(A) passos necessários para A dissecção de cérebros de rato P2 − P4. (B) (i, IV) brightfield imagens de culturas gliais mistas tratadas (i) e não tratadas (IV) com arac. As pontas de seta vermelhas indicam a microglia contaminante. (II, v) Imagens de culturas de astrocite purificadas tratadas (II) e não tratadas (v) com arac. As pontas de seta azuis indicam oligodendrócitos contaminantes. (III, vi) Imagens confocais de culturas de astrocícitos purificadas tratadas (III) e não tratadas (vi) com arac. Verde mostra GFAP coloração e DAPI (azul) rótulos de todos os núcleos. (C) percentagem de células GFAP positivas. Os dados representam média ± SEM. * * * p < 0, 1, teste t não pareado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
(A, E, I) Painéis esquerdos: astrócitos expressando EAAT1-GFP (A), Cx43-GFP (E) ou tratados com uma sonda que rotula endosomas tardios e lisossomas (I). As caixas vermelhas indicam regiões usadas para analisar a dinâmica das partículas. Painéis direito: kymographs originais e cor-codificados que mostram trajetórias para as cargas indicadas. Linhas vermelhas representam cargas de movimento retrógrado, linhas verdes anterógrada-movendo cargas, e linhas azuis não-motile cargas. (B, F, J) Percentual de partículas estacionárias e motile. (C, G, K) Quantificação da velocidade anterograda e retrógrada e (D, H, L) comprimento de execução. Os dados representam média ± SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Aqui, descrevemos uma abordagem experimental para expressar, Visualizar e rastrear organelas fluorescentamente marcadas e proteínas de membrana de interesse usando a microscopia de vídeo de lapso de tempo em astrocytes de MD cortical do mouse primário de alta pureza. Também Delineamos uma metodologia para medir a dinâmica das partículas. A visualização direta da dinâmica protéica e organela nos astrócitos primários fornece uma poderosa ferramenta para estudar a regulação do transporte intracelular nessas células in vitro.
A metodologia para o estabelecimento de culturas de astrocite de mouse MD descrita acima combina etapas de outros protocolos publicados13,14,15, oque resulta em um método mais simples e em maior pureza e qualidade Culturas. A combinação de tratamento arac15 e de purificação à base de agitação13,14pode produzir culturas de astrocite com uma pureza tão alta quanto 98% (avaliada pela proporção de células totais de GFAP+ células), que em nosso exemplo resulta em um aumento de 27% na pureza sobre culturas submetidas apenas às etapas de purificação (Figura 1B, C). As culturas de alta pureza de astrócitos de camundongo obtidas com este método são semelhantes aos valores relatados para as culturas de astrocícitos de ratos (avaliados por ensaios enzimáticos e microscopia eletrônica) por McCarthy e deVellis14. Entretanto, o método de McCarthy/deVellis, que não inclui o tratamento de AraC, exige uma etapa de agitação mais longa (15 − 18 h) e duas voltas adicionais da purificação14.
Em nosso exemplo, mostramos que este protocolo é suficientemente sensível para captar diferenças de motilidade entre várias proteínas de membrana e organelas em astrócitos, que são prováveis representativos de seus itinerários intracelulares individuais e celulares Função. Embora o nosso exemplo demonstre a utilidade deste protocolo em condições basais, esta metodologia pode ser facilmente adaptada para medir parâmetros de transporte dentro de uma ampla gama de questões de pesquisa. Por exemplo, protocolos semelhantes com pequenas modificações podem ser usados para caracterizar eventos de transporte em astrócitos in vitro em resposta ao ambiente intra ou extracelular, como danos celulares, toxicidade, mutações patogênicas, atividade sináptica (em culturas mistas de neurônios e astrócitos), etc. Da mesma forma, a coexpressão e a visualização de múltiplas cargas ou organelas, individualmente marcadas com diferentes fluoróforos, também podem ser usadas para avaliar mudanças dinâmicas na colocalização e formação complexa, interações transitórias entre organelas , e eventos de transporte de reciclagem de membrana e endocitic.
O sucesso da metodologia aqui apresentada baseia-se principalmente na capacidade de obter culturas de astrocícitos de alta qualidade e na rotulagem eficiente de cargas de interesse. Ao utilizar este procedimento para a imagem latente viva, é importante monitorar pròxima a expressão fluorescente para determinar o tempo óptimo da incubação do borne-transfection. Em média, verificou-se que para as cargas analisadas um período de incubação de 24 h resulta em boa intensidade de sinal para aquisição de imagens ao vivo. A incubação prolongada de astrócitos transfected pode conduzir à expressão elevada das proteínas cDNAs etiquetadas, que podem induzir a agregação da proteína, assim mudando a localização e a dinâmica da carga, e diminuindo a saúde das culturas. Os astrócitos são muito vulneráveis a danos físicos e mudanças no ambiente da cultura, o que pode levar à indução de respostas transcricional e celular, incluindo reatividade. Portanto, é fundamental reduzir os intervalos de tempo entre as etapas de lavagem e minimizar a exposição das culturas ao ar e a mudanças significativas de temperatura ou intensidade de luz nos períodos de incubação e de aquisição.
Em síntese, os métodos aqui apresentados podem ser utilizados para avaliar e quantificar mudanças dinâmicas na localização de proteínas e organelas em astrócitos. Eles fornecem ferramentas valiosas que permitem o exame de alterações nas respostas astrocíticas condições fisiológicas e patológicas.
DNL foi apoiado pela Universidade da Carolina do Norte na Chapel Hill (UNC) escola de medicina como um estudioso Simmons. O TWR foi apoiado pelo UNC PREP Grant R25 GM089569. Trabalho usando o centro de neurociência UNC microscopia núcleo Facility foi apoiado, em parte, pelo financiamento do NIH-NINDS Neuroscience Center support Grant p30 NS045892 e o NIH-NICHD intelectual e desenvolvimento apoio centro de pesquisa subsídio U54 HD079124.

- Mas, como não é nada fácil subir na árvore, eles precisam da sua ajuda para pular até a agarrar os galhos!
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