この酵素の触媒作用により分子状酸素の一原子は水に還元され残り一原子は基質である有機化合物に添加(水酸化)される。この時二電子と二個のプロトンが必要である。細菌のカンフア-水酸化酵素であるP450camの活性部位には、そこに結合した分子状酸素を囲む形の構造(酸素ポケット)が存在する。ポケットを構成するアミノ酸の配列が各P450間でよく保存されていること、結晶構造が明らかにされている他のヘムタンパクにはこのような構造は認められないことから、これはP450の機能と関わる構造と推定されている。本研究はP450camの触媒作用と酸素ポケットの相関を明らかにすることを目的とする。そこでポケットを構成するアミノ酸(GlyーGlyーValー251Aspー252ThrーVal)の置換を行い、既に(1)252ThrのーOH基が水酸化反応(OーO結合の切断反応)に必須であること。電子が効率よく渡るのに必須であること等を明らかにした。本年度は、以上の結果をさらに発展させ、酸素の触媒作用に必要なプロトンの供与機構に関する新しい知見等を得た。天然型Pー450camの酸化還元電位を広いpH範囲(pH5.6ー9.0)で測定し、酸性解離基(pKa=6)が還元型酵素のヘム周辺に存在することが示唆された。この解離基の存在は、一酸化炭素化型のCーO伸縮振動の測定からも裏づけられた。上述した251Aspまたは252Thrを改変した酵素では、電位、伸縮振動に有意なpH依存性が見られず、この2つのアミノ酸残基が解離性基の発現に関与しているものと推定された。結晶構造を見ると252Thrはヘム鉄と相互作用できる位置にあるが、251Aspはそのような位置にない。relay系が存在しAsp残基の解離がThrのーOH基の状態を変化させると考えれば上述の結果を説明できる。channelが考えられる。そこで366GluをMetに変異されたが、この変異酵素には天然型と同じ酸性解離基が観察され、カンファ-水酸化活性も高い。relay系とは考え難い。relay系の存在が示唆され、最終的にThrのーOH基が、OーO結合切断に必要なプロトンの供与すると考えられる。P450camのCーO伸縮振動を検討したところ、252Thrの時のみ重水の効果が観察され、252変異酵素では効果は殆ど観察されなかった。このことからThrのーOH基と結合CO間の相互作用(水素結合)が示唆された。