配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。請求項1記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。配列番号1に示すヌクレオチド配列からなる、請求項2記載のポリヌクレオチド。請求項2又は3記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。開花植物はスイートピーである請求項9記載の製造方法。odoratus)のフラボノイド生合成経路における色素前駆物質のB環の水酸基をメチル化する酵素に関する。odoratus)はマメ科に属し、地中海のシシリー島からクレタ島を原産とする一年性の草本である。本種は、つる性植物で高さが1~2mに立ち上がり、花は3~5cmの幅で、園芸品種の花色は豊富である。【0003】例えば、花色発現にかかわる花色遺伝について、複対立遺伝子が関与しているとの報告がある(特許文献1)。具体的に特許文献1は、「スイートピー(マメ科)花弁色素の分析を行い、各品種系統の花弁色素遺伝子型を調べた。その結果、各品種系統の花弁色素遺伝子型を明らかにした。Dpnの色素表現型にはメチル化アントシアニジンであるマルヴィジン(malvidin、Mv)とペチュニジン(petunidin、Pt)を含み、これらは、いずれもDpnを生成する色素遺伝子型に包含される。Cynの色素表現型にはメチル化アントシアニジンであるペオニジン(peonidin、Pn)を含み、Cynを生成する色素遺伝子型に包含した」と記載している。【0004】一方、植物のO-メチル化変換酵素(OMT)はリグニンや種々の二次代謝物質をメチル化する重要な酵素である。OMTは、受容分子中の水酸基をS-アデノシル-メチオニンを介してメチル基への変換を触媒する酵素であり、結果として、メチルエーテル誘導体を生じさせる。スイートピーの花色発現に関わるフラボノイド、特に、アントシアニジンについて、その花弁には、ペオニジン、ペチュニジン、マルヴィジンなどのメチル化アントシアニジンが含まれていることが知られているが(非特許文献1)、スイートピーのOMTをコードする遺伝子については報告されていない。【0005】これまで、アントシアニン生合成経路においてアントシアニジンのメチル化に関与する酵素の遺伝子として、ネコメソウのF3&apos;,5&apos;MT遺伝子(非特許文献2)、ニチニチソウのF3&apos;,5&apos;MT遺伝子(非特許文献3)、シクラメンのF3&apos;,5&apos;MT遺伝子(特許文献2)などが知られている。【0006】特許文献3には「茶葉から抽出した茶カテキン類抽出液に、上記茶カテキンメチル化酵素を作用させて、茶カテキン類抽出液中の茶カテキン類を茶メチル化カテキン類に変換させることにより、茶メチル化カテキン類を高濃度で含有する茶メチル化カテキン類含有組成物を、効率よく、安価に製造することが可能となる」という記載がある。植物の具体例としては、茶葉等が挙げられ、また動物の具体例としては、ラット肝細胞等が挙げられ、さらに微生物の具体例としては、ストレプトコッカス・グリセウス等を挙げることができる。p.127-137【発明の概要】【発明が解決しようとする課題】【0009】上記の通り、スイートピーの花弁色素が花弁色素遺伝子型で制御されていること、及びスイートピーの花弁にペオニジン、ペチュニジン、マルヴィジンなどのメチル化アントシアニジンが含まれていることが知られているが、スイートピーのO-メチル化変換酵素をコードする遺伝子については報告されていない。【0010】そこで本発明は、スイートピーの花色発現に関与するO-メチル化変換酵素、及び該酵素を利用する方法を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】【0011】本発明者らは、上記課題を解決すべく、既存の植物で既に知られているO-メチル化変換酵素の配列情報から、比較的保存性の高い領域を特定し、該領域を基にスイートピーの全長O-メチル化変換酵素の特定を試みた。その過程で、イポメア及びメディカルゴのO-メチル化変換酵素遺伝子と類似性を有する1種のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、各種メチル化フラボノイドの生成を触媒する活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。【0012】すなわち本発明は以下の特徴を包含する。以下の(a)~(d)いずれか記載のポリペプチド。上記(1)記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。配列番号1に示すヌクレオチド配列からなる、上記(2)記載のポリヌクレオチド。上記(2)又は(3)記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。上記(5)記載の形質転換宿主細胞を、前記組換えベクターにコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養すること、及び該ポリペプチドを回収することを含む、上記(1)記載のポリペプチドの製造方法。非メチル化フラボノイドを含む溶液を、上記(1)記載のポリペプチドを用いて酵素処理することを含む、メチル化フラボノイドの製造方法。非メチル化フラボノイドを含む溶液は、茶、リンゴ、ブルーベリー、ブドウ、カキ又はイチゴ由来の抽出物である、上記(7)記載の製造方法。上記(2)又は(3)記載のポリヌクレオチドを開花植物の細胞若しくは組織培養物に導入することを含む、変異体植物の製造方法。開花植物はスイートピーである上記(9)記載の製造方法。【発明の効果】【0015】本発明によれば、スイートピーの花色発現に関与するO-メチル化変換酵素が提供される。【0016】本発明の酵素は、アントシアニジンやカテキンを含む、各種フラボノイドのメチル化形態の生成を触媒することができるため、新花色を有するスイートピーの育種や、メチル化フラボノイドの製造に有用である。【図面の簡単な説明】【0017】【図1】図1は、A:Dp(デルフィニジン)、Cy(シアニジン)、My(ミリセチン)、Qu(クエルセチン)及びKa(ケンフェロール)、並びにB:エピカテキン(ECG)及びエピガロカテキンガレート(EGCG)を基質として酵素反応を行い、メチル化体の生成を確認した図を示す。【図2】図2は、スイートピー赤色花弁の各開花ステージ(上図)に測定した、Cy(シアニジン)及びPn(ペオニジン)の含量を示す(下図)。【図3】図3は、スイートピー紫色花弁の各開花ステージ(上図)に測定した、Dp(デルフィニジン)、Pt(ペチュニジン)及びMv(マルヴィジン)の含量を示す(下図)。【図4】図4は、ステージ4、6、8、10の(a)赤色花弁、(b)紫色花弁のOMTの発現を示す図である。【発明を実施するための形態】【0018】本発明は、スイートピー由来のメチル化変換酵素(以下、OMTポリペプチドとも称する)とその利用方法に関する。【0019】スイートピーOMT遺伝子(以下、OMTポリヌクレオチドとも称する)のヌクレオチド配列の一例を配列番号1に示し、配列番号1に示すヌクレオチド配列によってコードされるOMTポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号2に示す。しくは挿入を含みかつフラボノイドのメチル化を触媒する活性を有するポリペプチド、又は配列番号2に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性、好ましくは80%以上の相同性、より好ましくは90%以上の相同性、最も好ましくは95%以上の相同性を有するポリペプチドからなりかつフラボノイドのメチル化を触媒する活性を有するポリペプチド(以下、これらを「変異型ポリペプチド」と称する)であってもよい。挿入するアミノ酸は、例えば1~20個、好ましくは1~10個、より好ましくは1~5個とすることができる。相同性の値は、複数のアミノ酸配列間の相同性を演算するソフトウェア(例えば、FASTA、DANASYS、BLAST)を用いてデフォルトの設定で算出した値を意味する。【0020】またOMTポリヌクレオチドとしては、配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイドのメチル化を触媒する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(以下、変異型ポリヌクレオチドとも称する)も含まれる。変異型ポリヌクレオチドは、配列番号2に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、フラボノイドのメチル化を触媒する活性を有する変異型ポリペプチドをコードすることとなる。【0021】ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件下としては、例えば70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の配列相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。1989を参照することにより当業者には自明である。【0022】上述した変異型ポリペプチドがメチル化フラボノイドの生成を触媒する活性を有するか否かは、非メチル化フラボノイドを基質として該変異型ポリペプチドを作用させ、メチル化フラボノイドの生成の有無を検出することによって行うことができる。基質として使用することができる非メチル化フラボノイドとしては、これに限定されるものではないが、アントシアニジン(例えばペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン)、クエルセチン、及びその配糖体、並びに、ミリセチン、カテキン(例えばエピカテキン(ECG)、エピガロカテキンガレート(EGCG))などのポリフェノールを用いることができる。具体的に、変異型ポリペプチドがメチル化フラボノイドの生成を触媒する活性を有するか否かは、次のようにして試験することができる。USA)、10mM基質(10μl)及び変異型ポリペプチドを含む溶液(10μl)を加えて全量50μlの反応液とする。2:1)を50μl加え、強く撹拌して反応を停止させる。その後、遠心分離(10,000g、3分間)行い、上層部(50μl)を新しいチューブに移し替え、高速液体クロマトグラフィーにて色素を同定することで、上記活性の有無を評価することができる。【0023】本発明のOMTポリヌクレオチドは、配列番号1に示すヌクレオチド配列情報に基づいて、該配列を特異的に増幅することができるプライマーセットを設計し、スイートピーの花弁から抽出した総DNAを鋳型としてPCR増幅を行うことによって、クローニングすることができる。Lett.,第22巻,p1859~1862参照)などの方法により、直接的に合成することができる。市販の自動DNA合成装置を使用することによって合成してもよい。【0025】本発明のOMTポリペプチドは、上記のようにしてクローニングしたOMTポリヌクレオチドを利用して、定法に従って製造することができる。本発明のOMTポリペプチドは、OMTポリヌクレオチドを適当な宿主細胞内で発現させ、培養物からOMTポリペプチドを回収することにより製造することができる。(例えばカイコガ培養細胞)、動物細胞細胞(例えばマウス培養細胞)、植物培養細胞(例えばタバコ培養細胞)などの真核細胞を挙げることができる。発現調節配列が機能する条件下で培養し、その培養物から本発明のOMTポリペプチドを回収することができる。【0028】本発明で使用できるベクターとしては、プラスミドベクター、Tiプラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、YACベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。これらベクターは、その後の形質転換に使用する宿主細胞のタイプに応じて、該宿主細胞中でのOMTポリペプチドの発現を調節・補助する追加の配列を含むことができる。そのような配列としては、これに限定されるものではないが、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、SD配列などを挙げることができる。選別するための選択マーカー(例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など)を含むことができる。【0029】上記発現構築物による宿主細胞の形質転換は、当業者に慣用の手法、例えばプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法を用いて行うことができる。ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。よって、その活性を保持するかたちでOMTポリペプチドを得ることができる。【0031】あるいは、本発明のOMTポリペプチドは、無細胞発現系、すなわち上記発現構築物を試験管内で用いて製造することもできる。本発明で使用できる無細胞発現系としてはセルフリーサイエンス社のWEPRO(登録商標)シリーズなどが挙げられる。【0032】本発明のOMTポリペプチドは、メチル化形態のフラボノイド、例えばメチル化ポリフェノールの一種であるメチル化ミリセチン、メチル化カテキン((-)-epigallocatechin3-O-gallate、(-)-epicatechin3-O-gallateなど)の生成を触媒する活性を有するものである(図1参照)。【0033】したがって、本発明のOMTポリペプチドは、メチル化フラボノイドの製造に使用することができる。【0034】本発明のメチル化フラボノイドの製造方法は、非メチル化フラボノイドを含有する溶液を、本発明のOMTポリペプチドを用いて酵素処理することを含んでいる。【0035】上記方法に供する溶液は、非メチル化フラボノイドを含有する溶液であれば特に制限されず、天然物からの抽出物であってもよいし、調製した溶液であってもよい。メチル化フラボノイドの中で、メチル化カテキンは、近年、抗アレルギー作用を有する化合物として注目されており、機能性食品や医薬品などの有効成分として有用な化合物であると考えられている。したがって、好ましくは、非メチル化フラボノイドを含有する溶液は非メチル化カテキンを含有する溶液である。カテキンを含有する溶液としては、これに限定されるものではないが、茶、リンゴ、ブルーベリー、ブドウ、カキ、イチゴ由来抽出物等を挙げることができる。【0036】また使用するOMTポリペプチドの形態は特に制限されず、精製ポリペプチドの他、粗製ポリペプチド(例えば該ポリペプチドを発現する宿主細胞からの抽出物など)を用いることができ、またOMTポリペプチドを発現する宿主細胞を用いてもよい。粗製酵素を使用する場合には、本発明のOMTポリペプチドの酵素活性を阻害する因子を含まないようにする点に留意する。【0037】また本発明において、上記ポリペプチドは担体に固定化して使用することができる。)、架橋法及び包括法等の当業者に周知の方法が含まれる。ガラス、金属酸化物などの無機物質などを担体として使用できる。架橋法は官能基を2個以上もった試薬と酵素とを反応させて、酵素間で架橋化を行うことで固定化する方法であり、架橋試薬として、グルタルアルデヒド、イソシアン酸誘導体、N,N-エチレンビスマレイミド、ビスジアゾベンジシン、N,N-ポリメチレンビスヨードアセトアミドなどが使用できる。包括法は天然高分子や合成高分子のゲルマトリックスの中に酵素を閉じ込める格子型等を含み、その際に用いる高分子化合物として、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂、デンプン、コンニャク粉、ゼラチン、アルギン酸、カラギーナンなどが含まれる。【0038】酵素反応の条件は特に制限されないが、例えばフラボノイド基質10mM当たり、本発明のOMTポリペプチドを1~10ユニット使用し、5~30分間反応を行えばよい。反応温度及びpHは、本発明のOMTポリペプチドの至適温度及び至適pH近位の値を採用するものとし、具体的には25~30°Cの温度、pH6.5~8.5の条件を用いればよい。シアニジン(10μl)及びポリペプチド溶液(10μl)を加えて全量を50μlからなる反応液において、1分間に1mMモルのペオニジンを生成する量を1ユニットと定義する。【0039】また本発明のOMTポリペプチドは、メチル化形態のフラボノイド、例えばスイートピーの花色に関与するメチル化アントシアニジン(ペチュニジン、マルヴィジン、ペオニジンなど)、イソラムネチン、メチル化クエルセチン、を生成する活性を有するものである(図1参照)。【0040】したがって本発明のOMTポリヌクレオチドは、変異体植物の製造に使用することができる。本発明でいう「変異体植物」とは、外的に導入したOMTポリヌクレオチドの発現の結果、野生型とは異なる花色を有している開花植物である。本発明で変異体植物の製造対象となる開花植物は、花色発現にフラボノイドのメチル化が関与している植物であれば特に制限されない。本発明において、変異体植物の製造対象となる開花植物は、好ましくはスイートピーである。【0041】具体的に、変異体植物の製造は、当業者に公知のトランスジェニック技術を用いて、本発明のOMTポリヌクレオチドを、必要に応じて該ポリヌクレオチドを含む植物発現用ベクターの形態で、開花植物の細胞若しくは組織培養物に導入することによって行うことができる。【0042】本発明に使用することができるトランスジェニック技術として、例えばアグロバクテリウム(Agrobacterium)を利用した形質転換を挙げることができる。簡潔に説明すると、植物感染性であるアグロバクテリウムからプラスミドを取り出し、該プラスミドのT-DNA遺伝子を本発明のOMTポリヌクレオチドで置換し、これをアグロバクテリウムに戻して植物組織の感染に利用する。その際、OMTポリヌクレオチドと共に当業者に公知の選択マーカー遺伝子を挿入することで、OMTポリヌクレオチドが導入されている植物を選択することができる。そのような選択マーカー遺伝子として、例えばカナマイシン、テトラサイクリン、リファンピシン、スペクチノマイシン、カルベニシリン、ゲンタマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子などを使用することができる。(1996)や米国特許第5,188,958号などに記載されている。【0043】本発明で使用することができる他のトランスジェニック技術として、これに限定されるものではないが、ウイルスベクターを介した形質転換、エレクトロポレーション及びパーティクルガンなどを挙げることができる。パーティクルガンを利用した形質転換の実例は、例えば米国特許第5,204,253号などに記載されている。【0044】本発明のOMTポリヌクレオチドで形質転換された細胞又は組織培養物は、その後、当業者に公知の技術によって植物体まで再生させることができる。植物体の再生は、当業者に公知の手法に従って行えばよい。【0045】以下、本発明の一例を実施例として詳細に説明するが、本発明はこの実施例のみに限定されるものではない。2005年12月に播種し、2006年春に開花した種子を採集した。採集した種子を2006年12月に再度播種し、2007年春に開花した自殖系統の各種花色を有する花弁を花色測定及び色素分析に供試した。赤色自殖系統で色素を主としてシアニジンとペオニジンを含む系統の種子を、2007年春に開花した自殖系統から採集した。紫色自殖系統で色素を主としてデルフィニジン、ペオニジン、マルヴィジンを含む系統の種子を、2007年春に開花した自殖系統から採集した。採集した種子を2007年12月に播種し、2008年春に開花させ、開花した花弁を花色測定及び色素分析に供試した。開花したスイートピーの花弁、つぼみ、葉を採集後、直ちに重量を測定し、そのまま液体窒素で凍結し、-80°Cで冷凍庫に保存し、用時冷凍庫から取り出して実験に使用した。全RNAは、RNeasyマキシキット(Qiagen)を用いて、比較的幼若なスイートピーの紫色系統の花弁から抽出した。ポリ(A)+RNAは、Oligotex-dT30<Super>(タカラバイオテック)のキットを用いて全RNAから精製し、mRNAを得た。cDNAは、GeneRacerキット(Invitrogen)を用いてmRNAから合成した。いずれも製品に添付されたプロトコールに従って実験を行った。プライマーD、5’-ACCATCGAGATCGGCGTNTTYCANGG-3’。具体的に、希釈された1μlを含むcDNAと、10pmolのA又はB及びC又はDのプライマーを各組み合わせで用いて反応させた。plus(TOYOBO)を含む反応溶液を94°Cで1分間インキュベートし、その後、熱変性後(94°Cで30秒間)、アニーリング(50°Cで30秒間)、伸長反応(68°Cで1分間)を1サイクルとし、35回のサイクルを繰り返した。SKプラズミドに挿入し、クローンを得た。DNAシークエンスサービスを利用して行った。GAGGAGAAGCCCGGTTCAATGCGCACGCC)を用いて、スイートピーOMTのコード領域の全長cDNAをPCRによって増幅した。(Promega)に組み込むことによりスイートピーOMTコード領域の全長cDNAのクローンを発現するベクターを得た。BL21(DE3)を、カナマイシン(50μg/ml)を含む2YT液体培地中、37°Cで一晩培養した後、引き続き、IPTG(400μM)を加え30°Cで6時間培養した。K-Pi緩衝液(pH7.0、500μl)に懸濁し、再び同条件で遠心分離した。)を用いて大腸菌細胞を溶解させた。細胞残片を遠心分離(12,000g、20分間、4°C)で除去し、粗たんぱく溶液を得た。得られた粗たんぱく溶液は、-20°Cで保存した。粗たんぱく溶液の酵素活性検定は以下の方法に従った。基質(10μl)及び粗たんぱく溶液(10μl)を加えて全量を50μlとした。溶液を30°Cで30分間反応させた。2:1)を50μl加え、強く撹拌して反応を停止した。遠心分離(10,000g、3分間)行い、上層部(50μl)を新しいチューブに移し替え、高速液体クロマトグラフィーにて色素を同定した。標準品として、メチル化フラボノイドのペオニジン、ペチュニジン、マルヴィジン、イソラムネチンを用いた。France)、並びにポリフェノールであるエピカテキン(ECG)、エピガロカテキンガレート(EGCG)を用いた。図1Aから明らかな通り、Dp(デルフィニジン)からPt(ペチュニジン)、Mv(マルヴィジン)が生成し、Cy(シアニジン)からPn(ペオニジン)が生成し、My(ミリセチン)からMt-My(メチル化ミリセチン)、Qu(クエルセチン)からIs(イソラムネチン)及びMt-Qu(メチル化クエルセチン)の生成が確認された。このように、スイートピーから得られた上記粗たんぱく(酵素)は、フラボノイド類をメチル化する機能を有することが立証された。当該粗たんぱくは、ECG、EGCGのようなポリフェノールと反応させた結果、図1Bに示したようにメチル化ポリフェノールを含むいくつかのピークが観察されたため、メチル化を含む様々な活性を持っている可能性が示された。花器から花弁のみを切除し、重量を測定後、液体窒素により凍結した。凍結花弁を粉砕機で粉状に粉砕した。各サンプルの花弁フラボノイドを1%塩酸-メタノール溶液(v/w)で抽出し、これを3回繰り返した。抽出液をまとめ、遠心分離して上澄み液を分取した。全てのサンプル溶液を0.16g/mlの濃度に調整した。Japan)でろ過後、各サンプル溶液を高速液体クロマトグラフィー(20μl、HPLC)で定量分析した。装置と分析条件は以下のとおりである。