーの発現を調節する新規の化合物が得られる。多能性幹細胞のp53発現促進剤が得られる。新規の悪性腫瘍治療薬が得られる。【図面の簡単な説明】【0031】【図1A】図1Aは、RGM249の2次元構造を表した図である。shRNAの2次元構造を表した図である。shRNA皮下注射後の腫瘍ボリュームの変化を調査した結果である。shRNAプラスミド等を皮下注射した際の、腫瘍ボリュームの目視的な観察結果である。shRNAプラスミド等を皮下注射から35日後に、腫瘍で発現している遺伝子の発現抑制効果を調査した結果である。shRNAプラスミド等を静脈注射から28日後に、腫瘍で発現している遺伝子の発現抑制効果を調査した結果である。mRNAと、内部の3つのmiRNAに相当する部位を表した結果である。【図3B】図3Bは、3つのmiRNAの2次構造を表した図である。【図3C】図3Cは、3つのmiRNAと、3つのsiRNAのアンチセンス鎖との配列を比較した結果である。【図3D】図3Dは、3つのsiRNAをHMV-Iへトランスフェクションした後の、癌細胞増殖の抑制効果を調査した結果である。【図3E】図3Eは、3siRNA混合物を同時にトランスフェクションしたHMV-IからRNA抽出を行い、miR-47、miR-101、miR-197の発現レベルを調査した結果である。関連する遺伝子について評価した結果である。【図4】図4は、3siRNA混合物+DDSの皮下投与による、HMV-I細胞の増殖性の抑制を調査した結果である。【図5A】図5Aは、評価した腫瘍のあるパーツ表した図である。【図5B】図5Bは、3siRNA混合物による、miR-47、miR-101、miR-197それぞれの発現抑制効果を評価した結果である。【図5C】図5Cは、siRNAで処理した腫瘍を顕微鏡で観察した写真である。関連遺伝子の転写レベルを調査した結果である。siRNAを293FT細胞にトランスフェクションした後、顕微鏡で観察した写真である。【図6B】図6Bは、hsa-mir-520dの2次構造を表した図である。siRNAをトランスフェクションした293FT細胞を、顕微鏡で免疫組織化学的に観察した写真である。未分化マーカーの発現量を観察した結果である。未分化マーカーの発現量を観察した結果である。未分化マーカーの発現量を観察した結果である。siRNAとhsa-mir-520を用いて作成したiPS細胞における各種遺伝子の転写量を調査した結果である。【図7B】図7Bは、hiPSCと293FT細胞におけるmiRNA-197とhsa-mir-520dの、miRNA発現レベルの関連性をツーステップリアルタイムRT-qPCR(n=5)で評価した結果である。【図8A】図8Aは、293FT細胞へのhas-mir-520dのウイルス導入後に出現した浮遊細胞集団を顕微鏡的に評価した結果である。【図8B】図8Bは、520d-293FTの幹性化転換を免疫細胞化学に基づき確認した結果である。【図8C】図8Cは、520d-293FTのGFP陽性とNANOG陽性状態を調査した結果である。【図9A】図9Aは、細胞のp53、hTERT等の発現量をRT-PCRで調査した結果である。【図9B】図9Bは、細胞のp53、hTERT等の発現量をウエスタンブロットで調査した結果である。【図9C】図9Cは、細胞のmiRNAの発現量を調査した結果である。【図9D】図9Dは、has-mir-520dの過剰発現時の細胞のmiRNAの発現量を調査した結果である。【図10A】図10Aは、293FT、mock-293FT、520d-293FTの細胞周期解析の結果である。1、HDAC、Sin3A、MBD3の発現量比を調査した結果である。【図11A】図11Aは、520d-HLFの形態学的変化を調査した結果である。【図11B】図11Bは、520d-HLFにおける各種mRNAの発現量比を調査した結果である。【図11C】図11Cは、mock-HLF、520d-HLFの浸潤する性質を調査した結果である。【図11D】図11Dは、HLF、mock-HLF、520d-HLFにおける各種蛋白質の発現量を、ウエスタンブロットで調査した結果である。【図12A】図12Aは、mock-HLF、520d-HLFの細胞周期解析の結果である。【図12B】図12Bは、HLF、hiPSC、520d-HLFにおける各種mRNAの発現量比を調査した結果である。1、HDAC、Sin3A、MBD3の発現量比を調査した結果である。【図14A】図14Aは、腫瘍形成を示す写真である。【図14B】図14Bは、白色結節を示す写真である。【図14C】図14Cは、正常肝組織へと転換したことを示す写真である。【図14D】図14Dは、腺腫様過形成を示す写真である。【図14E】図14Eは、生成した奇形腫と肝組織を示す写真である。【図15】図15は、520d-HLFの分化を調査した結果である。【図16】図16は、520d-HLFを骨分化誘導した結果である。【図17】図17は、has-mir-520dウイルスが感染したHuh7の形態学的変化等を調査した結果である。【図18】図18は、has-mir-520dウイルスが感染したT98Gの形態学的変化等を調査した結果である。【図19】図19は、has-mir-520dウイルスが感染したPK-9の形態学的変化等を調査した結果である。【図20】図20は、has-mir-520dウイルスが感染したHT1080の形態学的変化等を調査した結果である。assayを実施した結果である。【図22】図22は、siRNA生成ウイルス感染後のHMV-1の蛍光顕微鏡写真と増殖曲線である。assayを実施した結果である。【発明を実施するための最良の形態】【0032】以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。同様な内容については、繰り返しの煩雑を避けるために適宜説明を省略する。本発明の一実施形態は、配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドである。この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、後述する実施例で細胞を多能性幹細胞に誘導することが示唆されている。そのため、この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。【0034】また、この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、後述する実施例で未分化細胞マーカーの発現の促進または抑制をすること、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進すること、または悪性腫瘍の抑制に効果があることが示唆されている。そのため、この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、多能性幹細胞のp53の発現量を促進するために好適に使用できる。この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。ここで、配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果は、上述したとおりである。細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。多能性幹細胞のp53の発現量を促進するために好適に使用できる。悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。p53発現促進剤、または悪性腫瘍の治療薬である。ここで、配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果は、上述したとおりである。p53発現促進剤、または悪性腫瘍の治療薬は、未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。それらは細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。それらは多能性幹細胞のp53の発現量を促進するために好適に使用できる。それらは悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。【0037】他の実施形態は、配列番号41の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有する、shRNAまたはpre-miRNAである。ここで、配列番号41の塩基配列を含むポリヌクレオチドの有する効果は、上記の配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果と同様である。そのため、このshRNAまたはpre-miRNAは、細胞を多能性幹細胞へ誘導するために好適に使用できる。このshRNAまたはpre-miRNAは、未分化細胞マーカーの発現を調節するために好適に使用できる。このshRNAまたはpre-miRNAは、多能性幹細胞のp53の発現量を促進するために好適に使用できる。このshRNAまたはpre-miRNAは、悪性腫瘍の治療に好適に使用できる。【0038】他の実施形態は、配列番号41の塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有する、ベクターである。このベクターは、上記の配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドを発現、又は生産するために好適に使用できる。【0039】またこのベクターは、さらに、配列番号42の塩基配列に相補的な塩基配列を含んでいてもよい。この場合、配列番号41の塩基配列を含むポリヌクレオチドに対して、塩基対を形成可能なポリヌクレオチドを発現、又は生産するために好適に使用できる。配列番号41の塩基配列を含むポリヌクレオチドを含有するsiRNA、miRNA、pre-miRNAまたはshRNAを発現、又は生産するために好適に使用できる。【0040】上記の配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、さらに、配列番号42の塩基配列を含んでいてもよい。この場合、上記の配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドが発揮する、RNAiまたはmiRNAの作用効率が上昇すると考えられる。配列番号41の塩基配列と配列番号42の塩基配列とが塩基対を形成することで、RISCに取り込まれやすくなると考えられるためである。上記の、1または複数本鎖が1本鎖である場合には、shRNAまたはpre-miRNAの構造をとることができる。配列番号42の塩基配列を含む場合、上記の配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドがより安定化されると考えられる。上記の配列番号41の塩基配列を含む、1または複数本鎖のポリヌクレオチドが、配列番号41の塩基配列からなるRNA鎖の相補鎖を含んでいても同様の効果が得られると考えられる。配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、配列番号43の塩基配列を含む1本鎖のポリヌクレオチドであってもよい。この場合、shRNAまたはpre-miRNAとして好適に使用できる。【0041】他の実施形態は、配列番号43の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、後述する実施例で細胞を多能性幹細胞に誘導すること、未分化細胞マーカーの発現の促進または抑制をすること、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進すること、または悪性腫瘍の抑制に効果があることが示唆されている。治療薬の用途に使用できる。shRNA、pre-miRNAまたはベクターとしても使用可能である。【0042】また、配列番号1、2、3、8、または44~47の1つ以上の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、上述したような配列番号41の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果と、同様の効果を発揮しうることが、後述する実施例で示唆されている。治療薬、siRNA(またはmiRNA)もしくはshRNA(またはpre-miRNA)、またはベクターの用途に使用できる。配列番号1、2、3、8、または44~47の1つ以上の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、それらの相補鎖、またはそれぞれ配列番号4、5、6、9、または48~51の1つ以上の塩基配列を含むポリヌクレオチドをさらに含んでいても良い。配列番号8の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、配列番号10の塩基配列を含む1本鎖のポリヌクレオチドであってもよい。配列番号44~47の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号52~55もしくはそれぞれ56~59の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドであってもよい。【0043】これと同様のことは、配列番号7の塩基配列を含むRNA鎖を、ダイサーで処理して得られるRNA鎖に対して相補的な塩基配列(以下、「ダイサー処理後の相補的な塩基配列」と称することもある)を含む、1または複数本鎖のポリヌクレオチドでもいえる。治療薬、siRNA(またはmiRNA)もしくはshRNA(またはpre-miRNA)、またはベクターの用途に使用できる。この1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、ダイサー処理後の相補的な塩基配列に相補的な配列をさらに含んでいても良い。ダイサー処理後の相補的な塩基配列は、配列番号11、12、および13からなる群から選ばれる1種以上の塩基配列を含むRNA鎖に対して、RNAi作用を有する1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドであっても良い。【0044】これと同様のことは、配列番号7の塩基配列を含むRNA鎖に対してRNAi作用を有する1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドでもいえる。治療薬、siRNA(またはmiRNA)もしくはshRNA(またはpre-miRNA)、またはベクターの用途に使用できる。他の実施形態は、上記のいずれかの1または複数本鎖のポリヌクレオチド、または上記のいずれかのベクターが導入された細胞である。この細胞は多能性が誘導されているため、再生医療等の医療材料や研究材料として好適に使用できる。【0046】またこの細胞は、外来性のc-Mycが無く、内在性のp53が発現しているため、悪性腫瘍化のリスクが低い。このp53の発現量は、例えば、hiPSCのHPS0002:253G1株のp53発現量に対して、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0、5.0、10、100、または1000倍であるが、それらに限定されない。この発現量は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。p53の発現量の測定方法は、測定精度および簡便性の面からリアルタイムPCRが好ましい。詳しい測定条件については、後述する実施例におけるリアルタイムPCRの測定条件を用いることができる。他の実施形態は、上記のいずれかの1または複数本鎖のポリヌクレオチドを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法である。上記のいずれかのベクターを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法である。この方法を適切に用いれば、多能性幹細胞を生産することができる。ポリヌクレオチドまたはベクターの細胞への導入、および培養方法は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。羊土社(2003):152-179.]。薬剤耐性やセルソーター等を利用して、導入された細胞のみを選択することができる。培地は、例えば、霊長類ES細胞用培地(コスモ・バイオ社)や通常のヒト細胞用の培地(例えば、DMEMやRPMIベースの培地)等を使用できる。一般的にES細胞を樹立する際にはフィーダー細胞と共培養することが多いが、本実施形態の多能性幹細胞はフィーダー細胞の非存在下でも樹立可能である。Culturesより入手できる。FBSの条件で培養可能である。そのため、いわゆるiPS細胞の有する培養上の困難性を克服することにも成功している。【0048】他の実施形態は、上記生産方法で得られる多能性幹細胞である。HPS0002:253G1株に比べて内在性のp53の発現量が増大している、多能性幹細胞である。上記のいずれかの1または複数本鎖のポリヌクレオチドの発現量が増大している、多能性幹細胞である。これらの細胞は、内在性のp53が発現しているため、悪性腫瘍化のリスクが低い。ここで、上記の配列番号1~10、および41~59の塩基配列は、ある程度であれば変異を受けていてもよい。そのような変異を有している塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。変異型の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、人工的に作成することが可能であり、その場合には改変型の塩基配列を含むポリヌクレオチドと呼ぶこともできる。【0050】なお、RNAiやmiRNA等の用途で用いる場合には、配列番号4~6、9、42、48~51、および56~59の塩基配列の変異は、配列番号1~3、8、41、44~47、および52~55の塩基配列の変異より大きくても、その機能に変動が生じにくい。配列番号1~3、8、41、44~47、および52~55の塩基配列は、RNAiやmiRNA等の機能を特徴付ける重要な配列であるが、一方で、配列番号4~6、9、42、48~51、および56~59の塩基配列は補助的な配列なためである。【0051】また、上記の配列番号1~10、および41~59の塩基配列は、それぞれの塩基配列の1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であっても良い。そのような塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。ここで上記「1もしくは数個」は好ましくは10個以下であり、より好ましくは5個以下であり、より好ましくは4個以下であり、より好ましくは3個以下であり、より好ましくは2個以下であり、さらに好ましくは1個である。上記「1もしくは数個」が少ないほど、野生型に近い特性を有していることになるからである。上記「付加」には挿入の概念を含む。【0052】また、上記の配列番号1~10、および41~59の塩基配列は、それぞれの塩基配列に対して、80%以上の相同性を有する塩基配列であっても良い。そのような塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。ここで上記「80%以上」は好ましくは85%以上であり、より好ましくは90%以上であり、より好ましくは95%以上であり、より好ましくは96%以上であり、より好ましくは97%以上であり、さらに好ましくは98%以上であり、最も好ましくは99%以上である。上記「80%以上」が大きいほど、野生型に近い特性を有していることになるからである。【0053】また、上記の配列番号1~10、および41~59の塩基配列は、それぞれの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであっても良い。そのような塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、野生型の塩基配列を含む1または複数本鎖のポリヌクレオチドと同様の効果を有すると考えられる。【0054】本明細書において「相同性」とは、2つもしくは複数間の塩基配列の同一の塩基数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定したものである。割合を算定する前には、比較する塩基配列群の塩基配列を整列させ、同一の割合を最大にするために必要である場合は塩基配列の一部に間隙を導入する。最適に整列した状態において、オーバーラップする塩基を含めた全塩基に対する、同一の塩基数の割合を意味する。Analysisなど)を使用して測定することができる。【0055】本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、例えば(1)洗浄のための低イオン強度と高温度、例えば、50°Cにおいて0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いる、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42°Cにおいて50%(vol/vol)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%ポリビニルピロリドン/50mMリン酸ナトリウムバッファー(pH6.5)、および750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いる、または(3)42°Cにおいて50%ホルムアミド、5×SSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5×デンハート液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、および10%のデキストラン硫酸と、42°Cにおいて0.2×SSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中での洗浄および55°Cのホルムアミド、次いで55°CにおけるEDTAを含む0.1×SSCにてストリンジェントな洗浄を含む条件であっても良い。中程度にストリンジェントな条件の例は、20%ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート液、10%デキストラン硫酸、および20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中において、37°Cで一晩インキュベーション、次いで1×SSC中37~50°Cでのフィルターの洗浄のような条件である。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者によって容易に決定でき、一般的にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存する。一般に、長いプローブは適当なアニーリングのために高温を必要とし、短いプローブは低温を必要とする。一般に、ストリンジェンシーは塩濃度に逆比例する。生命工学の分野では、ポリヌクレオチド中の塩基がある程度の変異や欠失等をしていても、野生型と同様の機能が保たれることが知られている。2つのポリヌクレオチド間での塩基のミスマッチについてもある程度許容されることが知られている。後述する実施例においても、実際にポリヌクレオチド中の塩基の欠失や、ミスマッチが存在する。みられている(図1B、図1D)。このことは、ある程度の欠失等が生じても、野生型と同様の機能が保たれることを示唆している。siRNAの配列をみると、ガイド鎖とパッセンジャー鎖の間に3つのミスマッチが存在している(図3B)。siRNAの配列をみると、ガイド鎖とパッセンジャー鎖間に1つのミスマッチが存在している(図3B)。siRNAのガイド鎖の間に3つのミスマッチが存在している(図3C)。これらのことは、RNAiまたはmiRNAの機能は、2本鎖がある程度ミスマッチを有していても生じることを示唆している。本明細書において「多能性幹細胞」とは、多能性を有しており、様々な細胞へ分化することができる細胞である。9.]に生産方法や特性の例が記載されている。253G1)に比べて、いずれかの未分化マーカーを同程度かそれ以上発現している細胞を含む。【0058】本明細書において「未分化細胞マーカー」とは、未分化の細胞で特異的に発現しているDNA鎖、RNA鎖、または蛋白質等の化合物の総称である。Klf4、c-Myc、Oct4、Sox2、PROM1、Nanog、SSEA-1、ALP、eRas、Esg1、Ecat1、Fgf4、Gdf3、REX-1などが挙げられる。多能性幹細胞マーカーということもある。RNA)、短鎖または長鎖の1または複数本鎖RNA等によって、標的遺伝子やmRNA等の機能が抑制される現象である。一般的に、この抑制は配列特異的であり、様々な生物種に存在する。siRNAを用いた場合の、典型的な哺乳類におけるRNAiのメカニズムは以下の通りである。Complex)を形成する。RISCは取り込まれた1本鎖RNAをガイド分子として、この1本鎖RNAと相補性の高い配列を持つ標的RNA鎖を認識する。標的RNA鎖はRISC内のAGO2によって、siRNAの中心部分で切断される。その後、切断された標的RNA鎖は分解される。16.]に記載されている。本明細書において「RNAi作用を有する分子」は、RNAi作用を引き起こすことができる分子であり、例えば、siRNA、shRNA等を含む。【0060】本明細書において「siRNA」とは、RNAiを引き起こす2本鎖のポリヌクレオチドである。一般的にsiRNAの2本鎖はガイド鎖とパッセンジャー鎖に分けることができ、ガイド鎖がRISCに取り込まれる。RISCに取り込まれたガイド鎖は、標的RNAを認識するために使われる。RNAi研究では主に人工的に作成したものが使用されるが、生体内において内在的に存在するものも知られている。【0061】本明細書において「miRNA(microRNA)」とは、siRNAと類似の機能を有しているポリヌクレオチドであり、標的RNA鎖の翻訳抑制や分解をすることが知られている。pre-miRNAは、miRNAの前駆体である。miRNAとsiRNAとの違いは、一般的に生成経路と、詳細なメカニズムにある。生体内におけるmiRNAの典型的な生成経路は以下の通りである。miRNA)として転写される。このpri-miRNAの中には、後にmiRNAになる配列が含まれており、その部分はヘアピン構造をとっている。このヘアピン構造の根本をDroshaが切断する。切り出されたヘアピンはpre-miRNAと呼ばれる。このpre-miRNAはExportin-5によって細胞質に運ばれる。次に細胞質においてDicerがpre-miRNAを切断することで2本鎖のmiRNAができ、さらにこれが1本鎖化してRISCを形成する。この1本鎖RNAがガイド分子として働いて、標的RNA鎖を認識し、切断または翻訳抑制する。以上が典型的なmiRNAの生成経路である。本明細書において「miRNA作用を有する分子」は、miRNA作用を引き起こすことができる分子であり、例えば、miRNA、pre-miRNA、pri-miRNA等を含む。【0062】本明細書において「shRNA」とは、ヘアピン状に折りたたまれた構造(ヘアピン様構造)を形成可能な1本鎖のポリヌクレオチドであり、RNAiを誘導する機能を有する。pre-miRNAと類似の構造をしており、通常細胞内ではDicerによって切断され、siRNAが切り出される。このsiRNAによって標的RNAの切断が生じることが知られている。RNA」とは、比較的小さいRNAをいい、例えば、siRNA、miRNA、shRNA、pre-miRNA、1または複数本鎖の低分子RNAなどを挙げることができるが、それらに限定されない。塩基数は、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、または100塩基であるが、それらに限定されない。この塩基数は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【0064】本明細書において「ダイサー(Dicer)」は、siRNAやmiRNA等の前駆体を切断して、siRNAやmiRNA等を切りだす機能を有している酵素を含む。dsRNAをsiRNAへ、pre-miRNAをmiRNAへ、shRNAをsiRNAへと導くことができる。ダイサーは上記以外のいくつかの機能を有していることが知られている。【0065】上記の1または複数本鎖は、1本鎖または2本鎖であってもよい。この場合、siRNA、miRNA、shRNA、またはアンチセンスRNAのメカニズムを利用することができる。【0066】上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、いずれかを個々で使用してもよいが、2つ以上を併用してもよい。p53発現促進剤、または悪性腫瘍の治療薬として好適に使用できる。2つ以上を併用する場合の併用割合は特に限定しない。【0067】上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、RNAi作用を有していてもよい。この場合、標的とするRNA鎖をRNAi作用によって分解することが可能である。RNAであってもよい。この場合、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低い。インターフェロン応答とは、一般的に細胞が2重鎖RNA(dsRNA)を感知することによって抗ウイルス状態になる現象として知られている。Apr;5(2):107-14.)。その結果、非特異的な遺伝子発現の抑制やアポトーシスが誘導されるといわれている。【0069】上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、または500ヌクレオチドであるが、それらに限定されない。この数は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。この数が15以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。この数が100以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。この現象は、ヌクレオチド数が少ないほど生じにくいと考えられる。【0070】上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、1本鎖の場合にはshRNAであってもよく、2本鎖の場合にはsiRNAであってもよい。この場合、標的とするRNA鎖をRNAi作用によって分解することが可能である。6;110(5):563-74.)。2本鎖の場合には、miRNAであっても良い。この場合、標的とするRNA鎖をmiRNA作用によってサイレンシングすることが可能である。1本鎖でshRNAのようなへアピン構造を有していない場合であってもよい。19;521(1-3):195-9.]に記載されている。【0071】また、上記shRNAは35以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。35以上であれば、shRNAに特有のへアピン様構造を精度よく形成できる可能性が高まる。上記shRNAは100以下のヌクレオチドから構成されていてもよい。100以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。一般的にshRNAと構造および機能が類似しているpre-miRNAの多くが、100ヌクレオチド程度またはそれ以上の長さを有していることから、shRNAの長さは必ずしも100ヌクレオチド以下でなくても、shRNAとして機能できると考えられる。28.]には、人工的にpre-miRNAを4つ結合させた大きな分子でも機能できることが示唆されている。そのため、この数はshRNAとして機能できれば限定されず、例えば、35、36、37、38、39、40、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、または500ヌクレオチドである。この数は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。pre-miRNAも同様の理由から、shRNAと同程度の数のヌクレオチドを有していても良い。【0072】また、上記siRNAまたはmiRNAのガイド鎖は15以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。15以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。それらガイド鎖は40以下のヌクレオチドから構成されていてもよい。40以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。この数は、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または40ヌクレオチドであるが、それらに限定されない。この数は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【0073】上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチド、shRNA、siRNA、miRNA、およびpre-miRNAは、1~5ヌクレオチドからなるオーバーハングを含んでいてもよい。この場合、RNAiの効率が上昇すると考えられる。この数は、例えば5、4、3、2、または1ヌクレオチドであるが、それらに限定されない。この数は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。USA)などを用いることができる。体細胞を多能性幹細胞へ誘導する機能を有していてもよい。この場合、体細胞から多能性幹細胞を作成することができる。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。細胞を多能性幹細のような多能性を有している細胞に近づける作用を持った物質のことである。本明細書において「リプログラミング」とは細胞を多能性幹細のような多能性を有している細胞に近づける作用のことである。悪性腫瘍細胞を多能性幹細胞へ誘導する誘導剤であってもよい。多能性幹細胞を作成することができる。本明細書において「悪性腫瘍」とは、正常な細胞が突然変異を起こして増殖を続けることで起こる疾患を含む。悪性腫瘍は全身のあらゆる臓器や組織から生じ、悪性腫瘍細胞が増殖すると、かたまりとなって周囲の正常な組織に侵入し破壊することが知られている。癌、または悪性リンパ腫などを含む。メラノーマからなる群から選ばれる1種以上の悪性腫瘍の細胞を多能性幹細胞へ誘導する誘導剤であってもよい。この場合、それらの悪性腫瘍細胞から多能性幹細胞を作成することができる。悪性腫瘍細胞を多能性幹細胞へ誘導することはこれまでにほとんど報告されておらず、新しい革新的な悪性腫瘍の治療方法として期待できる。【0078】上記の多能性幹細胞は、内在性のp53を発現していてもよい。この場合、悪性腫瘍化が生じにくいと考えられる。p53の発現量は、コントロール試料(例えば、p53ノックアウト細胞、正常細胞、またはそれらに由来する試料等)に比べて有意に高発現していることが好ましい。明細書において「有意に」とは、例えばコントロール群と被検査群との間の統計学的有意差をスチューデント(Student)のt検定を使用して評価し、p<0.05であるときを含む。本明細書において「コントロール群」とは、被検査群と異なる条件下に置かれた試料のことであり、当該技術分野において通常使用される範囲内の概念で表すことができる。分類される遺伝子であり、DNAが損傷したときに活性化されて、細胞分裂の停止と損傷の修復を誘導する機能が知られている。これらことは、p53による悪性腫瘍抑制とiPS細胞作成の効率化は、トレードオフの関係にあることを示している。これは分化誘導後に未分化細胞が残存する可能性が高いことを意味している。そのため、再生医療においてp53を欠損させた細胞を移植した場合に、悪性腫瘍形成のリスクが高まると考えられる。従って、この面からもp53は細胞にとって重要な分子であることがわかる。【0080】本明細書において「内在性」とは、被検物質が細胞の内部のメカニズムに由来して存在していることを表している。細胞内で恒常的に発現している蛋白質は、その発現した蛋白質に限っては内在性に含まれる。【0081】上記の未分化細胞マーカー発現調節剤において、未分化細胞マーカーはKlf4、c-Myc、Oct4、Sox2、PROM1からなる群から選ばれる1種以上の未分化細胞マーカーであってもよい。Reaction)などの公知の方法を用いて検出することができる。RT-PCRは、RNA鎖を鋳型に逆転写を行い、生成されたcDNAに対してPCRを行う方法である。トータルRNAは細胞からグアニジンチオシアネート法、市販の試薬またはキットを使用して抽出できる。タカラバイオ株式会社等から購入できる。未分化細胞マーカーや各種蛋白質は、さらにリアルタイムPCRと組み合わせて検出することもできる。そのような方法は、リアルタイムRT-PCRと呼ばれる。リアルタイムPCRは、PCRによって増幅する核酸をリアルタイムでモニタリングする方法である。文献[原理からよくわかるリアルタイムPCR実験ガイド、羊土社、2007/12]に記載の手順によって行うことができる。eXtensyon)法などが挙げられる。Iなどの蛍光物質が二本鎖の核酸に入り込み、励起光の照射によって発光を発する特性を利用して核酸量を測定する方法である。蛍光の強さは核酸の量に比例して強くなるため、蛍光強度を測定することによって核酸の増幅量を知る事ができる。リアルタイムPCRを使用した定量方法では、大きく分けて絶対定量法と相対定量法の2つの定量方法がありそれらを適宜使用できる。【0082】本明細書において「発現調節剤」とは、標的蛋白質またはmRNAの発現量を増加または減少させることが可能な物質を含む。ここで、増加または減少する量は、コントロール細胞に比べて有意差があることが好ましい。System)を含んでいてもよい。この場合、ポリヌクレオチドを細胞内に効率的に導入できる。DDSとしては、ゼラチンハイドロゲルまたはアテロコラーゲンを含む。本明細書において「ゼラチンハイドロゲル」とは、ゼラチンを原料としたハイドロゲルでDDSとして使用できる。本明細書において「アテロコラーゲン」とは、アテロコラーゲンを原料としたDDSである。細胞への導入効率や安全性に優れている。アテロコラーゲンとは、一般的にコラーゲンに含まれるテロペプチドを酵素的に分解したもので、免疫反応を誘発し難い。メラノーマからなる群から選ばれる1種以上の悪性腫瘍であってもよい。この場合、それらの悪性腫瘍の治療が可能になる。これらの悪性腫瘍はいずれも革新的な治療方法が無いために、上記の悪性腫瘍の治療薬は有望な治療薬である。【0085】本明細書において「肝臓癌」とは、肝臓の細胞が増殖を続けることで起こる疾患を含む。肝臓癌を生起させることができる肝細胞は胆管、門静脈のような血管の細胞、樹状細胞または肝細胞を含む。原発性肝癌と転移性肝癌を含む。carcinoma)であることが知られている。大細胞癌はまとめて非小細胞癌とも呼ばれる。カルチノイドや円柱種など、小細胞癌および非小細胞癌に含まれない少数の腫瘍もある。【0087】本明細書において「膵臓癌」とは、膵臓から発生した悪性腫瘍を含む。膵臓は、膵液を産生する腺房、膵液を運ぶ膵管、および内分泌腺であるランゲルハンス島などからなる。癌はいずれの組織からも発生しうる。非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する悪性腫瘍を含む。脂肪肉腫、骨原発の血管肉腫等が挙げられる。【0089】本明細書において「グリオーマ」とは、神経膠細胞から発生する悪性腫瘍を含む。発生するメラノサイト由来の悪性腫瘍を含む。【0091】本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドもしくは塩基、またはそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ヌクレオチドおよび塩基は、DNA塩基またはRNA塩基を含む。上記の等価物は、例えばDNA塩基またはRNA塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、またはヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。「DNA鎖」とは、DNA塩基またはそれらの等価物が2個以上連結した形態のことを表す。「RNA鎖」とは、RNA塩基またはそれらの等価物が2個以上連結した形態のことを表す。「塩基配列」とは、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドまたはその等価物の配列である。一般的に塩基配列は、A(アデニン)、G(グアニン)、C(シトシン)、T(チミン)によって表すことができる。TとU(ウラシル)は、用途に合わせて互いに読み替えることが可能である。Sequenceにおいて、DNA鎖およびRNA鎖の塩基配列を表すときにA、G、C、Tが用いられている。ポリヌクレオチドはDNA/RNA合成装置を用いて合成可能である。その他、DNA塩基またはRNA塩基合成の受託会社(例えば、インビトロジェン社やタカラバイオ社等)から購入することもできる。siRNA、miRNA、shRNA、pre-miRNA、またはそれらをコードするベクターの合成も各メーカーに委託することができる。30;10:392.)等を使用できる。RNAi作用またはmiRNA作用の確認は、リアルタイムRT-PCRによるRNA鎖発現量の定量によって行なうことができる。ノザンブロットによるRNA鎖発現量の解析や、ウェスタンブロットによる蛋白量の解析・表現型の観察等の方法でも行うことができる。リアルタイムRT-PCRによる方法が効率的である。【0093】本明細書において「相補鎖」とは、一つのポルヌクレオチドに対して、ハイブリダイズすることが可能な相補性の高い他のポリヌクレオチドである。本明細書において「ハイブリダイズ」とは、複数のポリヌクレオチド間において、塩基間の水素結合等によって塩基対ができる性質のことを表す。塩基対はワトソン・クリック型塩基対、フーグスティーン型塩基対、または任意の他の配列特異的な形で生じうる。2つの1本鎖がハイブリダイズした状態は2本鎖と呼ばれる。「相補的」とは、例えば一つのポリヌクレオチドに対して、AにはT、GにはCが対応する形で、他のポリヌクレオチドがハイブリダイズすることが可能な形態を含む。【0094】本明細書において「治療」とは、被験者の疾患または疾患に伴う1つ以上の症状の、予防または症状改善効果を発揮しうることをいう。【0095】本明細書において「被験者」とは、ヒトもしくはその他哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、サル、チンパンジー、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなど)を含む。好ましくは、マウス、ラット、サル、チンパンジー、またはヒトであり、特に好ましくはヒトである。ヒトであればヒトの疾患の治療や、ヒト用の治療薬または診断薬の開発等に、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを利用できるためである。マウス、ラット、サル、およびチンパンジーは、世界中で研究用のモデル動物として汎用され多くの特性が明らかになっているため、これらの生物に対して、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドの薬効薬理を調査することで、より優れた治療薬等の開発のために特に有用な情報が得られる。【0096】また、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを治療薬または予防薬として使用する場合、単独で投与することも可能ではあるが、通常はDDSまたは薬理学的に許容される1つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを直接使用せずに、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドの前駆体を投与することも可能である。静脈内などの非経口投与をあげることができ、全身または局部的に投与することができる。投与経路は、好ましくは非経口投与あげることができる。後述する実施例のように、皮下または静脈内投与であっても良い。この場合、1または複数本鎖のポリヌクレオチドが患部へ到達する効率が高い。テープ剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80(TM)、HCO-50と併用してもよい。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製することができる。噴霧剤は上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体、などを用いて調製することができる。この担体としては具体的には乳糖、グリセリンなどが例示できる。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤と、用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤化が可能である。これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。【0100】また、上記の治療薬または予防薬は、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物(例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。選択することができる。上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含有するいずれかの薬剤を含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。被験者あたり0.001~100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。体重1kgあたりの投与量は、例えば0.0001、0.01、1、50、100、250、500、または1000mgである。この投与量は、ここで例示したいずれか2つの値の範囲内であってもよい。被験者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。適切な化学療法薬と併用で投与してもよい。【0102】上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドは、悪性細胞の抑制等の効果を通して、畜産において動物の成育を補助するための添加剤などにも使用できる。【0103】また本発明の他の実施形態は、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを含む、試薬またはキットである。この試薬またはキットは、上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドの有する効果を通して、研究用の試薬もしくはキット、または医療用のキットとして使用できる。マーカー発現調節用、またはp53発現細胞作成用の添加物、補助物質として使用できる。キットには上記の1または複数本鎖のポリヌクレオチドを用いる際の使用方法もしくは使用例を記載した指示書、その指示書の所在を記載した文面、または種々のバッファーを含んでいてもよい。本発明の一実施形態は、以下の(1)~(33)のいずれかの実施形態を含んでいてもよい。含む1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有し、未分化細胞マーカーの発現を調節する、未分化細胞マーカー発現調節剤。(20)に記載の未分化細胞マーカー発現調節剤であって、前記未分化細胞マーカーが、Klf4、c-Myc、Oct4、Sox2、PROM1からなる群から選ばれる1種以上の未分化細胞マーカーである、未分化細胞マーカー発現調節剤。含む1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有し、多能性幹細胞におけるp53の発現量を促進する、多能性幹細胞のp53発現促進剤。含む1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを、細胞に導入する工程を含む、多能性幹細胞の生産方法。(23)に記載の生産方法で得られる、多能性幹細胞。HPS0002:253G1株に比べて内在性のp53の発現量が増大している、(24)に記載の多能性幹細胞。フィーダー細胞の非存在下で培養可能である、(25)に記載の多能性幹細胞。含む1本鎖または2本鎖のポリヌクレオチドを含有する、悪性腫瘍の治療薬。メラノーマからなる群から選ばれる1種以上の悪性腫瘍である、悪性腫瘍の治療薬。前記悪性腫瘍が肉腫である、(27)に記載の悪性腫瘍の治療薬。配列番号41の塩基配列に相補的な塩基配列、またはその塩基配列に対して1~3個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。(30)に記載のベクターを含む、悪性腫瘍の治療薬。p53発現促進用、または悪性腫瘍の治療用のキット。【0104】以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。【実施例】【0105】以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。shRNAプラスミド)を作成した。mRNAの塩基配列は、5&apos;-GGAAAACUAAAAUGAGAGAAUGGGUGUCCAAGAGGACAAGUUCAUGCUCACCCGGUGAUGAGAGUUUGAUUGCAGAAUAAGGCUAGACAAAGGGAAGCUGAACAUGACCAAAGCCAUGUGACAUCGUAUGAUCCUCGAAUCUCACAGUAUCUAUGUAUCUAUAAUCAGAUACAUCCCUAGACUUUCCAGGAAUUCUGGUACUUCACGAGGAUGUGAGAAGACUCUGAACAAAAUAAUACACUGCUCGUG-3&apos;(配列番号7)である。shRNAをコードする配列は、5&apos;-CACCGCAGAATAAGGCTAGACAAAGCGAACTTTGTCTAGCCTTATTCTGC-3&apos;(配列番号11)である。ボトムストランドにおいて、上記トップストランドと2重鎖を形成している配列は、5&apos;-AAAAGCAGAATAAGGCTAGACAAAGTTCGCTTTGTCTAGCCTTATTCTGC-3&apos;(配列番号12)である。shRNAのターゲット部位を示す。shRNAの塩基配列は、5&apos;-GCAGAAUAAGGCUAGACAAAGUUCGCUUUGUCUAGCCUUAUUCUGCGGUG-3&apos;(配列番号10)である。プラスミドから転写後はヘアピン様構造を形成すると考えられる(図1B)。図中の下線部は、水素結合を形成可能な部分である。mRNAの一部に相補的な配列は、5&apos;-CUUUGUCUAGCCUUAUUCUGC-3&apos;(配列番号8)である。shRNAの塩基配列中の5&apos;-GCAGAAUAAGGCUAGACAAAG-3&apos;(配列番号9)と水素結合を形成し、へアピン様構造を形成すると考えられる。mRNAに対してハイブリダイズすると考えられる。UUCGはループ部分に相当する。GGUGはオーバーハングしていると考えられる。shRNAプラスミド)を作成した。shRNAをコードする配列は、5&apos;-CACCGCAGAATAAGGCTAGACAAAGCGAACTTTGTCAGCCTTATTCTGC-3&apos;(配列番号13)である。ボトムストランドにおいて、上記トップストランドと2重鎖を形成している配列は、5&apos;-AAAAGCAGAATAAGGCTGACAAAGTTCGCTTTGTCTAGCCTTATTCTGC-3&apos;(配列番号14)である。shRNAを使用した。shRNAの塩基配列は、5&apos;-GCAGAAUAAGGCUGACAAAGUUCGCUUUGUCUAGCCUUAUUCUGCGGUG-3&apos;(配列番号15)である。配列番号15の塩基配列が配列番号10の塩基配列と異なるのは、配列番号10の5末端から14番目のAが欠失している点である。shRNAの場合と同じである。胸腺欠損マウスの右側腹に、HLF細胞を皮下注射によって播種した。shRNAプラスミド+DDSを皮下注射した。この皮下注射は、DDS1mg当たり数μg~数十μgの生理活性物質を混ぜ、マウス20~30gに対して行った。このときの腫瘍ボリュームの変化を調査した(図1C)。shRNAグループによる有意な腫瘍抑制効果が見られた。System)としてはカチオン化ゼラチンハイドロゲル(MedGel社製)を使用した。プラスミドとDDSは、メーカーのプロトコールに従い各100nMで混合した。グラフには標準誤差を示してある。データ(n=5)はマン・ホイットニーテストによって分析した(P<0.01)。shRNAグループに比較して、有意に腫瘍抑制効果を示した(P=0.034、P=0.021)。【0112】図1Dの3つの写真は、上記それぞれのプラスミドを皮下注射した際の、腫瘍ボリュームの目視的な観察結果である。shRNAグループは平均で80%の抑制効果を示していた。shRNAグループは平均で50%未満に腫瘍ボリュームを抑制していた。皮下注射から35日後に、腫瘍で発現している遺伝子の発現抑制効果を調査した(図2A)。Kitを用いてmiRNAの発現量を調べた。mRNAとhTERTmRNAのP値は、それぞれP=0.036、P=0.025)。これらのデータはマン・ホイットニーテストによって分析した。mRNAの発現を示す。一方で、上記のそれぞれのプラスミドを尾静脈へ静脈注射した場合において、28日後に腫瘍で発現している遺伝子の発現抑制効果を調査した(図2B)。(2010).)を用いた。プラスミドとDDSは、メーカーのプロトコールに従い各100μMで混合した。shRNAと比較して有意に低下していた。これらのデータはマン・ホイットニーテストによって分析した(P<0.05)。mRNAの発現を示す。shRNAグループと比較して、両方とも有意に抑制された(それぞれP=0.049、0.046)。静脈注射から28日後に、肝臓の内外の結節を目視的に観察した。shRNAグループにおいて癌結節が目視的に見られた。顕微鏡でみた場合、全てのマウスの肝臓または肺に転移性の病巣が、1匹のマウスで左腎への転移が見られた。shRNAグループでは、1匹のマウスでのみ肝臓に結節の存在が確認された(表1)。1匹のマウスでのみ腎臓に結節を有していることが確認された。shRNAグループが他のグループと比較して腫瘍形成と転移を抑制したことを表す。shRNAグループは静脈注射で与えたときに腹腔内の発癌を抑制した。mRNAを標的として治療したことを意味する。mRNAの減少、および癌の転移抑制に効果があることが示された。mRNAが、癌になんらかのメカニズムを経て影響していると考えられた。shRNAと類似の効果を有していた。mRNAから生成されるmiRNAと、そのmiRNAに対するsiRNAによる癌への影響を調べた。USA社、ニュージャージー、米国)に連結した。mRNAを、Dicer酵素(Genlantis社、カリフォルニア、米国)を使用して消化した。小RNAがAgo2に結合しない可能性があるため抗Ago2を用いずにも精製した。Technologies社、アイオワ、米国)を使用してクローニングし、TOPOベクター(Invitrogen社、カリフォルニア、米国)を使用してシークエンシングした。二次構造を予測した(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)。RNAsの配列相同性を、miRBasを使用して検討した。以上の結果、miR-47、miR-101、miR-197の3つのmiRNAが得られた。mRNAと、内部の3つのmiRNAに相当する部位を図3Aに示す。【0120】miR-47の塩基配列は5&apos;-CUCACCCGGUGAUGAGAGUUUGAUU-3&apos;(配列番号16)、miR-101の塩基配列は5&apos;-AACAUGACCAAAGCCAUGUG-3&apos;(配列番号17)、miR-197の塩基配列は5&apos;-GUACUUCACGAGGAUGUG-3&apos;(配列番号18)である。【0121】上記3つのmiRNAに対するsiRNAを生成するコンストラクト(shRNA)を作成する場合、pRNATin-H1.4/Lentiを使用した。designerを用いて合成した。各siRNAの推定2次構造を図3Bに示す。(配列番号1)である。(配列番号2)である。siRNAのセンス鎖は、3&apos;末端においてチミンが2塩基突出している。この2塩基を除いた配列は、5&apos;-AACAUGACCAAAGCCCAUGUG-3&apos;(配列番号5)である。siRNAの塩基配列はセンス鎖が5&apos;-GUACUUCACGAGGAUGUGUU-3&apos;(配列番号20)、アンチセンス鎖が5&apos;-CACAUCCUCGUGAAGUAC-3&apos;(配列番号3)である。siRNAのセンス鎖は、3&apos;末端においてチミンが2塩基突出している。この2塩基を除いた配列は、5&apos;-GUACUUCACGAGGAUGUG-3&apos;(配列番号6)である。3つのmiRNAと、3つのsiRNAのアンチセンス鎖との配列比較を図3Cに示す。siRNA、またはそれらの混合物(3siRNA混合物)各50nMを高レベルのRGM249を発現するHMV-Iへトランスフェクションした。トランスフェクションにはFuGeneキット(Roche社製)を使用した。トランスフェクションから24時間経過後の形質転換体を収集した。【0123】細胞数を測定した結果、DDSで処理したコントロール細胞と比較して、それぞれのsiRNAを単独で使用した場合に、若干の癌細胞増殖の抑制効果がみられた(図3D)。3siRNA混合物をトランスフェクションした場合、癌細胞増殖の顕著な抑制効果がみられた。これは、3つのsiRNAが相乗的に働いたためと考えられる。一方で、siRNAを2つ組み合わせて使用した場合には、同等の効果は見られなかった。このことは、2つでは相乗効果が生じにくく、むしろ1つ当たりの濃度が低くなったことが癌細胞増殖の抑制効果を弱めたと考えられる。【0124】この結果から、3つのmiRNAを阻害すると、癌細胞の増殖抑制効果があることが強く示唆された。mRNAが3つのmiRNAに分解され、その3つのmiRNAが癌に関与するメカニズムが、生体内で働いていると考えられる。上記の3つのsiRNAはこのメカニズムを遮断することで、癌細胞の増殖抑制効果を発揮したと考えられる。上記(2-2)において3siRNA混合物を同時にトランスフェクションしたHMV-IからRNA抽出を行い、miR-47、miR-101、miR-197の発現レベルを調査した(図3E)。形質転換体の転写発現プロファイリングを、癌(hTERT、c-Myc、p53)、多分化能(Oct4、Sox2、Klf4)、幹細胞性(PROM1)に関連する遺伝子について評価した(図3F)。3siRNA混合物を使用した場合、Oct4、Sox2、hTERT、p53遺伝子は3siRNA混合物による処理に伴いアップレギュレイトし、c-MycとKlf4遺伝子はダウンレギュレイトした。PROM1への影響は見られなかった。siRNAは、Oct3/4およびhTERT遺伝子をアップレギュレイトし、c-MycおよびKlf4遺伝子をダウンレギュレイトした。mRNAと比較した時に有意差があることを示す。siRNAの使用によって未分化マーカー(Oct3/4)の発現がアップレギュレイトしたことから、HMV-Iは未分化状態に変換したか、少なくとも未分化状態に誘導されたと考えられる。癌遺伝子であるc-Mycがダウンレギュレイトしたことから、未分化状態に誘導された細胞は癌化が抑制された状態にあると考えられる。【0128】さらには、3siRNA混合物を使用した場合には、2つの未分化マーカー(Oct3/4、Sox2)の発現がアップレギュレイトした。siRNAを使用した場合と同様に、ダウンレギュレイトした。癌抑制遺伝子であるp53がアップレギュレイトした。未分化状態に誘導された細胞は、c-Mycおよびp53の両面から癌化が抑制された状態にあると考えられる。【0129】以上の結果から、3つのmiRNAは、癌と、分化のメカニズムに関与していることが示唆された。3つのsiRNAは癌抑制と、癌細胞のリプログラミングの機能を有していることが示唆された。次に、siRNAをマウスに投与することで、癌抑制と癌細胞のリプログラミングについてさらに詳しく調査した。3siRNA混合物+DDSの皮下投与は、DDSのみのコントロール投与に比べて、HMV-I細胞の増殖性の抑制を示した(Kruskal-WallisテストにおいてP<0.01、n=5)(図4)。この試験には胸腺欠損マウスを用いた。DDSはアテロコラーゲン(AteloGeneTM)を用いた。3siRNA混合物とDDSは、メーカーのプロトコールに従い各100μMで混合した。図4中の上部に示した写真は、RNAを含まないアテロコラーゲン(mock)を皮下注射したときの写真である。下部に示した写真は、3siRNA混合物+DDSを皮下注射したときの写真である。*はRNAを含まないものとsiRNAを含むものの間に有意差(P<0.01)があることを示す。結節)に複数の結節を示した(表2)。いくつかの転移性の病巣が腹腔内および腹腔外で観察され、皮下浸潤も観察された。胸腺欠損マウスにHLF細胞を投与した後1週間後から、3siRNA混合物+DDSを毎週静脈注射した。μlをインジェクションした。DDSはアテロコラーゲン(AteloGeneTM)を使用した。3siRNA混合物とDDSは、メーカーのプロトコールに従い各100μMで混合した。28日後にその動物を屠殺し、肝内腫瘍と腹腔内転移の試験を行なった(表3)。この結果、3siRNA混合物+DDSの静脈投与は、HMV-1細胞の抗転移能を有意に誘導した(P<0.05、肺と肝臓それぞれ)。肝臓と肺では転移がほとんど見られず、1匹のマウスのみで腹腔内への転移が見られた。【0133】【表3】【0134】以上の結果、3siRNA混合物をマウスに投与することで、癌の増殖と、転移を有意に抑制できることが示された。siRNAで処理した腫瘍を用いてmiR-47、miR-101、miR-197の発現レベルの評価を以下の通り行った。これにより、siRNAによるmiRNAの発現抑制効果、およびmiRNAの発現量の変化を確認した。【0136】mRNAを定量化するために用いたプライマーセットの配列を表4に示す。ウエスタンブロット法はi-Blotゲル転写システムを用いて行った。抗体(抗hTERT抗体、抗p53抗体、抗c-Myc抗体、抗Oct4抗体、抗PROM1抗体)は1:500倍に希釈し、抗βアクチン抗体は1:1000倍に希釈した。LAS-4000を使用して、化学発光シグナルを1分以内に検出した。皮下による異種移植によって、3つのmiRNAの抑制効果を実証した。107個のHMV-I細胞を右側腹へ接種することにより確立した。触知できる腫瘍は播種から7日後に確認できた。μM)(n=5)、または等量のDDS(n=5)を投与した。vitroで増殖が抑制された。5週間後、腫瘍を分析するためにマウスを屠殺した。π/6×横幅×縦幅×高さの式によって評価した。細胞)を胸腺欠損マウスの尾静脈にインジェクションした。siRNA混合物またはDDSは毎週投与し、腫瘍ボリュームまたは転移を5週間後に調査した。facilitiesで保管および飼育した。guidelinesを厳格に遵守した。【0140】図5Aに示すように腫瘍のあるパーツ毎に分けて評価した。1は表面、2は内部、3は中央部分である。腫瘍はもろいため、わけ方はおおよそのものである。腫瘍内のRNAの定量化、および高い再現性のシークエンシングを行ない、3siRNA混合物による、miR-47、miR-101、miR-197それぞれの発現抑制効果を評価した結果を図5Bに示す。データはクラスカル・ワーリステスト(n=5)を用いて分析した。*はDDS処理した腫瘍に対してmiRNA発現レベルに有意差(P<0.01)があることを示す。3つのmiRNAはの量は、3siRNA混合物を投与することによって減少する傾向が見られた。×400)を図5Cに示す。上部はコントロールを、下部はsiRNAで処理した腫瘍を示す。siRNAで処理した腫瘍はHMV-I細胞で減少し、フィブロシスによる置き換わりに伴って腫瘍は壊死し、新血管新生は抑制された。癌幹細胞性に関与すると考えられる。mRNAの発現を比較した。mixは3siRNA混合物+DDSを表す。この結果、3siRNA混合物はp53およびSox2のmRNAの上昇を誘導した。一方で、hTERT、PROM1、Oct3/4、Klf4は減少した。【0144】以上の結果、3siRNA混合物をマウスに投与することで、3つのmiRNAはダウンレギュレイトし、未分化マーカーであるSox2と、癌抑制遺伝子であるp53はアップレギュレイトすることが示された。利用して、癌細胞のリプログラミングについてさらに詳細に調査した。siRNAを293FT細胞にトランスフェクションした後、顕微鏡で観察した(図6A)。Bioscience:SBI社製)を用いて、hsa-mir-520d(Accession:MI0003164)をヒトの線維芽細胞細胞(TIG-1-20)に感染させた後、顕微鏡で観察した。上記ウイルスベクターから発現するhsa-mir-520dの塩基配列は5&apos;-UCUCAAGCUGUGAGUCUACAAAGGGAAGCCCUUUCUGUUGUCUAAAAGAAAAGAAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGUUACGGUUUGAGA-3&apos;(配列番号43)である。その推定2次構造を図6Bに示す。この配列において、ガイド鎖に相当する配列は5&apos;-UCUACAAAGGGAAGCCCUUUCUG-3&apos;(配列番号41)、パッセンジャー鎖に相当する配列は5&apos;-AAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGU-3&apos;(配列番号42)である。siRNAとhsa-mir-520dの発現量は、各RNA鎖とともに発現しているGFPプロテインを検出することで評価した。円形細胞が培地に出現した後、ES細胞のための培地(ReproCELL社)に移して観察した。siRNAとhsa-mir-520dの発現が確認された。して、miRNA-197の抑制またはhsa-mir-520dのアップレギュレーションを行った。)を、顕微鏡で免疫組織化学的に観察した結果を図6Cに示す。図6Cは未分化マーカーであるOct4とNANOGを検出している。×40)で観察した写真である。左の列は身染色、真ん中の列は抗Oct4抗体によるローダミン染色、右の列は抗NANOG抗体によるローダミン染色を施した結果である。細胞の染色は各1週間行った。siRNAで誘導してから24時間後に、顕微鏡で免疫組織化学的に観察した写真である。下部(48hr)の3つは、48時間後に、同様に顕微鏡で免疫組織化学的に観察した写真である。×200)が強く発現していた。siRNAで処理した293FT細胞は、Oct4またはNANOGを発現したことから、リプログラミングされ、iPS細胞化したと考えられる。その効率も良く、106細胞から20~100程度のiPS細胞が作成できた。この293FT細胞は、一般的にES細胞やiPS細胞にみられる細胞形状を有していた。培地中で7日後も未分化状態を維持していた。iPS細胞化した293FT細胞は、ES細胞用培養液で培養できるが、一般培養用の培養液でも十分培養可能であった。フィーダー細胞は不要であり、培養面のコーティングはコラーゲンでもマトリゲルでもよかった。Bioscience:SBI社製)で感染させ、強制発現させた。同様の方法で未分化マーカーの発現量を観察した。その結果を図6D、図6E、図6Fに示す。)、HLF細胞(ヒト肝癌由来細胞株)である。HMV-I細胞、およびHLF細胞においては、未分化マーカーであるOct4またはNANOGを発現していた。【0151】以上の結果、hsa-mir-520dで処理した癌細胞は、リプログラミングされ、iPS細胞化したと考えられる。このhsa-mir-520dを強制発現させた癌細胞は、一般的にES細胞やiPS細胞にみられる細胞形状を有していた。上記ようにして生成したiPS細胞における各種遺伝子の転写量を図7Aに示す。siRNAで処理した293FT細胞、およびhsa-mir-520dが過剰発現した293FT細胞における各種遺伝子の転写量は同じであった。(2010).)の発現量に対して比較した結果である。転写レベルはワンステップリアルタイムRT-qPCRで調査した。図中、hiPSCの発現量を0として表している。上部は、293FT細胞用の培地において293FT細胞にトランスフェクションまたは感染させてから48時間後の転写量である。下部は、その後2週間、ES細胞のための培地で維持したときの転写量である。mRNAは、hiPSCに比べてハイレベルで発現していた。mRNAのみハイレベルで発現していた。他の遺伝子は、2週間後hiPSCとほとんど同レベルの発現量であった。(n=5)で評価した結果を図7Bに示す。左のパネルはhsa-mir-520dの発現量を示す。siRNAで処理した293FT細胞、293FT細胞である。右のパネルはmiRNA-197の発現量を示す。これにより形質転換体におけるmiRNA-197サイレンシングとmir-520d過剰発現を確認した。【0155】左のパネルから、生成したiPS細胞のhsa-mir-520dの発現量はhiPSCと類似していることがわかる。一方で、293FT細胞においてはhsa-mir-520dの発現量は有意にダウンレギュレイトしていることがわかる。右のパネルからは、生成したiPS細胞はmiRNA-197をhiPSCと同じくらい弱く発現していることがわかる。一方で、293FT細胞においてはmiRNA-197を他の細胞と比較して10倍多く発現していた。vivoにおけるhsa-mir-520d発現の効果を評価するために、複数種類の細胞株とレンチウイルスベクターとを使用した。L-グルタミン、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。Collection)から購入し、10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI培地中で培養した。ウイルス処理により形質転換した細胞の未分化状態を維持するため、5ng/mlのbFGF-2を有するReproStem培地(ReproCell社、東京、日本)中で、細胞を培養した。Bank)から提供された。106細胞の)293FT細胞へトランスフェクトした。gで遠心後、ウイルスペレットを回収し、Lenti-XTM(商標)qRT-PCR滴定キット(Clontech社、カリフォルニア、米国)を使用して力価測定を行った。293FTまたはHLF細胞へのレンチウイルス感染のために、10cm培養プレート当たり100万個のウイルスを使用した。Diagnostics社、バーゼル、スイス)を用いて、50nMの合成オリゴヌクレオチドを、293FT細胞へトランスフェクトした。520d-HLF細胞が骨芽細胞へと分化誘導することを確認するために、通常のRPMI1640培地中に2Mのpurmorphamineを添加して、その細胞を一週間処理した。107個のHLF細胞を、各々のマウスの腹腔内および皮下(右側腹)へ接種した。注入体積は、200μlであった。)を、4週間通常給餌した。mg/kgのネンブタールを腹腔内注射することにより麻酔し、解剖および組織学的検査のために屠殺した。皮下への異種移植を使用して、hsa-mir-520dの抑制効果を実証した。