【0120】本発明者らは、ベンジルイソキノリンアルカロイド経路が微生物システムにて構築されたこと、および大腸菌細胞が植物アルカロイドを産生する能力を獲得したことを初めて示す。本発明者らのシステムにおいて、中間体生成物であるレチクリンを、大腸菌中でドーパミンのみから産生することに成功した。3&apos;-ヒドロキシノルコクラウリン(ノルラウダノソリン)からレチクリンまでのベンジルイソキノリンアルカロイド経路におけるその他の中間体の生合成を、様々な組合せのメチルトランスフェラーゼ酵素の生合成遺伝子(6OMT、CNMTおよび4&apos;OMT)を発現するトランスジェニック大腸菌細胞を用いて調べた。LC-MS分析により明らかに、(S)-レチクリンまでの4種のベンジルイソキノリン中間体が本発明者らのインビトロ方法を用いて主要生成物として合成されることが示された。インビボでの有効な生物変換も6OMTを導入していない組換え大腸菌と比較してMAO、NCSおよび6OMTを導入した組換え大腸菌では培地が明色になることにより示された(6OMTを導入していない組換え大腸菌では培地は黒くなった)。これらの結果は、CNMTまたは4&apos;OMT反応が、ベンジルイソキノリンアルカロイド生合成において重要な役割を果たしている6OMT反応なしでは進行しないことを明らかに示す。これらの結果はオウレン細胞において6OMTが律速段階の酵素であることが示されたことおよび4’OMTの活性がN-メチル化により制御されていることと一致している。Co.、Ltd.から譲り受けた。16497-16502)。部位を含むようにしてpGYR-SpeIを構築した。CNMTの発現ベクターは以下に記載するように構築した。(配列番号17))を用いてPCRにより増幅した。部位にライゲーションし、酵母発現ベクター、pAUR123-CNMTを作成した。al.、データ未公表)。pYES2-BBEの作成用プライマーとしては、HindIII-BBE-Fプライマー(5&apos;-ATAAAGCTTATTATGCGAGCAACGCATACAATTATCTC-3&apos;(配列番号18))および、BBE-EcoRI-Rプライマー(5&apos;-TGAATTCTTTAGATAACAATATTTCCTCTACATCCAACACC-3&apos;(配列番号19))を用いた。203-210)、BBEの発現プラスミドをBJ5627に導入した。38557-38565)。培地でインキュベートした。グルコースを大腸菌培地に添加し、28°Cでのインキュベーションをさらに72時間行った。ガラクトースを大腸菌培地に添加し、28°Cでのインキュベーションをさらに48時間マグノフロリン生産の場合と同様にして行った。培地を回収し、等容量のメタノールによるタンパク質沈降後の上清を用いてマグノフロリン/スコウレリン生産をLC-MSにより測定した。生成物を標準化学物質との共溶出、およびLC-MS/MSにおいて断片化スペクトルについての標準化学物質との比較により同定した。Service)を用いた。【0127】LC-MSの結果、図6-Aは、マグノフロリン(m/z342)やコリツベリン(m/z328)が得られたことを示す。図6-Bは、(S)-スコウレリン(m/z328)、(S)-N-メチルスコウレリン(m/z342)が得られたことを示す。実施例1に記載の大腸菌を用いて、実施例2と同様の方法により、様々なアルカロイド類のインビボでの合成を行った。この実施例では、ドーパミンと共に共存するアミンとして、チラミン、2-フェニルエチルアミン、O-メチルチラミン、3-O-メチルドーパミン、5-ヒドロキシドーパミンを用いた。実施例1に記載の大腸菌から得られた酵素抽出物を用いて、実施例3と同様の方法により、ただし、ドーパミンと共に、トリプタミンを共存させ、アルカロイド類のインビトロでの合成を行った。得られたアルカロイド類の構造およびLC-MS分析の結果を図7-1~7-3に示す。チラミン、2-フェニルエチルアミン、O-メチルチラミン、3-O-メチルドーパミン、5-ヒドロキシドーパミンおよびトリプタミンから、それぞれレチクリンに加えて、ノルコクラウリン(m/z=272)、N-メチルコクラウリン(m/z=300)、N,4’-ジメチルコクラウリン(m/z=314)(以上チラミンとの共存)、7-イソキノリノール、1,2,3,4-テトラヒドロ-6-メトキシ-1-(フェニルメチル)-(m/z=270)、7-イソキノリノール、1,2,3,4-テトラヒドロ-6-メトキシ-2-メチル-1-(フェニルメチル)-(m/z=284)(以上、2-フェニルエチルアミンとの共存)、4’-O-メチルノルコクラウリン(m/z=286)、N,4’-ジメチルノルコクラウリン(m/z=300)、N,4’ジメチルコクラウリン(m/z=314)(以上,O-メチルチラミンとの共存)、3’-O-メチルノルコクラウリン(m/z=302)、3&apos;-O-メチル-N-メチルコクラウリン(m/z=330)、3’-O-メチルレチクリン(m/z=344)(以上、3-O-メチルドーパミンとの共存)、3’,5’-ジヒドロキシノルコクラウリン(m/z=304)、3’,5’-ジヒドロキシ-4’O-メチルコクラウリン(m/z=332)(以上、5-ハイドロキシドーパミンとの共存)、6-O-メチル-7ヒドロキシ-インドリルメチル-1,2,3,4テトラハイドロイソキノリン(m/z=323)(トリプタミンとの共存)と考えられる化合物が得られた。植物由来遺伝子とを組み合わせる代謝工学は、医薬産業に微生物システムのさらなる進歩を提供する。本発明により、抗マラリア薬および抗癌薬を製造する新しい機会が開発される。いうのは、チロシンからレチクリンへのベンジルイソキノリンアルカロイド生合成における初期の工程は多くのイソキノリンアルカロイドの生合成に共通しており、レチクリンはすべてのベンジルイソキノリンアルカロイドの普遍的な前駆体であるからである。【0130】本発明者らのシステムにより、新規または有用な目的のさらなる中間体の産生が可能となった。このシステムは広範なベンジルイソキノリンアルカロイドの製造のための微生物システムの基礎として役立ちうる。