Coleta & Montagem
Para o estudo dos Thysanoptera é necessário a coleta, preservação e preparação apropriada dos espécimes.
Coletando tripes
Os tripes podem ser encontrados em muitos microhabitats e o método de coleta dependerá do local e objetivos da atividade.
Para a coleta de tripes em plantas, a batida da vegetação em uma bandeja de plástico (preferencialmente branca) é uma das técnicas mais utilizadas. Após caírem na bandeja os tripes podem ser coletados gentilmente com um pincel fino molhado em álcool 60%, e transferidos imediatamente para um tubo do tipo Eppendorf. Para a coleta de tripes em flores de abertura estreita, inflorescências densas (p.ex. Asteraceae) ou galhas é recomendado ainda a inspeção em laboratório com o uso de estereomicroscópio. O uso de guarda-chuva entomológico ou de varredura entomológica também podem ser utilizadas para coletar tripes na vegetação, porém a eficiência de captura tende a ser limitada e a triagem do material é mais lenta.
Para o estudo e coleta de tripes fungívoros é necessário inspecionar cascas de árvores, galhos mortos, folhiço e troncos caídos. Para os galhos secos e folhas mortas dependuradas na planta é razoável adotar a mesma técnica de batida em uma bandeja descrita acima. É possível capturar os tripes habitantes do folhiço através de armadilhas do tipo Pitfall, ou então transferindo amostras de folhas secas para um funil de Berlese por no mínimo 24h.
Os tripes possuem corpo sensível e precisam ser manipulados com cuidado, evitando assim a perda de estruturas importantes para a identificação. A concentração do álcool também é uma variável importante para a preservação dos tripes. Geralmente os tripes são conservados em álcool 60%, mas é possível fazer boas preparações em lâminas de microscopia de indivíduos fixados em álcool 70-95%. No entanto, espécimes fixados em concentrações acima de 80% tendem a ficar mais suscetíveis a danos pela manipulação.
Os dados de coleta contendo data, local, planta/ambiente podem ser escritos em uma tira de papel vegetal e armazenado dentro do tubo, junto com os espécimes.
Os tripes podem ser também fixados em AGA (10 partes de álcool etílico 60%, uma parte de glicerina e uma parte de ácido acético glacial), que ajuda a preservar a maleabilidade dos espécimes. É importante destacar que o uso do AGA não é indicado para amostras que serão usadas em análises moleculares.
Preparando os tripes para estudo
Os tripes podem ser preparados de diferentes maneiras para estudo, mas o método mais indicado é a montagem de lâminas de microscopia. Nesse sentido, duas técnicas costumam ser empregadas dependendo dos objetivos da atividade: a de lâminas semi-permanentes que utilizam um meio de montagem a base de água e a de lâminas permanentes, que geralmente utilizam Bálsamo do Canadá.
A preparação de lâminas semi-permanentes são rápidas e eficientes para a identificação de rotina e que haja a necessidade de preservar o material por longos períodos. O meio de montagem chamado Hoyer's é o mais amplamente utilizado pelos especialistas.
Preparação do meio de montagem Hoyer's
Água destilada.......................40 ml
Goma arábica (em cristais).....30 g
Hidrato de cloral.....................200 g
Glicerina................................20 ml
As substâncias devem ser misturadas nessa sequência e a temperatura ambiente, e em seguida filtrada em algodão ou gaze. Depois de fazer esta mistura, é recomendado esperar pelo menos 24h para usá-lo para que as bolhas de ar saiam do líquido.
Para iniciar o processo é necessário macerar os espécimes para a retirada do conteúdo estomacal. Este e os demais procedimentos devem ser realizados com o uso de estereomicroscópio.
Abaixo segue um protocolo de preparação de lâminas semi-permanentes utilizado pelos autores:
1-Coloque os tripes em um tubo ou placa de Petri pequena contendo NaOH 5% ou KOH 5%. Os tripes devem permanecer pelo menos 3h, às vezes mais, nos casos em que a coloração do indivíduo é mais escura (alguns tripes devem permanecer por mais de 24h). Durante este período fure o abdome do tripes na face ventral usando um micro alfinete, preferencialmente entre as coxas posteriores, e massageie gentilmente para tirar o conteúdo do corpo.
2-Coloque os tripes em água destilada por pelo menos 10 minutos para retirada do NaOH.
3-Transfira os espécimes para o álcool 60% por cerca de 24h.
4-Distenda as pernas, antenas e asas dos tripes.
5-Coloque uma gota de Hoyer's em uma lamínula de microscopia (18x18mm ou menor).
6-Transfira o tripes sobre a gota de Hoyer's com o auxílio de um micro alfinete, posicionando o indivíduo no centro da lamínula com a região ventral voltada para cima.
7-Coloque uma gota de Hoyer's no centro de uma lâmina de microscopia e junte a lâmina com a lamínula (liquido com liquido), sem soltar a lâmina por cima da lamínula. Depois que os líquidos se espalharem, vire rapidamente a lâmina de maneira que a lamínula fique na parte superior.
8-Coloque a lâmina imediatamente em uma superfície previamente aquecida a 50ºC, e deixe a lâmina descansar por algumas horas antes de observá-la no microscópio.
Lembre-se que o Hoyer's demora alguns meses para secar e por isso deve-se evitar deixar a lâmina na posição vertical. É recomendado armazenar as lâminas em uma estufa a 60°C para acelerar o processo de secagem.
Agora você pode identificar seu material clicando aqui.
Para estudos taxonômicos dos tripes, recomenda-se a montagem de lâminas permanentes usando Bálsamo do Canadá. A durabilidade das lâminas preparadas nesse meio de montagem é indefinida, mas lâminas confeccionadas há mais de 100 anos estão preservadas em bom estado.
A montagem em Bálsamo do Canadá exige que os espécimes passem por um processo de desidratação, caso contrário, o material pode ficar danificado ou favorecer o aparecimento de bolhas que atrapalham a observação.
Assim como na preparação em Hoyer's, os tripes devem ser macerados em NaOH 5% ou KOH 5% seguindo o mesmo protocolo nos passos 2, 3 e 4 descritos acima. Recomendamos o protocolo abaixo para a preparação de lâminas permanentes.
1-Transfira os tripes para o álcool 70% por pelo menos 1h.
2-Transfira os tripes para o álcool 80% por 20min.
3-Transfira os tripes para o álcool 90-95% por 10min.
4-Transfira os tripes para o álcool 100% por cerca de 10min.
5-Transfira os tripes para o óleo de cravo por no mínimo 1h. Não utilize óleo de cravo diluído em água, largamente usado como essências aromáticas.
6-Coloque uma gota de Bálsamo do Canadá em uma lamínula de microscopia (18x18mm ou menor). O Bálsamo usado na montagem não deve ser espesso, sob o risco de danificar o espécime. Recomendamos o uso de xilol para a diluição.
7-Transfira 1 (ou mais) tripes sobre a gota com o auxílio de um micro alfinete, posicionando o indivíduo no centro da lamínula com a região ventral voltada para cima.
8-Coloque uma gota de Bálsamo do Canadá no centro de uma lâmina de microscopia e junte a lâmina com a lamínula (liquido com liquido), sem soltar a lâmina por cima da lamínula. Depois de unidas, vire rapidamente a lâmina de maneira que a lamínula fique na parte superior.
9-Coloque a lâmina imediatamente em uma superfície previamente aquecida a 50ºC e deixe a lâmina nesta superfície por algumas horas antes de observá-la no microscópio.
Importante: A quantidade do líquido de montagem em ambos os tipos de preparação deve ser suficiente para suportar a pressão da lamínula sem distorcer o indivíduo.
As lâminas demoram alguns meses para secar e por isso deve-se evitar deixar a lâmina na posição vertical. É recomendado armazenar as lâminas em uma estufa a 60°C para acelerar o processo de secagem.
As lâminas devem ser etiquetadas adequadamente para fins taxonômicos e de armazenamento, e o uso de etiquetas adesivas facilita este processo. Geralmente, a etiqueta do lado esquerdo da lâmina contém os dados de identificação, enquanto que a do lado direito possui as informações de coleta.