移注までを素早く行う。2本目の遠心管の細胞浮遊液を取った駒込ピペットの内面には高密度の細胞液が付着したままになってる。倍希釈にしかならない!)。細胞浮遊液を入れるところで使用を終え、新しい駒込ピペットで3本目の遠心管内の細胞浮遊液を均一に混ぜる。取り、エッペンドルフチューブに移す。取り、このチップのままで全体を丁寧にピペッティングして撹拌する。攪拌後すぐに次の操作に移らないと、死細胞だけでなく生細胞も少しずつ色素に染まってしまう。血球計算板にカバーグラスを載せ、計算盤とカバーグラスの隙間に、マイクロピペットでトリパンブルーと混ぜた細胞浮遊液を静かに入れる(毛細管現象で吸い込まれて行く)。過剰の液を入れてカバーグラスが浮き上がってしまったり、細胞浮遊液が目盛のある面の周囲の溝に漏れ出したら失敗である。計算盤を顕微鏡に載せ、コンデンサーの絞りを絞って目盛が見えるようにする。四方の正方形の中に含まれる細胞数を数えるが、青く染まっているのは死んだ細胞、透明に見えるのが生きた細胞である。四方中の生細胞数と死細胞数の両方を数えよ。取り、これに最初の細胞浮遊系を加えて希釈する。出来るようにするには、どのように薄めたらよいかを考えよ。PBS)はその中に生きた細胞を長く保っておくのには適さない。安定性も良い、理想的な平衡塩類溶液である。塩化アンモニウムを加えたもの。この低浸透圧条件で赤血球の細胞膜は破れ、溶血が起こるが、膜の構造がよりしっかりしたリンパ球や単球は破壊されない。この溶液に長時間曝せばリンパ球や単球の細胞膜も傷害されることは言うまでもない。従って、温度と時間の条件は厳密に守らなければいけない。この溶血操作はマウスの赤血球に対しては有効だがヒトの赤血球はこの方法ではなかなか溶血しない。このため、ヒトの赤血球と白血球を分離するには比重遠心の方法が用いられる。リンパ節・脾臓などの免疫組織には、それぞれ異なる機能を持った複数種類の免疫細胞が存在する。)などがあり、リンパ球は更に抗体産生能を持つBリンパ球と、細胞性免疫反応に関与するTリンパ球に分けられる。陽性T細胞(主にヘルパーT細胞に相当する)とがあることも、講義で詳しく述べた通りである。形質細胞やマクロファージ、それに顆粒白血球は、それらの特徴的な形態によって無染色の標本や通常の組織標本上でもある程度区別可能であるが、リンパ球は全く特徴のない球形の細胞で(昔は「小円形細胞」と呼ばれた)、形を見ただけではその機能は全く予測不可能である。そこで、形の上では区別不可能だがお互いに全く異なる機能を持つ細胞群を明確に区別するために、「細胞表面マーカー」が利用されるようになった。各細胞群の機能に直結した分子を、その分子に特異的に反応する抗体によって検出出来れば理想的であるが、実際には、最初は先ず特定の細胞集団をその他の細胞集団から区別する抗体が出来、後にその抗体の反応する分子の機能が判ったと言う例も多い。呼ばれる抗原がTリンパ球のマーカーとして使われていたが、この分子はTリンパ球と(何故か)神経細胞に強く発現しており、脂質のアンカーによって細胞表面に結合している。分子そのものを用いて染め分け、その数を数えてみよう。CD4分子を、これと特異的に反応するモノクローナル抗体(anti-L3T4)で検出する。法)、酵素反応を利用するもの、ラジオアイソトープを利用するものなどがある。cytometerで陽性細胞数と各細胞の蛍光強度を測定してみよう。CD4陽性細胞数を調べる場合に用いられているものと同じである。フローサイトメーターは、細胞の均一な浮遊液より、浮遊物(細胞)の光学特性を測定する機器である。存在する種々の抗原或いは核酸量等の、生物学的特性を迅速、かつ正確に測定することができる。散乱光とは、レーザーが細胞に当たって周囲に散乱した光である。FSC)はレーザー光軸に対して前方で検出し、散乱光強度は細胞の表面積に比例する。FSCの値が大きければ細胞も大きく、FSCの値が小さければ細胞も小さいと考えられる。レーザー光軸に対して90度(直角)の位置で検出し、細胞の顆粒や細胞内構造の状態に散乱光強度が比例する。SSCの値が大きければ細胞の内部構造は複雑であり、SSCの値が小さければ細胞の内部構造は単純であると考えられる。図1にFSCをX軸に、SSCをY軸にとったドットプロットの例を示す。各細胞は図の中の一つのドット(点)で示されており、それらの位置は、FSCとSSCの相対値によって決められる。比較的サイズが小さく内部構造が単純なリンパ球は左下部に、サイズが大きく内部に顆粒を持つ顆粒球は右上部に、またサイズは大きいが内部構造が単純な単球はリンパ球と顆粒球の間に、それぞれお互いに分離した集団を作って表示される。今回の実習では、この画面でリンパ球のデータだけを抽出し解析するように設定する。蛍光とは、細胞に標識されている蛍光色素が照射されたレーザー光によって励起され、エネルギーを放出する際生じた光を言う。FACSCalibur)は、488nmの単一波長レーザー光を照射する。細胞はそれ自体も弱い蛍光を発する性質を有しているが(自家蛍光)、実際に細胞の持つ分子を蛍光を用いて特異的に検出しようとする場合は、あらかじめ何らかの形で細胞或いはその持つ分子に蛍光色素を結合させる必要がある。530nmの蛍光(緑色)を発する。FITCの蛍光強度が異なってくるため、その細胞の表面に存在する抗原量を推定することができる。FACSCaliburは、異なる蛍光波長域を検出できる3本の蛍光検出器を搭載しており、異なった波長の光を発する複数の蛍光色素を用意しておけば、最大3つの異なる抗原を同時に検出することが可能である。680nmの蛍光(赤色)を発する。これらの蛍光色素が種々の抗体と組み合わされ、細胞の二重染色や三重染色に用いられる。Y軸にとったグラフをヒストグラムと言う(図2)。CD4陽性細胞数を調べている。CD4陽性細胞であるとわかる。この場合、総計で1万個以上の細胞を計数しているが、肉眼では勿論このように多数の細胞を計測することは不可能である。Y軸におき、個々の細胞が二次元グラフ上の一つ一つの点に対応するような表示方法を用いて解析する。CD8陽性細胞数を求めている。5%であることもわかる。各グループに以下の実験器具と試薬が配布されている。配布されている脾細胞浮遊液の入ったエッペンドルフチューブの蓋にそれぞれA、Bと記入する。μl添加し、蓋を閉めてからチューブの底を人差し指で強くなでるようにして抗体液と細胞浮遊液を撹拌混合する(泡を立てるな!)。l添加し、同様にして抗体液と細胞浮遊液を撹拌混合する。その後、チューブは氷上に置いて抗体を細胞に結合させる。μl添加し、同様にして抗体液と細胞浮遊液を撹拌する。チューブを氷上に置く。3,000rpm、3.5分遠心して、上清を吸引除去する。Aのチューブの細胞に液を吹きかけるようにして丁寧に浮遊させる。次にパスツールピペットを新しいものに換えて、Bのチューブの細胞を浮遊させる。3,000rpm、3.5分遠心し、上清を吸引除去する。II(新棟)10階の部屋番号10-Aに行く。(ここからの操作は教員が行う。学生は教員の操作をよく見て解説を聞くこと。2,0000個の細胞を解析する。CD8陽性細胞の割合を調べる。IgM陽性細胞の割合を調べる。テュートリアルのページに戻る免疫学教室ホームページ。