moriformisに分類・同定された。その後,単一細胞内に娘細胞を形成し増殖するChlorella属と類似する増殖態度を有することから藻類Algaeに再分類され現在に至っている。その間,Chlorella属とPrototheca属の形態および生理生化学的性状の研究が行なわれ,Prototheca属はChlorella属から変異・分化したものであると理解されるに至った。自然界から容易に分離されること,また,本属は人あるいは動物のプロトテカ症の原因となることがよく知られている。stagnoraの3藻種に再分類されるという経過を辿ってきた。stagnoraの4藻種に分類することが報告されている。以上のように,Prototheca属の藻種の分類に関しては,統一的な見解が得られていないのが現状である。血清学的性状につき,それぞれ別の見地から分類しているために混乱が生じていると思われる。ついて精査するとともに,血清学的手法を用いて供試藻株間の比較を行なうことにより総合的に藻種の関連を解明することを試みた。自然発生が認められている。米国・欧州・カナダでの牛乳房炎や,ほとんどのものが重篤な深在性プロトテカ症の病型をとる犬の報告は多く,獣医学領域では重要な感染症の1つとなってきた。このようにPrototheca属の症例は数多く報告されているが,本症の病因論的検討はほとんどなされていない。本症の治療に関する報告も単一薬剤の検討がほとんどであり,基本的な薬剤の比較試験の報告がないのが現状である。vitroの実験系で感染防御要因を明らかにすることを試みた。数種類の抗菌剤に対する感受性試験を実施して,Prototheca属に有効な薬剤について比較検討した。よる藻種の分類・病原性およびそれに対する防御因子について検討し,さらに抗プロトテカ剤についても検討した。本研究成績の概要は以下のとおりである。Prototheca属は環境中に容易に見い出されることは既に多くの成書に記載されているが,その詳細な報告はなされていない。Prototheca属が原因となるプロトテカ症も近年増加の傾向にあるが,本邦での生態に関しては殆ど不明のままである。この原因として本属は酵母様真菌と集落形態が類似するため酵母様真菌として処理されたことが考えられる。そこで著者は,Sabouraudデキストロース寒天培地(SDA)・PIM培地および感受性試験からPrototheca属への感受性がないことが証明されているペニシリンを加えた変法PIM培地を用いてPrototheca属の分離を試みた。その結果,環境中からのPrototheca属の分離はSDAに比べ,PIM培地および変法PIM培地が優れていた。各培地でそれぞれPrototheca属は池水(n=50);10,30および40%,樹液(n=50);2,10および14%,河川(n=50);16,42および50%,および土壌(n=50);0,4および8%に分離されたが,牛372頭の乳汁の合計572検体からは1株もPrototheca属を分離できなかった。Prototheca属の特徴としては,Chlorella属に類似した生活環が挙げられる。formation(オートスポア形式)と呼ばれ,単一細胞から発育が始まりやがて内部分裂により細胞内に娘細胞が形成されるというものである。透過型電子顕微鏡を用いて比較・検討した。zopfiiの病巣由来7918-1,8008-1,B-1270株では楕円形であったのに対して,環境由来のB-1266株では球状に近い楕円形であった。stagnoraでは球形であった。母細胞に含まれる娘細胞の数の比較では,藻種により大きさおよび数の違いが特徴的であった。staqnoraが他の藻種に比べ大きい特徴が示された。走査型電子顕微鏡を用いた観察結果は,いずれのPrototheca属の藻種も表面が滑らかな球形~楕円形を示し,成熟した母細胞壁は破れ易くなっている像が観察された。stagnoraは大形球状を示し,明らかに藻種間での相違を認めた。zopfiiにおいて由来による形態の相違が認められた。牛乳房炎由来の7918-1株,8008-1株,B-1270株が大形の楕円形であったのに対して,環境由来のB-1266株はやや小形の球状に近い楕円形であった。透過型電子顕微鏡による観察結果では,いずれのPrototheca属も形は異なるものの,細胞内には核・電子密度の高い小体・ミトコンドリアが観察され,また細胞壁は2層構造であることが特徴であった。formation(オートスポア形成)による増殖,ビタミンB_1による発育促進およびシクロヘキサミドによる発育抑制は共通したものであった。zopfiiは培養が古くなるに従い,黄褐色を呈するようになるのが特徴であった。B-1421株は病巣由来のB-1280株と異なりやや顆粒状の集落を形成した。zopfiiの7918-1,8008-1,B-1270株は15°C~42°Cで発育可能であったが,同じ藻種であるB-1266株は36°Cですでに発育が阻害された。wickerhamiiのB-1280株は15°C~42°Cで発育可能であったが,B-1421株の15および36°Cでの発育は不良であった。stagnoraのB-1277株は15°C~42°Cで発育可能であった。stagnoraはグルコース,ガラクトースを同化し,明らかに藻種による相違が認められた。ZYMキットを用いて調べた19種類の酵素の結果,供試藻株を比較すると,7918-1,8008-1およびB-1270株が同一の細胞酵素活性を示す以外は,それぞれの藻株により細胞酵素活性は異なっていた。7918-1,8008-1およびB-1270株はエステラーゼ(C4),エステラーゼリパーゼ(C8),ロイシンアリルアミダーゼ,酸性ホスファターゼ,ホスホアミダーゼ活性を,さらにアルカリホスファターゼ,リパーゼ(C14)にも弱い活性を持ち,B-1266株はエステラーゼ(C4),エステラーゼリパーゼ(C8),リパーゼ(C14),ロイシンアリルアミダーゼ活性と弱いアルカリホスファターゼ,バリンアリルアミダーゼ,酸性ホスファターゼ,ホスホアミダーゼ活性,B-1421株はアルカリホスファターゼ,エステラーゼ(C4),エステラーゼリパーゼ(C8),ロイシンアリルアミダーゼ,酸性ホスファターゼ,ホスホアミダーゼ活性と弱いトリプシン活性を,B-1280株はエステラーゼ(C4),エステラーゼリパーゼ(C8),酸性ホスファターゼ,ホスホアミダーゼと弱いアルカリホスファターゼ,ロイシンアリルアミダーゼ,トリプシン活性を,B-1277株はエステラーゼ(C4),酸性ホスファターゼ,ホスホアミダーゼ活性と弱いアルカリホスファターゼ,エステラーゼリパーゼ(C8),トリプシン活性を保有していた。シスチンアリルアミダーゼ,キモトリプシン,α-ガラクトシダーゼ,β-ガラクトシダーゼ,β-グルクロニダーゼ,α-グルコシダーゼ,β-グルコシダーゼ,N-アセチル-β-グルコサミニダーゼ,α-マンノシダーゼおよびα-フコシダーゼ活性はいずれの藻株にも認められなかった。これらの結果は培養および細胞形態で得られた藻種および藻株間での相違とよく一致し,藻種間の鑑別に酵素活性を利用することは困難であるが,Prototheca属を鑑別するためには利用できると推測された。供試藻株の細胞糖および蛋白含有量は,B-1421およびB-1270株の蛋白量を除き各藻株間に差は認められなかった。糖含有量は約45~80mg/dl,蛋白含有量は約0.2~0.4mg/dlであった。wickerhamiiのB-1421,B-1280株では同一Rf値の2スポットが検出された。各藻株に共通するスポットはRf値0.68と0.46であった。wickerhamiiのB-1421,B-1280株では同一Rf値の2スポットが検出された。各藻株に共通するスポットはRf値0.68と0.42であった。stagnoraのB-1277株に9スポットが検出された。各藻株に共通するスポットはRf値0.65,0.10,0.07と0.05であった。各藻株の脂質の比較をするためシリカゲルGによる薄層クロマトグラフィーを行なった。展開後,脂質の検出は紫外線ランプにより行ったため得られた結果はキノン系脂質である。wickerhamiiのB-1421,B-1280株では同一Rf値の1スポットが検出された。各藻株に共通するスポットはRf値0.64であった。供試藻株の抗原関係および診断価値のある血清診断法を調べる目的で行った実験の成績を以下に示す。各藻株の培養濾液抗原をウサギに免疫して得られた抗血清およびプロトテカ症牛から得られた血清と供試藻株のホモおよびヘテロ培養濾液抗原を用いて寒天ゲル内沈降反応を行った。その結果,プロトテカ症牛から得られた血清を用いた成績では,血清はホモである7918-1および8008-1株との間に沈降線を認めたほか,同一藻種であり同じ牛乳房炎由来であるB-1270株の培養濾液抗原とも反応した。stagnoraのB-1277株であった。wickerhamiiのB-1280株の抗血清は7918-1,8008-1,B-1270株の抗原と交差反応を示した。zopfiiの7918-1,8008-1,B-1270株間の反応はプロトテカ症牛から得られた血清を用いた成績と一致していた。このことから,供試した3藻種は寒天ゲル内沈降反応により5つに型別することができ,培養濾液は血清型抗原として優れていることが明かとなった。各藻株のホルマリン処理抗原をウサギに免疫して得られた抗血清およびプロトテカ症牛から得られた血清と供試藻株のホモおよびヘテロ抗原を用いて蛍光抗体法を行った。stagnoraのB-1277株とは反応しなかった。各藻株のホルマリン処理抗原に対する抗血清を用いた成績は,いずれの抗血清もホモばかりでなくヘテロにも反応した。zopfiiの7918-1,8008-1,B-1270株を除く他の藻株と反応した。これらの結果は蛍光抗体法の感度が高いために交差反応が広く起こることを示しているものと判断した。そこで,各抗血清をヘテロの抗原で吸収して蛍光抗体法を試みた。zopfiiの7918-1,8008-1,B-1270株はホモの抗原との反応も吸収された。zopfiiの7918-1,8008-1,B-1270株に対する特異抗体が得られた。Prototheca属の病原性を知る目的で,ICR系のSPFマウスに対するLD_50を検討した。B-1277株は非病巣由来株である。cells/mlの静脈内(0.5ml),腹腔内(1.0ml),精巣内(0.1ml)接種のいずれにおいても斃死するものは認められなかった。病巣由来株,非病巣由来株とも生体が正常な状態においては大量の藻が侵入してもすぐには死の機転をとらないことが明らかになった。そこで真菌感染実験にしばしば用いられてるプレドニン前処理によるLD_50の検索を試みた。cellsと大きく2つに区分された。以上のことから,病巣由来株は非病巣由来株よりもマウスに対する毒力の強いこと,またProtothecaを用いた感染実験を行う場合は病巣由来株およびプレドニン前処理マウスを用いる必要があることが明らかになった。おける生藻数を求めた。7918-1株の生藻数から明らかなように,前処置方法の相違により臓器内の増殖像に明らかな差異が認められた。プレドニン前処置群とブレドニン+ナイトロジェンマスタード前処置群マウスではいずれの臓器においてもナイトロジエンマスタード前処置群および無処置群よりも10^2~10^6オーダー以上の藻増殖が認められた。好中球を特異的に抑制するとされるナイトロジエンマスタード前処置群では対照群と同様に藻の発育が抑えられていること,また,プレドニン前処置群とプレドニン+ナイトロジエンマスタード前処置群が同程度に組織内藻増殖が認められることから本藻感染防御の主体は網内系細胞であることが明らかとなった。cells/gの藻が生存していた。cells/gの藻が生存していた。以上のことから,本藻が生体内に血流によって侵入した際の標的臓器はCandidaやAspergillusの実験感染と同様に腎臓および肺であり,また正常マウスにおいても腎臓および脳では本藻が比較的長期に亘って生存することが明らかになった。7918-1株感染マウスの病理組織学的所見は上記のPrototheca属の生体内増殖像とよく一致した結果であった。プレドニン前処置群とブレドニン+ナイトロジエンマスタード前処置群マウスでは各臓器にPAS染色でよく染まる藻体が多く認められ,特に腎臓での藻の増殖が特徴であった。ナイトロジエンマスタード前処置群と対照群では腎臓においてマクロファージに取り囲まれた藻体が観察されたがその病変はごく一部に限局されていた。その他の臓器の病理組織像では藻体は観察されなかった。生体内増殖像と病理組織像の結果から本藻の生体内での感染には食細胞,特にマクロファージが重要な役割を果していることがわかった。比較することにより本藻感染への役割を検討した。7918-1株接種時を0時間として細胞外生藻数を調べたところ,漸次減少し2時間目で最低値に達し,以後増加した。この時の食藻率は細胞外生藻数とは逆に2時間目に最高値を示した。細胞内生藻数の減少は2時間目で止まり,以後は細胞内で増殖した。マウスマクロファージでの細胞外生藻数および食藻率は2時間目で好中球と同様であったが,細胞内生藻数は好中球の場合とは異なり漸次減少する傾向を示した。好中球の細胞内生藻数は明らかにマクロファージでの細胞内生藻数より多かった(P<0.01)。以上のような成績から,食細胞による感染防御は好中球ではなくマクロファージによってなされていることが明らかになった。プロトテカ症の病型は表在性のものから深在性に至るまで多彩であるが,それらの治療に関する成功例の報告はほとんどない。その理由の1つとして,Prototheca属に対する感受性薬剤の詳細な研究がなされていないことが挙げられる。そこで,Prototheca属の各藻種を用いて代表的な抗細菌剤および抗真菌剤に対する感受性試験を実施し,どの薬剤に対して感受性を有するかを検討した。7種の抗細菌剤に対する各藻株のMICでは,ストレプトマイシンおよびカナマイシンがすべての藻株に対して50μg/mlレベルの抗藻活性を有する以外は,すべての藻株に有効な薬剤はなかった。B-1277株にのみ50μg/mlのMICを示した。その他のアンピシリン,クロラムフエニコール,ペニシリンG,エリスロマイシンに対しては,供試藻株は100μg/ml以上の耐性を示した。13種の抗真菌剤に対する各藻株のMICを検討した結果,すべての供試藻株が100μg/ml以上の耐性を示すものはグリセオフルビン,トルナフテート,5-フルオロサイトシンの3剤で,その他は感受性を示した。供試藻株に抗藻活性を有するものの中でも,アンホテリシンB,ナナオマイシンAが0.8~3.2μg/mlと最も高く,続いてナイスタチン:1.6~6.25μg/ml,ミコナゾール:6.25~12.5μg/ml,バトラフエン:6.25~25.0μg/ml,CN-146:12.5~25.0μg/ml,ケトコナゾール:6.25~50.0μg/mlの順であった。zopfiiの7918-1,8008-1,B-1270には100μg/ml以上であったが,その他の藻株に対しては3.2~6.25μg/mlという独特な抗藻活性を示した。zopfiiの7918-1,8008-1,B-1270株は他の藻株よりも2~4倍の耐性があることがわかった。上述の研究成績から本藻類の自然界における生態が明らかとなった。stagnoraの3藻種に分類することが妥当であるとの成績であった。認められる同種藻株間での明らかな相違は,その異なる性状に一致してゲル内沈降反応および蛍光抗体法のいずれにおいても免疫学的に属内を5つに型別できた。したがって,Prototheca属が3藻種,5血清型に再分類できることを明らかにした。vitroにおける食細胞を用いて明らかにするとともに,本症の治療に対する基礎的データーとなる薬剤の比較試験をも検討し,明らかにした。電子リソースリポジトリ。