ガイドラインを厳格に遵守した。miRNA分離キット(Ambion社、オースチン、米国)を使用して抽出した。View、米国)を製造元のマニュアル(Clontech)に従って使用することにより、成熟型miRNAsの定量を実施した。RNAをインターナルコントロールとして使用した。RT-PCRキット(日本QIAGEN社、東京、日本)を用いて逆転写および増幅した。)を使用して実施した。サンプルの発現レベルを、検量線方法(2-ΔΔ法)を使用して決定した。全てのデータ(hTERTのものを除く)を、インターナルコントロールであるβ-アクチンに対して標準化した。hTERTの推定は、本発明者が以前開発した定量方法に従って、コピー数により行った。そのRNA定量を、シークエンシングによって、高い再現性をもって確認した。SYBRキット(タカラバイオ(株)、東京、日本)を使用して定量した。siRNAによる抑制を確認するために、miRNA発現変化を評価した。mRNAまたはmiRNA定量用のプライマー配列を、表4に示す。P<0.01として示した。20μg/μlのタンパク質とi-Blotゲル転写システムとを用いてウエスタンブロット解析した。製造元のマニュアルに従って、抗β-アクチン抗体以外の抗体(抗hTERT抗体、抗p53抗体、抗Oct4抗体、抗DICER1抗体、抗AID抗体、抗Alb抗体、および抗GFAP抗体)を1:500倍に希釈し、抗β-アクチン抗体を1:1,000倍に希釈した。LAS-4000(富士フイルム、東京、日本)を使用して、化学発光シグナルを1分以内に検出した。293FT細胞およびHLF細胞に、miRNA-197に対するsiRNAもしくはhas-mir-520dを含むレンチウイルス粒子をトランスフェクトまたは感染させた。浮遊するトランスフェクタント(つまり、トランスフェクトされた細胞)を回収し、顕微鏡観察用の新しい培養プレートまたは免疫染色用スライドチャンバーに移した。免疫組織化学解析のために、4%パラフォルムアルデヒド中で固定された肝臓組織標本を、常法により処理した。この試験で用いられたモノクローナル抗体は、以下のものである:抗アルブミン抗体(Sigma社、セントルイス、米国)、抗AFP抗体(Sigma社)、および抗GFAP抗体(Sigma社)。ネガティブコントロールとしては、一次抗体を省略して染色工程を実行した。発現の程度は、病理専門家が評価した。細胞周期解析を実行するために、単一細胞懸濁物を、冷却したPBSで一度洗浄した。細胞ペレットを、その後、穏やかにチューブを振とうすることによりほぐして、ddH2O中の3.7%ホルマリンを滴下して固定した。細胞を、少なくとも一晩、-20°Cでインキュベートした。固定後、細胞を冷却したPBSを用いて二回洗浄してEtOHを除去した。106細胞/mlにて再懸濁し、37°Cで50分間インキュベートした。50μg/mlのヨウ化プロピジウムを直接加えて、光を遮蔽して氷上において40分間インキュベートした。Coulter社)により解析した。DNA含量は、pMIRNA1-mir-520d/GFPクローンをトランスフェクト後に、約20000イベントで評価した。Coulter社)により分取(ソート)した。後腹膜腔への転移がんを、明視野イメージング機能を備えた解剖顕微鏡下または肉眼で検査および計測した。組織サンプルは、10%緩衝ホルマリン溶液中で一晩固定し、PBSで洗浄し、70%エタノールへ移した。その後、パラフィンに包埋し、薄切し、ヘマトキシリン・エオシンを用いて染色した。レンチウイルスmir-520d発現ベクターによる感染効率を評価するために、緑色蛍光発現を検出した。Uテストを用いて、3つの群(コントロール群、モック(mock)群、およびmir-520d群)間で比較した。表現系の変化を、顕微鏡的に評価した。図8Aは、293FT細胞へのhas-mir-520dのウイルス導入後に出現した浮遊細胞集団を示す。培養し、GFP発現を有するトランスフェクタントの増殖過程をタイムラプスモードで観察した(図8A(c))。has-mir-520dがウイルス感染した293FT細胞は、24時間以内にシート状の層を形成した。幹性化転換を、免疫細胞化学(図8B)に基づき確認した。GFP陽性細胞は、抗Oct4抗体により強く染色された。3日から1週間後、細胞はより大きなコロニーに生育し、NANOG陽性状態を維持していた(図8C)。RT-PCRにより評価した。siRNAによるトランスフェクタントと比較すると、has-mir-520dが過剰発現した293FT(520d-293FT)は、p53とRGM249とを強力に転写的にアップレギュレートし、Oct4とhTERTとをより弱く発現した。293FTと比較すると、p53、RGM249、およびOct4は、より強くアップレギュレートされるが、hTERTは、同じレベルで発現されていた(図9A)。ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSCs)と比較すると、浮遊状態にある520d-293FTでは、p53とOct4とがより強く転写的にアップレギュレートされていた。hTERTは、同等に発現されていた。(0日目)と比較すると、p53とOct4とは、より強くアップレギュレートされていたが、hTERTは同じレベルで発現されていた(図9B)。Dicer1はアップレギュレートされていて、そのことは、520dが成熟する過程にDicer1が必要なことを示唆した。miRNA-197発現はhiPSC中でのものと同等であった。2種類のオリゴヌクレオチドを用いて処理することにより、hiPSCレベルのmiRNA発現を有する細胞へと、293FT細胞を有意に誘導した(図9C)。miRNA-197のダウンレギュレーションを生じた(図9D)。has-mir-520dのウイルス感染後、293FTは、培地中の接着性細胞もしくは浮遊性細胞のいずれか中で、mir-520dを安定的に発現した。ウイルス感染効率は、GFP陽性細胞ソーティングを用いて決定したところ、99.2%以上であった(データは示されない)。vivo用に適応できる材料であることも示唆している。細胞周期解析によると、293FTおよびモックウイルス感染293FT(mock-293FT)と比較して、520d-293FTは、G0期が増加し、S期が減少していた(図10A)。mock-293FTと比較した場合、高レベルで有意に維持されていた(P<0.01)。1(DNA(シトシン-5-)-メチルトランスフェラーゼ)は、293FTまたはmock-293FT中でのものと同程度であった(図10B)。has-mir-520d発現ベクターを受容したHLF細胞(以下「520d-HLF」と称することもある)を、10cmプレート当たり20~50個の新規細胞集団へと転換した。図11A(左上図)に形態学的変化を示す。これらの細胞は、GFP(右上)および多能性マーカー(右下)を発現していた。その中で、Oct4およびNANOGは、転写的にアップレギュレートされていた。P<0.01;図11B)。浸潤アッセイにおいては、多能性マーカー陽性細胞のほとんどは、フィブロネクチン膜(6穴プレート当たり5μg/ml)を通過して移動することはできなかった。対照的に、mock-HLF細胞は、容易に移動することができた(図11C)。ウエスタンブロットは、Oct4およびp53のアップレギュレーションを示した。has-mir-520d発現HLF(520d-HLF)細胞中で、DICER1が抑制されていた(図11D)。細胞周期解析によると、mock-HLFと比較して、520d-HLF細胞はS期が増加し、G0期が減少していたことを示した(図12A)。mir-520dを安定的に発現する10クローンのHLF細胞を、ES用培地で一ヶ月間に渡り培養した後には、HLFのものと比べて、520d-HLF細胞中でのhTERTおよびアルブミン(Alb)はダウンレギュレートされていた。520d-HLF細胞中での、Oct4およびp53はアップレギュレートされていた。がん幹細胞マーカー(PROM1:CD133)は、HLF、hiPSC、520d-HLF細胞間では有意差はなかった(図12B)。(データは示されない)。mir-520dによるHuh7細胞(高分化肝癌細胞株)における多能性誘導を検証した。小さく丸い細胞集団におけるOct4およびNANOG発現は、モックベクターによる誘導と比較して、より上昇していた。2μMのpurmorphamine添加により、ALP、SPP1、およびIBSPのアップレギュレーションを有する骨芽細胞へと、520d-HLF細胞を誘導した。図13はHLF細胞の場合の初期化レベルを検討するためのグラフである。MBD3が有意に発現を高めるのに対し、HLFではそれらの発現が有意に低下した。107細胞)を、免疫不全マウス(KSN/Slc)の腹腔内間隙へ注射した。has-mir-520dを発現したHLF細胞を注入したマウス群の75%は、腹腔内または注射針の刺入部分に沿って腫瘍を形成した(図14A)。対照的に、100%のモック感染群は、白色結節(HE染色(×40)にて組織学的に未分化肝癌細胞)を、腹腔内または肝臓に形成した(図14B)。(右図;白矢印)を有し、部分的に腺腫様過形成を内部に有する(図14D)(右から2番目の図))正常肝組織へと転換した(図14C、下図:HE染色組織標本)。37.5%(3/8)のHLF細胞は、表皮を有する類皮嚢胞と、汗腺(左図;白矢印)(図14A、図14D、および図14C上図;HE染色組織標本)とおよび皮脂腺(左から2番目;白矢印)とからなる奇形腫に形質転換した。生成した奇形腫と肝組織は、GFPタンパク質を発現していた(図14E)(左図:HEおよび右図:GFP)。肝組織中のほとんど全ての肝細胞がヒトアルブミンを強く発現しているのを免疫組織化学染色により確認した。肝星細胞(HSC)/筋線維芽細胞(MFs)のマーカーである、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)およびアルファフェトプロテイン(AFP)は、弱く発現していた。このことは、一ヶ月間に、520d-HLF細胞が未成熟肝組織へと分化したことを示唆する。50%(4/8)は、全く腫瘍および特定組織を形成しなかった。存在を確認できた(図15)。sialoprotein陽性の骨芽細胞を得たことから、内・中・外胚葉へ分化できる間葉系幹細胞(MSC)に形質転換できた。図17は高分化型肝癌(Huh7)細胞について評価した結果である。肝癌細胞においては分化度に関わらず、同等に多能性マーカー強陽性に変化させることができた。図18は多形性膠芽腫(T98G)細胞について評価した結果である。vivoで腫瘍を形成せずに正常組織に生着した。図19は膵癌(PK-9)細胞について評価した結果である。膵癌においても幹性誘導が見られた。ある肉腫細胞(HT1080)をも幹性誘導し、脂肪細胞へ分化させることができた。USA)から購入した。corp.,)に上記shRNAをコードする塩基配列が組込まれたものである(以下、「siRNA生成ウイルス)と証することもある)。細胞に導入後、shRNAを発現し、さらにsiRNAを生成することができる。designer(Invitrogen社)によって入手した。これらsiRNAが細胞増殖抑制等の効果を有していることを確認した後、上記(7-3)のshRNAでさらに細胞増殖抑制等の効果がみられるかどうかを検証するという流れで実験を行った。siRNA等)のアンチセンス鎖において、表5のmiRNAの配列に対して、相補的な関係にある部分の配列を表7に示す。この相補的な部分が、RNAi又はmiRNAの作用において特に重要な部分と考えられる。その部分に相補的なセンス鎖の配列を併せて示す。細胞へのinfectionは、まず、293FTまたは293H細胞へレンチウイルスベクター(pRNATin-H1.4/Lenti)をtransfectionし、上清を回収し、遺伝子実験施設にある超遠心機で、27,000rpm、2時間遠心してウイルスを回収し、ペレットをPBSに溶解し、力価を検討後、-80度で保存した。そのウイルスを用いて、力価に基づき、各50μlずつ細胞に感染させた。siRNA)共感染では、1種類のウイルス粒子が有効に作用する力価で感染させた。totalRNAを抽出した。15秒間振盪後、14,000rpmで15分間遠心を行った。