2/3を500μl加え、同様に遠心した。Waterを100μl加え、同様に遠心、そして、この過程を2回繰り返した。)を用いて濃度を測定した。β-actinをコントロールとした。検討した遺伝子は多能性関連マーカー、未分化マーカー及び分化マーカー、テロメレース関連遺伝子を使用した。22μlを加え、たんぱく質抽出液を得た。そのうちの2μlをNanoDropを用いて濃度測定に使用した。)を使用し、電気泳動したゲルをセミドライ状態でメンブレンに転写した。5分×4、リンス2分×2を行った。1×106個の細胞をwashした後、trypsin処理し15mlチューブに回収した。その後、95%エタノールを5ml加え、オーバーナイトで固定した。washした細胞をtrypsin処理した後、96wallプレートに1×106個の細胞を100μlずつ蒔いた。kitを使用して細胞増殖能を検討した。agerを使用して、形質転換を起こした細胞の足場依存性及び腫瘍形成能を検討した。そのディッシュに細胞を播き、1-2週間培養し、その後、細胞をカウントした。miRNA定量kitを用いて定量した。指定されたプロトコールに準じて施行した。感染効率はレンチウイルスベクターの情報に準じて評価した。感染をGFP発現に関して蛍光顕微鏡で可視化して判定し、neomycinの導入、miRNAの導入を感染細胞の一部よりDNAまたはRNAを抽出し、PCRで増幅後、電気泳動で可視化して評価した。ゲノムへの取り込み部位の検討は施行しなかった。assayを3日間施行した(図21)。siRNA)共感染細胞で有意に増殖抑制を確認した。各siRNA生成ウイルス感染による導入はmiRNA発現を阻害した。細胞の増殖抑制を示す経時的変化を示した(図22)。hsa-mir-222でのGFP検出のための蛍光顕微鏡写真である。HMV-1の増殖曲線である。siRNA)共感染で顕著な増殖抑制を観察し、感染細胞は3週間以内にアポトーシスに至った。assayを行った(図23)。miRNAの共発現で、顕著にコロニー形成能が抑制された。hsa-mir-192に対するsiRNAでは途中までコロニー形成を認めたが、その後、増殖は止まり、そのまま細胞の断片化を起こしてアポトーシスに至った。-222)の共感染ではコロニーを形成することはなかった。【0193】以上の実施例における各種材料および操作方法は、特に記載のない限り、以下の通り行なった。pRNAT-T6.1/neo)。USA)を用いて、プロトコールに沿って作成した。ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI培地で培養した。nMのantagomirとともにインキュベーションした。siRNA、コントロールのオリゴヌクレオチド、または空のベクターをトランスフェクションした。enzyme)はGenlantisから購入し、プロトコールに沿って使用した。Technologies)でクローニングすることによって得た。Ltd.からKSN/Slcを購入した。(Ambion)を用いて抽出した。Company)を用いて説明書に従って行った。RNAをインターナルコントロールとして使用した。(QIAGEN)を用いて逆転写及び増幅させた。(TOYOBO)を用いて行った。サンプルの発現レベルは、検量線方法(2-ΔΔ法)を使用して決定した。全てのデータ(hTERTおよびRGM249のものを除く)を、インターナルコントロールであるβ-アクチンに対して標準化した。hTERTおよびRGM249の推定は、本発明者が以前開発した定量方法に従って、コピー数により行った。RNAに関しては100ng/μlで試験した。ウエスタンブロット解析をi-Blotゲル転写システム(Invitrogen社)を使用して実行した。目的バイオマーカー遺伝子に対するそれぞれの抗体を、製造元のマニュアルに従った希釈率を用いて使用した。20μgの細胞抽出物を試験した。組織学的解析を、実験方法セクションに記載したように実施した。(100μM)を週一回のペースで4~5週にわたって行なった。腫瘍を摘出して計量した。腹腔外(postperitoneal)転移がんを、明視野イメージング機能を備えた解剖顕微鏡下または肉眼で検査および計測した。組織サンプルは、10%緩衝ホルマリン溶液中で一晩固定し、PBSで洗浄し、70%エタノールへ移した。その後、パラフィンに包埋し、薄切し、ヘマトキシリン・エオシンを用いて染色した。転移プロセスの後期ステージにおけるantagomirの効果を評価するために、胸腺欠損マウスの尾静脈を介するかまたは皮下に腫瘍細胞を移植した。次に、腫瘍細胞移植7日後に、同所性の実験に使用したと同一の用量と頻度でantagomir治療を開始した。静脈内投与の場合は全身性転移によって、または、皮下接種の場合は肝臓転移もしくは腹腔内転移によって、マウスは30日目には瀕死の状態になり、安楽死させた。μMのアンタゴマーを、週一回のペースで4~5週間にわたって6回、静脈投与した。体重は2週に1回のペースで測定した。マウスは最後の投与後6日で安楽死させ、組織を収集した。全血の一定分量をEDTAで処理したチューブに集めた。遠心分離により血球細胞を除去して、血漿を得た。サンプルを、オリンパス社製Bioanalyzerを使用して解析し、血液の生化学的値を測定した。全ての可能な病理状態に関して、肺または肝臓の切片を検査した。miRNA-47、-101、-197に対するsiRNAをトランスフェクションすることにより、293FT細胞はヒト正常細胞へと誘導された。その後、RT-PCRとウエスタンブロット法を用いて関連遺伝子の発現の変化を評価した。細胞に、miRNA-197に対するsiRNAをトランスフェクトまたは感染した。浮遊するトランスフェクタントを回収し、顕微鏡観察用の新しい培養プレートまたは免疫染色用スライドチャンバーに移した。(2008))から提供された。3-10ng/mlからなる群から選ばれる1種以上の培地で37°C、5%CO2、10%FBSの条件で培養可能であった。miRNA-197に対応するsiRNAをトランスフェクトした293FT細胞を使用して、トリプシンにより分離脱着した細胞上で、フローサイトメトリーを実行した。単一細胞懸濁物を、冷却したPBSで一度洗浄した。細胞ペレットを、その後、穏やかにチューブを振とうすることによりほぐして、ddH2O中の冷却70%EtOHを滴下して固定した。細胞を、少なくとも一晩、-20°Cでインキュベートした。固定後、細胞を冷却したPBSを用いて二回洗浄してEtOHを除去した。106細胞/mlにて再懸濁し、37°Cで50分間インキュベートした。50μg/mlのヨウ化プロピジウムを直接加えて、光を遮蔽して氷上において40分間インキュベートした。Coulter社)により解析した。ADC解析ソフトウエアを搭載したフローサイトメーターにより、siRNA-197をトランスフェクション後、約20000イベントで、iPS細胞を評価した。GFP発現細胞もしくはPE陽性細胞のフローサイトメトリーを用いた精製に関しては、ウイルストランスダクション過程の完了24時間後に、(未分化状態を維持して2週間培養後の)293FT細胞またはHLF細胞を、5%FCSを添加したリン酸緩衝液(PBS)中に再懸濁した。Coulter社、カリフォルニア、米国)を使用して分取および解析した。1×108細胞を、アルゴンレーザー(488nm、100mW)を用いて、フォワードスキャッター、サイドスキャッター、ならびにPEおよびGFP蛍光に関して解析した。検出器としては、各々、GFPに関してはFL1を、PEに関してはFL2を使用した。体温を、加熱パッドを使用して、37°Cに維持した。頭蓋を露出し、左線条体の上に、小規模な開頭を作製した。ポリエチレンの管を介して10μlのハミルトンシリンジに連結された30Gの注射針を、細胞移植用に使用した。2.5mm)し、5μlの細胞懸濁物(108細胞/μl)を圧力注射した。注射後、その注射針をゆっくりと引き抜いて、頭蓋の孔を、歯科用セメントを用いて被覆した。切開部を、6-0プロレン(Prolene)を用いて縫合した。外科手術から回復後、動物を元の飼育ケージへと戻した。以上の結果を踏まえて考察する。mRNA量の抑制の効果を有していることが示された。転移抑制、細胞内の3つのmiRNA量の抑制、未分化マーカーのアップレギュレイト、p53のアップレギュレイト、または正常細胞もしくは悪性腫瘍細胞のリプログラミングの効果を有していることが示された。hsa-mir-520dは、未分化マーカーのアップレギュレイト、p53のアップレギュレイト、または正常細胞もしくは悪性腫瘍細胞のリプログラミング、悪性腫瘍の増殖抑制等の効果を有していることが示された。siRNA等についても類似の効果が見られた。マウスで見られた悪性腫瘍の抑制は、悪性腫瘍細胞のリプログラミングが要因のひとつであると考えられる。未分化型だけでなく高分化型肝癌細胞でもOct4陽性かつNANOG陽性細胞になり、分化型によらない幹性化効果が見られた。mRNAから始まるカスケードを遮断する点で機能が共通しており、この機能が上記の悪性腫瘍の抑制や悪性腫瘍細胞のリプログラミング等の効果に関与していると考えられる。hsa-mir-520dはこのときアップレギュレイトしていると考えられる。siRNA等はいずれも悪性腫瘍治療に好適に使用できると考えられる。RNAは体内外で細胞を多能性幹細胞へと誘導する誘導剤、または多能性幹細胞を生産するための試薬として好適に使用できると考えられる。癌遺伝子を使用しない点、悪性腫瘍細胞をリプログラミングできる点、単剤でリプログラミングできる点、p53のアップレギュレイトが生じる点、または培養時にフィーダー細胞が不要である点において従来の多能性幹細胞を生産するために研究されてきた化合物よりも優れた特性を有していると考えられる。【0209】特に悪性腫瘍細胞のリプログラミングについては世界的にほとんど研究成果がでていない領域であり、今後の悪性腫瘍治療の新たな可能性を秘めている。RNAを用いて得られた多能性幹細胞が、p53をアップレギュレイトしていたことは驚くべき結果であった。この多能性幹細胞は、p53が発現しているため悪性腫瘍化しにくいと考えられる。持続させる場合に生じ、生体内では腫瘍は発生しにくかった。RNA導入後は1週間以内に治療に用いることが好ましい。shRNA、3つのsiRNA、hsa-mir-520dは、それぞれへアピン様構造の1本鎖、2本鎖、pre-miRNA様構造の1本鎖からなっている。このことは、siRNAまたはmiRNAが機能するときの2次構造は必ずしも固定されたものではなく、ある程度の範囲を許容できることを示唆している。siRNA等は、標的RNA鎖をRNAiまたはmiRNAの作用でサイレンシングしていると考えられる。siRNA等(配列番号44等)を使用すれば、上記のような効果が得られることは明らかである。ここで示されない標的RNA鎖と反応していても同様である。【0213】以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。