【図7-1】図7-1は、基質としてドーパミンと共に様々なアミンを用いて得られたアルカロイド類の構造およびLC-MS分析の結果を示す。【図7-2】図7-2は、基質としてドーパミンと共に様々なアミンを用いて得られたアルカロイド類の構造およびLC-MS分析の結果を示す。【図7-3】図7-3は、基質としてドーパミンと共に様々なアミンを用いて得られたアルカロイド類の構造およびLC-MS分析の結果を示す。(4’OMT)をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させ、宿主細胞より酵素を抽出し、その酵素抽出液を試験管内で混合し、基質となるドーパミン、メチル基供与体であるS-アデノシルメチオニンの存在下でレチクリンを生産させる。これらのうち少なくともMAO、6OMT、CNMTおよび4’OMTをコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させ、ドーパミンの投与により細胞内でレチクリンを生産させる。宿主細胞内でのレチクリン生合成ではSAMの添加は必要ないが、酵素抽出液によるレチクリン合成でも、SAMの添加は必須ではない。いうのは、酵素抽出液に含まれるSAMを利用可能であるためである。酵素抽出液を用いて大規模にレチクリンを合成する場合は、SAMを添加するのが好ましい。【0042】本発明は、基質であるドーパミンを、MAO、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTの作用に供することを含む、レチクリンを生産する方法を提供する。3&apos;-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンを、4&apos;OMTの作用に供することによって、レチクリンを得る工程。【0043】植物細胞においては、図1aの合成経路に示す通り、レチクリンは、ドーパミンと4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド(4-HPAA)との重合反応後、3段階のメチル化と1段階のヒドロキシル化を経て生合成されることが知られている(図1a)。用いることで、ヒドロキシル化のステップを省略できる。本発明においては、MAOを用いることで、ドーパミンから3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドを合成できる。本発明により、ドーパミンのみから効率的にレチクリン合成が可能になった(図1b)。【0044】本発明の方法においては、ドーパミンの入手源は特に限定されないが、例えば、ナカライテスク社(日本国、京都)和光純薬工業(日本国、大阪)、シグマアルドリッチ(米国、ミズーリ州セントルイス)から得られる。【0045】また、本発明の方法においては、MAO、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTの4つの酵素が必要である。NCSを用いるのが好ましい。luteus由来のものを用いるのが好ましい。【0047】6OMT、CNMT、4&apos;OMTおよびNCSは、特に限定されないが、イソキノリンアルカロイド生産性植物由来のものであるのが好ましい。イソキノリンアルカロイド生産性植物としては、ハナビシソウ、ケシ、エンゴサク等のケシ科植物、メギ等のメギ科植物、キハダ等のミカン科植物、コブシ等のモクレン科植物、オオツヅラフジなどのツヅラフジ科植物、ならびにオウレン等のキンポウゲ科植物などのイソキノリンアルカロイド産生植物などが挙げられ、好ましくはオウレンである。【0048】以下、本発明に利用できるMAO、6OMT、CNMT、4&apos;OMT、およびNCSについて説明する。【0049】本発明において使用される、MAOはドーパミンを3,4-DHPAAに変換する反応、NCSはドーパミンと3,4-DHPAAを3&apos;-ヒドロキシノルコクラウリンに変換する反応、6OMTは3&apos;-ヒドロキシノルコクラウリンを3&apos;-ヒドロキシコクラウリンに変換する反応、CNMTは、3&apos;-ヒドロキシコクラウリンを3&apos;-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンに変換する反応、4&apos;OMTは3&apos;-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンをレチクリンに変換する反応をそれぞれ触媒する酵素活性を有するものであれば特に限定されない。luteus由来のMAO、配列番号2、3、4および5に示すヌクレオチド配列にコードされる、いずれもオウレン由来のNCS、6OMT、CNMT、4&apos;OMTを好適に用いることが出来る。NCSとしては、アミンとアルデヒドの反応を触媒するNCS活性を有するものを使用できる。NCSとしては様々な配列が報告されているが、配列番号2に示すCjPR10と称される酵素およびそのホモログ、ならびにCjNCSと称される酵素が好適に使用される。(a)または(b)のタンパク質である:(a)配列番号1、2、3、4または5のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質;(b)配列番号1、2、3、4または5のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、MAO、NCS、6OMT、CNMT、または4&apos;OMTの酵素活性を有するタンパク質。【0051】本発明に使用されるタンパク質としては、以下の(b&apos;)のタンパク質も挙げられる。配列番号1、2、3、4または5のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列に対して、70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、MAO、NCS、6OMT、CNMT、または4&apos;OMTの酵素活性を有するタンパク質。タンパク質は、「MAO、NCS、6OMT、CNMT、または4&apos;OMTの酵素活性を有する」という(a)のタンパク質の機能が失われない程度にアミノ酸変異(欠失、置換、付加)が起こっているタンパク質である。このような変異には、自然界において生じる変異の他に、人為的な変異も含まれる。1982)が挙げられるがこれに限定されるわけではない。変異(欠失、置換、付加)したアミノ酸の数は、上記(a)のタンパク質の酵素活性が失われない限りその個数は制限されないが、好ましくは50アミノ酸以内であり、さらに好ましくは30アミノ酸以内である。【0053】(b&apos;)のタンパク質も、「MAO、NCS、6OMT、CNMT、または4&apos;OMTの酵素活性を有する」という(a)のタンパク質の機能が失われない程度の(a)のタンパク質に対する相同性を有するタンパク質である。相同性は、50%以上が好ましく、70%以上が特に好ましい。【0054】本発明において「相同性」とは、2つのポリペプチドあるいはポリヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象のアミノ酸配列または塩基配列の領域にわたって最適な状態(配列の一致が最大となる状態)にアラインメントされた2つの配列を比較することにより決定される。相同性の数値(%)は両方の(アミノ酸または塩基)配列に存在する同一のアミノ酸または塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸または塩基の総数で割り、得られた数値に100をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび相同性を得るためのアルゴリズムとしては当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム(例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど)が挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、例えばBLASTP、FASTAなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。塩基配列の相同性は、BLASTN、FASTAなどのソフトウェアを用いて決定される。【0055】タンパク質がMAO、NCS、6OMT、CNMT、または4&apos;OMTの酵素活性を有するか否かは、該タンパク質調製物にそれぞれの反応基質を添加し、それぞれの酵素の反応生成物が生成したか否かを調べることにより判定することが出来る。MAOについてはドーパミンを添加し、3,4-DHPAAが生成したか、NCSについてはドーパミンと3,4-DHPAAを添加し、3&apos;-ヒドロキシノルコクラウリンが生成したか、6OMTについては3&apos;-ヒドロキシノルコクラウリンを添加し、3&apos;-ヒドロキシコクラウリンが生成したか、CNMTについては、3&apos;-ヒドロキシコクラウリンを添加し、3&apos;-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンが生成したか、4&apos;OMTについては3&apos;-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンを添加し、レチクリンが生成したか、を調べることによりその活性の有無を判定することが出来る。【0056】生成物が、3,4-DHPAA、3&apos;-ヒドロキシノルコクラウリン、3&apos;-ヒドロキシコクラウリン、3&apos;-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、またはレチクリンであるか否かは、当業者に周知のあらゆる手段によって確認することが出来る。具体的には、生成物と3,4-DHPAA、3&apos;-ヒドロキシノルコクラウリン、3&apos;-ヒドロキシコクラウリン、3&apos;-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン、またはレチクリンのそれぞれの標品とを、LC-MSに供し、得られるスペクトルを比較することによって同定することが出来る。生成物と対応する標品とのNMR分析による比較によっても確認することが出来る。【0057】次いで、本発明に利用できるMAO、NCS、6OMT、CNMT、または4&apos;OMTをコードする遺伝子について説明する。【0058】本発明において好適に使用される、MAO、NCS、6OMT、CNMT、または4&apos;OMTをコードする遺伝子としては、それぞれ配列番号1、2、3、4または5に示すヌクレオチド配列を有する遺伝子が挙げられる。【0059】即ち、本発明に使用される遺伝子は、これらに限定されないが、好ましくは、以下の(a)または(b)のDNAである遺伝子である:(a)配列番号1、2、3、4または5のヌクレオチド配列からなるDNA;(b)(a)のヌクレオチド配列からなるDNAと相補的なヌクレオチド配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、MAO、NCS、6OMT、CNMT、または4&apos;OMTの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。【0060】さらに本発明に使用される遺伝子としては、以下の(c)のDNAである遺伝子も挙げられる。配列番号1、2、3、4または5のヌクレオチド配列に対して、70%以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ、MAO、NCS、6OMT、CNMT、または4&apos;OMTの酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。【0061】ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSC程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは(a)のヌクレオチド配列からなるDNAと60%以上の高い相同性を有することが望ましく、さらに80%以上の相同性を有することが好ましい。ここで「相同性」については上記したとおりである。【0062】上記遺伝子によってコードされるタンパク質が「MAO、NCS、6OMT、CNMT、または4&apos;OMTの酵素活性を有する」か否かの確認方法は、タンパク質について上記したとおりである。【0063】上記遺伝子は、当業者に周知のPCRまたはハイブリダイゼーション技術によって取得することが可能であり、あるいはDNA合成機などを用いて人工的に合成してもよい。配列の決定は常套方法により配列決定機を用いて行うことが出来る。【0064】次いで「インビボでのレチクリン生産」について説明する。ドーパミンの存在下に、該組換え宿主細胞を培養する工程。【0065】好ましくは、組換え宿主細胞はさらにNCSをコードする遺伝子を発現する。イソキノリンアルカロイド非生産性植物細胞などが挙げられる。なる群から選択される場合は、NCSをコードする遺伝子を宿主細胞に導入しなくても、レチクリンを生産することが出来る。なる群から選択される場合は、細胞内において、ドーパミンの区画化が起こらないため、ドーパミンと3,4-DHPAAの化学的カップリングが、NCSの非存在下でも進行する。【0068】インビボでのレチクリン生産において、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4&apos;OMTおよびそれらをコードする遺伝子については、上記に説明したとおりである。【0069】宿主細胞に遺伝子を導入する場合、遺伝子を直接導入してもよいが、遺伝子が導入されたベクターを宿主に導入するのが好ましい。導入遺伝子はすべて同一のベクターに組み込んでもよいし、2以上の別々のベクターに分けて組み込んでもよい。【0070】上記遺伝子が導入されるベクターとしては、宿主細胞内で自律的に複製しうるプラスミドまたはファージから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。マーカー、プロモーター等の発現制御配列、ターミネーターを含むのが好ましい。プラスミドベクターとしては、例えば大腸菌で発現させる場合は、pETベクター系、pQEベクター系、pColdベクター系などが挙げられ、酵母で発現させる場合は、pYES2ベクター系、pYEXベクター系などが挙げられる。【0072】発現ベクターは、発現制御配列を含むものが好ましい。発現制御配列とは、DNA配列に適切に連結した場合、宿主細胞において、そのDNA配列を発現させることが出来る配列を意味する。発現制御配列には少なくともプロモーターが含まれる。プロモーターは構成的プロモーターであっても誘導可能なプロモーターであってもよい。該発現ベクターには転写終結シグナル、即ちターミネーター領域が好ましくは含まれる。【0073】本発明に用いる発現ベクターは、上記遺伝子の末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することにより作成することが出来る。【0074】発現ベクターの宿主細胞への形質転換方法としては、従来公知の方法を用いることが出来、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。【0075】次いでMAO、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTおよび所望によりNCSをコードする遺伝子を導入した組換え宿主細胞をドーパミンの存在下で培養する。【0076】ドーパミンの添加量としては、通常最終濃度が1~5mMとなるよう添加するのが好ましい。【0077】培養条件は、組換え宿主細胞が良好に生育し、かつ、導入した遺伝子がコードするそれぞれの酵素が十分に発現し、それぞれの酵素活性を示す条件であれば特に限定されない。具体的には、培養条件は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して適宜選択すればよく、通常液体培養で行われる。培地の炭素源としては、グルコース、グリセロールなどが挙げられ、窒素源としては硫酸アンモニウム、カザミノ酸などが挙げられる。その他、塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどを所望により使用できる。【0078】培養温度は宿主細胞が成育し、目的の酵素を発現し、その活性が発揮される範囲で適宜変更できるが、例えば、大腸菌の場合、温度20°C、24時間、pH7.0の培養条件を用いることができる。【0079】目的の酵素の発現は、その酵素活性のアッセイにより確認できる。目的酵素の基質から生成物への変換をアッセイすることにより確認することが出来る。【0080】レチクリンの生産の確認は、当業者に周知のあらゆる手段によって確認することが出来る。具体的には、反応生成物とレチクリン標品とを、LC-MSに供し、得られるスペクトルを比較することによって同定することが出来る。反応生成物とレチクリン標品とのNMR分析による比較によっても確認することが出来る。【0081】なお、インビボでのレチクリン生産において、SAMの添加は特に必要ではない。いうのは、大腸菌などの宿主細胞においては、SAMの再生システムがあり、それによって、インビボでのメチル化活性が維持されているようであるためである【0082】レチクリンの回収は、例えば、宿主細胞を懸濁している培地を回収し、固相抽出カートリッジ(Sep-pak等)を通してアルカロイドを吸着させ、MeOHで溶出して回収する方法が挙げられる。【0083】次いで、「インビトロでのレチクリン生産」について説明する。本明細書において「インビトロ」とは、無細胞系を意味する。インビトロでのレチクリン生産において、MAO、NCS、6OMT、CNMT、4&apos;OMTおよびそれらをコードする遺伝子についての説明は、「インビボでのレチクリン生産」について記載したとおりである。該酵素抽出液とドーパミンとの混合液を提供し、該混合液からレチクリンを産生させる工程。【0085】インビトロ第一方法では、宿主細胞は、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTのすべてを発現する1種類の細胞である。【0086】かかる組換え宿主細胞からMAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTを含む酵素抽出液を得る方法は、得られた抽出液が活性のMAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTおよびSAMを含んでいる限り特に限定されない。宿主細胞を遠心分離して回収し、細胞を破砕し、遠心分離により得られた細胞の上清を酵素抽出液として用いることが出来る。該酵素抽出液とドーパミンとの混合液を提供し、該混合液からレチクリンを産生させる工程。【0088】インビトロ第二方法で用いる細胞群は、各々が、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTからなる群から選択される1以上の酵素を発現する2種類上の細胞から構成される。細胞群は全体として、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTのすべてを発現する。該細胞群を構成する細胞のうち少なくとも1種類は、イソキノリンアルカロイド非生産性細胞である。【0089】細胞群とは、二種類以上の細胞の集団をいう。細胞群を構成する細胞は、それぞれ、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTからなる群から選択される1以上の酵素を発現するものであり、同じ生物由来の細胞であってもよいし、異なる生物由来の細胞であってもよい。【0090】該細胞群から、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTを含む酵素抽出液を得る方法は得られた抽出液が活性のMAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTおよびSAMを含んでいる限り特に限定されない。細胞群を遠心分離して回収し、細胞群を合わせて破砕し、遠心分離により得られた細胞群の上清を酵素抽出液として用いてもよいし、細胞群を構成する各々の細胞を遠心分離して回収し、細胞を破砕し、遠心分離により得られた各々の細胞の上清を合わせて酵素抽出液として用いてもよい。酵素抽出液には、トリス、HEPES、MOPSバッファー等の一般的バッファー(グッドバッファー)を含めるのが好ましく、pHは6~8に調整するのが好ましい。【0091】酵素抽出液とドーパミンとの混合液を用いてレチクリンを産生させる工程は第一方法および第二方法ともに同様である。この工程の条件は、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTのそれぞれの酵素が十分に酵素活性を示す条件であれば特に限定されない。酵素抽出液とドーパミンとの混合液は、活性のMAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTならびにSAMを必須に含み、かつ、基質として添加したドーパミンを含む。ドーパミンの添加量は、通常最終濃度1~5mMである。【0092】酵素抽出液とドーパミンとの混合液を用いてレチクリンを産生させる工程の条件としては、例えば、37°C、pH7.5の条件が挙げられる。イソキノリンアルカロイド非生産性植物細胞からなる群から選択される細胞であるのが好ましい。【0094】インビトロ第一方法においても第二方法においても、該酵素抽出液とドーパミンとの混合液には、酵素を抽出した細胞に由来するSAMが含まれているため、SAMをさらに添加する必要はない。大量のレチクリンを得るためには、SAMを添加するのが好ましい。いうのは、酵素抽出液においては、細胞固有のSAMの再生システムが働かないためである。【0095】インビトロ第一方法および第二方法において、得られたレチクリンの生産の確認方法はインビボでの場合と同様であり、得られたレチクリンの回収方法は、酵素抽出液から周知の方法によってタンパク質を沈降させた後、固相抽出カートリッジ(Sep-pak等)を通してアルカロイドを吸着させ、MeOHで溶出して回収する方法が挙げられる。【0096】本発明のインビトロのレチクリン生産方法によると、光学活性の(S)-レチクリンが得られる。光学純度は、キラルカラムを用いたHPLCによる光学異性体分離や、旋光計を用いた比旋光度測定により測定することが出来る。【0097】以上、ドーパミンを基質とし、レチクリンを生産する方法について説明したが、本発明の方法はドーパミンとともにそれ以外のアミンを共存する基質とし、レチクリン以外のアルカロイド類を生産するためにも用いることが出来る。基質として用いられるドーパミン以外のアミンとしては、チラミン、2-フェニルエチルアミン、O-メチルチラミン、3-O-メチルドーパミン、5-ヒドロキシドーパミン、トリプタミンが例示される。インドリルメチル-1,2,3,4テトラハイドロイソキノリン(トリプタミンとの共存)が生産される。大腸菌においてベンジルイソキノリンアルカロイドを生産させるために、本発明者らはベンジルイソキノリンアルカロイド経路を改変した(図1b)。NCSにより縮合して(S)-ノルコクラウリンを生じる。これらの最初の工程はいまだによく特徴決定されていないため、多様なベンジルイソキノリンアルカロイドの効率的な産生のために再構成するのは困難である。(MAO)、NCS、6OMT、CNMT、および4&apos;OMTをレチクリンの合成に用いた。よるヒドロキシラーゼの工程を省略した。(2007))、微生物由来のMAOをレチクリン生合成系に導入して、MAOによるドーパミンの脱アミノ化により3,4-DHPAAを合成させた。【0100】すべての酵素を含む発現ベクターを単一のベクター中に構築して大腸菌にて発現させると、インビボ(大腸菌細胞内)およびインビトロ(大腸菌からの酵素抽出液)システムの両方でドーパミンからレチクリンが産生できた。【0101】微生物システムにおけるレチクリン産生のために、レチクリン生合成遺伝子をトランスジェニック大腸菌中に発現させた。組換え大腸菌によるレチクリンの生合成では、添加するドーパミン濃度を5mMまで上げることで(R.S)-レチクリンが11mg/Lの収量で得られた。【0102】(R,S)-レチクリンはメチル-基供与体であるS-アデノシル-L-メチオニン(SAM)を添加しなくても産生された。【0103】NCSは、立体特異的に光学異性体、(S)-形態を産生するのに、大腸菌において産生されたレチクリンはラセミ形態であった。NCS以外の4つのレチクリン生合成遺伝子(MAO、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMT)を発現する大腸菌細胞でもラセミ形態の(R,S)-レチクリンが同じでベルで産生された(データ示さず)。これらの結果は、NCSは活性の形態で産生されるのにもかかわらず(データ示さず)大腸菌細胞においてうまく機能することが出来なかったことを示す。この結果は、ノルコクラウリンを形成する縮合反応が化学反応として起こったことを示す。【0104】レチクリンのインビトロでの高産生を調べるため、トランスジェニック大腸菌細胞からの酵素抽出液をS-アデノシルメチオニン(SAM)と混合してレチクリンを合成させた。驚くべきことに、立体特異的に(S)-レチクリンが精製および各酵素レベルの微調整をしなくても酵素抽出液によりドーパミンとSAMから合成された。(R)-レチクリンの形成は本発明者らのシステムでは検出されなかった。【0105】収量は十分に高く、レチクリン以外の中間体は存在しなかったことから、本発明者らのシステムにおいて反応生成物である(S)-レチクリンを精製するのは容易であった。ドーパミンの添加量を増加させることにより、大腸菌より発現した酵素抽出液を用いて、55mg/Lの(S)-レチクリンが得られた。5mMドーパミンではSAMの添加がないと収率は低いものの、2mMドーパミンでは、SAMを添加した場合と比べてSAMを添加しない場合でも9割程度の合成率であった。【0106】メチルトランスフェラーゼ酵素はSAMを添加しなくても測定可能に反応していた(データ示さず)。(S)-レチクリンを植物培養細胞の発酵システムと比較して、安定且つ短時間で供給することが出来る。イソキノリンアルカロイドの中間産物であるレチクリンは、ドーパミンと4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドとの重合反応後、3段階のメチル化と1段階のヒドロキシル化を経て生合成されることが知られている(図1a)。本発明者らは、4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドのかわりに3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドを用いることで、ヒドロキシル化のステップを省略できることを見いだした。用いることで、ドーパミンから3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドを合成できる。本発明によると、ドーパミンのみから効率的にレチクリン合成が可能になる(図1b)。