3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンを、3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼの作用に供することによって、レチクリンを得る工程。アルカロイド類がレチクリンである、請求項1記載の方法。ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼおよび3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼが、イソキノリンアルカロイド生産性植物由来のものである、請求項1または2に記載の方法。ドーパミンと3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドとの反応を、ノルコクラウリンシンターゼの存在下で行う、請求項1~3何れかに記載の方法。ノルコクラウリンシンターゼが、イソキノリンアルカロイド生産性植物由来のものである、請求項4記載の方法。基質としてドーパミンの他に、チラミン、2-フェニルエチルアミン、O-メチルチラミン、3-O-メチルドーパミン、5-ヒドロキシドーパミンおよびトリプタミンからなる群から選択されるアミンを共存させる請求項1~5いずれかに記載の方法。ドーパミンの存在下に、該組換え宿主細胞を培養する工程、を含む、ドーパミンからアルカロイド類を生産する方法。得られるアルカロイド類がレチクリンである、請求項7記載の方法。組換え宿主細胞がさらにノルコクラウリンシンターゼをコードする遺伝子を発現する、請求項7または8記載の方法。哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項7または8記載の方法。イソキノリンアルカロイド非生産性植物細胞からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。該酵素抽出液とドーパミンとの混合液を提供し、該混合液からアルカロイド類を産生させる工程、を含む、ドーパミンからアルカロイド類をインビトロで生産する方法。得られるアルカロイド類がレチクリンである、請求項12に記載の方法。該酵素抽出液とドーパミンとの混合液を提供し、該混合液からアルカロイド類を産生させる工程、を含む、ドーパミンからアルカロイド類をインビトロで生産する方法。得られるアルカロイド類がレチクリンである、請求項14に記載の方法。該酵素抽出液とドーパミンとの混合液に、S-アデノシルメチオニンを添加することをさらに含む、請求項12~15いずれかに記載の方法。イソキノリンアルカロイド非生産性植物細胞からなる群から選択される、請求項12~16いずれかに記載の方法。レチクリンが、(S)-レチクリンである、請求項12~17いずれかに記載の方法。ドーパミンの他のアミンを基質として共存させる、請求項7~18いずれかに記載の方法。ドーパミンの他のアミンがチラミン、2-フェニルエチルアミン、O-メチルチラミン、3-O-メチルドーパミン、5-ヒドロキシドーパミンおよびトリプタミンからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼおよび3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4'-O-メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が導入された組換え微生物。ノルコクラウリンシンターゼをコードする遺伝子が導入された請求項21記載の組換え微生物。0001】本発明は、アルカロイド類、特にレチクリンの生産方法に関する。【背景技術】【0002】イソキノリンアルカロイドは6000種類にも及ぶ多様な化合物のクラスであり、モルヒネやベルべリン等有用医薬品を多く含んでおり、植物の生産する重要な有用二次代謝産物である。その生産のほとんどは天然物からの抽出に依存していた。【0003】鎮痛薬であるモルヒネ、コルヒチン、抗菌薬であるベルベリン、パルマチン、およびサンギナリン等のベンジルイソキノリンアルカロイドは、モクレン科、キンポウゲ科、メギ科、ケシ科、およびその他の多くの植物種において、チロシンから(S)-レチクリンを介して合成される。(S)-レチクリンは、多くのタイプのベンジルイソキノリンアルカロイドの生合成経路における分岐点中間体である。(S)-レチクリンは抗マラリア薬および抗癌薬の開発に有用な医薬上重要な非麻薬性アルカロイドである。植物を用いたラージスケールでのアルカロイドの産生は、植物における二次代謝の厳密な制御下では困難である。アルカロイドの化学合成は、アルカロイドの構造が複雑であるため困難である。【0004】本発明者らは、高いアルカロイド生合成活性を有するオウレン細胞の遺伝子解析からアルカロイド生合成遺伝子を多数、単離・同定した。本発明者らは、これらの遺伝子をもちいた代謝工学により、新たな有用物質、特に、重要な中間代謝産物であるレチクリンを生産する方法を開発してきた(特許文献1)。アルカロイド生合成経路の最終産物の量を増加させる試みへの適用により、選択された植物細胞が、工業的に適用され得る量の代謝産物を産生することができるようになった。代謝工学の発達とともに、中間体を基質として用いる、新たな有用新薬の開発が望まれるにいたっている。代謝中間体の蓄積についての植物代謝工学における成功例は数例しか報告されていない。よりトランスジェニックハナビシソウ細胞において報告されている(非特許文献2)。トランスジェニックケシは、レチクリンの産生に有効であるが、植物または培養細胞ごとに生成物の量が大きく変動すること、および植物または培養細胞は生育に長い時間がかかるという問題がある。コデイノン還元酵素のRNAiによるモルヒネ生合成における最終工程のノックダウンはレチクリンの蓄積を誘導したが、この蓄積のメカニズムを説明することはできなかった。ハナビシソウ細胞および根培養物においてBBEを抑制するためにアンチセンスを用いた研究では、レチクリンの蓄積は観察されなかった(非特許文献3および4)。【0007】このように、形質転換体などにおいて重要な中間体であるレチクリンの生産が試行されるに至っている。植物体、あるいは、培養細胞を用いた系においては、その増殖に時間がかかること、また、多くの場合、生産物は混合物であるなどの問題がある。再構成するいくつかの試みが微生物システムにおいて調べられた(非特許文献5および6)。微生物システムは二次代謝産物の量だけでなく質の改善にも優れた能力を有する。いうのは他の植物代謝産物は微生物システムに固有に存在しないからである。植物由来遺伝子の組合せは多様な化合物の効率的かつ高生産性のシステムの確立のために有望である。【0009】ベンジルイソキノリンアルカロイド経路においては、ノルコクラウリンからベルベリンまでのほぼすべての生合成遺伝子が単離されており、それらの活性は微生物システムにおいて示されている(非特許文献7および8)。(以下、4-HPAAとも称する)とのカップリングを触媒することから、(S)-ノルコクラウリンを介して(S)-レチクリンが産生されることが明らかとなっている。(S)-レチクリンに変換される(図1a参照)。(2000)【発明の開示】【発明が解決しようとする課題】【0010】本発明の目的は、微生物と植物酵素との組合せにより、ベンジルイソキノリンアルカロイドの有用な中間体であるアルカロイド類、特にレチクリンを産生するシステムを確立することにある。異種細胞発現系を用い、アルカロイド生合成系の再構築を行なうことを試みた。その結果、本発明者らは、レチクリンの産生のための微生物と植物の酵素を組み合わせた合成生物学的システムを見いだした。【0012】イソキノリンアルカロイドの中間産物であるレチクリンは、ドーパミンと4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドとの重合反応後、3段階のメチル化と1段階のヒドロキシル化を経て生合成されることが知られている(図1a)。本発明者らは4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドのかわりに3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド(以下、3,4-DHPAAとも称する)を用いることで、ヒドロキシル化のステップを省略できることを見いだした。用いることで、ドーパミンから3,4-ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドを合成できることを見いだした。本発明者らは、ドーパミンのみから効率的にレチクリン合成が可能になることを見いだした(図1b)。【0013】本発明は、少なくともドーパミンを含む1以上のアミンを基質とし、これを、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼおよび3&apos;-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4&apos;-O-メチルトランスフェラーゼの作用に供することを含む、アルカロイド類を生産する方法を提供する。好ましくは、該酵素反応は、ノルコクラウリンシンターゼの存在下で行う。基質として用いるドーパミン以外のアミンとしては、チラミン、2-フェニルエチルアミン、O-メチルチラミン、3-O-メチルドーパミン、5-ヒドロキシドーパミン、トリプタミン等が挙げられる。以下、基質としてドーパミンを単独で用いてレチクリンを産生させる場合を例として本発明を説明する。【0014】本発明は、基質であるドーパミンを、MAO、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTの作用に供することを含む、レチクリンを生産する方法を提供する。3&apos;-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンを、4&apos;OMTの作用に供することによって、レチクリンを得る工程。aerogenes由来のものが好ましい。【0017】6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTの由来は特に限定されないが、イソキノリンアルカロイド生産性植物由来のものであるのが好ましい。イソキノリンアルカロイド生産性植物としては、ハナビシソウ、ケシ、エンゴサク等のケシ科植物、メギ等のメギ科植物、キハダ等のミカン科植物、コブシ等のモクレン科植物、オオツヅラフジなどのツヅラフジ科植物、ならびにオウレン等のキンポウゲ科植物などのイソキノリンアルカロイド産生植物などが挙げられ、好ましくはオウレンである。【0018】本発明の方法において、ドーパミンと3,4-DHPAAとの反応は、酵素触媒によらない化学反応によっても、NCSの存在下で行ってもよい。NCSの存在下で行うことが好ましい。NCSの由来は特に限定されないが、上記のイソキノリンアルカロイド生産性植物由来のものであるのが好ましい。用いる場合、ドーパミンと3,4-DHPAAとの反応は、NCSの非存在下であっても、化学反応により進行しうる。【0020】一方、宿主として、イソキノリンアルカロイド非生産性植物細胞を用いる場合は、ドーパミンと3,4-DHPAAとの反応のために、NCSを導入するとよい。【0021】一方、同様に以下に説明する「インビトロでのレチクリン生産」においては、用いる細胞に拘わらず、MAO、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTに加えて、NCSの存在が必須である。【0022】このように、用いる生産系によってドーパミンと3,4-DHPAAとの反応は、化学反応により起こる場合と、NCSの作用によって起こる場合とがある。植物細胞においては、ドーパミンはDOPAデカルボキシラーゼによりL-DOPAから細胞質ゾル中にて合成され、液胞内に輸送され、液胞に区画化される。この区画化が、アミンであるドーパミンとアルデヒドである3,4-DHPAAの化学的カップリングを妨げている可能性がある。大腸菌などの細胞ではドーパミンは区画化されないため、ドーパミンと3,4-DHPAAの化学的カップリングが、NCSの酵素反応よりも優勢であるようである。ドーパミンの存在下に、該組換え宿主細胞を培養する工程。該方法においては、レチクリンが組換え宿主細胞内で生産されるため、本明細書においてかかる方法を、「インビボでのレチクリン生産」と称する。【0024】インビボでのレチクリン生産方法においては、基質であるドーパミンの添加は必須であるが、メチルトランスフェラーゼ反応におけるメチル基供与体であるS-アデノシルメチオニン(以下、SAMとも称する)の添加は必須ではない。大腸菌を宿主として用いる場合、SAMを添加しなくてもインビボでレチクリンが生産される。大腸菌などの宿主細胞においては、SAMの再生システムがあり、それによって、インビボでのメチル化活性が維持されているようである。宿主を用いる場合、MAO、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTをコードする遺伝子を導入するだけでよい。【0026】しかし、インビボでのレチクリン生産方法においても、以下に説明するインビトロでの方法と同様に、MAO、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTを発現する組換え宿主細胞は、さらにNCSをコードする遺伝子を発現するのが好ましい。イソキノリンアルカロイド非生産性植物細胞などが挙げられる。該酵素抽出液とドーパミンとの混合液を提供し、該混合液からレチクリンを産生させる工程。該酵素抽出液とドーパミンとの混合液を提供し、該混合液からレチクリンを産生させる工程。【0029】インビトロの第二方法においては、2種類以上の細胞からなる細胞群を用いる。かかる細胞群を構成する各々の細胞は、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTからなる群から選択される1以上の酵素を発現する。細胞群は全体としては、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTのすべてを発現する。細胞群を構成する細胞のうち、少なくとも1種類はイソキノリンアルカロイド非生産性細胞である。【0030】インビトロの第一および第二方法では、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTを発現する細胞から得られた酵素抽出液を用いてレチクリンを生産するため、これらの方法を、「インビトロでのレチクリン生産」と称する。【0031】インビトロ第一方法は、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTをコードする遺伝子が導入されてなる一種類の細胞からの酵素抽出液を用いる。インビトロ第二方法では、二種類以上の細胞からの酵素抽出液を合わせたものを用いる。いずれの方法においても、酵素抽出液は、MAO、NCS、6OMT、CNMTおよび4&apos;OMTを必須に含む。いずれの方法においても、基質としてドーパミンを加える必要がある。【0032】インビトロでのレチクリン生産では、酵素抽出液にSAMが含まれているため、メチル基供与体としてSAMを添加しなくてもレチクリンが生産できる。インビトロでは、SAMを再生することはできないため、大規模にインビトロでレチクリンを生産する場合には、該酵素抽出液とドーパミンとの混合液にSAMを外部から添加するのが好ましい。イソキノリンアルカロイド非生産性植物細胞が好ましい。インビトロ第二方法においては、それぞれの酵素を発現する細胞の種類は特に限定されないが、細胞群を構成する細胞のうち少なくとも1種類の細胞は、第一方法と同様にイソキノリンアルカロイド非生産性細胞である。【0034】インビトロでのレチクリン生産によると、(S)-レチクリンが得られる。【0035】本発明はまた、本発明の方法に用いられる、モノアミンオキシダーゼ、ノルコクラウリン6-O-メチルトランスフェラーゼ、コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼおよび3&apos;-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリン-4&apos;-O-メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が導入された組換え微生物を提供する。該組換え微生物は好ましくはさらに、ノルコクラウリンシンターゼをコードする遺伝子が導入されている。【発明の効果】【0036】本発明によると、宿主細胞にレチクリン合成に必要な生合成酵素遺伝子を導入し、大量調製させた酵素を直接利用して基質を生物変換すること、あるいは、必要遺伝子を発現させた宿主細胞に直接基質を投与することにより、目的の産物のみを高効率で生産することができる。【0037】本発明により、多様な有用化合物生産のための素材であるレチクリンが大量に生産できる基盤が構築される。レチクリンを用いたさらなる代謝変換による新たなる創薬資源の開発が可能となる。本発明の方法は、基質としてドーパミンと共にドーパミン以外のアミン類を用いる場合にも適用することが出来る。【図面の簡単な説明】【0038】【図1】図1(a)は公知の植物におけるレチクリン合成経路、図1(b)は本発明によるレチクリン合成経路を示す。【図2】図2は、レチクリン合成に関与する遺伝子を含むコンストラクトを示す。