A fosfofrutose pode agora ser fosforilada por uma enzima limitante da taxa, a fosfofrutoquinase, para produzir frutose 1,6-bifosfato.
Outra enzima catalisadora triosefosfato isomerase converte o DHAP em G3P para produzir duas moléculas.
Assim, durante esta fase de investimento de energia, um total líquido de dois ATPs é usado para dividir uma molécula inicial de glicose em dois açúcares menores.
A glicose é a fonte de quase toda a energia usada pelos organismos. O primeiro passo da conversão da glicose em energia utilizável é chamado de glicólise. A glicólise ocorre no citosol da célula ao longo de duas fases: uma fase de necessidade de energia e uma fase de liberação de energia. Ao longo dos três primeiros passos, a glicose é convertida em diferentes formas e se liga a dois grupos de fosfato doados por duas moléculas de ATP, resultando em um açúcar instável. Nos dois estágios seguintes, o açúcar instável se divide em dois isômeros de açúcar que são convertidos ou usados diretamente na próxima fase da glicólise.