Bolsa 09/10729-2 - Leveduras, Genes essenciais - BV FAPESP
Caracterização da ORF essencial YMR134W de função desconhecida -envolvimento na resposta antioxidante e no metabolismo de ferro em Saccharomyces Cerevisiae
Processo: 09/10729-2
Beneficiário: Gabriel Moretti de Almeida
Assunto(s): Leveduras Genes essenciais
Saccharomyces cerevisiae teve seu sequenciamento genômico terminado em 1996, sendo composto de cerca de 6300 ORFs ("open reading Frames") distribuídas em 16 cromossomos, das quais aproximadamente 20% estão anotadas como não caracterizadas e de função molecular desconhecida. Com o objetivo de caracterizar algumas dessas ORFs essenciais à levedura, que estejam relacionadas aos processos antioxidantes, foi adquirida uma coleção a qual possui linhagens de mutantes termossensíveis para genes essenciais de Saccharomyces cerevisiae. Inicialmente buscamos os genes de levedura anotados como função molecular e biológica desconhecidas, cuja deleção resultava em células inviáveis, usando o site Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Essa busca resultou em 36 ORFs, sendo que 14 linhagens estavam presentes na nossa coleção de termossensíveis. Após a escolha dos genes candidatos foram realizados testes de viabilidade para seleção de ORFs relacionadas à resposta antioxidante. Testes na presença de peróxido de hidrogênio, tert butil hidroperóxido ou luz ultravioleta (UV) relacionaram o gene YMR134W com a resposta antioxidante, cuja linhagem mutante se mostrou unicamente sensível ao peróxido de hidrogênio. O objetivo desse projeto é estudar a função biológica e molecular de YMR134W na resposta antioxidante, investigando seu padrão de expressão gênica, sua estrutura terciária e, se possível, caracterizar sua atividade bioquímica. Para isso clonaremos e expressaremos esse gene em E. coli, purificaremos a proteína e realizaremos testes de atividade, ensaios de cristalografia, além de produzirmos anticorpos para análises da expressão e localização da proteína in vivo. Investigaremos ainda seu envolvimento no metabolismo mitocondrial de ferro, já que alguns dados da literatura relacionam os mutantes de YMR134W com esse processo celular.