上記観察対象物が上記非観察対象物に衝突したと判定された場合に上記輪郭識別手段で更新された上記観察対象物の上記非観察対象物に衝突した時の輪郭の形状を下記(A1)~(A3)の何れかに訂正すると共に、訂正後の輪郭の位置を下記(B1)~(B4)の何れかに訂正する訂正手段と、を備えたことを特徴とする、顕微鏡装置。(A1)非観察対象物との衝突前の観察対象物の輪郭の形状に置き換える。(A2)数ピクセル小さくする。(A3)衝突前の観察対象物の輪郭の形状と衝突後の観察対象物の輪郭の形状との重み付け平均した形状に置き換える。(B1)観察対象物の訂正後の輪郭を、衝突前の観察対象物の輪郭の画像上の位置と衝突後の観察対象物の画像上の位置の重み付け平均の位置へ置く。(B2)非観察対象物に衝突前の観察対象物の画像上の輪郭の位置にカルマンフィルター,パーティクルフィルタなどの観察対象物の運動モデルから予測される移動量を足した画像上の位置へ、観察対象物の訂正後の輪郭を置く。(B3)非観察対象物との衝突前の観察対象物の輪郭の形状の重心を非観察対象物に衝突した時の観察対象物の輪郭の形状の重心に重ねる。(B4)輪郭の任意の軸に対する回転により、又はアフィン変換、非アフィン変換の何れかにより訂正を行う。上記衝突判定手段で上記観察対象物が上記非観察対象物に衝突したと判定された場合に上記輪郭識別手段で更新された上記観察対象物の上記非観察対象物に衝突した時の輪郭の形状を下記(A1)~(A3)の何れかに訂正すると共に、訂正後の輪郭の位置を下記(B1)~(B4)の何れかに訂正する訂正手段、として機能させるようにしたことを特徴とする、輪郭識別プログラム。(A1)非観察対象物との衝突前の観察対象物の輪郭の形状に置き換える。(A2)数ピクセル小さくする。(A3)衝突前の観察対象物の輪郭の形状と衝突後の観察対象物の輪郭の形状との重み付け平均した形状に置き換える。(B1)観察対象物の訂正後の輪郭を、衝突前の観察対象物の輪郭の画像上の位置と衝突後の観察対象物の画像上の位置の重み付け平均の位置へ置く。(B2)非観察対象物に衝突前の観察対象物の画像上の輪郭の位置にカルマンフィルター,パーティクルフィルタなどの観察対象物の運動モデルから予測される移動量を足した画像上の位置へ、観察対象物の訂正後の輪郭を置く。(B3)非観察対象物との衝突前の観察対象物の輪郭の形状の重心を非観察対象物に衝突した時の観察対象物の輪郭の形状の重心に重ねる。(B4)輪郭の任意の軸に対する回転により、又はアフィン変換、非アフィン変換の何れかにより訂正を行う。当該特異点のラベル値の符号を変更させないことを特徴とする、輪郭識別プログラム。当該特異点のラベル値の符号を変更させないことを特徴とする、請求項3に記載の輪郭識別プログラム。各画素に対応した演算素子もしくは、複数の画素に対応した演算素子を備える演算部に実装することを特徴とする、請求項3,4,7の何れかに記載の輪郭識別プログラム。0001】本発明は、生体組織等の蛍光観察などに使用される顕微鏡装置及び画像情報検出部で取得された当該顕微鏡視野等の画像に基づいて生体組織等の観察対象物の輪郭を識別するプログラムに関する。おいて、生体組織や細胞内イオン、分子等の観察は必須の技術である。光学顕微鏡は、主に生体組織を観察するときに用いられる。レーザ共焦点顕微鏡は、光を生体細胞の一部に照射し、その照射位置を移動させ、細胞の一部を観察するときに用いられる。【0003】光学顕微鏡の主な観察技術の一つに、生体組織の細胞内のイオンや分子に蛍光色素を付け、その蛍光色素に励起光を照射し、励起された蛍光色素が発する蛍光を観察する蛍光観察法がある。【0004】蛍光と励起光の波長は異なっている。従って、蛍光を解析することで細胞内分子の検出や濃度の計測が可能になる。このため、蛍光観察は以下の長所を持つ。(i)イオンや分子の大きさでも観察できる。(ii)特定のイオンや分子のみを観察できる。(iii)蛍光の明るさがイオンや分子濃度に応じて変化するので、これらの濃度を測定することができる。【0005】しかしながら、一般に蛍光観察は以下の短所も有している。(i)励起光の波長帯域が紫外の場合、励起光が細胞にとって有毒となる。(ii)励起光を当て続けると蛍光色素が退色する。退色とは、蛍光の強さが弱まることである。【0006】蛍光観察が可能な蛍光顕微鏡を使用して動く細胞を観察していると、細胞が顕微鏡の視野外に出て観察が中断してしまう場合がある。【0007】この問題の解決方法として、(1)対物レンズの倍率を下げ視野を広げる、(2)機械的又は化学的に細胞の動きを抑制する、(3)ステージを動かし細胞の位置を視野の中心にする、等で対応している。(1)の方法は空間解像度が低下し、(2)の方法は細胞へ悪影響を及ぼす可能性がある。【0008】近年、細胞を追跡する蛍光顕微鏡システムが開発されている(特許文献1,2)。この技術は、ビジュアルサーボの技術分野に属し、細胞の位置を計算する画像処理技術と細胞の重心位置を顕微鏡の視野中心に自動的に保つ電動ステージの制御技術とを要素技術とする。【0009】従来、細胞のXY座標の計算は、背景と細胞の境界情報に基づいている。従来の細胞境界認識の画像処理技術は、2値化処理を基本としたセルフウィンドウ法と並列計算機付き(SIMD型プロセッサ付き)高速(撮影速度1kHz)カメラの組み合わせであった(手法1;非特許文献1、2、3)。背景と細胞領域の輝度値がはっきりと分かれていない顕微鏡画像において、セルフウィンドウ法は有効に機能しないとの問題があった。【0010】背景と細胞領域の輝度値がはっきりと分かれていない状況でも細胞の境界を認識できる技術が開発されている。この技術は領域依存レベルセット法(LSM)を並列化したものである(手法2;非特許文献4)。LSMは、評価関数の設定と、評価関数最小化の戦略により、輪郭を初期値から細胞の境界に近づくように、自動更新することで対象を認識するプログラムである。2003【発明の開示】【発明が解決しようとする課題】【0014】しかし、手法1~3は衝突問題にロバストではないという問題がある。追跡している細胞(追跡細胞)と、その他の細胞(非追跡細胞)、測定液中の泡、容器の枠、その他の対象(非追跡物)等の非観察対象物が接触したときに、非観察対象物を観察対象だと誤認識する問題があった(衝突問題)。この問題を解決し、同一の細胞のみを認識し続けなければ、追跡は失敗してしまう。【0015】本発明は上記課題に鑑みて創作されたものであり、衝突問題に対する細胞追跡の頑健性(ロバスト性)を向上させることができる、顕微鏡装置及び画像に基づいて生体組織等の観察対象物の輪郭を識別するプログラムを提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】【0016】上記目的を達成するため、本発明の第1の構成は、顕微鏡視野の画像を検出する画像情報検出部と、画像情報検出部からの画像に基づいて観察対象物の輪郭を識別する輪郭識別手段と、を備え、輪郭識別手段が画像情報検出部から所定時間ごとに送られてくる画像に基づいて輪郭を更新するよう構成した顕微鏡装置であって、観察対象物が非観察対象物と衝突したか否かを判別する衝突判定手段と、衝突判定手段で観察対象物が非観察対象物に衝突したと判定された場合に輪郭識別手段で更新された輪郭を訂正する訂正手段と、を備えたことを特徴としている。【0017】認識領域の内部状態の変化を検知した場合は、過去及び現在に計算した輪郭を用いて、現在の輪郭を計算し直す例外処理を行う。認識領域の面積や総光量が一定値を超えたかを検知し、過去のフレームで計算した輪郭(黒色線)を、現在のフレームで計算した輪郭の重心点へ(灰色線)平行移動する例外処理(変位補正)を行う。【0018】上記目的を達成するため、本発明の第2の構成は、顕微鏡視野の画像を検出する画像情報検出部と、画像情報検出部からの画像に基づいて観察対象物の輪郭を識別する輪郭識別手段と、を備え、輪郭識別手段が画像情報検出部から所定時間ごとに送られてくる画像に基づいて輪郭を更新するよう構成した顕微鏡装置であって、観察対象物の輪郭を更新する場合に観察対象物の輪郭が複数に分割されるか判定する分割判定手段と、分割判定手段で観察対象物の輪郭が複数に分割されると判定される場合に輪郭識別手段による輪郭の更新に代えて一つの輪郭を成すように観察対象物の輪郭を更新する分割規制手段と、を備えたことを特徴としている。【0019】本発明によれば、衝突問題の部分問題である分裂問題を解決する。分裂問題とは、2つの細胞が接触後離れるときに、認識領域の総面積或いは総光量を一定値に保ったまま輪郭が2つに分裂し、2つの細胞を共に部分的に認識してしまう問題である。分裂問題に関し、本発明によれば、観察対象物の輪郭全体のトポロジー(個数)変化を検知した場合は、過去及び現在に計算した輪郭を用いて、現在の輪郭を計算し直す例外処理を行う。各画素における輪郭更新が、輪郭全体の個数を変化させるか否かを、代数演算を用いて検出する。輪郭全体の個数を変化させない画素においては輪郭更新を許可し、輪郭全体の個数を変化させる画素、即ち特異点においては輪郭更新を許可せず、輪郭全体の個数を変化させない更新におきかえる例外処理(特異点補正)を行う。観察対象物が非観察対象物に衝突したと判定された場合に観察対象物の輪郭を訂正する訂正手段、として機能させるようにしたことを特徴としている。第3の構成において、画像とは、輪郭識別プログラムがインストールされた装置に搭載されたカメラ、CCD等の画像情報検出部によって取得された画像に限らず、他の装置の画像情報検出部で取得された画像を含む。本発明において、画像は白黒画像,カラー画像,透過光画像,反射画像,蛍光観察によって取得された画像等を含み、これらの少なくとも一つの画像を利用して観察対象物の輪郭の識別が行われる。上記観察対象物の輪郭が複数に分割されると判定される場合に、輪郭識別手段による輪郭の更新に代えて、一つの輪郭を成すように観察対象物の輪郭を更新する分割規制手段、として機能させるようにしたことを特徴としている。第4の構成において、画像とは、輪郭識別プログラムがインストールされた装置に搭載されたカメラ、CCD等の画像情報検出部によって取得された画像に限らず、他の装置の画像情報検出部で取得された画像を含む。本発明において、画像は白黒画像,カラー画像,透過光画像,反射画像,蛍光観察によって取得された画像等を含み、これらの少なくとも一つの画像を利用して観察対象物の輪郭の識別が行われる。【発明の効果】【0022】本発明によれば、観察対象物が他の細胞や泡などの非観察対象物に衝突した場合でも観察対象物の輪郭を明確に識別することができる。観察対象物である細胞の輪郭をトポロジカル的に捉えて常に一つに周縁として認識することができる。よって、観察対象物である細胞のXY座標の重心位置を正確に計算により求めることができる。したがって、観察対象物である細胞の重心が顕微鏡視野の中心に来るように、ステージの位置を調整することができる。このように、観察対象物で細胞を顕微鏡視野の中央に位置させることができるので、細胞が顕微鏡視野から外れることなく、蛍光観察を長時間に亘って行うことができる。輪郭近辺の回折やぼけを用いたZ座標の位置計算の精度も向上することができる。【図面の簡単な説明】【0023】【図1】本発明の実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す模式図である。【図2】本発明の実施形態に制御部のブロック図である。【図3】本発明の実施形態に係るレベルセット関数を示す図である。【図4】図3のレベルセット関数をゼロ等位面で切った切り口を示す図である。【図5】本発明の実施形態に係るエネルギー関数を示す図である。【図6】(A)~(D)は、観察対象物と輪郭との関係を模式的に示す図である。【図7】(A)及び(B)は本発明の実施形態に係る輪郭識別手段の変位補正を説明するための図である。【図8】(A)~(C)は本発明の実施形態に係る輪郭識別手段の特異点判定を説明するための図である。【図9】画素間の近傍関係を説明するための図である。【図10】本発明の実施形態に係る制御部のフローチャートである。【図11】本発明の実施形態に係る回路構成を示す図である。【図12】本発明の実施例に係る水槽の模式図である。【図13】(A),(C),(E)は手法4の実験結果、(B),(D),(F)は手法3の実験結果を示す像である。【図14】(A)は手法4の実験結果、(B)は手法5の実験結果を示す像である。【発明を実施するための最良の形態】【0024】以下、この発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。各図において同一又は対応する部材には同一符号を用いる。【0025】図1は本発明の実施形態に係る顕微鏡装置1の構成を示す模式図である。【0026】本実施形態に係る顕微鏡装置1は、観察対象物2を載置し、観察対象物2の位置を自由に移動し得るステージ3と、光学系10と、ステージ3の位置等を制御する制御部20と、を備えている。17と、を有している。観察対象物2は、例えば、生体試料である細胞等であってよい。【0028】ステージ3には観察対象物2が載置され、後述する制御部20により観察対象物2の位置が制御される。このステージ3は、所謂電動ステージであり、観察対象物2の載置される二次元の平面(X-Y平面)で駆動制御されるXYステージでも、又は三次元で駆動制御されるXYZステージであってもよい。三次元の駆動は、ロボットアーム型のマニュピレータで行ってもよい(特許文献1,2参照)。【0029】ここで、観察領域のXY軸方向に関する位置制御は、照明用光源4や励起用光源5の照射位置、図示されていないピンホールの配置される位置を制御してなされてもよい。観察領域のZ軸方向に関する位置制御は、対物レンズ,結像レンズ,ピンホールの配置される位置を制御してなされてもよい(特許文献1,2参照)。)である場合、照明用光源4は、観察対象物2が吸収する波長又は反射する波長を含む光を発するものであれば何でもよい。このような透過用光源4としては、ハロゲンランプ等の各種ランプ、発光ダイオード、各種レーザを使用することができる。透過光Tが励起光5Aや蛍光Fと干渉しないように、透過光用光源から出力される光のうち励起光5Aや蛍光Fと同じ波長帯は光学フィルタ8等でカットされることが望ましい。照明用光源4から観察対象物2へ照射された照明光が、観察対象物2からの透過光Tや反射光となって画像情報検出部16で検出される。観察対象物2からの画像は、所謂明視野像や暗視野像等の画像情報である。【0031】励起用光源5は、観察対象物2それ自体又は観察対象物2に含有させた蛍光体を励起できる光源であれば何でもよい。このような励起用光源5としては、キセノンランプ、水銀ランプ等のランプ、アルゴンレーザ等の各種レーザを励起光5Aとすることができる。励起光5Aを、透過光Tや蛍光Fと干渉させないためには、不必要な波長帯を光学フィルタ9等でカットすることが望ましい。励起用光源5は、図示しない投光管を介して観察対象物2に導入されてもよい。【0032】鏡筒部15は、照明用光源4の光によって観察対象物2で生じた光、励起光5A及び蛍光Fを通過させる光路を形成するために、第1及び第2のビームスプリッター18,19、対物レンズ6及び結像レンズ7,12からなる光学部品を含んで構成されている。図示の場合には、倒立型の顕微鏡装置の一例を示している。正立型の顕微鏡装置を用いることも可能である。ここで、照明用光源4の光によって観察対象物2で生じた光は、透過光Tではなく反射光であってもよい。【0033】第1及び第2のビームスプリッター18,19は、鏡筒部15に設けた図示しないポートに配置されてもよい。ビームスプリッター18,19は、透過用光源4の波長と観察対象物2から発生する蛍光Fの波長とを分離できるダイクロイックミラーなどを使用することができる。以下の説明においては、ビームスプリッター18,19をダイクロイックミラーとして説明する。2からの透過光Tは、励起光5Aの波長よりも長波長の光を用いることにより、第1のダイクロイックミラー18を透過する。【0035】第2のダイクロイックミラー19は、第1のダイクロイックミラー18の下方に配置されている。第1のダイクロイックミラー18を透過した観察対象物2からの透過光Tは、第2のダイクロイックミラー19と結像レンズ7を通過し、鏡筒部15から画像情報検出部16へ出射される。ダイクロイックミラーと画像情報検出部16との間に図示しないフィルタを配置しておくことにより、透過光Tが励起光5Aや蛍光Fと干渉せず、画像情報検出部16へ入射させてもよい。17へ入射させてもよい。【0037】画像情報検出部16は、照明用光源4からの光が観察対象物2からの透過光Tや反射光による画像情報を取得できる検知器を備えている。透過光Tの光軸で、かつ、透過光Tを検出する画像情報検出部16の直前には結像レンズ7が設けられている。検知器には、撮像素子を用いることができ、CCD型撮像素子やCMOS型撮像素子を使用できる。これらの撮像素子は、S/N比(信号対雑音比)を向上させるために雑音を減らすように、例えば液体窒素やペルチェ素子を使用した冷却装置で冷却してもよい。検知器は、画像処理を行う計算機を備えていてもよい。目視観察用として接眼レンズを備えていてもよい。17は、観察対象物2である細胞からの蛍光画像を取得できる検知器を備えている。この検知器は、目的に応じて銀塩カメラや撮像素子を用いることができる。撮像素子には、画像情報検出部16と同様に、CCD型撮像素子やCMOS型撮像素子を使用できる。これらの撮像素子は、S/N比(信号対雑音比)を向上させるために雑音を減らすように、液体窒素やペルチェ素子を使用した冷却装置で冷却してもよい。17の直前に結像レンズ12を設けてもよい。目視観察用として接眼レンズを備えていてもよい。17用の結像レンズ12は異なるレンズでもよい。17用の結像レンズ12の倍率を上げるようにしてもよい。17では、観察対象物2のより拡大した蛍光画像を得ることができる。【0040】図1においては、説明のために透過光Tの光路や励起光5A及び蛍光Fの光路を重ならないように示しているが、これらの各光路は一致させてもよい。17との間で、視野中心位置及び焦点位置のズレが生じる場合がある。この場合、予めそれらのズレを測定し、観察対象物2の位置制御及び観察領域制御におけるオフセットとして利用してもよい。オフセットを掛けることによって、視野中心位置や焦点位置のズレを補正することができる。【0041】制御部20は、観察対象物2の透過光Tや反射光による画像情報が、画像情報検出部16を介して入力される。制御部20は、画像情報の処理と、画像情報の処理結果に基づいたステージ3の制御とを行う。制御部20は電子計算機から構成されている。このような電子計算機としては、詳細は後述するようにコンピュータを用いることができる。【0042】制御部20は、光学系10により観察対象物2を透過した透過光Tの画像情報が入力され、この画像情報によりステージ3上の観察対象物2の位置を制御する。【0043】図2は本発明の実施形態に係る制御部20の機能ブロック図である。制御部20は、位置制御手段21と、輪郭識別手段22と、衝突判定手段23と、訂正手段24と、分割判定手段25と、分割規制手段26と、を備えている。位置制御手段21は、ステージ3の位置を制御するものである。この位置制御手段21は、画像情報検出部16から観察対象物2の透過光の画像を取得し、当該画像情報から観察対象物2の輪郭を後述の輪郭識別手段22から取得する。位置制御手段21は、観察対象物2の重心が視野中心に移動するように、ステージ3のモーター回転角の目標値を定め、このモーターをフィードバック制御する。ステージ3にはXYZステージを使用することができる。何れか、またはこれらの組み合わせによる制御手法を用いることができる。【0045】観察対象物2(以下、細胞と言う場合がある。)の軌跡を再構成、つまり、再現するためには、上記のXYZステージ3の変位情報をコンピュータに記録しておく。これにより観察対象物2の軌跡を得ることができる。【0046】透過光Tを使用するのは、追跡対象となる観察対象物2の全体像を高輝度で安定して写すためである。透過光T以外には、落斜照明を用いた観察対象物2からの反射光を用いることもできる。反射光の光源は、透過光用光源4と同様の光源を用いることができる。この場合、観察対象物2からの画像は反射光画像である。輪郭識別手段22は、画像情報検出部16からの画像に基づいて観察対象物2の輪郭を識別すると共に、画像情報検出部16から所定時間ごとに送られてくる画像に基づいて当該観察対象物2の輪郭を更新するものである。【0047】輪郭識別手段22では、前述の手法1としてのセルフウィンドウ法では顕微鏡視野における背景と観察対象物2の輝度値がはっきりと分かれていない顕微鏡画像に対して有効に機能しない場合があったため、前述の第2の手法を利用する。境界認識するための画像処理用のプログラムに領域依存レベルセット法(LSM)を利用する。LSMでは、図3に示すように、3次元のレベルセット関数φ(x,y,t)のゼロ等位面SAで、2次元の輪郭C(x,y,t)を表現する(式1)。以下、レベルセット関数φを関数φと言う場合があり、輪郭C(x,y,t)を輪郭Cと言う場合がある。(x,y)は画像上の各ピクセルを示す。【0049】図4は、レベルセット関数φ(x,y,t)をゼロ等位面SAで切った切り口、即ち輪郭Cと画像情報検出部16から入力された画像情報を概略的に重ねた図である。【0050】輪郭Cの内側と外側の領域は、それぞれ、ΩとΩ*で定義する。図4に示すように、画像情報検出部16から取得した画像に観察対象物2の細胞があり、輪郭Cの内側に細胞があることを仮定して説明する。図4においてBは観察対象物2と背景との境界である。関数φによる輪郭Cを境界Bと一致させることで、制御部20は観察対象物2の境界Bを認識することができる。具体的には、制御部20は、レベルセット関数φに適当な初期値を与え、エネルギー関数Eを最小にするように、関数φを更新する(式3)ことで、境界B、即ち細胞の正確な輪郭を識別できる。図5はエネルギー関数Eを示している。横軸は観察対象物2に沿った輪郭Cである。このエネルギー関数Eは、輪郭Cの観察対象物2への沿い具合を示す指標であり、輪郭Cが観察対象物2に完全に沿ったとき極小となる。Einは輪郭Cの内部エネルギー関数であり(式5)、Eoutは輪郭Cの外部エネルギー関数である(式6)。式5、式6の積分区間は画像全体である。式5,式6における係数のα、βは、それぞれEinとEoutの重みパラメータを示す。【0057】式6において、λ1F1(φ)が境界Cの内側を積分した成分であり、λ2F2(φ)が境界Cの外側を積分した成分である。【0058】式5、式6中のIは、画像中の座標(x,y)の輝度値I(x,y)を示す。IinとIoutとはそれぞれ、領域Ωと領域Ω*における輝度値の面積平均を示す(式7)。式5、式6におけるλ1とλ2とは領域Ωと領域Ω*を基準とした輪郭Cの適合度を示す。式5、式6のH(φ)はヘビサイド関数を示す(式8)。上記式(8)のヘビサイド関数を利用すると、1次元のデルタ関数は次のように表すことができる(式9)。関数φの空間変化が小さければ、式4における内部エネルギー関数Einは小さくなる。内部エネルギー関数Einは輪郭Cを含んだ関数φの形状を滑らかにする機能、即ちスムーザーの機能を有する。【0062】輪郭Cが対象の境界B(図4参照)と一致している場合、外部エネルギー関数Eoutは最小値となる。外部エネルギー関数Eout=0を取る。外部エネルギー関数Eoutは、境界Bを認識する機能、即ちディテクターの機能を有する。【0063】図6(A)~図6(D)は観察対象物2と輪郭Cとの関係を模式的に示す図である。ここで、観察対象物2と背景BGとの境界Bを境に、境界B内の観察対象物2である細胞の輝度は一定であり、且つ、境界B外の背景BGの輝度は一定であると仮定する。外部エネルギー関数Eoutはこの仮定を前提として計算される。【0064】図6(A)は輪郭Cが境界Bの外側にある場合を示しており、この場合、F1(φ)>0であり、F2(φ)≒0となる。よって、この場合、輪郭Cは境界Bと一致しないと判断される。【0065】図6(B)は輪郭Cが境界Bの内側にある場合を示しており、この場合、F1(φ)≒0であり、F2(φ)>0となる。よって、この場合、輪郭Cは境界Bと一致しないと判断される。【0066】図6(C)は輪郭Cが観察対象物2の境界Bの外側と内側とに跨っている場合を示しており、この場合、F1(φ)>0であり、F2(φ)>0となる。よって、この場合、輪郭Cは境界Bと一致しないと判断される。【0067】図6(D)は輪郭Cが観察対象物2の境界Bと一致している場合を示しており、この場合、F1(φ)≒0であり、F2(φ)≒0となる。よって、この場合、外部エネルギー関数Eoutは最小値となるため、境界Bが検出されたことになる。【0068】これらの機能を持つ式3のエネルギー関数E(φ)は輪郭Cを滑らかにすると同時に、観察対象物2の境界Bへ輪郭Cを初期値から移動させる。この式3は、式4~式6をオイラー・ラグランジェ方程式に対して最急降下法を用いて解くと、下記の式10として表すことができる。この式10に下記の式11、即ち前述の式9の近似式を用いて、式10を近似できる。式10は、式11を用いると共に、離散化することにより、式12として表すことができる。φm,n(xi,yj)は座標(xi,yj)におけるφm,nの値を示す。【0072】連続する2つのイタレーション間で関数φの値の差が閾値φthよりも小さくなれば、つまりΣiΣj|φm,n(xi,yj)-φm,n-1(xi,yj)|<φthであれば、式12が収束したと判定する。【0073】このように、輪郭識別手段22は、従来の手法2を利用することで、背景BGと観察対象物2との境界Bがはっきりと区別できない場合でも境界Bを認識することができる。上記の手法2ではエネルギー関数に基づいて細胞の境界Bを認識することができるが、例えば非追跡細胞が視野中に侵入するだけで、非追跡細胞も追跡細胞だと誤認識してしまう場合がある。このような侵入問題を解決するために、本発明の実施形態に係る輪郭識別手段22では、前述の手法3を利用している。【0074】前述の手法2における内部エネルギー関数Einと外部エネルギー関数Eoutとして次のものを利用する。式13におけるQは、Q=|S-S0|=|∫H(φ)dxdy-S0|(>0)である。【0077】また、式13におけるαとγ、式14におけるβは重みパラメータである。【0078】Sは領域Ω内の面積であり、S0は第一フレームで計算した輪郭Cで画される面積、若しくは予め測定しておいた単一細胞の面積の集団平均値を示す。【0079】Qは実際に得られたSとS0の差であり、Qが小さくなれば内部エネルギー関数Einは小さくなる。Qは、輪郭Cに依存する領域Ω内の面積を、単一細胞の平均値にする機能を持つ。【0080】式4,式13及び式14をオイラー・ラグランジェ方程式に対して最急降下法を用いることで、式3を下記のように表すことができる。離散化することにより、式15は下記の式16のように表すことができる。式16においてsign(Q)は以下の通りである。連続する2つのイタレーション間でφの差が閾値φthよりも小さくなれば、つまりΣΣ|φm,n(xi,yj)-φm,n-1(xi,yj)|<φthであれば、式16が収束したと判定する。【0084】このようにして、本発明の実施形態に係る輪郭識別手段22によれば、一つの観察対象物2である単一細胞の境界Bを認識することができる。【0085】以上の構成は、従来の技術と同一乃至同等であり、本発明に実施形態に係る顕微鏡装置1では制御部20は、以下の『細胞の境界認識プログラム』として手法4及び手法5を備えていることに特徴がある。上記手法2及び手法3によれば、単一の細胞の境界Bを認識することができるが、例えば二つの細胞が衝突した場合に観察対象物2の細胞の輪郭Cを正確に認識できない、即ち衝突した他の細胞内まで含んで輪郭Cを認識してしまう場合がある。このような問題を解決するための手法4について説明する。【0086】この衝突問題を解決するために、本発明の実施形態では観察対象物2の輪郭Cの訂正(以下、変位補正と言う場合がある。)を行うことを特徴とする。変位補正とは、観察対象物2、即ち観察対象の細胞が他の細胞と衝突した場合に、観察対象物2の輪郭、具体的には背景等との境界Bが歪むが、その歪みを訂正することを意味する。【0087】このため、本発明の実施形態に係る制御部20では、図2に示すように、衝突判定手段23と、訂正手段24とを備えている。【0088】衝突判定手段23は、観察対象物2が非観察対象物と衝突したか否かを判別するものである。【0089】訂正手段24は、衝突判定手段23で観察対象物2が非観察対象物に衝突したと判定された場合に輪郭識別手段22で更新された観察対象物2の輪郭Cを訂正するものである。衝突判定手段23は、以下の衝突判定を行う。【0090】衝突判定は、式16に従い収束した関数φm,nが|S-S1|>Sthを満たしていたら、衝突が起こったと判定する。Sは領域Ω内の観察対象物2の面積であり、S1は第一フレームで収束したSである。Sthは衝突判定の閾値である。この処理で衝突を検出できる理由は、衝突が起こったときに、領域Ωが異物を含んで面積Sが増加するからである。【0091】このように衝突が検出できた場合に、変位補正を行う。訂正手段24は、以下の変位補正を行う。【0092】訂正手段24は、非観察対象物に衝突した時の観察対象物2の輪郭を、衝突前の観察対象物2の輪郭に訂正する。訂正手段24は、収束した関数φm,lastとその輪郭Cm,lastとを衝突前のフレームのものに置き換える。hフレーム前で収束した関数φm-h,last及びその輪郭Cm-h,lastを利用する。【0093】訂正手段24は、衝突前の観察対象物2の輪郭の重心を非観察対象物に衝突した時の観察対象物2の重心に重なるように、衝突した時の観察対象物2の輪郭を衝突前の当該観察対象物2の輪郭に訂正する。ここで、衝突した段階での、フレーム番号をmとして、利用するhフレーム前のフレーム番号を(m-h)とすると、訂正手段24は、輪郭Cm-h,lastの重心位置から衝突した段階での輪郭Cm,lastの重心位置まで当該輪郭Cm-h,lastを平行移動させ、それを衝突した段階での輪郭Cとみなし、関数φm-h,lastを衝突した段階での関数φとみなす。このように本実施形態では、観察対象物2が非観察対象物と衝突した場合には、例外処理として、衝突した段階で算出された関数φm,lastとその輪郭Cm,lastは利用しないことを特徴としている。【0094】図7(A)は、二つの細胞が衝突した状態を示しており、この図において左側の細胞が観察対象物2である。この観察対象物2である細胞に関し、顕微鏡装置1では、現在、破線で示すように、輪郭Cm,lastを認識している。この輪郭Cm,lastは、図に示すように、上部が衝突した他の細胞2*までに及んでいる。そこで、本実施形態では、hフレーム前に検出した輪郭Cm-h,lastを利用する。図においてhフレーム前の輪郭Cm-h,lastを実線で示している。本実施形態の訂正手段24は、図7(A)に示すhフレーム前の輪郭Cm-h,lastを、図7(A)に示す輪郭Cm-h,lastの重心の位置から現在検出している図7(A)の輪郭Cm,lastの重心の位置へ、図7(B)に示すように移動させる。このようにして、輪郭Cm,lastを訂正する。このときに、輪郭Cm,lastを数ピクセル小さくしてもよい。【0095】本発明の実施形態に係る輪郭識別手段22では、手法3のプログラムを実行することで、観察対象物2が非観察対象部2*に衝突した場合でも、観察対象物2の輪郭Cを正確に識別することができる。上記手法4によれば、細胞同士が衝突した場合でも単一の細胞の境界を正確に認識することができるが、例えば二つの細胞が衝突した後に分離した場合に二つの細胞のそれぞれの部分を纏めて一つの細胞として認識してしまう場合がある。このような問題、即ち分裂問題を解決するために、本発明の実施形態に係る制御部20は、「単一細胞の境界プログラム」として手法5を利用する。【0096】この分裂問題を解決するために、本発明の実施形態に係る輪郭識別手段22では、観察対象物2、即ち細胞における輪郭Cの個数は1個であることを前提として、計算処理(画像処理)によって本来一つの輪郭Cが例えば二つに分かれようとする場合にはそのような輪郭数への変更を規制し、輪郭数を二つに変更せずに本来の一つである状態を維持する。【0097】具体的には、本実施形態では、画像上の各座標、即ち各ピクセルの所定時間経過後における関数φの値における符号の変化をチェックし、符号が変わった場合にその点について、輪郭Cを二分することになる特異点であるかを判定する。当該チェックした点が特異点であった場合、計算処理をそのまま進めてしまうと、輪郭Cが二つになってしまい、本来一つの細胞に関して一つの輪郭Cしか存在しないとの前提条件を崩してしまうので、このように輪郭Cを二つにする特異点が発生した場合には、当該特異点における関数φの値の変更を許可せず、例えば値の更新を行わなかったり、更新の程度を変更したり、或いは数フレーム前に計算した値を利用することを特徴としている。【0098】このため、本発明の実施形態に係る制御部20は、図2に示すように、分割判定手段25と、分割規制手段26と、を備えている。【0099】分割判定手段25は、観察対象物2の輪郭Cを更新する場合に観察対象物2の輪郭Cが複数に分割されるか判定するものである。【0100】分割規制手段26は、分割判定手段25で観察対象物2の輪郭Cが複数に分割されると判定される場合に、当該観察対象物2の輪郭Cが複数に分かれることを規制する。26は、輪郭識別手段22による輪郭Cの更新に代えて、一つの輪郭Cを成すように、即ち一つの輪郭を維持するように観察対象物2の輪郭Cを更新するものである。【0101】このように、本実施形態では、特異点の補正を行うことを特徴とする。【0102】なお、特異点とは輪郭Cを二つに分ける画像上のある点であり、特異点補正とは特異点の更新を行うと輪郭Cが二つになるので、二つの輪郭Cの発生を規制するために、特異点における値の更新を行わず、前の値をそのまま利用するか、更新の程度を変更するか、或いは、数フレーム前における値を利用するように、特異点における値を訂正することを意味する。